DE69823981T2 - Verwendung von Peptidverbindungen zur Behandlung von SLE - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Peptidverbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Behandlung von systemischem Lupus Erythematosus brauchbar ist.
• Die EP-A-752 425 offenbart eine Peptidverbindung der Formel (H₂N-X₁-Thr-X₂-CO)_n-R (I),worin
  X₁ und X₂ verschieden sind und einen Aminosäurerest von Arginin oder Tyrosin in L- oder D-Konfiguration bedeuten, worin die Hydroxigruppe von Threonin und Tyrosin und der Guanidinteil von Arginin durch eine Verbindung geschützt sein können, die in der Peptidchemie zum Schutz der Hydroxigruppe bzw. des Guanidinteils üblicherweise verwendet wird,
  n für 1, 2, 3 oder 4 steht, und
  R für den Fall, dass n für 2, 3 der 4 steht, eine für die Bildung eines Dimers, Trimers oder Tetramers geeignete Gruppe ist, und R für den Fall, dass n für 1 steht, OH, ein einzelner Aminosäurerest oder eine bis zu 7 Aminosäurereste umfassende Peptidkette ist, die als Ligand für Immunglobuline brauchbar ist.
• Die WO 98/26794 offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine biologisch wirksame Menge einer Peptidverbindung der Formel (H₂N-X₁-Thr-X₂-CO)_n-R (1),worin
  X₁ und X₂ die oben genannten Bedeutungen haben,
  n für 2, 3 oder 4 steht, und
  R eine Gruppe ist, die in der Lage ist, ein dimeres, trimeres bzw. tetrameres Peptid zu bilden,
  und mindestens einen pharmazeutisch verträglichen inerten Bestandteil enthält.
• Diese Verbindungen haben sich in vivo als besonders brauchbar zur Behandlung von allergischen Reaktionen erwiesen.
• Systemischer Lupus Erythematosus (SLE) ist eine chronische, schubweise verlaufende multisystemische Autoimmunkrankheit, die vorwiegend Frauen mit einer Häufigkeit von 1 : 700 bei Frauen im Alter zwischen 20 und 60 Jahren betrifft, während das Frauen : Männer-Verhältnis 10 : 1 beträgt.
• Das klinische Hauptsyndrom umfasst Hautausschläge, Arthritis und Glomerulonephritis. Hämolytische Anämie, Thrombozytopenie und Beteiligung des zentralen Nervensystems sind ebenfalls verbreitet.
• In Patienten mit SLE werden viele verschiedene Antikörper gefunden. Die häufigsten sind antinukleäre Antikörper, insbesondere Anti-DNA-Antikörper und Antikörper gegen Ribonukleoproteine, Histone, nukleolare Antigene, Erythrozyten und Plättchen.
• Bisher wurde systemischer Lupus Erythematosus mit Aspirin und anderen antiinflammatorischen Arzneimitteln oder mit Arzneimitteln gegen Malaria behandelt.
• Eine schwere Erkrankung mit Vasculitis, Beteiligung des Nervensystems und Nierenschaden erfordert weiterhin eine unverzügliche Kortikosteroidtherapie in Kombination mit Immunsuppressiva wie beispielsweise Methotrexat und Cyclosporin.
• Diese Arzneimittel können jedoch ernste Nebenwirkungen hervorrufen. Die häufigsten Nebenwirkungen von Aspirin sind Leberschäden, während Arzneimittel gegen Malaria Übelkeit und Erbrechen hervorrufen. Übliche Nebenwirkungen von Kortison-ähnlichen Arzneimitteln umfassen Gewichtszunahme, Schlaflosigkeit und Depression, während die Verabreichung von Kortikosteroiden über einen langen Zeitraum zu Osteoporose und Katarakten führen kann.
• Die immunsuppressiven Arzneimittel können weiterhin die Bildung von Blutzellen beeinträchtigen, das Auftreten von Infektionen erhöhen und schwere Nierenschäden hervorrufen.
• Es wurde nun gefunden, dass die Peptidverbindung der Formel (H₂N-X₁-Thr-X₂-CO)_n-R (I)worin X₁, X₂, R und n die hier nachfolgend angegebenen Bedeutungen haben, zur Behandlung von systemischen Lupus Erythematosus brauchbar ist.
• Die vorliegende Erfindung betrifft daher in einem ersten Aspekt die Verwendung einer Peptidverbindung der Formel (H₂N-X₁-Thr-X₂-CO)_n-R (I),worin
  X₁ und X₂ verschieden sind und einen Aminosäurerest von Tyrosin oder Arginin in L- oder D-Konfiguration bedeuten, worin die Hydroxigruppe von Threonin und der Guanidinteil von Arginin durch eine Verbindung geschützt sein können, die in der Peptidchemie zum Schutz der Hydroxigruppe bzw. des Guanidinteils üblicherweise verwendet wird,
  n für 2, 3 oder 4 steht, und
  R eine Gruppe ist, die in der Lage ist, ein dimeres, trimeres bzw. tetrameres Peptid zu bilden,
  zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Behandlung von systemischem Lupus Erythematosus brauchbar ist.
• Vorzugsweise ist n 4.
• Jede Aminosäure der Verbindung der Formel (I) kann L- oder D-Konfiguration aufweisen.
• In der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen sollen die Begriffe "Dimer", "Trimer" und "Tetramer" Peptide bedeuten, die zwei, drei bzw. vier Sequenzen H₂N-X₁-Thr-X₂-CO- umfassen, wobei X₁ und X₂ die oben genannte Bedeutung haben.
• Ein typisches Beispiel für eine geeignete Gruppe zur Bildung eines Dimers (n = 2) ist ein Lysinrest. Ein typisches Beispiel für eine geeignete Gruppe zur Bildung eines Trimers (n = 3) ist ein Dipeptid Lysil-Lysin der Formel Lys-Lys. Typische Beispiele geeigneter Gruppen zur Bildung eines Tetramers (n = 4) sind ein verzweigtes Tripeptid der Formel Lys-Lys(εLys) und ein verzweigtes Tetrapeptid der Formel Gly-Lys-Lys(εLys).
• Ein typisches Beispiel eines Tetramers der Formel (I) weist die folgende Formel (H₂N-X₁-Thr-X₂-CO)₄-(Lys)₂-Lys-Gly-OH (IA)auf, worin
  X₁ und X₂ die oben genannten Bedeutungen haben und worin die Hydroxigruppe von Threonin und Tyrosin und der Guanidinteil von Arginin durch eine Verbindung geschützt sein können, die in der Peptidchemie zum Schutz der Hydroxigruppe bzw. des Guanidinteils üblicherweise verwendet wird.
• In der Literatur werden viele Gruppen beschrieben, die für den Schutz der Hydroxigruppe brauchbar sind (Grant G. A. "Synthetic peptides: a user's guide", Freeman, N. Y., 1992).
• Typische Beispiele der Schutzgruppen sind die tert-Butyl- (tBu) (La Joie, G. Crivici, A., Adamson, J. G. et al., "Synthesis", 571–572, 1990) und die Benzylgruppe (Yojima. "Tetrahedron", 44, 805–819, 1988).
• Viele zum Schutz des Guanidinteils von Arginin brauchbare Gruppen sind ebenfalls aus der Literatur bekannt (Grant G. A. "Synthetic peptides: a user's guide", Freeman, N. Y., 1992).
• Typische Beispiele der Schutzgruppen sind: 2,2,5,7,8-Pentamethylcroman-6-sulphonyl (Pmc) und 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzol (Mtr) (Ramage & Green, "Tetrahedron Letters", 28, 2287, 1987); Fujino et al. "Chem. Pharm. Bull., 29, 2825, 1981).
• Besondere Beispiele für Verbindungen der Formel (I) sind (H₂N-L-Arg(Pmc)-L-Thr(OtBu)-L-Tyr(OtBu)-CO)₄-(Lys)₂-Lys-Gly-OH (P-PAM) (H₂N-L-Arg-L-Thr-L-Tyr-CO)₄-(Lys)₂-Lys-Gly-OH (L-PAM) (H₂N-D-Arg-D-Thr-D-Tyr-CO)₄-(Lys)₂-Lys-Gly-OH (D-PAM)
• Wie in den nachfolgenden Beispielen detaillierter beschrieben wird, erwiesen sich die Peptidverbindungen der Formel (I) als aktiv in einem in vivo-Test bei Mäusen, die systemischen Lupus Erythematosus entwickelten. Es zeigte sich insbesondere, dass sie die Sterblichkeitsrate behandelter Tiere herabsetzten und den durch die Krankheit verursachten Nierenschaden verringerten.
• Die Peptidverbindungen der Formel (I) erwiesen sich zusätzlich bei Tests zu akuter Toxizität in Mäusen, entweder mit oraler oder intravenöser Verabreichung, als gut verträglich und frei von immunogenen Eigenschaften.
• Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden vorzugsweise in einer geeigneten Dosierungsform hergestellt, die eine wirksame Dosierung mindestens einer Peptidverbindung der Formel (I) und mindestens einen pharmazeutisch verträglichen inerten Bestandteil umfasst.
• Beispiele geeigneter Dosierungsformen sind Pillen, Kapseln, beschichtete Pillen, Granulate, Lösungen und Sirupe für orale Verabreichung, Salben und Pflaster für topische Verabreichung; Zäpfchen für rektale Verabreichung und sterile Lösungen für Injektions-, Inhalations- und ophthalmische Verabreichung.
• Die Dosierungsformen können auch andere übliche Bestandteile wie Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel, oberflächenaktive Mittel, Puffer, Salze zur Regulierung des osmotischen Drucks, Emulsionsmittel, Süßungsmittel, Farbstoffe, Geschmacksstoffe und dergleichen enthalten.
• Falls für bestimmte Therapien erforderlich, kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung weitere aktive pharmakologische Bestandteile umfassen, deren gleichzeitige Verabreichung therapeutisch nützlich ist.
• Die Menge einer Peptidverbindung der Formel (I) in einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in einem ziemlichen weiten Bereich in Abhängigkeit von bekannten Faktoren wie beispielsweise der Art der zu behandelnden Krankheit, der Schwere der Krankheit, dem Körpergewicht des Patienten, der Dosierungsform, der gewählten Verabreichungsroute, der Anzahl der täglich verabreichten Dosierungsformen und der Wirksamkeit der gewählten Peptidverbindung der Formel (I) variieren.
• Typischerweise wird die Menge einer Peptidverbindung der Formel (I) in einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung eine Verabreichungskonzentration von 1 bis 200 mg/kg/Tag, vorzugsweise von 2 bis 50 mg/kg/Tag sicherstellen.
• Die Dosierungsformen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung können nach Verfahren hergestellt werden, die dem pharmazeutischen Chemiker bekannt sind, und umfassen Verfahren wie beispielsweise Mischen, Granulierung, Tablettierung, Lösen, Sterilisieren und dergleichen.
• Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter beschrieben, die nur der Veranschaulichung dienen und nicht als eine Beschränkung der Erfindung aufgefasst werden sollten.
• BEISPIEL 1
• Stabilität gegenüber proteolytischen Enzymen
• Die Stabilität der Peptidverbindungen der Formel (I) gegenüber einem proteolytischen Angriff durch Proteasen wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) beurteilt.
• Mausseren wurden durch Abschneiden eines kleinen Teils der Schwanzspitze und Sammeln einiger Bluttropfen erhalten. Nach dem Sammeln wurde das Blut 1 Stunde bei 37°C inkubiert und das Serum dann vom Gerinnsel durch 20-minütige Zentrifugation bei 1200 g bei 4°C entfernt. Verschiedene Mengen der Peptidverbindungen nach Formel (I) wurden zu 50 μl Serum gegeben und das Gemisch bei 37°C für verschiedene Zeitdauern inkubiert. Danach wurden 2 μl des Reaktionsgemisches zu 50 μl 0,1 M Essigsäure gegeben, um die Peptidverbindung von Serumimmunoglobulinen zu eluieren. Die Proben wurden dann bis zur Verwendung bei –80°C gelagert.
• Die Analyse der Proben wurden auf einer Aquapore RP-8-Säule (30 × 2,1 mm I. D.) durchgeführt, wobei die äquilibrierte Säule bei einer Flussrate von 0,5 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0,1% Trifluoressigsäure-Puffer eluiert wurde, der eine innerhalb von 35' von 5% auf 60% ansteigende Acetonitrilkonzentration enthielt. Die Elution wurde durch Extinktion bei 225 nm überwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
• TABELLE 1

  
• Die in Tabelle 1 dargestellten Daten zeigen, dass D-PAM sich gegenüber einem proteolytischem Angriff als stabiler erwies als L-PAM.
• BEISPIEL 2
• Immunogenizität
• Die Fähigkeit von Peptidverbindungen der Formel (I) zum Auslösen einer Antikörperanwort wurde durch Immunisierung von zwei Gruppen mit jeweils vier Balb/c-Mäusen mit 100 μg D-PAM bzw. L-PAM durch i. p.-Injektion beurteilt. Nach der ersten Immunisierung wurde das gleiche Immunogen bei zwei nachfolgenden Boosts verabreicht, und Blutproben wurden von jedem Tier entnommen, um die Antikörpertiter wie nachfolgend beschrieben durch einen ELISA-Assay zu überwachen.
• Mikrotiterplatten aus Polystyrol (Falcon Kat.-Nr. 3912) wurden mit 50 μg/ml an BSA konjugiertem D-PAM und L-PAM (100 μl/Well) in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer (pH 8,5) beschichtet und bei 4°C über Nacht inkubiert. Nachdem die Mikrotiterplatten zehnmal mit 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,2 (PBS), der 150 mM NaCl enthielt, gewaschen worden waren, wurden die Wells 1 Stunde bei 37°C mit 200 μl Rinderserumalbumin (BSA, Sigma Kat.-Nr. A-9418) enthaltendem PBS abgesättigt, um die unbeschichtete Plastikoberfläche zu blockieren. Die Platten wurden dann erneut mit 0,05% Tween 20 (PBS-T) enthaltendem PBS gewaschen und mit Proben befüllt (100 μl/Well), die zuvor mit 1% BSA enthaltendem PBS-T (PBS-T-B) verdünnt worden waren. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C und anschließendem Waschen wurden die Wells mit 100 μl Meerrettichperoxidase-markiertem Schaf-Anti-Maus Immunglobulin F (ab')₂-spezifischer Lösung (Sigma, Kat.-Nr. A-7282) befüllt, die 1000-fach mit PBS-T-B verdünnt war. Man ließ die Platten dann 1 Stunde bei 37°C stehen, wusch zehnmal und befüllte sie dann mit 150 μl 2,2-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolinsulfonat] (ABTS) als chromogener Substratlösung, die nach Anleitung des Herstellers (Boehringer Mannheim Kat.-Nr. 1112422) frisch hergestellt worden war. Man ließ die Farbe 30' entwickeln und bestimmte die Extinktionen bei 405 nm mit einem ELISA-Plattenleser (Labsystems Multiskan Bichromatic). Präimmunserum wurde als Kontrolle verwendet.
• Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
• TABELLE 2

  
• Die in Tabelle 2 dargestellten Daten zeigen, dass L-PAM und D-PAM selbst im empfänglichen Mausstamm Balb/c nicht in der Lage sind, eine Antikörperantwort hervorzurufen.
• BEISPIEL 3
• Anti-Mensch systemische Lupus Erythematosus-Aktivität in vivo
• In vivo-Untersuchungen zur Aktivität der Peptidverbindungen der Formel (I) wurden unter Verwendung eines experimentellen Tiermodells für menschlichen systemischen Lupus Erythematosus durchgeführt. MRL/Ipr, NZB/NZW oder BXSB bezeichnen Mausstämme, die spontan ein Autoimmunsyndrom entwickeln, das auffällige Ähnlichkeiten mit menschlichem systemischem Lupus Erythematosus aufweist. Der Stamm MRL-Ipr/Ipr ist für das Gen Ipr homozygot. Die Ipr-Mutation verursacht funktionale Defekte beim Fas-Ag. Fas gehört zur TNF-Rezeptorfamilie und vermittelt Apoptose (Watanabe-Fukunaga, R. et al., "Nature", 356, 314, 1992; Itoh, N., et al., "Cell", 66, 233, 1991; Murphy, E. D., "Immunological defects in Laboratory Animals", 2, 143, 1981; Steinberg, A. D., "Semin. Immunol.", 6, 55, 1994). Die Autoimmunkrankheit in MRL/Ipr-Mäusen ist gekennzeichnet durch die Produktion von Autoantikörpern, Vasculitis, Arthritis und Glomerulonephritis, welche die Haupttodesursache ist (Theofilopoulos, A. N., et al., "Adv. Immunol.", 37, 269, 1985; Cohen, P. L., et al., "Annu. Rev. Immunol.", 9, 243, 1991).
• Ab einem Alter von 7 Wochen wurden die Mäuse zweimal pro Woche mit 1 mg intraperitoneal verabreichtem D-PAM, L-PAM oder Placebo (als Positivkontrolle) behandelt. Die Behandlung wurde bei einem Alter von 30 Wochen abgesetzt. Die Mäuse wurden täglich auf klinische Anzeichen der Krankheit und Mortalität untersucht, und alle zwei Wochen wurde zur Bestimmung der Produktion von Anti- DNA-Antikörpern Blut entnommen, während Proteinkonzentrationen im Harn über zweimal wöchentlich genommene Proben bestimmt wurden.
• Der standardmäßige ELISA-Assay zur Messung der Serumkonzentrationen von Anti-DNA-Antikörpern wurde wie folgt durchgeführt. Mikrotiterplatten (Costar, Kat.-Nr. 3590) wurden mit einer Lösung von 10 μg/ml DNA (Sigma, Kat.-Nr. D-8899) in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 8,0) beschichtet (100 μl/Well) und bei 4°C über Nacht inkubiert. Nachdem die Mikrotiterplatten zehnmal mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,2) (PBS), der 150 mM NaCl und 0,05% Tween enthielt (PBS-T), gewaschen worden waren, wurden die Wells mit 200 μl PBS-T, das 1 Stunde bei 56°C durch Hitze inaktiviertes fötales Kälberserum (1%) enthielt (PBS-T-FCS), abgesättigt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um die unbeschichtete Plastikoberfläche zu blockieren. Die Platten wurden dann erneut mit PBS-T gewaschen und mit Proben befüllt (100 μl/Well), die zuvor mit PBS-T-FCS verdünnt worden waren. Nach zweistündiger Inkubation bei Raumtemperatur und anschließendem Waschen wurden die Wells mit 100 μl einer 1000-fach mit PBS-T-FCS verdünnten Lösung von Meerrettichperoxidase-markierten Ziege-Anti-Maus-polyvalenten Immunglobulinen (IgG, IgA, IgM) (Sigma, Kat.-Nr. A-0412) befüllt. Man ließ die Platten dann 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen, wusch zehnmal und befüllte sie mit 150 μl o-Phenylendiamindihydrochlorid (Sigma Kat.-Nr. P-6912) chromogener Substratlösung, die gemäß Anleitung des Herstellers frisch hergestellt worden war. Man ließ die Farbe 30' entwickeln und bestimmte die Extinktion bei 450 nm mit einem ELISA-Plattenlesegerät (Labsystems Multiskan Bichromatic).
• Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
• TABELLE 3

  
• Die in Tabelle 3 dargestellten Daten zeigen, dass der Grad der Produktion von Anti-DNA-Antikörpern behandelter Gruppen sich nicht von dem der Kontrollgruppe unterschied.
• Die Proteinkonzentrationen im Harn wurden über colorimetrische Analyse unter Verwendung von Dipsticks (Combur 7, Boehringer Mannheim, Kat.-Nr. 185515) gemäß den Protokollen des Herstellers (Wang et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 93, 8563–8568, 1996) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
• TABELLE 4

  
• Die in Tabelle 4 dargestellten Daten zeigen, dass in Tieren, die mit L-PAM und D-PAM behandelt worden waren, im Vergleich zu unbehandelten Tieren eine deutliche Verzögerung des Einsetzens schwerer Proteinurie erreicht werden konnte. Während 90% der Kontrollmäuse Proteinurie entwickelt hatten, entwickelten mit D-PAM-Peptid behandelte Mäuse in den ersten 20 Wochen keine Proteinurie, und ein signifikanter Prozentsatz dieser Mäuse hielt während der Behandlungsdauer eine normale Nierenfunktion ohne Anzeichen von Proteinurie aufrecht.
• Eine dramatisch verlängerte Überlebensdauer wurde einhergehend mit den verbesserten klinischen Zeichen schwerer Immunkomplexnephritis beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
• TABELLE 5

  
• Die in Tabelle 5 dargestellten Daten zeigen, dass nach 30 Wochen 80% der mit D-PAM behandelten Mäuse noch am Leben waren, während nur 10% der mit Placebo behandelten Tiere noch am Leben waren.
• Weiterhin wurde eine histopathologische Untersuchung am Nierengewebe aus Tieren durchgeführt, die D-PAM, L-PAM oder Placebo behandelt worden waren. Die Nieren eingeschläferter Tiere wurden in 10% gepuffertem Formalin fixiert und die Gewebe dann verarbeitet und in Parafinblöcke eingebettet. Gewebeschnitte mit einer Dicke von ungefähr 5 μm wurden von jedem Block erhalten, und vor der Untersuchung im Lichtmikroskop mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Eine Behandlung mit L-PAM und D-PAM induzierte im Vergleich mit der Positivkontrollgruppe eine offensichtliche Verringerung des Fortschreitens der Glomerulonephropathie.

Claims (2)

1. Verwendung einer Peptidverbindung der Formel (H₂N-X₁-Thr-X₂-CO)_n-R (I)worin X₁ und X₂ verschieden sind und einen Aminosäurerest von Tyrosin und Arginin in L- oder D-Konfiguration bedeuten, worin die Hydroxigruppe von Threonin und der Guanidinteil von Arginin durch eine Verbindung geschützt sein können, die in der Peptidchemie zum Schutz der Hydroxigruppe bzw. des Guanidinteils üblicherweise verwendet wird, n für 2, 3 oder 4 steht und R eine Gruppe ist, die in der Lage ist, ein dimeres, trimeres bzw. tetrameres Peptid zu bilden, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Behandlung von systemischem Lupus Erythematosus brauchbar ist.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass n für 4 steht.