PT89573B

PT89573B - Metodo para a reducao de respostas mediadas por imunoglobulina e

Info

Publication number: PT89573B
Application number: PT89573A
Authority: PT
Inventors: Robert L Coffman; Jan Egbert De Vries
Original assignee: Schering Biotech Corp
Priority date: 1988-02-02
Filing date: 1989-01-31
Publication date: 1994-01-31
Also published as: DK183590D0; IL89124A; HU211059B; ES2058490T3; ATE93144T1; IE63097B1; ZA89766B; CA1341477C; IL89124A0; HK35196A; WO1989006975A1; KR900700132A; DE68908431D1; FI903827A0; AU629536B2; JPH03500050A; HU891044D0; HUT54214A; EP0327283B1; EP0397764A1

Description

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 89.573

REQUERENTE: SCHERING BIOTECH CORPORATION, norte-americana, com sede em 901 Califórnia Avenue, Paio Alto, Califórnia 94304, Estados Unidos da América do Norte

EPÍGRAFE: MÉTODO PARA A REDUÇÃO DE RESPOSTAS MEDIADAS

POR IMUNOGLOBULINA E

INVENTORES: Robert L. Coffman, Jan Egbert de Vries

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883. Estados Unidos da América do Norte, em 2 de Fevereiro de 198B, sob o n^e. 151,413 in»: 113 fi l 18733

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um método pajra a redução de respostas mediadas pela imunoglobulina e associadas a certas perturbações imunológicas. 0 método caracteriza-se pela administração de uma quantidade eficaz de um antagonista da interleuquina-4 humana. De preferência o antagonista é ura anticorpo monoclonal bloqueador especifico da interleuquina-4 humana ou um fragmento ou composição de ligação derivado dele.

SCHERING BIOTECH CORPORATION

MÉTODO PARA A REDUÇÃO DE RESPOSTAS MEDIADAS POR IMUNOGLOBULINA E

È também referida a utilização do referido antagonista na preparação de uma composição terapêutica útil na redução de uma resposta mediada pela imunoglobulina E, bem como o processo para a preparação da referida composição terapêutica.

invento está relacionado de um modo geral com um método para o tratamento de doenças do sistema imune associadas à produção excessiva de imunoglobulina E (ig E) e, mais particularmente com um método para a redução da produção de Ig E através da inibição da acção da interleuquina-^.

Tanto quanto pode ser determinado, a principal função fisiológica das respostas mediadas por IgE é combater parasitas. A resposta pode ser dividida em cinco fases: uma célula B portadora de IgE é estimulada para responder a um antigénio (fase 1) e activada para secretar anticorpos IgE (fase 2); os anticorpos produzidos ligam-se aos mastócitos e basófilos em tecido (fase 3, fixação de anticorpo), a interacção do antigénio em IgE ligada a células activa estas células e provoca a libertação de mediadores quimicos guardados nos seus grânulos (fase 4, desgranulação); e finalmente, os mediadores induzem uma resposta de tecidos complexa com a finalidade de eliminar os parasitas não microbianos do corpo (fase 5). Parte deste mecanismo de defesa é um ataque ao tecido que hospeda o parasita - ou seja o próprio. Remover um parasita de um tecido sem danificar o resto do corpo é um acto extremamente delicado. Os mediadores libertados pelos mastócitos activados e basófilos podem causar danos consideráveis, mesmo a morte, se libertados numa altura inadequada ou se dirigidos contra um alvo inadequado. A resposta de IgE deve ser controlada de perto e rapidamente atenuada após o seu objectivo ter sido conseguido. Desde que este controle funcione não existe perigo de partes saudáveis do corpo serem danificadas, mas caso os controles falhem a reac ção benéfica tornar-se-à prejudicial. Cerca de 90 por cento dos seres humanos não tem dificuldade em usar as suas IgE apenas com fins defensivos; mas os restantes 10 por cento são portadores de um defeito genético do mecanismo de controle que permite a estimulação de respostas de IgE por

antigénios que não têm nada a ver com parasitas. Inicialmente pensou-se que este defeito estaria limitado apenas aos seres humanos, no entanto defeitos semelhantes foram descobertos mais tarde em vários outros mamiferos. As respostas de IgE inadequadamente estimuladas causam uma pletora de diversas doenças, agrupadas sob o nome de alergia ou atropia; ver Klein, Immunology: The Science of Self-Non Self Discrimination (john Wiley & Sons, New York,1982).

Correntemente os esteróides glucocorticóides são as drogas mais eficazes para o tratamento de doenças alérgicas. No entanto, o tratamento prolongado com esteróides está associado a muitos efeitos secundários prejudiciais: Goodman e Gilman, The Pharmacologycal Basis of Therapeutics, Ed. (Mac. Millan Publishing Company, New York, 1980). Consequentemente, a disponibilidade de abordagem alternativa ao tratamento de perturbações do sistema imunitário associadas à produção excessiva de IgE poderá ter importante utilidade clinica.

invento proporciona portanto um método para reduzir os niveis de IgE pela administração de uma quantidade eficaz de um antagonista da interleuquina 4 humana (lL-4). Um antagonista preferido da IL-4 é um anticorpo monoclonal ou composições derivadas dele através de técnicas convencionais.

antagonista da interleuquina-4 humana é de preferência um anticorpo monoclonal capaz de bloquear a actividade potenciadora da imunoglobulina E da interleuquina-4 humana, um fragmento de um anticorpo monoclonal capaz de bloquear a actividade potenciadora de imunoglobulina E da interleuquina-4 humana ou uma composição de ligação compreendendo a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve de um anticorpo monoclonal capaz de bloquear a actividade de potenciação

da imunoglobulina E da interleuquina-4 humana.

O invento baseia-se na descoberta de que a IL-4 aumenta a produção de IgE em humanos. 0 método do invento compreende portanto a administração a um paciente de uma dose eficaz ou aliviadora da doença, de um antagonista da IL-4 humana.

De preferência, os antagonistas do invento são derivados de anticorpos especificos para a IL-4 humana. Mais preferencialmente, os antagonistas do invento compreendem fragmentos ou composições de ligação especificos para IL-4.

Os anticorpos compreendem uma montagem de cadeias polipeptidicas ligadas umas às outras por pontes dissulfureto. Duas cadeias polipeptidicas prin cipais, referidas como cadeia leve e cadeia pesada, prefazem | todas as principais classes estruturais (isotipos) do anti- ¹corpo. Tanto as cadeias pesadas como as cadeias leves são ainda divididas em sub-regiões referidas como regiões variá-

Conforme aqui é usado, o termo região varuável da cadeia pesada significa um polipeptideo (1) que tem entre 110 e 125 aminoácidos de comprimento (o número começando no aminoácido N-terminal da cadeia pesada) e (2) cuja sequência de aminoácidos corresponde à de uma cadeia de um anticorpo monoclonal do invento. Igualmente, o termo região variável da cadeia leve significa um poli-6-

peptideo (1) que tem 95 a 115 aminoácidos de comprimento ( a numeração começando no aminoácido N-terminal da cadeia leve) e (2) cuja sequência de aminoácidos corresponde à de uma cadeia leve de um anticorpo monoclonal do invento.

Conforme aqui e usado o termo anticorpo monoclonal refere-se a populações homogénas de imunoglobulina que são capazes de se ligar especificamente a IL-*+ humana.

Conforme aqui é usado o termo composição de ligação significa uma composição compreendendo duas cadeias polipeptidicas (1) que quando operacionaj_ mente associadas, assumem uma conformação tendo elevada afinidade de ligação para interleuquina-^ e (2) que são derivadas de um hibridoma produtor de anticorpos monoclonais específicos para interleuquina-4 humana. 0 termo operacionalmente associado pretende indicar que as duas cadeias polipeptidicas podem ser dispostas uma em relação à outra de modo a ligarem-se por uma variedade de meios, incluindo associação num fragmento de anticorpo nativo, como seja Fab ou Fo ou por meio de adaptadores peptidicos contendo cisteina e obtidos por engenharia genetica no extremo carbonilo. Normalmente, as duas cadeias polipeptidicas correspondem à região variável da cadeia leve e à região variável da cadeia pesada de um anticorpo monoclonal especifico para interleuquina-4 humana.

De preferência, os antagonistas do invento são derivados de anticorpos monoclonais específicos para IL-^4 humana. Os anticorpos monoclonais capazes de bloquear actividade de potenciação de IgE da IL-** são seleccionados em ensaios in vitro convencionais para IL-4 baseados na proliferação de células T; e.g. Yokota et al., (referido atrás). Nos sistemas de murganhos observou-se que

todas as actividades biológicas de IL-4 podem ser bloqueadas por um simples anticorpo monoclonal. Assim, pensa-se que todas as actividades são mediadas por um único sitio, i.e. o sitio de ligação ao receptor, na proteina.

Os bibridomas do invento são produzidos por técnicas conhecidas. Geralmente, os processos envolvem a fusão de uma linha celular imortal com um linfócito B que produz o anticorpo pretendido. Como alternativa, são também possiveis técnicas sem envolverem fusão para a obtenção de linhas celulares imortais produtoras de anticorpos que estão dentro do âmbito do presente invento; e.g. transformação induzida por vírus: Casali et al., Human Monoclonais from Antigen-Specific Selection of B Lynphocytes and Transformaiion by EBV, Science, vol 234, págs. 476-479 (1986). As linhas celulares imortalizadas são geralmente células de mamíferos transformadas, particularmente células de mieloma de roedores, bovinos ou humanos. Mais frequentemente e por questões de conveniência e disponibilidade empregam-se linhas celulares de mieloma de rato ou de murganho.

São bem conhecidas as técnicas para obtenção dos linfócitos adequados a partir de mamíferos injectados com o antigénio alvo. Geralmente usam-se linfócitos do sangue periférico (PBLs) se se pretende células de origem humana ou usam-se células do baço ou de módulos linfáticos se se pretende células de outra fonte de mamífero não humana. Um mamífero hospedeiro não humano é injectado com doses repetidas do antigénio purificado e deixa-se que o mamífero produza as células produtoras de anticorpos pretendidas antes destas serem colhidas para fusão com a linha celular imortal. São também bem conhecidas as técnicas de fusão e em geral envolvem mistura das células com um agente de fusão, como seja polietilenoglicol. Os hibridomas são seleccíonados por processos convencionais,

como seja selecção com HAT. São especialmente preferidos os hibridomas humano-huamno. De entre estes hibridomas são seleccionados os que secretam o anticorpo pretendido testando o seu meio de cultura por imunoensaios convencionais como seja transferencias Western, ELISA, RIA ou similares. Os anticorpos são recuperados do meio usando técnicas convencionais de purificação de proteínas; e.g. Tijissen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985). Existem disponíveis muitas referências spbre a aplicação das técnicas atrás; e.g. Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York (198O); Tijissen, Pratice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsivier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antjbodies: Techniques and Application (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); e similares.

É também bem conhecido o uso e obtenção de fragmentos de anticorpos, e.g. fragmentos Fub: Tijissen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); e fragmentos Fv. Hochman et al., Biochemistry, Vol. 12, págs. 1130-1135 (1973), Sharom et al Biochemistry, Vol. 15, págs. 1591-1594 (1976) e Ehrlich et al., Patente U.S. 4 355 023; θ meias moléculas de anticorpo: Auditore-Hargreaves, Patente US 4 470 925. Ainda, tais compostos e composições do invento podem ser usadas para construir anticorpos bi-especificos por técnicas conhe cidas; e.g. outras fusões de hibridomas (i.e. para formar os chamados quadromas)- ver Reading, Patente US 4 474 493; ou reassociaçao química de meias moléculas - ver Brennan et al., Science, Vol. 229, págs. 81-S3 (1985).

Os hibridomas e anticorpos mono clonais do invento são produzidos contra versões glicosiladas ou não glicosiladas da interleuquina-4 humana madura protegida por via recombinante. Geralmente, em E. coli são

produzidas versões não glicosiladas de IL-4 humana e as versões glicosiladas são produzidas em células de mamíferos e.g. células de macaco CV1 ou COS, células L de murganho ou similares. A IL-4 humana madura produzida por via recombinante é produzida através da introdução de um vector de expressão numa célula hospedeira usando protocolos convencionais: e.g. Maniatis et al..Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1982); Okayama e Berg, Mol. Cell, Biol. Vol. 2, págs. 161-170 (1982) e Vol. 3 págs. 280-289 (1983); Hasmer, Gene tic Engineering, Vol. 2 págs. 83-100 (1980) e Patente U.S. 4 599 ^08; Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. Vol. 2, págs. 1304-I319 (1982); ou similares.

A construção de bectores de expressão bacterianos ou de mamíferos é bem conhecida na especialidade uma vez conhecida a sequência de nucleotideos codificadores de uma proteína pretendida; e.g. De Boer na Patente U.S. 4 551 433 de screve promotores para usar em vectores de expressão bacterianos; Goeddel et al na Patente U.S. 4 6oi 980 e Riggs na Patente U.S. k 431 739 descreve a produção de proteínas de mamifero por sistemas de expressão em E. coli; e Riggs (citado atrás), Ferretti et al Proc. Natl. Acad. Sei. Vol, 83, págs. 599-603 (1986), Sproat et al, Nucleic Acids Research, Vol. 13, págs. 2959-2977 (1985) e Mullenbach et al., J. Biol. Chem. Vol. 261, págs. 719-722 (1986) descreve como construir genes sintéticos para a expressão em bactérias. Assim, estas referências são incluídas como referência. A sequência de aminocaidos da IL-4 madura está divulgada por Yokota et al., (referido atrás) e o cDNA codificador de IL-4 humana inserido no vector pcD descrito por Yokota et al (referido atrás) está depositado na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, M.D. com o número de acesso 67029. Muitos vectores de expressão em bactérias e hospedeiros podem ser adquiridos comercialmente e através da ATCC. De prefe-10-

rência, a IL-4 humana para imunização de animais hospedeiros e isolada a partir de sobrenadantes de cultura de células COS, CV1 ou L de murganho que foram transitoriamente transfectadas pelo vector pcD atrás referido.

Os anticorpos e fragmentos de anticorpos caracteristicos de hibridomas do invento podem ser também produzidos por meios recombinantes através da extracção de RNA mensageiro, construção de uma biblioteca de cDNA o selecção de clones que codificam segmentos da molécula de anticorpo; e.g. Wall et al., Nucleic Acids Research Vol. 5, págs. 3113-3128 (1978); Zakut et al., Nucleic Acids Research, Vol. 8, págs, 3591-3^01 (1980); Cabilly et al., Proc, Natl. Acad. Sei, Vol. 81, págs.3273-3277 (1984); Boss et al., Nucleic Acids Research, Vol.12 págs. 3791-3806 (1984), Amster et al., Nucleic Acids Research, Vol. 8 págs. 2055-2065 (1980); e Moore et al., Patente U.S. 4 642 234. Em particular, tais técnicas podem ser usadas para produzir anticorpos monoclonais interespecificos, em que a região de ligação de uma espécie é combinada com uma região de não ligação do anticorpo de uma outra espécie para reduzir a imunogenicidade; e.g. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. Vol. 84, págs. 3439-3443 (1987).

Os antagonistas do invento são administrados como uma composição farmacêutica. Tais composições contêm uma quantidade terapêutica de pelo menos um dos anticorpos monoclonais do invento ou seus fragmentos, num veiculo farmacêuticamente eficaz. Um veiculo farmacêutico pode ser qualquer substância não téxica compatível adequada a libertação das composições do invento num paciente. Num veiculo podem ser incluídos água estéril, álcool, gorduras, graxas e sélidos inertes. Adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis (e.g. agentes tamponantes, agentes dispersantes) podem também ser incorporados na composição farmacêutica. Geral mente, as composições úteis para administração parentérica

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de tais drogas são bem conhecidas, e.g. ver Remington¹s Pharmaceutical Sciences, 15- Ed. (Mack Publishing Company, Easton, PA 1980). Como alternativa, as composições do invento podem ser introduzidas no corpo de um paciente através de sistemas implantáveis de libertação de drogas; e.g. ver Urgurhart et al. , Ann. Rev. Pharmacol. Toxico 1. Vol. 24, págs. 199-236 (1984).

Quando os antagonistas do invento são derivados de anticorpos, eles são normalmente administrados parentericamente, de preferência intravenosamente. Uma vez que os antagonistas proteicos ou peptidicos podem ser imunogénicos, eles são de preferência administrados lentamente, através de uma administração IV convencional ou a partir de um depósito subcutâneo.

Quando administrados parentéricamente, os anticorpos ou fragmentos serão normalmente formulados com um veiculo parentérico farmaceuticamente aceitável numa forma de dosagem unitária adequada para injecção (solução, suspensão, emulsão). Tais veiculos são inerentemente não tóxicos e não terapêuticos. São exemplos de tais veiculos o soro fisiológico normal, solução de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank. Podem usar-se também veiculos não aquosos como sejam óleos fixados e oleato de etilo. Um veiculo preferido e 5% dextrose/soro fisiológico. 0 veiculo pode conter quantidades minimas de aditivos tais como substâncias que aumentam a isotoxicidade e a estabilidade quimica, e.g. tampões e preservativos. 0 anticorpo é de preferência formulado numa forma substancialmente pura, sem agregados e outras proteinas, em concentrações de cerca de 5 a 30 mg/ml, de preferência entre lo e 20 mg/ml. Para libertação intravenosa isto pode então ser ajustado a uma concentração na gama de cerca de 1 a cerca de 20 mg/ml.

A selecção de um regime de admi nistração para um antagonista depende de vários factores, incluindo a velocidade de renovação do antagonista no soro, o nivel de IL-4 no soro associado à doença imunitária, a imunogenicidade do antagonista, o acesso da IL-4 alvo (e.g. se se tiver de bloquear IL-4 sem ser do soro), a afinidade da IL-4 para o seu receptor relativamente à IL-4 para o antagonista e similares. De preferência, um regime de administração maximiza a quantidade de antagonista libertado no paciente consistente com um nivel aceitável de efeitos secundários. Assim, a quantidade de antagonista libertado depende em partir do antagonista particular e da gravidade da doença a ser tratada. As linhas directivas para a selecção de doses adequadas encontra-se na literatura nos usos terapêuticos de anticorpos; e.g. Bach et al., capitulo 22, em Ferrone et al., eds., Handbook of Monoclonal Antibodies (Noges Publications, Park Ridge, NJ 1985); e Russell, págs. 303-357, e Smith et al., Págs. 3^5-389, em Haber et al., eds. Antibodies in Human Diagnosis and Therapy (Raven Press, New York, 1977). De preferência, a dose é na gama de cerca de 1-20 mg por dia, especialmente quando o antagonista compreende anticorpos monoclonais ou fragmentos deles do tamanho de Fab (incluindo composições de ligação). Mais preferencialmente a dose é na gama de cerca de 1-10 mg/kg por dia.

As descrições das execuções precedentes do invento foram apresentadas com fins ilustrativos e descritivos. Não se pretende que sejam exaustivos ou que limitem o invento às formas precisas divulgadas e obviamente são possíveis muitas modificações e variações face aos ensinamentos acima. As execuções foram escolhidas e descritas de modo a explicar melhor os princípios do invento e a sua aplicação pratica para assim permitir que outros familiarizados com o assunto utilizem da melhor forma o invento em várias realizações e com várias modifica-13-

ções conforme adequado ao uso particular em questão. Pretende-se que o âmbito do invento seja definido pelas reivindicações que lhe estão apensas.

Os requerentes da patente depositaram E. coli MC lo61 portadora de pcD-IL-4-humana na American Type Culture Collection Rockville, MD, USA (ATCC) com o número de acesso 67029. Este depósito foi feito de acordo com o tratado de Budapeste (1977) sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para fins de Processo de Patente.

Claims

-14REIVINDICAÇ Õ E S:

15. - Método para redução de uma resposta mediada por imunoglobulina E num indivíduo caracterizado por se administrar uma quantidade eficaz de um antagonista da interleuquina 4 humana.

25. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido antagonista da interleuquina 4 humana ser seleccionado de entre um anticorpo monoclonal capaz de bloquear a actividade de potenciação da imunoglobulina E demonstrada pela interleuquina-4 humana, um fragmento de um anticorpo monoclonal capaz de bloquear a actividade de potenciação da imunoglobulina E demonstrada pela interleuquina-4 humana e una composição de ligação compreendendo a região variável da cadeia pesada e a região variãvel da cadeia leve de um anticorpo monoclonal capaz de bloquear a actividade de potenciação da imunoglobulina E demonstrada pela interleuquina-4 humana.

35. - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido fragmento do referido anticorpo monoclonal ser um fragmento Fab.

45. - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal ser produzido por uni hibridoma humano-humano.

55. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido fragmento do referido anticorpo monoclonal ser um fragmento Fab.

65. - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido passo de administração incluir a libertação intravenosa do referido antagonista numa concentração na gama de cerca de 1 a 20 mg/ml.

7-. - Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido passo de administração incluir ainda a libertação intravenosa de uma quantidade do referido antagonista na gama de cerca de 1 a 20 mg/kg peso de corpo do referido individuo por dia.

8?. - Processo para a preparação de uma composição terapêutica, útil na redução de uma resposta mediada pela imunoglobulina E, caracterizado por se incluir na referida composição um antagonista de interleuquina-4 humana, sendo a concentração do ingrediente activo de 1 a 30 mg/ml.

95. - Processo de reivindicação 8, caracterizado por o referido da interleuquina-4 humana ser seleccionado de anticorpo monoclonal capaz de bloquear a actividade de potenciação da imunoglobulina E demonstrada pela interleuquina-4 humana, um fragmento de um anticorpo monoclonal capaz de bloquear a actividade de potenciação da imunoglobulina E demonstrada pela interleuquina-4 humana, e uma composição de ligação compreendendo a região variável de cadeia pesada e a região variável da cadeia leve de um anticorpo monoclonal capaz de bloquear a actividade de potenciação da imunoglobulina E da interleuquina-4 humana.

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