EA002983B1 - Способ изменения гуморального иммунного ответа с помощью агентов, блокирующих рецепторы бета-лимфотоксина - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способам изменения гуморального иммунного ответа на основе композиций, включающих в себя "агенты, блокирующие рецептор β-лимфотоксина", которые блокируют передачу сигналов рецептора β-лимфотоксина и могут быть использованы для лечения иммунологических заболеваний.

Description

Данное изобретение относится к способам изменения гуморального иммунного ответа на основе композиций, включающих в себя агенты, блокирующие рецепторы β-лимфотоксина, которые блокируют сигнал рецепторов βлимфотоксина. Агенты, блокирующие рецепторы β-лимфотоксина, могут быть использованы для лечения иммунологических заболеваний, более конкретно для ингибирования опосредованных антителами иммунных ответов, регулирующих экспрессию адрессинов и направленную миграцию клеток, а также для воздействия на дифференцировку фолликулярных дендритных клеток. Данное изобретение относится к растворимым формам внеклеточного домена рецептора β-лимфотоксина и к антителам против рецептора β-лимфотоксина или его лиганда и поверхностного лимфотоксина, действующим как агенты, блокирующие рецептор βлимфотоксина.

Предпосылки изобретения

Существует два вида приобретенного иммунитета, которые, обеспечивая достижение совместной цели по устранению антигена, опосредованы различными частями иммунной системы, оказывающими различное действие. Один вид приобретенного иммунного ответа, гуморальный иммунитет, опосредован, главным образом, В-клетками и циркулирующими антителами. Другой вид, называемый клеточным или клеточно-опосредованным иммунитетом, опосредован Т-клетками, синтезирующими и вырабатывающими цитокины, действующие на другие клетки.

Активация и дифференцировка В-клеток в ответ на большую часть антигенов требует, чтобы (1) В-клетки получали сигнал антигена через свой антиген-специфичный рецептор, мембранный 1д, и (2) чтобы В-клетки получали контактно-зависимые и независимые сигналы от активированных Т-клеток. Контактно-зависимый совместимый стимулирующий сигнал возникает в результате лигирования рецептора СЭ40 на Вклетках с лигандом СЭ40, экспрессируемым на активированных Т-клетках-хелперах. (Ьатаи е! а1., Стй. Веу. 1ттипо1., 16, рр. 59-108 (1996); У ап Коо1еп апй Вапсйегеаи, Αάν. 1ттипо1., 61, рр. 1-77 (1969)). Контактная независимая передача сигналов опосредована цитокинами, синтезируемыми и вырабатываемыми активированными Т-клетками. Эти контактно-зависимые и независимые сигналы совместно направляют Вклетки по пути дифференцировки в (1) В-клетки памяти, готовые обеспечить более быстрый ответ после вторичного воздействия антигена, или (2) в плазматические клетки, секретирующие антитела. Плазматические клетки, которые представляют собой конечную стадию дифференцировки В-клеток, синтезируют и секретируют антитела.

Т-клетки-хелперы (Тй) играют несколько важных ролей в иммунной системе. Было установлено, что цитокины, вырабатываемые Тклетками-хелперами при получении иммунного стимула, обеспечивают последующую активацию иммунных реакций по тому или иному эффекторному пути. Т-клетки-хелперы активируются в результате взаимодействия их антигенспецифического рецептора с антиген представляющими клетками (АРС), несущими на своей поверхности пептидные фрагменты обработанного чужеродного антигена, связанного с молекулами МНС (главный комплекс гистосовместимости) класса II. Активированные Т-клеткихелперы в свою очередь секретируют цитокины (лимфокины), активирующие соответствующие иммунные эффекторные механизмы.

В соответствии с типом секретируемых цитокинов Т-клетки-хелперы могут быть разделены на три подгруппы: Тй0, Тй1 и Тй2. (Ртйей е! а1., Апп. Веν. 1ттипо1., 11, рр. 29-48 (1993). У мышей нестимулированные наивные Тклетки-хелперы продуцируют 1Ь-2. Краткое стимулирование Т-клеток-хелперов приводит к образованию клеток-предшественников Тй0, вырабатывающих широкий круг цитокинов, включая ΙΡΝ-α, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-5 и Ш-10. Постоянно стимулируемые клетки Тй0 разделяют на два типа клеток: либо Тй1-клетки, либо Тй2клетки, при этом меняется экспрессия цитокинов. Определенные цитокины, например 1Ь-3, ОМ-С8Р и ΊΝΡ, выделяются как клетками Тй1 так и Тй2. Другие цитокины вырабатываются исключительно одной из подгрупп Т-клетокхелперов. (Вотадпаш е! а1., Апп. Веν. 1ттипо1., 12, рр. 227-257 (1994) . Клетки Тй1 вырабатывают БТа 1Ь-2 и ΙΡΝ-γ, активирующие макрофаги и воспалительные реакции, связанные с клеточным иммунитетом и сопротивляемостью внутриклеточным инфекциям.

Клетки Тй2 вырабатывают цитокины 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6 и Ш-10, увеличивающие образование эозинофильных и тучных клеток и способствующие размножению и созреванию В-клеток. (Нохатй е! а1., Т-се11-йегШей суЮкшез апй 1йе1т гесерЮгз, Рипйатеп!а1 1ттипо1оду, 3й ей., Ваνеп Ргезз, №х Уогк (1993)). Клетки Тй2 также принимают участие в выработке В-клеток памяти, соматической мутации и, таким образом, в аффинном созревании, а также в регуляции переключения изотипа иммуноглобулина йе ηоνо. Например, цитокин 1Ь-4 клеток Тй2 переключают активированные В-клетки на изотип 1дС1, при этом подавляя другие изотипы. 1Ь-4 также стимулирует перепроизводство 1дЕ в реакциях гиперчувствительности I типа. Цитокин 1Ь-5 клеток Тй2 индуцирует изотип 1дА, важный для иммунитета слизистой.

Вторичные лимфоидные ткани, такие как лимфатические узлы (ЬЦ), лимфоидные ткани селезенки и слизистой, накапливают и концен трируют посторонние вещества с высокой эффективностью и являются основными сайтами активации и дифференцировки Т- и Влимфоцитов, вызванными антигенами. Эти процессы зависят от разнообразия и организации клеток в этих тканях, обеспечивая конструкцию для многих аспектов гуморальных иммунных ответов, таких как взаимодействие Т/В-клеток, образование зародышевых центров, аффинное созревание, переключение класса иммуноглобулина и направление миграции клеток. (К1ет, 1., 1ттипо1оду. 1о1т ^йеу апб Зопк (1982)). Молекулярные механизмы, ответственные за развитие, структуру и функции периферических лимфоидных тканей, полностью не выявлены.

Несмотря на то, что общая структура вторичных лимфоидных тканей существенно отличается и имеет разновидности среди видов млекопитающих, тонкая структура этих вторичных лимфоидных тканей имеет определенные особенности, такие, например, как (1) доступность антигена, (2) структурные особенности, обеспечивающие непрерывный контакт антигена с лимфоцитами, (3) зоны, богатые Т-клетками, (4) фолликулы, богатые В-клетками, (5) сайты типа маргинальных зон, (6) специализированные эндотелиальные клетки, и (7) сайты по выработке антител, как подробно описано ниже.

Система вторичных лимфоидных тканей доступна антигену. Например, антиген достигает селезенки через синусоидальный ток крови, лимфатических узлов - через афферентные лимфатические сосуды, и транспортируется через специализированный эпителий в слизистую лимфоидную ткань.

Вторичные лимфоидные ткани у разных видов также обладают определенными структурными особенностями, например, фолликулярные дендритные клетки и интердигитальные клетки, обеспечивающие непрерывное присутствие антигена на участках тканей, богатых лимфоцитами.

Другой общей чертой является наличие областей, богатых Т-клетками, окруженных Вклетками. Области, богатые Т-клетками, включают, например, периартериолярные лимфоидные оболочки в белой пульпе селезенки, а также паракорковый участок лимфатических узлов, содержащий большое количество рециркулирующих Т-клеток и интердигитальных клеток, которые, в свою очередь, являются вспомогательными клетками для Т- и В-клеток.

Кроме того, лимфоидные ткани обычно имеют первичные и вторичные фолликулы, богатые В-клетками, в белой пульпе селезенки и в коре лимфатических узлов. Вторичные фолликулы в таких лимфоидных тканях, обычно называемые зародышевыми центрами, имеют плотную сеть фолликулярных дендритных клеток для захвата и представления антигенов.

Области типа маргинальных зон также отмечаются как определенные гистологические области в селезенке мышей и более диффузные сайты во вторичных лимфоидных органах человека. Эти области, в основном, состоят из макрофагов маргинальных зон, металлофильных макрофагов, В-клеток маргинальных зон и ретикулярных клеток, но также могут включать Тклетки и дендритные клетки (Кгаа1, 1пС Вес. Су1о1.. 132, рр. 31-74 (1992). Выход тока артериальной крови в области маргинальных зон дает антигенам прямой доступ к этим клеткам и обеспечивает клеточные реакции с антигенами в этом сайте. (Кгаа1 е! а1., ΙπΙ. Веу. Су!о1., 132, рр. 31-74 (1992)). Присутствие макрофагов маргинальных зон также необходимо для оптимальной направленной миграции В-клеток в белой пульпе селезенки. (Кгаа1, 1992; Кгаа1 е! а1., 1ттипо1оду, 68, рр. 227-232 (1989)).

Обычно лимфоциты крови попадают во вторичные лимфоидные ткани, пересекая специализированный эндотелий, например эндотелиальную выстилку венул лимфатических узлов (высокие эндотелиальные венулы) и эндотелиальную выстилку синусоидов крови селезенки в структурах, подобных маргинальной зоне. Этот эндотелий экспрессирует адгезивные молекулы и адрессины, участвующие в направленной миграции клеток к вторичным лимфоидным тканям. Например, периферические адрессины лимфатических узлов (ΡΝΑ6) отличаются от адрессина лимфатических узлов слизистой (МАбСАМ-1), принимающего участие в направленной миграции лимфоцитов к слизистым лимфоидным тканям, включая такие ткани, как мезентериальные лимфатические узлы, пейеровы бляшки и 1атта ргорпа.

Не все адрессины определены четко, например адрессин для хоминга лимфоцитов в селезенке остается невыясненным. Физиологическая роль этих адрессинов включает в себя усиление рекруитмента соответствующих наборов антиген-специфических лимфоцитов в иммунном ответе и последующее распространение иммунного ответа по всему организму.

Наконец, плазматические клетки, вырабатывающие антитела, обнаруживаются в различных местах, откуда В-клетки-предшественники активируются антигеном. Например, антитело, выработанное плазматическими клетками в красной пульпе селезенки, получается, главным образом, в результате активации В-клеток в Тклеточных зонах, а плазматические клетки в мозговом веществе лимфатических узлов получаются из В-клеток, активируемых в Тклеточных зонах этого же узла. Подобным образом, антитела, вырабатываемые плазматическими клетками в костном мозгу, производятся Вклетками, активированными в селезенке и лимфатическом узле, а плазматические клетки в 1атта ргорпа кишечника главным образом получаются из В-клеток, активированных в лимфоидной ткани мезентериальных лимфатических узлов или кишечника.

См., например, 1СМ МасЬеппап, Тйе 81гис1иге апб Рипсбоп о£ 8есопбагу Ьутрйо1б Т1ккиек 1п Сйшса1 Акрес!к о£ 1ттипо1оду, 51й ебйюп, ебк. РЭ. Ьасйтап, 8ίτ Ό.Κ. Ре!егк, Р.8. Кокеп. М.1. Аа1рог1. В1аск\\е11 8с1епййс РиЬйса!юпк, рр. 13-30 (1993).

В целом, клеточные/гистологические явления, лежащие в основе гуморальной иммунной реакции на Т-зависимые антигены, являются следующими (Тое11пег е! а1., 1. Ехр. Меб., 183, рр. 2303-2312 (1996)).

В индуктивной фазе наивные В- и Тклетки активируются и начинают принимать участие в иммунном ответе непосредственно после попадания антигена в организм. Например, в селезенке в течение 12 ч после иммунизации для выработки вторичного ответа Вклетки памяти встречают выработанный кровью антиген в маргинальной зоне и покидают маргинальную зону, поступая в Т-клеточные зоны. В-клетки могут быть обнаружены в Тклеточных зонах в течение 24 ч. Транскрипты переключения иммуноглобулина могут быть обнаружены в течение 12 ч после вторичного появления антигена, указывая, таким образом, на то, что взаимодействие Т-В клетки уже состоялось. Затем В-клетки мигрируют к зоне выхода и красной пульпе, где они пролиферируют, образуя очаги В-лимфобластов и дифференцируют в клетки плазмы. В-клетки также продолжают пролиферировать в Т-клеточной зоне, богатой интердигитальными клетками. В течение 4 дней после иммунизации и после пролиферации в зародышевых центрах начинается выработка В-клеток памяти. При первичном ответе хорошо развитые зародышевые центры проявляются на 10-й день и достигают максимального размера на 14-й день после иммунизации.

Пролиферация Т-клеток в Т-клеточных зонах становится очевидной через 48-72 ч, достигая своего пика на 7-й день после иммунизации. Такая пролиферация Т-клеток приводит к зависимой от Т-клеток активации В-клеток. Уровень пролиферации в Т-клеточной зоне снижается по мере образования зародышевых центров. Пролиферация Т-клеток также происходит в зародышевых центрах, где центроциты (В-клетки) в темной зоне забирают антиген у интердигитальных клеток и представляют его Т-клеткам в светлой зоне.

Антиген, зависимый от Т-клеток, может активировать В-клетки маргинальной зоны, вновь образованные наивные В-клетки и рециркулирующие лимфоциты, привлеченные и удерживаемые во вторичных лимфоидных органах адрессинами и молекулами адгезии. Наивные В-клетки проявляют такую же кинетику продвижения к Т-клеточной зоне и т.д., как и активированные В-клетки.

Фаза становления ответов, зависимых от Т-клеток

Фаза становления зависимых от Т-клеток ответов поддерживается непрерывной активацией В-клеток памяти в фолликулах вторичных лимфоидных органов. На этой стадии происходит очень небольшой рекруитмент наивных Вклеток, а ответ, в основном, обусловлен антигеном, удерживаемым на фолликулярной дендритной клетке. Для оптимальной генерации памяти, переключения изотипов, соматической мутации и, таким образом, аффинного созревания иммуноглобулина необходимы зародышевые центры.

Сумма таких ответов лимфоцитов приводит к образованию антител, способных циркулировать в организме по различным путям, например антитела покидают селезенку через кровь, а поступают в лимфатические узлы через эфферентные лимфатические протоки. Таким образом, антитела контактируют и непосредственно связываются с инвазивным патогеном. Такое явление распознавания включает каскад иммунных эффекторных механизмов, включая активацию комплементного каскада и клеточные реакции для обеспечения защиты хозяина от патогена.

Антитела также играют роль в некоторых патологических реакциях, таких как реакции гиперчувствительности - несвойственные или непропорциональные иммунные реакции, возникающие при контакте с ранее встречаемым антигеном. Различают 4 типа гиперчувствительности.

Тип I гиперчувствительности немедленного типа включает в себя активацию аллерген-индуцированных клеток Тй2 и высвобождение цитокинов Тй2. Цитокин 1Ь-4 Тй2-клеток стимулирует В-клетки к переключению изотипа для продукции 1дЕ, который, в свою очередь, активирует тучные клетки, в результате чего происходят острые воспалительные реакции, ведущие к экземе, астме и риниту.

Типы II и III гиперчувствительности вызываются антителами !дС и !§М против антигенов клеточной поверхности или специфичных тканевых антигенов (тип II), либо растворимых сывороточных антигенов с образованием циркулирующих иммунных комплексов (тип III).

Тип IV, гиперчувствительность замедленного типа, представляет собой ответ, опосредованный Тй1-клетками, и может передаваться от одной мыши другой путем переноса клеток Тй1, причем переноса сыворотки недостаточно. Эта особенность отличает IV тип гиперчувствительности замедленного типа от остальных трех типов гиперчувствительности, требующих гуморальных иммунных ответов, вызываемых первично антителами, которые могут быть перенесены в состав сыворотки, свободной от клеток. (Кой! е! а1., Iттиηо1оду, рр. 19.1-22.12 (МокЬу-Уеаг Воок Еигоре Ь!б, 3б еб., 1993)).

Патологические гуморальные иммунные реакции связаны с некоторыми органоспецифическими и системными аутоиммунными состояниями, такими как системная красная волчанка, гранулематоз Вегенера, нодозный полиартрит (ΡΑΝ), быстро прогрессирующий серповидный гломерулонефрит и идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, а также хронические воспалительные заболевания, такие как болезнь Сгауек' и Сйадак'. Гуморальные иммунные ответы также могут возникнуть при пересадке ткани и отторжении трансплантированных органов.

В настоящее время лечение таких иммунологических состояний, в целом, включает иммуномодулирующие и иммунодепрессивные средства. В настоящее время используются три основных иммунодепрессивных средства: стероиды, циклофосфамид и азатиоприн.

Стероиды представляют собой плейотропные противовоспалительные средства, подавляющие активированные макрофаги и ингибирующие активность антиген-представляющих клеток, снимая многие виды патологического действия Т-клеток. Циклофосфамид, алкилирующий агент, вызывает гибель клеток, ингибируя репликацию и репарацию ДНК. Азатиоприн является антипролиферативным агентом, ингибирующим синтез ДНК. Применение этих неспецифичных иммунодепрессивных средств требует больших доз, увеличивающих их токсичность (например, нефро- и гепатотоксичность) и вызывающих побочные действия. Таким образом, они не подходят для длительного лечения.

Таким образом, существует насущная потребность в дополнительных агентах и видах лечения, разрешающих проблемы, вызываемые современной терапией.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение решает вышеуказанные проблемы, предусматривая фармацевтические композиции и способы лечения иммунологических заболеваний путем ингибирования передачи сигналов рецептора β-лимфотоксина (ЬТ-β-Β) с применением блокирующих рецептор β-лимфотоксина агентов. Более конкретно, композиции и способы, включающие в себя агенты, блокирующие рецепторы β-лимфотоксина, могут быть использованы для ингибирования опосредованных антителом иммунных ответов, для регуляции уровня экспрессии адрессина и направленной миграции клеток, для воздействия на дифференцировку фолликулярных дендритных клеток и для изменения структурной организации вторичных лимфоидных тканей и подобных лимфоидных структур при патологических состояниях, таких, например, как системная красная волчанка и идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура. Кроме того, в некоторых вариантах заявленное изобретение может быть использовано для изменения связи между иммунными комплексами и Вклетками. Более конкретно, способы согласно изобретению могут предотвращать презентацию или отложение антигенов на клетках, либо, наоборот, по существу, растворять или устранять антигены, уже присутствующие на клетках.

В альтернативных вариантах осуществления данного изобретения агент, блокирующий рецептор β-лимфотоксина, выбирают из группы, включающей в себя растворимый рецептор βлимфотоксина, антитело против рецептора βлимфотоксина и антитело против поверхностного лиганда лимфотоксина.

Один из вариантов осуществления данного изобретения предусматривает растворимые формы внеклеточного домена рецептора βлимфотоксина, действующие как агенты, блокирующие рецепторы β-лимфотоксина. Предпочтительные композиции и способы в соответствии с этим вариантом включают в себя рекомбинантный белок слияния рецептора βлимфотоксина, имеющий внеклеточный лигандсвязывающий домен рецептора β-лимфотоксина, слитого с доменом константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Более предпочтительно связующий домен лиганда рецептора β-лимфотоксина слит с Ре-доменом 1дС человека.

В другом варианте осуществления данного изобретения предусмотрены антитела, действующие как агенты, блокирующие рецепторы βлимфотоксина. Предпочтительные композиции и способы в данном варианте включают в себя одно или несколько антител против рецептора β-лимфотоксина. Более предпочтительно антитело представляет собой моноклональное антитело. Другие предпочтительные композиции и способы данного варианта включают в себя одно или несколько антител против поверхностного лимфотоксина. Более предпочтительно антитело представляет собой моноклональное антитело против β-лимфотоксина. Предпочтительные антитела включают в себя тАЬ ΒΌΑ8 против ЬТ-β-Β человека и тАЬ Β9 против ЬТ-β-Β человека.

В соответствии с очередным вариантом осуществления данного изобретения, заявленное изобретение относится к способам изменения гуморального иммунного ответа у животных путем введения фармацевтической композиции, имеющей терапевтически активное количество агента, блокирующего рецепторы βлимфотоксина. В соответствии с некоторыми другими вариантами, фармацевтическую композицию вводят в количестве, достаточном для покрытия ^Т-β-Β-позитивных клеток на период приблизительно от 1 до 14 дней. В некоторых вариантах фармацевтическая композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель или адъювант.

В других вариантах осуществления данного изобретения заявленные способы ингибируют сигнал рецептора β-лимфотоксина, не ингибируя ΤΝΕ-Β (рецептор фактора некроза опухоли), с использованием вышеописанных агентов, блокирующих рецепторы β-лимфотоксина. Заявленное изобретение также предусматривает способы лечения, профилактики или элиминации вируса иммунодефицита человека у млекопитающих, включающие в себя введение агентов, блокирующих рецепторы β-лимфотоксина, либо отдельно, либо в сочетании с фармацевтическими носителями, адъювантами или другими лекарственными средствами, которые, как известно специалистам в данной области, используются для лечения или уменьшения интенсивности симптомов ВИЧ или СПИД.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения в области трансплантологии, т. е. отторжения трансплантата. Конкретно, некоторые варианты осуществления данного изобретения относятся к совместному введению агента, блокирующего путь СЭ40, и агента, блокирующего путь лимфотоксина.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - последовательность внеклеточного участка рецептора ΕΤβ человека, кодирующего лиганд-связывающий домен;

фиг. 2 - иммуногистохимический анализ селезенки мышей, получавших многократные инъекции слитых белков ΕΤβ-Β-Ι§ или ЬЕА-3-1д и ангигена;

фиг. 3 - иммуногистохимический анализ, показывающий отсутствие зародышевых центров в селезенках мышей, получавших ΕΤβ-Β-Ι§ и МВ-1 (антитело лиганда анти-СЭ40), а также присутствие фолликулярных дендритных клеток в селезенках мышей, получавших МВ-1, но не ΕΤβ-Β-Ιμ. Слитые белки и антиген эритроцитов барана вводят, как указано в описании к фиг. 2;

фиг. 4 - иммуногистохимический анализ, показывающий изменение экспрессии адрессина в лимфатических узлах мышей, получавших ΕΤβ-Β-Ιμ внутриутробно и непрерывно после рождения;

фиг. 5 - иммуногистохимический анализ расположения лимфоцитов и экспрессии маркеров макрофагов в мезентериальных лимфатических узлах мышей, получавших (как и в случае, показанном на фиг. 4) ΕΤβ-Β-Ιμ внутриутробно и непрерывно после рождения;

фиг. 6 - иммуногистохимический анализ, показывающий, что введение ΕΤβ-Β-Ιμ мышам ингибирует реакцию антителообразования на 8ВВС (эритроциты барана);

фиг. 7 - изображение накопления иммунных комплексов на фолликулярных дендритных клетках.

Подробное описание изобретения

Следующее подробное описание приводится с целью обеспечения более полного понимания настоящего изобретения.

Термины иммуноглобулиновый ответ, или гуморальный ответ, в данном описании означают иммунологический ответ животного на посторонний антиген, при котором животное вырабатывает антитела на посторонний антиген. Класс Τй2-Τ-клеток-хелперов является важным для эффективной выработки антител с высокой аффинностью.

Термин зародышевый центр в данном описании означает вторичный В-клеточный фолликул, образующийся после иммунизации антигеном. Возникновение этого гистологического сайта коррелирует с оптимальной выработкой памяти, переключением изотипа, соматической гипермутацией и, таким образом, аффинным созреванием антительного ответа.

Термины маргинальная зона или область типа маргинальной зоны означают гистологически описанные компартменты вторичных лимфоидных тканей, включающие в себя, главным образом, макрофаги маргинальной зоны, металлофильные макрофаги, В-клетки и ретикулярные клетки маргинальной зоны, а также Тклетки и дендритные клетки. Артериальный ток крови открывается в маргинальные синусы, обеспечивая таким образом антигенам прямой доступ к этим клеткам и способствуя клеточным реакциям на антигены в этом сайте.

Термин адрессин в данном описании означает молекулу, принимающую участие в хоминге лимфоцитов во вторичные лимфоидные органы. Такие молекулы экспрессируются на эндотелиальных клетках, а конкретно, на высоких эндотелиальных венулах в лимфатических узлах. Селезеночный адрессин не определен. ΝΑ6ί.ΆΜ-1 представляет собой адрессин слизистой, а ΡΝΑ6 представляет собой периферический адрессин.

Термин Т-клетки-хелперы (Τ11) в данном описании означает функциональный подкласс Т-клеток, помогающих вырабатывать цитотоксичные Т-клетки, которые сотрудничают с Вклетками, стимулируя выработку антител. Тклетки-хелперы распознают антиген в сочетании с молекулами главного комплекса гистосовместимости, класса ΙΙ и обеспечивают контактно-зависимые и контактно-независимые (цитокиновые) сигналы эффекторным клеткам.

Термин цитокин в данном описании означает молекулу, передающую сигналы между клетками. Лимфокин - это цитокин, высвобождаемый лимфоцитами.

Термин Τ112 означает подкласс Т-клетокхелперов, вырабатывающих ΕΤα. интерферон-γ и 1Ь-2 (и другие цитокины) и вызывающих воспалительные реакции, связанные с клеточным, т. е. неиммуноглобулиновым, ответом на иммунный стимул.

Термин Рс-домен антитела означает часть молекулы, включая петлю, домены СН2 и СН3, но не включая антиген-связывающие сайты. Этот термин также означает эквивалентные области изотипа 1дМ или другого антитела.

Термин антитело против рецептора ΕΤβ означает любое антитело, специфически связывающееся, по меньшей мере, с одним эпитопом рецептора ΕΤβ.

Термин антитело против ЬТ означает антитело, специфически связывающееся, по меньшей мере, с одним эпитопом комплекса ЬТа. ΕΤβ или ЬТа/β.

Термин сигналирование (сигнал) ΕΤβ-Κ (рецептора β-лимфотоксина) относится к молекулярным реакциям, связанным с рецептором βлимфотоксина, и последующим, вызванным ими, молекулярным реакциям.

Термин агент, блокирующий рецепторы β-лимфотоксина означает агент, способный уменьшать связывание лиганда с рецептором βлимфотоксина, образование кластеров рецепторов β-лимфотоксина на поверхности клеток или сигналирование рецепторов β-лимфотоксина, или такой, который способен воздействовать на интерпретацию сигнала рецептора β-лимфотоксина внутри клетки.

Агент, блокирующий рецепторы βлимфотоксина, действующий на стадии связывания лиганд-рецептор, способен ингибировать лиганд лимфотоксина, связывающийся с рецептором β-лимфотоксина, по меньшей мере, на 20%. Примеры агентов, блокирующих рецепторы β-лимфотоксина, включают в себя растворимые молекулы ΕΤβ-Κ-Ее, анти-ЬТа, анти-ΕΤβ, анти-ЬТа/β и анти-ΕΤβ-Κ АЬк. Предпочтительно антитела не вступают в перекрестную реакцию с секретируемой формой ЬТа.

Термин биологическая активность рецептора β-лимфотоксина означает 1) способность молекулы рецептора β-лимфотоксина или ее производного конкурировать за растворимый или поверхностный лиганд лимфотоксина, связывающийся с растворимыми или поверхностными молекулами рецепторов β-лимфотоксина; 2) нативную активность β-лимфотоксина, например способность стимулировать иммунный регуляторный ответ или цитотоксическую активность.

Термин лиганд лимфотоксина означает гетеромерный комплекс аф-лимфотоксина или его производного, способный специфически связываться с рецептором β-лимфотоксина.

Термин лиганд-связывающий домен рецептора β-лимфотоксина означает часть или части рецептора β-лимфотоксина, принимающие участие в специфическом распознавании и взаимодействии с лигандом лимфотоксина.

Термины поверхностный лимфотоксин и поверхностный комплекс лимфотоксина озна чают комплекс, включающий в себя алимфотоксин и мембранно-связанные субъединицы β-лимфотоксина, включая мутантные, измененные и химерные формы одной или более субъединиц, распределенные на поверхности клетки. Поверхностный лиганд лимфотоксина означает поверхностный комплекс лимфотоксина или его производного, способный специфически связываться с рецептором β-лимфотоксина.

Термин объект относится к животному, либо к одной или нескольким клеткам, полученным у животного. Предпочтительно, чтобы животное являлось млекопитающим. Клетки могут иметь любую форму, включая, но не ограничиваясь ими, клетки, задержанные в ткани, клеточные кластеры, иммортализованные, трансфецированные или трансформированные клетки, а также клетки, полученные у животного, измененного физически или фенотипически.

Лимфотоксин β: член семейства факторов некроза опухоли

Цитокины, связанные с фактором некроза опухоли, возникли как большое семейство плейотропных медиаторов защиты и иммунной регуляции хозяина. Члены этого семейства существуют в мембраносвязанных формах, оказывающих местное действие через контакт клетки с клеткой, или в виде секретированных белков, способных воздействовать на отдаленные мишени. Параллельное семейство рецепторов, связанных с фактором некроза опухоли, вступает в реакцию с этими цитокинами и включает различные механизмы, в том числе гибель клеток, пролиферацию клеток, дифференциацию тканей и провоспалительные реакции.

Фактор некроза опухоли (ΤΝΡ), лимфотоксин а (ЬТа, также называемый ΤΝΡβ) и лимфотоксин β (ΕΤβ) являются членами ΤΝΕсемейства лигандов, также включающем лиганды к рецепторам Рак, СЭ27, СЭ30, СЭ40, ОХ-40 и 4-1ВВ. (8шйЬ е1 а1., Се11, 76, рр. 959-962 (1994)). Передача сигнала несколькими членами семейства факторов некроза опухоли, включая ΤΝΡ, ΕΤβ и Рак, может индуцировать гибель опухолевых клеток путем некроза или апоптоза (запрограммированная гибель клеток). В неопухолевых клетках фактор некроза опухоли и многие виды взаимодействия лиганда из семейства фактора некроза опухоли с рецептором влияют на развитие и ответ иммунной системы на различные иммунные стимулы.

Большая часть комплексов ^(/./[1 связанных с мембраной (поверхностный лимфотоксин), имеет стехометрию ΡΤσ.1/β2. (Вто^шпд е1 а1., Се11, 72, рр. 847-856 (1993); Вгсшшпд е1 а1., 1. 1ттипо1., 154, рр. 33-46 (1995)). Поверхностные лиганды лимфотоксина не связывают рецептор фактора некроза опухоли с высокой аффинностью и не активируют передачу сигналов рецептора фактора некроза опухоли. Однако рецептор β-лимфотоксина связывает эти поверхностные комплексы лимфотоксина с высокой аффинностью (Сго\ус е! а1., 8с1епсе, 264, рр. 707-710 (1994)).

Передача сигнала рецептора β-лимфотоксина, подобно передаче сигнала рецептора фактора некроза опухоли, оказывает антипролиферативное действие и может быть цитотоксичным для опухолевых клеток. В одновременно рассматриваемой заявке заявителя, серийный № 08/378968, США, описаны композиции и способы для селективного стимулирования рецептора β-лимфотоксина с применением агентов, активирующих рецепторы β-лимфотоксина. Агенты, активирующие рецепторы β-лимфотоксина, могут быть использованы для ингибирования роста клеток опухоли, не активируя при этом индуцированные рецептором фактора некроза опухоли провоспалительные или иммунорегулирующие пути.

Недавние исследования по таргетированию гена дают основание предполагать, что α/βлимфотоксин играет роль в развитии вторичных лимфоидных органов. (Вапкз е! а1., 1. 1ттипо1., 155, рр. 1685-1693 (1995); Бе Тодт е! а1., 8с1епсе, 264, рр. 703-706 (1994)). Действительно, мыши с дефицитом лимфотоксина α не имеют лимфатических узлов и пейеровых бляшек. Более того, их селезенки имеют нарушенное строение, а экспрессия функциональных маркеров на клетках маргинальной зоны селезенки изменена. (Вапкз е! а1., 1995; Бе Тодш е! а1., 8с1епсе, 264, рр. 703-706 (1994); Ма!зито!о е! а1., 8с1епсе, 271, рр. 1289-1291 (1996)). Ни одна из этих характеристик не была описана относительно рецепторов фактора некроза опухоли мышей. (Епскзоп е! а1., №!ше, 372, рр. 560-563 (1994); РГеГГег е! а1., Се11, 73, рр. 457-467 (1993); Ко!йе е! а1., Ыа!иге, 364, рр. 798-802 (1993)). Заявители недавно определили роль мембранных комплексов α/β-лимфотоксинов в развитии вторичных лимфоидных органов, показав, что потомство мышей, которым во время беременности инъецировалась растворимая форма мышиного рецептора β-лимфотоксина, слитого с порцией человеческого 1дО1 Ес (ΡΤβ-Ρ-Ιβ). не имело большей части лимфатических узлов и обладало нарушенным строением селезенки. (Реппе г! е! а1., 1996, 8итГасе ЬутрйоЮхт а1рйа/Ье!а сотр1ех ίδ гесцпгеб Гог !йе беуе1ортеп! оГ рег1рПега1 1утрйо1б огдапк, 1. Ехр. Меб., 184: 19992006). В результате другого исследования было установлено, что мыши, трансгенные по подобной конструкции ΕΤβ-Κ.-Ι§, которая начинает экспрессироваться через 3 дня после рождения, имеют лимфатические узлы. Однако строение их печени было нарушено и несколько маркеров клеток маргинальной зоны селезенки не было экспрессировано (ЕШпдег е! а1., Б1згир!еб кр1ешс агсЫ!ес!иге, Ьи! погта1 1утр11 побе беуе1ортеп! ίπ писе ехргеззтд а ко1иЬ1е ΕΤβ-Ρ/Ι§01 Ги зюп рго!ет, Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сЕ И.8.А., 93: 13102-13107). В сумме эти данные показывают, что существуют временные условия функционирования лимфотоксинов мембраны для опосредованного воздействия на развитие вторичных лимфоидных органов, но не на строение селезенки.

Система факторов некроза опухоли может оказывать влияние также и на развитие селезенки. Клетки маргинальной зоны селезенки мышей с дефицитом фактора некроза опухоли не экспрессируют маркеры макрофагов или МАбСАМ-1 (А1ехорои1ои е! а1., 60!й 1п!.ТПР Сопдгезз, Еиг. Су!ок1пе Ые!теогк, рр. 228 (1996); Разрагак18 е! а1., 601й 1п!.ТПР Сопдгезз, Еиг. Су!ок1пе №Щогк, рр. 239 (1996)). Мыши с дефицитом ΈΝΕ-Κ.55 также не имеют окрашивания МАбСАМ-1 (но не МОМА-1) в маргинальной зоне селезенки. (№итапп е! а1., 1. Ехр. Меб., 184, рр. 259-264 (1996); Ма!зито!о е! а1., 8с1епсе, 271, рр. 1289-1291 (1996)). Как видно на селезенке мышей с дефицитом ΊΝΕ-Κ75, экспрессия этих маркеров оказывается нормальной. (Ма!зито!о е! а1., 8с1епсе, 271, рр. 1289-1291 (1996)).

Лимфоидоподобные ткани не только выступают как часть процессов развития, но и появляются при некоторых патологических состояниях, таких как хроническое воспаление, процесс, недавно получивший название неолимфоорганогенез (Рюкег апб Ви!сйег, Аппи. Кеу. 1ттипо1., 10, рр. 561-591 (1992); 1<га1х е! а1., 1. Ехр. Меб., 1183, рр. 1461-1471 (1996)). На такие процессы очевидно воздействуют члены семейства факторов некроза опухоли. У мышей, трансгенных по гену α-лимфотоксина, находящегося под контролем инсулинового промотора крыс (КЕР-ЬТ), развиваются хронические воспалительные поражения, индуцированные лимфотоксином, с характеристиками организованных лимфоидных тканей (Кга1х е! а1., 1. Ехр. Меб., 1183, рр. 1461-1471 (1996); Рюагейез е! а1., Ргос.

Асаб. 8сЦ 89, рр. 10036-10040 (1992)).

Оценка функции лимфотоксина во время иммунного ответа, зависимого от Т-клеток у мышей с дефицитом α-лимфотоксинов, указывает на необходимость присутствия лимфотоксинов для образования зародышевых центров, возможно для поддержания организованной структуры фолликулярных дендритных клеток (ЕБС) и для гуморальных ответов. (Вапкз е! а1.,

1. 1ттипо1., 155, рр. 1685-1693 (1995); Ма!зито!о е! а1., 8с1епсе, 271, рр. 1289-1291 (1996); Ма!зито!о е! а1., №!иге, 382, рр. 462-466 (1996)). У мышей с дефицитом Т№-К55 также отсутствуют фолликулярные дендритные клетки, у них не развиваются зародышевые центры, а также оптимальный ответ антитела на эритроциты барана. Это предполагает, что для большей части таких ответов Т№-К55 может быть стимулирован растворимым лимфотоксином или сигналами фактора некроза опухоли (Ье Ни е! а1., 1.

Ехр. Мей., 183, рр. 2367-2372 (1996); А1ехорои1ои е1 а1., 601й Ιηΐ.ΤΝΕ Сопдге88, Еиг. Су1окше Ые1^огк, рр. 228 (1996); Разрагакщ е1 а1., 601й Ιηΐ.ΤΝΡ Сопдгезз, Еиг. Су1окше №1\уогк. рр. 239 (1996)). До настоящего времени функциональная роль пути поверхностного ЬТ/ΕΤβ-Κ. в гуморальных иммунных ответах не была определена.

Рецептор β-лимфотоксина, член семейства рецепторов фактора некроза опухоли, специфически связывается с поверхностными лигандами лимфотоксинов. Рецептор β-лимфотоксина связывает гетеромерные комплексы лимфотоксина (преимущественно ΕΤα1/β2 и ΕΤα2/β1), но не связывает фактор некроза опухоли или αлимфотоксин (Сго\\'е е1 а1., 8с1епсе, 264, рр. 707710 (1994)). мРНК рецепторов β-лимфотоксина обнаруживаются в селезенке, тимусе и в других органах человека, связанных с иммунной системой. Несмотря на то, что исследования экспрессии рецепторов β-лимфотоксинов находятся на ранней стадии, типы экспрессии рецептора βлимфотоксина, по всей видимости, подобны типам, описанным для ΤΝΡ-Κ.55, за исключением того, что рецептор β-лимфотоксина отсутствует на периферических Т- и В-клетках крови, а также Т- и В-клеточных линиях.

Комплексы лимфотоксинов поверхности клеток были охарактеризованы в СП4'-Тклетках гибридомы (ΙΙ-23.Ό7), экспрессирующих высокий уровень лимфотоксина (ΒΐΌ\νπίπ§ е! а1., 1. 1ттипо1., 147, рр. 1230-1237 (1991); Апйго1е\\'1сх е1 а1., 1. Вю1. Сйет., 267, рр. 2542-2547 (1992), приводимые в данном описании в качестве ссылок). Экспрессия и биологическая роль рецептора β-лимфотоксина, субъединиц лимфотоксина и поверхностных комплексов лимфотоксина описаны С.Е. Шаге е1 а1., Τίκ йдапйз апй гесер1ог8 о! 1йе 1утрйо1охш 8у81ет, ш Ра111\\'ау5 Гог Су1о1у818, Сиггеп! ^рюз М1сгоЫо1. 1ттипо1., 8ргтдег-Уег1ад, рр. 175-218 (1995), в частности, приводимом в данном описании в качестве ссылки.

Индукция экспрессии α-лимфотоксинов и секреция α-лимфотоксинов, в основном, наблюдается в активированных Т- и В-лимфоцитах и естественных клетках-киллерах. По всей видимости, в Т-клетках-хелперах α-лимфотоксин продуцируется клетками ΤΜ, а не Τ112. αЛимфотоксин также обнаруживается в меланоцитах. Клетки микроглии и Т-клетки в очагах поражения у пациентов с множественным склерозом также могут быть окрашены с помощью антисыворотки против α-лимфотоксина (8е1та_) е! а1., 1. С1т. 1пуе§1., 87, рр. 949-954 (1991)).

Лимфотоксин β (также называемый р33) экспрессируется на поверхности Т-лимфоцитов людей и мышей. Т-клеточных линий, Вклеточных линий и лимфокин-активированных клеток-киллеров (БАК). β-Лимфотоксин является предметом рассмотрения параллельных зая вок заявителя РСТ/и8 91/04588, опубликована 9 января 1992 г. как ШО 92/00329; и РСТ/И8 93/11669, опубликована 23 июня 1994 г. как ШО 94/13808, приводимых в данном описании в качестве ссылок.

Поверхностные комплексы лимфотоксина вначале экспрессируются активированными Т(хелперы, ΤΜ и клетки-киллеры) и Влимфоцитами, а также естественными клетками-киллерами, как показано с помощью анализа клеточного сортера с возбуждением флуоресценции или иммуногистологически с применением антител против α-лимфотоксина или растворимых слитых белков ΕΤβ-Ρ-Ι§. В одновременно рассматриваемой заявке США заявителя, серийный № 08/505606, поданной 21 июля 1995 г., описаны композиции и способы применения растворимых рецепторов β-лимфотоксина, а также антитела против рецептора βлимфотоксина и лиганд-специфические антитела как терапевтические средства для лечения иммунологических заболеваний, опосредованных клетками ТЬ1. Поверхностные лимфотоксины описаны также на клонах цитотоксичных Т-лимфоцитов человека (СТБ), активированных периферических мононуклеарных лимфоцитах (РМБ), активированных 1Б-2 периферических лимфоцитах крови (лимфокин-активированные клетки-киллеры), активированных митогеном лаконоса или анти-СП40-активированных периферических В-лимфоцитах (РВБ) и различных лимфоидных опухолях Т- и В-ряда. Вовлечение аллоантиген-несущих клеток-мишеней специфически индуцирует экспрессию поверхностных лимфотоксинов клонами цитотоксичных Т-лимфоцитов С.П8' и С.П4'.

В данной заявке заявители описывают несколько иммунологических функций поверхностного лимфотоксина и показывают действие реагентов, связывающих α/β-лимфотоксины, на возникновение и характер иммунологических ответов, поддержание клеточной организации вторичных лимфоидных тканей, включая действие на состояние дифференцировки фолликулярных дендритных клеток и образование зародышевых центров, а также уровень экспрессии адрессинов, влияющих на направленную миграцию клеток. Таким образом, заявители определяют терапевтическое применение поверхностных агентов, связывающих рецепторы ΕΤα/β и ΕΤβ.

До настоящего изобретения влияние сигнала рецепторов β-лимфотоксина на гуморальный или иммуногенный ответы не было выяснено полностью. Авторы впервые обнаружили, что блокирование пути лимфотоксина (βлимфотоксина или рецептора β-лимфотоксина) может изменить гуморальный иммунный ответ животного. Таким образом, заявленное изобретение в широком смысле относится к способам изменения гуморального иммунного ответа жи вотных, включая стадии введения фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество блокирующего агента пути лимфотоксина, в частности, предпочтительными являются блокаторы рецептора β-лимфотоксина.

В соответствии с данным изобретением могут быть использованы любые блокирующие агенты, и специалист в данной области может легко определить агенты, блокирующие рецепторы β-лимфотоксина. Например, такие блокирующие агенты могут включать в себя ингибиторы небольших молекул рецептора, растворимый рецептор β-лимфотоксина, антитела против рецепторов β-лимфотоксина и антитела против поверхностного лиганда лимфотоксина. В предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения блокирующие агенты включают в себя растворимые рецепторы β-лимфотоксина, имеющие лиганд-связывающий домен, способный селективно связываться с поверхностным лигандом лимфотоксина, и более предпочтительно, когда растворимый рецептор βлимфотоксина включает в себя Ес-домен иммуноглобулина человека.

В других вариантах осуществления данного изобретения предпочтительные блокирующие агенты включают в себя моноклональные антитела против рецептора β-лимфотоксина, предпочтительно включая шАЬ ΒΌΑ8 против рецептора β-лимфотоксина человека и тАЬ Β9 против β-лимфотоксина человека. Более предпочтительные антитела включают в себя Α1.Ό5.18, Α0.Ό12.10 и ΒΒ-Ε6. В некоторых случаях желательно применение моноклонального антитела против мышиного лиганда поверхностного лимфотоксина.

Длительное представление антигена фолликулярными дендритными клетками, по всей вероятности, является существенным при аутоиммунных заболеваниях, когда непрерывная активация иммунной системы эндогенными аутоантигенами поддерживает болезнь. Захват иммунного комплекса на фолликулярных дендритных клетках показан на фиг. 7. Возможность удалять эти иммунные комплексы с фолликулярных дендритных клеток будет способствовать уменьшению иммунной активации и уменьшать заболевание или даже прекращать его развитие. Аутоиммунные заболевания, вызывающие аберрантные ответы антител, являются очевидными мишенями для ингибиторов путей лимфотоксина, хотя другие, более классически вызванные Т-клетками аутоиммунные заболевания, могут содержать нераспознанные гуморальные компоненты и поэтому также могут быть подвергнуты положительному воздействию.

Подобным образом, в области трансплантологии отторжение трансплантата, т.е. хозяин против трансплантата и болезнь трансплантат против хозяина, требует постоянной презентации антигена. Описываемые здесь механизмы манипулирования фолликулярными дендритными клетками также применимы к задачам, связанным с распознаванием не своего, т.е. трансплантата.

Кроме того, непрерывное представление антигена или поддержание антигенной памяти может играть роль в аутоиммунных заболеваниях, вызванных молекулярной мимикрией. Например, иммунный ответ на инфекционный агент болезни Лайма БоггсКа ЬигдбогГсп приводит к возникновению артритоподобного заболевания предположительно из-за того, что какойто антигенный эпитоп этой бактерии напоминает нормальный компонент сустава. Удаление удерживаемого фолликулярными дендритными клетками антигена бактерий Лайма может вызвать улучшение при артрите, индуцированном болезнью Лайма. Такая терапия также подходит и для других случаев мимикрии, связанных с инфекционными агентами.

Заявители неожиданно обнаружили, что введение блокирующих агентов рецепторов βлимфотоксина способно мешать представлению и/или депонированию антигенов на фолликулярных дендритных клетках. Обычно В-клетки распознают антиген в виде иммунных комплексов, связанных с поверхностью фолликулярных дендритных клеток. Эти клетки могут удерживать антигены неопределенно долго. Периодический контакт с антигеном, удерживаемым на фолликулярных дендритных клетках, может быть, таким образом, связан с удержанием памяти на В-клетках. Таким образом, заявляемые способы включают в себя многочисленные болезненные состояния, зависящие от представления антигена на дендритных клетках. Введение блокирующих агентов в соответствии с данным изобретением может быть осуществлено перед введением животному антигена. В этом случае блокирующие агенты полностью или частично предотвращают депонирование антигена на фолликулярных дендритных клетках, предотвращая или уменьшая таким образом ожидаемый иммуногенный ответ. Альтернативно, блокирующие агенты в соответствии с данным изобретением могут быть введены животному после того, как фолликулярные дендритные клетки связались с ними посредством антигена. Заявляемые способы могут обеспечить разрушение этой связи таким образом, что ожидаемый иммуногенный ответ будет затем снижен или устранен. Таким образом, терапевтические способы в соответствии с данным изобретением могут включать в себя полное или частичное устранение иммунных комплексов, уже захваченных в фолликулы В-клеток, либо полное или частичное предотвращение захвата иммунных комплексов В-клеточными фолликулами.

Способность разрушать связь между этими антиген представляющими фолликулярными дендритными клетками и иммунными комплексами является уникальной для обмена βлимфотоксина. Например, анти-СО40Ь (МК-1) является другим членом семейства факторов некроза опухоли и также экспрессируется на фолликулярных дендритных клетках. Было установлено, что подобно ЬТ-β-Κ/Ι^, МК-1 предотвращает образование зародышевых клеток, однако, он не влияет на экспрессию маркеров фолликулярных дендритных клеток. В отличие от рецептора β-лимфотоксина, анти-СО40-Ь не предотвращает захват иммунного комплекса на фолликулярных дендритных клетках, он также не способен устранять иммунные комплексы, захваченные ранее на фолликулярных дендритных клетках. Кроме того, заявители установили, что анти-СО40-Ь не влияет на выживание/поддержание ранее генерированных Вклеток памяти.

Несмотря на то, что точное основание для различий между воздействием блокирующих агентов анти-СО40-Ь и рецептора β-лимфотоксина неизвестно, высказывается предположение, что С'П40 может обеспечивать сохранение сигналов к В-клеткам. Однако система лимфотоксина важна для поддержания фолликулярных дендритных клеток в полностью дифференцированном и функциональном состоянии, что является необходимым условием для реакции зародышевого центра, а также для генерации и поддержания В-клеток памяти. Таким образом, блокирование пути ΟΌ40/ΟΌ40Τ может предотвратить генерацию В-клеток памяти, но не повлияет на уже образовавшийся пул Вклеток памяти. С другой стороны, блокирование обмена лимфотоксина предотвращает не только генерацию и поддержание В-клеток памяти, но также влияет на поддержание ранее генерированных В-клеток памяти.

Дальнейшее применение ингибирования пути обмена лимфотоксина заключается в воздействии на вирусы, образующие резервуары в компартменте фолликулярных дендритных клеток. Хорошим примером такого случая является вирус ВИЧ. После вирусного заражения большое количество инфекционных вирусов размещается на фолликулярных дендритных клетках в В-клеточных фолликулах вторичных лимфоидных органов (Нса111с с1 а1., 1995, РоШси1аг бепбгШс се11к апб йишап штипобейаепсу νίπικ 1п1ес11УЙу, №и.1ге. 377: 740-4). Предполагается, что вирус образует комплексы с комплементом или иммуноглобулином и связывается с Рсрецепторами или рецепторами комплемента либо с теми и другими. Таким образом, вирус использует нормальный механизм иммунной системы для сохранения антигенной памяти на долгое время. В процессе заболевания активное инфицирование лимфоцитов возникает, прежде всего, на этих сайтах. Было подсчитано, что во время асимптоматической фазы инфекции пул вируса в этом компартменте более чем в 10 раз превышает пул, содержащийся в Т-клетках и моноцитах (Сауей е1 а1., 1997, Ктебск о! гекропке ш 1утрйо1б бккиек Ю апйгейоуйШ Легару о! Ηΐν-1 шРесбоп, §аепсе, 276: 960-964). В современных способах воздействия на ВИЧ многочисленные антивирусные агенты соединяют для снижения вирусной нагрузки и избежания потери резистентных вариантов. Вероятное ограничение такого лечения заключается в несоответствии с терапией - во время таких интервалов остаточный вирус имеет возможность мутировать, обеспечивая развитие резистентных вариантов и, таким образом, обходя процесс лечения. В то время как вирусная нагрузка в компартменте фолликулярных дендритных клеток подвергается сильному воздействию во время множественной лекарственной терапии, сами лекарственные средства, в основном, направлены на вирусный репликативный комплекс, а не на нерепликативный вирус на поверхности фолликулярных дендритных клеток. Поэтому резервуар вирусов на фолликулярных дендритных клетках может служить для реинокуляции после прекращения лекарственной терапии. Более того, фолликулярные дендритные клетки способны превращать нейтрализованный вирус в инфекционную форму, подчеркивая важность этих клеток в патогенезе ВИЧ.

Поскольку ингибирование пути обмена лимфотоксина может заставить фолликулярные дендритные клетки высвободить иммунные комплексы с поверхности клеток, ВИЧ также может быть высвобожден в виде иммунного комплекса. Желательно снять всю нагрузку ВИЧ в этом компартменте непосредственно перед началом режимов множественной терапии, поскольку высвобожденный вирус должен быть либо подвергнут воздействию и удален из организма, либо после заражения он станет чувствительным к лекарственной терапии. Такое сочетание может снизить остаточную вирусную нагрузку до очень низкого уровня, возможно, оказывая влияние на лечение. В этом случае полезными оказываются ΤΤ-β-Κ/Ι§ или антитела, блокирующие лиганд или рецептор. Потенциальный протокол лечения включает в себя инициирующую лекарственную терапию, а затем в течение нескольких дней высвобождение всех связанных вирусов путем однократного или многократного воздействия ингибиторами пути лимфотоксина. После снижения вирусной нагрузки дальнейшее воздействие агентами, направленными на лимфотоксин, не требуется.

Тогда как ВИЧ является особенно хорошо изученным примером, по всей вероятности другие вирусы размещаются или прячутся на фолликулярных дендритных клетках в спокойном состоянии, ожидая каких-либо событий, таких как иммунологическое возмущение, ведущее к большой дополнительной антигенной нагрузке, и, вследствие этого, к высвобождению связан ного вируса из фолликулярных дендритных клеток и его возрождению. Поэтому данное изобретение относится к любым способам ингибирования пути лимфотоксина во избежание осложнений, обусловленных вирусом, связанным с фолликулярной дендритной клеткой.

Это открытие имеет важное значение для многих заболеваний, основой которых является представление антигена на дендритных клетках и ответ, генерируемый В-клетками памяти. ΣΤα1/β2 эффективно передает сигналы и служит примером терапевтически полезного антиЬТЬ-блокирующего моноклонального антитела. Кроме того, моноклональное антитело против α-лимфотоксина человека, называемое

ΆΘΌ12, способно блокировать передачу сигналов ΕΤα1/β2 и все же, в отличие от большей части моноклональных антител против αлимфотоксина человека, оно малоэффективно против одного α-лимфотоксина. Эти моноклональные антитела были получены после иммунизации мышей растворимым лигандом ΕΤα1/β2, приведя к открытию моноклональных антител с уникальной специфичностью. Более того, мы настаиваем, что анти-α-лимфотоксиновые моноклональные антитела со специфичностью предпочтительно против комплекса ΕΤα1/β2 будут обнаружены только при такой иммунизации, а не при иммунизации только αлимфотоксином, и поэтому включают уникальный класс антител против α-лимфотоксинов.

Примеры Материалы и методы

Мыши.

Беременных мышей Ва1Ь/с с одинаковым сроком приобретали в 1асккоп ЬаЬота1огу (Ваг НагЬог, МЕ), помещали в обычные клетки и содержали в соответствии с рекомендациями. В хвостовую вену беременных мышей внутривенно вводили белки рецептора-1д. Потомству мышей и 5-недельным самкам Ва1Ь/с (приобретенным в 1асккои ЬаЬогаЮгу, Ваг НагЬог, МЕ) внутрибрюшинно вводили слитые белки.

Слитые белки и антитела.

Слитые белки, включающие в себя внеклеточный домен мышиного рецептора β-лимфотоксина, ΤΝΡ-Β55 или ЬБА-3 человека (не связывающегося с мышиным СЭ2). слитые в петлю, С_н2- и С_н3-домены 1дС1 человека готовили, как описано Ротсе е! а1., 1. 1ттипо1., 155, рр. 5280-5288 (1995); МШег е! а1, 1. Ехр. Меб., 178, рр. 211-222 (1993). Очищенный 1дС1 человека, используемый в качестве контроля, приобретали в Рго1ок 1ттипогекеагсй (8ап Ргапшксо, СА). МВ1, антитело против мышиного лиганда СЭ40, приобретали в Рйаттшдеп (8ап П1едо, СА).

Антитела (МОМА-1, ΕΌ3), специфичные в отношении маркеров, экспрессируемых мышиными металлофильными макрофагами (ММ) (ΕΌ3 распознает сиалоадгезин), или специфич ные в отношении ретикулярных фибробластов мыши (ΕΚ.-ΤΚ.-7) приобретали в 8его1ес (Охоп, ИВ). Антитела, специфичные для мышей В220, С’Э4 и МабСАМ-1 (МЕСА 367) приобретали в Рйаттшдеп (8ап П1едо, СА). Антитело (ΕΒ-ΤΒ9), специфичное к маркеру, экспрессируемому макрофагами маргинальной зоны мышей, поставляет Ότ. Веша МеЬшк (Уп)е ишуеткйей, Лтк1егбат). Антитела (РЭС-М1 и РЭС-М2), специфичные к мышиной фолликулярной дендритной клетке, были описаны ранее (Маеба е! а1., 1. 1ттипо1., 148, рр. 2340-2347 (1992)). Антитело против СВ1 мыши (которое также окрашивает фолликулярные дендритные клетки) было любезно предоставлено Ότ. Вапбо1р11 1. №е11е (Эаг1тои1й Меб1са1 8сйоо1). Для выявления адрессина периферических лимфатических узлов (РNАб) применяли антитело МЕСА 79 (супернатант клеточной культуры, полученной из клеток, приобретенных в АТСС, ВоскуШе, МЭ).

Антигены и иммунизация.

Мышей подвергали внутрибрюшинной иммунизации 100 мкл 10% суспензии (приобретаемой в Со1огабо 8етцт Сотрапу), что эквивалентно 1-5х10⁸ 8ВВС на иммунизацию.

Иммуногистохимия.

Селезенку и лимфатические узлы замораживали в заливочной среде ОСТ (Мбек, Е1кйай, ΙΝ) и подготавливали для получения срезов в криостате. Срезы толщиной 7-10 мм высушивали и фиксировали ацетоном. Срезы инкубировали с конъюгированными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре в увлажненной камере после разбавления в Ττίκ-забуференном солевом буфере А ^В8-А, 0,05М Ττίκ, 0,15М №С1, 0,05% Τ\\^π-20 (об./об.), 0,25% бычьего сывороточного альбумина), промывали в 1В8-В (0,05М Ττίκ, 0,15 №С1, 0,05% Рмееп-20) и фиксировали в течение 1 мин в этаноле, перед тем как инициировать энзиматическую реакцию. Активность пероксидазы (НВР) хрена и щелочной фосфатазы (АР) выявляли с помощью набора ЭАВ таблеток с субстратом (81дша, 8ΐ. Ьошк, МО) и 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат нитроголубой тетразолий (ВОР/ΝΕΤ, 8щта) соответственно. Срезы ткани фиксировали в течение 5 мин в метаноле и окрашивали для подсчета, применяя О1етка (Р1ика, Вискк, 8\\'Цхег1апб).

Анализ флюоресцентного изображения.

Для иммунофлюоресцентного окрашивания замороженные срезы фиксировали в ацетоне, высушивали на воздухе и предварительно блокировали 5 мкг/мл анти-С’О16/С’О32-Рсблокатором (Рйатттдеп, 8ап П1едо, СА) в забуференном Ττίκ солевом растворе, содержащем 0,25% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% Τ\\^π-20 и 10% термоагрегированной сыворотки кролика. Срезы окрашивали в этом же буфере, используя следующие т8Ьк и выявляющие реагенты: 10 мкг/мл биотинилированного анти-В220 тАЬ (Рйатттдеп), затем 20 мкг/мл стрептавидин-флуоресцин-изотиоцианата (8ои1Негп Вю!есНпо1оду Ав8ос1а!е8, В1гттдНапг АЬ); 10 мкг/мл МЕСА 367, а затем 10 мкг/мл РЕ-козьего Е(аЬ')2 против крысиного 1дС (8ои1Негп В1о!есНпо1оду А88ос1а!ез); супернатанта культуры МЕСА79, затем 20 мкг/мл Е1ТСмышиного антикрысиного 1дМ (РНатипдеп); 20 мкг/мл антисиалоадгезинового тАЬ, затем 10 мкг/мл РЕ-козьего Е(аЬ')2 против крысиного 1дС (8ои!йет Вю!есНпо1оду А88ос1а!ев), 50 мкг/мл биотинилированного арахисового агглютинина (РИА) (УесЮг ЬаЬога!ог1е8, Вигйпдате, СА), затем 10 мкг/мл стрептавидина-РЕ (8оп1Негп Вю1есНпо1оду А88ос1а!ез); разбавленное 1:5 тАЬ из супернатанта клеточной структуры МОМА-1, затем 20 мкг/мл мышиного Е1ТС-антикрысиного 1дМ (РНатипдеп). Некоторые срезы окрашивали одновременно многими тАЬз для получения анализа наложенного образа. Все срезы рассматривали при 50х увеличении и фотографировали, используя Ек1асНготе Р1600 (Кобак, ВосНейег ΝΥ), или запечатлевали в виде красных и зеленых файлов изображения, как описано Реппей е! а1., 1. Ехр. Меб. (ноябрь 1996 г., в печати).

Анализы на гемагглютинацию.

Серийные разбавления сывороток осуществляют в 96-луночном титрационном микропланшете (Соз!аг, СатЬпбде, МА) в забуференном фосфатом физиологическом растворе/1% глюкозе. Титр 1дМ, специфичный к эритроцитам барана, определяют путем добавления 25 мкл 10% суспензии эритроцитов барана в каждую лунку и инкубирования планшета в течение 1 ч в увлажненном инкубаторе при 37°С. При использовании 1дС, специфичного к эритроцитам барана, сыворотку инкубируют в течение 30 мин при 37°С с применением 20 мкл/лунку 1% 2-меркаптоэтанола (об./об.) (Вю-К.аб, ШсНтопб, СА) для устранения пентамеров 1дМ. Затем добавляют 25 мкл/лунку 10% суспензии эритроцитов барана, а потом 25 мкл/лунку 10 мг/мл раствора (в забуференном фосфатом физиологическом растворе/1% глюкозе) козьего антимышиного 1дС (8оп1Негп Вю!есНпо1оду, В1гттдйат, АЕ) в качестве поперечносшивающего агента для гемагглютинации. Титр определяют как обратную величину последнего разбавления сыворотки, при котором гемагглютинация явно очевидна.

Твердофазные иммуноферментные анализы (ЕЫ8А8).

В анализах 1д-рецепторов в плазме используют тАЬз, специфичные к мышиному рецептору β-лимфотоксина (Вгслиипд е! а1., манускрипт находится в стадии подготовки), ЬЕА-3 (МШег е! а1., 1. Ехр. Меб., 178, рр. 211-222 (1993)) или домен СН3 1дС1 человека (СОС5, выпускаемый в Вюдеп), непосредственно иммобилизованные (10 мкг/мл) в 96-луночных титрационных микропланшетах для получения изображений, а также ослиные антитела против

1дС| человека против пероксидазы хрена для регистрации (1аскзоп 1ттипоК.е8еагсй, ХУей Сгоуе, РА, разбавление 1:4000).

Получение растворимых молекул рецептора β-лимфотоксина.

В одном из вариантов осуществления данного изобретения агенты, блокирующие рецепторы β-лимфотоксина включают растворимые молекулы рецепторов β-лимфотоксина. Фиг. 1 показывает последовательность внеклеточной части рецептора β-лимфотоксина человека, кодирующую лиганд-связывающий домен. Используя информацию о последовательности, приведенную на фиг. 1, и метод рекомбинантной ДНК, хорошо известный в данной области, функциональные фрагменты, кодирующие лиганд-связывающий домен рецептора βлимфотоксина, могут быть клонированы в вектор и экспрессированы в соответствующем хозяине для получения растворимой молекулы рецептора β-лимфотоксина. В качестве агентов, блокирующих рецепторы β-лимфотоксина, выбирают растворимые молекулы рецепторов βлимфотоксина, которые могут конкурировать с нативными рецепторами β-лимфотоксина для связывания лиганда лимфотоксина в соответствии с анализами, описанными в одновременно рассматриваемой заявке заявителя, серийный № 08/505606, поданной 21 июля 1995 г., США.

Растворимый рецептор β-лимфотоксина, включающий в себя аминокислотные последовательности, выбранные из последовательностей, приведенных на фиг. 1, может быть прикреплен к одному или нескольким гетерологичным белковым доменам (домен слияния) для улучшения стабильности белка слияния рецептора ш угуо, либо для модулирования его биологической активности или локализации.

Устойчивые белки плазмы, обычно имеющие период полураспада, превышающий 20 ч в циркуляции, предпочтительно используют для конструирования белков слияния рецепторов. Такие белки плазмы включают, но не ограничиваются ими, иммуноглобулины, сывороточный альбумин, липопротеины, аполипопротеины и трансферрин. Последовательности, способные нацеливать растворимую молекулу рецептора βлимфотоксина на конкретную клетку или тип ткани, также могут быть прикреплены к лигандсвязывающему домену рецептора βлимфотоксина для получения специфически локализованного растворимого белка слияния рецептора β-лимфотоксина.

Весь внеклеточный участок рецептора βлимфотоксина или его функциональная часть (фиг. 1), включающие лиганд-связывающий домен рецептора β-лимфотоксина, могут быть слиты с постоянным участком иммуноглобулина, подобно Ес-домену 1дС1 человека с тяжелой цепью (Вгслгшпд е! а1., 1. 1ттипо1., 154, рр. 3346 (1995)). Растворимые белки слияния 1дС ре цепторов являются предпочтительными и обычными иммунологическими реагентами; способы их конструирования известны в данной области (см., например, патент США № 5225538, приводимый в настоящем описании в качестве ссылки).

Функциональный лиганд-связывающий домен рецептора β-лимфотоксина может быть слит с Рс-доменом иммуноглобулина (1д), полученного из класса или подкласса иммуноглобулинов, отличных от 1дС 1. Рс-Домены антител, принадлежащих к различным классам или подклассам 1д, могут активировать различные вторичные эффекторные функции. Активация происходит тогда, когда Рс-домен связан родственным Рс-рецептором. Вторичные эффекторные функции включают способность активировать систему комплемента, проникать через плаценту и связывать различные микробные белки. Свойства различных классов и подклассов иммуноглобулинов описаны Βοίΐί е! а1., 1ттипо1оду, р. 4.8 (МокЬу-Уеаг Воок Еигоре Ы6., 36 е6., 1993).

Активация системы комплемента инициирует каскад ферментативных реакций, вызывающих воспаление. Продукты системы комплемента имеют различные функции, включая связывание бактерий, эндоцитоз, фагоцитоз, цитотоксичность, выработку свободных радикалов и солюбилизацию иммунных комплексов.

Каскад ферментов комплемента может быть активирован Рс-доменами антигенсвязанных антител 1дС1, 1дС3 и 1дМ. Рс-Домен 1дС2 оказывается менее эффективным, а домены Рс 1дС4, 1дА, 1дЭ и 1дЕ - неэффективными для активации комплемента. Таким образом, Рсдомен может быть выбран на основании его ассоциированных вторичных эффекторных функций, желательных для конкретного иммунного ответа, или заболевания, лечимого белком слияния иммуноглобулина рецептора β-лимфотоксина.

Если предпочтительно повредить или убить несущую лиганд клетку-мишень лимфотоксина, можно выбрать особо активный Рсдомен (1дС1) для получения слитого белка иммуноглобулина рецептора β-лимфотоксина. Альтернативно, если желательно нацелить слияние Рс-рецептора β-лимфотоксина на клетку без запуска системы комплемента, можно выбрать неактивный Рс-домен 1дС4.

Мутации в Рс-доменах, снижающие или устраняющие связывание с Рс-рецепторами и активацию комплемента, описаны 8. Мот юн, Аппи. Веу. 1ттипо1., 10, рр. 239-265 (1992). Эти или иные мутации могут быть использованы по отдельности или в сочетании для оптимизации активности Рс-домена, используемого для конструирования слитого белка иммуноглобулина рецептора β-лимфотоксина.

Получение растворимого слитого белка рецептора β-лимфотоксина человека, включающего в себя лиганд-связывающие последовательности, слитые с Рс-доменом иммуноглобулина человека (ΙιΕΤβ-Β-^), описано в примере 1. Одну линию СНО, полученную в соответствии с примером 1, секретирующую ΗΕΤβ-Β-Рс, называют ΙιΕΤβ-Β, 11С1 СНОМ4. Образец этой линии был депонирован 21 июля 1995 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС) (ΒοскνШе, МО) в соответствии с условиями Будапештского договора и ему был присвоен номер АТСС СХ1.11965.

Получение растворимой мышиной слитой молекулы рецептора β-лимфотоксина (ΣΤβ-Β1д) описано в примере 2. Линию СНО, полученную в соответствии с примером 2, секретирующую иммуноглобулин рецептора β-лимфотоксина, называют т^Τβ, Β-11Ο1 СНОА1,3.ВВ. Образец этой линии был депонирован 21 июля 1995 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС) ^оску^^, МЭ) в соответствии с условиями Будапештского договора, и ему был присвоен номер АТСС ΟΒΕ11964.

Все ограничения по доступности вышеуказанных депозитов АТСС будут бесповоротно устранены после выдачи патента по данной заявке.

Различные аминокислотные остатки, образующие точку слияния рецептора с иммуноглобулином в слитом белке, могут изменять структуру, стабильность и окончательную биологическую активность растворимого слитого белка рецептора β-лимфотоксина. К С-концу выбранного фрагмента рецептора β-лимфотоксина могут быть добавлены одна или несколько аминокислот для модификации точки слияния выбранным доменом слияния.

Ν-конец слитого белка рецептора βлимфотоксина также может варьироваться путем изменения позиции, в которой выбранный фрагмент ДНК рецептора β-лимфотоксина расщепляют на 5'-конце для инсерции в рекомбинантный вектор экспрессии. Стабильность и активность каждого слитого белка рецептора βлимфотоксина может быть проверена и оптимизирована с помощью рутинных экспериментов и анализов по выбору описанных выше агентов, блокирующих рецепторы β-лимфотоксина.

С помощью последовательностей лигандсвязывающего домена рецептора β-лимфотоксина в составе внеклеточного домена, приведенного на фиг. 1, можно также сконструировать варианты аминокислотных последовательностей для модификации аффинности растворимого рецептора β-лимфотоксина или слитого белка к лиганду лимфотоксина. Растворимые молекулы рецептора β-лимфотоксина согласно изобретению могут конкурировать за поверхностное связывание лиганда с эндогенными рецепторами β-лимфотоксина на поверхности кле ток. Предусматривается, что любая растворимая молекула, содержащая лиганд-связывающий домен рецептора β-лимфотоксина, способный конкурировать с рецепторами β-лимфотоксина на поверхности клеток за связывание лиганда лимфотоксина, представляет собой агент, блокирующий рецептор β-лимфотоксина согласно изобретению.

Источник антител против рецептора βлимфотоксина.

В соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения антитела против рецептора β-лимфотоксина человека функционируют как агенты, блокирующие рецептор β-лимфотоксина.

Антитела против рецептора β-лимфотоксина (анти-ΕΤβ-Β АЬк) согласно изобретению могут быть поликлональными или моноклональными (тАЬк) и могут быть модифицированы для оптимизации их способности блокировать передачу сигналов рецептора βлимфотоксина, их биодоступности 1п у1уо, стабильности или других желательных свойств.

Поликлональные антисыворотки против рецептора β-лимфотоксина человека получают с применением известных способов путем подкожного введения животным, таким как коза, кролик, крыса, хомяк или мышь, слитого белка иммуноглобулина с рецептором β-лимфотоксина (пример 1) в полном адъюванте Фрейнда с повторной внутрибрюшинной или подкожной бустер-инъекцией в неполном адъюванте Фрейнда. Поликлональные антисыворотки, содержащие требуемые антитела против рецептора β-лимфотоксина, подвегают скринингу путем обычных иммунологических процедур.

Моноклональные антитела мышей против слитого белка ΕΤβ-Β-Ι§ человека получают в соответствии с описанием, приведенным в параллельной заявке заявителей, серийный № 08/505606, США, поданной 21 июля 1995 г. Клеточная линия гибридомы (ΒΌ.Α8.ΑΒ9), вырабатывающая мышиные моноклональные антитела ΒΌΑ8 против рецептора β-лимфотоксина человека, была депонирована 12 января 1995 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС) (ВоскуШе, МИ), в соответствии с условиями Будапештского договора, и ей был присвоен порядковый номер АТСС НВ11798. Все ограничения по доступности вышеуказанных депозитов АТСС будут бесповоротно сняты после выдачи патента по данной заявке.

С применением стандартных методов рекомбинантной ДНК могут быть получены различные формы антител против рецептора βлимфотоксина (Ат!ег апб М11к!ет, №11иге. 349, рр. 293-299 (1991)). Например, могут быть сконструированы химерные антитела, в которых антиген-связывающий домен из антитела человека связан с константным доменом человека (например, СаЬШу е! а1., ИЗ 4816597; Моткоп е!

а1., Ргос. Αсаб. Зс1. υ.3.Α., 81, рр.6851-6855 (1984)). Химерные антитела уменьшают наблюдаемые иммунные ответы, вызываемые антителами животных, будучи использованными для клинического лечения людей.

Кроме того, могут быть синтезированы рекомбинантные очеловеченные антитела, распознающие рецептор β-лимфотоксина. Очеловеченные антитела представляют собой химеры, в основном включающие последовательности 1дО человека, в которые вставляют участки, ответственные за специфическое связывание антигенов (например, АО 94/04679). Животных иммунизируют желаемым антигеном, соответствующие антитела выделяют и часть последовательностей с вариабельными участками, ответственными за специфическое связывание антигенов, удаляют. Полученные от животных антигенсвязывающие участки затем клонируют в соответствующую позицию генов антител человека с удаленными антигенсвязывающими участками. Очеловеченные антитела сводят к минимуму применение гетерологичных (межвидовых) последовательностей в антителах человека, что снижает вероятность нежелательных иммунных реакций в процессе лечения.

Конструирование различных классов рекомбинантных антител против рецепторов βлимфотоксина может быть также осуществлено путем получения химерных или очеловеченных антител, включающих в себя антитела против вариабельных доменов рецепторов βлимфотоксина и константные домены человека (СН1, СН2, СН3), выделенные из иммуноглобулинов различных классов. Например, 1дМантитела против рецепторов β-лимфотоксина с повышенной валентностью антигенсвязывающих сайтов могут быть получены рекомбинантным способом путем клонирования антигенсвязывающего сайта в векторы, несущие константные участки с μ-цепью иммунглобулина человека (Лпбапапбат е! а1., 1. Ехр. Меб., 177, рр. 1439-1450 (1993); Ьапе е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1., 22, рр. 2573-2578 (1993); Тгаипескег е! а1., №11иге. 339, рр. 68-70 (1989)).

Кроме того, стандартные методы рекомбинантной ДНК могут быть использованы для изменения аффинности связывания рекомбинантных антител с их антигенами путем изменения аминокислотных остатков вблизи от антигенсвязывающих сайтов. Антиген-связывающая аффинность очеловеченного антитела может быть усилена с помощью мутагенеза, основанного на молекулярном моделировании (Онееп е! а1., Ргос. Αсаб. Зск υ.3.Α., рр. 10029-10033 (1989); АО 94/04679).

Может возникнуть необходимость увеличить или уменьшить аффинность антител против рецепторов β-лимфотоксина к рецепторам β-лимфотоксина в зависимости от типа тканимишени или конкретной схемы лечения. На пример, может возникнуть необходимость лечения пациента, поддерживая постоянный уровень антител против рецепторов β-лимфотоксина с пониженной способностью передавать сигналы по пути β-лимфотоксина с целью полупрофилактического лечения. Подобным образом, ингибиторные антитела против рецепторов βлимфотоксина с повышенной аффинностью по отношению к рецепторам β-лимфотоксина могут оказаться предпочтительными для краткосрочного лечения.

Источник антител против поверхностных лигандов лимфотоксина.

Другой предпочтительный вариант осуществления данного изобретения предусматривает композиции и способы, включающие антитела против лиганда лимфотоксина, действующего как агенты, блокирующие рецепторы βлимфотоксина. Как описано выше для антител против рецепторов β-лимфотоксина, антитела против лигандов лимфотоксина, функционирующие в качестве агентов, блокирующих рецепторы β-лимфотоксина, могут быть поликлональными или моноклональными и могут быть модифицированы в соответствии с рутинными процедурами для модулирования их антиген-связывающих свойств и их иммуногенности.

Антилимфотоксиновые антитела согласно изобретению могут быть получены конкретно против одной или двух субъединиц, включая растворимые, мутантные, измененные и химерные формы субъединицы лимфотоксина. Если субъединицы лимфотоксина используют в качестве антигена, предпочтительно, чтобы это были субъединицы β-лимфотоксина. При использовании субъединиц α-лимфотоксина предпочтительно, чтобы полученные антитела против αлимфотоксина связывались с поверхностным лигандом лимфотоксина и не вступали в перекрестную реакцию с секретируемым α-лимфотоксином или модулировали активность рецептора ΤΝΕ (в соответствии с анализами, описываемыми в параллельной заявке заявителей № 08/505606, США, поданной 21 июля 1995 г.).

Альтернативно, антитела против гомомерных (ΕΤβ) или гетеромерных комплексов (ΕΤα/β), содержащих одну или несколько субъединиц лимфотоксина, могут быть получены и подвергнуты скринингу на активность как агенты, блокирующие рецепторы β-лимфотоксина. Комплексы ΕΤα1/β2 предпочтительно используют в качестве антигена. Как указывалось выше, предпочтительно, чтобы полученные антитела против ΕΤα1/β2 связывались с поверхностным лигандом лимфотоксина, не связываясь с секретируемым α-лимфотоксином и не воздействуя на активность рецептора ΤΝΕ.

Получение поликлональных антител против α-лимфотоксина человека описано в одновременно рассматриваемой заявке заявителя (АО 94/13808). Моноклональные антитела против α-лимфотоксина и β-лимфотоксина также описаны (Вго^шпд е! а1., 1. 1ттипо1., 154, рр. 33-46 (1995)).

Мышиные моноклональные антитела против β-лимфотоксина человека получают в соответствии с описанием, приведенным в параллельной заявке заявителя, серийный № 08/505606, США, поданной 21 июля 1995 г. Клеточная линия гибридомы (В9.С9.1), вырабатывающая мышиные моноклональные антитела В9 против рецептора β-лимфотоксина человека, была депонирована 21 июля 1995 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС) (ВоскуШе, МО) в соответствии с условиями Будапештского договора, и ей был присвоен порядковый номер АтСс НВ 11962.

Моноклональные антитела хомяка против мышиного α/β-лимфотоксина получают в соответствии с описанием, приведенным в параллельной заявке заявителя, серийный № 08/505606, США, поданной 21 июля 1995 г. Линия клеток гибридомы (ВВ.Е6.1), вырабатывающая моноклональные антитела хомяка против мышиного α/β-лимфотоксина, ВВ.Е6 тАЬ, была депонирована 21 июля 1995 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС) (ВоскуШе, ΜΌ) в соответствии с условиями Будапештского договора, и ей был присвоен порядковый номер АТСС НВ 11963.

Все ограничения по доступности вышеуказанных депозитов АТСС будут бесповоротно сняты после выдачи патента по данной заявке.

Применение растворимого ΕΤβ-Β-Ι§ для ингибирования иммунологических функций поверхностного комплекса лимфотоксина.

Далее следует описание действия реагента, связывающего поверхностный лимфотоксин, слитого белка, содержащего внеклеточный домен мышиного рецептора β-лимфотоксина и петлю, СН2- и СН3-домены 1дС 1 человека (ΕΤβ-Β-Ιβ), на выработку и характер ответов иммуноглобулина, на поддержание клеточной организации вторичных лимфоидных тканей, включая действие на состояние дифференцировки фолликулярных дендритных клеток и образование зародышевых центров, а также на уровень экспрессии адрессина, влияющего на направленную миграцию клеток.

Многократные инъекции мышам ΕΤβ-Β-Ι§ изменяют организацию лимфоцитов селезенки и экспрессию функциональных маркеров клетками маргинальной зоны селезенки.

Действие блокады поверхностного лимфотоксина на структуру селезенки изучают, впрыскивая мышам 6 недель подряд (1 раз в неделю) ΕΤβ-Β-Ι§. Затем мышей подвергают иммунизации эритроцитами барана и через 4 дня еще раз впрыскивают ΕΤβ-Β-Ι§. На 10-й день после введения эритроцитов барана мышей умерщвляют. Иммуногистохимическое окрашивание заморо женных срезов селезенки обнаруживает несколько гистологических изменений. После введения ΕΤβ-Κ-Ι§ фолликулы, включающие компартмент В-клеток селезенки у нормальных мышей, более не являются дискретными. Вместо этого В-клетки теперь организованы в виде диффузной полосы, окружающей участки с Тклетками (фиг. 2В), а граница между зонами Ти В-клеток нарушена (фиг. 2В). В противоположность этому, у контрольных мышей, получавших ЬЕА-3-1д, фолликулы В-клеток селезенки являются дискретными и имеется четкая граница между областями Т- и В-клеток (фиг. 2А).

Экспрессия поверхностных маркеров клеток, распознаваемых моноклональными антителами ΕΚ-ΤΚ-9 и МОМА-1, отсутствует у двух различных популяций макрофагов, размещающихся в маргинальной зоне селезенки мышей, получавших ΕΤβ-Κ-Ι§. Известно, что ΕΚ-ΤΚ-9 окрашивает маркер на макрофагах маргинальных зон (Иукйга е! а1., 1ттипо1., 55, 23-30 (1985)), а МОМА-1 окрашивает маркер на металлофильных макрофагах (Кгаа1 апб .Тапке, 1ттипо1., 58, 665-669 (1986)) (фиг. 2Ό, Е соответственно). Эти маркеры экспрессированы на клетках контрольных мышей, получавших ЬЕА3-Ι (фиг. 2С, Е). Экспрессия сиалоадгезина, другого маркера МОМА-1 + микрофаги в маргинальной зоне селезенки мышей, у мышей, получавших ΕΤβ-Κ-Ι§, также отсутствует (не показано).

Антитело МЕСА-367 связывает адгезивную молекулу и адрессин слизистой МабСАМ1, первоначально описанный на эндотелиальных клетках в пейеровых бляшках, мезентериальных лимфатических узлах, интестинальной слизистой оболочке и 1атша ргорйа (Бпккт е! а1., №11иге, 363, рр. 461-464 (1993); Иакаске е! а1., №11иге, 337, рр. 179-181 (1989)). Также описана экспрессия МАбСАМ-1 в маргинальной зоне селезенки (предположительно экспрессируемой на эндотелиальных клетках небольших терминальных артериол, выходящих на маргинальный синус) и на ретикулярной сетчатой структуре в зародышевых центрах (Кгаа1 е! а1., Ат. I. Ра!ко1., 147, рр. 763-771 (1995)) (фиг. 26). Окрашивание МЕСА 367 срезов от мышей, получавших ΕΤβ-Κ-Ι§, показывает, что экспрессия МАбСАМ-1 в селезенке была погашена (фиг. 2Н).

Подобным образом, окрашивание антителом ΕΚ-ΤΚ-7 (Уап Уйе! е! а1., Су!оскет., 34, рр. 883-890 (1986)), отличающее популяцию ретикулярных фибробластов в маргинальной зоне (фиг. 2Ι), распределяется аномально и сильнее в белой пульпе животных, получавших ΕΤβ-Κ-Ι§, чем кЕА-3-Ιβ (фиг. 21). Изменения, наблюдаемые у мышей, получавших ΕΤβ-Κ-Ι§, не зависели от воздействия антигена, поскольку рисунок окрашивания у иммунизированных мышей, по лучавших ΕΤβ-Κ-Ι§, был идентичным (не показано).

Образование зародышевых центров прекращается и фолликулярные дендритные клетки не обнаруживаются в селезенке мышей, получавших ΕΤβ-Κ-Ι§.

Для определения на гистологическом уровне, влияют ли многократные инъекции мышам ΕΤβ-Κ-Ι§ на иммунный ответ на эритроциты барана, проводят исследование образования зародышевых центров и распределения фолликулярных дендритных клеток (ЕЭС) в ответ на праймирование антигена. Замороженные срезы селезенки мышей, предварительно многократно получавших ΕΤβ-Κ-Ι§ или ЬЕА-3Ι§, как указано в описании к фиг. 2, окрашивали арахисовым агглютинином, чтобы выявить зародышевые центры, а также антителом М1 для выявления фолликулярных дендритных клеток, клеточного компонента, необходимого для образования зародышевых центров (Зсйпеуег апб ИаДег, Абу. Iттипо1., 51, рр. 243-248 (1992); Τе\ν е! а1., Iттипо1. Кеу., 1127, рр. 185-211 (1990). Взаимодействие лигандов ί.Ό40-ί.Ό40 также оказалось важным для образования зародышевых центров (Еоу е! а1., I. Ехр. Меб., 180, рр. 157-163 (1994)). Таким образом, для сравнения группа мышей получает МК1, антитело против мышиного лиганда СИ40, после системы инъекций, которые, как показали ранее, ингибировали образование зародышевых центров (Нап е! а1., I. Iттипо1., 155, рр. 556-567 (1995)). Через 10 дней после стимулирования эритроцитами барана у мышей, получавших контрольный белок иммуноглобулина ЬЕА-3, развиваются многочисленные ярко окрашенные зародышевые центры РИА в селезенке (фиг. 3А). Зародышевые центры не обнаруживаются в селезенке мышей, получавших ΕΤβ-Κ-Ι§ или МК1 (фиг. 3В, С соответственно). Однако действие МК1 и ΕΤβ-Κ-Ι§ может быть обнаружено с помощью двух других наблюдений. Окрашивание фолликулярных дендритных клеток (ЕИС-М1) в зародышевых центрах (фиг. 3Ό) отсутствует в селезенке мышей, получавших ΕΤβ-Κ-Ι§ (фиг. 3Е), но все еще присутствует в селезенке мышей, получавших МК1 (фиг. 3Е). Подобные наблюдения были проведены с применением антитела ЕИС-М2 для окрашивания фолликулярных дендритных клеток (не показано). Таким образом, введение ΕΤβ-Κ-Ι§ приводит к изменениям фенотипа фолликулярных дендритных клеток в селезенке и к отсутствию образования зародышевых центров.

Помимо окрашивания зародышевых центров, РИА также окрашивает маргинальную зону в селезенке нормальных мышей. Такое окрашивание также было отмечено у мышей, получавших кЕА-3-Ιβ (фиг. 3А) и МК1 (фиг. 3С), но отсутствовало в селезенке мышей, получавших ΕΤβ-Κ-Ι§ (фиг. 3В).

Экспрессия сиалоадгезина, МОМА-1, ЕКТК-9, ЕК-ТК-7 и МабСАМ-1 в селезенке мышей, получавших МК1, также оказалась нормальной (не показано), еще более подчеркивая молекулярные эффекты действия сигналирования ΓΌ40 и рецептора β-лимфотоксина.

Кинетика изменений, индуцированных ЬТв-КЛд, в организации лимфоцитов селезенки и экспрессии маркеров клеток маргинальной зоны.

Изучали количество инъекций ЬТв-КЧд, необходимых для воздействия на организацию лимфоцитов и экспрессию маркеров клеток маргинальной зоны в селезенке. ЬТв-КЧд вводили мышам внутрибрюшинно один или несколько раз, как показано в табл. 1. Некоторые мыши были затем также иммунизированы эритроцитами барана в день последней инъекции ЬТв-КИд. Экспрессию В220 и СЭ4 на В- и Тклетках соответственно, а также окрашивание ΡΝΑ (для зародышевых центров) и МЕСА 367 (для МАбСАМ-1), МОМА-1, ЕК-ТК-9 и Р1)СМ1 оценивали на замороженных срезах селезенки подвергнутых обработке мышей. Кинетика исчезновения окрашивания металлофильных макрофагов, макрофагов маргинальной зоны, МАбСАМ-1, зародышевых центров и фолликулярных дендритных клеток оказалась различной.

Одной инъекции ЬТв-КЧд достаточно для устранения окрашивания МАбСАМ-1 неделю спустя. После трех еженедельных инъекций ЬТв-КИд окрашивание зародышевых центров и фолликулярных дендритных клеток не обнаруживалось, а компартменты лимфоцитов Т/В оказались прерванными. Требуется, как минимум, 4 инъекции ИТв-К-[д для устранения окрашивания металлофильных макрофагов. Шесть инъекций ЬТв-КИд не устраняли полностью окрашивания макрофагов маргинальной зоны антителом ЕК-ТК-9 (также показано на фиг. 2Ό).

Более точный анализ быстрого ингибирования окрашивания МОМА-1, МАбСАМ-1, РИС-М1, РИС-М2 и СК-1 после одной инъекции ЬТв-КИд проводили в отсутствие антигена (табл. 2).

Таблица 1

Действие ЬТв-Кбд на организацию селезенки и образование зародышевых центров в ответ на введение эритроцитов барана взрослым мышам

Количество инъекций ΓΙ'β-Η-Γ	Организация Т/В-клеток	Металлофильные макрофаги*	Макрофаги маргинальной зоны*	Экспрессия МАбСАМ-1*	Зародышевые центры#	Фолликулярные дендритные клетки*
0	нормальная	+++	+++	+++	+++	+++
1	нормальная	++	+++		+	+
2	слегка аномальная	+	+++		не провод.	+/-
3х	прерванная	+	++		не провод.	не провод.
4х	прерванная	+/-	++		не провод.	не провод.
5х	прерванная	-	+		не провод.	не провод.
6	прерванная	-	+/-		-	-

Мышам вводили внутрибрюшинно по 100 мкг ЬТв-КИд еженедельно в течение 1-5 недель, а затем умерщвляли. Если не указано иначе, ЬТв-КИд вводили перед введением внутрибрюшинно эритроцитов барана (100 мкл 10% суспензии), причем последнюю инъекцию ЬТв-Кделали в тот же день, что и инъекцию антигена. Животных умерщвляли через 10 дней после инъекции эритроцитов барана. Замороженные срезы селезенки дважды окрашивали биотинилированным крысиным антителом против мышиного В220 и крысиным антителом против мышиного СЭ4, а затем стрептавидинщелочной фосфатазой и мышиной противокрысиной иммуноглобулин-пероксидазой соответственно. Срезы селезенки также окрашивали следующими мышиными антителами против крысиных макрофагов маргинальной зоны (ЕКТК-9), крысиных металлофильных макрофагов (МОМА-1), крысиных МАбСАМ-1 (МЕСА 367) и крысиных фолликулярных дендритных клеток (РИС-М1), а затем мышиной антикрысиной им муноглобулин-пероксидазой. Дополнительный набор замороженных срезов окрашивали биотинилированным арахисовым агглютинином (ΡNΑ-биотин), а затем стрептавидин-пероксидазой для выявления зародышевых центров. Проводили наблюдения срезов, по меньшей мере, от 3 животных на группу.

* Интенсивность окрашивания оценивали на глаз: нормальное окрашивание - +++, пониженное окрашивание - ++, слабое окрашивание + и отсутствие окрашивания - Интенсивность окрашивания на срезах от неподвергавшихся инъецированию животных и от животных, получавших ЕБА-3-[д, оценивали относительно нормального окрашивания.

# Количество зародышевых центров на срезе селезенки определяли следующим образом: 10 - +++, 5-10 - ++, 1-5 - +, отсутствие - ^х Животные из этих групп не получали эритроцитов барана.

Таблица 2

Точное время влияния ЬТР-В-Тд на окрашивание МОМА-1, МАбСЛМ-1, СК1, ЕРС-М1 и ЕРС-М2

Дни после разовой инъекции ^β-Κ-Ι^
	0	1	3	5	7	10	14
МОМА-1*	+++	+++	+++	+++		++	++	+
МАбСАМ-1*	+++	+/-	-	-	-	-	-
СК1*	+++	+++	++	++	++	++	+
РБС-М1*	+++	+/-	-		-	-	-	-
РБС-М2*	+++	+/-	-	-	-	-	-

5-6-недельные мыши Ва1Ь/с получали по одной внутрибрюшинной инъекции (100 мкг) ΡΤβ-Κ-Ιμ или иммуноглобулина человека. Мышей из каждой группы умерщвляли на 0-й, 1-й, 3-й, 5-й, 7-й, 10-й и 14-й день. Замороженные срезы селезенки окрашивали следующими антителами: крысиными, против мышиных металлофильных макрофагов (МОМА-1), крысиными, против мышиных МАбСАМ-1 (МЕСА 367), крысиными, против мышиных фолликулярных дендритных клеток (ЕРС-М1), крысиными, против мышиных фолликулярных дендритных клеток (ЕРС-М2) и мечеными биотином крысиными, против мышиных СК1, а затем мышиной антикрысиной иммуноглобулин-пероксидазой (МОМА-1, МАбСАМ-1, ЕРС-М1, ЕРС-М2) или меченым пероксидазой стрептавидином (СК1).

* Интенсивность окрашивания оценивали на глаз: нормальное окрашивание - +++, пониженное окрашивание - ++, слабое окрашивание + и отсутствие окрашивания - Интенсивность окрашивания на срезах от неподвергавшихся инъецированию животных и от животных, получавших иммуноглобулин человека, принимали в качестве стандарта нормального окрашивания. Анализу подвергали срезы, по меньшей мере, от двух животных на группу.

Мышей Ва1Ь/с, получивших по одной внутрибрюшинной инъекции ΕΤβ-Κ-Ι§, умерщвляли каждый день в течение 14 дней после инъекции, а их селезенки удаляли и замораживали. Замороженные срезы селезенки окрашивали МОМА-1, анти-МАбСАМ-1 (МЕСА-367) и ЕИС-специфичными реагентами: антителами ЕРС-М1, ЕРС-М2 и анти-СКТ Через день после инъекции ΡΤβ-Κ-Ιμ окрашивание реагентами анти-МАбСАМ-1, ЕРС-М1 и ЕРС-М2 существенно снижалось (табл. 2). Более быстрое ингибирование окрашивания ЕРС-М1 в этом эксперименте по сравнению с результатами, представленными в табл. 1, возможно происходило благодаря интенсивности окрашивания ЕИСМ1, более сильной у иммунизированных животных. Окрашивание СК1 все еще обнаруживалось на 14-й день, показывая тем самым, что фолликулярные дендритные клетки все еще присутствуют на 3-й день после введения ΕΤβКЧд, но что экспрессия маркеров, обнаруживаемых с помощью ЕРС-М1 и ЕРС-М2, снижается. Таким образом, введение ΡΤβ-Κ-Ιμ изменяло фенотип фолликулярных дендритных кле ток. Наконец, окрашивание МОМА-1 снижалось, но все еще обнаруживалось на 14-й день.

Многократное введение ΡΤβ-Κ-Ιμ ингибирует экспрессию адрессина в лимфатических узлах.

Мы исследовали экспрессию адрессина в лимфатических узлах потомства беременных мышей Ва1Ь/с с одинаковым сроком, которым на 14-й и 17-й день беременности вводили внутривенно по 200 мкг белков иммуноглобулинрецептор. После рождения потомству либо ничего не вводили, либо один раз в неделю вводили внутрибрюшинно по 100 мкг ΕΤβ-Η-Ι§, ΤΝΕК55-1д или ЬЕА-3-1д. Как показали методом ЕЫ8А, уровень слитых белков остается на уровне или выше 10 мкг/мл на протяжении всей жизни (не показано). Иммуногистохимическое окрашивание МЕСА367 и МЕСА79 показывает, что МАбСАМ-1 и периферические адрессины лимфатических узлов полностью отсутствуют в мезентериальных лимфатических узлах мышей, получавших на протяжении всей жизни ΡΤβ-Κ1д (фиг. 4А, В). Сакральные лимфатические узлы этих мышей также не экспрессировали никаких адрессинов, а цервикальные и подвздошные лимфатические узлы не обнаруживали периферического окрашивания (не показано). Регуляция экспрессии адрессина по типу обратной связи является обратимой, поскольку экспрессия достигает нормального уровня у животных, получавших инъекции только внутриутробно (фиг. 40, Н). У мышей, получавших на протяжении всей жизни по 100 мкг в неделю ΤΝΕК55-1д или ЬЕА-3-1д, экспрессия адрессина в лимфатических узлах остается не сравнимой с экспрессией у мышей, не получавших инъекций (фиг. 4С, Ό, Е, Е).

Расположение β-лимфоцитов и экспрессия маркеров макрофагов в лимфатических узлах мышей, получавших ΕΤβ-Κ-Ι§, меняются.

Антитела, связывающие маркеры популяций макрофагов в субкапсулярном синусе лимфатических узлов (аналогично маргинальной зоне селезенки), использовали для проведения иммуногистохимического анализа лимфатических узлов, взятых у мышей, получавших во время беременности и непрерывно после рождения ΕΤβ-Β-Ι§, ΤΝΡ-Κ.55-Ι§ или ЕЕА-3-1д, как указано в вышеприведенном описании к фиг. 4. Флуоресцентные изображения анализировали с применением математического обеспечения для анализа изображений. Было установлено, что экспрессия сиалоадгезина в лимфатических узлах мышей, получавших растворимый ^β-Β(фиг. 5В), снижается, в отличие от лимфатических узлов мышей, получавших Т№-В55-1д или ЬРА-3-1д (фиг. 5Е, Н). Экспрессия МОМА-1 на макрофагах субкапсулярного синуса все еще обнаруживалась в лимфатических узлах мышей, получавших ^β-Β-^ (фиг. 5С).

Оценивали также эффект непрерывного действия ^β-Β-^ на организацию лимфоцитов в лимфатических узлах. Срезы лимфатических узлов окрашивали шАЬз, специфичными по отношению к маркеру В-клеток В220 и маркеру Тклеток СЭ4. Для идентификации областей наложения зон Т- и В-клеток применяли анализ изображения. Введение ^Тβ-Β-Iд вызывает растворение фолликул В-клеток таким образом, что В-клетки присутствуют в диффузной полосе на внешней границе области Т-клеток (фиг. 5А). Несмотря на растворение фолликулярной структуры В-клеток, эти клетки не присутствуют в областях Т-клеток, вместо этого они появляются в областях, аномально занятых лимфоцитами. Очень похожий рисунок окрашивания Т- и Вклеток наблюдался у мышей, всю жизнь получавших по 100 мкг в неделю Т№-В55-1д, но не ЬРА-3-1д (фиг. 5Ό). Фолликулы В-клеток вновь прерываются и В-клетки присутствуют в областях лимфатических узлов, в которых лимфоциты обычно не обнаруживаются. Наложения Вклеток на Т-клетки не наблюдается.

Введение ШТ[3-К-1д мышам ингибирует ответ антител 1дМ и 1дС.

Неспособность зародышевых центров селезенки образовывать последующее праймирование эритроцитов барана у мышей, многократно получавших ^[1-6-^ (как на фиг. 3), предполагает изменения гуморального иммунного ответа этих мышей. С целью непосредственного исследования этого взрослым мышам делали по 6 инъекций (один раз в неделю) ^[1-6-^ или ЬРА-3-1д, а затем их праймировали эритроцитами барана. У мышей брали кровь на 7-й и 14-й день после иммунизации и анализировали ее на присутствие в сыворотке 1дМ и 1дС, специфичных к эритроцитам барана, с применением анализа на гемагглютинацию. Через 7 дней после иммунизации эритроцитами барана титр 1дМ оказывался нормальным, но ответ 1дС существенно снижался у мышей, получавших ЕТ1-В1д, по сравнению с мышами, получавшими иммуноглобулин человека или забуференный фосфатом физиологический раствор (фиг. 6А). На 14-й день после иммунизации 1дС, специфичный к эритроцитам барана, все еще не обнаруживался в сыворотке мышей, получавших ^[1-6-^, а титр 1дМ, специфичного к эритроцитам барана, у этих мышей также снижался более чем наполовину, по сравнению с мышами, получавшими иммуноглобулин человека или забуференный фосфатом физиологический раствор (фиг. 6А).

Через 10 дней после праймирования эритроцитами барана зародышевые центры обнаруживаются в селезенках мышей, один или два раза получавших иммуноглобулин рецептора βлимфотоксина, однако, количество зародышевых центров существенно снижается по сравнению с контролем (табл. 1). Если мыши получают по две инъекции иммуноглобулина рецептора β-лимфотоксина, первую инъекцию за неделю до праймирования эритроцитами барана, а вторую инъекцию - в день инъекции эритроцитов барана, то ингибирование ответов 1дМ и 1дС на эритроциты барана на 7-й и 14-й день (фиг. 6В) подобно ингибированию, обнаруживаемому в тех случаях, когда мыши получают многократные инъекции ^β^-^ (фиг. 6А). На 30-й день после иммунизации 1дС, специфичный к эритроцитам барана, не обнаруживается, а уровень 1дМ снижается более чем на 80% по сравнению с контролем (фиг. 6В). Таким образом, такие протоколы введения ^β^-^ приводят к полному ингибированию ответов 1дС, а также к сокращенному/сниженному ответу 1дМ относительно контроля.

Если мыши получали разовую инъекцию иммуноглобулина рецептора β-лимфотоксина в тот же день, что и праймирование эритроцитами барана, уровень ответа 1д6 и 1дМ на эритроциты барана на 7-й день был сравним с уровнем в контрольных группах (фиг. 6С). Однако на 24-й день после иммунизации титры 1дМ и 1дС снижались на 30%. На 34-й день после праймирования эритроцитами барана титр 1дМ, специфичного к ним, снижался на 50% по сравнению с контрольными группами, а 1дС, специфичного к эритроцитами барана, не обнаруживали (фиг. 6С). Эти данные показывают, что такой протокол введения ^β^-^ приводит к заметному сокращению/снижению уровня непрерывного ответа 1дМ и 1д6, т.е. введение ^Тβ-Β-Iд способно ингибировать уже инициированный гуморальный ответ.

Заболевания, вызванные антителами

Многие органоспецифичные и мультисистемные аутоиммунные состояния включают в себя ответы патологических антител. Такие состояния включают в себя миастению Οπινίδ, аутоиммунную гемолитическую анемию, болезнь Чагаса, болезнь Грейвса, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (1ТР), системную красную волчанку, гранулематоз Вегенера, нодозный полиартрит и быстро прогрессирующий серповидный гломерулонефрит (из Веп_)ат1ш е! а1., 1ттипо1оду, А 8йой Соигзе (АйеуЫзз, №х-Уогк, 3й ей. (1996)).

Несмотря на то, что этиология системной красной волчанки неизвестна, имеется достаточно сведений об иммунологическом механизме, отвечающем на наблюдаемую патологию.

По неизвестным причинам пациенты с системной красной волчанкой вырабатывают антитела против ядерных компонентов организма (антинуклеарные антитела явно направлены против нативной двухцепочечной ДНК). Клинически присутствие этих антител лучше всего коррелирует с почечной патологией в системной красной волчанке. Эти антитела образуют комплексы с ДНК, по всей очевидности, образующиеся в результате нарушения нормальной ткани, и, как и при любом заболевании, при котором происходит образование иммунных комплексов, такие комплексы образуют отложения, накапливаемые на базальной мембране гломерул, в стенках артериол и в синовиальном пространстве суставов. Эти комплексы активируют каскад комплементов и привлекают гранулоциты. Последующая воспалительная реакция характеризуется как гломерулонефрит, приводящий к повреждению почек и вызывающий протеинурию и гематурию.

Люпус-нефрит исследовался на моделях мышей в течение нескольких десятилетий. Недавно на такой модели оценивалась терапевтическая эффективность реагента, специфичного к мышиному лиганду ΟΌ40 (МоНап е1 а1., 1. 1ттипо1., 154, рр. 1470-1480 (1995)). Было установлено, что ускорение волчаночного процесса переносом клеток, индуцирующих выработку патогенных антител ίη у1уо, ингибируется введением моноклонального антитела, блокирующего взаимодействие лигандов ΟΌ40/ί.Ό40. Более того, краткий период лечения мышей с волчанкой антителом против лиганда ΟΌ40 оказывает продолжительное благоприятное действе на их спонтанное заболевание еще в течение долгого времени после того, как антитело выведено из системы их организма. Эксперименты показали, что патогенные В-клетки не способны вырабатывать антитело даже через 9 месяцев после терапии, что дает возможность предположить, что существует задержка экспансии аутоиммунных В-клеток памяти, приводящая к длительным положительным терапевтическим результатам. Поскольку мы показали, что реагенты, блокирующие взаимодействие ^Τα/β/^Τβ-Κ ίη у1уо, ингибируют генерацию ответов антитела, изменяют фенотип фолликулярных дендритных клеток и образование зародышевых центров, принимающих участие в оптимальной выработке В-клеток памяти, блокирующие реагенты ^Τα/β/^Τβ-Κ согласно изобретению могут быть использованы для лечения или профилактики системной красной волчанки.

Нормальный иммунный ответ на некоторые патогенные инфекционные агенты также вызывает ответы антитела, которые могут стать чрезмерными и превратиться в медицинскую проблему. Одним из примеров является болезнь Чагаса, воспалительная кардиомиопатия, развивающаяся у людей и экспериментальных жи вотных с хронической инфекцией Τ^ураηокота сги/ϊ. Среди возможных механизмов, участвующих в патогенезе кардиомиопатии Чагаса у людей, в последнее время существенную экспериментальную поддержку получило индуцирование сердечно-специфичных аутоиммунных ответов. Недавние исследования (^Ьейк е1 а1., 1. 1ттипо1., 152, рр.1493-1499 (1994)) показали, что сердечные антиген-специфичные антитела вырабатываются у мышей С57В1/6 с сердечным заболеванием, инфицированных Τ.Οπιζί. После заражения бразильским штаммом Τ.Οπιζί мыши С57В1/6 развивают кардиомиопатию, гистологически похожую на кардиомиопатию, наблюдаемую в хронически инфицируемых людях. Антисыворотки этих мышей реагируют с тремя сердечными антигенами, в то время как мыши С57В1/6, инфицированные штаммом Сиауак БСпи, не вызывающим кардиомиопатию, не вырабатывают таких антител. Эти данные показывают, что такие антитела являются специфическими маркерами кардиомиопатии. Таким образом, подобная модель грызунов может служить для оценки способности агентов, блокирующих рецептор β-лимфотоксина, ингибировать нарушения, вызываемые аутоантителами.

Другим примером клеточной деструкции антителами, вырабатываемыми в результате определенных инфекционных заболеваний или по неизвестным причинам, является идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ΙΤΡ). При таком состоянии антитела против тромбоцитов приводят к их деструкции (комплементарными или фагоцитарными клетками с рецептором Рс или С3Ь), что может вызвать кровотечение. Терапии, ингибирующие такие аутоиммунные реакции, вызванные антителами ίη у1уо, такие как агенты, блокирующие рецептор βлимфотоксина согласно изобретению, могут быть также использованы для лечения или профилактики этих аутоиммунных заболеваний.

Нормальный иммунный ответ на некоторые патогенные инфекционные агенты также вызывает реакции гиперчувствительности, которые могут приобрести чрезмерный характер и превратиться в медицинскую проблему. Наиболее распространенным примером гиперчувствительности Ι типа является аллергическая реакция. Она вызывается антителами 1дЕ, которые связываются через свой Рс-участок с рецепторами на тучных клетках и базофилах для запуска выделения фармакологически активных агентов, вызывающих анафилаксию. Иногда считают, что идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и синдром Гудпасчера принадлежит к реакциям ΙΙ типа, происходящим тогда, когда антитела 1дМ или 1дС связываются с антигеном на поверхности клеток и активируют каскад комплемента. Тогда гранулоциты привлекаются в сайт активации, а нарушение, возникающее в результате выделения литических ферментов из их гранул, приводит к разрушению клеток. Считается, что ревматоидный артрит является результатом реакции гиперчувствительности ΙΙ типа, вызываемой иммунными комплексами антигена (в этом случае ревматоидным фактором является аутоантитело 1дМ), связывающегося с Рс-участком нормального 1дС. Эти иммунные комплексы участвуют в воспалении суставов и повреждениях, характерных для этого заболевания. Поскольку эти патологии частично вызываются антителами, терапевтические агенты, ингибирующие выработку антител, такие как агенты, блокирующие рецептор βлимфотоксина согласно изобретению, могут быть также использованы для лечения или профилактики этих заболеваний.

Лечение с применением агентов, блокирующих рецептор β-лимфотоксина

Композиции согласно изобретению вводят в эффективной дозе для лечения конкретного клинического состояния. Определение предпочтительного фармацевтического состава и режима терапевтически эффективной дозы для конкретного применения зависит от квалификации специалиста, принимающего во внимание, например, состояние и массу тела пациента, степень желаемого лечения и его переносимость пациентом.

Дозы, составляющие приблизительно 1 мг/кг растворимого рецептора β-лимфотоксина, считаются подходящими исходными точками для оптимизации доз лечения.

Терапевтически эффективная доза также может быть определена путем проведения экспериментов ίπ νίΙΐΌ, устанавливающих концентрацию агента, блокирующего рецептор βлимфотоксина, необходимую для покрытия клеток-мишени (рецептор β-лимфотоксина или лиганд-положительные клетки лимфотоксина в зависимости от блокирующего агента) в течение 1-14 дней. Анализы по связыванию рецептора и лиганда, описанные ранее в одновременно рассматриваемой заявке заявителя, серийный № 08/505606, США, поданной 21 июля 1995 г., могут быть использованы для мониторинга реакции покрытия клеток. Рецептор β-лимфотоксина или лиганд-положительные клетки лимфотоксина могут быть отделены от активированных популяций лимфоцитов с применением клеточного сортера с возбуждением флуоресценции. На основании результатов таких анализов по связыванию ш νίΙΐΌ может быть подобран интервал подходящих концентраций агента, блокирующего рецептор β-лимфотоксина, для ипытания на животных.

Введение растворимых молекул рецептора β-лимфотоксина, лиганда антилимфотоксина и согласно изобретению, по отдельности или в сочетании, включая выделенные и очищенные формы антител или комплексов, их солей или их фармацевтически прием лемых производных, может быть осуществлено с применением любых общепринятых способов введения агентов, обладающих иммуносупрессивной активностью.

Фармацевтические композиции, применяемые в такой терапии, также могут иметь различные формы, включающие, например, твердые, полутвердые и жидкие лекарственные формы, такие как таблетки, пилюли, порошки, жидкие растворы или суспензии, суппозитории, а также растворы для инъекций и вливаний. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Способы введения могут включать пероральное, парентеральное, подкожное, внутривенное, местное введение или введение в очаг поражения.

Растворимые молекулы рецептора βлимфотоксина, антитела против лиганда лимфотоксина и ΕΤβ-Κ согласно изобретению, например, могут быть добавлены к стерильным изотоническим составам с кофакторами или без них, стимулирующим поглощение или стабильность. Состав предпочтительно является жидким или может представлять собой лиофилизированный порошок. Например, растворимые молекулы рецептора β-лимфотоксина, антитела против лиганда лимфотоксина и ΕΤβ-Κ согласно изобретению, могут быть разбавлены буферным составом, включающим 5,0 мг/мл моногидрата лимонной кислоты, 2,7 мг/мл тринатрий цитрата, 41 мг/мл маннита, 1 мг/мл глицина и 1 мг/мл полисорбата 20. Этот раствор может быть лиофилизирован, сохранен в холодильнике и восстановлен перед введением водой для инъекций (И8Р).

Композиции также предпочтительно включают известные фармацевтически приемлемые носители, широко применяемые в данной области (см., например, КетнщЮп'к РйагтасеиЦса1 8с1епсек, 161Н ЕбИюп, 1980, Мас РиЬНкЫпд Сотрапу). Такие фармацевтически приемлемые носители могут включать в себя другие лекарственные средства, носители, генетические носители, адъюванты, наполнители и т. д., такие как сывороточный альбумин человека или препараты плазмы. Композиции имеют вид разовой дозы, обычно вводимой один или несколько раз в сутки.

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть также введены с использованием макрофагов, липосом, других систем доставки микрочастиц или составов пролонгированного действия, приводимых в контакт с пораженными тканями или током крови. Подходящие примеры носителей пролонгированного действия включают в себя полупроницаемые полимерные матрицы в виде формованных изделий, такие как суппозитории или микрокапсулы. Имплантируемые или микрокапсулярные матрицы пролонгированного действия включают в себя полилактиды (патент США № 3773319, ЕР 58481), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и этил-Ь-глутамата (81бтап е! а1., В1оро1утег8, 22, рр. 547-556 (1985)), поли(2^:гидроксиэтилметакрилат) или этиленвинилацетат (Ьапдег е! а1., I. Вютеб. Ма1ег. Βе8., 15, рр. 167-277 (1981); Ьапдег, СЬет. ТесЬ., 12, рр. 98105 (1982)).

Липосомы, содержащие растворимые молекулы рецептора β-лимфотоксина, антитела против лиганд лимфотоксина и против ΕΎβ-Β согласно изобретению, отдельно или в сочетании, могут быть получены хорошо известными способами (см., например, ΌΕ 3218121; ЕрДеш е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8сЕ И.8.А., 82, рр. 36883692 (1985); Н\гапд е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8сЕ И8А, 77, рр. 4030-4034 (1980); патенты США №№ 4485045 и 4544545). Обычно это небольшие (около 200-800 А) однослойные липосомы, в которых содержание липидов составляет примерно более 30 мол.% холестерина. Пропорцию холестерина выбирают таким образом, чтобы контролировать оптимальный уровень выделения растворимых молекул рецептора βлимфотоксина, антител против лиганда лимфотоксина и против ЬТв-Β.

Растворимые молекулы рецептора βлимфотоксина, антитела против лиганда лимфотоксина и против ЬТв-Β АЬ§ согласно изобретению, могут быть также прикреплены к липосомам, содержащим другие агенты, блокирующие рецепторы β-лимфотоксина, иммуносупрессивные агенты или цитокины для модулирования активности, блокирующей рецепторы βлимфотоксина. Прикрепление молекул рецепторов β-лимфотоксина, антител против лиганда лимфотоксина и против ΕΓβ-Β АЬ§, к липосомам может осуществляться при помощи любого известного поперечно-сшивающего агента, такого как гетеробифункциональные поперечносшивающие агенты, широко используемые для связывания токсинов или химиотерапевтических агентов с антителами для направленной доставки. Конъюгирование с липосомами может быть также осуществлено с применением карбогидрат-направленного поперечно-сшивающего реагента 4-(4-малеимидофенил)гидразида масляной кислоты (МРВН) (Ьи/дипех е! а1., 1. Се11. ВюсЬет. АЬ§Е 8ирр1., 16Е 77 (1992)).

Преимущества терапевтических композиций, включающих агенты, блокирующие рецепторы β-лимфотоксина

Агенты, блокирующие рецепторы βлимфотоксина согласно изобретению, способны селективно ингибировать иммуноэффекторные механизмы. Ингибирование иммунитета, вызванного антителами, осуществляется многими механизмами, включая регуляцию образования зародышевых центров путем воздействия на функцию фолликулярных дендритных клеток. Иммунитет, опосредованный как антителами, так и клетками, частично ингибируется путем регуляции экспрессии адрессинов, воздействующих таким образом на миграцию лимфоцитов. Таким образом, агенты, блокирующие рецепторы β-лимфотоксина, могут быть использованы для лечения состояний, обостряемых действием антител или аберрантной экспрессией адрессинов. Способность селективно ингибировать такие иммуноопосредованные ответы подходит для лечения аномальных состояний, включая различные аутоиммунные и хронические воспалительные состояния. Как указано выше, лечение таких патологических иммуноопосредованных состояний обычно включает в себя применение иммуномодуляторных и иммуносупрессивных агентов, оказывающих плейотропное действие на широкий спектр типов клеток и иммунологические ответы. Обычно требуются высокие и зачастую цитотоксические дозы этих неспецифических иммуносупрессивных агентов, вызывающих побочное действие.

Способность реагента, ингибирующего ответы антител, улучшать патологический иммунологический ответ подтверждается последними исследованиями люпус-нефрита у мышей. Последнее исследование показывает, что введение антитела, блокирующего путь 0040/0040, ингибирует акселерацию люпус-нефрита, возникающего после переноса клеток, индуцирующих выработку патогенных антител ш у1уо, и оказывает положительное пролонгированное действие на спонтанное заболевание в течение длительного периода времени после выведения антитела из системы. Эти данные показывают, что агенты, блокирующие рецепторы βлимфотоксина согласно изобретению, могут быть использованы для подавления клеточного трансплантата и трансплантата органов, ингибируя процессы, ведущие к возникновению ответов антител.

Агенты, блокирующие рецепторы βлимфотоксина, композиций и способов согласно изобретению могут быть модифицированы для получения желаемого уровня передачи сигналов рецепторов β-лимфотоксина, в зависимости от состояния, расстройства или подвергаемого лечению заболевания. Предусматривается, что абсолютный уровень передачи сигналов рецепторов β-лимфотоксина может контролироваться с помощью концентрации и аффинностей агентов, блокирующих рецепторы β-лимфотоксина, по отношению к соответствующим молекулярным мишеням.

Например, в одном из вариантов осуществления данного изобретения вводят композиции, включающие растворимые молекулы рецепторов β-лимфотоксина. Растворимый рецептор β-лимфотоксина способен эффективно конкурировать с клеточными поверхностными рецепторами β-лимфотоксина за связывание по верхностных лигандов лимфотоксина. Способность конкурировать с поверхностными лигандами лимфотоксина зависит от относительной концентрации растворимых и связанных с клеточной поверхностью молекул рецепторов βлимфотоксина, а также от их сравнительной аффинности связывания лигандов.

Растворимые молекулы рецепторов βлимфотоксина, несущие мутации, повышающие или снижающие связывающую аффинность такого растворимого мутантного рецептора βлимфотоксина с поверхностным лигандом лимфотоксина, могут быть построены с применением стандартных методов рекомбинантной ДНК, хорошо известных специалистам в данной области. Большое количество молекул с сайтнаправленными или случайными мутациями могут быть исследованы на активность действия в качестве агентов, блокирующих рецепторы βлимфотоксина, с применением рутинных экспериментов и описываемых в данной заявке методов.

Подобным образом в другом варианте осуществления данного изобретения антитела против рецептора β-лимфотоксина либо одного, либо нескольких субъединиц лиганда лимфотоксина функционируют в качестве агентов, блокирующих рецепторы β-лимфотоксина. Способность этих антител блокировать передачу сигналов рецепторов β-лимфотоксина может быть модифицирована путем мутации, химической модификации или другими способами, способными изменить эффективную концентрацию или активность антитела, доставляемого объекту.

Способность уменьшить передачу сигналов рецепторов β-лимфотоксина, не ингибируя ее полностью, может оказаться важной для установления или поддержания пониженного уровня передачи сигналов рецепторов βлимфотоксина, поддерживающих нормальную иммунную функцию при ингибировании слишком сильных или аномальных ответов антител или клеточно-опосредованных ответов.

Разрушение гена α-лимфотоксина у мышей ведет к развитию аберрантного периферического лимфоидного органа (Эе Το^ηί е! а1., 8с1епсе, 264, рр. 703-707 (1994)). У таких мышей отсутствуют лимфатические узлы, а в их селезенках отсутствует обычно четкая граница между зонами, обогащенными Т- и В-клетками, в фолликулах. Мы полагаем, что этот фенотип связан с потерей поверхностной, индуцированной лимфотоксином, передачи сигналов рецепторов β-лимфотоксина, поскольку подобные фенотипы не наблюдались при модулировании активности рецепторов ΤΝΡ. Таким образом, способность селективно или частично блокировать пути рецептора β-лимфотоксина может быть использована при лечении аномального развития лимфоидоподобных структур, возни кающих в результате хронического воспаления, связанного с неправильной или избыточной экспрессией сигналов по пути рецептора βлимфотоксина.

Антитела являются решающими медиаторами иммунных ответов на патологические агенты. Таким образом, абсолютное ингибирование ответов антител в определенных обстоятельствах может оказаться нежелательным. Например, антитела требуются для сообщения резистентности против инфекций внеклеточными бактериями, такими как пневмококковые и гемофильные бактерии.

Способность влиять на уровень антител, вырабатываемых путем блокирования передачи сигналов рецепторов β-лимфотоксина, может оказаться существенной при максимизации положительных результатов, которые могут быть достигнуты при лечении агентами, блокирующими рецептор β-лимфотоксина, в соответствии с данным изобретением.

Терапевтические способы согласно изобретению включают в себя селективное ингибирование ответов, частично или полностью зависящих от пути β-лимфотоксина. Как очевидно специалистам в данной области, конкретные случаи терапевтического применения заявленного изобретения зависят от соответствующего этиологического механизма ингибируемого процесса или от поддерживаемого желательного медицинского процесса. Таким образом, способы различных вариантов осуществления данного изобретения включают в себя введение терапевтически эффективного количества агента, блокирующего рецептор β-лимфотоксина или βлимфотоксин. Белки, используемые в этих способах, могут представлять собой либо полноразмерные белки, либо фрагменты белка, либо фрагменты слияния. В других вариантах осуществления данного изобретения способы включают в себя введение растворимого фрагмента, такого как растворимый рецептор βлимфотоксина. В других предпочтительных вариантах осуществления данное изобретение относится к введению антител против рецептора β-лимфотоксина или против β-лимфотоксина. Блокирующие агенты в соответствии с данным изобретением могут вводиться вместе с терапевтически эффективным количеством второго соединения, оказывающего положительное медицинское действие.

Например, в соответствии с некоторыми способами лечения СПИД и/или ВИЧ-инфекции может оказаться желательным совместное введение дополнительных известных антивирусных агентов, например ΑЗΤ или ингибиторов протеазы. Особенно предпочтительным может оказаться введение блокирующих агентов в соответствии с данным изобретением, более предпочтительно белка слияния ΕΤβ-Β/Ι§0 в сочетании с коктейльной терапией СПИД. Такие лекарственные коктейли включают в себя введение пациенту нескольких лекарственных препаратов для снижения количества вирусов в системе организма пациента.

Композиции согласно изобретению могут быть составлены в соответствии со стандартной практикой, например, с применением носителя. Термин фармацевтически приемлемый носитель означает один или несколько органических или неорганических ингредиентов, натуральных или синтетических, которые могут облегчить введение блокирующих агентов в соответствии с данным изобретением пациенту. Подходящие носители известны специалистам в данной области.

Любая из композиций в соответствии с данным изобретением может быть введена любым медицински приемлемым способом. Такие способы включают в себя парентеральные инъекции, такие как внутривенные, внутрисосудистые, внутриартериальные, подкожные, внутримышечные, внутриопухолевые, внутрибрюшинные, интраэнтрикулярные, интраэпидуральные и прочие инъекции, а также пероральные, назальные, глазные, ректальные или местные инъекции. Введение препаратов с пролонгированным действием также входит в состав данного изобретения, например Ь-средства, такие как вещества замедленного всасывания или имплантаты. Также может возникнуть необходимость в локализованной доставке. Способы введения легко определяются специалистами в данной области.

Агенты, блокирующие путь лимфотоксина, используемые в заявляемом изобретении, включают в себя функциональные производные растворимого рецептора β-лимфотоксина, а также антитела, заявленные в данном описании. Функциональные производные включают в себя фрагменты, варианты, аналоги или химические производные молекулы. Подразумевается, что фрагмент молекулы, такой как любой из антигенов согласно изобретению, вырастает в любой полипептидной субпопуляции молекулы. Подразумевается, что вариант такой молекулы относится к естественной молекуле, по существу, подобной либо всей молекуле, либо ее фрагменту. Аналог молекулы означает искусственную молекулу, существенно подобную либо всей молекуле, либо ее фрагменту.

Варианты блокирующих агентов согласно изобретению отличаются от естественных агентов аминокислотной последовательностью или другими особенностями, либо тем и другим. Варианты аминокислотной последовательности образуются тогда, когда одна или несколько аминокислот в естественных молекулах замещена другой естественной аминокислотой, ее производным или ненативной аминокислотой. Особенно предпочтительные варианты включают в себя естественные белки или биологически активные фрагменты естественных белков, по следовательности которых отличаются от последовательности дикого типа одним или несколькими консервативными заместителями аминокислоты. Такие замены хорошо известны специалистам в данной области и обычно оказывают минимальное влияние на вторичную структуру и гидрофобную природу блокирующего агента.

В соответствии с другими вариантами воплощения данного изобретения варианты с менее консервативными заменами аминокислот могут также привести к желаемым производным, например путем осуществления решающих изменений, конформации и других биологических свойств. Такие замены включают в себя, например, замену гидрофильных остатков на гидрофобные остатки, замену цистеина или линии рго! (ргоШпе) на другой остаток, замену остатка с небольшой боковой цепью на остаток с большой боковой цепью, или замену остатка, имеющего чистый положительный заряд, на остаток, имеющий отрицательный заряд. Если результат какой-либо замены не может быть предсказан с достаточной определенностью, производные могут быть легко проанализированы в соответствии с описываемыми в данной спецификации способами определения отсутствия или наличия желаемых свойств.

Варианты, входящие в состав данного изобретения, включают в себя белки и пептиды с аминокислотными последовательностями, имеющими, по меньшей мере, 80% гомологию с блокирующими агентами согласно изобретению. Более предпочтительно гомология последовательностей составляет, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95%. С целью определения гомологии следует указать, что длина сравниваемых последовательностей в целом составляет, по меньшей мере, 8 аминокислотных остатков, обычно, по меньшей мере, 20 аминокислотных остатков. Варианты, входящие в состав данного изобретения, также включают в себя любой блокирующий агент, который 1) имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 40% гомологичную последовательности блокирующего агента, а также который 2) после оптимального выравнивания с последовательностью блокирующего агента согласно изобретению имеет, по меньшей мере, 80% своих цистеиновых остатков, выравненных с цистеинами блокирующего агента согласно изобретению.

В объем данного изобретения также входят агенты, специфически связывающиеся с блокирующими агентами в соответствии с настоящим изобретением, включая лиганды и антитела.

Нижеследующие примеры иллюстрируют растворимые рецепторы β-лимфотоксина, антитела против лиганда лимфотоксина и антитела против рецептора β-лимфотоксина согласно изобретению, а также способы, используемые для их характеристики. Эти примеры не должны рассматриваться как ограничивающие: они приводятся с целью иллюстрации, а настоящее изобретение ограничивается только формулой изобретения.

Пример 1. Получение растворимых рецепторов β-лимфотоксина человека в виде белков слияния Ес-иммуноглобулина.

Последовательность клона кДНК человека, выделенная из библиотеки транскрибированных последовательностей 12р человека, полученных из соматического клеточного гибрида (Ваепк е! а1., Сепотюк, 16, рр. 214-218 (1993)), была помещена в банк данных СепВапк и позднее идентифицирована как последовательность, кодирующая рецептор β-лимфотоксина человека. Последовательность этого клона кДНК рецептора β-лимфотоксина человека полной длины может быть получена, начиная с 1992 г., в банке данных СепВапк как позиция Ь04270.

Внеклеточный домен рецептора βлимфотоксина вплоть до трансмембранного участка (фиг. 1) амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции из клона кДНК, используя праймеры, помещающие сайты фермента рестрикции и За11 на концы 5'-и 3'-, соответственно (Вго^шпд е! а1., 1. 1ттипо1., 154, рр.33-46 (1995)). Амплифицированный продукт разрезают с помощью №11 и За11, очищают и лигируют в вектор рМОК.901, линеаризованный вместе с фрагментом За11-№11. кодирующим участок Ес-1дС1 человека. Полученный вектор содержит ген дигидрофолатредуктазы и белок слияния иммуноглобулина рецептора β-лимфотоксина, направляемые отдельными промоторами.

Вектор электропорировали в клетки бЫг СНО (яичников китайского хомячка), а клоны, резистентные к метотрексату, выделяли с использованием стандартных процедур. ΕΤβ-Κ.-Ι§ секретировался в среду и для отбора клеточных линий, вырабатывающих самый высокий уровень белка слияния рецептора, применяли метод ΕΕΚΑ. Высокопроизводительную клеточную линию выращивали до больших объемов, а культуральную среду собирали. Чистый белок слияния рецептора β-лимфотоксина выделяли с помощью высокоскоростной аффинной хроматографии на белок А-сефарозе (Рйагтааа).

Пример 2. Получение растворимых рецепторов β-лимфотоксина мышей в виде слитых белков иммуноглобулина.

Полный клон кДНК рецептора β-лимфотоксина мышей получают путем лигирования фрагментов 5'-Nо!I/Αра^I и 3*-Αра^I/NоΐI из двух частичных изолятов кДНК в сайт №11 рСЭМО (1пУйгодеп, Зап П1едо, СΑ). Последовательность этого клона кДНК доступна в банке данных под кодом υ29173. При сравнении с другой последовательностью рецептора βлимфотоксина мышей в банке данных под ко дом Ь38423 не было обнаружено никаких различий между кодирующими последовательностями.

Растворимый рецептор β-лимфотоксина мышей и слитой белок 1дС1 человека получали путем амплификации полимеразной цепной реакции клона кДНК рецептора ιηΕΤβ-Β полной длины в виде матрицы и праймеров 5' ΑΑСΤΟСΑΟСΟΟССΟССΑΤΟСΟССΤΟССС 3' и 5' ΟΑСΤΤТОΤСΟΑССΑΤТОСΤССТОΟСΤСТОΟΟΟ 3'. Амплифицированный продукт очищали и разрезали с помощью и За11, а также лигировали с помощью фрагмента Ес-1дС1 человека ЗаИ/№И в линеаризованный №И и обработанный фосфатазой ЗΑΒ132 для получения ДЪВ 122. Для устойчивой экспрессии кассету №П, содержащую фрагмент мышиного ΕΤβ-Κ.-Ι§ переносили в сайт рМОК.901, получая

РЗН001, а вектор трансфицировали в клетки СНО (яичников китайского хомячка), как описано Вго^шпд е! а1., 1. 1ттипо1., 154, рр. 33-46 (1995). Клоны клеток, секретирующие мышиный ΕΤβ-Κ.-Ι§ идентифицировали с помощью метода ΕΕΚΑ. Очищенный слитой белок рецептора выделяли из супернатантов клеток СНО (яичников китайского хомячка) с применением высокоскоростной аффинной хроматографии на белок А-сефарозе (Рйагтааа) и использовали в следующих примерах.

Пример 3. Иммуногистохимический анализ селезенки после многократного инъецирования мышей ΕΤβ-Κ.-Ι§.

Мыши в возрасте 4-5 недель получали по 6 инъекций (по одной в неделю) ΕΤβ-Κ.-Ι§ или иммуноглобулина 3-ΕΡΑ (100 мкг внутрибрюшинно) и иммунизацию эритроцитами барана на шестой инъекции слитого белка. Затем мыши пролучали дополнительную инъекцию ΕΤβ-Κ.-Ι§ или иммуноглобулина 3-ΕΡΑ на 4-й день после стимулирования эритроцитами барана. Животных умерщвляли на 10-й день после стимулирования эритроцитами барана, а органы забирали для анализа структуры. Левая колонка фиг. 2 показывает срезы селезенки от животных, получавших иммуноглобулин 3-ΕΡΑ (А, С, Е, С, Ι), а правая колонка - от животных, получавших ΕΤβ-Κ.-Ι§ (В, Ό, Е, Н, 1). Зафиксированные в ацетоне замороженные срезы селезенки дважды окрашивали биотинилированными антителами против мышиных меченых В220 и мышиных ί.Ό4 (А и В), а затем подвергали соответствующему второму окрашиванию щелочным, меченым фосфатазой, стрептавидином (темная фиолетово-синяя окраска) и меченым пероксидазой хрена мышиным антикрысиным иммуноглобулином (светло-коричневая окраска) соответственно. Другой набор замороженных срезов окрашивали ЕВ-ТВ-9 (для выявления макрофагов маргинальных зон, С и Ό), МОМА-1 (для выявления металлофильных макрофагов Е и Е), МЕСА-367 (специфичного к МΑбСΛМ-1, С и

Н), а также антителами ЕК-ТК-7 (для окрашивания ретикулярных фибробластов, I и 1), а затем проводили второе окрашивание меченым пероксидазой хрена мышиным антикрысиным иммуноглобулином (коричневая окраска). Эти снимки показывают характерное окрашивание срезов, как минимум, от 6 животных при 10х увеличении.

Пример 4. Действие ЬТв-КЛд и лиганда анти-СО40 на образование зародышевых центров и окрашивание фолликулярных дендритных клеток.

Животным вводили ЬТв-КЛд или иммуноглобулин 3-ЬРА. Другой группе животных вводили МК1 (антимышиный лиганд СЭ40, 250 мкг/инъекцию, внутрибрюшинно в -1-й, на 1-й и 3-й день, эритроциты барана на 0-й день и умерщвляли на 10-й день. Фиксированные в ацетоне срезы селезенки животных, получавших ^А-БРА (фиг. 3, левая колонка, А и Ό), ЬТв-К(средняя колонка, В и Е), МК1 (правая колонка, С и Р) окрашивали меченым биотином арахисовым агглютинином (верхний ряд, А, В и С) или РЭС-М1 (нижний ряд, Ό, Е и Р), а затем второй раз окрашивали меченым пероксидазой хрена стрептавидином и меченым пероксидазой хрена мышиным антикрысиным иммуноглобулином, соответственно (коричневая окраска). Окрашивание арахисовым агглютинином маргинальной зоны указано стрелками в А и С. Образование зародышевых центров показано белой звездочкой в А. Окрашивание фолликулярных дендритных клеток показано черными стрелками в Ό и Р. Эти снимки показывают характерное окрашивание срезов, как минимум, от 4 животных при 10х увеличении.

Пример 5. Экспрессия адрессина в лимфатических узлах мышей, получавших ЬТв-КЛд внутриутробно и непрерывно после рождения.

В этих экспериментах использовали потомство мышей Ва1Ь/с с одинаковым сроком беременности, которым внутривенно вводили на 14-й и 17-й день беременности по 200 мкг белков рецептор-иммуноглобулин. После рождения потомству один раз в неделю интраперитонеально вводили по 100 мкг ЬТв-КЛд, ΊΝΕК554д или ^РΑ-3-Iд. Как показали методом ЕЫ8А (данные не приведены), содержание слитого белка оставалось на уровне или выше 10 мкг/мл на протяжении всей жизни. Фиг. 4: панели А, В, С и Н: окрашивание лимфатических узлов мышей, получавших ЬТв-КЛд; панели С и Ό: окрашивание лимфатических узлов мышей, получавших ^РΑ-3-Iд; панели Е и Р: окрашивание лимфатических узлов мышей, получавших 1^^55-¾. Панели А, С, Е и С представляют собой мезентериальные лимфатические узлы, окрашенные антителом МЕСА367 для выявления адрессина слизистой, МАбСАМ-1. Панели В, Ό, Р и Н представляют собой периферические (плечевые) лимфатические узлы, окрашенные антителом МЕСА79, специфичным к периферическим адрессинам лимфатических узлов (ΡNΑбк). Панели С и Н представляют собой лимфатические узлы мышей в возрасте 6 недель, получавших ЬТв-КЛд только внутриутробно. Все изображения имеют 50х увеличение.

Пример 6. Расположение лимфоцитов и экспрессия маркеров макрофагов в лимфатических узлах мышей, получавших ЬТв-КЛд внутриутробно и непрерывно после рождения.

Мыши получали ЬТв-КЛд, ТNР-К55-Iд или ГРАА-^ внутриутробно и непрерывно после рождения, как описано в примере 5. Затем участки лимфатических узлов окрашивали антителами, специфичными к маркерам, экспрессируемым макрофагами, или тАЬк, специфичными к маркеру В220 В-клеток и к маркеру СЭ4 Т-клеток. Для идентификации областей наложения зон Т- и В-клеток проводили анализ изображений. Фиг. 5: панели А, Ό и С представляют собой окрашивание В220/СО4 лимфатических узлов мышей, получавших ЬТв-КЛд, иммуноглобулин ЬРА-3 и иммуноглобулин ΊΝΕК55 соответственно. Флуоресцентные изображения анализировали с применением математического анализа изображений. Панели В, Е и Н показывают окрашивание сиалоадгезина, а панели С, Р и I показывают окрашивание МОМА1.

Пример 7. Действие инъекций ЬТв-КЛд на ответ антител на эритроциты барана.

Мышей Ва1Ь/с инъецировали ЬТв-КЛд, иммуноглобулином человека или забуференным фосфатом физиологическим раствором следующим образом. Фиг. 6А: мыши получали по 6 инъекций, как указано в описании к фиг. 2, пример 3. Животным пускали кровь на 7-й день (черные столбики) и на 14-й день (полосатые столбики) после иммунизации эритроцитами барана. 6В: животные получали слитые белки на -7-й день и 0-й день. Эритроциты барана вводили на 0-й день и животным делали кровопускание на 7-й день (черные столбики), 14-й день (полосатые столбики) и на 30-й день (белые столбики). 6С: животные получали белки слияния один раз в 0-й день, одновременно с иммунизацией эритроцитами барана. Кровь собирали на 7-й день (черные столбики), 14-й день (полосатые столбики) и 34-й день (серые столбики).

Титры и ^С, специфичных к эритроцитам барана, определяли путем анализа сыворотки в исследованиях на гемагглютинацию. Титр определяли как величину, обратную последнему разбавлению сыворотки, в котором определяли гемагглютинацию и представляли в виде логарифма по основанию 2 (1 = разбавлению сыворотки 1/15). Результаты представлены в виде средней величины, полученной от четырех различных животных на группу со стандартным отклонением.

Claims (18)

1. Способ изменения гуморального иммунного ответа у животного, включающий в себя стадию введения фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество агента, блокирующего рецептор β-лимфотоксина.

2. Способ по п.1, где агент, блокирующий рецептор β-лимфотоксина, выбран из группы, состоящей из растворимого рецептора βлимфотоксина, антитела против рецептора βлимфотоксина, антитела против поверхностного лиганда лимфотоксина и антитела против βлимфотоксина.

3. Способ по π. 1, где животное является млекопитающим.

4. Способ по п.З, где млекопитающее является человеком.

5. Способ по п.2, где агент, блокирующий рецептор β-лимфотоксина, содержит растворимый рецептор β-лимфотоксина, имеющий лиганд-связывающий домен, способный селективно связываться с поверхностным лигандом βлимфотоксина.

6. Способ по и.5, где растворимый рецептор β-лимфотоксина содержит Ес-домен иммуноглобулина человека.

7. Способ по п.2, где агент, блокирующий рецептор β-лимфотоксина, содержит моноклональное антитело против рецептора βлимфотоксина.

8. Способ по п.7, где композицию вводят на период приблизительно от 1 до 14 дней.

1 εςΡΰΆ,νΡΡΥΑ ЗЕЫОТСШЭЭЕ ΚΕΥΥΕΡφΗΚΙ ССЗВСРРСТУ У£АКС5К1КС 50

51 ТУСАТСАЕ№ ΥΝΕΗΜΝΥΕΤΙ СфЬСКРСОРУ МОЬЕЕТАРСТ ЗКККТфСКСф 100

101 РОМРСААИАЬ ЕСТНСЕЬЪЗО СРРСТЕАЕЬК ϋΕνσΚΟΝΝΗΟ УРСКАСНЕфЫ 150

151 ТЗЗРЗАКСфР ΗΤΚϋΕΝΟΟϋν ΕΑΑΡΟΤΑφδϋ ТТСКИРЬЕРЬ РРЕМЗСТ 197

Фиг. 1

Фиг. 2

9. Способ по п.7, где агент, блокирующий рецептор β-лимфотоксина, содержит шАЬ ΒΌΑ8 против рецептора β-лимфотоксина человека.

10. Способ по п.2, где агент, блокирующий рецептор β-лимфотоксина, содержит моноклональное антитело против поверхностного лиганда β-лимфотоксина.

11. Способ по и. 10, где композицию вводят на период приблизительно от 1 до 14 дней.

12. Способ по и. 10, где антитело направлено против субъединицы лиганда βлимфотоксина.

13. Способ по п.10, где агент, блокирующий рецептор β-лимфотоксина, представляет собой шАЬ В9 против β-лимфотоксина человека.

14. Способ по и. 10, где агент, блокирующий рецептор β-лимфотоксина, представляет собой моноклональное антитело против мышиного поверхностного лиганда лимфотоксина.

15. Способ по п.1, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или адъювант.

16. Способ по π. 1, согласно которому гуморальный иммунный ответ ингибируется.

17. Способ по п.1, согласно которому указанное животное инфицировано вирусом иммунодефицита человека.

18. Способ по и. 17, дополнительно включающий введение противовирусного агента.