DE69736244T2

DE69736244T2 - Lösliche lymphotoxin-beta rezeptoren, anti-lymphotoxin-antikörper und anti-lymphotoxin ligand antikörper als therapeutische wirkstoffe zur behandlung von immunologischen krankheiten

Info

Publication number: DE69736244T2
Application number: DE69736244T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Brookline BROWNING; Susan Paula Newton HOCHMAN; D. Paul Holliston RENNERT; Fabienne Watertown MacKAY
Original assignee: Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2017-10-25
Also published as: IL129527A0; PL190617B1; NO991926D0; BG63565B1; IL129527A; HUP9904516A2; JP2001502697A; EE9900146A; EP0954333B1; SK55399A3; EA199900409A1; HU226467B1; NZ335353A; DE69736244D1; PT954333E; KR20000052800A; CN1237910A; CA2269614A1; CN101239186A; NO328540B1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verwendungen von „Lymphotoxin-β-Rezeptor-blockierenden Wirkstoffen", welche die Signalgebung des Lymphotoxin-β-Rezeptors blockieren. Lymphotoxin-β-Rezeptor-blockierende Wirkstoffe eignen sich für die Behandlung von Antikörper-vermittelten Immunantworten, für die Regulation der Expression von Addressinen und des Zelltrafficking sowie für die Beeinflussung der Differenzierung von follikulären dendritischen Zellen. Die vorliegende Erfindung betrifft lösliche Formen der extrazellulären Domäne des Lymphotoxin-β-Rezeptors und Antikörper, die entweder gegen den Lymphotoxin-β-Rezeptor oder gegen seinen Liganden, das Oberflächen-Lymphotoxin, gerichtet sind, die als Lymphotoxin-β-Rezeptor-blockierende Wirkstoffe wirken.
Hintergrund der Erfindung
Es gibt zwei Arme der erworbenen Immunität, die zwar in der Lage sind, zusammenzuarbeiten, um das gemeinsame Ziel der Eliminierung eines Antigens zu erreichen, die jedoch durch verschiedenartige Mitwirkende des Immunsystems mit unterschiedlichen Effekten vermittelt werden. Der eine Arm der erworbenen Immunantwort, die humorale Immunität, wird hauptsächlich durch B-Zellen und zirkulierende Antikörper vermittelt. Der andere Arm, der als zelluläre oder zellvermittelte Immunität bezeichnet wird, wird durch T-Zellen vermittelt, welche Cytokine, die andere Zellen beeinflussen, synthetisieren und ausarbeiten („elaborate").
Für die Aktivierung und Differenzierung von B-Zellen als Antwort auf die meisten Antigene ist es erforderlich, dass (1) B-Zellen über ihren Antigen-spezifischen Rezeptor, Membran-Ig, ein Antigensignal erhalten, und dass (2) B-Zellen Kontakt-abhängige und -unabhängige Signale von aktivierten T-Zellen erhalten. Das Kontakt-abhängige co-stimulatorische Signal resultiert aus der Ligierung des CD40-Rezeptors auf B-Zellen mit dem auf aktivierten T-Helferzellen exprimierten CD40-Liganden (Laman et al., Crit. Rev. Immunol. 16, S. 59-108 (1996); Van Kooten und Banchereau, Adv. Immunol. 61, S. 1-77 (1996)). Eine Kontakt-unabhängige Signalgebung wird durch Cytokine vermittelt, die durch aktivierte T-Zellen synthetisiert und ausgearbeitet werden. Zusammen steuern diese Kontakt-abhängigen und -unabhängigen Signale B-Zellen, sich entweder zu (1) Gedächtnis-B-Zellen, die so vorliegen, dass sie bei einer sekundären Exposition gegenüber dem Antigen eine schnellere Antwort vermitteln, oder zu (2) Antikörper-ausscheidenden Plasmazellen zu differenzieren. Plasmazellen, welche das letzte Differenzierungsstadium von B-Zellen darstellen, synthetisieren Antikörper und scheiden sie aus.
Die T-Helferzellen („Th") spielen im Immunsystem verschiedene signifikante Rollen. Für Cytokine, die von Th-Zellen zu Beginn einer immunologischen Provokation ausgearbeitet werden, wurde gezeigt, dass sie diejenigen Stoffwechselwege von Immuneffektoren beeinflussen, die anschließend aktiviert werden. Th-Zellen werden durch die Wechselwirkung ihres Antigen-spezifischen Rezeptors mit Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) aktiviert, welche auf ihren Oberflächen Peptidfragmente eines prozessierten fremden Antigens in Assoziation mit MHC-Molekülen der Klasse II präsentieren. Aktivierte Th-Zellen ihrerseits sekretieren Cytokine (Lymphokine), welche die geeigneten Immuneffektor-Mechanismen aktivieren.
Die Zellen können aufgrund ihrer Cytokin-Sekretionsmuster in die drei Untergruppen Th0, Th1 und Th2 eingeteilt werden (Fitch et al., Ann. Rev. Immunol. 11, S. 29-48 (1993)). In Mäusen produzieren nicht-stimulierte „naive" T-Helferzellen IL-2. Eine kurzfristige Stimulation von Th-Zellen führt zu Th0-Vorläuferzellen, die ein großes Spektrum von Cytokinen produzieren, einschließlich IFN-α, IL-2, IL-4, IL-5 und IL-10. Chronisch-stimulierte Th0-Zellen können sich zu entweder Th1- oder Th2-Zelltypen differenzieren, woraufhin sich das Cytokin-Expressionsmuster ändert. Bestimmte Cytokine, z.B. IL-3, GM-CSF und TNF, werden sowohl durch Th1- als auch durch Th2-Zellen freigesetzt. Andere Cytokine werden ausschließlich durch nur eine Untergruppe von Th-Zellen hergestellt (Romagnani et al., Ann. Rev. Immunol. 12, S. 227-257 (1994)). Th1-Zellen produzieren LTα, IL-2 und IFN-γ, welche Makrophagen und Entzündungsantworten aktivieren, die mit der zellulären Immunität und Resistenz gegenüber intrazellulären Infektionen assoziiert sind.
Th2-Zellen produzieren die Cytokine IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10, welche die Produktion von Eosinophilen und Mastzellen steigern und die vollständige Entfaltung und Reifung von B-Zellen fördern (Howard et al., „T cell-derived cytokines and their receptors", Fundamental Immunology, 3. Aufl., Raven Press, New York (1993)). Außerdem sind Th2-Zellen an der Erzeugung des B-Zellen-Gedächtnisses, der somatischen Mutation und somit der Reifung der Affinität und an der Regulation des de novo-Immunglobulin-Isotyp-Wechsels beteiligt. Z.B. bewirkt das Th2-Cytokin IL-4, dass aktivierte B-Zellen zu dem IgG1-Isotyp wechseln, während andere Isotypen supprimiert werden. Außerdem stimuliert IL-4 die Überproduktion von IgE in Überempfindlichkeitsreaktionen vom Typ I. Das Th2-Cytokin IL-5 induziert den IgA-Isotyp, der in der Schleimhaut-Immunität wichtig ist.
Die sekundären lymphatischen Gewebe wie Lymphknoten (LN), lymphatische Gewebe von Milz und Schleimhaut, sind hocheffizient darin, fremde Stoffe abzufangen und zu konzentrieren, und sie sind die Hauptstellen einer Antigen-gesteuerten Aktivierung und Differenzierung von T- und B-Lymphocyten. Diese Prozesse sind abhängig von der Vielfältigkeit und Organisation von Zellen in diesen Geweben, wodurch ein Gerüst für zahlreiche Aspekte humoraler Immunantworten bereitgestellt wird, wie T/B-Zell-Interaktionen, Bildung von Keimzentren (GC), Reifung der Affinität, Wechsel von Immunglobulinklassen und Zelltrafficking (Klein, J., Immunology, John Wiley and Sons, (1982)). Die molekularen Mechanismen, die für die Entwicklung, strukturelle Erhaltung und Funktion von peripheren lymphatischen Geweben verantwortlich sind, konnten noch nicht vollständig aufgeklärt werden.
Obwohl die allgemeine Struktur der sekundären lymphatischen Gewebe sich zwischen Arten von Säugern deutlich unterscheidet und Variationen zeigt, weist die Feinstruktur dieser sekundären lymphatischen Gewebe bestimmte gemeinsame Merkmale auf, wie z.B.: (1) die Antigen-Zugänglichkeit, (2) Strukturmerkmale, die eine fortgesetzten Kontakt von Antigen mit Lymphocyten sicherstellen, (3) T-Zellen-reiche Bereiche, die von B-Zellen umgeben sind, (4) B-Zellen-reiche Follikel, (5) Marginalzonen-Typ-Stellen, (6) spezialisierte endotheliale Zellen und (7) Stellen der Antikörperproduktion, wie nachstehend noch ausführlicher diskutiert wird.
Die sekundären lymphatischen Gewebe sind für ein Antigen im System zugänglich. Z.B. erreicht ein Antigen die Milz über die Sinus-Blutversorgung, den LN über die zuführenden Lymphgefäße und wird durch ein spezialisiertes Epithel hindurch in das lymphatische Gewebe der Schleimhaut transportiert.
Die sekundären lymphatischen Gewebe haben in verschiedenen Arten auch bestimmte Strukturmerkmale gemeinsam, wie follikuläre dendritische Zellen (FDC) und interdigitierende Zellen (IDC), die das fortgesetzte Vorliegen eines Antigens in Lymphocyten-reichen Bereichen der Gewebe sicherstellen.
Ein weiteres gemeinsames Merkmal ist das Vorliegen von T-Zellen-reichen Bereichen, die von B-Zellen umgeben sind. T-Zellen-reiche Bereiche schließen z.B. die periarteriolären lymphatischen Lappen in der weißen Pulpa der Milz und die parakortikale Region von LN ein, die zahlreiche rezirkulierende T-Zellen und IDC enthalten, welche ihrerseits als akzessorische Zellen für T- und B-Zellen fungieren.
Außerdem weisen lymphatische Gewebe typischerweise B-Zellen-reiche primäre und sekundäre Follikel in der weißen Pulpa der Milz und im Kortex der LN auf. Sekundäre Follikel in solchen lymphatischen Geweben werden auch Keimzentren (GC) genannt und besitzen ein dichtes FDC-Netzwerk, um Antigene einzufangen und zu präsentieren.
Bereiche vom Marginalzonen-Typ werden auch als definierte histologische Bereiche in der murinen Milz und in diffuseren Stellen in sekundären lymphatischen Organen des Menschen festgestellt. Diese Bereiche bestehen hauptsächlich aus Marginalzonen-Makrophagen (MZM), metallophilen Makrophagen (MM), Marginalzonen-B-Zellen und Retikulumzellen, können jedoch auch T-Zellen und dendritische Zellen einschließen (Kraal, Int. Rev. Cytol. 132, S. 31-74 (1992)). Die Öffnung des arteriellen Blutstroms in die Marginalzonenbereiche hinein führt dazu, dass Antigene einen direkten Zugang zu diesen Zellen haben, und fördert an dieser Stelle zelluläre Reaktionen gegen die Antigene (Kraal, Int. Rev. Cytol. 132, S. 31-74 (1992)). Das Vorliegen von MZM ist außerdem für ein optimales Zelltrafficking von B-Zellen in der weißen Pulpa der Milz erforderlich (Kraal, 1992; Kraal et al., Immunology 68, S. 227-232 (1989)).
Typischerweise treten Blutlymphocyten in die sekundären lymphatischen Gewebe ein, indem sie ein spezialisiertes Endothelium durchkreuzen, z.B. die endotheliale Auskleidung der Venolen von LN (der hochendothelialen Venolen, HEV) und die endotheliale Auskleidung der Sinus-Blutgefäße der Milz in den Marginalzone-artigen Strukturen. Dieses Endothelium exprimiert Adhäsionsmoleküle und Addressine, die beim Zelltrafficking zu sekundären lymphatischen Geweben eine Rolle spielen. Z.B. unterscheiden sich periphere LN-Adressine (PNAd) von dem Schleimhaut-LN-Addressin, MAdCAM-1, das am Trafficking von Lymphocyten zu lymphatischen Geweben der Schleimhaut, umfassend Gewebe wie die Mesenterial-LN, Peyer'-Plaques und Lamina propria, beteiligt ist.
Nicht alle Addressine sind klar definiert, z.B. konnte das Addressin für das gezielte Hinlenken („Homing") von Lymphocyten zur Milz noch nicht definiert werden. Die physiologischen Rollen dieser Addressine schließen ein Steigern der Rekrutierung von geeigneten Sätzen von Antigen-spezifischen Lymphocyten für eine Immunantwort und die anschließende Verteilung der Immunantwort über den ganzen Körper ein.
Schließlich werden die Plasmazellen, welche die Antikörper-produzierenden Plasmazellen sind, an unterschiedlichen Positionen nachgewiesen, von wo aus die Vorläufer-B-Zellen durch ein Antigen aktiviert werden. Z.B. kommt ein Antikörper, der durch Plasmazellen in der roten Pulpa der Milz produziert wird, hauptsächlich durch die Aktivierung von B-Zellen in T-Zell-Zonen zustande, und Plasmazellen im Mark von LN stammen von B-Zellen, die in T-Zell-Zonen des gleichen Knotens aktiviert wurden. Genauso stammen Antikörper, die durch Plasmazellen im Knochenmark produziert werden, von B-Zellen, die in Milz und Lymphknoten aktiviert wurden, und Plasmazellen in der Lamina propria des Darms stammen hauptsächlich von B-Zellen, die in Mesenterial-LN oder Darm-assoziiertem lymphatischem Gewebe aktiviert wurden.
Vgl. z.B. ICM MacLennan, „The Structure and Function of Secondary Lymphoid Tissues", in: Clinical Aspects of Immunology, 5. Aufl., Hrsg. P. J. Lachman, Sir D. K. Peters, F. S. Rosen, M. J. Walport, Blackwell Scientific Publications, S. 13-30 (1993).
Im Allgemeinen laufen die zellulären/histologischen Ereignisse, die einer humoralen Immunreaktion gegen T-abhängige Antigene zugrunde liegen, wie folgt ab (Toellner et al., J. Exp. Med. 183, S. 2303-2312 (1996)):
In der Induktiven Phase werden naive B- und T-Zellen für die Immunantwort aktiviert und rekrutiert, dies erfolgt in den Tagen, unmittelbar nachdem das Antigen in den Körper eingedrungen ist. Z.B. treffen in der Milz innerhalb von 12 Stunden nach einer Immunisierung für eine sekundäre Antwort die Gedächtnis-B-Zellen in der Marginalzone auf ein im Blut vorliegendes Antigen und verlassen die Marginalzone, um zu den T-Zell-Zonen hinzuwandern. B-Zellen können innerhalb von 24 Stunden in den T-Zell-Zonen nachgewiesen werden. Transkripte aus einem Immunglobulinwechsel können innerhalb von 12 Stunden nach einer sekundären Antigenexposition nachgewiesen werden, dies zeigt, dass die T-B-Zellen-Interaktion bereits stattgefunden hat. Danach wandern die B-Zellen zu den Austrittzonen und der roten Pulpa, wo sie proliferieren, wobei sie Foci von B-Zellen-Blasten bilden und sich zu Plasmazellen differenzieren. Außerdem proliferieren die B-Zellen weiterhin in der IDC-reichen T-Zell-Zone. Innerhalb von vier Tagen nach der Immunisierung und nach der Proliferation in den GC wird die Produktion von B-Gedächtniszellen beginnen. In einer primären Antwort sind am Tag zehn gut entwickelte GC zu sehen, deren Größe am Tag 14 nach der Immunisierung einen Peak erreicht.
Die Proliferation von T-Zellen in den T-Zell-Zonen wird nach 48 bis 72 Stunden offensichtlich und erreicht am Tag sieben nach der Immunisierung einen Peak. Diese Proliferation von T-Zellen trägt zu der T-Zell-abhängigen Aktivierung von B-Zellen bei. Das Ausmaß der Proliferation in der T-Zell-Zone nimmt ab, wenn sich ein GC bildet. Die Proliferation von T-Zellen findet auch im GC statt, wo Centrocyten (B-Zellen) in der dunklen Zone ein Antigen von den IDC aufnehmen und das Antigen in der hellen Zone den T-Zellen präsentieren.
Ein T-Zell-abhängiges Antigen kann die Aktivierung von Marginalzonen-B-Zellen, von neu produzierten naiven B-Zellen und von rezirkulierenden Lymphocyten, die durch Addressine und Adhäsionsmoleküle zu sekundären lymphatischen Organen angezogen und darin festgehalten werden, bewirken. Naive B-Zellen zeigen die gleiche Kinetik für das Hinwandern zur T-Zell-Zone usw., wie dies bei den aktivierten B-Zellen der Fall ist.
Etablierte Phase von T-Zell-abhängigen Antworten
Die etablierte Phase von T-Zell-abhängigen Antworten wird durch die fortgesetzte Aktivierung von Gedächtnis-B-Zellen in den Follikeln von sekundären lymphatischen Organen aufrechterhalten. In diesem Stadium erfolgt eine sehr geringe Rekrutierung von naiven B-Zellen, und die Antwort wird hauptsächlich durch das Antigen gesteuert, das auf den FDC zurückgehalten wird. GC sind erforderlich für eine/einen optimale/n Gedächtniserzeugung, Isotyp-Wechsel, somatische Mutation und somit Reifung der Affinität von Immunglobulin.
Das Aufbauen solcher Lymphocyten-Antworten führt zur Produktion von Antikörpern, die in der Lage sind, im ganzen Körper auf verschiedenen Routen zu zirkulieren, z.B. verlassen Antikörper die Milz über das Blut, und sie treten aus den LN über die austretende Lymphflüssigkeiten aus. Die Antikörper treffen auf diese Weise auf das eindringende Pathogen und binden es direkt. Dieses Erkennungsereignis setzt eine Kaskade von Immuneffektormechanismen in Gang, einschließlich Aktivierung der Komplementkaskade und zellulärer Reaktionen, wodurch der Schutz des Wirts gegen das Pathogen vermittelt wird.
Antikörper spielen auch in einigen pathologischen Antworten eine Rolle, etwa bei Überempfindlichkeitsreaktionen, wobei es sich um ungeeignete oder falsch proportionierte Immunantworten handelt, die bei Kontakt mit einem vorher schon kontaktierten Antigen hervorgerufen werden. Man kennt vier Arten von Überempfindlichkeit.
Die „unmittelbare Überempfindlichkeit" vom Typ I umfasst eine Allergen-induzierte Aktivierung von T2-Zellen und Freisetzung von Th2-Cytokin. Das Th2-Cytokin IL-4 stimuliert B-Zellen, so dass sie einen Isotyp-Wechsel durchlaufen, wodurch IgE produziert wird, das seinerseits Mastzellen dazu aktiviert, akute Entzündungsreaktionen zu produzieren, wie diejenigen, die zu Ekzemen, Asthma und Rhinitis führen.
Überempfindlichkeit der Typen II und III werden durch IgG- und IgM-Antikörper verursacht, die gegen Zelloberflächenantigene oder spezifische Gewebeantigene (Typ II) oder lösliche Serumantigene gerichtet sind, wodurch zirkulierende Immunkomplexe gebildet werden (Typ III).
Die Überempfindlichkeit vom Typ IV vom „verzögertem Typ" (DTH) ist eine von Th1-Zellen vermittelte Antwort und kann zwischen Mäusen übertragen werden, indem Th1-Zellen übertragen werden, nicht jedoch, indem Serum alleine übertragen wird. Dieses Merkmal unterscheidet die Typ-IV-DTH von den anderen drei Überempfindlichkeits-Typen, für welche humorale Immunantworten erforderlich sind, die hauptsächlich durch Antikörper bewirkt werden, welche in einem zellfreien Serum übertragen werden können (Roitt et al., Immunology, S. 19.1-22.12 (Mosby-Year Book Europe Ltd., 3. Aufl., 1993)).
Pathologische humorale Immunantworten sind mit einer Reihe von organspezifischen und systemischen Autoimmunerkrankungen assoziiert, wie Systemischer Lupus erythematodes, Wegener-Granulomatose, Polyarteriitis nodosa (PAN), Schnell Fortschreitende Sichelförmige Glomerulonephritis und Idiopathische thrombozytopenische Purpura, außerdem chronische entzündliche Erkrankungen wie Basedowsche Krankheit und Chagas-Krankheit. Außerdem können humorale Immunantworten an der Abstoßung von transplantiertem Gewebe und transplantierten Organen beteiligt sein.
Für die Behandlung dieser verschiedenen immunologischen Erkrankungen wurden bisher im Allgemeinen immunmodulatorische und immunsuppressive Wirkstoffe eingesetzt. Drei allgemeine immunsuppressive Wirkstoffe, die zurzeit eingesetzt werden, sind Steroide, Cyclophosphamid und Azathioprin.
Steroide sind pleiotrope entzündungshemmende Wirkstoffe, die aktivierte Makrophagen unterdrücken und die Aktivität von Antigen-präsentierenden Zellen so hemmen, dass zahlreiche pathologische Effekte von T-Zellen aufgehoben werden. Cyclophosphamid, ein alkylierender Wirkstoff, vermittelt den Zelltod durch Hemmung der DNA-Replikation und -Reparatur. Azathioprin ist ein anti-proliferativer Wirkstoff, der die DNA-Synthese hemmt. Diese unspezifischen Immunsuppressiva sind im Allgemeinen in hohen Dosen erforderlich, wodurch ihre Toxizität (z.B. Nephro- und Hepatotoxizität) erhöht wird und unerwünschte Nebenwirkungen verursacht werden. Somit sind sie für langfristige Therapien ungeeignet.
In WO 94/13808 wird erwähnt, dass LT-β möglicherweise in der Behandlung von SLE eingesetzt werden kann.
Somit besteht ein nicht gestillter Bedarf an zusätzlichen Wirkstoffen und Therapien, welche die Probleme lösen, die durch herkömmliche Behandlungen verursacht werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung löst die vorstehend angesprochenen Probleme, indem sie Verwendungen gemäß der Definition in den Ansprüchen 1 bis 19 bereitstellt. Zusammensetzungen und Verfahren, umfassend LT-β-R-blockierende Wirkstoffe, sind geeignet, Antikörper-vermittelte Immunantworten zu hemmen, Addressin-Expressionsraten und Zelltrafficking zu regulieren, die Differenzierung von follikulären dendritischen Zellen zu beeinflussen und die strukturelle Organisation von sekundären lymphatischen Geweben und ähnlichen lymphatischen Strukturen, die zu pathologischen Zuständen wie z.B. systemischem Lupus erythematodes und idiopathischer thrombozytopenischer Purpura führen, zu verändern. Außerdem sind LT-β-R-blockierende Wirkstoffe geeignet, die Assoziation zwischen Immunkomplexen und B-Zellen zu verändern, und sie können die Präsentation oder Ablagerung von Antigenen auf Zellen verhindern, oder alternativ können sie die bereits auf Zellen vorliegenden Antigene im Wesentlichen lösen oder abspalten.
Der LT-β-R-blockierende Wirkstoff ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus dem löslichen Lymphotoxin-β-R, einem Antikörper, der gegen den LT-β-R gerichtet ist, und einem Antikörper, der gegen einen Oberflächen-LT-Liganden gerichtet ist, besteht.
In einer Ausführungsform werden lösliche Formen der extrazellulären Domäne des Lymphotoxin-β-Rezeptors verwendet, die als LT-β-R-blockierende Wirkstoffe wirken. Vorzugsweise umfassen sie ein rekombinantes Lymphotoxin-β-Rezeptor-Fusionsprotein, bei dem die extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne von LT-β-R mit einer konstante Domäne der schweren Kette eines Immunglobulins verbunden ist. Stärker bevorzugt ist die Ligandenbindungsdomäne von LT-β-R mit einer menschlichen IgG-Fc-Domäne verbunden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Antikörper verwendet, die als LT-β-R-blockierende Mittel wirken. Vorzugsweise werden ein oder mehrere Antikörper eingesetzt, die gegen den Lymphotoxin-β-Rezeptor gerichtet sind. Stärker bevorzugt ist der Antikörper ein monoclonaler Antikörper. Andere Ausführungsformen umfassen einen oder mehrere Antikörper, die gegen ein Oberflächen-Lymphotoxin gerichtet sind. Stärker bevorzugt ist der Antikörper ein monoclonaler Antikörper, der gegen Lymphotoxin-β gerichtet ist. Bevorzugte Antikörper schließen den gegen den menschlichen LT-β-R gerichteten mAb BDA8 und den gegen menschliches LT-β gerichteten mAb B9 ein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In 1 ist eine Sequenz des extrazellulären Teils des menschlichen LTβ-Rezeptors dargestellt, welcher die Ligandenbindungsdomäne codiert.
In 2 ist eine immunhistochemische Analyse der Milz von Mäusen dargestellt, die mehrere Injektionen von LTβ-R-Ig- oder LFA-3-Ig-Fusionsproteinen und Antigen erhielten.
In 3 ist eine immunhistochemische Analyse dargestellt, welche die Abwesenheit von Keimzentren in Milzen von mit LTβ-R-Ig behandelten und mit MR-1 (anti-CD40-Ligand-Antikörper) behandelten Mäusen und das Vorliegen von follikulären dendritischen Zellen in Milzen von mit MR-1, jedoch nicht von mit LTβ-R-Ig behandelten Mäusen zeigt. Fusionsproteine und SRBC-Antigen wurden, wie für 2 beschrieben, verabreicht.
In 4 ist eine immunhistochemische Analyse dargestellt, welche zeigt, dass die Addressin-Expression in LN von Mäusen, die in utero und nach der Geburt kontinuierlich mit LTβ-R-Ig behandelt wurden, verändert ist.
In 5 ist eine immunhistochemische Analyse von Lymphocyten-Positionierung und Expression von Makrophagen-Markern in Mesenterial-LN von Mäusen dargestellt, die (wie in 4) in utero und nach der Geburt kontinuierlich mit LTβ-R-Ig behandelt wurden.
In 6 ist eine immunhistochemische Analyse dargestellt, die zeigt, dass die LTβ-R-Ig-Behandlung von Mäusen die Antikörperantwort auf SRBC hemmt.
In 7 ist ein Schema zum Einfangen von Immunkomplexen auf FDCs dargestellt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die folgende genaue Beschreibung ist angegeben, um die hier beschriebene Erfindung vollständig verständlich zu machen.
Die hier verwendeten Begriffe „Immunglobulin-Antwort" oder „humorale Antwort" beziehen sich auf die immunologische Antwort eines Tiers auf ein fremdes Antigen, wodurch das Tier Antikörper gegen das fremde Antigen produziert. Die Th2-Klasse von T-Helferzellen ist für die effiziente Produktion von Hochaffinitäts-Antikörpern wichtig.
Der hier verwendete Begriff „Keimzentrum" bezieht sich auf ein sekundäres B-Zellen-Follikel, das sich nach einer Antigen-Immunisierung bildet. Das Erscheinen dieser histologischen Stelle hängt zusammen mit einer optimalen Gedächtniserzeugung, Isotypen-Wechsel, somatischen Hypermutation und somit der Reifung der Affinität einer Antikörper-Antwort.
Die Begriffe „Marginalzone" oder „Marginalzonen-Typ-Bereich" beziehen sich auf histologisch beschriebenen Kompartimente der sekundären lymphatischen Gewebe, die hauptsächlich aus Marginalzonen-Makrophagen (MZM), metallophilen Makrophagen (MM), Marginalzonen-B-Zellen und Retikulumzellen und außerdem T-Zellen und dendritischen Zellen bestehen. Der arterielle Blutstrom ist zu den Randsinus hin offen, wodurch den Antigenen ein direkter Zugang zu diesen Zellen ermöglicht wird und zelluläre Reaktionen auf Antigene an dieser Stelle gefördert werden.
Der hier verwendete Begriff „Addressin" bezieht sich auf ein Molekül, das am Homing von Lymphocyten in sekundäre lymphatische Organen beteiligt ist. Solche Moleküle werden auf Endothelzellen, spezifisch auf den hochendothelialen Venolen in den Lymphknoten, exprimiert. Das Milz-Addressin ist nicht definiert. MAdCAM-1 ist ein Schleimhaut-Addressin; PNAd ist ein peripheres Addressin.
Der hier verwendete Begriff „T-Helferzellen (Th-Zellen)" bezieht sich auf eine funktionelle Subklasse von T-Zellen, die dazu beitragen, cytotoxische T-Zellen zu erzeugen, und die mit B-Zellen kooperieren, um die Antikörperproduktion zu stimulieren. Helfer-T-Zellen erkennen ein Antigen in Assoziation mit MHC-Molekülen der Klasse II und stellen Kontakt-abhängige und Kontakt-unabhängige (Cytokin-) Signale für Effektorzellen bereit.
Der hier verwendete Begriff „Cytokin" bezieht sich auf ein Molekül, das die Signalgebung zwischen Zellen vermittelt. Ein „Lymphokin" ist ein Cytokin, das durch Lymphocyten freigesetzt wird.
Der Begriff „Th2" bezieht sich auf eine Subklasse von T-Helferzellen, die LTα, Interferon-γ und IL-2 (und andere Cytokine) produzieren und die entzündliche Reaktionen hervorrufen, die mit einer zellulären, d.h. einer Nicht-Immunglobulin-, Antwort auf eine Provokation assoziiert sind.
Der Begriff „Th2" bezieht sich auf eine Subklasse von T-Helferzellen, die Cytokine produzieren, wie IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10, die mit einer Immunglobulin(humoralen) Antwort auf eine immunologische Provokation assoziiert sind.
Der Begriff „Fc-Domäne" eines Antikörpers bezieht sich auf einen Teil des Moleküls, der die Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen umfasst, dem jedoch die Antigenbindungsstellen fehlen. Der Begriff soll außerdem die äquivalenten Regionen eines IgM- oder anderen Antikörper-Isotyps einschließen.
Der Begriff „anti-LTβ-Rezeptor-Antikörper" bezieht sich auf einen beliebigen Antikörper, der spezifisch an mindestens ein Epitop des LTβ-Rezeptors bindet.
Der Begriff „anti-LT-Antikörper" bezieht sich auf einen beliebigen Antikörper, der spezifisch an mindestens ein Epitop von LTα, LTβ oder einen LTα/β-Komplex bindet.
Der Begriff „LTβ-R-Signalgebung" bezieht sich auf Molekülreaktionen, die mit dem LTβ-R-Stoffwechselweg und anschließenden Molekülreaktionen, die daraus resultieren, assoziiert sind.
Der Begriff „LTβ-R-blockierender Wirkstoff" bezieht sich auf einen Wirkstoff, der die Ligandenbindung an LTβ-R, Zelloberflächen-LTβ-R-Clustering oder LTβ-R-Signalgebung vermindern kann oder der beeinflussen kann, wie das LTβ-R-Signal innerhalb der Zelle interpretiert wird.
Ein LTβ-R-blockierender Wirkstoff, der auf der Stufe der Ligand-Rezeptor-Bindung wirkt, kann die LT-Ligandenbindung an den LTβ-R um mindestens 20 % hemmen. Beispiele von LTβ-R-blockierenden Wirkstoffen schließen lösliche LTβ-R-Fc-Moleküle und anti-LTα-, anti-LTβ-, anti-LTα/β- und anti-LTβ-R-Ak ein. Vorzugsweise erfolgt keine Kreuzreaktion der Antikörper mit der sekretierten Form von LTα.
Der Begriff „biologische LTβ-R-Aktivität" bezieht sich auf: 1) die Fähigkeit des LTβ-R-Moleküls oder -Derivats, um die Bindung eines löslichen oder Oberflächen-LT-Liganden mit löslichen oder Oberflächen-LTβ-R-Molekülen zu kompetieren; oder 2) eine native LTβ-Aktivität wie die Fähigkeit, eine regulatorische Immunantwort oder cytotoxische Aktivität zu stimulieren.
Der Begriff „LT-Ligand" bezieht sich auf einen heteromeren LTα/β-Komplex oder ein Derivat davon, der/das spezifisch an den LTβ-Rezeptor binden kann.
Der Begriff „LTβ-R-Ligandenbindungsdomäne" bezieht sich auf den Teil oder die Teile des LTβ-R, der/die an einer spezifischen Erkennung von einem LT-Liganden und an einer spezifischen Interaktion damit beteiligt ist/sind.
Die Begriffe „Oberflächen-LT" und Oberflächen-LT-Komplex" beziehen sich auf einen Komplex, umfassend LTα- und membrangebundene LTβ-Untereinheiten, einschließlich mutierter, veränderter und chimärer Formen von einer oder mehreren der Untereinheiten, der auf der Zelloberfläche präsentiert wird. „Oberflächen-LT-Ligand" bezieht sich auf einen Oberflächen-LT-Komplex oder ein Derivat davon, der/das spezifisch an den LTβ-Rezeptor binden kann.
Der Begriff „Individuum" bezieht sich auf ein Tier oder eine oder mehrere Zellen, die von einem Tier stammen. Vorzugsweise ist das Tier ein Säuger. Zellen können in jeder beliebigen Form vorliegen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Zellen, die noch in Gewebe vorliegen, Zellcluster, immortalisierte, transfizierte oder transformierte Zellen und Zellen, die von einem Tier stammen, das physikalisch oder phänotypisch verändert wurde.
Lymphotoxin-β: Ein Mitglied der TNF-Familie
Mit dem Tumornekrosefaktor (TNF) verwandte Cytokine haben sich zu einer großen Familie von pleiotropen Mediatoren der Verteidigung des Wirts und der Immunregulation entwickelt. Mitglieder dieser Familie liegen in membrangebundenen Formen, die durch Zell-Zell-Kontakt lokal wirken, oder als sekretierte Proteine vor, die auf entfernte Ziele wirken können. Eine parallele Familie von TNF-verwandten Rezeptoren reagiert mit diesen Cytokinen und löst eine Vielzahl von Stoffwechselwegen aus, umfassend Zelltod, Proliferation von Zellen, Gewebedifferenzierung und entzündungsfördernde Antworten.
TNF, Lymphotoxin-α (LTα, auch TNFβ genannt) und Lymphotoxin-β (LTβ) sind Mitglieder der TNF-Familie von Liganden, die auch die Liganden für die Fas-, CD27-, CD30-, CD40-, OX-40- und 4-1BB-Rezeptoren einschließt (Smith et al., Cell 76, S. 959-962 (1994)). Die Signalgebung durch verschiedene Mitglieder der TNF-Familie, einschließlich TNF, LTα, LTβ und Fas, kann den Tod von Tumorzellen durch Nekrose oder Apoptose (programmierter Zelltod) induzieren. In nichttumorigenen Zellen beeinflussen TNF und zahlreiche der TNF-Familie-Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen die Entwicklung des Immunsystems und Antworten des Immunsystems auf verschiedene immunologische Provokationen.
Die meisten membranassoziierten LTα/β-Komplexe („Oberflächen-LT") haben eine LTα1/β2-Stöchiometrie (Browning et al., Cell 72, S. 847-856 (1993); Browning et al., J. Immunol. 154, S. 33-46 (1995)). Oberflächen-LT-Liganden binden nicht mit hoher Affinität an TNF-R und aktivieren nicht die TNF-R-Signalgebung. Der LTβ-Rezeptor (LTβ-R) jedoch bindet mit einer hohen Affinität an diese Oberflächen-Lymphotoxin-Komplexe (Crowe et al., Science 264, S. 707-10 (1994)).
Die LTβ-R-Signalgebung hat, wie die TNF-R-Signalgebung, eine antiproliferative Wirkung und kann gegenüber Tumorzellen cytotoxisch sein. In WO 96/22788 sind Zusammensetzungen und Verfahren zur selektiven Stimulierung von LTβ-R unter Verwendung von LTβ-R-aktivierenden Wirkstoffen offenbart. LTβ-R-aktivierende Wirkstoffe eigenen sich zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen, ohne dass sie gleichzeitig TNF-R-induzierte entzündungsfördernde oder immunregulatorische Stoffwechselwege aktivieren.
Kürzliche Studien mit Gen-Targeting legen eine Rolle für LTα/β in der Entwicklung von sekundären lymphatischen Organen nahe (Banks et al., J. Immunol. 155, S. 1685-1693 (1995); De Togni et al., Science 264, S. 703-706 (1994)). Tatsächlich fehlen bei den LTα-defizienten Mäusen Lymphknoten (LN) und Peyer'-Plaques (PP). Außerdem weisen ihre Milzen eine unterbrochene Architektur auf, und die Expression von funktionellen Markern auf Zellen der Marginalzone der Milz ist verändert (Banks et al., 1995; De Togni et al., Science 264, S. 703-706 (1994); Matsumoto et al., Science 271, S. 1289-1291 (1996)). Keines dieser Charakteristika wurde für eine der TNF-Rezeptor-Knock-out-Mäuse beschrieben (Erickson et al., Nature 372, S. 560-563 (1994); Pfeffer et al., Cell 73, S. 457-467 (1993); Rothe et al., Nature 364, S. 798-802 (1993)). Die Anmelder haben kürzlich für Membran-LTα/β-Komplexe eine Rolle in der Entwicklung von sekundären lymphatischen Organen definiert, indem sie gezeigt haben, dass den Nachkommen von Mäusen, denen während der Trächtigkeit eine lösliche Form von Maus-LTβ-R, gebunden an den menschlichen IgG1-Fc-Teil (LTβ-R-Ig), injiziert worden war, die meisten Lymphknoten fehlten und dass bei ihnen eine unterbrochene Milzarchitektur vorlag (Rennert et al., „Surface Lymphotoxin alpha/beta complex is required for the development of peripheral lymphoid organs", J. Exp. Med. 184, S. 1999-2006 (1996)). In einer anderen Untersuchung wurde gezeigt, dass Mäuse, die für ein ähnliches LTβ-R-Ig-Konstrukt transgen waren, dessen Expression drei Tage nach der Geburt begann, LN aufwiesen. Jedoch war ihre Milzarchitektur unterbrochen, und verschiedene Marker der Marginalzonen-Milzzellen wurden nicht exprimiert (Ettinger et al., „Disrupted splenic architecture, but normal lymph node development in mice expressing a soluble LTβ-R/IgG1 fusion protein", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, S. 13102-7). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass ein temporärer Bedarf an Membran-LT-Funktionen besteht, um Wirkungen auf die Entwicklung von sekundären lymphatischen Organen zu vermitteln, nicht jedoch, um Wirkungen auf die Architektur der Milz zu vermitteln.
Das TNF-System hat möglicherweise auch eine Funktion in der Entwicklung der Milz. Marginalzonenzellen der Milz von TNF-defizienten Mäusen exprimieren keine Makrophagen-Marker oder MAdCAM-1 (Alexopoulou et al., 60^th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, S. 228 (1996); Pasparakis et al., 60^th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, S. 239 (1996)). Bei TNF-R55-defizienten Mäusen fehlt auch eine MAdCAM-1-Färbung (nicht jedoch eine MOMA-1-Färbung) in der Marginalzone der Milz (Neumann et al., J. Exp. Med. 184, S. 259-264 (1996); Matsumoto et al., Science 271, S. 1289-1291 (1996)). Die Expression dieser Marker, wie in der Milz von TNF-R75-defizienten Mäusen zu sehen ist, scheint normal zu sein (Matsumoto et al., Science 271, S. 1289-1291 (1996)).
Lymphartige Gewebe entstehen nicht nur als Teil von Prozessen während der Entwicklung, sondern treten auch unter bestimmten pathologischen Umständen wie bei chronischer Entzündung auf, wobei es sich um einen Prozess handelt, der kürzlich mit Neolymphoorganogenese bezeichnet wurde (Picker und Butcher, Annu. Rev. Immunol. 10, S. 561-591 (1992); Kratz et al., J. Exp. Med. 183, S. 1461-1471 (1996)). Solche Prozesse werden anscheinend von Mitgliedern der TNF-Familie beeinflusst. Mäuse, die für das LTα-Gen transgen waren, welches durch den Ratten-Insulin-Promotor (RIP-LT) gesteuert wurde, entwickelten LT-induzierte, chronische, entzündliche Läsionen mit Charakteristika von organisierten lymphatischen Geweben (Kratz et al., J. Exp. Med. 1183, S. 1461-1471 (1996); Picarella et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89, S. 10036-10040 (1992)).
Die Auswertung der LT-Funktion während einer T-Zell-abhängigen Immunantwort unter Verwendung von LTα-defizienten Mäusen zeigte, dass LT erforderlich ist für die Bildung von GC, und zwar möglicherweise für die Aufrechterhaltung einer organisierten Struktur von follikulären dendritischen Zellen (FDCs) und für humorale Antworten (Banks et al., J. Immunol. 155, S. 1685-1693 (1995); Matsumoto et al., Science 271, S. 1289-1291 (1996); Matsumoto et al., Nature 382, S. 462-466 (1996)). Den TNF-R55-defizienten Mäusen fehlen auch FDCs, sie versagen dabei, GC zu entwickeln, und sie versagen dabei, eine optimale Antikörperantwort auf Erythrocyten von Schafen (SRBC) hervorzubringen. Dies legt nahe, dass TNF-R55 für die meisten dieser Antworten möglicherweise durch lösliche LT- oder TNF-Signale aktiviert wird (Le Hir et al., J. Exp. Med. 183, S. 2367-2372 (1996); Alexopoulou et al., 60^th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, S. 228 (1996); Pasparakis et al., 60^th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, S. 239 (1996)). Bisher konnte noch keine funktionelle Rolle in den humoralen Immunantworten für den Oberflächen-LT/LTβ-R-Stoffwechselweg definiert werden.
Der LTβ-Rezeptor, ein Mitglied der TNF-Familie von Rezeptoren, bindet spezifisch an Oberflächen-LT-Liganden. LTβ-R bindet an heteromere LT-Komplexe (hauptsächlich LTα1/β2 und LTα2/β1), bindet jedoch nicht an TNF oder LTα (Crowe et al., Science 264, S. 707-710 (1994)). LTβ-R-mRNA werden in Milz, Thymus und allgemeinen Organen des Menschen mit einer Beteiligung am Immunsystem gefunden. Obwohl sich die Untersuchungen über die LTβ-R-Expression noch in der Anfangsphase befinden, scheinen die LTβ-R-Expressionsmuster denjenigen ähnlich zu sein, die für TNF-R55 berichtet wurden, mit der Ausnahme, dass LTβ-R auf T- und B-Zellen und T- und B-Zelllinien des peripheren Bluts fehlt.
Zelloberflächen-Lymphotoxin-(LT-)Komplexe wurden in CD4⁺-T-Zellen-Hybridomzellen (II-23.D7) charakterisiert, welche hohe Spiegel von LT exprimierten (Browning et al., J. Immunol. 147, S. 1230-1237 (1991); Androlewicz et al., J. Biol. Chem. 267, S. 2542-2547 (1992), die beide hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind). Die Expression und biologische Rollen von LTβ-R, LT-Untereinheiten und Oberflächen-LT-Komplexen wurden in einer Übersicht dargestellt von C. F. Ware et al., „The ligands and receptors of the lymphotoxin system", in: Pathways for Cytolysis, Current Topics Microbiol. Immunol., Springer-Verlag, S. 175-218 (1995), das hier durch Bezugnahme spezifisch eingeschlossen ist.
Die Expression von LTα wird induziert, und LTα wird sekretiert, und zwar hauptsächlich durch aktivierte T- und B-Lymphocyten und natürliche Killerzellen (NK-Zellen). Unter den T-Helferzellen scheint LTα von Th1-, nicht jedoch von Th2-Zellen produziert zu werden. Außerdem wurde LTα in Melanocyten nachgewiesen. Auch Mikroglia und T-Zellen in Läsionen von Patienten mit multipler Sklerose lassen sich mit gegen LTα gerichteten Antiseren anfärben (Selmaj et al., J. Clin. Invest. 87, S. 949-954 (1991)).
Lymphotoxin-β (auch mit p33 bezeichnet) wird auf der Oberfläche von menschlichen und Maus-T-Lymphocyten, -T-Zelllinien, -B-Zelllinien und -Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK-Zellen) exprimiert. LTβ ist der Gegenstand von den gleichzeitig anhängigen internationalen Anmeldungen der Anmelder PCT/US91/04588, veröffentlicht am 9. Januar 1992 als WO 92/00329; und PCT/US93/11669, veröffentlicht am 23. Juni 1994 als WO 94/13808, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Oberflächen-LT-Komplexe werden hauptsächlich durch aktivierte T-Zellen (Helfer-, Th1- und Killerzellen) und B-Lymphocyten und natürliche Killerzellen (NK-Zellen) exprimiert, wie durch FACS-Analyse oder Immunhistologie unter Verwendung von anti-LTβ-Antikörpern oder löslichen LTβ-R-Ig-Fusionsproteinen definiert. In WO 97/03687 werden Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung von löslichen LTβ-Rezeptoren und anti-LTβ-Rezeptor- und Liganden-spezifischen Antikörpern als Therapeutika zur Behandlung von immunologischen Erkrankungen, die durch Th1-Zellen vermittelt werden, offenbart. Oberflächen-LT wurde auch auf menschlichen cytotoxischen T-Lymphocyten-(CTL-)Clonen, aktivierten, peripheren mononukleären Lymphocyten (PML), IL-2-aktivierten, peripheren Blut-Lymphocyten (LAK-Zellen), Kermesbeere- Mitogen-aktivierten oder anti-CD40-aktivierten, peripheren B-Lymphocyten (PBL) und verschiedenen lymphatischen Tumoren des T- und B-Zellstammbaums, beschrieben. Das Engagement von Alloantigen-tragenden Zielzellen induziert spezifisch die Expression von Oberflächen-LT durch CD8⁺- und CD4⁺-CTL-Clone.
Die Anmelder haben hier mehrere immunologische Funktionen für Oberflächen-LT beschrieben und zeigen die Effekte von LTα/β-bindenden Reagenzien auf die Erzeugung und den Charakter von immunologischen Antworten, auf die Aufrechterhaltung der zellulären Organisation von sekundären lymphatischen Geweben, einschließlich der Effekte auf den Differenzierungszustand von follikulären dendritischen Zellen und auf die Bildung von Keimzentren und auf die Addressin-Expressionsraten, welche das Zelltrafficking beeinflussen. Somit definieren die Anmelder therapeutische Anwendungen für Oberflächen-LTα/β- und LTβ-Rezeptor-bindende Wirkstoffe.
Jedoch war, bevor es die vorliegende Erfindung gab, die Auswirkung einer LT-β-R-Signalgebung auf humorale oder immunogene Antworten noch nicht vollständig aufgeklärt. Die Erfinder haben erstmalig entdeckt, dass eine Blockierung des LT- Stoffwechselwegs, entweder LT-β oder LT-β-R, die humorale Immunantwort in einem Tier verändern kann.
Bevorzugte Blockierungsmittel schließen monoclonale Antikörper ein, die gegen den LT-β-R gerichtet sind, einschließlich vorzugsweise des gegen den menschlichen LT-β-R gerichteten mAk BDA8 und des gegen menschliches LT-β gerichteten mAk B9. Stärker bevorzugte Antikörper umfassen A1.D5.18 und AO.D12.10. sowie BB-F6. In bestimmten Fällen kann es wünschenswert sein, einen monoclonalen Antikörper einzusetzen, der gegen einen murinen Oberflächen-LT-Liganden gerichtet ist.
Die langfristige Präsentation von Antigen durch FDCs spielt wahrscheinlich bei solchen Autoimmunerkrankungen eine wichtige Rolle, bei denen die Krankheit durch die kontinuierliche Aktivierung des Immunsystem durch endogene oder Auto-Antigene aufrechterhalten wird. Das Einfangen von Immunkomplexen auf FDCs ist in 7 erläutert. Die Fähigkeit, diese Immunkomplexe von den FDCs zu entfernen, würde dazu dienen, das Ausmaß an Immunaktivierung zu reduzieren und die Erkrankung abzuschwächen oder sogar die Progression der Erkrankung zu stoppen. Diejenigen Autoimmunerkrankungen, an denen abnorme Antikörperantworten beteiligt sind, sind offensichtliche Ziele für Inhibitoren des LT-Stoffwechselwegs, wobei jedoch möglicherweise auch andere, eher „klassische" T-Zell-vermittelte Autoimmunerkrankungen noch nicht aufgeklärte humorale Komponenten haben können und deshalb auch günstig beeinflusst werden können.
Genauso ist auf dem Fachgebiet der Transplantation bei der Transplantatabstoßung, d.h. der Wirt-gegen-Transplantat-Krankheit und der Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit, für das Fortbestehen der Krankheit die Präsentation von Antigen erforderlich. Die hier beschriebenen Mechanismen zum Manipulieren von FDC lassen sich möglicherweise auch auf diejenigen Probleme anwenden, die mit der Erkennung von Nicht-Selbst, d.h. einer Transplantation, assoziiert sind.
Außerdem spielt möglicherweise die fortgesetzte Präsentation von Antigen oder die Aufrechterhaltung des Antigengedächtnisses eine Rolle bei denjenigen Autoimmunerkrankungen, die durch molekulare Mimikry verursacht werden. Z.B. führt die Immunreaktion auf das infektiöse Agens der Lyme-Krankheit, Borrelia burgdorferi, zu einer Arthritis-ähnlichen Erkrankung, vermutlich da ein gewisses antigenes Epitop auf diesem Bakterium einer normalen Komponente der Gelenke ähnlich ist. Durch die Entfernung des auf FDC zurückgehaltenen Antigens des Lyme-Bakteriums kann möglicherweise die durch die Lyme-Krankheit induzierte Arthritis gebessert werden. Eine solche Therapie wäre auch für andere Fälle von Mimikry, die mit infektiösen Agenzien assoziiert sind, relevant.
Die Anmelder haben überraschenderweise gefunden, dass die verabreichten blockierenden Mittel von LT-β-R in der Lage sind, die Präsentation und/oder Ablagerung von Antigenen auf follikulären dendritischen Zellen zu stören. Typischerweise erkennen B-Zellen Antigene als Immunkomplexe, die an der Oberfläche von follikulären dendritischen Zellen gebunden sind. Follikuläre dendritische Zellen können die Antigene für eine nicht spezifizierte Zeitspanne festhalten. Ein periodischer Kontakt mit dem auf den FDC festgehaltenen Antigen kann also mit der Beibehaltung des Gedächtnisses von B-Zellen in Zusammenhang stehen. Somit umfassen die Verfahren zahlreiche Krankheitszustände, die von der Präsentation von Antigen auf dendritischen Zellen abhängig sind. Die Verabreichung von blockierenden Wirkstoffen kann vor der Einführung eines Antigens in ein Tier erfolgen, in diesem Fall werden die blockierenden Wirkstoffe die gesamte Ablagerung des Antigens auf den follikulären dendritischen Zellen oder einen Teil davon verhindern, wodurch die erwartete immunogene Antwort verhindert oder abgeschwächt wird. Alternativ können die blockierenden Wirkstoffe an ein Tier zu einem Zeitpunkt verabreicht werden, nachdem die Assoziation der follikulären dendritischen Zellen über das Antigen mit ihnen erfolgt ist. Die Verfahren können diese Assoziation aufbrechen, so dass die erwartete immunogene Antwort sodann abgeschwächt wird oder gar nicht auftritt.
Die Fähigkeit, die Assoziation zwischen diesen Antigen-präsentierenden follikulären dendritischen Zellen und den Immunkomplexen aufzubrechen, scheint einzig auf den LT-β-Stoffwechselweg zuzutreffen. Z.B. ist anti-CD40L (MR-1) ein anderes Mitglied der TNF-Familie und wird auch auf follikulären dendritischen Zellen exprimiert. Wie für LT-β-R/Ig wurde auch für MR-1 gezeigt, dass es die Keimzellbildung verhindert, jedoch die Expression von FDC-Markern nicht beeinträchtigt. Anti-CD40-L verhindert nicht, anders als LT-β-R, das Einfangen von Immunkomplexen auf follikulären dendritischen Zellen, und es ist auch nicht in der Lage, die vorher auf follikulären dendritischen Zellen eingefangenen Immunkomplexe zu eliminieren. Außerdem haben die Anmelder gezeigt, dass anti-CD40-L keinen Einfluss auf das Überleben/die Aufrechterhaltung von vorher erzeugten Gedächtnis-B-Zellen hat.
Obwohl die genaue Grundlage für die Unterschiede zwischen der Wirkung von anti-CD-40L- und LT-β-R-blockierenden Wirkstoffen nicht bekannt ist, wird die Hypothese aufgestellt, dass CD40 möglicherweise Überlebens-Signale für B-Zellen bereitstellt. Jedoch ist das LT-System kritisch dafür, follikuläre dendritische Zellen in einem vollständig differenzierten und funktionellen Zustand aufrechtzuerhalten, ein Zustand, der für die Keimzentrum-Reaktion und die Erzeugung und Aufrechterhaltung von Gedächtnis-B-Zellen erforderlich zu sein scheint. Somit verhindert die Blockierung des CD40/CD40L-Stoffwechselwegs möglicherweise die Erzeugung von Gedächtnis-B-Zellen, beeinträchtigt jedoch nicht den bereits etablierten Gedächtnis-B-Zellpool. Andererseits verhindert die Blockierung des LT-Stoffwechselwegs nicht nur die Erzeugung und Aufrechterhaltung von Gedächtnis-B-Zellen, sondern sie beeinträchtigt auch die Aufrechterhaltung von vorher erzeugten Gedächtnis-B-Zellen.
Eine weitere Anwendung der Hemmung des LT-Stoffwechselwegs außerhalb des Rahmens der Patentansprüche liegt in der Behandlung von Viren, die in dem Kompartiment follikulärer dendritischer Zellen (FDC) Reservoire bilden. Das HIV-Virus ist ein gutes Beispiel für einen solchen Fall. Nach einer Virusinfektion liegen große Mengen von infektiösem Virus auf FDCs in den B-Zell-Follikeln der sekundären lymphatischen Organe vor (Heathe et al., „Folicular dendritic cells and human immunodeficiency virus infectivity", Nature 377, S. 740-4 (1995)). Man nimmt an, dass Virus entweder mit Komplement oder mit Immunglobulin komplexiert und entweder an Fc-Rezeptoren oder an Komplement-Rezeptoren oder an beide gebunden wird. Somit nutzt das Virus den normalen Mechanismus des Immunsystems aus, ein Antigen-Gedächtnis für lange Zeitspannen aufrechtzuerhalten. Während des Verlaufs der Erkrankung findet eine aktive Infektion von Lymphocyten hauptsächlich an diesen Stellen statt. Es wurde errechnet, dass während der asymptomatischen Phase der Infektion der Viruspool in diesem Kompartiment mehr als zehnfach größer ist als derjenige, der in T-Zellen und Monocyten enthalten ist (Cavert et al., „Kinetics of response in lymphoid tissues to antiretroviral therapy of HIV-1 infection", Science 276, S. 960-4 (1997)). In den aktuellen Verfahren zur HIV-Behandlung werden mehrere anti-virale Wirkstoffe kombiniert, um die Viruslast zu reduzieren und zu verhindern, dass resistente Varianten entkommen können. Eine wahrscheinliche Einschränkung dieser Therapie liegt in der Nicht-Compliance mit der Therapie, und während solcher Intervalle hat das restliche Virus die Freiheit zu mutieren, wodurch die Entwicklung von resistenten Varianten ermöglicht und auf diese Weise der Fortschritt der Therapie verhindert wird. Obwohl während der Mehrfach-Arzneistoff-Therapie auf die Viruslast in dem FDC-Kompartiment dramatisch eingewirkt wird, sind die Arzneistoffe selbst jedoch hauptsächlich auf die Replikationsmaschinerie des Virus gerichtet und nicht auf das nicht-replizierende Virus auf den FDC-Oberflächen. Deshalb kann das Virusreservoir auf FDCs nach Beendigung der Arzneistofftherapie als ein Re-Inokulum dienen. Darüberhinaus können die FDCs neutralisiertes Virus zu einer infektiösen Form umwandeln, dies unterstreicht noch weiter die Wichtigkeit dieser Zellen für die Pathogenese von HIV.
Da die Hemmung des LT-Stoffwechselwegs bewirken kann, dass FDCs Immunkomplexe aus der Zelloberfläche freisetzen, könnte auch HIV in Form eines Immunkomplexes freigesetzt werden. Es wäre wünschenswert, die gesamte HIV-Last in diesem Komplartiment unmittelbar vor Beginn von Behandlungsplänen vom Typ Mehrfach-Therapie freizusetzen, da das freigesetzte Virus entweder prozessiert und aus dem Körper entfernt werden sollte oder da es bei einer Infektion gegenüber der Arzneistofftherapie empfindlich wäre. Eine solche Kombination könnte die restliche Viruslast auf sehr geringe Werte reduzieren, wodurch eine Heilung möglich wäre. In diesem Fall wären entweder LTβ-R/Ig oder blockierende Antikörper gegen entweder den Liganden oder den Rezeptor nützlich. Ein mögliches Behandlungsprotokoll würde den Beginn einer Arzneistofftherapie und danach, innerhalb von mehreren Tagen, die Freisetzung jeglicher gebundener Viren durch eine oder mehrere Behandlungen mit Inhibitoren des LT-Stoffwechselwegs umfassen. Sobald die Viruslast reduziert wurde, wäre keine weitere Behandlung mit auf LT gerichteten Wirkstoffen erforderlich.
Während HIV ein besonders gut untersuchtes Beispiel darstellt, ist es wahrscheinlich, dass auch andere Viren in einem Ruhezustand auf FDCs vorliegen oder sich auf diesen Zellen verstecken, wobei sie auf irgendein Ereignis wie eine immunologische Störung warten, die dann zu einer weiteren Antigenlast im großen Ausmaß und folglich zur Freisetzung des gebundenen Virus von den FDCs und zu einem erneuten Auftreten des Virus führt.
Diese Entdeckung hat signifikante Folgen für eine Reihe von Krankheiten, die auf die Präsentation von Antigen auf dendritischen Zellen und auf die durch Gedächtnis-B-Zellen erzeugte Antwort angewiesen sind. LTα1/β2-Signalgebung wirksam und dient als Beispiel eines therapeutisch nützlichen anti-LTb-blockierenden monoclonalen Antikörpers. Außerdem war ein gegen menschliches LT-alpha gerichteter monoclonaler Antikörper, der mit AOD12 bezeichnet wurde, in der Lage, die LTα1/β2-Signalgebung gut zu blockieren, jedoch war er im Gegensatz zu den meisten gegen menschliches LT-alpha gerichteten monoclonalen Antikörpern gegen LTα alleine nur schwach wirksam. Diese monoclonalen Antikörper wurden nach einer Immunisierung von Mäusen mit dem löslichen LTα1/β2-Liganden erhalten; dies führte zur Entdeckung von monoclonalen Antikörpern mit einer einmaligen Spezifität. Weiterhin halten wir fest, dass monoclonale anti-LTα-Antikörper mit einer Spezifität, die vorzugsweise gegen den LTα1/β2-Komplex gerichtet ist, nur zu finden sein werden, wenn diese Form von Immunisierung durchgeführt wird, und dass sie nicht nach einer Immunisierung mit LT-alpha alleine erhalten werden können und somit eine einmalige Klasse von anti-LTα-Antikörpern umfassen.
Beispiele
Material und Methoden
Mäuse
Zeitlich aufeinander abgestimmte trächtige Balb/c-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) bezogen, unter herkömmlichen Käfigbedingungen untergebracht und gemäß den geltenden Richtlinien gehalten. Rezeptor-Ig-Proteine oder mAk wurden in die Schwanzvene (i.v.) von trächtigen Mäusen injiziert. Die Nachkommen dieser Mäuse und fünf Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse (bezogen vom Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) erhielten über die intraperitoneale (i.p.) Route Injektionen mit Fusionsproteinen.
Fusionsproteine und Antikörper
Fusionsproteine, die aus der extrazellulären Domäne von entweder murinem LTβ-R, menschlichem TNF-R55 oder menschlichem LFA-3 (das nicht an murines CD2 bindet) bestanden, welche an die Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen des menschlichen IgG1 fusioniert war, wurden, wie beschrieben zubereitet (Force et al., J. Immunol. 155, S. 5280-5299 (1995); Miller et al., J. Exp. Med. 178, S. 211-222 (1993)). Gereinigtes menschliches IgG1, das als Kontrolle verwendet wurde, wurde von Protos Immunoresearch (San Francisco, KA) bezogen. MR1, ein gegen den CD40-Liganden der Maus gerichteter Antikörper, wurde von Pharmingen (San Diego, KA) bezogen.
Antikörper (MOMA-1, ED3), die für Marker spezifisch sind, die durch metallophile Makrophagen (MM) der Maus exprimiert werden (ED3 erkennt Sialoadhesin) oder die für retikuläre Fibroblasten der Maus spezifisch sind (ER-TR-7), wurden von Serotec (Oxon, GB) bezogen. Antikörper, die für Maus-B220, CD4 und MadCAM-1 spezifisch sind (MECA 367), wurden von Pharmingen (San Diego, KA) bezogen. Ein Antikörper (ER-TR-9), der für einen Marker spezifisch ist, der durch Marginalzonen-Makrophagen der Maus exprimiert wird, wurde von Dr. Reina Mebius (Vrije Universiteit, Amsterdam) zur Verfügung gestellt. Antikörper (FDC-M1 und FDC-M2), die für follikuläre dendritische Zellen (FDC) der Maus spezifisch sind, wurden früher beschrieben (Maeda et al., J. Immunol. 148, S. 2340-2347 (1992)). Der anti-Maus-CR1-Antikörper (der auch FDC färbt) wurde freundlicherweise von Dr. Randolph J. Noelle (Dartmouth Medical School) zur Verfügung gestellt. Für den Nachweis von Addressin der peripheren Lymphknoten (PNAd) wurde der Antikörper MECA 79 verwendet (Zellkulturüberstand, der von Zellen stammte, die von ATCC, Rockville, MD, bezogen wurden).
Antigene und Immunisierungen
Mäuse wurden mit 100 μl einer 10 % Suspension von SRBC (bezogen von der Colorado Serum Company) i.p. immunisiert. Dies entspricht 1 bis 5 × 10⁸ SRBC pro Immunisierung.
Immunhistochemie
Milz und Lymphknoten wurden in OCT-Einbettmedium (Miles, Elkhart, IN) eingefroren und zum Schneiden im Kryostaten vorbereitet. Schnitte mit einer Dicke von 7 bis 10 mm wurden getrocknet und mit Aceton fixiert. Die Schnitte wurden mit konjugierten Antikörpern eine Stunde bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Box inkubiert, nachdem die Verdünnung in Tris-gepufferter Kochsalzlösung Puffer A (TBS-A, 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,05 % Tween-20 (Vol./Vol.), 0,25 % Rinderserumalbumin (BSA)) erfolgt war, sodann wurden sie in TBS-B (0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,05 % Tween-20) gespült und eine Minute in Methanol fixiert, bevor die Enzymreaktion in Gang gesetzt wurde. Die Aktivitäten der Meerrettich-Peroxidase (HRP) und der alkalischen Phosphatase (AP) wurden entwickelt, indem der DAB-Tablettensubstrat-Kit (Sigma, St. Louis, MO) bzw. 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/Nitroblau-Tetrazolium (BCIP/NBT, Sigma) verwendet wurde. Gewebeschnitte wurden fünf Minuten in Methanol fixiert und mit Giemsa (Fluka, Buchs, Schweiz) gegengefärbt.
Fluoreszenz-Bildanalyse
Für die Immunfluoreszenzfärbung wurden gefrorene Schnitte mit Aceton fixiert, luftgetrocknet und mit 5 μg/ml „anti-CD16/CD32-Fc-Block (Pharmingen, San Diego, KA) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,25 % BSA, 0,05 % Tween-20 und 10 % Hitze-aggregiertem Kaninchenserum vorblockiert. Die Schnitte wurden im gleichen Puffer unter Verwendung der folgenden mAk und Nachweisreagenzien gefärbt: 10 μg/ml biotinylierter anti-B220-mAk (Pharmingen), gefolgt von 20 μg/ml Streptavidin-FITC (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL); 10 μg/ml MECA 367, gefolgt von 10 μg/ml PE-Ziegen-F(ab')2-anti-Ratte-IgG (Southern Biotechnology Associates); Kulturüberstand von MECA79, gefolgt von 20 μg/ml FITC-Maus-anti-Ratte-IgM (Pharmingen); 20 μg/ml anti-Sialoadhesin-mAk, gefolgt von 10 μg/ml PE-Ziege-F(ab')2-anti-Ratte-IgG (Southern Biotechnology Associates), 50 μg/ml biotinyliertes PNA (Vector Laboratories, Burlingame, CA), gefolgt von 10 μg/ml Streptavidin-PE (Southern Biotechnology Associates); 1:5-Verdünnung des mAb MOMA-1-Zellkulturüberstands, gefolgt von 20 μg/ml FITC-Maus-anti-Ratte-IgM (Pharmingen). Einige Schnitte wurden mit mehreren mAk gleichzeitig angefärbt, um eine Bildüberlappungs-Analyse zu ermöglichen. Alle Schnitte wurden unter 50×-Vergrößerung betrachtet und unter Verwendung von Ektachrom P1600 (Kodak, Rochester, NY) fotografiert oder als getrennte rote und grüne Bildfiles, wie beschrieben, erfasst (Rennert et al., J. Exp. Med. (Nov. 1996, im Druck)).
Hämagglutinin-Tests
Serielle Verdünnungen von Seren wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) in PBS, 1 % Glucose hergestellt. Der SRBC-spezifische IgM-Titer wurde bestimmt, indem zu jeder Vertiefung 25 μl einer 10 SRBC-Suspension zugegeben wurden und die Platte eine Stunde in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C inkubiert wurde. Für SRBC-spezifisches IgG wurden die Seren 30 Min. bei 37°C mit 20 μl/Vertiefung von 1 % 2-Mercaptoethanol (Vol./Vol.) (Bio-Rad, Richmond, CA) inkubiert, um IgM-Pentamere zu eliminieren. Danach wurden 25 μl/Vertiefung einer 10 % SRBC-Suspension zugegeben, gefolgt von 25 μl/Vertiefung einer 10 mg/ml Lösung (in PBS, 1 % Glucose) von Ziegen-anti-Maus-IgG (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) als Vernetzungsmittel für Hämagglutinin. Der Titer wurde als reziproker Wert der letzten Serumverdünnung, für welche eine Hämagglutination deutlich sichtbar ist, bestimmt.
ELISAs
Für Analysen von Rezeptor-Ig im Plasma wurden eingesetzt: mAk, die spezifisch sind für murinen LTβ-R (Browning et al., Manuskript in Vorbereitung), LFA-3 (Miller et al., J. Exp. Med. 178, S. 211-222 (1993)) oder für die CH3-Domäne von menschlichem IgG1 (CDG5, hergestellt bei Biogen), direkt immobilisiert (10 μg/ml) an Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, zum Einfangen und Affen-anti-Mensch-IgG₁-Meerrettich-Peroxidase (HRP) zum Nachweisen (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Verdünnung von 1:4000).
Herstellung von löslichen LTβ-R-Molekülen
Die LTβ-R-blockierenden Wirkstoffe umfassen lösliche LTβ-Rezeptor-Moleküle. 1 zeigt die Sequenz des extrazellulären Teils des menschlichen LTβ-R, der die Ligandenbindungsdomäne codiert. Unter Verwendung der Sequenzinformationen von 1 und von DNA-Rekombinationstechniken, die dem Fachmann bekannt sind, können funktionelle Fragmente, welche die LTβ-R-Ligandenbindungsdomäne codieren, in einen Vektor cloniert und in einem geeigneten Wirt exprimiert werden, so dass ein lösliches LTβ-R-Molekül produziert wird. Lösliche LTβ-R-Moleküle, die mit nativen LTβ-Rezeptoren um die LT-Ligandenbindung gemäß dem in WO 97/03687 beschriebenen Test kompetieren können, werden als LTβ-R-blockierende Wirkstoffe ausgewählt.
Ein löslicher LTβ-Rezeptor, umfassend Aminosäuresequenzen, die aus denjenigen ausgewählt sind, die in 1 dargestellt sind, kann mit einer oder mehreren heterologen Proteindomänen verknüpft werden („Fusionsprotein"), um die in vivo-Stabilität des Rezeptor-Fusionsproteins zu steigern oder seine biologische Aktivität oder Lokalisation zu modulieren.
Für die Konstruktion der Rezeptor-Fusionsproteine werden vorzugsweise stabile Plasmaproteine verwendet, die typischerweise eine Halbwertszeit im Kreislauf von länger als 20 Stunden haben. Solche Plasmaproteine schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: Immunglobuline, Serumalbumin, Lipoproteine, Apolipoproteine und Transferrin. Außerdem können Sequenzen, die das lösliche LTβ-R-Molekül zu einem bestimmten Zell- oder Gewebetyp hinsteuern können, mit der LTβ-R-Ligandenbindungsdomäne verknüpft werden, wodurch ein spezifisch lokalisiertes, lösliches LTβ-R-Fusionsprotein erzeugt wird.
Die gesamte extrazelluläre Region von LTβ-R oder ein funktioneller Teil der extrazellulären Region von LTβ-R (1), umfassend die LTβ-R-Ligandenbindungsdomäne, kann an die konstante Region eines Immunglobulins wie die Fc-Domäne der schweren Kette eines menschlichen IgG1 fusioniert werden (Browning et al., J. Immunol. 154, S. 33-46 (1995)). Lösliche Rezeptor-IgG-Fusionsproteine sind bevorzugt, wobei es sich um herkömmliche immunologische Reagenzien handelt, und Verfahren für ihre Konstruktion sind dem Fachmann bekannt (vgl. z.B. US-Patent Nr. 5 225 538, hier durch Bezugnahme eingeschlossen).
Eine funktionelle LTβ-R-Ligandenbindungsdomäne kann an eine Fc-Domäne eines Immunglobulins (Ig) fusioniert werden, die von einer Immunglobulin-Klasse oder -Unterklasse stammt, die eine andere als IgG1 ist. Die Fc-Domänen von Antikörpern, die zu unterschiedlichen Ig-Klassen oder -Unterklassen gehören, können verschiedenartige sekundäre Effektorfunktionen aktivieren. Eine Aktivierung findet statt, wenn die Fc-Domäne durch einen dazugehörigen Fc-Rezeptor gebunden wird. Sekundäre Effektorfunktionen umfassen die Fähigkeit, das Komplementsystem zu aktivieren, die Plazenta zu durchdringen und verschiedene mikrobielle Proteine zu binden. Die Eigenschaften der unterschiedlichen Klassen und Subklassen von Immunglobulinen sind in Roitt et al., Immunology, S. 4.8 (Mosby-Year Book Europe Ltd., 3. Aufl., 1993), beschrieben.
Durch die Aktivierung des Komplementsystems werden Kaskaden von enzymatischen Reaktionen in Gang gesetzt, welche eine Entzündung vermitteln. Die Produkte des Komplementsystems haben eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich der Bindung von Bakterien, Endocytose, Phagocytose, Cytotoxizität, Produktion freier Radikaler und Solubilisierung von Immunkomplexen.
Die Komplement-Enzym-Kaskade kann durch die Fc-Domänen von Antigen-gebundenen IgG1-, IgG3 und IgM-Antikörpern aktiviert werden. Die Fc-Domäne von IgG2 scheint weniger wirksam zu sein, und die Fc-Domänen von IgG4, IgA, IgD und IgE sind beim Aktivieren des Komplements unwirksam. Somit kann man eine Fc-Domäne aufgrund dessen auswählen, ob ihre assoziierten sekundären Effektorfunktionen für die bestimmte Immunantwort oder Erkrankung, die mit dem LTβ-R-Ig-Fusionsprotein behandelt wird, wünschenswert sind.
Wenn es vorteilhaft ist, die LT-Liganden-tragende Zielzelle zu schädigen oder zu töten, könnte man für die Herstellung des LTβ-R-Ig-Fusionsproteins eine besonders aktive Fc-Domäne (IgG1) auswählen. Wenn es alternativ wünschenswert ist, das LTβ-R-Fc-Fusionsprotein zielgerichtet zu einer Zelle hinzusteuern, ohne das Komplementsystem zu aktivieren, könnte eine inaktive IgG4-Fc-Domäne ausgewählt werden.
Mutationen in Fc-Domänen, welche die Bindung an Fc-Rezeptoren und die Komplementaktivierung reduzieren oder eliminieren, wurden beschrieben (S. Morrison, Annu. Rev. Immunol. 10, S. 239-265 (1992)). Diese oder andere Mutationen können alleine oder in Kombination eingesetzt werden, um die Aktivität der Fc-Domäne, die zum Konstruieren des LTβ-R-Ig-Fusionsproteins verwendet wird, zu optimieren.
Die Produktion eines löslichen menschlichen LTβ-R-Fusionsproteins, umfassend Ligandenbindungssequenzen, fusioniert an eine menschliche Immunglobulin-Fc-Domäne (hLTβ-R-Ig), ist in Beispiel 1 beschrieben. Eine bestimmte CHO-Linie, hergestellt gemäß Beispiel 1, die hLTβ-R-Fc ausscheidet, ist mit „hLTβ-R; hG1 CHO#14" bezeichnet. Eine Probe dieser Linie wurde am 21. Juli 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer CRL11965.
Die Herstellung eines löslichen murinen LTβ-R-Fusionsmoleküls (LTβ-R-Ig) ist in Beispiel 2 beschrieben. Eine CHO-Linie, hergestellt gemäß Beispiel 2, die LTβ-R-Ig ausscheidet, ist mit „mLTβ; R-hG1 CHO#1.3.BB" bezeichnet. Eine Probe dieser Linie wurde am 21. Juli 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer CRL11964.
Alle Einschränkungen bezüglich der Verfügbarkeit für die Öffentlichkeit der vorstehenden ATCC-Hinterlegungen werden bei Erteilung eines Patents auf diese Anmeldung unwiderruflich aufgehoben.
Unterschiedliche Aminosäurereste, die den Übergangspunkt des Rezeptor-Ig-Fusionsproteins bilden, können die Struktur, die Stabilität und die endgültige biologische Aktivität des löslichen LTβ-Rezeptor-Fusionsproteins verändern. Eine oder mehrere Aminosäuren können an den C-Terminus des ausgewählten LTβ-R- Fragments angefügt werden, um den Übergangspunkt zur selektierten Fusionsdomäne zu modifizieren.
Der N-Terminus des LTβ-R-Fusionsproteins kann auch variiert werden, indem die Position geändert wird, an der das ausgewählte LTβ-R-DNA-Fragment an seinem 5'-Ende für die Insertion in den rekombinanten Expressionsvektor gespalten wird. Die Stabilität und Aktivität des jeweiligen LTβ-R-Fusionsproteins kann getestet und optimiert werden, indem Routineexperimente und die hier beschriebenen Tests zum Selektieren von LTβ-R-blockierenden Wirkstoffen eingesetzt werden.
Unter Verwendung der Sequenzen der LTβ-R-Ligandenbindungsdomäne innerhalb der extrazellulären Domäne, wie in 1 dargestellt, können auch Aminosäuresequenz-Varianten konstruiert werden, um die Affinität des löslichen LTβ-Rezeptors oder Fusionsproteins für den LT-Liganden zu modifizieren. Die löslichen LTβ-R-Moleküle können um die Bindung an den Oberflächen-LT-Liganden mit endogenen Zelloberflächen-LTβ-Rezeptoren kompetieren.
Quelle von anti-LTβ-R-Antikörpern
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wirken Antikörper, die gegen den menschlichen LTβ-Rezeptor gerichtet sind (anti-LTβ-R-Ak), als LTβ-R-blockierende Wirkstoffe. Die anti-LTβ-R-Ak können polyclonale oder monoclonale Antikörper (mAk) sein, und sie können modifiziert werden, um ihre Fähigkeit zur Blockierung der LTβ-R-Signalgebung, ihre in vivo-Bioverfügbarkeit, ihre Stabilität oder andere gewünschte Merkmale zu optimieren.
Polyclonale Antikörperseren, die gegen den menschlichen LTβ-Rezeptor gerichtet sind, werden unter Verwendung herkömmlicher Techniken hergestellt, indem an Tiere wie Ziegen, Kaninchen, Ratten, Hamster oder Mäuse subkutane Injektionen mit einem menschlichen LTβ-Rezeptor-Ig-Fusionsprotein (Beispiel 1) in komplettem Feundschen Adjuvans verabreicht werden, worauf eine intraperitoneale oder subkutane Boosterinjektion in inkomplettem Freundschem Adjuvans folgt. Polyclonale Antiseren, welche die gewünschten Antikörper enthalten, die gegen den LTβ-Rezeptor gerichtet sind, werden durch herkömmliche immunologische Verfahren durchgemustert.
Monoclonale Antikörper (mAk) der Maus, die gegen ein menschliches LTβ-Rezeptor-Ig-Fusionsprotein gerichtet sind, werden, wie in WO 97/03687 beschrieben, hergestellt. Eine Hybridomzelllinie (BD.A8.AB9), die den gegen den menschlichen LTβ-R gerichteten mAk der Maus BDA8 produziert, wurde am 12. Januar 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt und erhielt die ATCC-Hinterlegungsnummer HB11798. Alle Einschränkungen bezüglich der Verfügbarkeit für die Öffentlichkeit der vorstehenden ATCC-Hinterlegungen werden bei Erteilung eines Patents auf diese Anmeldung unwiderruflich aufgehoben.
Verschiedene Formen von anti-LTβ-R-Antikörpern können auch unter Verwendung herkömmlicher DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden (Winter und Milstein, Nature 349, S. 293-299 (1991)). Z.B. können „chimäre" Antikörper konstruiert werden, in denen die Antigenbindungsdomäne aus einem tierischen Antikörper an eine menschliche konstante Domäne gebunden ist (z.B. Cabilly et al., US 4 816 567 ; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, S. 6851-6855 (1984)). Chimäre Antikörper reduzieren die festgestellten immunogenen Antworten, die durch tierische Antikörper, die in klinischen Behandlungen beim Menschen eingesetzt werden, hervorgebracht werden.
Außerdem können rekombinante „humanisierte Antikörper" synthetisiert werden, die den LTβ-R erkennen. Humanisierte Antikörper sind Chimäre, die hauptsächlich menschliche IgG-Sequenzen umfassen, in welche die Regionen, die für eine spezifische Antigenbindung verantwortlich sind, eingefügt wurden (z.B. WO 94/04679). Tiere werden mit dem gewünschten Antigen immunisiert, die entsprechenden Antikörper werden isoliert, und der Teil der Sequenzen der variablen Region, der für eine spezifische Antigenbindung verantwortlich ist, wird entfernt. Die vom Tier stammenden Antigenbindungsregionen werden sodann in die geeignete Position von menschlichen Antikörpergenen, aus denen die Antigenbindungsregionen entfernt wurden, cloniert. Bei humanisierten Antikörpern ist die Verwendung von heterologen (Inter-Art-) Sequenzen in menschlichen Antikörpern so gering wie möglich, und deshalb besteht eine geringere Wahrscheinlichkeit, dass sie in dem behandelten Individuum Immunantworten hervorrufen.
Die Konstruktion von verschiedenen Klassen von rekombinanten anti-LTβ-R-Antikörpern kann auch erreicht werden, indem chimäre oder humanisierte Antikörper hergestellt werden, umfassend die gegen LTβ-R gerichteten variablen Domänen und menschliche konstante Domänen (CH1, CH2, CH3), die aus verschiedenen Klassen von Immunglobulinen isoliert wurden. Z.B. können gegen LTβ-R gerichtete IgM-Antikörper mit gesteigerten Wertigkeiten der Antigenbindungsstelle rekombinant produziert werden, indem die Antigenbindungsstelle in Vektoren cloniert wird, welche die konstanten Regionen der menschlichen μ-Kette enthalten (Arulanandam et al., J. Exp. Med. 177, S. 1439-1450 (1993); Lane et al., Eur. J. Immunol. 22, S. 2573-2578 (1993); Traunecker et al., Nature 339, S. 68-70 (1989)).
Außerdem können herkömmliche DNA-Rekombinationstechniken eingesetzt werden, um die Bindungsaffinitäten von rekombinanten Antikörpern zu ihren Antigenen zu verändern, indem Aminosäurereste in der Nachbarschaft der Antigenbindungsstellen verändert werden. Die Antigenbindungsaffinität eines humanisierten Antikörpers kann durch eine Mutagenese, die auf einer Molekülmodellierung beruht, gesteigert werden (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, S. 10029-33 (1989); WO 94/04679).
Es kann wünschenswert sein, die Affinität von anti-LTβ-R-Ak für den LTβ-R zu steigern oder abzuschwächen, abhängig von dem Ziel-Gewebetyp oder dem bestimmten beabsichtigten Behandlungsschema. Z.B. kann es vorteilhaft sein, einen Patienten für semiprophylaktische Behandlungen mit konstanten Spiegeln von anti-LTβ-R-Abs mit einer reduzierten Fähigkeit zur Signalgebung durch den LT-β-Stoffwechselweg zu behandeln. Genauso können inhibitorische anti-LTβ-R-Ak mit einer gesteigerten Affinität für den LTβ-R für kurzfristige Behandlungen vorteilhaft sein.
Quelle von gegen den Oberflächen-LT-Liganden gerichteten Antikörpern
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung von gegen den LT-Liganden gerichteten Antikörpern, die als LTβ-R-blockierende Wirkstoffe dienen. Wie vorstehend für die anti-LTβ-R-Ak beschrieben, können anti-LT-Ligand-Antikörper, die als LTβ-R-blockierende Wirkstoffe dienen, polyclonale oder monoclonale Antikörper sein, und sie können gemäß Routineverfahren modifiziert werden, um ihre Antigenbindungseigenschaften und ihre Immunogenität zu modulieren.
Die anti-LT-Antikörper der vorliegenden Erfindung können gegen jeden einzelnen der zwei LT-Untereinheiten getrennt hervorgerufen werden, umfassend lösliche, mutierte, veränderte und chimäre Formen der LT-Untereinheit. Wenn LT-Untereinheiten als das Antigen verwendet werden, sind sie vorzugsweise LTβ-Untereinheiten. Wenn LTα-Untereinheiten verwendet werden, ist es bevorzugt, dass die resultierenden anti-LTα-Antikörper an den Oberflächen-LT-Liganden binden und nicht mit ausgeschiedenem LTα kreuzreagieren oder die TNF-R-Aktivität modulieren (gemäß den in WO 97/03687 beschriebenen Tests).
Alternativ können Antikörper, die gegen einen homomeren (LTβ-) oder einen heteromeren (LTα/β-) Komplex gerichtet sind, der eine oder mehrere LT-Untereinheiten umfasst, hervorgebracht werden und auf Aktivität als LTβ-R-blockierende Wirkstoffe durchgemustert werden. Vorzugsweise werden LTα1/β2-Komplexe als das Antigen verwendet. Wie vorstehend diskutiert, ist es bevorzugt, dass die resultierenden anti-LTα1/β2-Antikörper an den Oberflächen-LT-Liganden binden, ohne an ausgeschiedenes LTα zu binden und ohne die TNF-R-Aktivität zu beeinträchtigen.
Die Produktion von polyclonalen anti-Mensch-LTα-Antikörpern ist in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung der Anmelder (WO 94/13808) beschrieben. Außerdem wurden schon monoclonale anti-LTα- und anti-LTβ-Antikörper beschrieben (Browning et al., J. Immunol. 154, S. 33-46 (1995)).
Gegen menschliches LTβ gerichtete mAk der Maus wurden, wie in WO 97/03687 beschrieben, hergestellt. Eine Hybridomzelllinie (B9.C9.1), die den gegen den menschlichen LTβ-R gerichteten mAk der Maus B9 produziert, wurde am 21. Juli 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt und erhielt die ATCC-Hinterlegungsnummer HB11962.
Gegen Maus-LTα/β gerichtete monoclonale Antikörper des Hamsters wurden, wie in WO 97/03687 beschrieben, hergestellt. Eine Hybridomzelllinie (BB.F6.1), die den gegen Maus-LTα/β gerichteten mAk des Hamsters BB.F6 produziert, wurde am 21. Juli 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer HB11963.
Alle Einschränkungen bezüglich der Verfügbarkeit für die Öffentlichkeit der vorstehenden ATCC-Hinterlegungen werden bei Erteilung eines Patents auf diese Anmeldung unwiderruflich aufgehoben.
Verwendung von löslichem LTβ-R-Ig zur Hemmung der immunologischen Funktionen des Oberflächen-LT-Komplexes
Nun zeigen wir die Effekte eines Oberflächen-LT-bindenden Reagens, eines Fusionsproteins, das aus der extrazellulären Domäne des murinen LTβ-R und den Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen des menschlichen IgG1 besteht (LTβ-R-Ig), auf die Erzeugung und den Charakter von Immunglobulinantworten, auf die Aufrechterhaltung der zellulären Organisation von sekundären lymphatischen Geweben, umfassend Effekte auf das Differenzierungsstadium von follikulären dendritischen Zellen und die Bildung von Keimzentren, und auf Addressin-Expressionsraten, welche das Zelltrafficking beeinflussen.
Mehrere Injektionen von LTβ-R-Ig in Mäuse verändern die Organisation von Milz-Lymphocyten und die Expression von funktionellen Markern durch Marginalzonen-Zellen der Milz
Die Wirkung einer Oberflächen-LT-Blockade auf die Struktur der Milz wurde untersucht, indem den Mäusen sechs aufeinander folgende wöchentliche Injektionen mit LTβ-R-Ig verabreicht wurden. Danach wurden die Mäuse mit SRBC immunisiert und erhielten vier Tage später eine weitere Injektion mit LTβ-R-Ig. Die Mäuse wurden am Tag zehn nach der SRBC-Injektion getötet. Die immunhistochemische Färbung von gefrorenen Milzschnitten zeigte mehrere histologische Veränderungen. Die Follikel, welche in normalen Mäusen das B-Zell-Kompartiment der Milz umfassen, liegen nach der LTβ-R-Ig-Behandlung nicht mehr getrennt vor. Statt dessen sind B-Zellen nun in einer diffusen bandförmigen Struktur organisiert, welche die T-Zell-Bereiche umgibt (2B), und die Grenze zwischen den T- und B-Zell-Zonen ist unterbrochen (2B). Im Gegensatz dazu liegen die B-Zell-Follikel der Milz in den mit LFA-3-Ig behandelten Mäusen der Kontrolle getrennt vor, und zwischen den T- und B-Zell-Bereichen ist eine klare Trennlinie zu erkennen ( 2A).
Die Expression von Zelloberflächenmarkern, die durch die monoclonalen ER-TR-9- und MOMA-1-Antikörper erkannt werden, fehlt bei zwei bestimmten Makrophagenpopulationen, die in der Marginalzone der Milz von LTβ-R-Ig-behandelten Mäusen vorliegen. Von ER-TR-9 ist bekannt, dass es einen Marker auf MZM färbt (Dijkstra et al., Immunol. 55, S. 23-30 (1985)), und MOMA-1 färbt einen Marker auf metallophilen Makrophagen (Kraal und Janse, Imunol. 58, S. 665-669 (1986)) (2D bzw. F). Diese Marker werden auf Zellen in den mit der Kontrolle (LFA-3-Ig) behandelten Mäusen exprimiert (2C, E). Auch die Expression von Sialoadhesin, einem anderen Marker von MOMA-1⁺-Makrophagen in der Marginalzone der murinen Milz, fehlt bei den mit LTβ-R-Ig behandelten Mäusen (Daten nicht dargestellt).
Der Antikörper MECA-367 bindet an das Adhäsionsmolekül und Schleimhaut-Addressin MAdCAM-1, das ursprünglich auf Endothelzellen in Peyer'-Plaques, Mesenteriallymphknoten, der Darmschleimhaut und Lamina propria beschrieben wurde (Briskin et al., Nature 363, S. 461-646 (1993); Nakache et al., Nature 337, S. 179-181 (1989)). Die Expression von MAdCAM-1 wurde auch in der Marginalzone der Milz (vermutlich exprimiert auf den Endothelzellen der kleinen Terminalarteriolen, die sich zum Marginalsinus hin öffnen) und auf dem retikulären Maschenwerk innerhalb der Keimzentren beschrieben (Kraal et al., Am. J. Pathol. 147, S. 763-771 (1995)) (2G). Die Färbung von Schnitten aus LTβ-R-Ig-behandelten Mäusen mit MECA 367 zeigt, dass die Expression von MAdCAM-1 in der Milz aufgehoben wurde (2H).
Genauso ist die Färbung durch den ER-TR-7-Antikörper (Van Vliet et al., Cytochem. 34, S. 883-890 (1986)), wodurch eine Population von Retikulum-Fibroblasten in der Marginalzone dargestellt wird (2I), abnorm verteilt und in der weißen Pulpa der mit LTβ-R-Ig behandelten Tiere stärker ausgeprägt als bei den mit LFA-3-Ig behandelten Tieren (2J). Die Änderungen in den mit LTβ-R-Ig behandelten Mäusen waren unabhängig von einer Antigenexposition, da das Muster der Färbung bei mit LTβ-R-Ig behandelten, nicht-immunisierten Mäusen identisch war (Daten nicht dargestellt).
In den Milzen von LTβ-R-Ig-behandelten Mäusen fehlt die Bildung von Keimzentren und lassen sich keine follikulären dendritischen Zellen nachweisen
Um auf histologischer Ebene zu bestimmen, ob mehrere Injektionen von LTβ-R-Ig an Mäuse die Immunantwort auf SRBC beeinflussen, wurde eine Analyse der Bildung von Keimzentren (GC) und der Verteilung von follikulären dendritischen Zellen (FDC) als Antwort auf eine Antigen-Sensibilisierung durchgeführt. Gefrorene Milzschnitte aus Mäusen, die mehrmals mit LTβ-R-Ig oder LFA-3-Ig, wie für 2 beschrieben, vorbehandelt worden waren, wurden mit Erdnuss-Agglutinin (PNA) gefärbt, um die GCs darzustellen, und sie wurden mit dem Antikörper FDC-M1 gefärbt, um FDC, eine zelluläre Komponente, die für die GC-Bildung erforderlich ist, nachzuweisen (Schriever und Nadler, Adv. Immunol. 51, S. 243-284 (1992); Tew et al., Immunol. Rev. 117, S. 185-211 (1990)). Außerdem wurde gezeigt, dass die Interaktion von CD40 und CD40-Ligand für die GC-Bildung entscheidend ist (Foy et al., J. Exp. Med. 180, S. 157-163 (1994)). Deshalb wurde zum Vergleich eine Gruppe von Mäusen mit MR1, einem gegen den CD40-Liganden der Maus gerichteten Antikörper, nach einem Injektionsprotokoll behandelt, für das früher gezeigt wurde, dass es die GC-Bildung hemmt (Han et al., J. Immunol. 155, S. 556-567 (1995)). Zehn Tage nach der SRBC-Provokation entwickelten die Mäuse, die mit dem Kontroll-LFA-3-Ig-Protein behandelt worden waren, zahlreiche PNA-helle GC in der Milz (3A). In der Milz von LTβ-R-Ig- oder MR1-behandelten Mäusen wurden keine GC nachgewiesen (3B bzw. C). Jedoch lässt sich die Wirkung von MR1 und von LTβ-R-Ig durch zwei weitere Beobachtungen unterscheiden. Die Färbung auf FDCs (FDC-M1) innerhalb der GC (3D) fehlt in der Milz von LTβ-R-Ig-behandelten Mäusen (3E), liegt jedoch in der Milz von MR1-behandelten Mäusen noch vor (3F). Ähnliche Beobachtungen wurden gemacht, wenn der Antikörper FDC-M2 zum Färben von FDCs verwendet wurde (Daten nicht dargestellt). Somit führt eine LTβ-R-Ig-Behandlung zu der phänotypischen Änderung von FDC in der Milz und dem Unvermögen, GC zu bilden.
Zusätzlich zur Färbung von GC färbt PNA außerdem die Marginalzone in der Milz von normalen Mäusen an. Eine solche Färbung wurde auch in mit LFA-3-Ig behandelten (3A) und mit MR1 behandelten Mäusen (3C) festgestellt, fehlte jedoch in der Milz von mit LTβ-R-Ig behandelten Mäusen (3B).
Außerdem wurde gezeigt, dass die Expression von Sialoadhesin, MOMA-1, ER-TR-9, ER-TR-7 und MAdCAM-1 in der Milz von MR1-behandelten Mäusen normal ist (Daten nicht dargestellt), wodurch sich die molekularen Effekte, die das Stören der CD40- und der LTβ-R-Signalgebung betreffen, noch weiter unterscheiden lassen.
Kinetik von LTβ-R-Ig-induzierten Änderungen der Lymphocyten-Organisation in der Milz und Expression von Zellmarkern in der Marginalzone der Milz
Die Anzahl von LTβ-R-Ig-Injektionen wurde analysiert, die erforderlich ist, um die Lymphocyten-Organisation und die Expression von Zellmarkern der Marginalzone in der Milz zu beeinträchtigen. Mäuse erhielten entweder einmalig oder mehrmals i.p.-Injektionen von LTβ-R-Ig, wie in Tabelle 1 angegeben. Anschließend wurden einige Mäuse außerdem am Tag der letzten LTβ-R-Ig-Injektion mit SRBC immunisiert. Die Expression von B220 und CD4 auf B- bzw. T-Zellen und die Färbung mit PNA (auf GC) und MECA367 (auf MAdCAM-1), MOMA-1, ER-TR-9 und FDC-M1 wurden an gefrorenen Milzschnitten aus behandelten Mäusen durchgeführt. Es wird gezeigt, dass die Kinetiken des Verschwindens der Färbung von metallophilen Makrophagen, Marginalzonen-Makrophagen, MAdCAM-1, GCs und FDCs verschieden sind.
Eine einzige Injektion von LTβ-R-Ig ist ausreichend, um eine Woche später die Färbung von MAdCAM-1 zum Verschwinden zu bringen. Nach drei wöchentlichen LTβ-R-Ig-Injektionen wird keine Färbung für GCs und FDCs nachgewiesen, und die T/B-Lymphocyten-Kompartimente sind aufgebrochen. Mindestens vier LTβ-R-Ig-Injektionen sind erforderlich, um die Färbung auf metallophile Makrophagen aufzuheben. Sechs LTβ-R-Ig-Injektionen führen nicht dazu, dass die Färbung von Marginalzonen-Makrophagen mit dem ER-TR-9-Antikörper vollständig aufgehoben wird (auch in 2D erläutert).
Eine genauere Analyse der schnellen Hemmung der MOMA-1-, MAdCAM-1-, FDC-M1-, FDC-M2- und CR1-Färbung nach einer einzelnen Injektion von LTβ-R-Ig wurde in Abwesenheit von Antigen durchgeführt (Tabelle 2).
Tabelle 1 Wirkung von LTβ-R-Ig auf die Organisation der Milz und Keimzentrum-Bildung als Antwort auf SRBC in erwachsenen Mäusen
Den Mäusen wurden eine bis fünf Wochen lang jede Woche 100 μg LTβ-R-Ig i.p. injiziert, danach wurden sie getötet. LTβ-R-Ig wurde vor der i.p.-Injektion von SRBC (100 μl einer 10 % Suspension) verabreicht, sofern nichts anderes angegeben ist, und die letzte LTβ-R-Ig-Injektion wurde am gleichen Tag wie das Antigen verabreicht. Die Tiere wurden zehn Tage nach der SRBC-Injektion getötet. Gefrorenen Milzschnitte wurden mit biotinyliertem Ratten-anti-Maus-B220 und Ratten-anti-Maus-CD4 doppelt gefärbt, gefolgt von Streptavidin-alkalische-Phosphatase bzw. Maus-anti-Ratte-Ig-Peroxidase. Außerdem wurden Milzschnitte mit den folgenden anti-Maus-Antikörpern gefärbt: Ratte-anti-Marginalzonen-Makrophagen (ER-TR-9), Ratte-anti-metallophile-Makrophagen (MOMA-1), Ratte-anti-MAdCAM-1 (MECA 367) und Ratte-anti-FDC (FDC-M1), gefolgt von einer Maus-anti-Ratte-Ig-Peroxidase. Ein weiterer Satz von gefrorenen Schnitten wurde mit biotinyliertem Erdnuss-Agglutinin (PNA-Biotin) gefärbt, gefolgt von einer Färbung mit Streptavidin-Peroxidase, um Keimzentren nachzuweisen. Die Untersuchungen wurden an Schnitten aus mindestens drei Tieren pro Gruppe durchgeführt.

* Die Intensität der Färbung wurde visuell bestimmt: normale Färbung: +++; reduzierte Färbung: ++; schwache Färbung: +; und keine Färbung: –. Die Intensität der Färbung auf Schnitten aus unbehandelten Tieren und aus Tieren, die mit LFA-3-Ig behandelt worden waren, wurde als Referenz für die normale Färbung genommen.
§ Die Zahl von Keimzentren pro Milzschnitt ist wie folgt angegeben: > 10: +++; 5 bis 10: ++; 1 bis 5: +, keine: –.
Tiere aus diesen Gruppen erhielten keine SRBC.
ND: nicht durchgeführt.

Tabelle 2 Genaues Timing von LTβ-R-Ig-Effekten auf die MOMA-1, MAdCAM-1-, CR1-, FDC-M1- und FDC-M2-Färbung
Balb/c-Mäuse, 5 bis 6 Wochen, erhielten eine i.p.-Injektion von 100 μg LTβ-R-Ig oder menschlichem Ig. Die Mäuse aus jeder Gruppe wurden am Tag 0, 1, 3, 5, 7, 10 und 14 getötet. Gefrorene Milzschnitte wurden mit den folgenden Antikörpern gefärbt: Ratten-anti-Maus-metallophile-Makrophagen (MOMA-1), Ratten-anti-Maus-MAdCAM-1 (MECA 367), Ratten-anti-Maus-FDC (FDC-M1), Ratten-anti-Maus-FDC (FDC-M2) und Biotin-markierter Ratten-anti-Maus-CR1, gefolgt von einer Maus-anti-Ratten-Ig-Peroxidase (MOMA-1, MAdCAM-1, FDC-M1 und FDC-M2) oder Peroxidase-markiertem Streptavidin (CR1).

* Die Intensität der Färbung wurde visuell bestimmt: normale Färbung: +++; reduzierte Färbung: ++; schwache Färbung: +; und keine Färbung: –. Die Intensität der Färbung auf Schnitten aus unbehandelten Tieren und aus Tieren, die mit menschlichem Ig behandelt worden waren, wurde als Referenz für die normale Färbung genommen. Schnitte aus mindestens zwei Tieren pro Gruppe wurden analysiert.

Von Balb/c-Mäusen, die eine einzelne i.p.-Injektion von LTβ-R-Ig erhielten, wurden 14 Tage lang jeden Tag nach der Injektion Tiere getötet, und ihre Milzen wurden entnommen und eingefroren. Gefrorene Milzschnitte wurden mit MOMA-1-, anti-MAdCAM-1 (MECA-367) und FDC-spezifischen Reagenzien: FDC-M1, FDC-M2 und anti-CR1-Antikörpern angefärbt. Einen Tag nach der LTβ-R-Ig-Injektion war die Färbung mit anti-MAdCAM-1-, FDC-M1- und FDC-M2-Reagenzien stark reduziert (Tabelle 2). Die schnellere Hemmung der FDC-M1-Färbung in diesem Experiment im Vergleich zu den in Tabelle 1 angegebenen Ergebnissen ist möglicherweise auf die Intensität der FDC-M1-Färbung zurückzuführen, die in immunisierten Tieren stärker ist. Die Färbung auf CR1 war am Tag 14 immer noch nachweisbar, dies zeigt, dass die FDC am Tag 3 nach der Behandlung mit LTβ-R-Ig noch vorlagen, dass die Expression von Markern, die mit FDC-M1 und FDC-M2 nachgewiesen wurden, jedoch aufgehoben war. Somit veränderte die LTβ-R-Ig-Behandlung den FDC-Phänotyp. Letztendlich war die MOMA-1-Färbung reduziert, wurde jedoch am Tag 14 immer noch nachgewiesen.
Mehrere LTβ-R-Ig-Behandungen hemmen die Addressin-Expression in LN
Wir untersuchten die Addressin-Expression in LN der Nachkommen von zeitlich aufeinander abgestimmten trächtigen Balb/c-Mäusen, denen an den Tagen 14 und 17 der Trächtigkeit Injektionen mit 200 μg Rezeptor-Ig-Proteinen i.v. verabreicht worden waren. Nach der Geburt blieben die Nachkommen entweder unbehandelt, oder ihnen wurden einmal pro Woche 100 μg LTβ-R-Ig, TNF-R55-Ig oder LFA-3-Ig i.p. injiziert. Die Fusionsprotein-Spiegel blieben das ganze Leben lang bei 10 μg/ml oder darüber, dies wurde durch ELISA bestimmt (Werte nicht dargestellt). Die immunhistochemische Färbung mit MECA367 und MECA79 zeigte, dass MAdCAM-1 und periphere LN-Addressine in Mesenterial-LN aus Mäusen, die ihr ganzen Leben lang mit LTβ-R-Ig behandelt worden waren, vollkommen fehlten (4A, B). Auch bei den Sakral-LN aus diesen Mäusen fehlte die Expression aller Addressine, und die Zervikal- und Iliak-LN zeigten keine Färbung peripherer Lymphknoten (PNAd) (Daten nicht dargestellt). Die Nach-Unten-Regulation der Addressin-Expression war reversibel, da sich die Expression bei Tieren, die nur in utero behandelt worden waren, wieder auf normale Werte erholte (4G, H). In Mäusen, die ihre ganzes Leben mit 100 μg TNF-R55-Ig oder LFA-3-Ig pro Woche behandelt worden waren, blieb die Addressin-Expression in LN vergleichbar mit unbehandelten Mäusen (4C, D, E, F).
Die Positionierung von B-Lymphocyten und die Expression von Makrophagenmarkern sind in LN von LTβ-R-Ig-behandelten Mäusen verändert
Antikörper, die an Marker auf Makrophagenpopulationen im subkapsulären LN-Sinus (analog zu der Marginalzone der Milz) binden, wurden verwendet, um immunhistochemische Analysen von LN durchzuführen, die aus Mäusen entnommen wurden, die während der Trächtigkeit und kontinuierlich nach der Geburt, wie für 4 vorstehend beschrieben, mit LTβ-R-Ig, TNF-R55-Ig oder LFA-3-Ig behandelt worden waren. Fluoreszenzbilder wurden unter Verwendung einer Bildanalyse-Software analysiert. Es wird gezeigt, dass die Expression von Sialoadhesin in LN von mit löslichem LTβ-R-Ig behandelten Mäusen vermindert ist (5B), nicht jedoch in LN von TNF-R55-Ig- oder LFA-3-Ig-Mäusen (5E, H). Die Expression von MOMA-1 auf Makrophagen im subkapsulären Sinus wurde noch in LN von mit LTβ-R-Ig behandelten Mäusen nachgewiesen (5C).
Außerdem wurden die Effekte einer kontinuierlichen LTβ-R-Ig-Behandlung auf die Lymphocyten-Organisation in LN untersucht. LN-Schnitte wurden mit mAk gefärbt, die für den B-Zell-Marker B220 und den T-Zell-Marker CD4 spezifisch waren. Anhand einer Bildanalyse wurden überlappende Bereiche von T- und B-Zell-Zonen identifiziert. Die Behandlung mit LTβ-R-Ig bewirkte die Auflösung von B-Zell-Follikeln, so dass die B-Zellen in einer diffusen bandförmigen Struktur am äußeren Rand des T-Zell-Bereichs vorlagen (5A). Trotz der Auflösung ihrer follikulären Strukturen lagen keine B-Zellen innerhalb von T-Zell-Arealen der LN vor, statt dessen kamen sie in Bereichen zum Vorschein, die normalerweise nicht von Lymphocyten besetzt sind. Ein sehr ähnliches Muster von T- und B-Zell-Färbung wurde in Mäusen festgestellt, die ihr ganzes Leben mit 100 μg TNF-R55-Ig pro Woche behandelt worden waren, nicht jedoch bei LFA-3-Ig (5D). Wieder waren B-Zell-Follikel aufgebrochen, und B-Zellen lagen in Arealen der LN vor, in denen normalerweise keine Lymphocyten gefunden werden. Es wurde keine Überlappung von B-Zellen mit T-Zellen gefunden.
Die LTβ-R-Ig-Behandlung von Mäusen hemmt die IgM- und IgG-Antikörperantwort
Die Tatsache, dass keine Milz-GC nach einer SRBC-Sensibilisierung von Mäusen gebildet wurden, die mehrmals mit LTβ-R-Ig behandelt worden waren (wie in 3), legte Änderungen in der humoralen Immunantwort dieser Mäuse nahe. Um dies direkt zu testen, erhielten erwachsene Mäuse sechs Injektionen, einmal pro Woche, von LTβ-R-Ig oder LFA-3-Ig und wurden sodann mit SRBC sensibilisiert. Den Mäusen wurde an den Tagen 7 und 14 nach der Immunisierung Blut abgenommen und das Vorliegen von SRBC-spezifischem IgM und IgG in den Seren unter Verwendung von Hämagglutinin-Tests analysiert. Sieben Tage nach der SRBC-Immunisierung ist der IgM-Titer normal, jedoch ist die IgG-Antwort in den mit LTβ-R-Ig behandelten Mäusen im Vergleich zu Mäusen, die mit menschlichem Ig oder PBS behandelt worden waren, stark vermindert (6A). Am Tag 14 nach der Immunisierung wird in den Seren aus LTβ-R-Ig-behandelten Mäusen noch kein SRBC-spezifisches IgG nachgewiesen, und der Titer von SRBC-spezifischem IgM ist in diesen Mäusen im Vergleich zu den mit menschlichem Ig oder PBS behandelten Mäusen auch um mehr als die Hälfte vermindert (6A).
Zehn Tage nach der SRBC-Sensibilisierung werden in den Milzen von Mäusen, die einmal oder zweimal mit LTβ-R-Ig behandelt wurden, GCs nachgewiesen, jedoch ist die Zahl von GCs im Vergleich zu den Kontrollen stark vermindert (Tabelle 1). Wenn Mäuse zwei Injektionen von LTβ-R-Ig erhielten, die erste Injektion eine Woche vor der SRBC-Sensibilisierung und die zweite Injektion am gleichen Tag wie die SRBC-Injektion, ist die Hemmung der IgM- und IgG-Antwort auf SRBC am Tag 7 und am Tag 14 (6B) ähnlich wie diejenige, die nachgewiesen wurde, wenn Mäuse mehrere LTβ-R-Ig-Injektionen erhielten ( 6A). Am Tag 30 nach der Immunisierung wird kein SRBC-spezifisches IgG nachgewiesen, und die IgM-Spiegel sind im Vergleich zu den Kontrollen um mehr als 80 % reduziert (6B). Somit führten diese LTβ-R-Ig-Behandlungsprotokolle zur vollständigen Hemmung von IgG-Antworten und im Vergleich zu den Kontrollen zu einer verkürzten/verminderten IgM-Antwort.
Wenn Mäuse eine einzelne Injektion von LTβ-R-Ig am gleichen Tag wie die SRBC-Sensibilisierung erhielten, war der Spiegel der IgG- und IgM-Antworten auf SRBC am Tag 7 mit demjenigen der Kontrollgruppen vergleichbar (6C). Jedoch sind am Tag 24 nach der Immunisierung die IgM- und IgG-Titer beide um 30 % reduziert. Am Tag 34 nach der SRBC-Sensibilisierung ist der Titer von SRBC-spezifischem IgM im Vergleich zu den Kontrollgruppen um 50 % reduziert, und kein SRBC-spezifisches IgG konnte nachgewiesen werden (6C). Diese Ergebnisse zeigen, dass dieses LTβ-R-Ig-Behandlungsprotokoll zur deutlichen Verminderung/Reduktion der Spiegel sowohl einer bereits laufenden IgM- als auch einer bereits laufenden IgG-Antwort führte, das heißt, dass die LTβ-R-Ig-Behandlung eine humorale Antwort hemmen kann, die bereits initiiert wurde.
Antikörper-vermittelte Erkrankung
Zahlreiche organspezifische und mehrere Systeme betreffende Autoimmunerkrankungen umfassen pathologische Antikörperantworten. Solche Erkrankungen schließen ein: Myasthenia gravis, autoimmune hämolytische Anämie, Chagas-Krankheit, Basedowsche Krankheit, Idiopathische Thrombozytopenische Purpura (ITP), Systemischer Lupus Erythematodes (SLE), Wegener-Granulomatose, Polyarteriitis nodosa und Schnell Fortschreitende Sichelförmige Graunolnephritis. (Aus Benjamini et al., „Immunology, A Short Course", (Wiley-Liss, New York, 3. Aufl., (1996)).
Obwohl die Ätiologie von SLE nicht definiert ist, ist schon ziemlich viel über den immunologischen Mechanismus bekannt, der für die festgestellten pathologischen Befunde verantwortlich ist. Aus unbekannten Gründen produzieren Patienten mit SLE Antikörper gegen nukleäre Komponenten des Körpers (antinukleäre Antikörper (ANA)), hauptsächlich gegen native doppelsträngige DNA. Das Vorliegen dieser Antikörper korreliert klinisch am besten mit dem pathologischen Befund der Nierenbeteiligung an SLE. Diese Antikörper komplexieren mit DNA, die offensichtlich aus dem Zusammenbruch des normalen Gewebes stammt, und wie bei jeder Immunaggregat-Krankheit bilden solche Komplexe Ablagerungen, die auf der Basalmembran der Glomeruli, in den Wänden von Arteriolen und in Gelenksynovialräumen festgehalten werden. Diese Komplexe aktivieren die Komplementkaskade und ziehen Granulocyten an. Die anschließende Entzündungsreaktion ist als Glomerulonephritis charakterisiert, es kommt zu einer Schädigung der Nieren, die zu Proteinurie und Hämaturie führt.
Lupus nephritis wurde seit Jahrzehnten in murinen Modellen untersucht. Kürzlich wurde die therapeutische Wirksamkeit eines für den murinen CD40-Liganden spezifischen Reagens in einem solchen Modell ausgewertet (Mohan et al., J. Immunol. 154, S. 1470-1480 (1995)). Es wurde gezeigt, dass die Beschleunigung von Lupus durch die Übertragung von Zellen, welche die Produktion von pathogenen Antikörpern in vivo induzieren, durch die Verabreichung eines monoclonalen Antikörpers gehemmt wird, der Interaktionen von CD40 und CD40-Ligand blockiert. Außerdem hatte eine kurze Behandlung von Lupus-Mäusen mit einem gegen den CD40-Liganden gerichteten Antikörper eine länger anhaltende, günstige Wirkung auf ihre spontane Erkrankung, lange nachdem der Antikörper aus ihren Systemen ausgeschieden worden war. Die Versuche zeigten, dass pathogene B-Zellen sogar neun Monate nach der Therapie keinen Antikörper produzieren konnten, dies legt nahe, dass eine Verzögerung der Expansion von Autoimmun-Gedächtnis-B-Zellen vorlag, was zu langfristigen, günstigen therapeutischen Effekten führte. Da wir gezeigt haben, dass Reagenzien, welche Wechselwirkungen von LTα/β und LTβ-R in vivo blockieren, die Erzeugung von Antikörperantworten hemmen, den Phänotyp von FDC und die Bildung von Keimzentren verändern, die an einer optimalen Erzeugung des B-Zell-Gedächtnisses beteiligt sind, sind die LTαβ/LTβ-R-blockierenden Reagenzien der vorliegenden Erfindung für die Behandlung oder Verhinderung von SLE geeignet.
Die normale Immunantwort auf einige pathogene infektiöse Agenzien induziert auch Autoantikörper-Antworten, die sehr stark werden können und möglicherweise ein medizinisches Problem darstellen. Ein Beispiel ist die Chagas-Krankheit, eine entzündliche Kardiomyopathie, die sich in Menschen und Versuchstieren bei einer chronischen Infektion mit Trypanosoma cruzi entwickelt. Unter mehreren möglichen Mechanismen, die an der Pathogenese der Chagas-Kardiomyopathie beim Menschen beteiligt sind, wurde kürzlich die Induktion von herzspezifischen Autoimmunantworten beträchtlich experimentell gestützt. In einer kürzlichen Studie (Tibbetts et al., J. Immunol. 152, S. 1493-1499 (1994)) wurde festgestellt, dass in mit T. cruzi infizierten C57/BI/6-Mäusen mit einer Herzerkrankung Herzantigen-spezifische Antikörper erzeugt werden. Bei Infektion mit dem Stamm Brazil von T. cruzi entwickeln C57B1/6-Mäuse eine Kardiomyopathie, die histologisch ähnlich ist wie diejenige, die bei chronisch infizierten Menschen festgestellt wird. Antiseren aus diesen Mäusen reagieren mit drei Herzantigenen, während die mit dem Stamm Guayas von T. cruzi infizierten C57/BI/6-Mäuse, die keine Kardiomyopathie entwickeln, keine solchen Antikörper produzieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Antikörper spezifische Marker der Kardiomyopathie darstellen. Somit kann die Fähigkeit von LTβ-R-blockierenden Wirkstoffen, die durch Autoantikörper vermittelte Schädigung zu hemmen, in einem solchen Nagermodell festgestellt werden.
Ein weiteres Beispiel einer Zerstörung von Zellen durch Autoantikörper, die als Folge von bestimmten Infektionskrankheiten oder aus unbekannten Gründen erzeugt werden, ist die idiopathische thrombocytopenische Purpura (ITP). Bei dieser Erkrankung führen Antikörper, die gegen Thrombocyten gerichtet sind, zu einer Zerstörung von Thrombocyten (durch Komplement oder phagocytische Zellen mit Fc- oder C3b-Rezeptor), wodurch es zu Blutungen kommen kann. Arzneimittel, welche solche Antikörper-vermittelten Autoimmunreaktionen in vivo hemmen, wie die LTβ-R-blockierenden Wirkstoffe, welche die Antikörpererzeugung hemmen, können auch zur Behandlung oder Verhinderung dieser Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden.
Behandlungen unter Verwendung von LTβ-R-blockierenden Wirkstoffen
Die Zusammensetzungen werden in einer wirksamen Dosis verabreicht, um den bestimmten klinischen Zustand zu behandeln. Der Fachmann ist nach dem Stand der Technik in der Lage, eine bevorzugte pharmazeutische Formulierung und ein therapeutisch wirksames Dosierungsschema für eine bestimmten Anwendung festzulegen, wobei er z.B. die körperliche Verfassung und das Gewicht des Patienten, das Ausmaß der gewünschten Behandlung und die Frage, inwieweit der Patient die Behandlung toleriert, berücksichtigen wird.
Man geht davon aus, dass Dosierungen von etwa 1 mg/kg eines löslichen LTβ-R geeignete Ansatzpunkte für eine Optimierung der Dosierungen für eine Behandlung darstellen.
Eine therapeutisch wirksame Dosis kann auch bestimmt werden, indem in vitro-Experimente durchgeführt werden, welche die Konzentration des LTβ-R-blockierenden Wirkstoffs messen, die erforderlich ist, um Zielzellen (LTβ-R- oder LT-Ligand-positive Zellen, abhängig von dem blockierenden Wirkstoff) für einen bis 14 Tage zu beschichten. Die Rezeptor-Liganden-Bindungstests, die früher in WO 97/03687 beschrieben wurden, können eingesetzt werden, um die Zellbeschichtungsreaktion zu überwachen. LTβ-R- oder LT-Liganden-positive Zellen können unter Verwendung von FACS aus aktivierten Lymphocyten-Populationen abgetrennt werden. Aufgrund der Ergebnisse solcher in vitro-Bindungstests, kann ein Spektrum von geeigneten Konzentrationen des LTβ-R-blockierenden Wirkstoffs ausgewählt werden, und diese können dann in Tieren getestet werden.
Die Verabreichung der löslichen LTβ-R-Moleküle, anti-LT-Ligand- und anti-LTβ-R-Ak alleine oder in Kombination, einschließlich isolierter und gereinigter Formen der Antikörper oder Komplexe, ihrer Salze oder pharmazeutisch verträglicher Derivate davon, kann unter Verwendung einer beliebigen herkömmlich anerkannten Art zur Verabreichung von Wirkstoffen, die eine immunsuppressive Aktivität zeigen, erfolgen.
Außerdem können die Arzneimittel, die in diesen Therapien eingesetzt werden, in vielfältigen Formen vorliegen. Diese schließen z.B. feste, halbfeste und flüssige Dosierungsformen ein, wie Tabletten, Pillen, Pulver, flüssige Lösungen oder Suspensionen, Suppositorien und injizierbare sowie infundierbare Lösungen. Die bevorzugte Form hängt von der vorgesehenen Verabreichungsart und therapeutischen Anwendung ab. Verabreichungsarten können eine orale, parenterale, subkutane, intravenöse, Intraläsions- oder topische Verabreichung einschließen.
Die löslichen LTβ-R-Moleküle, anti-LT-Ligand- und anti-LTβ-R-Ak können z.B. in sterile isotonische Formulierungen mit oder ohne Cofaktoren, welche die Aufnahme oder Stabilität stimulieren, eingebracht werden. Die Formulierung ist vorzugsweise flüssig, oder sie kann ein gefriergetrocknetes Pulver sein. Z.B. können die löslichen LTβ-R-Moleküle, anti-LT-Ligand- und anti-LTβ-R-Ak mit einem Formulierungspuffer verdünnt werden, der 5,0 mg/ml Citronensäure-Monohydrat, 2,7 mg/ml Trinatriumcitrat, 41 mg/ml Mannit, 1 mg/ml Glycin und 1 mg/ml Polysorbat 20 enthält. Diese Lösung kann gefriergetrocknet, unter Kühlung gelagert und vor der Verabreichung mit sterilem Wasser-für-die-Injektion (USP) rekonstituiert werden.
Die Zusammensetzungen schließen außerdem vorzugsweise herkömmliche, pharmazeutisch verträgliche Träger ein, die dem Fachmann bekannt sind (vgl. z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., 1980, Mac Publishing Company). Solche pharmazeutisch verträglichen Träger können andere medizinische Wirkstoffe, Träger, genetische Träger, Adjuvantien, Excipienten usw. wie menschliches Serumalbumin oder Plasmapräparate einschließen. Die Zusammensetzungen liegen vorzugsweise in Form einer Einheitsdosierung vor und werden üblicherweise einmal oder mehrmals pro Tag verabreicht.
Die Arzneimittel können auch unter Verwendung von Mikrokügelchen, Liposomen, anderen mikropartikulären Applikationssystemen oder langanhaltenden Freisetzungsformulierungen verabreicht werden, die in der Nähe von oder auf andere Weise in Kommunikation mit betroffenen Geweben oder dem Blutstrom platziert werden. Geeignete Beispiele von langanhaltenden Freisetzungsträgern schließen semipermeable Polymermatrizen in Form von geformten Vorrichtungen wie Suppositorien und Mikrokapseln ein. Implantierbare oder mikrokapsuläre Matrizen mit einer lang anhaltende Freisetzung schließen Polylactide (US-Patent Nr. 3 773 319; EP 58 481 ), Copolymere aus L-Glutaminsäure und Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, S. 547-556 (1985)); Poly(3-hydroxyethylmethacrylat) oder Ethylenvinylacetat ein (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, S. 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12, S. 98-105 (1982)).
Liposomen, die lösliche LTβ-R-Moleküle, anti-LT-Ligand- und anti-LTβ-R-Ak alleine oder in Kombination enthalten, können durch bekannte Verfahren hergestellt werden (vgl. z.B. DE 3 218 121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, S. 3688-92 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, S. 4030-4034 (1980); US-Patente Nr. 4 485 045 und 4 544 545). Normalerweise handelt es sich um Liposomen vom kleinen (etwa 200 bis 800 Ångström) unilamellaren Typ, in denen der Lipidgehalt größer als etwa 30 Mol.-% Cholesterin ist. Der Anteil von Cholesterin wird so ausgewählt, dass die optimale Rate der Freisetzung von löslichem LTβ-R-Molekül, anti-LT-Ligand- und anti-LTβ-R-Ak kontrolliert wird.
Die löslichen LTβ-R-Moleküle, anti-LT-Ligand- und anti-LTβ-R-Ak können mit Liposomen verknüpft werden, die andere LTβ-R-blockierende Wirkstoffe, Immunsuppressiva oder Cytokine enthalten, um die LTβ-R-blockierende Aktivität zu modulieren. Die Verknüpfung von LTβ-R-Molekülen, anti-LT-Ligand- und anti-LTβ-R-Ak mit Liposomen kann durch jedes bekannte Vernetzungsmittel erreicht werden, wie heterobifunktionelle Vernetzungsmittel, die schon verbreitet eingesetzt wurden, um Toxine oder Chemotherapeutika für eine gezielte Freisetzung an Antikörper zu koppeln. Die Konjugation an Liposomen kann auch unter Verwendung des auf Kohlenhydrat abzielenden Vernetzungsreagens 4-(4-Maleinimidphenyl)buttersäurehydrazid (MPBH) erreicht werden (Duzgunes et al., J. Cell. Biochem., Abst. Erg., 16E 77 (1992)).
Vorteile von Arzneimitteln, die LTβ-R-blockierende Wirkstoffe umfassen
Die LTβ-R-blockierenden Wirkstoffe sind in der Lage, Immuneffektormechanismen selektiv zu hemmen. Die Hemmung der Antikörper-vermittelten Immunität wird durch vielfältige Mechanismen gehemmt, umfassend die Regulation der GC-Bildung durch Beeinflussen der FDC-Funktion. Sowohl die Antikörper- als auch die zellvermittelte Immunität werden teilweise gehemmt, indem die Expression von Addressinen reguliert und somit das Trafficking von Lymphocyten beeinflusst wird. Somit sind LTβ-R-blockierende Wirkstoffe zur Behandlung von Erkrankungen geeignet, die durch die Aktivitäten von Antikörpern oder durch die abnorme Expression von Addressinen verschlimmert werden. Die Fähigkeit zur selektiven Hemmung solcher immunvermittelten Antworten kann für die Behandlung von abnormen Zuständen, umfassend verschiedene Autoimmunleiden und chronische Entzündungskrankheiten, eingesetzt werden. Wie vorstehend diskutiert, werden zur Behandlung solcher pathologischen, immunvermittelten Erkrankungen im Allgemeinen immunmodulatorische und immunsuppressive Wirkstoffe eingesetzt, die pleiotrope Effekte auf eine große Vielfalt von Zelltypen und immunologischen Antworten ausüben. Diese unspezifischen immunsuppressiven Wirkstoffe sind im Allgemeinen in hohen und häufig cytotoxischen Dosen erforderlich, die unerwünschte Nebenwirkungen auslösen.
Bei der kürzlichen Untersuchung des Lupusnephritis der Maus sprachen die Ergebnisse dafür, dass ein Antikörperantworten-hemmendes Reagens die Fähigkeit besitzt, eine pathologische Immunantwort abzuschwächen. In der letzterwähnten Studie wurde gezeigt, dass die Verabreichung eines Antikörpers, der den CD40/CD40L-Stoffwechselweg blockiert, die Beschleunigung eines Lupusnephritis hemmt, der durch die Übertragung von Zellen, welche die Produktion von pathogenen Antikörpern in vivo induzieren, erzeugt wurde, und eine lang anhaltende günstige Wirkung auf die spontane Krankheit ausübt, und zwar noch lange nachdem der Antikörper aus dem System ausgeschieden wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass die LTβ-R-blockierenden Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung geeignet sind, die zelluläre Abstoßung von Gewebetransplantaten und Organtransplantaten zu unterdrücken, indem sie Prozesse hemmen, die zur Erzeugung von Antikörperantworten führen.
Die LTβ-R-blockierenden Wirkstoffe können so modifiziert werden, dass man abhängig vom Zustand, von der Störung oder der Erkrankung, der/die behandelt wird, eine wünschenswerte Stärke der LTβ-R-Signalgebung erhält. Es ist so zu verstehen, dass die absolute Stärke der LTβ-R-Signalgebung fein eingestellt werden kann, indem die Konzentration und die Affinitäten der LTβ-R-blockierenden Wirkstoffe für ihre entsprechenden molekularen Ziele manipuliert werden.
Z.B. werden Zusammensetzungen, die lösliche LTβ-R-Moleküle umfassen, an ein Individuum verabreicht. Der lösliche LTβ-Rezeptor kann wirksam mit Zelloberflächen-LTβ-Rezeptoren um die Bindung von Oberflächen-LT-Liganden kompetieren. Die Fähigkeit, mit Oberflächen-LT-Liganden zu kompetieren, hängt von den relativen Konzentrationen der löslichen und der Zelloberflächen-LTβ-R-Moleküle und von ihren relativen Affinitäten für die Ligandenbindung ab.
Lösliche LTβ-R-Moleküle, die Mutationen enthalten, welche die Bindungsaffinität dieses mutierten löslichen LTβ-R zu dem Oberflächen-LT-Liganden steigern oder herabsetzen, können unter Verwendung herkömmlicher DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Eine große Zahl von Molekülen mit positionsgerichteten oder zufälligen Mutationen kann unter Verwendung von Routineexperimenten und der hier beschriebenen Verfahren auf ihre Fähigkeit getestet werden, als LTβ-R-blockierende Mittel zu wirken.
Genauso dienen Antikörper, die entweder gegen den LTβ-Rezeptor oder gegen eine oder mehrere der LT-Liganden-Untereinheiten gerichtet sind, als LTβ-R- blockierende Wirkstoffe. Die Fähigkeit dieser Antikörper, die LTβ-Rezeptor-Signalgebung zu blockieren, kann durch Mutation, chemische Modifikation oder durch andere Verfahren modifiziert werden, wodurch die wirksame Konzentration oder Aktivität des an das Individuum dargereichten Antikörpers variiert werden kann.
Die Fähigkeit, die LTβ-R-Signalgebung zu verringern, ohne sie vollständig zu hemmen, ist möglicherweise wichtig, um reduzierte Spiegel der LTβ-R-Signalgebung, welche die normale Immunfunktion fördern, einzustellen oder aufrechtzuerhalten, während Antikörper- oder zellvermittelte Antworten gehemmt werden, die übertrieben oder abnorm sind.
Die Unterbrechung des LTα-Gens in einer Maus führt zu einer anomalen Entwicklung peripherer lymphatischer Organe (De Togni et al., Science 264, S. 703-707 (1994)). Bei solchen Mäusen fehlten Lymphknoten, und in ihren Milzen fehlte die üblicherweise deutliche Abgrenzung zwischen T- und B-Zell-reichen Regionen in den Follikeln. Wir nehmen an, dass dieser Phänotyp mit dem Verlust einer durch Oberflächen-LT induzierten LTβ-R-Signalgebung assoziiert ist, da beim Modulieren der TNF-R-Aktivität keine ähnlichen Phänotypen festgestellt werden konnten. Die Fähigkeit, den LTβ-R-Stoffwechselweg selektiv oder teilweise zu blockieren, kann somit möglicherweise in der Behandlung einer abnormen Entwicklung von lymphartigen Strukturen eingesetzt werden, die durch eine chronische Entzündung zustande kommt, welche mit einer Fehl- oder Überexpression der Signalgebung durch den LTβ-R-Stoffwechselweg assoziiert ist.
Antikörper sind kritische Mediatoren von Immunantworten auf pathologische Agenzien. Somit kann es sein, dass die absolute Hemmung von Antikörperantworten unter bestimmten Umständen nicht wünschenswert ist. Z.B. sind Antikörper erforderlich, um eine Widerstandsfähigkeit gegenüber Infektionen durch extrazelluläre Bakterien wie Pneumokokken und Hämophilus zu vermitteln.
Die Fähigkeit, den Spiegel der erzeugten Antikörper durch Blockieren der LTβ-R-Signalgebung zu beeinflussen, ist möglicherweise wichtig, um die günstigen Ergebnisse, die durch Behandlungen mit den LTβ-R-blockierenden Wirkstoffen erreicht werden können, zu maximieren.
Die therapeutischen Verfahren umfassen eine selektive Hemmung von Antworten, die im Ganzen oder zum Teil vom LTβ-Stoffwechselweg abhängig sind. Die besonderen therapeutischen Anwendungen hängen von dem relevanten ätiologischen Mechanismus entweder des zu hemmenden Prozesses oder des medizinisch wünschenswerten Prozesses, der gefördert werden soll, ab, wie für den Fachmann ersichtlich ist. Somit umfassen die Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines blockierenden Wirkstoffs des LTβ-R. Bei dem Protein, das in diesen Verfahren eingesetzt wird, kann es sich entweder um vollständige Proteine, Fragmente des Proteins oder Fusionsfragmente handeln. Die Verfahren können die Verabreichung eines löslichen Lymphotoxin-β-Rezeptors umfassen. Die blockierenden Wirkstoffe können gleichzeitig mit einer therapeutisch wirksamen Menge einer zweiten Verbindung, die eine medizinisch wünschenswerte Wirkung ausübt, verabreicht werden.
Zusammensetzungen können gemäß der herkömmlichen Praxis formuliert werden, etwa können sie in einem Trägervehikel hergestellt werden. Der Begriff pharmazeutisch verträglicher Träger bezieht sich auf einen oder mehrere organische oder anorganische Bestandteile, natürliche oder synthetische, welche die Verabreichung der blockierenden Wirkstoffe der Erfindung an einen Patienten möglicherweise erleichtern. Geeignete Träger sind dem Fachmann bekannt.
Jede beliebige der Zusammensetzungen kann in einer beliebigen Art und Weise verabreicht werden, die medizinisch verträglich ist. Dies kann Injektionen durch parenterale Routen wie intravenöse, intravaskuläre, intraarterielle, subkutane, intramuskuläre, intratumorale, intraperitoneale, intraventriculäre, intraepidurale oder andere Routen sowie eine orale, nasale, ophthalmische, rektale oder topische Verabreichung einschließen. Insbesondere ist in der Erfindung auch eine langanhaltende Freisetzungsverabreichung eingeschlossen, wie mittels Depotinjektionen oder Implantaten. Außerdem kann eine lokalisierte Freisetzung wünschenswert sein. Der Fachmann kann Verabreichungsarten einfach definieren.
Die blockierenden Wirkstoffe des LT-Stoffwechselwegs, die in der beanspruchten Erfindung nützlich sind, sollen funktionelle Derivate des löslichen LT-β-R einschließen. Funktionelle Derivate weisen eine Ligandenbindungsdomäne auf, die selektiv an einen Oberflächen-LT-Liganden binden kann. Ein Fragment eines Moleküls wie eines der Antigene soll sich auf eine beliebige Polypeptid-Untergruppe des Moleküls beziehen. Eine Variante eines solchen Moleküls soll sich auf ein natürlich vorkommendes Molekül beziehen, das dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon im Wesentlichen ähnlich ist. Ein Analogon des Moleküls bezieht sich auf ein nicht-natürliches Molekül, das entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon im Wesentlichen ähnlich ist.
Varianten der blockierenden Wirkstoffe unterscheiden sich von natürlich vorkommenden Wirkstoffen in der Aminosäuresequenz oder in einer Art und Weise, die nicht die Sequenz umfasst, oder in beiden. Varianten in der Aminosäuresequenz werden hergestellt, indem eine oder mehrere Aminosäuren in den natürlich vorkommenden Molekülen durch eine andere natürliche Aminosäure, ein Aminosäurederivat oder eine nicht-native Aminosäure substituiert wird. Besonders bevorzugte Varianten schließen die natürlich vorkommenden Proteine oder biologisch aktive Fragmente der natürlich vorkommenden Proteine ein, deren Sequenzen sich von der Wildtypsequenz durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden. Solche Substitutionen sind dem Fachmann bekannt und haben typischerweise einen minimalen Einfluss auf die Sekundärstruktur und die hydrophobe Natur der blockierenden Wirkstoffe.
Auch Varianten mit Aminosäuresubstitutionen, die weniger konservativ sind, können zu gewünschten Derivaten führen, z.B. indem sie Änderungen in der Ladung, der Konformation und anderen biologischen Eigenschaften bewirken. Solche Substitutionen würden z.B. eine Substitution von hydrophilen Resten für einen hydrophoben Rest, eine Substitution eines Cysteinrests oder eines Prolinrests für einen anderen Rest, eine Substitution eines Rests, der eine kleine Seitenkette aufweist, für einen Rest, der eine voluminöse Seitenkette aufweist, oder eine Substitution eines Rests, der eine positive Nettoladung besitzt, für einen Rest, der eine negative Nettoladung besitzt, einschließen. Wenn das Ergebnis einer bestimmten Substitution nicht mit Sicherheit vorausgesagt werden kann, können die Derivate einfach gemäß den hier offenbarten Verfahren getestet werden, um das Vorliegen oder die Abwesenheit der gewünschten Merkmale zu bestimmen.
Im Folgenden sind Beispiele dargestellt, welche die löslichen LTβ-Rezeptoren, anti-LT-Ligand- und anti-LTβ-R-Antikörper und die Verfahren, die zu ihrer Charakterisierung verwendet wurden, erläutern. Diese Beispiele sollten nicht als Einschränkung aufgefasst werden: die Beispiele sind für Zwecke der Erläuterung eingeschlossen, und die vorliegende Erfindung ist nur durch die Patentansprüche eingeschränkt.
Beispiel 1
Herstellung von löslichen menschlichen LTβ-Rezeptoren als Immunglobulin-Fc-Fusionsproteine
Die Sequenz eines menschlichen cDNA-Clons, isoliert aus einer Bank von menschlichen 12p-transkribierten Sequenzen, hergeleitet von einem Körperzellhybrid (Baens et al., Genomics 16, S. 214-218 (1993)), wurde in GenBank eingegeben und später als die Sequenz identifiziert, die den menschlichen LTβ-R codiert. Die Sequenz dieses vollständigen menschlichen LTβ-R-cDNA-Clons war seit 1992 als GenBank Eintrag L04270 verfügbar.
Die extrazelluläre Domäne von LTβ-R bis zur Transmembranregion (1) wurde aus einem cDNA-Clon durch PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert, welche NotI- und SalI-Restriktionsenzymstellen an den 5'- bzw. 3'-Enden einbauten (Browning et al., J. Immunol. 154, S. 33-46 (1995)). Das amplifizierte Produkt wurde mit NotI und SalI gespalten, gereinigt und zusammen mit einem SalI-NotI-Fragment, welches die Fc-Region des menschlichen IgG1 codiert, in den NotI-linearisierten Vektor pMDR901 ligiert. Der resultierende Vektor enthielt das Dihydrofolat- Reductase-Gen und das LTβ-R-Ig-Fusionsprotein, die durch getrennte Promotoren gesteuert wurden.
Der Vektor wurde durch Elektroporation in CHO-dhfr^–-Zellen eingebracht, und Methotrexat-resistente Clone wurden anhand von Standardverfahren isoliert. Das LTβ-R-Ig wurde in das Medium ausgeschieden, und ein ELISA-Test wurde eingesetzt, um Zelllinien zu selektieren, welche die höchsten Spiegel des Rezeptor-Fusionsproteins produzierten. Eine viel-produzierende Zelllinie wurde so gezüchtet, dass große Zahlen vorlagen, und das konditionierte Medium wurde gewonnen. Das reine LTβ-Rezeptor-Fusionsprotein wurde durch Protein A Sepharose Fast Flow-Affinitätschromatographie (Pharmacia) isoliert.
Beispiel 2
Herstellung von löslichen murinen LTβ-Rezeptoren als Immunblobulin-Fusionsproteine
Ein vollständiger cDNA-Clon des murinen LTβ-R wurde hergestellt, indem 5'-NotI/ApaLI- und 3'-ApaLI/NotI-Fragmente aus zwei partiellen cDNA-Isolaten in die NotI-Stelle von pCDNA3 (InVitrogen, San Diego, CA) ligiert wurden. Die Sequenz dieses cDNA-Clons ist als GenBank-Eintrag U29173 zugänglich. Keine Unterschiede in der codierenden Sequenz wurden festgestellt, wenn sie mit einem anderen Sequenz-Eintrag für den murinen LTβ-R, der in GenBank-Eintrag L38423 zu finden ist, verglichen wurde.
Ein Fusionsprotein aus dem löslichen murinen LTβ-R und menschlichem IgG1 wurde durch PCR-Amplifikation des vollständigen mLTβ-R-cDNA-Clons als Matrize und unter Verwendung der Primer 5'-AACTGCAGCGGCCGCCATGCGCCTGCCC-3' und 5'-GACTTTGTCGACCATTGCTCCTGGCTCTGGGGG-3' hergestellt. Das amplifizierte Produkt wurde gereinigt und mit NotI und SalI gespalten und sodann mit einem menschlichen SalI/NotI-IgG1-Fc-Fragment in den NotI-linarisierten und Phosphatase-behandelten SAB132 ligiert, wodurch JLB122 gebildet wurde. Für eine stabile Expression wurde die NotI-Kassette, enthaltend das murine LTβ-R-Ig-Fragment, in die NotI-Stelle von pMDR901 überführt, wodurch PSH001 gebildet wurde, und anschließend wurde der Vektor in CHO-Zellen, wie beschrieben, transfiziert (Browning et al., J. Immunol. 154, S. 33-46 (1995)). Zellclone, die murines LTβ-R-Ig sekretierten, wurden durch eine ELISA-Analyse identifiziert. Das gereinigte Rezeptor-Fusionsprotein wurde aus CHO-Zellüberständen durch Protein A Sepharose Fast Flow-Chromatographie (Pharmacia) isoliert und wird in den folgenden Beispielen eingesetzt.
Beispiel 3
Immunhistochemische Analyse von Milzen nach mehreren Injektionen von LTβ-R-Ig an Mäuse
Vier bis fünf Wochen alte Mäuse erhielten sechs Injektionen, eine pro Woche, von LTβ-R-Ig oder LFA-3-Ig (100 μg, i.p.) und wurden am Tag der sechsten Fusionsprotein-Injektion mit SRBC immunisiert. Danach erhielten die Mäuse eine weitere Injektion von LTβ-R-Ig oder LFA-3-Ig am Tag vier nach der Provokation mit SRBC. Die Tiere wurden am Tag zehn nach der Provokation mit SRBC getötet, und die Organe wurden für die Analyse der Struktur entnommen. Die linke Spalte von 2 zeigt Milzschnitte aus Tieren, die mit LFA-3-Ig behandelt worden waren (A, C, E, G, I), und die rechte Spalte aus Tieren, die mit LTβ-R-Ig behandelt worden waren (B, D, F, H, J). Aceton-fixierte, gefrorene Milzschnitte wurden doppelt angefärbt mit biotinylierten anti-Maus-B220-markierten und anti-Maus-CD4-Antikörpern (A und B), gefolgt von einer entsprechenden zweiten Färbung mit alkalische-Phosphatase-markiertem Streptavidin (purpurfarben-blau, dunkle Färbung) bzw. mit Meerrettich-Peroxidase-markiertem Maus-anti-Ratte-Ig (hellbraune Färbung). Ein weiterer Satz von gefrorenen Schnitten wurde mit den Antikörpern ER-TR-9 (zum Nachweisen von MZM, C und D), MOMA-1 (zum Nachweisen von metallophilen Makrophagen, E und F), MECA-367 (spezifisch für MAdCAM-1, G und H) und ER-TR-7 (zum Anfärben von retikulären Fibroblasten, I und J) gefärbt, worauf eine zweite Färbung mit einem Meerrettich-Peroxidase-markierten Maus-anti-Ratte-Ig (braune Färbung) folgte. Diese Bilder stellen eine repräsentative Färbung von Schnitten aus mindestens sechs Tieren dar. Vergrößerung 10×.
Beispiel 4
Effekt von LTβ-R-Ig und anti-CD40-Ligand auf die GC-Bildung und FDC-Färbung
Die Tiere wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, mit LTβ-R-Ig oder LFA-3-Ig behandelt. Eine weitere Gruppe von Tieren wurde am Tag -1, Tag 1 und Tag 3 mit MR1 (anti-Maus-CD40-Ligand, 250 μg pro Injektion, intraperitoneal) behandelt und erhielt am Tag 0 SRBC, sodann wurden die Tiere am Tag 10 getötet. Aceton-fixierte Milzschnitte aus Tieren, die mit LFA-3-Ig (3, linke Spalte, A und D) oder mit LTβ-R-Ig (mittlere Spalte, B und E) oder mit MR1 (rechte Spalte, C und F) behandelt worden waren, wurden mit Biotin-markiertem Erdnuss-Agglutinin (PNA, obere Reihe, A, B und C) oder mit FDC-M1 (untere Reihe, D, E und F) gefärbt, worauf eine zweite Färbung mit einem Meerrettich-Peroxidase-markierten Streptavidin bzw. Meerrettich-Peroxidase-markierten Maus-anti-Ratte-Ig (braune Färbung) folgte. Die PNA-Färbung der Randzone ist in A und C durch einen Pfeil bezeichnet. Die GC-Bildung ist in A durch ein weißes Sternchen gekennzeichnet. Die Färbung auf FDC ist in D und F durch einen schwarzen Pfeil angegeben. Diese Bilder stellen repräsentative Färbungen von Schnitten aus mindestens vier Tieren dar. Vergrößerung 10×.
Beispiel 5
Addressin-Expression in LN von Mäusen, die in utero und kontinuierlich nach der Geburt mit LTβ-R-Ig behandelt worden waren
In diesen Experimenten wurden die Nachkommen von zeitlich aufeinander abgestimmten trächtigen Balb/c-Mäusen eingesetzt, die an den Tagen 14 und 17 der Trächtigkeit Injektionen mit 200 μg Rezeptor-Ig-Proteinen erhielten. Nach der Geburt erhielten die Nachkommen einmal pro Woche i.p.-Injektionen mit 100 μg LTβ-R-Ig, TNF-R55-Ig oder LFA-3-Ig. Die Fusionsprotein-Spiegel blieben das ganze Leben lang bei 10 μg/ml oder darüber, wie durch ELISA bestimmt wurde (Daten nicht dargestellt). 4: Abbildungen A, B, G, H: Färbung von Lymphknoten aus Mäusen, die mit LTβ-R-Ig behandelt worden waren. Abbildungen C, D: Färbung von Lymphknoten aus Mäusen, die mit LFA-3-Ig behandelt worden waren; E, F: Färbung von Lymphknoten aus Mäusen, die mit TNF-R55-Ig behandelt worden waren. Die Abbildungen A, C, E, G sind Mesenteriallymphknoten, gefärbt mit dem Antikörper MECA367, um das Schleimhaut-Addressin MAdCAM-1 nachzuweisen. Die Abbildungen B, D, F, H sind periphere (brachiale) Lymphknoten, gefärbt mit dem Antikörper MECA79, der für periphere LN-Addressine (PNAds) spezifisch ist. Die Abbildungen G, H sind Lymphknoten aus sechs Wochen alten Mäusen, die nur in utero LTβ-R-Ig ausgesetzt worden waren. Alle Bilder sind 50×-Vergrößerungen.
Beispiel 6
Positionierung von Lymphocyten und Expression von Makrophagenmarkern in LN von Mäusen, die in utero und kontinuierlich nach der Geburt mit LTβ-R-Ig behandelt worden waren
Die Mäuse wurden in utero und kontinuierlich nach der Geburt, wie für Beispiel 5 beschrieben, mit LTβ-R-Ig, TNF-R55-Ig oder LFA-3-Ig behandelt. Danach wurden LN-Schnitte mit Antikörpern gefärbt, die für die durch Makrophagen exprimierte Marker spezifisch waren, oder sie wurden mit mAk gefärbt, die für den B-Zell-Marker B220 und den T-Zell-Marker CD4 spezifisch waren. Anhand einer Bildanalyse wurden die überlappenden Bereiche von T- und B-Zell-Zonen identifiziert. 5: Die Abbildungen A, D, G sind B220/CD4-Färbung von LN aus LTβ-R-Ig-, LFA-3-Ig- bzw. TNF-R55-Ig-behandelten Mäusen. Die Fluoreszenzbilder wurden unter Verwendung einer Bildanalyse-Software analysiert. Die Abbildungen B, E, H sind Färbungen auf Sialoadhesin, und die Abbildungen C, F, I sind Färbungen auf MOMA-1.
Beispiel 7
Wirkung einer LTβ-R-Ig-Behandlung auf die Antikörperantwort auf SRBC
Balb/c-Mäuse erhielten Injektionen mit entweder LTβ-R-Ig, menschlichem Ig oder PBS wie folgt: 6A: Die Mäuse erhielten sechs Injektionen, wie für 2, Beispiel 3, beschrieben. Von den Tieren wurde am Tag 7 (schwarze Balken) und am Tag 14 (gestreifte Balken) nach der SRBC-Immunisierung Blut abgenommen. 6B: Die Tiere erhielten die Fusionsproteine am Tag -7 und am Tag 0. SRBC wurden am Tag 0 verabreicht, und von den Tieren wurde am Tag 7 (schwarze Balken), am Tag 14 (gestreifte Balken) und am Tag 30 (weiße Balken) Blut abgenommen. 6C: Die Tiere erhielten Fusionsproteine einmal am Tag 0, zur gleichen Zeit wie die SRBC-Immunsierung. Das Blut wurde am Tag 7 (schwarze Balken), am Tag 14 (gestreifte Balken) und am Tag 34 (graue Balken) entnommen.
Der Titer von SRBC-spezifischem IgM und IgG wurde bestimmt, indem die Seren in Hämagglutinin-Tests analysiert wurden. Der Titer ist als der reziproke Wert der letzten Serumverdünnung definiert, für welche eine Hämagglutination nachgewiesen wird, und er ist auf einer logarithmischer Skala zur Basis 2 dargestellt (1 = Verdünnung von 1/15 der Seren). Die Ergebnisse sind als Mittelwert von vier verschiedenen Tieren pro Gruppe mit Standardabweichungen angegeben.

Claims

Verwendung eines LT-β-R-blockierenden Wirkstoffs, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus löslichem Lymphotoxin-β-R mit einer Ligandenbindungsdomäne, die selektiv an einen Oberflächen-LT-Liganden binden kann, einem Antikörper, der gegen LT-β-R gerichtet ist, und einem Antikörper, der gegen einen Oberflächen-LT-Liganden gerichtet ist, oder wobei der LT-β-R-blockierende Wirkstoff einen löslichen Lymphotoxin-β-R mit einer Ligandenbindungsdomäne umfasst, die selektiv an einen Oberflächen-LT-Liganden binden kann, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Antikörper-vermittelten Autoimmunerkrankung in einem Tier, wobei der LT-β-R-blockierende Wirkstoff die Interaktion zwischen LT-β und seinem Rezeptor hemmt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Adjuvans umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Tier ein Säuger ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der LT-β-R-blockierende Wirkstoff einen monoclonalen Antikörper umfasst, der gegen einen Oberflächen-LT-Liganden oder eine Untereinheit davon gerichtet ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Oberflächen-LT-Ligand ein muriner Oberflächen-LT-Ligand ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der lösliche Lymphotoxin-β-Rezeptor (LTβ-R) die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Ligandenbindungsdomäne die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz oder ein funktionelles Fragment davon umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der lösliche LT-β-R zusätzlich eine oder mehrere heterologe Proteindomäne(n) umfasst.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die heterologe Proteindomäne ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Immunglobulinen, Serumalbumin, Lipoproteinen, Apolipoproteinen und Transferrin.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der lösliche Lymphotoxin-β-R eine menschliche Immunglobulin-Fc-Domäne umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 6, wobei der LT-β-R-blockierende Wirkstoff einen monoclonalen Antikörper umfasst, der gegen den LT-β-Rezeptor gerichtet ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Arzneimittel in einer Menge verabreicht werden soll, die ausreicht, um LT-β-Rezeptor-positive Zellen für etwa 1 bis etwa 14 Tage zu beschichten.
Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, wobei der LT-β-R-blockierende Wirkstoff den gegen menschlichen LT-β-R gerichteten Antikörper BDA8 (ATCC-Hinterlegungs-Nr.: HB 11798) umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Autoimmunerkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Myasthenia gravis, autoimmuner hämolytischer Anämie, idiophatischer thrombozytopenischer Purpura (ITP), systemischem Lupus erythematodes (SLE), Wegener-Granulomatose, Polyarteriitis nodosa und schnell fortschreitender sichelförmiger Glomerulonephritis.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Autoimmunerkrankung eine chronische entzündliche Erkrankung ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die chronische entzündliche Erkrankung die Chagas-Krankheit oder Basedowsche Krankheit ist.
Verwendung eines löslichen Lymphotoxin-beta-Rezeptors (LTβR), umfassend eine Ligandenbindungsdomäne mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz oder ein funktionelles Fragment davon, die/das mit einer menschlichen IgG1-Fc-Domäne fusioniert ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Antikörper-vermittelten Autoimmunerkrankung in einem Menschen.
Verwendung eines löslichen Lymphotoxin-beta-Rezeptors (LTβR), umfassend eine Ligandenbindungsdomäne mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz oder ein funktionelles Fragment davon, die/das mit einer menschlichen IgG1-Fc-Domäne verbunden ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von systemischem Lupus erythematodes (SLE) in einem Menschen.