DE60023673T2

DE60023673T2 - Dna-impfung zur behandlung von autoimmunerkrankungen

Info

Publication number: DE60023673T2
Application number: DE60023673T
Authority: DE
Inventors: Lawrence Steinman; Pedro Jose Ruiz; Hideki Stanford Uni. Stanford GARREN
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1999-03-12
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2020-03-11
Also published as: EP1168923B1; CA2363269A1; WO2000053019A1; ATE453404T1; ATE308244T1; EP1621208B1; ES2338890T3; DE60043624D1; EP1168923A1; DE60023673D1; DK1621208T3; EP1168923A4; DK1168923T3; PT1621208E; EP2177228A1; ES2251974T3; CA2363269C; JP2003508346A; EP1621208A1

Description

Die Komplexität des Immunsystems war bisher immer ein großes Hindernis für das Verständnis einer Immunsystemdysfunktion. In den letzten Jahren haben die Verfahren der Molekularbiologie Einblick in die Mechanismen und Bestandteile gegeben, die der Immunität zugrunde liegen. Die Geschichte der Immunität ist zum Großteil die Geschichte der Lymphozyten. Lymphozyten besitzen ein äußerst komplexes und raffiniertes System zur Wechselwirkung miteinander mit antigenpräsentierenden Zellen und mit fremden Antigenen und Zellen.
Eine Modulation der Immunantwort variiert je nach den jeweils produzierten spezifischen Faktoren und den Rezeptoren auf der reagierenden Zelle. Die Pfade zur Herabregulierung von Antworten sind genauso wichtig wie jene, die zur Aktivierung erforderlich sind. T-Zellentoleranz ist ein allgemein bekannter Mechanismus zur Verhinderung einer Immunantwort auf ein bestimmtes Antigen. Andere Mechanismen, wie z.B. die Sekretion von suppressiven Zytokinen, sind ebenfalls bekannt.
Ein gemeinsames Merkmal einer Reihe von Krankheiten und Entzündungsleiden ist die Beteiligung von entzündungsfördernden CD4⁺-T-Zellen. Diese T-Zellen sind verantwortlich für die Freisetzung von Entzündungszytokinen vom Th1-Typ. Zytokine vom Th1-Typ umfassen Interleukin 2 (IL-2), γ-Interferon, TNFα und IL-12. Solche entzündungsfördernden Zytokine dienen dazu, die Immunantwort zu stimulieren, was in vielen Fällen zur Zerstörung von autologem Gewebe führt. Zytokine, die mit der Suppression einer T-Zell-Antwort in Zusammenhang gebracht werden, sind jene vom Th2-Typ und umfassen IL-10, IL-4 und TGF-β. Es wurde herausgefunden, dass Zellen vom Th1- und Th2-Typ den gleichen Antigenrezeptor als Reaktion auf ein Immunogen verwenden können; im ersten Fall wird eine stimulierende Antwort erzeugt, im letzteren eine suppressive Antwort.
Zytokine spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Genesung von Autoimmunerkrankungen. Th1-Zytokine, wie z.B. Interleukin 12 (IL12) und Interferon gamma (IFNγ) wurden im Zentralnervensystem (ZNS) von Patienten, die an multipler Sklerose (MS) litten, und in Tieren mit EAE gefunden (Issazadeh et al., J. Neuroimmunol. 61, 205–12 (1995)). Th2-Zytokine, wie z.B. IL4, IL5 und IL10, waren während der Remission von entweder MS oder EAE in erhöhten Werten vorhanden (Waisman et al., Immunointervention in Autoimmunity by Th1/Th2 Regulation, 129–50, L. Adorini, Hrsg., Austin, Texas: R. G. Landes Co. (1997)). Vorhergehende Studien haben gezeigt, dass eine systemische Verabreichung von IL4 sowie eine lokale ZNS-Verabreichung von IFNγ die Schwere von EAE verringern können (Racke et al., J. Exp. Med. 180, 1961–6 (1994); Voorthuis et al., Clin. Exp. Immunol. 81, 183–8 (1990)). Außerdem kann der Zusatz von IL4 zu naiven T-Zellen zur Entwicklung von Zellen vom Th2-Typ führen, während der Zusatz von IL12 zur Entwicklung von Zellen vom Th1-Typ führen kann (Macatonia et al., Int. Immunol. 5, 1119–28 (1993)).
Eine DNA-Impfung ist wirksam, um Versuchstiere gegen infektiöse Pathogene und Krebs zu schützen, und vor kurzem wurde sie auch verwendet, um Autoimmunerkrankungen zu verhindern (Waisman et al., Nat. Med. 2, 899–905 (1996)). Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE), ein prototypisches Tiermodel für T-Zell-Autoimmunität, spiegelt viele der klinischen und pathologischen Merkmale der menschlichen Krankheit, multiple Sklerose, wider.
Um Immunantworten auf DNA-Vakzinen zu modifizieren, wurde gemeinsam mit der DNA-Impfung eine mit Zytokingenen sowie mit den Genen für bestimmte Pathogene durchgeführt. Beispiele umfassen DNA-Immunisierung mit Hepatitis-B-Virusantigenen und IL2-DNA, welche Th1-Reaktionen erhöhten, mit HIV-Antigenen und IL12-DNA, welche die zytotoxische T-Zell-Aktivität erhöhten, und mit Influenzaantigenen und IL6-DNA, welche die antivirale Aktivität erhöhten (siehe z.B. Chow et al., J. Immunol. 160(3), 1320–9 (1988)).
Die Impfung von Mäusen mit nackter DNA, die für die vorherrschende T-Zell-Rezeptor-(TCR-)β-Kette kodiert, die in reaktiven T-Zellen des basischen Myelinproteins (MBP) umgeordnet ist, schützt nachgewiesenerweise Mäuse vor EAE. Solch eine Immunisierung induzierte ein Muster einer Th2-Zytokinproduktion durch reaktive Mylein-T-Zellen und schuf eine suppressive Umgebung, die Autoimmunität blockierte: T-Zellen, die auf das Myelinautoantigen reagierten, wichen von einem aggressiven T-Helfer-1-(Th1-)Typ zu einem suppressiven Th2-Typ ab.
Die Weiterentwicklung einer Behandlung, die T-Zell-Aktivierung spezifisch hemmt, wäre von großem medizinischem Vorteil.
Relevante Literatur
Waisman et al., Nat. Med. 2, 899–905 (1996), und Offner et al., J. Immunol. 161, 2178–2186 (1998), beschreiben die Verwendung einer DNA-Impfung zur Verhinderung von Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE). Die Injektion von DNA, um eine Impfung gegen Mikroben und Tumoren zu fördern, ist in Cohen et al., Hosp. Pract. 32, 169–171 (1997); Syrenglas et al., Nat. Med. 2, 1038–1041 (1996); Ulmer et al., Curr. Opin. Immunol. 8, 531–536 (1996); Pardoll et al., Immunity 3, 165–169 (1995); Davis et al., Hum. Mol. Genet. 2, 1847–1851 (1993); Ulmer et al., Science 259, 1745–1749 (1993); und Tang et al., Nature 356, 152–154 (1992), beschrieben. Es hat sich gezeigt, dass eine genetische Immunisierung sowohl eine spezifische humorale als auch eine breiter reagierende zelluläre Immunantwort in Tiermodellen für Krebs, Mycoplasma, TB, Malaria und zahlreiche Virusinfektionen, einschließlich Influenza und HIV, auslösen. Siehe beispielsweise Mor et al., J. Immunol. 155, 2039–46 (1995); Xu und Liew, Immunology 84, 173–6 (1995); und Davis et al., Vaccine 12, 1503–9 (1994).
Die Anfälligkeit für multiple Sklerose (MS) wurde mit bestimmten MHC-Klasse-II-Genen in Zusammenhang gebracht, Oksenberg und Steinman, Current Opinion in Immunology 2, 619–621 (1990).
Auf zellulärer Ebene wurde die Oligoklonalität von T-Zellen in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) von MS-Patienten beschrieben, Lee et al., Ann. Neurol. 29, 33–40 (1991).
ZNS-Antigene, einschließlich Myelinproteine, die im Zusammenhang mit MS untersucht wurden, sind in Rosbo et al., J. Autoimmunity 11, 287–299 (1998), beschrieben. Die WO97/46253 beschreibt eine Immuntherapie für eine Autoimmunerkrankung basierend auf der Verabreichung eines Antigens oder einer DNA mithilfe einer Genkanone. Die WO 97/45144 betrifft die Konstruktion eines Gens, das für pathogene Epitope kodiert, um eine Autoimmunerkrankung zu behandeln. Nowicka et al., J. Neuroimmunology 90, 102, Zusammenfassung 582 (1998), beschreiben die Verwendung eines Plasmids, pRc-CMV mit einem PLP-Gen, zur Injektion in Mäuse. Tsunoda et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 57, 758–67 (1998), beschreiben die Verstärkung von EAE durch DNA-Immunisierung mit Myelinproteolipidproteinplasmid-DNA. Barnett et al., J. Neuroimmunol. 64, 163–73 (1996), berichten, dass rekombinante Vakziniaviren, die für einen enzephalitogenen Abschnitt eines basischen Myelinproteins kodieren, in einem Tiermodell für die menschliche demyelisierende Krankheit EAE beurteilt wurden.
Verstärker der Immunantwort auf DNA-Vakzinen umfassen unmethylierte CpG-Dinucleotide, Krieg et al., Trends Microbiol. 6, 23–27 (1998), und fusionierte, von einem Pathogen stammende Sequenzen, King et al., Nat. Med. 4, 1281–1286 (1998).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Unterdrückung von entzündungsfördernden T-Zell-Antworten bei Autoimmunerkrankungen. Ein Säugetierwirt wird mit einem DNA-Expressionsvektor geimpft, der für Autoantigenfragment kodiert. Als Antwort auf die Impfung wird die pathogene T-Zell-Proliferation gehemmt und die Produktion von Th1-Zytokinen, einschließlich IL-2, IFN-γ und IL15, verringert.
Somit stellt die Erfindung die Verwendung einer DNA-Expressionskassette, die aus einer Transkriptionsinitiationsregion, einer Autoantigen-kodierenden Sequenz, die für zumindest einen Teil eines Myelinprotein-Autoantigens kodiert, und einer Transkriptionsterminationsregion besteht, wobei das Myelinprotein-Autoantigen mit einer ent zündungsfördernden T-Zell-Antwort vom Th1-Typ assoziiert ist, wobei die Transkriptionsinitiationsregion unter der Regulationssteuerung eines Promotors steht, der in einem menschlichen Wirt mit einer Autoimmunerkrankung aktiv ist, zur Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Behandlung einer demyelinisierenden Autoimmunerkrankung in einem menschlichen Wirt durch intramuskuläre Injektion.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Nucleinsäure, die für ein Th2-Zytokin kodiert, gemeinsam mit der Autoantigen-kodierenden Sequenz verabreicht. Die Verwendung von für IL4 kodierenden Sequenzen ist von besonderem Interesse. Eine suppressive Impfung verringert die entzündungshemmenden T-Zell-Reaktionen auf spezifische, gezielte Weise.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Anti-SCH-IgG-(A) und Anti-PLP139-151-(B) Antikörpertiter in SJL/J-Mäusen nach einer DNA-Immunisierung mit dem PLP-Minigen.
2: Proliferative Lymphknotenzellenreaktionen auf PLP139–151 (Quadrate) und das Kontrollpeptid PLP178–191 (Dreiecke) für Tiere, denen DNA injiziert wurde, die für PLP139–151 (A) oder den Kontrollvektor pTARGET (B) kodierte.
3: (A) γ-Interferon- (gestreifte Balken) oder IL-2-Werte (gepunktete Balken) in Tieren, die mit Plasmid-DNA geimpft wurden, die für PLP139–151 oder einen Vektor alleine (pTARGET) kodierte. (B) Zytokin-mRNA-Detektion und -Analyse durch 5% Polyacrylamidgelelektrophorese.
4: Oberflächenexpression von B7.1, B7.2 und I-A^S durch Milzzellen nach einer Inkubation mit DNA. Zahlen in den Quadranten beziehen sich auf den Prozentsatz von Zellen im Monozytenfenster (A) oder Lymphozytenfenster (B), definiert durch Vorwärts- und Seitenstreuung.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegenden Verfahren stellen ein Mittel zur therapeutischen Behandlung und Untersuchung von Entzündungen durch die Suppression von pathogenen antigenspezifischen T-Zell-Antworten bereit. Eine DNA-Expressionskassette wird intramuskulär in Wirtsgewebe injiziert. Der Vektor umfasst eine DNA-Sequenz, die für zumindest einen Teil eines Myelinprotein-Autoantigens kodiert. Die Impfung kann auch DNA-Sequenzen umfassend, die für ein Th2-Zytokin, z.B. IL4, kodieren. Als Reaktion auf diese Impfung wird eine suppressive Antwort ausgelöst. Antigenspezifische T-Zell-Proliferation wird gehemmt und Th1-Zytokinproduktion wird verringert.
Ohne den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränken zu wollen wird angenommen, dass die hierin beschriebenen Verfahren ein neues Verfahren für schützende Immunität darstellen, welche die Wirkungen von DNA-Impfung und lokaler Genverabreichung kombinieren. Nach einer DNA-Impfung mit dem Autoantigenepitop alleine sind T-Zellen anergisch. Das kann teilweise auf die biologischen Wirkungen von DNA-Motiven, wie etwa den unmethylierten CpG-Dinucleotiden in bestimmten Basenkontexten (CpG-S-Motive), zurückzuführen sein (Krieg et al., Trends in Microbiol. 6, 23–27 (1998)). Der Zusatz von IL4 als DNA-Co-Vakzine rettet die Anergie, die durch die Autoantigen-DNA-Vakzine auferlegt wurde, und richtet die Antwort auf einen Th2-Phänotypen. STAT6 wird in den Zellen von drainierenden Lymphknoten durch die IL4-DNA-Vakzine aktiviert. Es wird angenommen, dass IL4 von der verabreichten DNA-Vakzine produziert wird und mit einem IL4-Rezeptor auf Lymphknotenzellen wechselwirkt, der wiederum die Aktivierung von STAT6 stromab vom Rezeptor auslöst. Eine Immunisierung gegen die Antigene, die diese Autoimmunerkrankungen auslösen, die durch autoreaktive Th1-Zellen verursacht sind, Krankheiten, wie beispielsweise multiple Sklerose, sind Zustände, bei denen eine gemeinsame Impfung mit DNA, die für IL4 kodiert, von Vorteil sein könnte.
Die Autoantigene wie hierin verwendet sind endogene Proteine oder Fragmente davon, die eine pathogene Immunantwort auslösen. Von besonderem Interesse sind Autoantigene, die eine T-Zell-vermittelte pathogene Entzündungsreaktion auslösen.
Eine suppressive Impfung mit dem relevanten Zielautoantigen wird bei der Behandlung von demyelinisierenden Autoimmunerkrankungen verwendet, die durch die Beteiligung von entzündungsfördernden T-Zellen charakterisiert sind, wie z.B. multiple Sklerose und experimentelle Autoimmun-Enzephalitis. Tiermodelle, insbesondere kleine Tiere, wie z.B. Mäuse, Hasenartige usw., sind für experimentelle Untersuchungen von Interesse.
Die vorliegenden Verfahren zur suppressiven Immunisierung werden für prophylaktische oder therapeutische Zwecke eingesetzt. Der Begriff "Behandlung" bezieht sich hierin auf sowohl die Vorbeugung einer Krankheit als auch die Behandlung von schon vorhandenen Leiden. Die Vorbeugung einer Autoimmunerkrankung unter Verwendung des Vakzinenautoantigens (VA) wird erreicht, indem die Vakzine vor dem Ausbruch der Krankheit verabreicht wird. Die Behandlung einer vorhandenen Erkrankung ist von besonderem Interesse, wenn die suppressive Impfung die klinischen Symptome des Patienten stabilisiert oder verbessert. Solch eine Behandlung wird wünschenswerterweise vor dem kompletten Funktionsverlust im betroffenen Gewebe durchgeführt.
Myelinprotein-Autoantigene hängen bekannterweise mit demyelinisierenden Krankheiten, wie z.B. multipler Sklerose und experimenteller Autoimmunmyelitis, zusammen.
Die Proteinkomponenten von Myelinproteinen, einschließlich des basischen Myelinproteins (MBP), Proteolipidproteins (PLP), myelinassoziierten Glykoproteins (MAG) und Myelinoligodendrozytenglykoproteins (MOG), sind von besonderem Interesse für die Verwendung als Immunogene der Erfindung. Die Suppression der T-Zell-Reaktionsbereitschaft auf diese Antigene wird verwendet, um demyelinisierende Krankheiten zu verhindern oder behandeln.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Vakzinenautoantigen ein Proteolipid. Zum besseren Verständnis ist eine Bezugssequenz von menschlichem PLP als Seq.-ID Nr. 1 angeführt; und ein menschliches basisches Myleinprotein als Seq.-ID Nr. 3. Ein Proteolipid ist ein Hauptbestandteil von Myelin und ist bekannterweise in demyelinisierenden Krankheiten involviert (siehe beispielsweise Greer et al., J. Immunol. 149, 783–788 (1992), und Nicholson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 9279–9284 (1997)).
Das integrale Membranprotein PLP ist ein dominantes Autoantigen von Myelin. Die Determinanten der PLP-Antigenität wurden in verschiedenen Mäusestämmen identifiziert und umfassen die Reste 139–151 (Tuohy et al., J. Immunol. 142, 1523–1527 (1989)), 103–116 (Tuohy et al., J. Immunol. 141, 1126–1130 (1988); 215–232 (Endoh et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 92, 433–438 (1990)), 43–64 (Whitham et al., J. Immunol. 147, 3803–3808 (1991)) und 178–191 (Greer et al., J. Immunol. 149, 783–788 (1992)). Eine Immunisierung mit nativem PLP oder mit synthetischen Peptiden, die PLP-Epitopen entsprechen, löst EAE aus. Analoga von PLP-Peptiden, die durch Aminosäuresubstitution hergestellt wurden, kann die Auslösung und das Fortschreiten von EAE verhindern (Kuchroo et al., J. Immunol. 153, 3326–3336 (1994); Nicholson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 9279–9284 (1997)).
MBP ist ein extrinsisches Myelinprotein, das eingehend untersucht wurde. Zumindest 26 MBP-Epitope wurden beschrieben (MeinI et al., J. Clin. Invest. 92, 2633–2643 (1993)). Von besonderem Interesse für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind die Reste 1–11, 59–76 und 87–99. Analoga von MBP-Peptiden, die durch Trunkierung hergestellt wurden, kehren EAE bekannterweise um (Karin et al., J. Immunol. 160, 5188–5194 (1988)). DNA, die für Polypeptidfragmente kodiert, kann für immunogene Epitope kodierende Sequenzen umfassen, z.B. das basische Myelinprotein p84–102, genauer gesagt das basische Myelinprotein p87–99 (Seq.-ID Nr. 11) VHFFKNIVTPRTP (p87–99), oder sogar das trunkierte 7-mer-Peptid (Seq.-ID Nr. 12) FKNIVTP. Die Sequenzen des basischen Myelinproteinexons 2, einschließlich des immunodominanten Epitops, das durch die Aminosäuren 59–85 begrenzt wird, sind ebenfalls von Interesse. Siehe beispielsweise Sakai et al., J. Neuroimmunol. 19, 21–32 (1988); Baxevanis et al., J. Neuroimmunol. 22, 23–30 (1989); Ola et al., Nature 346, 183–187 (1990); Martin et al., J. Immunol. 148, 1350–1366 (1992); Valli et al., J. Clin. Inv. 91, 616 (1993). Es wurde herausgefunden, dass das immunodominante MBP(84–102)-Peptid mit hoher Affinität an DRB1*1501- und DRB5*0101-Moleküle des mit der Krankheit assoziierten DR2-Haplotyps bindet. Überlappende aber getrennte Peptidsegmente waren wichtig für die Bindung an diese Moleküle; hyrophobe Reste (Val189 und Phe92) im MBP(88–95)-Segment für die Peptidbindung an DRB1*1501-Moleküle; hydrophobe und geladene Reste (Phe92, Lys93) in der MBP(89–101/102)-Sequenz trugen zur DRB5*0101-Bindung bei.
Das Transmembranglykoprotein MOG ist eine unbedeutendere Komponente von Myelin, die nachgewiesenerweise EAE auslöst. Immunodominante MOG-Epitope, die in verschiedenen Mäusestämmen identifiziert wurden, umfassen die Reste 1–22, 35–55, 64–96 (deRosbo et al., J. Autoimmunity 11, 267–299 (1998); deRosbo et al., Eur. J. Immunol. 25, 985–993 (1995), und 41–60 (Leadbetter et al., J. Immunol. 161, 504–512 (1998).
Eine DNA-Expressionskassette, die für zumindest einen Teil des Autoantigens kodiert, üblicherweise als Teil eines Vektors, wird in Gewebe des Vakzinenrezipienten eingeführt. Das Minigen wird im Gewebe exprimiert, und das kodierte Polypeptid agiert als Immunogen oder Antigen. Die Autoantigensequenz kann von jeder beliebigen Säugetier- oder Vogelspezies stammen, wie z.B. von Primaten-Spezies, insbesondere Menschen; Nagetieren, einschließlich Mäusen, Ratten und Hamstern; Kaninchen; Pferden; Rindern; Hunden; Katzen usw. Von besonderem Interesse sind die Mensch- und Mäuse-Autoantigensegmente. Im Allgemeinen stammt die Sequenz von der gleichen Spezies, der auch das Wirtstier angehört, und vorzugsweise ist es autolog.
Die vorliegende DNA-Expressionskassette umfasst den Großteil der oder die gesamte Sequenz, die für ein Autoantigenfragment kodiert, wie von Kabat et al., w.o., definiert ist. Die kodierende Sequenz kann am 5'- oder 3'-Terminus trunkiert sein und kann ein Fragment der kompletten Polypeptidsequenz sein. In einer Ausführungsform der Erfindung kodiert die Sequenz für ein Peptidfragment, das bekannterweise pathogenen T-Zellen präsentiert wird, beispielsweise Peptide, die durch Klasse-II- MHC-Moleküle des Wirts präsentiert werden. Solche Peptide wurden in der Literatur beschrieben und sind typischerweise etwa 8 bis etwa 39 Aminosäuren lang.
Die Vakzine kann mit einer oder mit einer Mischung von Autoantigensequenzen formuliert werden. Es hat sich zwar gezeigt, dass eine einzelne Sequenz in der Lage ist, eine Antwort auf mehrere Epitope zu unterdrücken, in manchen Fällen mag es aber wünschenswert sein, mehrere Sequenzen zu verwenden, wenn jede für ein anderes Epitop kodiert. Siehe beispielsweise Leadbetter et al., J. Immunol. 161, 504–512 (1988). Eine Formulierung, die aus mehreren kodierenden Sequenzen von unterschiedlichen PLP-Epitopen besteht, kann verwendet werden, um eine stärkere und/oder längere suppressive Antwort auszulösen. Indem auf mehrere autoraktive T-Zell-Populationen gezielt wird, kann eine solche Formulierung die Entwicklung einer Autoantigenresistenz verlangsamen oder verhindern. Die Verwendung von PLP-Sequenzen in Kombination mit anderen Myleinprotein-Epitopen kann das Repertoir an myelinreaktiven T-Zellen effektiv unterdrücken.
Neben den spezifischen Epitopen und Polypeptiden von Autoantigenen kann auch die Aufnahme von CpG-Sequenzen, wie von Krieg et al., Trends Microbiol. 6, 23–27 (1998), beschrieben wurde, und von Helfersequenzen, King et al., Nat. Med. 45, 1281–1286 (1998), die Immunantwort verstärken. Biologische Wirkungen von DNA-Motiven, wie z.B. unmethylierten CpG-Dinucleotiden in bestimmten Basenkontexten (CpG-S-Motiv), können die angeborenen Immunantworten modulieren, wenn sie Tieren injiziert werden. Geringe Zahlen von CpG-Motiven oder die Gegenwart von fehlerhaften Motiven kann an der Entwicklung einer Anergie durch Immunisierung mit Autoantigenen mitwirken.
Die für ein Polypeptid kodierende Sequenz, die eine Autoantigen- oder Zytokinsequenz sein kann, wird in eine geeignete Expressionskassette insertiert. Das Expressionskonstrukt wird auf herkömmliche Weise hergestellt. Die Kassette weist geeignete Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen zur Expression der Sequenz in den die Vakzine empfangenden Zellen auf. Die Kassette ist im Allgemeinen ein Teil eines Vektors, der einen geeigneten Replikationsstartpunkt und Gene ent hält, die für selektierbare Marker kodieren, wie sie für das Wachstum, die Amplifikation und die Manipulation des Vektors erforderlich sind, und zwar vor der Einbringung in den Rezipienten. Geeignete Vektoren umfassen Plasmide, YACs, BACs, Bakteriophagen, Retroviren und dergleichen. Herkömmlicherweise ist der Expressionsvektor ein Plasmid. Vor der Impfung kann die Kassette durch Spaltung, Amplifikation usw. von Vektorsequenzen isoliert werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Bei der Injektion kann die DNA supergeknäuelt oder linear sein, ist aber vorzugsweise supergeknäuelt. Die Kassette kann für längere Zeit oder vorübergehend in der Wirtszelle gehalten werden, im Allgemeinen aber nur vorübergehend. Eine stabile Erhaltung wird erreicht, indem die Sequenzen, welche die Integration und/oder Erhaltung bereitstellen, wie z.B. retrovirale Vektoren, EBV-Vektoren und dergleichen, inkludiert werden.
Die Expressionskassette weist im Allgemeinen eine exogene Transkriptionsinitiationsregion auf, d.h. einen anderen Promotor als den Promotor, der mit dem T-Zell-Rezeptor im normalerweise vorkommenden Chromosom assoziiert ist. Der Promotor ist in Wirtszellen funktionell, insbesondere in Wirtszellen, die das Ziel der Kassette darstellen. Der Promotor kann durch Rekombinationsverfahren in vitro oder als Ergebnis von homologer Integration der Sequenz durch eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden. Der Promotor ist operabel an die kodierende Sequenz des Autoantigens gebunden, um ein translatierbares mRNA-Transkript zu produzieren. Expressionsvektoren weisen am besten Restriktionsstellen auf, die sich nahe der Promotorsequenz befinden, um die Insertion von Autoantigensequenzen zu erleichtern.
Expressionskassetten werden hergestellt, die eine Transkriptionsinitiationsregion, die konstitutiv oder induzierbar sein kann, das für die Autoantigensequenz kodierende Gen und eine Transkriptionsterminationsregion umfassen. Die Expressionskassetten können in verschiedene Vektoren eingeführt werden. Promotoren von Interesse können induzierbar oder konstitutiv sein, sind aber üblicherweise konstitutiv, und stellen höhere Transkriptionswerte in den die Vakzine empfangenden Zellen bereit. Der Promotor kann nur im Rezipientenzelltyp aktiv sein oder in verschiedenen Zelltypen allgemein aktiv sein. Viele starke Promotoren für Säugetierzellen sind auf dem Ge biet der Erfindung bekannt, einschließlich des β-Actin-Promotors, der frühen und späten SV40-Promotoren, des Immunglobulinpromotors, des menschlichen Zytomegalieviruspromotors, der retroviralen LTRs usw. Die Promotoren können mit Enhancer assoziiert sein oder auch nicht, wobei die Enhancer von Natur aus mit dem jeweiligen Promotor oder mit einem anderen Promotor assoziiert sein können.
Eine Terminationsregion ist 3' zur kodierenden Region bereitgestellt, wobei die Terminationsregion von Natur aus mit der Domäne der variablen Region assoziiert sein kann oder von einer anderen Quelle stammen kann. Verschiedenste Terminationsregionen können eingesetzt werden, ohne die Expression zu beeinträchtigen.
Die verschiedenen Manipulationen können in vitro oder in einem geeigneten Wirt durchgeführt werden, wie z.B. E. coli. Nach jeder Manipulation kann das resultierende Konstrukt kloniert, der Vektor isoliert und die DNA gescreent oder sequenziert werden, um die Korrektheit des Konstrukts zu bestätigen. Die Sequenz kann durch Restriktionsanalysen, Sequenzierung oder dergleichen gescreent werden.
Eine kleine Zahl von Nucleotiden kann am Terminus der Autoantigensequenz insertiert werden, üblicherweise nicht mehr als 20, noch bevorzugter nicht mehr als 15. Die Deletion oder Insertion von Nucleotiden ist im Allgemeinen das Ergebnis der Notwendigkeiten der Konstruktion, wobei für geeignete Restriktionsstellen, die Addition von Verarbeitungssignalen, leichte Manipulation, Verbesserung der Expressionswerte oder dergleichen gesorgt wird. Außerdem können eine oder mehrere Aminosäuren aus den gleichen Gründen durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, wobei üblicherweise nicht mehr als etwa fünf Aminosäuren in der Region substituiert werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Autoantigen mit DNA-Sequenzen co-geimpft, die für ein Th2-Zytokin kodieren, wobei die Gruppe IL-4, IL-10, TGF-β usw. umfasst. IL4 ist von besonderem Interesse. Das Lymphokin IL-4 weist eine T-Zellen- und Mastzellenwachstumsfaktoraktivitäten auf. Menschliches IL4 ist ein 18- kD-Glykoprotein. Zum besseren Verständnis ist die Aminosäuresequenz hierin als Seq.-ID Nr. 13 angeführt und die DNA-Sequenz als Seq.-ID Nr. 14 (Yokota et al., P.N.A.S. 83, 5894–5898 (1986)). Diese Sequenz ist die bevorzugte Sequenz der Erfindung. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung dieser Sequenz in Konstrukten der Erfindung eingeschränkt. Auch eng verwandte Sequenzvarianten mit der gleichen biologischen Aktivität oder einer im Wesentlichen ähnlichen biologischen Aktivität können verwendet werden. Eine spezifische STAT6-DNA-Bindungszielstelle findet sich im Promotor des IL4-Rezeptorgens; und STAT6 aktiviert die IL4-Genexpression über diese Stelle. Interferone hemmen eine IL4-induzierte Aktivierung von STAT6 und STAT6-abhängiger Genexpression, zumindest teilweise, durch Induktion der Expression von SOCS1 (siehe Kotanides et al., J. Biol. Chem. 271, 25555–25561 (1996)).
Sequenzvarianten kodieren für Proteinuntereinheiten, die, wenn sie in einem DNA-Konstrukt der Erfindung vorhanden sind, dem Protein eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften von IL4 verleihen, wie oben beschrieben ist. DNA-Sequenzen der Erfindung können sich von einer nativen IL4-Sequenz durch Deletion, Insertion oder Substitution eines oder mehrer Nucleotide unterscheiden, solange sie für ein Protein mit der geeigneten biologischen Aktivität kodieren, wie oben beschrieben ist. Auf ähnliche Weise können sie trunkiert oder um ein oder mehr Nucleotide verlängert sein. Alternativ dazu können DNA-Sequenzen, die für die Umsetzung der Erfindung geeignet sind, degenerierte Sequenzen sein, die für das natürlich vorkommende IL4-Protein kodieren. Typischerweise weisen DNA-Sequenzen der Erfindung zumindest 70%, zumindest 80%, zumindest 90%, zumindest 95% oder zumindest 99% Sequenzidentität mit einer für natives IL4 kodierenden Sequenz auf. Sie können von beliebigen Spezies stammen, obwohl DNAs, die für menschliche Proteine kodieren, bevorzugt sind. Sequenzvarianten können mithilfe beliebiger auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel hergestellt werden.
Im Hinblick auf Substitutionen sind konservative Substitutionen bevorzugt. Typischerweise sind konservative Substitutionen solche, bei denen die substituierte Aminosäure von ähnlicher Art ist wie die im natürlich vorkommenden Protein, beispiels weise in Bezug auf die Ladung und/oder Größe und/oder Polarität und/oder Hydrophobizität. Auf ähnliche Weise weisen konservative Substitutionen typischerweise geringe oder keine Wirkung auf die Aktivität des Proteins auf. Proteine der Erfindung, deren Sequenz sich von der von natürlich vorkommendem IL4 unterscheidet, können so konstruiert werden, dass sich ihre Aktivität von der von natürlich vorkommendem IL4 unterscheidet. Solche Manipulationen werden typischerweise auf Nucleinsäureebene und unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Rekombinationsverfahren durchgeführt.
Die Vakzine kann mit einer oder mit einer Mischung von Autoantigensequenzen formuliert werden, die auf dem gleichen oder auf unterschiedlichen Vektoren vorhanden sein können. Die DNA-Vektoren werden in einem physiologisch annehmbaren Puffer, im Allgemeinen einer wässrigen Lösung, z.B. einer normalen Kochsalzlösung, phosphatgepufferten Kochsalzlösung, Wasser usw., suspendiert. Stabilisierungsmittel, Benetzungs- und Emulgiermittel, Salze zur Variation des osmotischen Drucks oder Puffer zur Sicherung eines geeigneten pH-Werts sowie Hautpenetrationsförderer können als Hilfsmittel verwendet werden. Die DNA ist üblicherweise in einer Konzentration von zumindest etwa 1 ng/ml und nicht mehr als etwa 10 mg/ml, üblicherweise etwa 100 μg bis 1 mg/ml, vorhanden.
In manchen Ausführungsformen der Erfindung wird dem Patienten sowohl eine für ein Autoantigen kodierende Sequenz als auch eine für ein Th2-Zytokin kodierende Sequenz verabreicht. Das Zytokin und Autoantigen können gleichzeitig oder innerhalb einer kurzen Zeitspanne auf dem gleichen Weg oder auf unterschiedlichen Wegen verabreicht werden. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die beiden Sequenzen co-formuliert, d.h. dass sie gemeinsam als Teile einer einzelnen Zusammensetzung verabreicht werden. Die kodierenden Sequenzen können durch eine kovalente Bindung in einem einzelnen Nucleinsäuremolekül miteinander assoziiert sein, wo sie als zwei separate kodierende Sequenzen vorhanden sein können, die durch einen Translationsstopp getrennt sind, oder als einzelnes Fusionsprotein. Die beiden Sequenzen können auch durch eine nicht kovalente Wechselwirkung, wie z.B. eine hydrophobe Wechselwirkung, Wasserstoffbrückenbindung, ionische Wech selwirkung, Van-der-Waals-Wechselwirkung, magnetische Wechselwirkung oder Kombinationen daraus, verbunden sein. Alternativ dazu können die beiden Konstrukte einfach in einer gemeinsamen Suspension vermischt sein oder zusammen in einer Form von Verabreichungsvorrichtung, wie z.B. einer Alginatvorrichtung, einem Liposom, einem Chitosanvesikel usw., eingekapselt sein (siehe z.B. WO 98/33520).
Die Vakzine kann in zwei oder mehrere Dosen fraktioniert sein, die zumindest etwa 1 μg, noch bevorzugter zumindest etwa 100 μg, insbesondere zumindest etwa 1 mg, pro Dosis enthalten und in einem Abstand von 4 Tagen bis zu einer Woche verabreicht werden. In manchen Ausführungsformen der Erfindung wird der Patient einer Reihe von Impfungen unterzogen, um eine volle, umfassende Immunantwort zu erzeugen. Gemäß diesem Verfahren werden zumindest zwei und vorzugsweise vier Injektionen in einem bestimmten Zeitraum verabreicht. Der Zeitraum zwischen den Injektionen kann von 24 Stunden bis zu zwei Wochen oder länger betragen, ist jedoch vorzugsweise eine Woche. Alternativ dazu können zumindest zwei und bis zu vier separate Injektionen gleichzeitig an verschiedenen Körperstellen verabreicht werden.
Die DNA-Vakzine wird in einen Muskel oder ein anderes Gewebe verabreicht, und zwar subkutan, intradermal, intravenös, oral oder direkt in die Spinalflüssigkeit. Von besonderem Interesse ist die Injektion in einen Skelettmuskel. Die genetische Vakzine kann dem zu immunisierenden Patienten direkt injiziert werden oder ex vivo in Zellen, die dem Patienten entnommen wurden und nach der Verabreichung wieder implantiert werden. Bei beiden Wegen wird das genetische Material in Zellen eingeführt, die im Körper des Patienten vorhanden sind. Alternativ dazu kann die genetische Vakzine auch mithilfe verschiedener Mittel in Zellen eingeführt werden, die dem Patienten entnommen wurden. Solche Mittel umfassen beispielsweise Transfektion, Elektroporation und Mikroprojektilbeschuss. Nachdem das genetische Konstrukt von den Zellen aufgenommen wurde, werden sie dem Patienten wieder implantiert. Sonst nicht immunogene Zellen, in die genetische Konstrukte inkorporiert wurden, können einem Patienten entnommen und einem anderen implantiert werden.
Ein Beispiel für eine intramuskuläre Injektion findet sich in Wolff et al., Science 247, 1485–1468 (1990). Jet-Injektion kann ebenfalls für die intramuskuläre Verabreichung eingesetzt werden, wie von Furth et al., Anal. Biochem. 205, 365–368 (1992), beschrieben wurde. Die DNA kann auf Goldmikropartikel aufgebracht und mithilfe einer Partikelschussvorrichtung oder "Genkanone" intradermal verabreicht werden. Die Mikropartikel-DNA-Impfung wurde in der Literatur beschrieben (siehe beispielsweise Tang et al., Nature 356, 152–154 (1992)). Goldmikroprojektile werden mit der Vakzinenkassette überzogen und dann auf Hautzellen geschossen.
Die genetischen Vakzinen werden gemäß dem verwendeten Verabreichungsmodus formuliert. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können leicht eine genetische Vakzine formulieren, die ein genetisches Konstrukt umfasst. In Fällen, in denen die intramuskuläre Injektion der Verabreichungsmodus der Wahl ist, wird eine isotonische Formulierung verwendet. Im Allgemeinen können Isotonizitätsadditive Natriumchlorid, Dextrose, Mannit, Sorbit und Lactose umfassen. Isotonische Lösungen, wie z.B. phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, sind bevorzugt. Stabilisatoren umfassen Gelatine und Albumin.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Zellen vor oder gleichzeitig mit der Verabreichung des genetische Konstrukts ein Zellstimulations- oder Zellproliferationsmittel verabreicht werden, wobei diese Begriffe austauschbar verwendet werden und sich auf Verbindungen beziehen, welche die Zellteilung stimulieren und die Aufnahme von DNA und RNA erleichtern.
Bupivacain oder Verbindungen mit funktioneller Ähnlichkeit können vor oder gleichzeitig mit der Vakzine verabreicht werden. Bupivacain ist ein Homolog von Mepivacain und mit Lidocain verwandt. Es macht Muskelgewebe spannungsempfindlich gegenüber Natriumprovokation und wirkt sich auf die Ionenkonzentration in den Zellen aus. Neben Bupivacain, Mepivacain, Lidocain und anderen ähnlich wirkenden Verbindungen umfassen weitere mögliche Zellstimulationsmittel Lectine, Wachstumsfaktoren, Zytokine und Lymphokine, wie z.B. der aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktor (PDGF), gCSF, gMCSF, den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und IL-4. Etwa 50 μl bis etwa 2 ml 0,5% Bupivacain-HCl und 0,1% Methylparaben in einem isotonischen pharmazeutischen Träger können an der Stelle verabreicht werden, an der die Vakzine verabreicht werden soll, vorzugsweise 50 μl bis etwa 1500 μl, noch bevorzugter etwa 1 ml. Die genetische Vakzine kann auch mit Kollagen als Emulsion kombiniert und intraperitoneal verabreicht werden. Die Kollagenemulsion stellt ein Mittel zur Depotabgabe von DNA bereit. 50 μl bis 2 ml Kollagen werden verwendet.
Die Wirksamkeit einer DNA-Impfung kann durch Injektion eines Kardiotoxins in das Gewebe etwa eine Woche vor der Impfung verbessert werden, wie von Davis et al., FEBS Lett. 333, 146–150 (1993), und in den Beispielen beschrieben ist. Das Kardiotoxin stimuliert Muskeldegeneration und -regeneration. In den Muskel werden etwa 0,1 bis 10 μM Kardiotoxin injiziert, das in einem pharmakologisch annehmbaren Vehikel gelöst ist.
Das Leiden, das behandelt wird, und der Immunstatus des Wirts sind entscheidend für die Wahl der Autoantigensequenz(en). Die Immunreaktionsbereitschaft des Wirts auf ein mögliches Vakzinenautoantigen kann durch verschiedene auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verwendung beurteilt werden.
Die Diagnose kann den Reaktivitätswert bestimmen, z.B. basierend auf der Anzahl an reaktiven T-Zellen in einer Probe, im Vergleich zu einer negativen Kontrolle von einem naiven Wirten oder aufgrund von einer standardisierten Datenkurve von einem oder mehreren Patienten. Neben der Detektion der qualitativen und quantitativen Gegenwart von Autoantigen-reaktiven T-Zellen ist auch eine Einteilung der T-Zellen nach der Expression von Zytokinen möglich, die bekannterweise Entzündungsreaktionen fördern oder unterdrücken. Außerdem mag es wünschenswert sein, die epitopische Spezifität der reaktiven T-Zellen einzuteilen.
T-Zellen können aus dem peripheren Blut, den Lymphknoten oder vorzugsweise von der Entzündungsstelle des Patienten isoliert werden. Reaktivitätstests können an primären T-Zellen durchgeführt werden, oder die Zellen können fusioniert werden, um Hybridome zu erzeugen. Solche reaktiven T-Zellen können auch für eine weitere Analyse des Verlaufs der Krankheit verwendet werden, indem ihre In-situ-Lage, die T-Zellen-Rezeptornutzung usw. überwacht werden. Tests zur Überwachung der T-Zellen-Reaktionsbereitschaft sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen Proliferationstests und Zytokinfreisetzungstests.
Proliferationstests messen das Ausmaß der T-Zellen-Proliferation als Reaktion auf ein spezifisches Antigen und sind auf dem Gebiet der Erfindung weit verbreitet. In einem exemplarischen Test werden Zellen von einem Lymphknoten, vom Blut oder von der Milz des Patienten erhalten. Eine Suspension von etwa 10⁴ bis 10⁷ Zellen, üblicherweise von etwa 10⁵ bis 10⁶ Zellen, wird hergestellt und gewaschen, dann in Gegenwart eines Kontrollantigens und von Testantigenen kultiviert. Die Testantigene können Peptide von beliebigen autologen Antigenen sein, von denen vermutet wird, dass sie eine entzündliche T-Zellen-Antwort auslösen. Die Zellen werden üblicherweise einige Tage lang kultiviert. Die antigeninduzierte Proliferation wird beurteilt, indem die Synthese von DNA durch die Kulturen überwacht wird, z.B. die Inkorporation von ³H-Thymidin während der letzten 18 h der Kultivierung.
Enzymgekoppelte Immunabsorptionsbestimmungen (ELISA) werden verwendet, um das Zytokinprofil von reaktiven T-Zellen zu bestimmen, und sie können verwendet werden, um die Expression von Zytokinen, wie z.B. IL-2, IL-4, IL-5, γIFN usw., zu überwachen. Die Einfangantikörper können beliebige Antikörper sein, die für ein Zytokin von Interesse spezifisch sind, wobei am besten Überstände der T-Zellen-Proliferationstests, wie sie oben beschrieben sind, als Antigenquelle verwendet werden. Nach dem Blockieren und Waschen werden markierte Detektorantikörper zugesetzt und die vorhandenen Proteinkonzentrationen als Funktion der Markierung bestimmt, die gebunden ist.
Die oben genannten Diagnosetests können mit unterschiedlichen Peptiden durchgeführt werden, die vom autologen Protein von Interesse stammen. Eine Reihe von Peptiden mit der Sequenz eines Autoantigens, z.B. PLP, MBP usw., können verwen det werden. Mögliche Peptide können gescreent werden, um zu bestimmen, welche im Zusammenhang mit der Autoimmunerkrankung immunodominant sind.
Die immunodominanten Peptide können durch Screenen mit einem Panel von Peptiden vom Testprotein definiert werden. Die Peptide weisen die Aminosäuresequenz eines Teils des Proteins auf, üblicherweise zumindest etwa 8 und nicht mehr als etwa 30 Aminosäuren, noch bevorzugter nicht mehr als etwa 20 Aminosäuren, lang. Das Panel von Peptiden repräsentiert die Länge der Proteinsequenz, d.h. alle Reste, die in zumindest einem Peptid vorhanden sind. Vorzugsweise werden überlappende Peptide erzeugt, wobei jedes Peptid um 1 bis 5 Aminosäuren rasterverschoben ist, sodass ein kompletteres Set von Epitopen erzeugt wird. Die Peptide können anfangs in Pools gescreent werden und später auf das genaue Epitop, auf das die T-Zelle reagiert, wie oben beschrieben ist. Immunodominante Peptide werden durch eine signifikante Fraktion der HLA-restringierten, reagierenden Hybridome erkannt, üblicherweise zumindest etwa 10%, noch bevorzugter zumindest etwa 25%, sogar bis zu 80%.
Die vorliegende Therapie wird wünschenswerterweise während der präsymptomatischen oder präklinischen Phase der Krankheit durchgeführt und in manchen Fällen während der symptomatischen Phase der Krankheit. Eine frühe Behandlung ist bevorzugt, um einen Funktionsverlust in Zusammenhang mit Gewebeschäden durch die Entzündung zu verhindern. Die präsymptomatische oder präklinische Phase ist als Zeitraum definiert, der nicht nach der T-Zellen-Involvierung an der Stelle der Erkrankung, d.h. Langerhanssche Inseln, Synovialgewebe, Schilddrüsen, liegt, in dem der Funktionsverlust aber noch nicht so stark ist, dass klinische Symptome auftreten, die auf eine ausgebrochene Erkrankung hinweisen. Die T-Zellen-Involvierung kann durch die Gegenwart einer erhöhten Anzahl von T-Zellen an der erkrankten Stelle, die Gegenwart von für Autoantigene spezifischen T-Zellen, die Freisetzung von Perforinen und Granzymen an der erkrankten Stelle, eine Reaktion auf die immunsuppressive Therapie usw. belegt werden.
Eine quantitative Zunahme an autoreaktiven Mylein-T-Zellen mit der Fähigkeit, IFNγ zu sekretieren, hängt mit der Pathogenese von MS und EAE zusammen, was vermuten lässt, dass Autoimmuninduktoren/Helfer-T-Lymphozyten im peripheren Blut von MS-Patienten den Demyelinisierungsprozess in Patienten mit MS initiieren und/oder regulieren können. Der Ausbruch der Krankheit bringt Muskelschwäche, Verlust von Abdomenreflexen, Sehvermögens-Defekte und Paresthesie mit sich. Während der präsymptomatischen Phase findet eine Infiltration von Leukozyten in die Zerebrospinalflüssigkeit, eine Entzündung und eine Demyelinisation statt. Familienanamnesen und die Gegenwart des HLA-Haplotyps DRB1*1501, DQA1*0102, DQB1*0602 weisen auf eine Anfälligkeit für die Krankheit hin. Marker, die für das Fortschreiten der Krankheit überwacht werden können, sind die Gegenwart von Antikörpern in der Zerebrospinalflüssigkeit, "evozierte Potentiale", die durch Elektroenzephalographie in der Sehrinde und im Hirnstamm sichtbar gemacht werden können, und die Gegenwart von Rückenmarksdefekten, die durch MRI oder Computertomographie erkennbar sind. Die Behandlung während der frühen Phasen der Erkrankung verlangsamt oder stoppt den weiteren Verlust der Nervenfunktion.
Säugetierspezies, die für Entzündungsleiden anfällig sind, umfassen Hunde und Katzen; Pferde; Rinder; Schafe; usw. sowie Primaten, insbesondere Menschen. Tiermodelle, insbesondere kleine Säugetiere, z.B. Mäuse, Hasenartige usw., können für experimentelle Untersuchenden eingesetzt werden. Tiermodelle von Interesse umfassen solche, in denen Antikörper mit Isotypen, die mit IL4-Produktion assoziiert sind, z.B. IgE, IgG1 und IgG4, produziert werden. Weitere Anwendungen umfassen Untersuchungen, bei denen eine spezifische Wirkung in Abwesenheit von T-Zellvermittelter Entzündung untersucht werden soll.
Es versteht sich, dass diese Erfindung nicht auf die beschriebenen speziellen Verfahren, Protokolle, Formulierungen und Reagenzien eingeschränkt ist, sondern natürlich auch variiert werden kann. Außerdem versteht sich, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich der Beschreibung von bestimmten Ausführungsformen dient und nicht den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränken soll, der nur durch die beiliegenden Ansprüche eingeschränkt ist.
Es gilt anzumerken, dass die Singularformen "ein/e" und "der/die/das" hierin und in den beiliegenden Ansprüchen auch die Mehrzahl umfassen, sofern nicht durch den Kontext klar das Gegenteil gegeben ist. Der Bezug auf "einen Komplex", beispielsweise, umfasst auch mehrere solcher Komplexe, und der Bezug auf "die Formulierung" umfasst eine oder mehrere Formulierungen und Äquivalente davon, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, usw.
Sofern nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Bezeichnungen hierin die gleiche Bedeutung, die von einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung, das zu dieser Erfindung gehört, gemeinhin verstanden wird. Obwohl auch Verfahren, Vorrichtungen und Materialien bei der Umsetzung oder beim Testen der Erfindung eingesetzt werden können, die den hierin beschriebenen ähneln oder äquivalent dazu sind, werden nachstehend bevorzugte Verfahren, Vorrichtungen und Materialien beschrieben.
Alle hierin erwähnten Veröffentlichungen werden zum Zwecke der Beschreibung und Offenbarung beispielsweise der Verfahren und Methoden erwähnt, die in den Veröffentlichungen beschrieben sind und in Zusammenhang mit der hierin beschriebenen Erfindung verwendet werden könnten. Die oben und im weiteren Text genannten Veröffentlichungen sind lediglich aufgrund ihrer Veröffentlichung vor dem Tag der Einreichung der vorliegenden Erfindung angeführt. Nichts hierin soll als Zugeständnis verstanden werden, dass die Erfinder nicht das Recht hätten, solch eine Offenbarung aufgrund einer früheren Erfindung zurückzudatieren.
Die nachstehenden Beispiele dienen dazu, Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung eine komplette Offenbarung und Beschreibung der Herstellung und Verwendung der vorliegenden Erfindung bereitzustellen, und nicht, um den Schutzumfang dessen, was als Erfindung betrachtet wird, einzuschränken. Es wurde versucht, alle Zahlen (z.B. Mengen, Temperatur, Konzentrationen usw.) mit größter Genauigkeit zu be handeln, was jedoch nicht ausschließt, dass es trotzdem zu experimentellen Fehlern und Abweichungen gekommen ist. Sofern nicht anders angegeben beziehen sich Teile auf Gewichtsteile, das Molekulargewicht steht für das mittlere Molekulargewicht, und der Druck liegt bei oder nahe atmosphärischem Druck.
EXPERIMENTELLER TEIL Materialien und Verfahren
Tiere: Sechs bis acht Wochen alte weibliche SJL/J-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) bezogen.
Antigene: Peptide wurden durch herkömmliche 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Chemie auf einem Peptid-Synthesegerät (Modell 9050: MilliGen, Burlington, MA, USA) synthetisiert. Peptide wurden durch HPLC gereinigt. Die Struktur wurde durch eine Aminosäureanalyse und Massenspektrometrie bestätigt. Die für die Versuche verwendeten Peptide waren: PLP139–151 (Seq.-ID Nr. 5 HSLGKWLGHPDKF), PLP139–151 L144/R147 (Seq.-ID Nr. 6 HSLGKLLGRPDKF) und PLP178–191 (Seq.-ID Nr. 6 NTWTTCQSIAFPSK). Ein Meerschweinchen-Rückenmarkhomogenat (SCH) wurde nach einer Gefriertrocknung verwendet.
PLP-Peptidexpressionsvektor: Drei Minigene, von denen jedes für ein PLP-Epitop kodierte, wurden durch Annealing von zwei Oligonucleotiden mit einer überlappenden komplementären 16-mer-Sequenz (unterstrichen) konstruiert und mit DNA-Polymerase und dNTPs verlängert.
Diese Oligonucleotidduplexe wurden so entworfen, dass sie Xho-1- und Xba-1-Restriktionsstellen enthielten.
Die Produkte wurden in die Mehrfachklonierungsregion des pTARGET-Vektors (Promega, Madison, WI, USA), einen Säugetierexpressionsvektor, der vom CMV-Promotor angetrieben wird, kloniert. Positive Klone wurden durch Farbscreenen identifiziert, und die korrekte Orientierung der Inserts wurde durch automatische DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Reinigung der Plasmid-DNA wurde mithilfe des Wizard plus Maxipreps (Promega) gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt.
DNA-Immunisierungs-Arbeitsvorschrift: Versuchstieren wurde in den linken Quadrizeps 0,1 ml 0,25% Bupivacain-HCl (Sigma, St. Louis, MO, USA) in PBS injiziert. Zwei und zehn Tage später wurde den Mäusen 0,05 ml Plasmid-DNA (1 mg/ml in PBS) in den gleichen Muskel injiziert.
ELISA für Anti-PLP139–151- oder Anti-Meerschweinchen-SCH-Antikörpertiter: Polystyrol-Mikrotiterplatten mit 96 Wells (Dynatech, Chantilly, VA, USA) wurden mit 0,1 ml Peptid oder Meerschweinchen-SCH beschichtet, das in PBS in einer Konzentration von 0,01 mg/ml in PBS verdünnt war. Nach dem Blockieren mit PBS + 0,5% fötalem Kälberserum (Gibco) und 0,05% Tween 20 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) wurden Mäuseseren zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, und die Antikörperbindung wurde durch den Zusatz von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-Anti-Mäuse-IgG (Southern Biotechnology, Birmingham, AL, USA) getestet. Nach dem Zusatz des Enzymsubstrats wurden die Platten bei 405 nm in einem ELISA-Lesegerät gelesen. 1 zeigt die Ergebnisse für Seren, die sieben Tage nach der zweiten intramuskulären Injektion entnommen wurden, ausgedrückt als O.D. einzelner Proben in einer Gruppe von zehn Tieren. O.D.-Werte für Präimmunseren waren: Verdünnung 1:10: 0,12; Verdünnung 1:20: 0,08; und Verdünnung 1:40: 0,03.
EAE-Induktion: Ein PLP139–151-Peptid wurde in PBS auf eine Konzentration von 2 mg/ml gelöst und mit einem gleichen Volumen inkomplettem Freundschem Adjuvans emulgiert, das mit 4 mg/ml durch Hitze abgetöteter Mycobakterientuberkulose-H37Ra (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) ergänzt war. Den Mäusen wurden subkutan 0,1 ml der Peptidemulsion injiziert und am gleichen Tag und 48 h später 0,1 ml 4 μg/ml Bordetella-pertussis-Toxin in PBS intravenös. Die Versuchstiere wurden wie folgt beurteilt: 0 = keine klinische Erkrankung; 1 = Schwanzschwäche oder -lähmung; 2 = Hinterbeinschwäche; 3 = Hinterbeinlähmung; 4 = Vorderbeinschwäche oder -lähmung; 5 = moribundes oder totes Tier.
Lymphknotenzellproliferationstest: Drainierende Lymphknoten wurden nach der akuten Phase einer Krankheit aus Mäusen entnommen, und Lymphknotenzellen (LNC) wurden in vitro auf spezifische proliferative Antworten auf das PLP139–151-Peptid getestet. Kulturen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Wells und flachem Boden in einem Volumen von 0,2 ml/Well und einer Zellkonzentration von 2,5 × 10⁶/ml hergestellt. Das Gewebekulturmedium für den Test bestand aus RPMI 1640, ergänzt mit L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), nichtessentiellen Aminosäuren (0,1 mM), Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (0,1 mg/ml), 2-Mercaptoethanol (5 × 10^–5 M) und 1% autologem frischem normalem Mäuseserum. Nach 72 h Inkubation bei 37°C wurden die Zellen 18 h lang mit 1 μCi/Well (³H)-Thymidin gepulst. Die Platten wurden abgeerntet, und die (³H)-Thymidin-Inkorporation wurde in einem Szintillationszähler gemessen. Nach der Erholung von der akuten Phase der Erkrankung wurden Tiere, denen DNA, die für PLP139–151 kodierte, oder der Kontrollvektor pTARGET injiziert worden war, getötet, und drainierende LNC wurden isoliert. Die Zellen wurden in vitro durch Stimulation mit unterschiedlichen Konzentrationen des Peptids PLP139–151 oder des Kontrollpeptids PLP178–191 getestet. Proliferative Antworten von gepoolten LNC von Gruppen aus. fünf Tieren sind in 2 als mittlere cpm ± Standardabweichung von drei Wells dargestellt. Die cpm von durch Concanavalin A (0,001 mg/ml) stimulierten LNC betrug 102401 für Gruppe A und 76702 für Gruppe B.
Zytokinbestimmung: Drainierende LNC (10⁷ Zellen/ml) von Versuchstieren wurden nach der akuten Phase der Erkrankung entnommen und in vitro mit unterschiedlichen Antigenkonzentrationen stimuliert. Nach 24 und 48 h Stimulation wurden Überstände gewonnen und durch Sandwich-ELISA getestet.
Ribonucleasenschutztest: Zur mRNA-Detektion wurden Gewebe-RNA-Proben von LNC von Versuchstieren unter Verwendung des "Multi-Probe RNase Protection Assay(RPA)"-Systems, RiboQuant (Pharmigen, San Diego, CA, USA) gemäß den Anleitungen des Herstellers getestet.
Fluorizytometrische Analyse: Milzzellen (5 × 10⁶/ml) von naiven SJL/J-Mäusen wurden bei 37°C in Gegenwart von Plasmid-DNA inkubiert, die für die PLP139–151-Sequenz kodierte (0,01 mg/ml). Nach 24 h wurden die Zellen gewonnen und auf einem FACScan-Durchflusszytometer (Becton Dickinson) analysiert. Die folgenden Antikörperkonjugate wurden verwendet: FITC-Antimäuse-CD80, Klon 16-10A1; FITC-Antimäuse-CD86, Klon GL1; FITC-Antimäuse-I-A^k, Klon 10–3.6; R-PE-konjugiertes Antimäuse-B220, Klon RA3-6B2; R-PE-konjugiertes Antimäuse-CD11b, Klon M1/70; PE-konjugierter Antimäuseklon GK1.5. Alle Antikörper wurden von Pharmigen, San Diego, CA, USA, bezogen. Nach 24 h In-vitro-Inkubation ohne DNA (keine) oder mit Plasmid-DNA, die für das PLP139–151-Peptid kodierte [DNA (PLP139–151)], wurden Milzzellen wie angegeben mit Anti-Mac-1-mAb, Anti-B220-mAb, Anti-B7.1-mAb und Anti-B7.2-mAb gefärbt. Leerwerte bezieht sich auf nicht-spezifische Hintergrundfärbung. Die in 4 dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für drei Versuche.
Ergebnisse
Das Minigen, das für das PLP139–151-Peptid kodierte, wurde in einen Expressionsvektor kloniert und zweimal mit einem Abstand von einer Woche intramuskulär in SJL/J-Mäuse injiziert. Zehn Tage nach der letzten Injektion wurde den Versuchstieren Blut abgenommen, und ihre Seren wurden auf die Gegenwart von spezifischen Antikörpern getestet. Wie in 1 dargestellt, können Anti-PLP139–151-IgG-Titer in den Mäusen detektiert werden, denen vorher das PLP139-151-Minigen injiziert worden war. Somit werden durch dieses spezielle Konstrukt spezifische serologische Immunantworten ausgelöst.
Um zu bestimmen, ob die Injektion von DNA-hältigen PLP-Sequenzen Mäuse vor EAE-Induktion schützen kann, wurde das PLP139–151-Minigenkonstrukt zweimal mit einem Abstand von einer Woche intramuskulär injiziert. Zehn Tage nach der letzten Injektion wurden die Mäuse mit dem PLP139–151-Peptid provoziert, das in CFA emulgiert worden war. Wie in Tabelle 1 dargestellt tritt in Tieren, die mit dem PLP139–151-Plasmidvektor geimpft worden waren, im Vergleich zur Kontrollplasmidgruppe eine Linderung der akuten klinischen Erkrankung auf. Der Ausbruch der Krankheit wurde im Vergleich zur Kontrollplasmidgruppe verzögert (11,5 ± 0,5 Tage, p < 0,008), die mittlere Schwere des Höhepunkts der Krankheit wurde verringert (p < 0,005), und der mittlere Krankheitswert wurde gesenkt (p < 0,0005). Außerdem wurde anderen Gruppen entweder a) ein Plasmid, das ein Minigen enthielt, das für den veränderten Peptidliganden PLP p139–151 kodierte (W144 > L, H147 > R), oder b) ein Plasmid, das ein Minigen enthielt, das für das PLP-Epitop p178–191 kodierte, injiziert. Der Ausbruch der Krankheit wurde mit dem Minigen, das für die veränderten Peptidliganden kodierte (W144, H147), verzögert (11,6 ± 0,5 Tage, p < 0,009), und der mittlere Krankheitshöhepunktswert wurde gesenkt (p < 0,02). Außerdem wurde der Ausbruch der Krankheit mit dem Minigen, das für das PLP-Peptid p178–191 kodierte, verzögert (11,5 ± 0,4 Tage, p < 0,003), die mittlere Schwere des Höhepunkts der Krankheit wurde verringert (p < 0,007), und der mittlere Krankheitswert wurde gesenkt (p < 0,0001). Tabelle 1 EAE-Induktion in DNA-immunisierten SJL/J-Mäusen

* Zahl in Klammer steht für kranke Tiere im Vergleich zu getesteten Tieren
✝ Mittelwerte sind Mittelwerte ± Standardabweichung
¶ Alle p-Werte sind Vergleiche zu pTARGET, bestimmt durch den Student-t-Test.

Mäuse, denen DNA injiziert worden war und die mit dem enzephalitogenen Peptid PLP139–151 provoziert worden waren, wurden nach Beendigung der akuten Phase der klinischen Erkrankung getötet. Drainierende LNC wurden in vitro mit dem PLP139–151-Peptid restimuliert und auf ihre proliferativen Antworten und die Zytokinproduktion getestet. 2 zeigt, dass LNC von Mäusen, denen für das PLP139–151-Peptid kodierende DNA injiziert worden war, geringere proliferative Antworten aufwiesen als LNC von Kontrolltieren (p < 0,01). 3(A) zeigt, dass bei Stimulierung mit PLP139–151 LNC von Mäusen, die mit der für die PLP139–151-Region kodierenden Plasmid-DNA immunisiert worden waren, weniger IL-3 und γ-Interferon sekretieren als Kontrollgruppen. Um die Werte der Zytokin-mRNA-Transkripte in entzündeten Gehirnen zu beurteilen, wurde ein Ribonucleasenschutztest an mRNA durchgeführt, die aus Gehirngewebe isoliert worden war. 3(B) zeigt in Mäusen, die mit dem für die PLP139–151-Region kodierenden Minigen immunisiert worden waren, eine Verringerung der mRNA-Werte von γ-Interferon und IL-15 auf. Daher besteht in mit der PLP139–151-DNA geimpften Mäusen eine klare Beziehung zwischen einen geringem Auftreten einer klinischen Erkrankung, verringerten zellulären Antworten und geringen Werten von IL-2, IL-15 und γ-Interferon. Die relativen Expressionswerte von Zytokin-mRNA-Banden in 3B wurde durch Densitometrie gemessen. Um die Beladungsunterschiede zu korrigieren, wurden die Werte in jeder Probe gemäß den Expressionswerten des Haushaltsgens GAPDH normalisiert. Es besteht eine Verringerung des Expressionswerts für die getesteten Zytokine in Gehirnen von Mäusen, die mit der für die PLP139–151-Determinante kodierenden Plasmid-DNA geimpft worden waren, im Vergleich zu mit pTARGET und PLP139–151-(L/R)Plasmid-DNA geimpften Mäusen.
Um einen Mechanismus für verringerte T-Zell-Antworten zu entwickeln, wurde in vitro die Wirkung von APCs, die in Gegenwart von DNA kultiviert worden waren, auf die proliferativen Antworten von PLP139–151-spezifischen T-Zellen getestet. Splenozyten wurden entweder mit Plasmid-DNA inkubiert, die für das PLP139–151-Segment kodierte, oder mit dem PLP139–151-Peptid und als APC-Quelle zur Stimulation von L139-Zellen, einer PLP139–151-spezifischen T-Zelllinie, verwendet. Proliferative Antworten der L139-T-Zelllinie auf die oben genannten APCs wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von Anti-CD28-Antikörper-beschichteten Kügelchen verglichen. Wie in Tabelle 2 zu sehen ist, reagierten L139-Zellen auf syngene APCs, die mit dem synthetischen Peptid PLP139–151 vorinkubiert worden waren [8512 mittlere cpm]. Diese Antwort wird durch den Zusatz von Anti-CD28-Antikörpern gesteigert [127281 mittlere cpm]. Wenn jedoch die APCs mit der Plasmid-DNA inkubiert wurden, die die für PLP139–151 kodierende Sequenz enthielt, waren die L139-Zellen unfähig, auf APCs zu reagieren [3358 mittlere cpm], auch in Gegenwart von Anti-CD28-Antikörpern [4532 mittlere cpm]. Diese Herabregulierung war keine Wirkung des Plasmids selbst, da APCs, die mit einem Plasmid inkubiert worden waren, das eine irrelevante Sequenz enthielt, sich nicht auf die proliferative Antwort von L139-Zellen auf Anti-CD28-Antikörper auswirkte [4532 cpm im Vergleich zu 26363 mittlere cpm, p < 0,0001]. Daher sind PLP139–151-spezifische T-Zellen nicht in der Lage, auf CD28-Co-Stimulierung zur reagieren, wenn sie in Gegenwart von mit für die PLP139–151-Sequenz kodierender Plasmid-DNA beladenen ACP kultiviert werden. Tabelle 2 Proliferative Antworten von PLP139–151-spezifischen T-Zelllinien in Gegenwart von syngenen Splenozyten, entweder mit Plasmid-DNA oder einem synthetischen Peptid beladen

¹ Splenozyten (5 × 10°/ml) von naiven SJL/J-Mäusen wurden bestrahlt (3000 rd) und in Gegenwart von entweder für die PLP139–151-Sequenz kodierender Plasmid-DNA, einem Plasmid alleine (pTARGET), einem PLP139–151-Peptid oder einem Kontrollpeptid (HSV VP16) inkubiert. Die Plasmid-DNA-Konzentration betrug 0,01 mg/ml und die Peptidkonzentration 0,001 mg/ml. Nach den ersten 24 h Inkubation wurden die Splenozyten zweimal gewaschen, und 10.000 T-Zellen von der PLP139–151-Peptidspezifischen T-Zelllinie L139 wurden zu jedem Well zugesetzt. Nach weiteren 48 h Inkubation wurde die Platte mit ³H-Thymidin markiert, und die Proliferation wurde durch Ernten 18 später und Zählen der ³H-Thymidininkorporation bestimmt. Um zu zeigen, dass exogen angewandte nackte DNA durch die Splenozyten aufgenommen und exprimiert wird, wurde ein Umkehrtranskriptase-Polymerasekettenreaktions-(RT-PCR-)Verfahren verwendet. Die gesamte RNA wurde unter Verwendung des Sets "Rneasey Total RNA" (Quiagen Inc., Valencia, CA, USA) von den Splenozyten gereinigt. Die RT-PCR wurde unter Verwendung des "Access RT-PCR"-Systems (Promega Corp., Madison, WI, USA) und der für das PLP139–151-Minigen spezifischen Oligonucleotidprimer durchgeführt. Vektorspezifische Primer wurden in einer separaten RT-PCR-Reaktion verwendet, um die Möglichkeit einer DNA-Kontamination auszuschließen. Eine einzelne Bande, die dem PLP139–151-Minigen entspricht, wurde von gesamter RNA, die von Splenozyten gereinigt worden war, die mit der PLP139–151-Plasmid-DNA beladen waren, amplifiziert (Daten nicht angeführt).
²Co-Stimulationssignal wurde erzeugt, indem Anti-CD28-beschichtete Kügelchen (5.000 pro Well) zusammen mit den T-Zellen zugesetzt wurden. Ein Anti-CD28-Antikörper (Klon 37.51) wurde von PharMingen (San Diego, CA, USA) erhalten. Sulfatpoylstyrollatexmikrokügelchen mit einem Durchmesser von 5 0,1 μm wurden von Interfacial Dynamics Corporation (Portland, OR, USA) erhalten. Kügelchen (6 × 10⁶) wurden in 6 ml PBS suspendiert und mit 24 μg Anti-CD28-Antikörper 1,5 h lang bei 37°C inkubiert. Die Kügelchen wurden gründlich mit PBS gewaschen und in RPMI-10% FCS resuspendiert und zumindest 30 min lang bei Raumtemperatur blockieren gelassen.
³ Ergebnisse sind als mittlere cpm von drei Wells angegeben.
* Der p-Wert ist < 0,0001 für den Unterschied zwischen den cpm von T-Zellen, die in Gegenwart von Splenozyten mit pTARGET-Plasmid-DNA inkubiert wurden, und T-Zellen, die in Gegenwart von Splenozyten mit PLP139–151-Plasmid-DNA inkubiert wurden, in Gegenwart von Anti-CD28-Antikörpern.

Die vorliegende Untersuchung demonstriert den Schutz einer Immunisierung mit für Myelinminigene kodierender Plasmid-DNA. Eine DNA-Vakzine wurde durch Insertion der für die PLP139–151-Region kodierenden Sequenz in ein bakterielles Plasmid unter Kontrolle eines CMV-Promotors geschaffen. Dieser Vektor wurde vor der Induktion von EAE durch Immunisierung mit dem PLP139–151-Peptid in CFA in SJL/J-Mäuse injiziert. Tiere, die das für das enzephalitogene Epitop kodierende Plasmid erhielten, waren vor der Induktion von EAE geschützt. Eine Analyse der Immunantworten in geschützten Tieren zeigt im Vergleich zur Kontrollgruppe eine geringere T-Zell-Proliferation und verringerte Sekretion von entzündungsfördernden Zytokinen auf, sowohl in lymphoiden Organen als auch im Zielorgan, dem Gehirn. Diese Merkmale lassen vermuten, dass eine DNA-Immunisierung pathogene T-Zellen anergisch macht.
Die Fähigkeit von Myelinminigenkonstrukten, die co-stimulierende Wirkung von Anti-CD28-Antikörpern auf eine PLP-spezifische T-Zelllinie herabzuregulieren, unterstreicht ihre Fähigkeit, APC-T-Zell-Wechselwirkungen zu modulieren. Fluorizytometrische Analysen wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob DNA-Immunisierung sich auf die Oberflächenexpression von CD28-Liganden auf APCs auswirkt. Nach 24 h Inkubation mit der Plasmid-DNA wurden Splenozyten mit entweder Anti-B7.1-(CD80) oder Anti-B7.2-(CD86)Antikörpern gefärbt. Wie in 4 dargestellt ist tritt eine Hochregulierung von B7.1 und B7.2 in Mac-1-positiven Zellen auf, nicht aber in B220⁺-Zellen, wo eine Herabregulierung von B7.2 beobachtet wurde. I-A^S-Expression in Milzzellen stieg bei Inkubation mit DNA ebenfalls sowohl in Mac-1- als auch B220-positiven Zellen.
Eine ähnliche Hochregulierung von co-stimulierenden Molekülen wurde in vivo in Lymphozyten des peripheren Bluts und in Milzzellen von Tieren beobachtet, die mit DNA-Expressionskassetten inokuliert wurden, die für das HIV-Kernprotein 55 kodierten. Im Gegensatz zu dieser Beobachtung fanden die Erfinder heraus, dass bei Autoimmunantworten auf PLP139–151 die Änderung der Expression von co-stimulierenden Molekülen nach einer DNA-Immunisierung durch Modulation des proliferativen Potentials und der Zytokinproduktion von autoreaktiven T-Zellen eine Schutzwirkung ausübt. Vor kurzem wurde berichtet, dass bei EAE eine Verstärkung der B7.1-Expression im Vergleich zu B7.2 in der Milzumgebung stattfindet, eine Erkenntnis, die dazu beitragen kann, zu erklären, wie das Immunsystem zu Autoimmunität neigt und nicht zu immunologischer Ignoranz von sich selbst. Interessanterweise steigt B7.2 im ZNS während aktiver EAE und Rückfällen. Eine Herabregulierung von B7.2 hängt mit Remission zusammen. Veränderung in der B7-1- und B7-2-Expression bei der Aufnahme von DNA durch antigenpräsentierende Zellen könnte ein Schlüsselfaktor bei der Regulierung von T-Zell-Antworten in Richtung Selbstantigene bei Autoimmunerkrankungen sein.
DNA-Vakzinen waren bei der Erzeugung von schützenden Immunantworten in verschiedenen Modellen von Krebs und von viralen, bakteriellen und parasitären Infektionen effektiv. Obwohl die Erzeugung von Th1-ähnlichen Antworten eine Eigenschaft von DNA-Vakzinen sein kann, die auf nicht eigene Antigene ausgerichtet sind, wurden durch DNA-Impfung keine gegen sich selbst gerichteten Th1-Antworten erreicht.
Biologische Wirkungen von DNA-Motiven, wie z.B. unmethylierten CpG-Dinucleotiden in bestimmten Basenkontexten (CpG-S-Motive), können angeborene Immunantworten modulieren, wenn sie Tieren injiziert werden (A. M. Krieg et al., Trends in Microbiol. 6, 23–27 (1998)). Obwohl die Erfinder eine mögliche Wirkung solcher Sequenzen in den PLP-139–151- und PLP139/151-(L/R)-Konstrukten nicht ausschließen können, erfüllen die CG-Motive in diesen Inserts nicht alle Kriterien für ein CpG-S-Motiv.
Von der Suppression von EAE in Lewis-Ratten durch vorherige Immunisierung mit DNA, die für ein immunodominantes MBP-Peptid kodierte, zusammen mit einem IgG-Fc-Rezeptor wurde berichtet. Die Impfung unterdrückte klinische und histopathologische Zeichen von EAE und verringerte die Interferon-γ-Produktion nach einer Provokation mit einem MBP-68–85-Peptid (Lobell et al., J. Exp. Med. 187, 1543–1548 (1998)). Die Impfung war nicht erfolgreich, wenn kein Tandem-IgG-Fc-Konstrukt verwendet wurde. In den hierin angeführten Versuchen bestand offensichtlich kein Bedarf an Tandemkonstrukten zusammen mit dem Myelinminigen. Sowohl in der vorliegenden Erfindung als auch in den Versuchen unter Verwendung von DNA mit dem Fc-IgG-Konstrukt wurde eine mangelhafte Th1-Immunität gegen sich selbst beobachtet. Im Gegensatz dazu berichtete das Labor der Erfinder von der Induktion von schützenden Antworten vom Th2-Typ bei DNA-Immunisierung in EAE-Fällen (Waismann (1996), w.o.). Daher kann sich die Immunantwort auf eine DNA-Vakzine, die für sich selbst kodiert, stark von der unterscheiden, die bei DNA-Impfung gegen fremde Antigene auftritt. Man könnte voraussagen, dass Immunantworten, die durch Selbst-Antigene ausgelöst werden, für die DNA-Vakzinen kodieren, ähnlich verlaufen wie die Immunisierung mit dem gleichen Selbst-Antigen in Peptid- oder Proteinform. Die Ergebnisse der Erfinder lassen vermuten, dass ein Selbst-Antigen, für das ein DNA-Vektor kodiert, eigenreaktive T-Zellen anergisch machen kann und einen Autoimmunangriff verhindern kann. Eine Co-Stimulierung von T-Zellen durch DNA, die für Selbst-Antigen kodiert, wird vermindert, wodurch pathogene T-Zellen geschwächt werden. Die Beobachtungen der Erfinder bei EAE lassen ein Modell vermuten, bei dem die DNA-Immunisierung zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung verwendet werden kann.
Beispiel 2
Schutz gegen Autoimmunerkrankungen mit einer Interleukin-4-DNA-Co-Vakzine durch Induktion von T-Helfer-2-Zellen und STAT6-Aktivierung
Das nachstehende Beispiel zeigt, dass eine Co-Impfung der Gene für das Zytokin IL4 zusammen mit dem Gen für PLP_139-151 als zwei separate Plasmide schützende Immunität gegen EAE bereitstellen kann. Außerdem wird ein Mechanismus vorgeschlagen, bei dem durch die DNA-Vakzine exprimiertes funktionelles IL4 lokal auf autoreaktive T-Zellen wirken kann, indem STAT6 aktiviert wird, um das Zytokinprofil zu einem Th2-Typ zu verlagern. Diese Ergebnisse zeigen die Entwicklung eines neuen Modells zu Behandlung von Autoimmunerkrankungen auf, das die antigenspezifischen Wirkungen der DNA-Impfung mit den vorteilhaften Wirkungen von lokaler Genverabreichung kombiniert.
Ergebnisse
Die IL4-DNA-Vakzine produziert ein IL4-Protein. Um die IL4-DNA-Vakzine herzustellen, wurde die gesamte für IL4 kodierende Sequenz durch PCR von Mäusemilz-cDNA amplifiziert. Dieses Gen wurde in den Säugetierexpressionsvektor pTargeT unter Steuerung des CMV-Promotors kloniert, und das Plasmid wurde wie in den Verfahren beschrieben gereinigt. Um zu demonstrieren, dass das IL4-cDNA-Konstrukt tatsächlich ein IL4-Protein voller Länge produzieren kann, wurde ein In-vitro-Translationssystem verwendet. Wenn das IL4-cDNA-Plasmid transkribiert und in vitro mit ³⁵S-Methionin translatiert und durch SDS-PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese) und Autoradiographie aufgelöst wurde, zeigte sich ein einzelnes Produkt mit der korrekten Größe für Mäuse-IL4. Eine Kontrollreaktion mit Vektor-DNA ohne Insert oder Plasmid, das für PLP_139-151 kodierte, ergab kein detektierbares Produkt. Das vorgegebene Molekulargewicht für PLP_139-151 beträgt etwa 1,5 kD und wäre deshalb sehr schwer durch Elektrophorese zu visualisieren.
Eine IL4-DNA-Impfung löst eine Aktivierung von STAT6 aus. Um zu demonstrieren, dass eine DNA-Vakzine als Genverabreichungsvehikel dienen kann, wollten die Erfinder die Frage beantworten, ob tatsächlich ein funktionelles IL4-Zytokin von der dem Tier verabreichten DNA-Vakzine exprimiert wurde. IL4 wirkt bekannterweise durch den IL4-Rezeptor, um spezifisch STAT6, ein Mitglieder der Signalumwandler und Aktivatoren der Transkriptionsfamilie, zu aktivieren (Takeda et al., Nature 380, 627–30 (1996); Quelle et al., Mol. Cell Biol. 15, 3336–43 (1995)).
Mäusen wurde intramuskulär einmal wöchentlich Plasmid-DNA verabreicht, die für die IL4-cDNA kodierte, wie in den Verfahren beschrieben ist. Drainierende Lymphknoten wurden eine Woche nach der letzten DNA-Vakzine dissektiert. Proteinlysate wurden von den Lymphknotenzellen isoliert und durch Western Blotting unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers, der für die phosphorylierte Form von STAT6 spezifisch war, auf die Gegenwart von aktiviertem STAT6 sondiert. Als Kontrollen wurde Mäusen außerdem ein pTargeT-Vektor alleine oder mit keiner DNA verabreicht. Aktiviertes oder phosphoryliertes STAT6 war nur in Lymphknoten von mit IL4-DNA geimpften Mäusen vorhanden. Das identifizierte phosphorylierte STAT6 läuft bei etwa 60 kD.
Identische Ergebnisse wurden in einem separaten Experiment erhalten, bei dem Mäuse dreimal täglich, und nicht einmal wöchentlich, Dosen der DNA-Vakzine erhielten. Die Mäuse wurden drei Tage lang täglich intramuskulär mit Plasmid-DNA geimpft. Einen Tag nach der letzten DNA-Vakzine wurden Proteinlysate von drainierenden Lymphknoten erhalten und wie oben in einem antiphosphorylierten STAT6-Western analysiert. Eine 60-kD-Bande war nur in Lymphknotenzellen von mit IL4-DNA geimpften Mäusen vorhanden.
Eine Co-Impfung mit für IL4 und das PLP_139-151-Minigen kodierender DNA schützt von EAE-Induktion. Um die Wirkung einer Modifikation des Schutzes, der durch DNA-Immunisierung mit dem für PLP_139-151 kodierenden Gen bereitgestellt wird, zu untersuchen, wurden Mäuse mit den Genen für IL4 und PLP_139-151 als zwei separate Plasmide co-geimpft. Das Mäuse-IL4-Gen wurde in den Säugetierexpressionsvektor pTargeT unter Steuerung des CMV-Promotors kloniert, wie oben beschrieben ist. Das für PLP_139-151 kodierende Gen wurde wie oben beschrieben erhalten.
SJL/J-Mäusen wurden 100 μg von jedem Plasmid zweimal intramuskulär injiziert, in Abständen von einer Woche. Kontrollmäusen wurde ein Vektor alleine oder mit PBS injiziert. Zehn Tage nach der letzten Injektion wurden die Mäuse zur Induktion von EAE mit dem enzephalitogenen Peptid PLP_139-151, emulgiert in komplettem Freundschem Adjuvans (CFA), provoziert. Wie in Tabelle 3 zu sehen gab es eine signifikan te Abnahme der mittleren Krankheitswerte bei Mäusen, die mit sowohl den IL4- als auch den PLP_139-151-Plasmiden co-geimpft wurden, im Vergleich zu den Kontrollen (siehe Tabelle für p-Werte). Außerdem nahmen die Häufigkeit der Krankheit und die mittlere Schwere am Höhepunkt der Krankheit bei der Co-Impfung im Vergleich zu Kontrollen ab. Der Ausbruch der Krankheit wurde im Vergleich zu den Kontrollgruppen nicht signifikant verzögert. Bei den Mäusen, die nur mit der für IL4 kodierenden DNA geimpft wurden, wurde kein signifikanter Schutz vor der Krankheit beobachtet. Tabelle 3: EAE-Krankheitsschwere bei DNA-geimpften Mäusen

a Mittelwerte sind Mittelwerte ± Standardabweichung
b Alle p-Werte sind Vergleiche zwischen IL4/PLP139–151 und pTargeT, bestimmt durch den Student-t-Test.

Co-Impfung mit für IL4 kodierender DNA rettet die proliferativen T-Zell-Antworten in mit PLP_139-151-DNA geimpften Tieren. Mäuse, die mit DNA geimpft und mit dem Peptid PLP_139-151 für die Induktion der Krankheit provoziert worden waren, wurden getötet, nachdem sie sich von der anfänglichen akuten Erkrankung erholt hatten. Zellen von drainierenden Lymphknoten (LNC) dieser Mäusen wurden entnommen und in vitro mit dem PLP_139-151-Peptid restimuliert, um ihre proliferativen Reaktionen zu bestimmten. Außerdem wurden antigenspezifische T-Zelllinien von diesen LNC erhalten, um ihre Zytokinsekretionsprofile zu analysieren.
LNC wurden auf ihre proliferativen Reaktionen auf das Peptid PLP_139-151 getestet. Es gab keine signifikante Veränderung im proliferativen Muster von LNC zwischen IL4- und PLP_139-151-co-DNA-geimpften Mäusen und Kontrollmäusen, die nur mit dem Vek tor geimpft worden waren. Im Gegensatz dazu wiesen LNC von Mäusen, die nur mit PLP_139-151-DNA geimpft worden waren, eine geringere Proliferationskapazität auf. Die Erfinder haben schon gezeigt, dass diese T-Zellen anergisch sind (Beispiel 1). Daher kann durch den Zusatz von IL4 als DNA-Co-Vakzine die durch die PLP_139-151-DNA-Vakzine erzeugte Anergie gerettet werden. Somit kann ein anderer Schutzmechanismus durch Co-Impfung mit IL4-DNA als bei Impfung mit PLP_139-151-DNA alleine erzeugt werden.
Co-Impfung mit für IL4 kodierender DNA ändert den Phänotyp von T-Zellen zu einem Th2-Typ. PLP_139-151-spezifische T-Zellen wurden aus Mäusen, die mit dem Peptid PLP_139-151 auf Krankheitsinduktion provoziert und davor mit unterschiedlichen DNA-Kombinationen geimpft worden waren isoliert und in Kultur gehalten. Diese T-Zelllinien wurden nach In-vitro-Stimulierung mit dem Peptid PLP_139-151 auf Zytokinproduktion getestet. T-Zellen von Mäusen, die mit IL4- und PLP_139-151-DNA co-geimpft worden waren, erzeugten signifikant höhere Mengen an IL4 (durchschnittlich 716 ± 237 pg/ml im Vergleich zu 0,208 ± 0,36 pg/ml bei pTargeT-geimpften Mäusen, p < 0,0064) und IL10 (durchschnittlich 1073 ± 221 pg/ml im Vergleich zu 464 ± 44 pg/ml bei pTargeT-geimpften Mäusen, p < 0,0151) als T-Zellen von Kontrollmäusen. Außerdem erzeugten die T-Zellen von den mit IL4- und PLP_139-151-DNA co-geimpften Mäusen geringere Mengen IFNγ als Kontroll-T-Zellen (durchschnittlich 1389 ± 108 pg/ml im Vergleich zu 6689 ± 85 pg/ml bei pTargeT-geimpften Mäusen, p < 0,0001). Somit produzieren T-Zellen, die aus den co-geimpften und geschützten Mäusen isoliert wurden, mehr Zytokine vom Th2-Typ als Kontroll-T-Zellen. Wie oben berichtet wiesen T-Zellen von Mäusen, die mit PLP_139-151-DNA alleine geimpft worden waren, geringere Mengen an IFNγ auf, durchliefen aber keine Th2-Verschiebung.
Schutz vor EAE bei IL4- und PLP_139-151-co-DNA-geimpften Mäusen kann durch T-Zellen übertragen werden. Die T-Zellen von Mäusen, die mit sowohl IL4-DNA als auch PLP_139-151-DNA co-geimpft worden waren, welche ihre proliferative Kapazität aufrechterhielten, aber eine Th2-Verschiebung durchliefen, wurden dann auf ihre Fähigkeit getestet, Schutz zu übertragen. Mäuse wurden mit dem enzephalitogenen Peptid PLP_139-151 immunisiert, das in CFA emulgiert war, und acht Tage später wurden jeder Maus 10 Millionen T-Zellen intravenös injiziert. Dann wurde der Krankheitsphänotyp der Tiere bestimmt. Kontroll-T-Zellen, die für PLP_139-151 spezifisch waren und bekannterweise EAE induzieren, wurden ebenfalls als Kontrolle injiziert. Mäuse, denen T-Zellen injiziert wurden, die von den co-geimpften Mäusen stammten, wiesen geringere Häufigkeit (1/5 Mäusen im Vergleich zu 4/5 Mäusen bei den Kontrollen) und geringere Krankheitswerte auf als Mäuse, denen Kontroll-T-Zellen injiziert worden waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die durch IL4- und PLP_139-151-DNA-Co-Impfung erreichte Schutzwirkung durch antigenspezifische TH2-Zellen auf naive Tiere übertragen werden kann.
Diskussion
Dieses Beispiel zeigt ein neues Verfahren für Schutzimmunität auf, das die Wirkungen einer DNA-Impfung und der lokalen Genverabreichung kombiniert. Zuerst zeigten die Erfinder, dass die genetische IL4-Vakzine funktionelles IL4 bereitstellt. Nach der Bestätigung, dass tatsächlich IL4 voller Länge vom für die Impfung verwendeten DNA-Konstrukt in vitro exprimiert wurde, zeigten die Erfinder, dass STAT6 durch die IL4-DNA-Vakzine in Zellen von drainierenden Lymphknoten aktiviert wird. Da STAT6 spezifisch durch IL4 aktiviert wird, kamen die Erfinder zu dem Schluss, dass IL4 durch die verabreichte DNA-Vakzine erzeugt wird und mit einem IL4-Rezeptor auf Lymphknotenzellen wechselwirkt, was wiederum die Aktivierung von STAT6 stromab vom Rezeptor verursacht. Das in der vorliegenden Untersuchung identifizierte phosphorylierte STAT6 weist etwa 60 kD auf. Obwohl die in der Literatur beschriebene vorherrschende Isoform von STAT6 100 kD aufweist, wurden in Mäuseimmungeweben andere Isoformen beschrieben (Quelle et al. (1995)). Außerdem zeigte eine kürzliche Studie die Existenz einer 65-kD-Isoform in Mäusemastzellen auf (Sherman et al. (1999)). Das durch die genetische DNA-Vakzine bereitgestellte IL4 scheint diese Isoform spezifisch zu aktivieren. Die Erfinder waren nicht in der Lage, in den IL4-DNA-geimpften Mäusen Antikörperantworten auf IL4 zu detektieren. Daher gehen sie davon aus, dass das so verabreichte und exprimierte IL4-Gen bei der Erzeu gung von Schutzimmunität effektiv ist, ohne eine Immunantwort gegen IL4 zu erzeugen.
Wenn Mäuse mit sowohl der IL4-DNA-Vakzine als auch einer separaten DNA-Vakzine für das Selbst-Peptid PLP_139-151 immunisiert worden waren, waren diese Mäuse gegen die Induktion einer Erkrankung durch das Peptid PLP_139-151, in CFA emulgiert, geschützt. Die IL4-DNA-Vakzine alleine stellte keinen signifikanten Schutz bereit. Als das Zytokinprofil von T-Zellen von co-geimpften und geschützten Mäusen untersucht wurde, zeigte sich eine Verschiebung des Zytokinsekretionsmusters zu einem Th2-Typ. Außerdem konnten diese Th2-Zellen Schutz gegen die Induktion einer Erkrankung in naiven Mäusen übertragen. Deshalb vermuteten die Erfinder, dass die Kombination der lokalen Verabreichung von IL4- und der Impfung mit PLP_139-151-DNA die antigenspezifischen autoreaktiven T-Zellen dazu bringt, ihren Phänotyp zu einem mehr Schutz bereitstellenden Th2-Antworttyp zu verschieben. Diese antigenspezifischen, schützenden T-Zellen werden dann zu Stellen mit Myelinschaden geleitet und schwächen die pathogene Autoimmunantwort ab.
Ein möglicher Mechanismus, wie die Verschiebung des Phänotyps stattfinden könnte, ist, dass die IL4- und PLP_139-151-DNA-Vakzinen durch antigenpräsentierende Zellen (APC) an der Verabreichungsstelle der Vakzinen aufgenommen werden. Das PLP_139-151-Peptid wird in den APCs exprimiert und auf MHC-Klasse-II-antigenspezifischen T-Zellen präsentiert, die so rekrutiert werden. Die APCs exprimieren auch IL4, das lokal während der Wechselwirkung zwischen den APCs und T-Zellen sekretiert wird. Dieses sekretierte IL4 führt dann dazu, dass der Phänotyp der antigenspezifischen T-Zelle einen eher in Richtung Th2-Typ gehenden Phänotyp annimmt. Diese Modell stimmt mit früheren Untersuchungen überein, die zeigten, dass in einer Kultur gezüchtete T-Zellen dazu gebracht werden können, einen eher in Richtung Th2-Typ gehenden Phänotyp anzunehmen, wenn sie in Gegenwart von IL4 gezüchtet werden (Macatonia et al., Int. Immunol. 5, 1119–28 (1993)).
Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass professionelle APCs, die entweder an der Verabreichungsstelle vorhanden sind oder aus dem Knochenmark rekrutiert werden, nackte DNA aufnehmen und zu lymphoiden Organen wandern können (Chattergoon et al., J. Immunol. 160, 5707–18 (1998)). Es ist möglich, dass zwei separate oder sogar voneinander entfernte APCs zwei unterschiedliche Plasmide aufnehmen. Die Erfinder sind jedoch der Ansicht, dass es die lokale Mikroumgebung während der APC- und T-Zell-Wechselwirkung ist, die von Bedeutung ist, da bei IL4-DNA-geimpften Mäusen keine detektierbare Zunahme an Serum-IL4 zu erkennen war. Als Verabreichungsverfahren eines möglicherweise schädlichen Genprodukts, wie z.B. Zytokin in hohen Dosen, könnte dieses Verfahren besser als herkömmliche Gentherapieverfahren geeignet sein, da das verabreichte Gen eher lokal als systemisch wirkt.
DNA-Vakzinen haben sich als wirksam beim Schutz gegen einige Tiermodelle von Autoimmunerkrankungen herausgestellt. Einer der vielen Vorteile von DNA-Vakzinen gegenüber herkömmlichen Behandlungen von Autoimmunerkrankungen ist die Möglichkeit, das Behandlungsvehikel leicht zu modifizieren. Die Erfinder haben hierin gezeigt, dass durch den Zusatz eines genetisch verabreichten IL4-Zytokins zur PLP_139-151-DNA-Vakzine Schutz gegen EAE bereitgestellt werden kann und sogar die schützende Antwort auf einen eher in Richtung Th2 gehenden Typ verstärkt werden kann. Der Zusatz von IL4 als DNA-Co-Vakzine rettet die durch die PLP_139-151-DNA-Vakzine bereitgestellte Anergie und führt die Antwort zu einem Th2-Phänotyp. Dieser durch die Co-Impfung mit IL4-DNA vermittelte Schutzmechanismus kann bestimmte Vorteile gegenüber einer Impfung mit PLP_139-151-DNA alleine aufweisen. Dieses Verfahren könnte sich auch bei der Behandlung von anderen Autoimmunerkrankungen als vorteilhaft erweisen. Eine Immunisierung gegen die Antigene, die durch autoreaktive Th1-Zellen verursachte Autoimmunerkrankungen auslösen, also Erkrankungen, wie z.B. Multiple Sklerose, infantile Diabetes und rheumatoide Arthritis, wären Leiden, bei denen sich eine Co-Impfung mit für IL-4 kodierender DNA als vorteilhaft herausstellen könnte. Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass die hierin dargelegten Daten ein mächtiges und neues Werkzeug implizieren, nämlich die Kombination von lokaler Genverabreichung und antigenspezifischer DNA-Impfung, die universell auf alle DNA-Vakzinen angewandt werden könnte.
Experimentelle Verfahren
Tiere: Sechs bis acht Wochen alte weibliche SJL/J-Mäuse wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) bezogen.
Peptide: Die Peptide wurden durch herkömmliche 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Chemie auf einem Peptid-Synthesegerät (Modell 9050; MilliGen, Burlington, MA, USA) synthetisiert. Gereinigt wurden die Peptide durch HPLC. Die Strukturen wurden durch Aminosäureanalyse und Massenspektrometrie bestätigt. In diesen Versuchen verwendete Peptide waren: (Seq.-ID Nr. 15) PLP_139-151 (HSLGKWLGHPDKF) und (Seq.-ID Nr. 16) HSVP16 P45(DMTPADALDDRDLEM).
DNA-Vakzinen: Ein für PLP_139-151 kodierendes Minigen wurde wie oben beschrieben erzeugt. Das Mäuse-IL4-Gen wurde durch PCR aus Milz-cDNA kloniert (Clontech, Palo Alto, CA, USA), und zwar unter Verwendung der folgenden PCR-Primer: (Seq.-ID Nr. 17) 5'-CGCGGATCCTTGATGGGTCTCAACCCCCAGCTAGTTGTC-3' und (Seq.-ID Nr. 18) 5'-ACGCTCGAGGTACTACGAGTAATCCATTTGCATGATGC-3'. Beide dieser Konstrukte wurden in die Mehfachklonierungsregion des pTargeT-Vektors (Promega, Madison, WI, USA) kloniert, der durch den CMV-Promotor getrieben wurde. Korrekte Klone wurden durch automatisierte DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Reinigung der Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Sets "Qiagen Endo-free Mega Prep" (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA) durchgeführt. Die Reinheit der Plasmid-DNA wurde durch UV-Spektralphotometrie und Agarosegelelektrophorese bestätigt. Nur DNA mit einem 260 nm/280 nm-Absorptionsverhältnis von mehr als 1,7 wurde verwendet.
In-vitro-Translation: DNA-Konstrukte, die für eine DNA-Impfung verwendet wurden, wurden durch einen In-vitro-Translationstest auf die Produktion des Produkts mit korrekter Größe getestet. Etwa 1 μg Plasmid-DNA wurden 2 h lang bei 30°C in einem Volumen von 50 μl inkubiert, das Folgendes enthielt: 25 μl TNT-Kaninchen-Retikulozyten-Lysat (Promega Corp., Madison, WI, USA), 2 μl TNT-Reaktionspuffer (Promega Corp., Madison, WI, USA), 1 μl TNT-T7-RNA-Polymerase (Promega Corp., Madison, WI, USA), 1 μl eines 1 mM Aminosäuregemischs ohne Methionin (Promega Corp., Madison, WI, USA), 4 μl ³⁵S-Methionin bei 10 mCi/ml (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, IL, USA) und 1 μl RNasin-Ribonucleaseninhibitor mit 40 U/μl (Promega Corp., Madison, WI, USA). Ein Volumen von 3 μl des Produkts dieser Reaktion wurde mit einem SDS-Probenpuffer vermischt und auf einem 18% SDS-Polyacrylamidgel laufen gelassen. Nach dem Trocknen wurde das Gel einem Autoradiographiefilm ausgesetzt.
STAT6-Western: Nach der Dissektion der drainierenden Lymphknoten aus DNA-geimpften Mäusen wurde das Gewebe mechanisch in 1 ml des folgenden Puffers homogenisiert: 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl pH 7,4, 0,001 M EDTA, 1 μg/ml Aprotinin, 1,6 μM Pefabloc SC (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA). 0,5 ml des resultierenden Lysats wurden in einem BCA-Proteintest verwendet (Pierce, Rockford, IL, USA), um die Gesamtproteinkonzentration zu bestimmen. Die restlichen 0,5 ml wurden zu 0,25 ml 3 × SDS-Ladepuffer (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) zugesetzt, der DTT in einer Endkonzentration von 0,04 M enthielt. Die Produkte wurden auf einem SDS-PAGE-Gel mit einem Gradienten von 4–15% (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) aufgelöst. Vorgefärbte Marker wurden verwendet, um die Molekulargewichte zu bestimmen (Bio Rad, Hercules, CA, USA). Nach der Elektrophorese wurden die Gele bei einer konstanten Spannung von 100 V in 25 mM Tris, 192 mM Glycin und 20 Vol.-% Methanol als Transferpuffer auf PVDF-Membranen geblottet. Die Membranen wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einer Tris-gepufferten Kochsalzlösung (TBS), 0,1% Tween 20 und 20% fettfreier Trockenmilch blockiert. Nachdem die Membranen mit TBS und 0,1% Tween 20 gewaschen worden waren, wurden die Membranen über Nacht bei 4°C mit einem Anti-Phospho-STAT6-Antikörper (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) hybridisiert, der 1:1000 in TBS, 0,1% Tween 20,5% BSA verdünnt war. Die Membranen wurden dann wie im ECL-Plus-Protokoll (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heigths, IL, USA) beschrieben bearbeitet, um die Banden durch Chemilumineszenz sichtbar zu machen. Die Membranen wurden durch Inkubation in 100 mM β-Mercaptoethanol, 2% (Gew./Vol.) SDS und 62,5 mM Tris-HCl pH 7,4 30 Minuten lange bei 60°C gestrippt. Dieselben Membranen wurden dann mit einem Antikörper gegen Mäuse-CD3ζ (Pharmingen, San Diego, CA, USA) als Kontrolle sondiert, um die gleiche Beladung der Bahnen zu bestätigen.
DNA-Immunisierungsarbeitsvorschrift: Tieren wurden in den linken Quadrizeps 0,1 ml 0,25% Bupivicain-HCL (Sigma, St. Louis, MO, USA) in PBS injiziert. Zwei und neun Tage später wurden den Mäusen 100 μg Plasmid-DNA (in einer Konzentration von 1 mg/ml in PBS) in den gleichen Muskel injiziert. Tiere, die eine Co-Vakzine erhielten, erhielten zwei separate Injektionen der einzelnen Plasmid-DNAs.
EAE-Induktion: Sieben bis zehn Tage nach der letzten DNA-Vakzine wurde mit 100 μg PLP_139-151-Peptid EAE in Mäusen induziert. Das Peptid wurde in einer Konzentration von 2 mg/ml in PBS gelöst und mit einem gleichen Volumen inkomplettem Freundschem Adjuvans emulgiert, das mit 4 mg/ml durch Hitze abgetöteter Mycobakterientuberkulose-H37Ra (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) ergänzt war. Den Mäusen wurden subkutan 0,1 ml der Peptidemulsion injiziert. Die Versuchstiere wurden wie folgt beurteilt: 1 = Schwanzschwäche oder -lähmung; 2 = Hinterbeinschwäche; 3 = Hinterbeinlähmung; 4 = Vorderbeinschwäche oder -lähmung; 5 = moribundes oder totes Tier.
Lymphknotenzellproliferationstest: Drainierende Lymphknoten wurden nach der akuten Phase einer Krankheit dissektiert, und Lymphknotenzellen (LNC) wurden in vitro für spezifische proliferative Antworten auf das PLP_139-151-Peptid kultiviert. LNCs wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten in einem Volumen von 0,2 ml/Well und einer Konzentration von 2,5 × 10⁶ Zellen/ml hergestellt. Das Kulturmedium bestand aus angereichertem RPMI (RPMI 1640, ergänzt mit L-Glutamin [2 mM], Natriumpyruvat [1 mM], nichtessentiellen Aminosäuren [0,1 mM], Penicillin [100 U/ml], Streptomycin [0,1 mg/ml], 2-ME [5 × 10^–5 M]), ergänzt mit 1% autologem frischem normalem Mäuseserum. Die Kulturen wurden 72 h lang bei 37°C inkubiert, dann wurden die Zellen 18 h lang mit 1 μCi/Well (³H)-Thymidin gepulst. Schließlich wurden die Zellen geerntet und in einem Beta-Zähler gezählt.
Zytokinprofilbestimmung: T-Zelllinien wurden aus LNCs von DNA-geimpften Mäusen etabliert. Diese T-Zellen wurden dann auf die Produktion von verschiedenen Zytokinen gestestet. 50 × 10³ T-Zellen/ml wurden mit 2,5 × 10⁶ bestrahlten syngenen APCs/ml in angereichertem RPMI und 10% FCS inkubiert. Nach 6 Tagen Kultivierung wurden die Überstände gewonnen und durch Sandwich-ELISA unter Verwendung eines herkömmlichne ELISA-Sets (Pharmingen, San Diego, CA, USA) getestet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer DNA-Expressionskassette, die aus einer Transkriptionsinitiationsregion, einer Autoantigen-kodierenden Sequenz, die für zumindest einen Teil eines Myelinprotein-Autoantigens kodiert, und einer Transkriptionsterminationsregion besteht, wobei das Myelinprotein-Autoantigen mit einer entzündungsfördernden Zellantwort vom Th1-Typ assoziiert ist, wobei die Transkriptionsinitiationsregion unter der Regulationssteuerung eines Promotors steht, der in einem menschlichen Wirt mit einer Autoimmunerkrankung aktiv ist, zur Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Behandlung einer demyelinisierenden Autoimmunerkrankung in einem menschlichen Wirt durch intramuskuläre Injektion.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Expressionskassette in einem Vektor vorhanden ist.
Verwendung nach Anspruch 2, worin die DNA-Expressionskassette in einem Plasmidvektor vorhanden ist.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, worin der Vektor weiters eine zweite DNA-Expressionskassette umfasst, die eine zweite Sequenz umfasst, die für ein Th2-Cytokin unter der Regulationssteuerung eines Promotors, der im menschlichen Wirt aktiv ist, kodiert.
Verwendung nach Anspruch 4, worin das Th2-Cytokin IL4 ist.
Verwendung nach Anspruch 5, worin das IL4 menschliches IL4 ist.
Verwendung nach Anspruch 1, die weiters die Verwendung einer zweiten DNA-Expressionskassette umfasst, die eine zweite Sequenz umfasst, die für ein Th2-Cytokin unter der Regulationssteuerung eines Promotors, der im menschlichen Wirt aktiv ist, kodiert, wobei die Kassette in einem gesonderten DNA-Konstrukt vorhanden ist.
Verwendung nach Anspruch 7, worin das Expressionskonstrukt, das für das Th2-Cytokin kodiert, und das Expressionskonstrukt, das für zumindest einen Teil des Myelinprotein-Autoantigens kodiert, co-formuliert werden.
Verwendung nach Anspruch 7, worin das Expressionskonstrukt, das für das Th2-Cytokin kodiert, und das Expressionskonstrukt, das für zumindest einen Teil des Myelinprotein-Autoantigens kodiert, unabhängig voneinander formuliert werden.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die erste Sequenz für ein endogenes menschliches Protein kodiert.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Myelinprotein Proteolipidprotein, basisches Myelinprotein, Myelinoligodendrocytprotein oder Myelin-assoziiertes Protein ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die demyelinisierende Erkrankung multiple Sklerose ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die entzündungsfördernde Antwort Expression von IL-2, γ-Interferon oder IL-15 umfasst.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Medikament in einer Serie von zumindest zwei Injektionen mit zumindest 24 Stunden Abstand zu verabreichen ist.