BR112020024659A2 - Métodos de uso de cd24 para a prevenção e tratamento de recaída de leucemia - Google Patents

Abstract

métodos de uso de cd24 para a prevenção e tratamento de recaída de leucemia". a presente invenção se relaciona ao uso de uma proteína cd24 para prevenção ou tratamento de recaída de um câncer em um indivíduo. a presente invenção também se relaciona ao uso de uma proteína cd24 para redução da atividade das células estaminais cancerígenas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DOS DE USO DE CD24 PARA A PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE RECAÍDA DE LEUCEMIA". Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a composições e métodos para prevenção e tratamento de recaída de leucemia. Antecedentes da Invenção

[002] Enxerto vs doença do hospedeiro (GVHD) é uma complica- ção que ameaça a vida que ocorre quando as células competentes imunes em um enxerto de tecido montam um ataque imune contra o hospedeiro. O GVHD é mais comumente associado com o transplante de célula hematopoiética (HCT) para o tratamento de malignidades hematológicas. Células T doadoras ativadas danificam células epiteli- ais hospedeiras após uma cascata inflamatória que começa com o re- gime preparativo. O risco exato é dependente da fonte de célula tron- co, idade do paciente, condicionamento, e profilaxia de GVHD usada. A incidência é diretamente relacionada ao grau de disparidade de an- tígenos de leucócito humano (HLA). O início mediano de GVHD agudo é tipicamente 21 a 25 dias após transplante. A incidência varia de 30- 65% em recipientes de transplantes doadores relacionados totalmente histocompatíveis a 60% a 80% em recipientes de células hematopoié- ticas incompatíveis ou células hematopoiéticas de um doador não re- lacionado. Transplante de sangue umbilical tem sido associado com recuperação de neutrófilo mais lenta com incidência inferior e começo mais tarde de GVHD agudo. Fatores que aumentam a incidência in- cluem uso de sangue periférico preferivelmente do que medula óssea como a fonte de células hematopoiéticas e idade mais antiga do reci- piente. O tempo médio de diagnose de GVHD crônico é 4,5 meses após transplante de irmãos idênticos de HLA e 4 meses após trans- plante de doador não relacionado. De novo GVHD crônico quase nun-

ca ocorre após 2 anos após HCT alogeneico.

[003] Há mais de 20 anos, a combinação de um inibidor de calci- neurina (por exemplo, ciclosporina e tacrolimus) com metotrexato tem permanecido o padrão de cuidado para a prevenção de GVHD. Apesar da administração de rotina de profilaxia imune, GVHD clinicamente significante (Grau II-IV) ocorre em aproximadamente 30 a 65% de pa- cientes que suportam HCT relacionado a HLA compatível e 60 a 80% de pacientes que recebem HCT doador não relacionado. O GVHD agudo é um evento precoce após HCT, com um tempo médio para começar de aproximadamente 25 a 30 anos. Em pacientes com GVHD muito severo, as taxas de mortalidade excedem 90%. Uma explanação para isto é que, uma vez estabelecidas, respostas ineficazes ocorrem para terapia de linha de frente com corticosteroides de alta dose em mais do que 50% de pacientes. A sobrevivência é significantemente diminuída para pacientes que demonstram refração de esteroide ou que requerem tratamento prolongado. Mesmo quando bem-sucedido, altas doses de corticosteroides são uma maior fonte de morbidez devi- do a infecções aumentadas e descondicionamento que coloca os pa- cientes em risco significante de TRM.

[004] Os danos do tecido hospedeiro causados pelos regimes de condicionamento de HCT, incluindo quimioterapia de alta dose e/ou irradiação de corpo total (TBI), são considerados serem a primeira etapa no desenvolvimento de GVHD agudo. Os danos do tecido hos- pedeiro causados pelo regime de condicionamento conduzem a libera- ção de citocinas pró-inflamatórias (tais como TNF-α, IL-1β e IL-6), e também a liberação de padrões moleculares associados a dano (DA- MPs) e padrões moleculares associados a patógeno (PAMPs). Ambos DAMPs e PAMPs podem ativar células que apresentam antígeno (APCs), tais como células dendríticas (DCs), por ligação a receptores de reconhecimento padrões (PRRs). Os APCs hospedeiros subse-

quentemente ativam células T doadoras e uma cascata imunológica que resultam na liberação de citocinas pró-inflamatórias e expansão das células T alo-reativas específicas de antígeno que direcionam te- cidos hospedeiros, resultando em GVHD. É, portanto, de maior inte- resse explorar se GVHD pode ser atenuado por direcionamento de resposta hospedeira a danos de tecido, e impedindo ativação de APCs, os processos chaves na iniciação de GVHD.

[005] Até aqui, tratamento e prevenção de GVHD tem predomi- nantemente focalizado em ou inibição ou depleção farmacológica de células T através de abordagens in vivo ou ex vivo para limitar expan- são de células T aloreativas que mediam dano do tecido. Enquanto que estratégias de depleção de célula T não seletivas (por exemplo, globulina antitimócita) são eficazes na prevenção de GVHD, elas não aperfeiçoam a sobrevivência devido a compensação de riscos para recaída, infecção e rejeição de enxerto. Inversamente, inibição mais seletiva por direcionamento de citocinas pró-inflamatórias únicas não tem demonstrado benefício clínico no tratamento de GVHD. Como um resultado, à parte de anticorpos que exaurem células T, nenhum bioló- gico foi aprovado para GVHD e a combinação de tacrolimus com me- totrexato tem permanecido o padrão de cuidado para a prevenção de GVHD. A significante medicina não satisfeita necessita clamar por produtos biológicos mais seletivos para ambos profilaxia e tratamento de GVHD e recaída de leucemia. Sumário da Invenção

[006] É aqui proporcionado um método de prevenção ou trata- mento de recaída de um câncer em um indivíduo em necessidade des- te, que pode compreender administrar uma proteína CD24 ao indiví- duo. É adicionalmente proporcionado uso de uma proteína CD24 na produção de um medicamento para prevenção ou tratamento de reca- ída de um câncer em um indivíduo. Também aqui proporcionado é um método de redução da atividade das células estaminais cancerígenas em um indivíduo em necessidade deste, que pode compreender admi- nistrar uma proteína CD24 ao indivíduo. É adicionalmente proporcio- nado uso de uma proteína CD24 na produção de um medicamento pa- ra redução da atividade das células estaminais cancerígenas em um indivíduo. A redução da atividade das células estaminais cancerígenas pode impedir ou tratar pelo menos um de recaída e metástase de um câncer do indivíduo.

[007] A célula estaminal cancerígena pode ser uma célula esta- minal cancerígena de leucemia. O indivíduo pode suportar ou pode ter suportado um transplante de células estaminais hematopoiéticas (HCT). O indivíduo pode ter câncer. O câncer ou célula estaminal can- cerígena pode ser Leucemia Mielóide Aguda (AML), Leucemia Linfo- blástica Aguda (ALL), Leucemia Mielógena Crônica (CML), Síndrome Mielodisplástica (MDS), ou Leucemia Mielomonocítica Crônica (CMML).

[008] A proteína CD24 pode ser administrada a uma dose de 240 mg ou 480 mg. A proteína CD24 pode ser administrada antes ou após o HCT, e pode ser administrada um dia antes do HCT. A proteína CD24 pode ser administrada mais do que uma vez, e pode ser admi- nistrada em doses bissemanais. As doses podes compreender uma dose no dia antes do HCT, uma dose no dia 14 após o HTC, e uma dose no dia 28 após o HCT, e as doses podem ser, respectivamente, 480 mg, 240 mg, e 240 mg.

[009] A proteína CD24 pode compreende um polipeptídeo huma- no maduro CD24 fundido em seu terminal N ou terminal C a uma regi- ão Fc de uma proteína de imunoglobulina (Ig) de mamíferos. O poli- peptídeo humano maduro CD24 pode compreender sequência coloca- da em SEQ ID NO: 1 ou 2. A proteína Ig pode ser humana. A região Fc pode compreender uma região de articulação e domínios CH2 e CH3 de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, ou IgA. A região Fc pode compreender uma região de articulação e domínios CH2, CH3 e CH4 de IgM. A pro- teína CD24 pode compreender sequência colocada em SEQ ID NO: 6, 11, ou 12. A sequência de aminoácido de uma proteína CD24 pode consistir de sequência colocada em SEQ ID NO: 6, 11, ou 12. A prote- ína CD24 pode ser solúvel, e pode ser glicosilatada. A proteína CD24 pode ser preparada usando um sistema de expressão eucariótico, que pode compreender expressão de um vetor em células de mamíferos. As células podem ser células do Ovário de Hamster Chinês. Breve Descrição dos Desenhos

[0010] A FIG. 1A mostra a composição de aminoácido da proteína de fusão CD24 de comprimento total, CD24Fc (também referida aqui como CD24Ig) (SEQ ID NO: 5). Os 26 aminoácidos sublinhados são o peptídeo de sinal de CD24 (SEQ ID NO: 4), que são clivados durante secreção de uma célula que expressa a proteína e, desse modo, care- cendo da versão processada da proteína (SEQ ID NO: 6). A porção em negrito da sequência é o domínio extracelular da proteína CD24 madura usada na proteína de fusão (SEQ ID NO: 2). O último aminoá- cido (A ou V) que está ordinariamente presente na proteína CD24 ma- dura foi eliminado do construto para evitar imunogenicidade. As letras não sublinhadas, sem negrito, são a sequência de IgG1 Fc, incluindo a região de articulação e domínios CH1 e CH2 (SEQ ID NO: 7). A FIG. 1B mostra a sequência de CD24VFc (SEQ ID NO: 8), em que a proteí- na CD24 humana madura (negrito) é a variante polimórfica valina de SEQ ID NO: 1. A FIG. 1C mostra a sequência de CD24AFc (SEQ ID NO: 9), em que a proteína CD24 humana madura (negrito) é a variante polimórfica alanina de SEQ ID NO: 1. As várias partes da proteína de fusão nas FIGS. 1B e 1C são marcadas como na FIG. 1A, e a variante de aminoácido valina/alanina é sublinhada em dobro.

[0011] A FIG. 2 mostra variações de sequência de aminoácido en-

tre proteína CD24s madura do rato (SEQ ID NO: 3) e humano (SEQ ID NO: 2). Os locais potenciais de O-glicosilação estão em negrito, e os locais de N-glicosilação estão sublinhados.

[0012] FIGS. 3A-C. Análise de modelagem compartimental de WinNonlin de farmacocinética de CD24IgG1 (CD24Fc). Os círculos abertos representam a média de 3 ratinhos, e a linha é a curva farma- cocinética prevista. A FIG. 3A. injeção i.v. de 1 mg de CD24IgG1. FIG. 3B. injeção s.c. de 1 mg de CD24IgG1 (CD24Fc). FIG. 3C. Compara- ção das quantidades totais de anticorpo no sangue conforme medidas pelas áreas sob curva (AUC), meia-vida e concentração de sangue máxima. Nota-se que, de um modo geral, a AUC e Cmáx da injeção s.c. é cerca de 80% de injeção i.v., embora a diferença não seja esta- tisticamente significante.

[0013] FIGS. 4A-B. Interação de CD24-Siglec G (10) discrimina entre PAMP e DAMP. FIG. 4A. Resposta do hospedeiro a PAMP foi infectada por interação CD24-Siglec G(10). FIG. 4B. Interação de CD24-Siglec G (10) reprime resposta de hospedeiro a DAMP, possi- velmente através do Siglec G/10-associado SHP-1.

[0014] FIGS. 5A-C. CD24 Fc se liga a Siglec 10 e HMGB1 e ativa Siglec G, o homólogo do rato de Siglec 10 humano. FIG. 5A. Medição de afinidade da interação de CD24Fc-Siglec 10. FIG. 5B. CD24Fc es- pecificamente interage com HMGB-1 em uma maneira dependente de cátion. CD24Fc foi incubado com HMGB1 em 0,1 mM de CaCl2 e MgCl2, na presença ou ausência do quelante de cátion EDTA. CD24Fc é empurrado para baixo com contas G de proteína, e as quantidades de HMGB1, CD24Fc ou controle de Fc é determinado por Western blot. FIG. 5C. CD24Fc ativa Siglec G de rato por indução de fosforila- ção de Tirosina (painel médio) e associação com SHP-1 (painel supe- rior). As quantidades de Siglec G são mostradas no painel inferior. Cé- lulas de baço CD24-/- foram estimuladas com 1 µg/ml de CD24Fc, con-

trole de Fc ou controle de veículo (PBS) por 30 minutos. Siglec G foi então imunoprecipitado e sondado com anti-fosfo-tirosina ou anti-SHP-

1.

[0015] FIGS. 6A-B. CD24Fc inibe produção de TNF-α e IFN-γ por células T humanas ativadas por anti-CD3. O PBML humano foi estimu- lado com anti-CD3 por 4 dias na presença ou ausência de CD24Fc e as quantidades de IFN-γ e TNF-α liberadas no sobrenadante de cultu- ra de célula foram medidas por ELISA. Dados mostrados são meios de triplicata. Barra de erro, SEM.

[0016] FIGS. 7A-B. CD24 inibe produção de citocina inflamatória por macrófagos humanos. FIG. 7A. ShRNA silenciando CD24 conduz a produção espontânea de TNF-α, IL-1β, e IL-6. Células de THP1 fo- ram transduzidas com vetores lentivirais que codificam ou escalam, ou duas moléculas independentes de CD24 shRNA. As células transduzi- das foram diferenciadas em macrófagos por cultura por 4 dias com PMA (15 ng/ml). Após lavagem com PMA e células não aderentes, as células foram cultivadas por outras 24 horas para medição de citocinas inflamatórias, por matriz de contas de citocina. FIG. 7B. Como na FIG. 7A, exceto que a dada concentração de CD24Fc ou controle de IgG Fc foi adicionada aos macrófagos nas últimas 24 horas. Dados mostrados na FIG. 7A são médias e S.D. de três experimentos independents, en- quanto que aqueles na FIG. 7B são representativos de pelo menos 3 experimentos independentes.

[0017] A FIG. 8 mostra um gráfico de concentração de plasma médio de CD24Fc (±SD) por tratamento para uma População Avaliável de PK em indivíduos humanos. PK = farmacocinética; SD = desvio pa- drão.

[0018] A FIG. 9 mostra um gráfico de proporcionalidade de dose de CD24Fc Cmáx versus dose para uma População Avaliável de PK.

[0019] A FIG. 10 mostra um gráfico de proporcionalidade de dose de CD24Fc AUC0-42d versus dose para uma População Avaliável de PK.

[0020] A FIG. 11 mostra um gráfico de proporcionalidade de dose de CD24Fc AUC0-inf versus dose para uma População Avaliável de PK.

[0021] A FIG. 12 mostra o desenho de ensaio para o ensaio de escalação de dose de Fase IIa controlada por placebo randomizada foi realizado para avaliar a adição de CD24Fc para padrão de profilaxia de GVHD agudo de cuidado em pacientes de câncer que suportam transplante de células estaminais hematopoiéticas (HCT) mieloablati- vas alogenêicas.

[0022] A FIG. 13 mostra o esquema de dosagem para coortes de dose única e multi-dose no ensaio de Fase IIa.

[0023] A FIG. 14 mostra o tempo médio para gravura para pacien- tes arrolados no ensaio.

[0024] A FIG. 15 mostra o quimerismo doador mielóide para paci- entes arrolados no ensaio.

[0025] A FIG. 16 mostra a incidência de GVHD de Grau II-IV e Grau III-IV agudo no coorte de tratamento (CD24Fc).

[0026] A FIG. 17 mostra a incidência cumulativa de aGVHD de grau III-IV 180 dias pós HCT em pacientes que recebem metotrexa- to/tacrolimus + CD24Fc conforme comparado a pacientes de controle contemporâneo que recebem metotrexato/tacrolimus.

[0027] A FIG. 18 mostra a análise de sobrevivência de Kaplan- Meier comparando aGVHD 180 duas de Grau III-IV, sobrevivência livre de recaída em pacientes que recebem ou CD24Fc ou controle de pla- cebo.

[0028] A FIG. 19 mostra análise de sobrevivência de Kaplan-Meier comparando aGVHD 180 dias de Grau III-IV, sobrevivência livre de recaída em pacientes que recebem ou CD24Fc com controle contem- porâneo.

[0029] A FIG. 20 mostra a análise de sobrevivência de Kaplan- Meier comparando 1,5 anos de sobrevivência total de pacientes que recebem ou CD24Fc ou controle de placebo.

[0030] A FIG. 21 mostra a análise de sobrevivência de Kaplan- Meier comparando 1,5 anos de sobrevivência total de pacientes que recebem ou CD24Fc ou controle contemporâneo.

[0031] As FIGS. 22A-B mostram os dados PK dos coortes de dose única de 240 e 480 mg. FIG. 22A Gráfico de Média (Desvio Padrão) Concentração de CD24Fc de Plasma (ng/mL) Versus Tempo em uma Escala Linear. FIG. 22B. Gráfico de Média (Desvio Padrão) Concen- tração de CD24Fc de Plasma (ng/mL) Versus Tempo em uma Escala Logarítmica.

[0032] As FIGS. 23A-B mostram os dados PK do coorte de multi- dose. FIG. 23A Gráfico de Média (Desvio Padrão) Concentração de CD24Fc de Plasma (ng/mL) Versus Tempo em uma Escala Linear. FIG. 23B. Gráfico de Média (Desvio Padrão) Concentração de CD24Fc de Plasma (ng/mL) Versus Tempo em uma Escala Semi- Logarítmica.

[0033] As FIGS. 24A-E mostram que CD24Fc suprime amplamen- te atividade de CFU de leucemia. Ensaios de formação de colônia fo- ram efetuados por deposição de 500-1000 células de linhas de célula diferentes em meio de metilcelulose com CD24Fc ou IgG (100 µg/ml). Os números de colônia foram classificados 7-14 dias mais tarde. Os dados representados são médias ± SEM.

[0034] As FIGS. 25A-B mostram efeito cumulativo de CD24Fc na atividade de THP-1 CFU em replicação em série. As células THP-1 (500 por cavidade) foram replicadas em série quarto rodadas em meio de metilcelulose com CD24Fc ou IgG Fc (100 µg/ml). Os números de colônia foram classificados 7 dias após deposição sob um microscó- pio. FIG. 25A, quantificação de formação de colônia em células THP-1 tratadas com CD24Fc ou controle de IgG Fc. FIG. 25B. Imagens re- presentativas de ensaio de formação de colônia na replicação de 4ª rodada de células THP-1 tratadas com CD24Fc ou IgG Fc. A barra de escala representa 1 mm. Dados representam média ± SEM.

[0035] A FIG. 26 mostra que CD24Fc diminui número de célula de leucemia cumulativa durante replicação em série. As células THP-1 (500 por cavidade) foram replicadas em série quatro rodadas em meio de metilcelulose com CD24Fc ou IgG (100µg/ml). Os números de célu- la foram contados 7 dias após deposição. Os números de célula total foram calculados baseado nas células nas rodadas prévias e o rendi- mento na rodada atual, conforme detalhado na seção de método.

[0036] As FIGS. 27A-B, mostram os efeitos de CD24Fc conforme comparado a controle (IgGFc) em células de leucemia de AML primá- rio (FIG. 278A) e CML (FIG. 27B). Ensaios de formação de colônia fo- ram efetuados por deposição de 500-1000 células de linhas de célula diferentes em meio de metilcelulose com CD24Fc ou IgG (100 µg/ml). Os números de colônia foram classificados 7-14 dias mais tarde. Da- dos representados são médias ± SEM.

[0037] As FIGS. 28A-F demonstram que CD24Fc reduz progressi- vamente atividade de AML CFU em replicação em série. Experimentos foram realizados em células THP-1. Células THP1 (500 célu- las/cavidade), ou de cultura em massa (primeira rodada) ou de placas de ensaio de formação de colônia prévio (segunda e terceira rodada), foram depositadas em meio de metilcelulose com CD24Fc ou IgG (100 µg/ml). Os números da colônia foram classificados 7 dias mais tarde. Dados representados são médias ± SEM.

[0038] As FIGS. 29A-F mostram que CD24Fc reduz progressiva- mente atividade de leucemia CFU através de CD33 humano. Experi- mentos foram realizados em células tipo selvagem (FIGS.29A-C) e CD33-/- THP-1 (FIGS. 29D-F). Células WT ou CD33-/- THP1 (500 célu-

las/cavidade), ou de cultura em massa (primeira rodada), ou de placas de ensaio de formação de colônia prévio (segunda e terceira rodada), foram depositadas em meio de metilcelulose com CD24Fc ou IgG (100 µg/ml). Os números da colônia foram classificados 7 (WT) 14 (CD33-/-) dias mais tarde. Dados representados são médias ± SEM.

[0039] As FIGS. 30A-B mostram a Sobrevivência Livre de GVDH 180 Dia Grau III-IV no grupo CD24Fc comparado ao grupo de controle de placebo (FIG. 30A) e ao grupo de controle contemporâneo (FIG. 30B).

[0040] As FIGS. 31A-B mostram a Sobrevivência Livre de Recaída no grupo CD24Fc comparado ao grupo de controle de placebo (FIG. 31A) e ao grupo de controle contemporâneo (FIG. 31B). Descrição Detalhada

[0041] O dano de tecido pode conduzir a liberação de ocitocinas pró-inflamatórias (tais como TNF-α, IL-1β e IL-6), e também a libera- ção de padrões moleculares associados a dano (DAMPs) e padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Ambos DAMPs e PAMPs podem ativar células de apresentação de antígeno (APCs), tais como células dendríticas (DCs), por ligação a receptores de reco- nhecimento de padrão (PRRs). Os APCs de hospedeiro subsequen- temente ativam células T doadoras e uma cascata imunológica que resulta na liberação de citocinas pró-inflamatórias e expansão das cé- lulas T alo-reativas específicas de antígeno. São estes eventos que conduzem ao desenvolvimento de GVHD e exacerbam os efeitos de mucosite. Por exemplo, RIOM inicia como uma inflamação aguda de mucosa oral, língua e faringe após radioterapia, que coincide com re- crutamento de várias células inflamatórias e liberação de citocinas in- flamatórias, mediadores quimiotáticos, e fatores de crescimento.

[0042] O envolvimento de dano de tecido em mucosite e GVHD eleva a perspectiva que regula negativamente a resposta do hospedei-

ro a DAMPs por CD24Fc que pode ser explorado para terapia de GVHD. Os estudos pré-clínicos dos inventores demonstraram que CD24Fc especificamente direciona inflamação mediada por DAMP e impede GVHD em modelos de rato, incluindo um modelo de rato hu- manizado. Importantemente, o fármaco tem vantagens sobre imunos- supressores convencionais à medida que não causa supressão imune geral e uso de altas doses de CD24Fc não bloqueia resposta de anti- corpo em primatas não humanos. Os dados também demonstram que CD24Fc impede GVHD, mas preserva o efeito de enxerto versus leu- cemia (GVL), tornando um fármaco ideal para profilaxia de GVHD em pacientes de leucemia. Finalmente, os estudos dos inventores em pri- mata não humano demonstram que CD24Fc não suprime resposta imune específica de antígeno, que sugere que CD24Fc não aumentará do mesmo modo risco de infecção.

[0043] Os inventores descobriram que uma forma solúvel de CD24 é altamente efetiva para prevenção de Doença de Enxerto versus Hospedeiro (GVHD) e condições associadas tal como mucosite, bem como para prevenção de recaída de leucemia após HCT. Os invento- res também descobriram que CD24Fc produzir uma redução depen- dente da dose em mucosite severa (grau ≥ 3) entre pacientes que re- cebem terapia de HCT. Estes efeitos podem ser mediados através de DAMPs. O reconhecimento de padrão é envolvido em resposta infla- matória disparada por ambos PAMPs e DAMPs. Os inventores com- preenderam que estudos recentes têm demonstrado que uma resposta de hospedeiro exacerbada a DAMPs pode desempenhar uma parte na patogênese de doença inflamatória e autoimune. DAMPs foram verifi- cados promoverem a produção de citocinas inflamatórias e doenças autoimunes e em modelos de animal, e inibidores de DAMPs tais co- mo HMGB1 e HSP90 foram consequentemente verificados melhora- rem artrite reumatoide (RA). TLRs, RAGE-R, DNGR (codificados por

Clec9A), e Mincle mostraram-se serem receptores responsáveis por mediar inflamação iniciada por uma variedade de DAMPs.

[0044] O trabalho recente dos inventores demonstrou que intera- ções CD24-Siglec G discriminam imunidade inata a DAMPs de PAMPs. Proteínas Siglec são membros da superfamília de imunoglo- bulina (Ig) associada à membrana que reconhecem uma variedade de estruturas contendo ácido siálico. Muitas Siglecs têm um motivo inibi- tório de tirosina imune intra-celular (ITIM) que se associa com SHP-1, - 2 e Cbl-b para controlar reguladores chaves de respostas inflamató- rias. Os inventores têm reportado CD24 como o primeiro ligante natu- ral para uma Siglec, Siglec G em rato e Siglec 10 em humano. A Si- glec G interage com CD24 sialilatado para suprimir a resposta de hos- pedeiro mediada por TLR a DAMPs, tal como HMGB1, via um meca- nismo de sinalização de SHP-1/2.

[0045] CD24 humana é uma molécula ancorada em GPI pequena codificada por uma estrutura de leitura aberta de 240 pares de base no gene CD24. Dos 80 aminoácidos, os primeiros 26 constituem o peptí- deo de sinal, enquanto que os últimos 23 servem como um sinal para clivagem para permitir a fixação da cauda de GPI. Como um resultado, a molécula de CD24 humana madura tem somente 31 aminoácidos. Um dos 31 aminoácidos é polimórfico entre a população humana. Uma transição A C a T no nucleotídeo 170 da estrutura de leitura aberta na substituição de Alanina (A) com Valina (V) no resíduo 31 da proteína madura. Desde que este resíduo é imediatamente N-terminal ao local de clivagem, e desde que a substituição é não conservativa, estes dois alelos podem ser expressos em eficiências diferentes na superfície da célula. De fato, estudos de transfecção com cDNA demonstram que o alelo CD24v é mais eficientemente expresso na superfície da célula. Consistente com isto, CD24v/v PBL expressam níveis mais altos de CD24, especialmente em células T.

[0046] Os inventores demonstraram que CD24 regula negativa- mente resposta de hospedeiro a DAMPs celulares que são liberados como um resultado de dano de tecido ou dano de órgão, e pelo menos dois mecanismos de sobreposição podem explanar nesta atividade. Primeiro, CD24 se liga a vários DAMPs, incluindo HSP70, HSP90, HMGB1 e nucleolina, e reprime resposta de hospedeiro a estes DA- MPs. Para fazer isto, é presumido que CD24 pode aprisionar o estímu- lo inflamatório para impedir interação com seus receptores, TLR ou RAGE. Segundo, usando um modelo de rato induzido por acetamino- feno de necrose de fígado e assegurando inflamação, os inventores demonstraram que através da interação com seu receptor, Siglec G, CD24 proporciona uma regulação negativa poderosa para resposta de hospedeiro a danos do tecido. Para alcançar esta atividade, CD24 po- de se ligar e estimular sinalização por Siglec G no qual SHP1 associa- do a Siglec G dispara a regulação negativa. Ambos mecanismos po- dem atuar em concerto como ratos com mutação direcionada de ou gene que monta resposta inflamatória muito mais forte. De fato, DC cultivado de medula óssea de ou ratos de CD24-/- ou Siglec G-/- produ- zem níveis mais altos de citocinas inflamatórias quando estimulados com ou HMGB1, HSP70, ou HSP90. Ao conhecimento dos inventores, CD24 é o único receptor de DAMP inibitório capaz de parar inflamação disparada por DAMPs e nenhum fármaco está atualmente disponível que especificamente direciona resposta inflamatória de hospedeiro a danos do tecido. Além disso, os inventores demonstraram a capacida- de de proteína CD24 solúvel exógena aliviar doença autoimune medi- ada por DAMP usando modelos de rato de RA, MS e GvHD.

1. Definições.

[0047] A terminologia aqui usada é para a proposta de descrição de concretizações particulares somente, e não é prevista para ser limi- tante. Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referentes plu- rais, a menos que o contexto determine claramente de outro modo.

[0048] Para recitação de faixas numéricas aqui, cada número de intervenção com o mesmo grau de precisão é explicitamente contem- plado. Por exemplo, para a faixa de 6-9, os números 7 e 8 são con- templados em adição a 6 e 9, e para a faixa 6,0-7,0, os números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, e 7,0 são explicitamente con- templados.

[0049] Um "peptídeo" ou "polipeptídeo" é uma sequência ligada de aminoácidos, e pode ser natural, sintética, ou uma modificação ou combinação de natural e sintética.

[0050] "Substancialmente idêntico" pode significar que uma primei- ra e segunda sequência de aminoácido são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,ou 99% sobre uma região de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, ou 300 aminoácidos.

[0051] "Tratamento" ou "tratando", quando se referindo a proteção de um animal de uma doença, meios de prevenção, supressão, re- pressão, ou eliminação completamente da doença. Prevenção da do- ença envolve administrar uma composição da presente invenção a um animal antes do começo da doença. A supressão da doença envolve administrar uma composição da presente invenção a um animal após indução da doença, mas antes de sia aparência clínica. Repressão da doença envolve administrar uma composição da presente invenção a um animal após aparência clínica da doença.

[0052] Uma "variante" pode significar um peptídeo ou polipeptídeo que difere em sequência de aminoácido pela inserção, eliminação, ou substituição conservativa de aminoácidos, mas retém pelo menos uma atividade biológica.

Exemplos representativos de "atividade biológica" incluem a capacidade de se ligar a um receptor similar a toll e a ser ligado por um anticorpo específico.

Variante pode também significar uma proteína com uma sequência de aminoácido que é substancial- mente idêntica a uma proteína referenciada com uma sequência de aminoácido que retém pelo menos uma atividade biológica.

Uma subs- tituição conservativa de um aminoácido, isto é, substituição de um aminoácido com um aminoácido diferente de propriedades similares (por exemplo, hidrofilicidade, grau e distribuição de regiões carrega- das) é reconhecida na técnica como tipicamente envolvendo uma me- nor mudança.

Estas menores mudanças podem ser identificadas, em parte, por considerar o índice hidropático de aminoácidos, conforme compreendido na técnica.

Kyte et al., J.

Mol.

Biol. 157:105-132 (1982). O índice hidropático de um aminoácido é baseado em uma considera- ção de sua hidrofobicidade e carga.

É conhecido na técnica que ami- noácidos de índices hidropáticos similares podem ser substituídos e ainda retêm função de proteína.

Em um aspecto, aminoácidos tendo índices hidropáticos de ±2 são substituídos.

A hidrofilicidade de ami- noácidos pode também ser usada para revelar substituições que resul- tariam em proteínas que retêm função biológica.

Uma consideração da hidrofilicidade de aminoácidos no contexto de um peptídeo permite cálculo da hidrofilicidade média local maior daquele peptídeo, uma medida útil que foi reportada para correlacionar bem com antigenicida- de e imunogenicidade.

A Patente U.S.

No. 4.554.101, incorporada aqui totalmente por referência.

Substituição de aminoácidos tendo valores similares de hidrofilicidade pode resultar em peptídeos que retêm ativi- dade biológica, por exemplo, imunogenicidade, conforme é compreen- dido na técnica.

Substituições podem ser realizadas com aminoácidos tendo valores de hidrofilicidade dentro de ±2 entre si.

Ambos o índice de hirofobicidade e o valor de hidrofilicidade de aminoácidos são influ- enciados pela cadeia lateral particular daquela aminoácido. Consisten- te com esta observação, substituições de aminoácido que são compa- tíveis com função biológica são compreendidas para depender da simi- laridade relativa dos aminoácidos, e particularmente as cadeias late- rais daqueles aminoácidos, conforme revelado pela hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho, e outras propriedades.

2. CD24

[0053] Aqui proporcionado é uma proteína CD24, que pode com- preender uma CD24 madura ou uma variante desta. CD24 madura corresponde ao domínio extracelular (ECD) de CD24. A CD24 madura pode ser de um humano ou outro mamífero. Conforme descrito acima, a proteína CD24 humana madura é 31 aminoácidos de comprimento, e tem um resíduo de alanina (A) ou valina (V) variável em sua extremi- dade C-terminal. A proteína CD24 madura pode compreender a se- guinte sequência:

[0054] SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(V/A) (SEQ ID NO: 1)

[0055] A valina ou alanina C-terminal pode ser imunogênica e po- de ser omitida de uma proteína CD24, que pode reduzir sua imunoge- nicidade. Portanto, a proteína CD24 pode compreender a sequência de aminoácido de CD24 humana madura que carece do aminoácido C-terminal:

[0056] SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK (SEQ ID NO: 2)

[0057] Apesar de consideráveis variações de sequência na se- quência de aminoácido das proteínas CD24 maduras de rato e huma- no, elas são funcionalmente equivalentes, à medida que CD24Fc hu- mana tem sido mostrada ser ativa no rato. A sequência de aminoácido da CD24 ECD humana mostra alguma conservação de sequência com a proteína do rato (39% de identidade; Número de acesso al Banco de Gene NP_033976). Contudo, não é surpreendente que a identidade por cento não é mais alta à medida que a CD24 ECD é somente 27-31 aminoácidos de comprimento, dependendo das espécies, e se ligando a alguns de seu(s) receptor(es), tal como Siglec 10/G, é mediada por seu ácido siálico e/ou açúcares de galactose da glicoproteína. A iden- tidade de sequência de aminoácido entre os domínios extracelulares das proteínas receptoras de Siglec-10 humana (Número de acesso ao Banco de Genes AF310233) e seu homólogo de murina Siglec-G (Número de acesso ao Banco de Genes NP_766488) é 63% (FIG. 2). Como um resultado de conservação de sequência entre CD24 de rato e humana principalmente no terminal C e na abundância de locais de glicosilação, variações significantes nas Proteínas CD24s maduras podem ser toleradas no uso de uma proteína CD24, especialmente se estas variações não afetam os resíduos conservados no terminal C, ou não afetam os locais de glicosilação de ou CD24 de rato ou humana. Portanto, uma proteína CD24 pode compreender a sequência de ami- noácido de murina madura CD24:

[0058] NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATTRG (SEQ ID NO: 3).

[0059] A sequência de aminoácido da CD24 ECD humana mostra mais conservação de sequência com a proteína de macaco cinomol- gus (52% de identidade; número de acesso no UniProt UniProtKB - I7GKK1) do que com rato. Novamente, isto não é surpreendente dado que a identidade por cento não é mais alta à medida que o ECD é so- mente 29-31 aminoácidos de comprimento nestas espécies, e o papel de resíduos de açúcar na ligação a seu(s) receptor(es). A sequência de aminoácido de receptor de cinomolgos Siglec-10 não foi determina- da, mas a identidade de sequência de aminoácido entre as proteínas de Siglec-10 humana e de macaco rhesus (Número de acesso ao Banco de Genes XP_001116352) é 89%. Portanto, uma proteína

CD24 pode também compreender a sequência de aminoácido de ma- caco cinomolgus maduro (ou rhesus) CD24:

[0060] TVTTSAPLSSNSPQNTSTTPNPANTTTKA (SEQ ID NO: 10)

[0061] A proteína CD24 pode ser solúvel. A proteína CD24 pode ainda compreender um peptídeo de sinal N-terminal, que pode permitir secreção da proteína de uma célula que expressa a proteína. A se- quência de peptídeo de sinal pode compreender a sequência de ami- noácido MGRAMVARLGLGLLLLALLLPTQIYS (SEQ ID NO: 4). Alter- nativamente, a sequência de sinal pode compreender qualquer daque- las que são encontradas em outras transmembrana ou proteínas se- cretadas, ou aquelas modificadas dos peptídeos de sinal existentes conhecidos na técnica. a. Fusão

[0062] A proteína CD24 pode ser fundida em sua extremidade N- ou C-terminal a uma etiqueta de proteína, que pode compreender uma porção de uma proteína de mamífero Ig, que pode ser humana ou de rato ou de outra espécie. A porção pode compreender uma região Fc da proteína Ig. A região Fc pode compreender pelo menos um da regi- ão de articulação, domínios CH2, CH3, e CH4 da proteína Ig. A proteí- na Ig pode ser IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, ou IgA humana, e a região Fc pode compreender a região de articulação, e domínios CH2 e CH3 da Ig. A região Fc pode compreender um isótopo de imunoglobulina hu- mana G1 (IgG1) SEQ ID NO: 7. A proteína Ig pode também ser IgM, e a região Fc pode compreender a região de articulação e domínios CH2, CH3, e CH4 de IgM. A etiqueta de proteína pode ser uma etique- ta de afinidade que auxilia na purificação da proteína, e/ou uma etique- ta de intensificação de solubilidade que intensifica a solubilidade e re- cuperação de proteínas funcionais. A etiqueta de proteína pode tam- bém aumentar a valência de uma proteína CD24. A etiqueta de proteí-

na pode também compreender GST, His, FLAG, Myc, MBP, NusA, tio- redoxin (TRX), modificador similar a ubiquitin pequeno (SUMO), ubi- quitin (Ub), albumina, ou a Camelid Ig. Métodos para produção de pro- teínas de fusão e purificação de proteínas de fusão são bem conheci- dos na técnica.

[0063] Baseado na pesquisa pré-clínica, para a construção da pro- teína de fusão CD24Fc identificada nos exemplos, a forma truncada de uma molécula de CD24 nativa de 30 aminoácidos, que carece do ami- noácido polimórfico ficam antes do local de clivagem de sinal GPI (isto é, uma proteína CD24 madura tendo SEQ ID NO: 2), foi usada. A se- quência de CD24 humana madura é fundida a um domínio de IgG1 Fc humano (SEQ ID NO: 7). A sequência da proteína de fusão CD24Fc de comprimento total é provida em SEQ ID NO: 5 (FIG. 1A), e a se- quência da versão processada de proteína de fusão CD24Fc que é secretada da célula (isto é, carecendo da sequência de sinal que é cli- vada) é provida em SEQ ID NO: 6. Variantes polimórficas processadas de CD24 madura (isto é, proteína CD24 madura tendo SEQ ID NO: 1) fundidas a IgG1 Fc podem compreender a sequência de aminoácido colocada em SEQ ID NO: 11 ou 12. b. Produção

[0064] A proteína CD24 pode ser fortemente glicosilatada, e pode ser envolvida em funções de CD24 tal como coestimulação de células imunes e interação com uma molécula de padrão molecular associado a dano (DAMP). A proteína CD24 pode ser preparada usando um sis- tema de expressão eucariótico. O sistema de expressão pode implicar em expressão de um vetor em células de mamíferos, tais como células de Ovário de Hamster Chinês (CHO). O sistema pode também ser um vetor viral, tal como um vetor retroviral defectivo de replicação que po- de ser usado para infectar células eucarióticas. A proteína CD24 pode também ser produzida de uma linha de célula estável que expressa uma proteína CD24 de um vetor, ou uma porção de um vetor que foi integrado no genoma celular. A linha de célula estável pode expressar uma proteína CD24 de um vetor retroviral defectivo de replicação inte- grado. A expressão sistema pode ser GPEx™. c. Composição farmacêutica

[0065] A proteína CD24 pode estar contida em uma composição farmacêutica, que pode compreender uma quantidade farmaceutica- mente aceitável de uma proteína CD24. A composição farmacêutica pode compreender um transportador farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode compreender um solvente, que pode manter a proteína CD24 estável sobre um período prolongado. O sol- vente pode ser PBS, que pode manter a proteína CD24 estável por pelo menos 66 meses a -20°C (-15~-25°C). O solvente pode ser capaz de acomodar a proteína CD24 em combinação com outro fármaco.

[0066] A composição farmacêutica pode ser formulada para admi- nistração parenteral incluindo, mas não limitada a, por injeção ou infu- são contínua. Formulações para injeção pode ser na forma de suspen- sões, soluções, ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e po- dem conter agentes de formulação incluindo, mas não limitados a, agentes de suspensão, de estabilização, e de dispersão. A composi- ção pode também ser provida em uma forma de pó para reconstrução com um veículo adequado, incluindo, mas não limitado a, água estéril livre de pirogênio.

[0067] A composição farmacêutica pode também ser formulada como uma preparação de depósito, que pode ser administrada por im- plantação ou por injeção intramuscular. A composição pode ser formu- lada com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (como uma emulsão em um óleo aceitável, por exemplo), resinas de troca de íon, ou como derivados moderadamente solúveis (como um sal modera- damente solúvel, por exemplo). Uma formulação para injeção subcu-

tânea pode ser particularmente relevante para uma indicação similar a lúpus e suas manifestações associadas e complicações.

3. Métodos de tratamento a. GVHD

[0068] Aqui proporcionado é um método de prevenção, mitigação ou tratamento de Doença de Enxerto versus Hospedeiro (GVHD) em um indivíduo em necessidade deste por administração de uma proteí- na CD24 ao indivíduo. O indivíduo pode ter ou estar em risco de de- senvolver GVHD. O indivíduo pode suportar ou pode estar suportando transplante de células estaminais hematopoiéticas (HCT). A proteína CD24 pode ser usada profilaticamente para prevenir GVHD em um indivíduo suportando HCT. A GVHD pode ser GVHD aguda. A proteína CD24 pode reduzir o risco do indivíduo de GVHD aguda de grau III-IV.

[0069] O indivíduo pode ter um câncer. O câncer pode ser Leuce- mia Mielóide Aguda (AML), Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL), Leu- cemia Mielógena Crônica (CML), Síndrome Mielodisplástica (MDS), ou Leucemia Mielomonocítica Crônica (CMML). b. Recaída de câncer

[0070] É aqui proporcionado um método de redução dos riscos de ou prevenção de recaída de um câncer em um indivíduo que suportará ou tenha suportado HCT, por administração de uma proteína CD24 ao indivíduo. O câncer pode ser uma leucemia aqui descrita.

[0071] O HCT pode ser um HCT mieloablativo alogenêico. O indi- víduo pode ser um mamífero. O mamífero pode ser um macaco ou um símio. O indivíduo pode ser um humano. c. Redução da Atividade das Células Estaminais Cancerígenas

[0072] É aqui proporcionado um método de redução ou supressão de atividade das células estaminais cancerígenas, que pode ser in vi- vo. O método pode compreender contatar células estaminais cancerí- genas com a proteína CD24. O método pode também compreender administrar a proteína CD24 a um indivíduo em necessidade deste aqui revelado. A célula estaminal cancerígena pode ser de um câncer aqui descrito, e, em particular, pode ser uma célula estaminal cancerí- gena de leucemia. A supressão ou redução de atividade das células estaminais cancerígenas pode reduzir o risco do indivíduo de, ou pre- venir, recaída de um câncer aqui descrito. A supressão ou redução de atividade das células estaminais cancerígenas pode também reduzir o risco do indivíduo de, ou prevenir, metástase do câncer. d. Medicamentos

[0073] Também são proporcionados são usos de uma proteína CD24 na produção de um medicamento para usos conforme aqui des- crito. e. Regime de dose

[0074] A dose de uma proteína CD24 administrada pode ser 0,01 mg/kg a 1000 mg/kg, e pode ser 1 a 500 mg/kg, dependendo do efeito desejado no GVHD e da rota de administração. A proteína CD24 pode ser administrada por infusão intravenosa (IV) ou por injeção subcutâ- nea, intramural (isto é, no interior da parede de uma cavidade ou ór- gão), ou injeção intraperitoneal. A dose pode ser 10-1000 mg, 10-500 mg, 240 mg, ou 480 mg, que, em particular, pode ser adequada onde o indivíduo é um humano.

[0075] A proteína CD24 pode ser administrada antes ou após o transplante de célula estaminal. A proteína CD24 pode ser administra- da 1-4 dias, particularmente 1 dia, antes do transplante de célula es- taminal. A proteína CD24 pode também ser administrada em múltiplas doses antes ou após transplante de célula estaminal. A proteína CD24 pode ser administrada em 2, 3, 4, 5 ou 6 doses bissemanais. Cada do- se de uma proteína CD24 pode ser 240 mg ou 480 mg. Uma primeira dose pode ser administrada no dia -4 ao dia 0 relativa ao dia de trans- plante de célula estaminal (dia 0), e pode ser administrada no dia -1,

em particular. Cada subsequente dose pode ser administrada todo 9- 19 ou 11-17 dias após. Uma segunda dose pode ser administrada no dia +9 a +19 ou dia +11 a +17, particularmente dia +14, relativa ao dia de transplante de célula estaminal. Uma terceira dose pode ser admi- nistrada no dia +18 a +38, dia +23 a +33, ou dia +22 a +34, particular- mente dia +28, relativa ao dia de transplante de célula estaminal. Em particular, a proteína CD24 pode ser administrada em três administra- ções bissemanalmente de 480 mg, 240 mg, e 240 mg, respectivamen- te no dia -1, dia +14 e dia +28 relativa ao dia de transplante de célula estaminal. A proteína CD24 pode, em particular, ser CD24Fc. f. Tratamento de combinação

[0076] A proteína CD24 pode ser administrada ao indivíduo em combinação com padrão de profilaxia de GVHD de cuidado. O padrão de profilaxia de GVHD de cuidado pode compreender administração de metotrexato mais inibidor de calcineurina, tal como tacrolimus (Pro- graf, FK506) ou ciclosporina (Sandimmune, Neoral). Tacrolimus pode ser administrado no dia -3 relativo ao dia de transplante de célula es- taminal, e pode ser administrado por IV ou PO (oralmente). Para do- sagem IV como uma infusão continua, a dose inicial pode ser 0,03 mg/kg/dia baseado no peso corpóreo ajustado. Para dosagem oral, a dose inicial pode ser 0,045 mg/kg/dose duas vezes diariamente. Se o indivíduo não pode tolerar tacrolimus, então ciclosporina pode ser ad- ministrada ao indivíduo por IV a uma dose de 100x a dose IV de tacro- limus (por exemplo, dose inicial 3 mg/kg/dia). A ciclosporina pode tam- bém ser administrada oralmente a uma dose de 3x a dose IV. Quando marca Neoral é usada, por causa da grande biodisponibilidade, a ci- closporina pode ser administrada oralmente a 2x a dose IV.

[0077] Na ausência de GVHD, níveis de tacrolimus podem ser monitorados para dosagem terapêutica somente durante as primeiras 100 dias pós-transplante. O alvo terapêutico através do nível para ta-

crolimus pode ser 5-15 ng/mL. Níveis de tacrolimus podem ser monito- rados a um mínimo de três vezes (por exemplo toda 48-72 horas) para a primeira semana pós infusão de proteína CD24 (dia 0 a dia 7). Na ausência de GVHD ou recaída, afunilamento de tacrolimus pode co- meçar no dia +100 pós-transplante. Na presença de GVHD, tacrolimus pode ser continuado na dosagem terapêutica.

[0078] Metotrexato pode ser usado em combinação com tacroli- mus para profilaxia de GVHD padrão. Metotrexato pode ser adminis- trado intravenosamente a uma dose de 15 mg/m2/dose uma vez diari- amente no Dia 1 após HCT, e a uma dose de 10 mg/m2/dose nos dias 3, 6, e 11 após HCT. Exemplo 1 Farmacocinética de CD24 em ratos

[0079] 1 mg de CD24Fc (CD24Fc) foi injetado em ratos C57BL/6 naïve e coletadas amostras de sangue em pontos de tempo diferentes (5 min, 1 hr, 4 hrs, 24 hrs, 48 hrs, 7 dias, 14 dias e 21 dias) com 3 ra- tos em cada ponto de tempo. Os soros foram diluídos 1:100 e os ní- veis de CD24Fc foram detectados usando um ELISA intercalado usando CD24 anti-humano purificado (3,3 μg/ml) como o anticorpo de captura e peroxidase conjugada de cabra anti-humana IgG Fc (5 μg/ml) como os anticorpos de detecção. Conforme mostrado na FIG. 3a. A curva de queda de CD24Fc revelou uma recaída de bifase típica da proteína. A primeira fase de biodistribuição tem uma meia-vida de 12,4 horas. A segunda fase segue um modelo de eliminação de pri- meira ordem a partir do compartimento central. A meia-vida para a se- gunda fase foi 9,54 dias, que é similar àquela de anticorpos in vivo. Estes dados sugerem que a proteína de fusão é muito estável na cor- rente sanguínea. Em outro estudo em que a proteína de fusão foi inje- tada subcutaneamente, uma meia-vida quase idêntica de 9,52 dias foi observada (FIG. 3b). Mais importantemente, enquanto que leva apro-

ximadamente 48 horas para a CD24Fc alcançar níveis de pico no san- gue, a quantidade total da proteína de fusão no sangue, conforme me- dida por AUC, foi substancialmente a mesma por qualquer rota de in- jeção. Desse modo, de um ponto de vista terapêutico, o uso de uma rota diferente de injeção não deve afetar o efeito terapêutico do fárma- co. Esta observação grandemente simplifica o desenho experimental para toxicidade dos primatas e ensaios clínicos. Exemplo 2 Interação de CD24-Siglec 10 em resposta de hospedeiro a lesões no tecido

[0080] Há quase duas décadas, Matzinger propôs o que foi popu- larmente denominado teoria do perigo. Em essência, ela arguiu que o sistema imune é ligado quando ele detecta os perigos no hospedeiro. Embora a natureza do perigo não fosse bem definida no tempo, ela tem determinado que necrose está associada com a liberação de componentes intracelulares tais como HMGB1 e proteínas de Choque Térmico, que foram denominados DAMP, para padrões moleculares associados a perigo. DAMP foram verificados promoverem produção de citocinas inflamatórias e doenças autoimunes. Em modelos de ani- mal, inibidores de HMGB1 e HSP90 foram verificados melhorarem RA. O envolvimento de DAMP elevou a prospecção que regulação negati- va para resposta de hospedeiro a DAMP pode ser explorada para te- rapia de RA.

[0081] Usando necrose do fígado induzida por acetaminofen e as- segurando inflamação, foi observado que através de interação de Si- glec G, CD24 proporciona uma regulação negativa poderosa para res- posta de hospedeiro a lesões no tecido. A CD24 é um GPI ancorado em moléculas que é amplamente expressa em células hematopoiéti- cas e outras células estaminais tecidulares. A análise genética de uma variedade de doença autoimune em humano, incluindo esclerose múl-

tipla, lúpus eritematoso sistêmico, RA, e artrite de célula gigante, mos- trou significante associação entre polimorfismo de CD24 e risco de do- enças autoimunes. Siglec G é um membro da família I-lectina, definida por sua capacidade de reconhecer estrutura contendo ácido siálico. Siglec G reconhece estrutura contendo ácido siálico em CD24 e nega- tivamente regula produção de citocinas inflamatórias por células den- dríticas. Em termos de sua capacidade de interagir com CD24, Siglec 10 humana e Siglec G de rato são funcionalmente equivalentes. Con- tudo, não é claro se existe uma correlação um para um entre homólo- gos de rato e humano. Embora o mecanismo permaneça para ser to- talmente elucidado, é plausível que SiglecG-associado SHP1 pode es- tar envolvido na regulação negativa. Estes dados conduzem a um no- vo modelo em que interação de CD24-Siglec G/10 pode desempenhar uma crítica em discriminação de padrão molecular associado a pató- geno (PAMP) de DAMP (FIG. 4).

[0082] Pelo menos dois mecanismos de sobreposição podem ex- planar a função de CD24. Primeiro, por ligação a uma variedade de DAMP, CD24 pode aprisionar o estímulo inflamatório para impedir sua interação com TLR ou RAGE. Esta noção é suportada por observa- ções que CD24 está associado com várias moléculas de DAMP, inclu- indo HSP70, 90, HMGB1 e nucleolina. Segundo, talvez após associa- da com DAMP, CD24 pode estimular a sinalização por Siglec G. Am- bos mecanismos podem atuar em concerto como ratos com mutação direcionada de seu gene monta resposta inflamatória muito mais forte. De fato, DC cultivado de medula óssea de ou ratos CD24-/- ou Siglec G-/- produzem citocinas inflamatórias muito mais altas quando estimu- lados com ou HMGB1, HSP70, ou HSP90. Em contraste, nenhum efei- to foi verificado em sua resposta a PAMP, tal como LPS e PolyI:C. Es- tes dados não somente proporcionam um mecanismo para o sistema imune inato para distinguir patógeno de lesão de tecido, mas também sugere que CD24 e Siglec G como alvos terapêuticos potenciais para doenças associadas com lesões no tecido. Exemplo 3 CD24Fc interage com HMGB1, Siglec 10 e induz associação entre Siglec G e SHP-1

[0083] Para medir a interação entre CD24Fc e Siglec 10, nós imo- bilizamos CD24Fc em um CHIP e usamos Biacore para medir a liga- ção de concentrações diferentes de Siglec-10Fc. Conforme mostrado na FIG. 5a, CD24Fc se liga com Siglec 10 com uma Kd de 1,6x10-7M. Isto é 100 vezes afinidade mais alta do que o controle Fc. A interação entre CD24Fc e HMGB1 foi confirmada por experimentos de abate usando contas de proteína G ligada a CD24Fc, seguida por Western blot com ou anti-IgG ou anti-HMGB1. Estes dados demonstram que CD24Fc, mas não Fc, se liga a HMGB1, e que esta ligação é depen- dente de cátion (FIG. 5b). Para determinar se CD24Fc é um agonista de Siglec G, a contraparte de rato de Siglec 10 humana, nós estimu- lamos CD24-/- células de baço com CD24Fc, controle Fc ou controle de veículo (PBS) por 30 minutos. Siglec G foi então imunoprecipitada e sondada com anti-fosfo-tirosina ou anti-SHP-1. Conforme mostrado na FIG. 5c, CD24Fc induz substancial fosforilação de Siglec G e associa- ção de SHP-1, um inibidor bem conhecido para ambas imunidade adaptiva e inata.

[0084] Estudos de eficácia in vitro de CD24Fc.

[0085] Para estudar o impacto de CD24Fc na produção de citoci- nas inflamatórias por células T humanas, as células T maduras em PBML humano ativadas por anti-CD3 anticorpo (OKT3), um agonista comumente usado do receptor de célula T na presença de concentra- ções diferentes de CD24Fc ou IgG1 Fc humana. Quatro dias mais tar- de, os sobrenadantes foram coletados e a produção de IFN-γ e TNF-α foi medida por ensaio imunoservente ligado a enzima (ELISA) para confirmar ativação. Os resultados na FIG. 6 demonstram que CD24Fc de dois lotes diferentes de manufatura reduz significantemente produ- ção de IFN-γ e TNF-α a partir do PBML humano ativado comparado com controle de controle de IgG Fc. Em adição, quando CD24Fc foi adicionada, a produção de citocina foi inibida em uma maneira depen- dente da dose. Portanto, CD24Fc pode inibir ativação de PBNL huma- na induzida por anti-CD3 in vitro. Este estudo não somente indica que o mecanismo de ação de CD24Fc pode ser através da inibição de ati- vação de célula T, mas também estabelece um bioensaio seguro para potência de fármaco e teste de estabilidade.

[0086] Para determinar se CD24Fc regula produção de citocinas inflamatórias em uma linha de célula humana, nós primeiro silencia- mos CD24 na linha de célula THP1 de leucemia monocítica aguda humana usando RNAi, e então induzimos diferenciação em macrófa- gos por tratamento das mesmas com PMA. Conforme mostrado na FIG. 7a, o silenciamento da CD24 substancialmente aumenta a produ- ção de TNFα, IL-1β e IL-6. Estes dados demonstram um papel essen- cial para CD24 humana endógena na limitação da produção de citoci- nas inflamatórias. Importantemente, CD24Fc restaura inibição de TNFα na linha de célula silenciada de CD24 (FIG. 7b), bem como IL-1 β e IL-6. Estes dados não somente demonstram a relevância de CD24 em resposta inflamatória de células humanas, mas também proporcio- na um ensaio simples para avaliar atividade biológica de CD24Fc.

[0087] Tomados juntos, estes dados demonstram que CD24Fc é capaz de inibir produção de citocina disparada por estímulo adaptativo e inato. Contudo, desde que o fármaco é muito mais efetiva na redu- ção de produção de citocina por efetores inatos, nós consideramos que o mecanismo primário para sua função profilática é para impedir inflamação disparada por lesões no tecido na fase precoce de trans- plante.

Exemplo 4 Farmacocinéticas de CD24 em humanos

[0088] Este exemplo mostra uma análise das farmacocinéticas de uma proteína CD24 em humanos. Isto foi derivado de um estudo de dose ascendente controlada por placebo, duplo-cego randomizado de fase I, para avaliar a segurança, tolerabilidade, e PK de CD24Fc em indivíduos adultos macho e fêmea saudáveis. Um total de 40 indiví- duos em 5 coortes de 8 indivíduos cada foram arrolados neste estudo. Seis dos 8 indivíduos em cada coorte receberam fármaco de estudo, e 2 indivíduos receberam placebo (0,9% de cloreto de sódio, salina). O primeiro coorte foi dosado com 10 mg. Coortes sucessivos receberam 30 mg, 60 mg, 120 mg, e 240 mg de CD24Fc ou placebo correspon- dente, e foram dosados pelo menos 3 semanas à parte para permitir revisão de dados de segurança e tolerabilidade para cada coorte ante- rior. A administração da próxima dose mais alta a um novo coorte de indivíduos foi permitida somente se segurança adequada e tolerabili- dade foram demonstradas.

[0089] Em cada coorte, os 2 indivíduos iniciais foram 1 recipiente de fármaco de estudo e 1 recipiente de placebo no Dia 1. O 3º a 5º e 6º a 8º indivíduos foram dosados após Dia 7 (um mínimo de 24 horas à parte entre os subgrupos). Cada indivíduo foi dosado pelo menos 1 hora à parte no mesmo subgrupo. Se necessário, a dosagem do res- tante de indivíduos foi revisão pendente retardada de quaisquer pro- blemas de segurança significantes que podem ter ocorrido durante o período de pós-dose envolvendo os primeiro ou segundo subgrupos naquele coorte. O subsequente coorte foi dosado pelo menos 3 sema- nas após o coorte anterior. Período de Triagem:

[0090] A Visita de Triagem (Visita 1) ocorreu até 21 dias antes do começo do período de tratamento ativo. Após provisão de consenti-

mento informado, os indivíduos suportaram procedimentos de triagem para elegibilidade. Período de Tratamento:

[0091] Indivíduos foram admitidos à Unidade de Farmacologia Clí- nica (CPU) no Dia -1 (Visita 2), e o período de tratamento randomizado começou no Dia 1 após um mínimo de 10 horas de jejum noturno. In- divíduos foram aleatoriamente atribuídos para tratamento com CD24Fc ou placebo como uma única dose. Indivíduos permaneceram confina- dos até a manhã do Dia 4. Seguimento:

[0092] Todos os indivíduos retornaram para a CPU no Dia 7, Dia 14, Dia 21, Dia 28, e Dia 42 (±1 dia) para seguidas visitas (Visita 3, Visita 4, Visita 5, Visita 6, e Visita 7). A Visita 7 foi a visita final para todos os indivíduos.

[0093] Duração de Tratamento: A duração total do estudo para ca- da indivíduo foi até 63 dias. Administração de única dose ocorreu no Dia 1.

[0094] Número de Indivíduos:

[0095] Planejados: 40 indivíduos

[0096] Classificados: 224 indivíduos

[0097] Randomizados: 40 indivíduos

[0098] Completados: 39 indivíduos

[0099] Descontinuados: 1 indivíduo

[00100] Diagnose e Critério Principal para Inclusão: A população para este estudo foi machos e fêmeas saudáveis entre as idades de 18 e 55 anos, inclusive, com um índice de massa corpórea entre 18 kg/m2 e 30 kg/m2, inclusive. Produto Investigacional e Informação Comparadora:

[00101] CD24Fc: única dose de 10 mg, 30 mg, 60 mg, 120 mg, ou 240 mg administrada via infusão IV; número do lote: 09MM-036.

CD24Fc foi uma proteína de fusão totalmente humanizada consistindo da sequência madura de CD24 humana e a região cristalizável de fra- gmento de imunoglobulina humana G1 (IgG1Fc). CD24Fc foi suprido como uma solução aquosa estéril, clara, incolor, livre de conservante para administração IV. CD24Fc foi formulada como solução de injeção de única dose, a uma concentração de 10 mg/mL e um pH de 7,2. Ca- da frasco de CD24Fc continha 160 mg de CD24Fc, 5,3 mg de cloreto de sódio, 32,6 mg de fosfato de sódio, heptahidrato dibásico, e 140 mg de fosfato de sódio monobásico monohidrato em 16 mL ± 0,2 mL de CD24Fc. CD24Fc foi suprida em frascos de vidro de borosilicato claro com rolhas de borracha clorobutil e selos de alumínio.

[00102] Placebo correspondente (0,9% de cloreto de sódio, salina) administrada via infusão IV; número de lotes: P296855, P311852, P300715, P315952.

[00103] A População de intenção de tratar (ITT) consiste de todos os indivíduos que receber pelo menos 1 dose do fármaco de estudo. A População de ITT foi a população de análise primária para informação de indivíduo e avaliação de segurança.

[00104] Avaliações de laboratório clínicas (química, hematologia, e urinálise) foram resumidas por tratamento e visita. Mudança de linha de base foi também resumida. Sinais vitais (pressão sanguínea, taxa cardíaca, taxa respiratória, e temperatura) foram resumidos por trata- mento e ponto de tempo. Mudança de linha de base foi também resu- mida. Todos dados de exame físico foram listados. Parâmetros de ele- trocardiograma e a mudança de linha de base foram resumidos. Todas as interpretações foram listadas. Concentração de CD24Fc de Plasma

[00105] Conforme mostrado na FIG. 8, a concentração de plasma média de CD24Fc aumenta proporcionalmente para a dose de CD24Fc administrada. Para todos os grupos de dose exceto 120 mg, a concentração de plasma média máxima de CD24Fc foi alcançada a 1 hora pós-dose. A concentração de plasma média máxima de CD24Fc para o grupo de 120 mg foi alcançada em 2 horas pós-dose. Pelo Dia 42 (984 horas), a concentração de plasma média de CD24Fc para to- dos os grupos diminuiu para entre 2% e 4% da concentração de plas- ma média máxima.

[00106] Tabela 1 resume os parâmetros de CD24Fc de plasma PK por tratamento para a População Avaliável PK. Tabela 1 Resumo de Parâmetros Farmacocinéticos de CD24Fc de Plasma por Tratamento – População Avaliável PK Estatística CD24Fc CD24Fc CD24Fc CD24Fc CD24Fc de Parâme- 10 mg(N=6) 30 mg(N=6) 60 mg(N=6) 120 mg(N=6) 240 mg(N=6) tro Cmáx (ng/mL) N 6 6 6 6 6 Média (SD) 2495 (576) 9735 (1715) 30 083 (7179) 52 435 (9910) 95 865 (10 734) CV% 23,1 17,6 23,9 18,9 11,2 Mediano 2371 9218 29 026 50 401 93 206 Mín, Máx 1,967, 3,390 8,583, 22,557, 40,434, 81,296, 13,086 42,628 65,704 110,110 Média Geo- 2,442 9,625 29,424 51,666 95,365 métrica CV% Geomé- 22,8 16,1 23,0 19,0 11,2 trica AUC0-42d (ng*hr/mL) N 6 6 6 6 6 Média (SD) 423,061 1,282,430 3,226,255 6,541,501 12,704,705 (99,615) (88,798) (702,862) (2,190,944) (1,918,596) CV% 23,5 6,9 21,8 33,5 15,1 Mediano 434,043 1,302,719 3,124,933 5,785,142 12,563,426 Mín, Máx 291,020, 1,175,733, 2,487,550, 4,485,193, 10,466,635, 528,079 1,403,024 4,139,748 9,415,266 15,693,606 Média geo- 412,795 1,279,851 3,163,252 6,249,552 12,586,731 métrica CV% geomé- 25,0 7,0 22,0 33,8 15,0 trico AUC0-inf (ng*hr/mL) N 6 6 6 6 6 Média (SD) 462,260 1,434,464 3,497,196 7,198,196 13,861,796 (116,040) (131,316) (705,653) (2,458,320) (1,962,780) CV% 25,1 9,2 20,2 34,2 14,2

Estatística CD24Fc CD24Fc CD24Fc CD24Fc CD24Fc de Parâme- 10 mg(N=6) 30 mg(N=6) 60 mg(N=6) 120 mg(N=6) 240 mg(N=6) tro Mediano 470,426 1,422,205 3,519,732 6,463,665 13,713,034 Mín, Máx 310,956, 1,281,715, 2,703,655, 4,910,640, 11,822,988, 596,599 1,650,503 4,309,023 10,479,940 17,175,236 Média geo- 449,583 1,429,578 3,437,036 6,862,129 13,750,972 métrica CV% geomé- 26,7 9,0 20,7 34,6 13,8 trico Tmáx (hr) N 6 6 6 6 6 Média (SD) 1,15 (0,42) 1,17 (0,41) 1,01 (0,01) 1,34 (0,51) 1,33 (0,52) CV% 36,1 35,0 1,2 38,0 38,7 Mediano 1,00 1,00 1,00 1,03 1,00 Mín, Máx 0,92, 2,00 1,00, 2,00 1,00, 1,03 1,00, 2,00 1,00, 2,00 t½ (hr) N 6 6 6 6 6 Média (SD) 280,83 327,10 279,82 286,45 285,33 (22,37) (41,32) (65,59) (23,38) (24,33) CV% 8,0 12,6 23,4 8,2 8,5 Mediano 279,61 317,23 264,69 290,76 287,74 Mín, Máx 258,87, 289,82, 210,18, 243,89, 249,24, 321,26 394,24 362,46 309,26 322,26 AUCextr (%) N 6 6 6 6 6 Média (SD) 7,61 (2,14) 10,44 (2,94) 7,88 (4,26) 8,92 (1,94) 8,46 (1,99) CV% 28,1 28,2 54,0 21,8 23,5 Mediano 7,16 10,01 6,35 9,27 8,45 Mín, Máx 5,46, 11,47 7,10, 15,05 3,92, 14,48 5,49, 10,99 5,56, 11,50 CL (L/hr) N 6 6 6 6 6 Média (SD) 0,0229 0,0211 0,0178 0,0183 0,0176 (0,0061) (0,0019) (0,0036) (0,0058) (0,0023) CV% 26,7 8,8 20,5 31,7 13,3 Mediano 0,0216 0,0211 0,0173 0,0191 0,0175 Mín, Máx 0,0168, 0,0182, 0,0139, 0,0115, 0,0140, 0,0322 0,0234 0,0222 0,0244 0,0203 Vd (L) N 6 6 6 6 6 Média (SD) 9,153(1,943) 9,867(0,804) 7,289(2,592) 7,491(2,202) 7,276(1,426) CV% 21,2 8,1 35,6 29,4 19,6 Mediano 8,507 10,007 7,486 7,691 7,151 Mín, Máx 7,326, 8,771, 4,222, 11,139 4,933, 9,974 5,814, 9,438 12,010 10,958

Estatística CD24Fc CD24Fc CD24Fc CD24Fc CD24Fc de Parâme- 10 mg(N=6) 30 mg(N=6) 60 mg(N=6) 120 mg(N=6) 240 mg(N=6) tro AUC0-42d = área sob a curva de concentração-tempo de tempo 0 a 42 dias; AUC0-inf = área sob a curva de concentração-tempo extrapolada do tempo 0 a infinidade; AUCextr = percentagem de AUC0-inf que foi devido a extrapolação do tempo da últi- ma concentração mensurável, por indivíduo, para infinidade; CL = limpeza do corpo total; Cmáx = concentração de fármaco de plasma observada máxima; CV% = coefi- ciente de variação; Mín = mínimo; Máx = máximo coeficiente de variação; SD = desvio padrão; t½ = meia-vida de eliminação terminal; Tmáx = tempo de concentra- ção de fármaco de plasma observada máxima; Vd = volume de distribuição. Análise de Proporcionalidade de Dose de CD24Fc de Plasma

[00107] A FIG. 9 mostra um gráfico de proporcionalidade de dose de CD24Fc Cmáx versus dose para a População Avaliável PK. A FIG. 10 mostra um gráfico de proporcionalidade de dose de CD24Fc AUC0- 42d versus dose para a População Avaliável PK. A FIG. 11 mostra um gráfico de proporcionalidade de dose de CD24Fc AUC0-inf versus dose para a População Avaliável OK. A Tabela 2 mostra uma análise de energia de proporcionalidade de dose.

Tabela 2 Análise de Energia de gráfico de proporcionalidade de Dose: Parâmetros Farmacocinéticos de CD24Fc de Plasma – População Avaliável PK Estatística de CD24Fc CD24Fc CD24Fc CD24Fc CD24Fc Proporcionalidade de Dose Parâmetro 10 mg 30 mg 60 mg 120 mg 240 mg Inclinação Erro Padrão 90% CI (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) (N=6) Estimada Cmáx (ng/mL) 1,172 0,040 (1,105, 1,240) Média geomé- 2,441,8 9,624,9 29,424,4 51,666,4 95,364,9 trica CV% geométri- 22,8 16,1 23,0 19,0 11,2 co AUC0-42d 1,088 0,036 (1,027, 1,148) (ng*hr/mL) Média geomé- 412,794,8 1,279,850,8 3,163,251,7 6,249,551,9 12,586,731,3

36/82 trica CV% geométri- 25,0 7,0 22,0 33,8 15,0 co AUC0-inf 1,087 0,036 (1,026, 1,148) (ng*hr/mL) Média geomé- 449,583,5 1,429,577,5 3,437,035,6 6,862,128,7 13,750,972,4 trica CV% geométri- 26,7 9,0 20,7 34,6 13,8 co CV% geométrico = 100*sqrt(exp(SD2)-1), onde SD foi o desvio padrão do dado log-transformado.

O modelo de energia foi ajus- tado por probabilidade máxima restrita, regredindo o parâmetro PK log-transformado na dose transformadea de log.

Ambos a intercepção e inclinação foram ajustadas como efeitos fixos.

A proporcionalidade de dose não foi rejeitada se o 90% de CI está dentro de (0,8, 1,25). AUC0-42d = área sob a curva de concentração-tempo de tempo 0 a 42 dias; AUC0-inf = área sob a curva de concentração-tempo extrapolada de tempo 0 a infinito; CI = intervalo de confidência; Cmáx = concentração de fármaco de plasma observada máxima; CV% = coeficiente de variação; PK = farmacocinéticas; SD = desvio padrão.

[00108] A estimativa de inclinação Cmáx foi 1,172 com 90% de CI de 1,105 a 1,240. A estimativa de inclinação AUC0-42d foi 1,088 com 90% de CI de 1,027 a 1,148. A estimativa de inclinação AUC0-inf foi 1,087 com 90% de CI de 1,026 a 1,1. Conclusões Farmacocinéticas

[00109] As Cmáx e AUCs de CD24Fc de plasma aumenta proporcio- nalmente às doses administrada em rato, macaco e humano. A CD24Fc de plasma alcança Tmáx entre 1,01 e 1,34 horas. A t½ de CD24Fc de plasma variou entre 280,83 e 327,10 horas. Exemplo 5 CD24 pode ser usada para tratar doença de enxerto versus doen- ça de hospedeiro em indivíduos

[00110] Um ensaio de escalação de dose de Fase IIa controlado por placebo, randomizado, duplo-cego, prospectivo, de multicentro, foi realizado para avaliar a adição de uma proteína CD24, CD24Fc, para padrão de profilaxia de GVHD aguda de cuidado em pacientes com câncer que suportam transplante de células estaminais hematopoiéti- cas (HCT) mioeloblativas alogenêicas. O desenho do ensaio é mostra- do na Fig. 12.

[00111] Os objetivos primários do estudo de fase IIa incluem avalia- ção da segurança e tolerabilidade de CD24Fc em combinação com profilaxia de metotrexato e tacrolimus em pacientes que suportam HCT doador não relacionado correspondente após condicionamento mielo- ablativo, e para definir a dose de fase 2 recomendada (RP2D) ou dose tolerada máxima (MTD). Em adição, objetivos de eficácia secundários no estudo de fase IIa incluem: • determinar se a adição de CD24Fc para padronizar meto- trexato e tacrolimus de profilaxia de GVHD de grau II-IV reduz a inci- dência cumulativa de aGVHD no dia 100 após HCT, • estimar sobrevivência livre de aGVHD de grau II – IV

(GFS) no dia 180 após HCT, • descrever a incidência de cGVHD (cGVHD) no 1 ano, • descrever a incidência de recaída um ano após HCT, • descrever a incidência de mortalidade relacionada a transplante (TRM) um ano após HCT, • descrever taxas de infecção no dia 100 após HCT, • avaliar sobrevivência total (OS), ausência de GVHD de grau III-IV, e sobrevivência livre de recaída um ano após HCT, • avaliar condicionamento de toxicidade incluindo mucosite oral e falha de órgão.

[00112] Outros objetivos incluem avaliar o perfil farmacocinético (PK) de CD24Fc, examinando o perfil de célula imune e respostas fun- cionais de APCs e células T após HCT na CD24Fc e grupos de place- bo, e avaliando biomarcadores farmacodinâmicos (PD) tal como as concentrações de plasma de citocinas pró-inflamatórias, DAMPs, lipí- deos, e biomarcadores de GVHD na CD24Fc e grupos de placebo.

[00113] Os pacientes arrolados no ensaio receberem transplantes de doadores não relacionados correspondentes que suportam HCT alogenêico de acordo com prática institucional. Pacientes entre as ida- des de 18-70 anos que suportam HCT alogenêico de doador não rela- cionado para uma condição hematológica malígna com uma classifica- ção de desempenho de Karnofsky  70% foram eligíveis para o estu- do. Uma correspondência alélica de HLA 8/8 entre o doador não rela- cionado e o recipiente em HLA-A, HLA-B, HLA-C, e HLA-DRB1 foi re- querida. Restrição do estudo a pacientes que recebem HCT de doado- res não relacionados é esperada para limitar a heterogeneidade e faci- litar estimativas estatísticas de incidência de aGVHD para subsequen- tes avaliações de eficácia, dada a maior incidência de aGVHD de grau II-IV (60 – 80%) e aGVHD de grau III-IV (20 – 35%) nesta população.

[00114] Este ensaio exclusivamente utiliza regimes de condiciona-

mento mieloablativos e padrão de profilaxia de cuidado (SOC) com- preendendo tacrolimus e metotrexato, visto que estes pacientes expe- rimentam a lesão de tecido mais severa e o fármaco provavelmente terá o efeito biológico mais forte nesta configuração. Todos os pacien- tes receberam condicionamento mieloablativo e padrão de profilaxia de GVHD de cuidado com metotrexato e tacrolimus por o protocolo de fase IIa. Pacientes receberam o regime de condicionamento mieloabla- tivo consistindo de ou fludarabina e busulfan (Flu/Bu 4) ou ciclofosfa- mida e irradiação total do corpo (Cy/TBI), conforme decidido pelo mé- dico de tratamento, seguido por uma infusão de células esteminais no dia 0. Profilaxia de GVHD foi administrada a todos os pacientes e con- sistia de tacrolimus (iniciado Dia -3 antes do transplante) e metotrexato (iniciado Dia +1 após transplante) em combinação com CD24Fc no braço de tratamento ou salina no braço de placebo. Na ausência de GVHD, tacrolimus começou no dia +100. A fonte de células esteminais doaroras foi ou células estaminais de sangue periférico (PBSC) ou medula óssea (BM).

[00115] O ensaio de fase IIa compreende dois coortes de dose as- cendente única (240 mg e 480 mg) e um coorte de multi-dose única de CD24Fc em adição a profilaxia de SOC GVHD conforme esboçado na Tabela 3 abaixo. Conforme mostrado na Fig. 13, no coorte de dose única, o agente de estudo, CD24Fc, foi administrada intravenosamente no dia -1 relativo ao dia de transplante de célula estaminal. Em coorte de multi-dosagem, os pacientes receberam 3 administrações bissema- nalmente de CD24Fc a 480 mg (dia -1), 240 mg (dia +14) e 240 mg (dia +28). Baseado nos dados de PK para CD24Fc este período de dosagem bissemanalmente permitirá a passagem de mais do que du- as meias-vidas. A dosagem é baseada em uma quantidade fixa e não baseada no peso ou BSA. Cada coorte de dosagem arrola 8 indivíduos usando um desenho de razão randomizada 3:1 (6 indivíduos com

CD24Fc e 2 com placebo) para um arrolamento total de 24 pacientes. Tabela 3 Plano de Escalação de Dose de Fase 2ª Nível Dose Tabela CD24Fc Placebo (N°) (Nº) -1 120 mg dia -1 6 2 0 240 mg dia -1 6 2 1 480 mg dia -1 6 2 2 960 480 mg (dia -1) 240 Mg 6 2 (multidose) (dia 14) 240 mg (dia 28)

[00116] A Tabela 4 lista informação demográfica e características clínicas para pacientes na CD24Fc e coortes de placebo, que foram relativamente equilibrados através de fatores de risco tais como idade, malignidade, e comorbidade. A malignidade mais comum em ambos a CD24Fc e coortes de placebo foi AML/MDS (66,7% e 8,3%). 72% dos pacientes no coorte de CD24Fc e 50% no grupo de placebo têm um índice de comorbidade de intermediário ou alto. PBSCs foram mais frequentemente usados como a fonte de enxerto conforme comparado a medula óssea em ambos coortes, e Flu/Bu 4 foi o regime de condici- onamento mais comum através de ambos coortes. Quatro pacientes, todos nos coortes de CD24Fc, suportaram condicionamento de Cy/TBI. Tabela 4 Características de Paciente de Fase 2ª CD24Fc + Placebo + TAC/MTX (N = 18) TAC/MTX (N = 6) Idade (anos) Mediana (faixa) 62 (23-68) 57 (36-66) Gênero (N, %) Fêmea 7 (38,8) 2 (33,3) Macho 11 (61,1) 4 (66,7) Fonte de PBSC 15 (83,3) 4 (66,7) Enxerto (N, %) BM 3 (16,7) 2 (33,3) Malignidade AML/MDS 12 (66,7) 5 (83,3) (N, %) CML 2 (11,1) 0 (0) CMML 1 (5,6) 1 (16,7) ALL 3 (16,7) 0 (0) Índice de Baixo (0) 5 3

CD24Fc + Placebo + TAC/MTX (N = 18) TAC/MTX (N = 6) comorbidade Intermediário 9 2 (classificação) (1-2) Alto (3-4) 4 1 Estado de D+, R+ 5 1 Citomegalo- D+, R 1 0 vírus D, R+ 3 1 D, R 8 4 Regime de Flu/Bu 4 14 (77,8) 6 (100) condicioname Cy/TBI 4 (22,2) 0 (0) nto (N) Dia do Neutrófilo 13,0 (12, 23) 15,5 (12, 18) Enxerto (Dia) (Mín, Máx) Plaquetas 13,0 (9, 23) 15,0 (11, > 48) (Mín, Máx) BM= Medula Óssea; Cy/TBI = ciclofosfamidae/irradiação total do corpo; D = doador; Flu/Bu 4 = fludarabina/busulfan; R = recipiente

[00117] Os objetivos principais do estudo são: avaliar a segurança e tolerabilidade de CD24Fc em indivíduos suportando transplante de cé- lula hematopoiética alogenêica mieloablativa (HCT); e determinar a dose de Fase II recomendada (RP2D) ou dose tolerável máxima (MTD) de CD24Fc em pacientes suportando HCT.

[00118] Todos os pacientes arrolados no estudo completaram o pe- ríodo de tratamento, que é o primeiro dia de tratamento com CD24Fc até 30 dias após HCT para os coortes de dosagem única, ou 60 dias após HCT para o coorte de multidosagem (os dias exatos podem vari- ar dependendo no último dia de administração de fármaco de estudo sem constituir um desvio) e é a avaliação e período de referência para eventos adversos (AE) incluindo toxicidades de limitação de dose po- tencialmente relacionadas ao fármaco de estudo. A Tabela 5 proporci- ona um resumo de toxicidades observadas no ensaio de Fase 2a. To- do este estudo demonstrou que administração IV de CD24Fc até 480 mg é geralmente bem tolerada na população de intenção de tratar (ITT). Nenhuma toxicidades de infusão, toxicidades de limitação de dose (DLTs) ou SAEs atribuíveis ou provavelmente atribuíveis ao fár- maco de estudo foram observadas e nenhum paciente foi removido do estudo.

[00119] Todos os 24 indivíduos arrolados enxertados após trans- plante conforme mostrado na Fig. 14. Um neutrófilo enxertam uma média de 13,0 e 15,5 dias após HCT em CD24Fc exposta e pacientes de placebo, respectivamente. Plaquetas enxertam uma média de 13,0 e 15,0 dias após HCT em CD24Fc exposta e pacientes de placebo, respectivamente, com a exceção de um paciente no grupo de placebo em quais plaquetas não enxertaram e quais morreram no Dia 49. Não existem casos de falha de enxerto. O quimerismo médio de CD3 no dia +30 foi 82,5% (faixa 38-100%) nos pacientes expostos a CD24Fc e 82,0% (faixa, 62%-91%) no grupo de placebo (Fig. 15). O quimerismo de CD3 de doador médio aumenta para 86% (faixa, 42%-100%) no dia 100 nos pacientes expostos a CD24Fc e 84% (faixa, 17%-100%) no grupo de placebo. Quimerismo de CD33 de doador no dia 30 e 100 foi 100% em ambos a CD24Fc e grupos de placebo. Tabela 5 Resumo de Toxicidades Coorte Tratamento # de Pts Infusão Rxn SAE DLT Único CD24Fc 6 0 1 0 240mg Placebo 2 0 2 0 Único 480 CD24Fc 6 0 0 0 mg Placebo 2 0 1 0 Multidose CD24Fc 6 0 4 0 Placebo 2 0 2 1

[00120] Análises de eficácia para o estudo de Fase 2a são conside- radas secundárias e incluem o seguinte: descrever sobrevivência livre de GVHD aguda de grau III-IV (GFS) no dia 180 após HCT; descrever a incidência cumulativa de GVHD aguda de grau II-IV no dia 100 após

HCT; descrever GVHD de grau III-IV, Sobrevivência Livre de Recaída no dia 180 após HCT; descrever GFS agudo de grau II-IV no dia 180 após HCT; descrever incidência de GVHD crônica em um ano após HCT; descrever incidência de recaída em um ano após HCT; descre- ver incidência de mortalidade relacionada a transplante (TRM) em um ano após HCT; descrever taxas de infecção no dia 100 após HCT; avaliar sobrevivência total (OS) e sobrevivência livre de doença (DFS) em um ano após HCT.

[00121] Em adição à inclusão do braço de placebo no estudo de fase IIa, dados nos controles contemporâneos (N = 92) foram coleta- dos das mesmas instituições que suportam HCT de doador não relaci- onado correspondente após o mesmo condicionamento mieloablativo e regimes de profilaxia de GVHD (menos a terapia experimental de CD24Fc) a partir do período de Janeiro de 2012 a Novembro de 2017. Um coorte de controle contemporâneo foi incluído dado o pequeno número de pacientes no braço de controle de placebo. Os dados de- mográficos dos 92 pacientes adultos no coorte de controle contempo- râneo são resumidos na Tabela 6. Tabela 6 Características de Pacientes Arrolados no Coorte de Controle Contemporâneo TAC/MTX (N = 92) Idade (anos) Média (fauxa) 49 (21-69) Fêmea 41 (44,5) Gênero (N, %) Macho 51 (55,5) AML/MDS 63 (68,5) CML 3 (3) Malignidade (N, %) CMML 2 (2) ALL 24 (26,5)

[00122] As Tabelas 7 e 8 proporcionam um resumo dos resultados clínicos do estudo de Fase 2a. GVHD agudo foi graduado de acordo com guias de orientação de consenso utilizadas pelo registro interna-

cional CIBMTR e Blood and Marrow Transplant Clinical Trials Network, e registrados semanalmente.

Pacientes foram avaliados para aGVHD após recebimento de HCT no dia 0 até dia 100 após HCT.

Tabela 7 Resumo de Resultados Clínicos, incluindo a incidência cumu- lativa de aGVHD de grau II-IV e grau III-IV.

Coorte aGVHD (Dia 180) Recaída Morte (Dia 180) (Dia 180) 1) Única Do- Gr II: 2 (pele) Gr III: 0 Gr IV: 0 Gr II-IV: 0 0 se: 240 mg 33,3% (95% de CI, 3,2, 70,4) Gr III-IV: (N=6) 0% 2) Única Do- Gr II: 2 (Pele e GI Superior) Gr III: 1 1 CMML 0 se: 480 mg (GI Inferior) Gr IV: 0 Gr II-IV: 50,0% (d161) (N=6) (95% de CI, 7,7, 82,9) Gr III-IV: 16,7% 3) MultiDose: Gr II: 2 (Pele e GI Superior) Gr III: 0 Gr 1 ALL (d103) 0 (N=6) IV: 0 Gr II-IV: 33,3% (95% de CI, 3,2, 70,4) Gr III-IV: 0% CD24Fc To- Gr II: 6 Gr III: 1 Gr IV: 0 Gr II-IV: 38,9% 2/18 (11,1%) 0/18* tal: (95% de CI, 16,8, 60,7) Gr III-IV: 5,6% Placebo Gr II: 0 Gr III: 1 (GI Inferior) Gr IV: 0 Gr 2/6 (33,3%) 1/6 (16,7%) (N=6) II – IV: 16,7% (95% de CI, 0,5, 54,9) Gr III – IV: 16,7% Controle Con- Gr II: 22 Gr III: 16 Gr IV: 3 Gr II-IV: 19/92 (23,1%) 22/92 (23,9%) temporâneo 50% (Morte como fator de competição) (Morte como (N=92) (95% de CI, 39,8, 60,2) Gr III-IV: 24% fator de com- (Morte como fator de competição) petição) (95% de CI, 17, 31) * Mortes (n=2) após dia 180: Coorte 1 infecções de Pneumonite 2/2 (d 210) e Coorte 2 recaída de CMML (d 196) Tabela 8 Resumo de Resultados Clínicos CD24Fc Placebo Significância Estatística Número 18 6 aGVHD III-IV D100 6% 17% D180 6% 17% 1 ano Recaída 11% 33% 1 ano NRM 6% 17% 1,5 ano RFS 83% 50%

CD24Fc Placebo Significância Estatística 1,5 ano OS 89% 50% P=0,046 D180 Gr III-IV, Sobrevivência 83% 33% P=0,01 Livre de Recaída Incidência de doença de enxerto versus hospedeiro aguda de Grau II a IV pelo Dia 100

[00123] A Tabela 9 resume a incidência cumulativa de GVHD agudo de Grau II a IV pelo Dia 100 para a população de mITT. No total, 7 (38,9%) pacientes que receberam CD24Fc (2 [33,3%] pacientes no coorte de dose única de 240 mg de CD24Fc, 3 [50.0%] pacientes no coorte de dose única de 480 mg de CD24Fc, e 2 [33,3%] pacientes no coorte de dose múltipla de 960 mg de CD24Fc) e 1 (16,7%) paciente que receberam placebo tem GVHD agudo de Grau II a IV pelo Dia

100. Adicionalmente, 1 (16,7%) paciente que recebeu placebo morreu sem GVHD agudo de Grau II a IV pelo Dia 100. Pacientes que esta- vam vivos com nenhuma ocorrência de GVHD agudo de Grau II a IV através do Dia 100 foram censurados em sua última avaliação para GVHD agudo em ou antes do Dia 100. Pelo menos 50,0% de pacien- tes em cada grupo de tratamento foram censurados. Tabela 9 Incidência Cumulativa de Doença de Enxerto Versus Hospe- deiro Aguda de Grau II a IV pelo Dia 100 – População de mITT Estatística Placebo CD24Fc24 CD24Fc48 CD24Fc960 CD24FcTo (N=6) 0 mgDose 0 mgDose mgDose tal única única Múltipla (N=18) (N=6) (N=6) (N=6) No. de pacientes 1 (16,7) 2 (33,3) 3 (50,0) 2 (33,3) 7 (38,9) com GVHD agudo de Grau II-IV pelo Dia 100 (n, %) No. de pacientes que 1 (16,7) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) morreram sem GVHD agudo de Grau II-IV por Dia 100 (n, %)

Estatística Placebo CD24Fc24 CD24Fc48 CD24Fc960 CD24FcTo (N=6) 0 mgDose 0 mgDose mgDose tal única única Múltipla (N=18) (N=6) (N=6) (N=6) No. de pacientes 4 (66,7) 4 (66,7) 3 (50,0) 4 (66,7) 11 (61,1) censurados (n, %) Incidência cumulativa 16,7 33,3 50,0 33,3 38,9 (%) de GVHD agudo de Grau II-IV por Dia 100 [1] 95% de CI (0,5, 54,9) (3,2, 70,4) (7,7, 82,9) (3,2, 70,4) (16,8,60,7) Comparação de tratamento: CD24Fc versus placebo [2] Razão de perigo (90% de CI) 2,6 (0,5, 14,7) Nota: Dia 100 = Dia 100 (+7 dias) pós-transplante (isto é, Estudo Dia 108).Percentagem foi calculada usando o número de pacientes na título da coluna como o denominador.Graus foram baseados na escala de graduação de CIBMTR. A incidência cumulativa (%) de GVHD agudo pelo Dia 100 e os 95% de CI foram estimados usando a função de incidência cumulativa com morte sem GVHD agudo de Grau II a IV como um risco de competição.Razão de perigo e 90% de CI foram baseadas em um modelo Fino e Cinza com tratamento como uma covariante e morte sem covariate de Grau II a IV como um risco de competição.CI = intervalo de confidência; CIBMTR = Centro Internacional de Pesquisa de Transplante de Sangue e Medula.; GVHD = doença de enxerto versus hospedeiro; No. = número.

[00124] Em geral, a incidência cumulativa de GVHD agudo de Grau II a IV pelo Dia 100 (com 95% de CI) foi 38,9% (16,8%, 60,7%) para o grupo de tratamento de CD24Fc e 16,7% (0,5%, 54,9%) para o grupo de placebo. A razão de perigo (com 90% de CI) para CD24Fc versus placebo foi 2,6 (0,5, 14,7). A incidência cumulativa de aGVHD de grau II-IV foi 50% no controle contemporâneo. No grupo tratado com CD24Fc, quatro casos de aGVHD de grau II envolveram pele somente e dois casos envolveram pele e o trato gastrointestinal (GI) superior. Não existem casos de aGVHD de grau II no grupo de placebo. Sobrevivência livre de doença de enxerto versus hospedeiro de Grau II-IV através do Dia 180

[00125] A Tabela 10 resume GFS agudo de Grau II a IV através do Dia 180 para População de mITT. A estimativa de Kaplan-Meier de GFS agudo de Grau II a IV média não foi alcançada em qualquer gru- po de tratamento. Em geral, a taxa de GFS agudo de Grau II a IV no

Dia 180 (com 95% de CI) foi 61,1% (35,3%, 79,2%) para o grupo de tratamento de CD24Fc e 50,0% (11,1%, 80,4%) para o grupo de pla- cebo.

A razão de perigo (com 90% de CI) para CD24Fc versus place- bo foi 0,8 (0,3, 2,5). Pacientes que estavam vivos e não tem ocorrência documentada de GVHD agudo de Grau II a IV da data de corte de da- dos foram censurados na última data de avaliação de GVHD agudo em ou antes do Dia 180. Em adição ao tamanho de amostra pequeno, pelo menos 50,0% de pacientes em cada grupo de tratamento foram censurados.

Tabela 10 Sobrevivência Livre de Doença de Enxerto Versus Hospe- deiro Aguda de Grau II-IV Através do Dia 180 – População de mITT Estatística Placebo CD24Fc240 CD24Fc480 CD24Fc960 CD24FcTotal (N=6) mg Dose mg Dose mg Doses (N=18) Única Única Múltiplas (N=6) (N=6) (N=6) No. de pa- 3 (50,0) 2 (33,3) 3 (50,0) 2 (33,3) 7 (38,9) cientes com eventos (n, %) Evento que mais cedo contribui GVHD Agudo 2 (33,3) 2 (33,3) 3 (50,0) 2 (33,3) 7 (38,9) (Grau II-IV) Morte 1 (16,7) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) No. de pa- 3 (50,0) 4 (66,7) 3 (50,0) 4 (66,7) 11 (61,1) cientes cen- surados (n, %) GVHD Agudo (Grau II-IV)–sobrevivência livre (dias) Estimativa de Kaplan-Meier [1] Média NE NE NE NE NE (95% de CI) Média (SD) [2] 144,2 145,7 116,2 150,5 137,4 (74,81) (74,98) (77,01) (86,69) (68,96) Média [2] 190,0 195,0 121,0 195,0 195,0 Mín, Máx [2] 46, 195+ 32, 195+ 24, 195+ 59, 195+ 24, 195+ Comparação de tratamento: CD24Fc versus placebo [3] Razão de perigo (90% de CI) 0,8 (0,3, 2,5)

Estatística Placebo CD24Fc240 CD24Fc480 CD24Fc960 CD24FcTotal (N=6) mg Dose mg Dose mg Doses (N=18) Única Única Múltiplas (N=6) (N=6) (N=6) Taxa (%) de 50,0 66,7 50,0 66,7 61,1 seres vivos (11,1, (19,5, 90,4) (11,1, 80,4) (19,5, 90,4) (35,3, 79,2) sem GVHD 80,4) agudo (Grau II- IV) no Dia 180 (95% de CI) [4] Nota: Dia 180 = Dia 180 (+14 dias) pós-transplante (isto é, Estudo Dia 195).Percentagem foi calculada usando o número de pacientes no título da coluna como o denominador.O 95% de CI para média foi computado usando o método de Brookmeyer e Crowley com transformação de log-log.Censura foi ignorada no cálculo para média (SD) e mediana. A "+" após o mín ou máx indica uma observação censurada.Razão de perigo e 90% de CI foram baseados em um modelo de perigos proporcional Cox com tratamento como uma covariante.Estimativa de Kaplan-Meier.CI = intervalo de confidência; GVHD = doença de enxerto versus hospedeiro; log = logaritmo; máx = máx- imo; mín = mínimo; NE = não estimável; No. = número; SD = desvio padrão. GFS agudo de Grau III a IV através do Dia 180 para a População de mITT

[00126] Conforme mostrado na Tabela 11, no total, 1 (5,6%) pacien- te que recebeu CD24Fc (1 [16,7%] paciente no coorte de dose única de 480 mg de CD24Fc) e 2 (33,3%) pacientes que receberam placebo tem GVHD agudo de Grau III a IV pelo Dia 180. Em geral, a taxa de GFS agudo de Grau III a IV no Dia 180 (com 95% de CI) foi 94,4% (66,6%, 99,2%) para o grupo de tratamento de CD24Fc e 50,0% (11,1%, 80,4%) para o grupo de placebo. A razão de perigo (com 90% de CI) para CD24Fc versus placebo foi 0,1 (0,0, 0,7). Pacientes que estavam vivos e não tem ocorrência documentada de GVHD agudo de Grau III a IV da data de corte de dados foram censurados na última data de avaliação de GVHD agudo em ou antes do Dia 180. Pelo me- nos 50,0% de pacientes em cada grupo de tratamento foram censura- dos. A taxa de GFS agudo de Grau III a IV no Dia 180 foi 24% no coor-

te de controle contemporâneo. A Figure 30 mostra a Sobrevivência Livre de GVHD de Grau III-IV 180 Dia no grupo de CD24Fc comparado ao grupo de controle de placebo (FIG. 31A) e o grupo de controle con- temporâneo (FIG. 31B). Tabela 11 Sobrevivência Livre de Doença de Enxerto Versus Hospe- deiro Aguda de Grau III a IV Através do Dia 180 – População de mITT Estatística Placebo CD24Fc240 CD24Fc480 CD24Fc96 CD24Fc (N=6) mg Dose mg Dose 0 mg Total Única Única Doses (N=18) (N=6) (N=6) Múltiplas (N=6) No. de pacientes 3 (50,0) 0 (0,0) 1 (16,7) 0 (0,0) 1 (5,6) com eventos (n, %) Evento que mais cedo contribui GVHD Agudo (Grau 2 (33,3) 0 (0,0) 1 (16,7) 0 (0,0) 1 (5,6) III-IV) Morte 1 (16,7) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) No. de pacientes 3 (50,0) 6 (100,0) 5 (83,3) 6 (100,0) 17 (94,4) censurados (n, %) GVHD Agudo (Grau III-IV)–sobrevivência livre (dias) Estimativa de Kaplan-Meier [0] Média (95% de CI) NE NE NE NE NE Média (SD) [0] 144,2 195,0 166,5 195,0 185,5 (74,98) (0,00) (69,81) (0,00) (40,31) Média [0] 190,0 195,0 195,0 195,0 195,0 Mín, Máx [0] 46, 195+ 195+, 195+ 24, 195+ 195+, 195+ 24, 195+ Comparação de tratamento: CD24Fc versus placebo [0] Razão de perigo (90% CI) 0,1 (0,0, 0,7) Taxa (%) de seres 50,0 100,0 83,3 100,0 94,4 vivos sem GVHD (11,1, 80,4) (NE) (27,3, 97,5) (NE) (66,6, 99,2) agudo (Grau III-IV) no Dia 180 (95% de CI) [0] Nota: Dia 180 = Dia 180 (+14 dias) pós-transplante (isto é, Estudo Dia 195).Percentagem foi calculada usando o número de pacientes no título da coluna como o denominador.O 95% de CI para média foi computado usando o método de Brookmeyer e Crowley com transformação de log-log.Censura foi ignorada no cál- culo para média (SD) e mediana. A "+" após o mín ou máx indica uma observação censurada.Razão de perigo e 90% de CI foram baseados em um modelo de perigo proporcional Cox com tratamento como uma covariante.Estimativa de Kaplan- Meier.CI = intervalo de confidência; GVHD = doença de enxerto versus hospedeiro; log = logaritmo; máx = máximo; mín = mínimo; NE = não estimável; No. = número; SD = desvio padrão.

[00127] Todos os pacientes que desenvolveram aGVHD no estudo no tempo do corte de dados responderam a tratamento de esteróide, conforme comparado a taxa de resposta de 50% observada no contro-

le de coorte contemporâneo. Após os primeiros cem dias pós HCT, os pacientes foram avaliados trimestralmente para início tardio de aGVHD (definida como início de GVHD aguda após dia 100), ou cGVHD até um ano após HCT. Nenhum evento adicional de aGVHD foi observado nos coortes de CD24Fc após Dia 100 pós-transplante.

[00128] A FIG. 16 mostra a incidência cumulativa de GVHD aguda de Grau II-IV e Grau III-IV no coorte de tratamento (CD24Fc). Em par- ticular, somente um paciente tem GVHD de Grau III que envolveu o GI mais baixo e nenhum GVHD de fígado foi observado. A incidência cu- mulativa de aGVHD de grau III-IV no Dia 180 após HCT nos coortes de CD24Fc tende mais baixa do que a aGVHD de grau III-IV no Dia 180 no controle contemporâneo (P = 0,097). Existe um caso adicional de aGVHD de Grar III no Dia 182, que resulta em morte no dia 184, em um paciente no grupo de placebo. Este paciente tem uma recaída de leucemia no Dia 145. Estes resultados sugerem que CD24Fc em adição a prifilaxia de metotrexato e tacrolimus reduz o risco de desen- volvimento mais sério de aGVHD de grau III e IV em pacientes que suportam HCT após recebimento de condicionamento mieloablativo. Sobrevivência livre de doença 1 ano após transplante de células estaminais hematopoiéticas

[00129] A Tabela 12 resume sobrevivência livre de doença (DFS) 1 ano pós HCT para a População de mITT. A estimativa média de DFS Kaplan-Meier não foi alcançada para qualquer grupo de tratamento. Em geral, a taxa de DFS em 1 ano pós-HCT (com 95% de CI) foi 83,3% (56,8%, 94,3%) para o grupo de tratamento de CD24Fc e 50,0% (11,1%, 80,4%) para o grupo de placebo. A razão de perigo (com 90% de CI) para CD24Fc versus placebo foi 0,2 (0,1, 0,9). Paci- entes que estavam vivos e não experimentaram recaída de doença no final do período de seguimento foram censurados na última data de avaliação. Pelo menos 50,0% de pacientes em cada grupo de trata-

mento foram censurados. A Figura 31 mostra a Sobrevivência Livre de Recaída no grupo de CD24Fc comparado ao grupo de controle de pla- cebo (FIG. 31A) e ao grupo de controle contemporâneo (FIG. 31B). Tabela 12 Sobrevivência Livre de Doença 1 Ano Após Transplante de Células Estaminais Hematopoiéticas – População de mITT Estatística Placebo CD24Fc240 CD24Fc480 CD24Fc960 CD24Fc (N=6) mg Dose mg Dose mg Doses Total Única Única Múltiplas (N=18) (N=6) (N=6) (N=6) No. de pacientes 3 (50,0) 1 (16,7) 1 (16,7) 1 (16,7) 3 (16,7) com eventos (n, %) Evento que mais cedo contribuiu Recaída 2 (33,3) 0 (0,0) 1 (16,7) 1 (16,7) 2 (11,1) Morte 1 (16,7) 1 (16,7) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (5,6) No. de pacientes 3 (50,0) 5 (83,3) 5 (83,3) 5 (83,3) 15 (83,3) censurados (n, %) Sobrevivência livre de doença (dias) Estimativa de Kaplan-Meier [1] Média NE NE NE NE NE (95% de CI) Média (SD) [2] 232,7 342,5 335,2 324,2 333,9 (152,48) (64,11) (92,82) (109,89) (85,76) Média [2] 256,0 366,0 370,5 366,0 366,0 Mín, Máx [2] 49, 371+ 212, 378+ 146, 380+ 100, 376+ 100, 380+ Comparação de tratamento: CD24Fc versus placebo [3] Razão de perigo (90% CI) 0,2 (0,1, 0,9) Taxa (%) de seres 50,0 83,3 83,3 83,3 83,3 vivos sem recaída (11,1, 80,4) (27,3, 97,5) (27,3, 97,5) (27,3, 97,5) (56,8, 94,3) em 1 ano pós- HCT (95% de CI)

[4] Note: Um ano = Dia 365 (+14 dias) pós-transplante (isto é, Estudo Dia 380).Percentagem foi calculada usando o número de pacientes no título da coluna como o deniminador.O 95% de CI para media foi computado usando o método de Brookmeyer e Crowley com transformação de log-log.Censura foi ignorada no cál- culo para média (SD) e mediana. A "+" após o mín ou máx indica uma observação censurada.Razão de perigo e 90% de CI foram baseados em um modelo de perigo proporcional Cox com tratamento como uma covariante.Estimativa de Kaplan- Meier. Para Dia 365, se o tempo máximo observado foi <Estudo Dia 380, a estima- tiva de Kaplan-Meier no tempo máximo observado é apresentada para um grupo de tratamento.CI = intervalo de confidência; HCT = transplante de células estaminais hematopoiéticas; log = logaritmo; máx = méximo; mín = mínimp; NE = não es- timável; No. = número; SD = desvio padrão.

Sobrevivência total 1 ano após transplante de células estaminais hematopoiéticas

[00130] A Tabela 13 resume sobrevivência total (OS) 1 ano pós- HCT para a População de mITT. A estimativa média de tempo OS de Kaplan-Meier não foi alcançada para qualquer grupo de tratamento. Em geral, a taxa OS em 1 ano (com 95% de CI) foi 83,3% (56,8%, 94,3%) para o grupo de tratamento de CD24Fc e 50,0% (11,1%, 80,4%) para o grupo de placebo. A razão de perigo (com 90% de CI) para CD24Fc versus placebo foi 0,2 (0,1, 1,0). Os pacientes que esta- vam vivos no final do período de seguimento foram censurados na úl- tima data que eles foram conhecidos estarem vivos. Pelo menos 50,0% de pacientes em cada grupo de tratamento foram censurados. Tabela 13 Sobrevivência Livre de Doença 1 Ano Após Transplante de Células Estaminais Hematopoiéticas – População de mITT Estatística Placebo CD24Fc240 CD24Fc48 CD24Fc960 CD24Fc (N=6) mg Dose 0 mg mg Doses Total Única (N=6) Dose Múltiplas (N=18) Única (N=6) (N=6) No. de pa- 3 (50,0) 1 (16,7) 1 (16,7) 1 (16,7) 3 (16,7) cientes que morreram (n, %) No. de pa- 3 (50,0) 5 (83,3) 5 (83,3) 5 (83,3) 15 (83,3) cientes cen- surados (n, %) Sobrevivência total (dias) Estimativa de Kaplan-Meier [1] Média NE NE NENE NE (95% de CI) Média (SD) 276,3 343,0 (64,34) 343,5 367,2(6,01) 351,2

[2] (132,25) (72,45) (53,91) Média [2] 341,5 366,5 370,5 366,0 366,5 Mín, Máx [2] 49, 371+ 212, 378+ 196, 380+ 358+, 376+ 196, 380+ Comparação de tratamento: CD24Fc versus placebo [3]

Estatística Placebo CD24Fc240 CD24Fc48 CD24Fc960 CD24Fc (N=6) mg Dose 0 mg mg Doses Total Única (N=6) Dose Múltiplas (N=18) Única (N=6) (N=6) Razão de perigo (90% de CI) 0,2 (0,1, 1,0) Taxa (%) de 50,0 83,3 83,3 83,3 83,3 seres vivos (11,1, 80,4) (27,3, 97,5) (27,3, 97,5) (27,3, 97,5) (56,8, 94,3) em 1 ano de pós-HCT (95% de CI)

[4] Note: Um ano = Dia 365 (+14 dias) pós-transplante (isto é, Estudo Dia 380).Percentagem foi calculada usando o número de pacientes no título da coluna como o deniminador.O 95% de CI para média foi computado usando o método de Brookmeyer e Crowley com transformação de log-log.Censura foi ignorada no cálculo para média (SD) e mediano. A "+" após o mín ou máx indica uma observação censurada.Razão de perigo e 90% de CI foram baseados em um modelo de perigo proporcional de Cox com tratamento como uma covariante.Estimativa de Kaplan-Meier. Para Dia 365, se o tempo máximo observado foi <Estudo Dia 380, a estimativa de Kaplan-Meier no tempo máximo observado é apresentada para um grupo de tratamento.CI = intervalo de confidência; HCT = transplante de células estaminais hemato- poiéticas; log = logaritmo; máx = máximo; mín = mínimo; NE = não es- timável; No. = número; SD = desvio padrão.

[00131] Estimativas de sobrevivência total (OS) a cerca de 800 dias pós HCT para pacientes no estudo de fase IIa são também encoraja- doras. A sobrevivência total (OS) foi cerca de 80% para pacientes nos coortes de CD24Fc, 50% para pacientes no coorte de placebo (p=0,06) (FIG. 20), e 50% para pacientes no controle contemporâneo (p=0,05) (FIG. 21). O OS aperfeiçoados nos pacientes expostos a CD24Fc conforme comparado aos pacientes de controle de placebo e de controle contemporâneo suporta as outras descobertas descritas acima que mostram que administração de CD24Fc em combinação com metotrexato e tacrolimus pode produzir um aperfeiçoamento substancial no resultado em pacientes que suportam HCT após condi- cionamento mieloablativo. Sobrevivência livre de doença aguda de Enxerto-versus-

hospedeiro e sobrevivência livre de recaída (aGRFS) através do Dia 180

[00132] Estratégias terapêuticas designadas para impedir GVHD podem resultar em um aumento na recaída de leucemia devido a uma redução do efeito de Enxerto Versus Leucemia (GVL). Conforme mos- trado na Tabela 7, a incidência de recaída de leucemia em pacientes expostos a CD24Fc no Dia 180 pós HCT (11%) é mais baixa conforme comparada a pacientes no grupo de placebo (33%) e o controle con- temporâneo (23%). Um indivíduo no coorte de CD24Fc de 480 mg ex- perimentou recaída de CMML no Dia 146, e um indivíduo no coorte de multi-dose de 960 mg de CD24Fc experimentou recaída de ALL no Dia 100 pós HCT. O paciente com CMML faleceu no Dia 196 devido a leu- cemia. O paciente com recaída de ALL foi tratado com blinatumomab, alcançou remissão completa, e estava vivo como do corte de dados de 8 de agosto de 2018. No coorte de placebo, um paciente experimentou recaída de CMML no Dia 94 e um paciente com recaída de MDS no Dia 146 (o paciente com CMML faleceu no Dia 316 e o paciente com MDS faleceu no Dia 184). Estes resultados sugerem que CD24Fc não interfere com o processo benéfico de enxerto-versus-tumor (GVT), e pode ainda reduzir o risco de recaída de leucemia.

[00133] O número de mortes nos coortes de CD24Fc no Dia 180 pós transplante é mais baixo do que nos coortes de placebo e coortes de controle contemporâneo (Tabela 7). No Dia 180 pós HCT, não exis- tem mortes em qualquer dos coortes de CD24Fc, uma morte devido a pneumonia no coorte de placebo (16,7%), e 22 mortes no controle contemporâneo (23,9%). Aperfeiçoamentos estatisticamente signifi- cantes no ponto final composto de aGVHD de grau III-IV, sobrevivên- cias livre de recaída (RFS) são observadas nos coortes de CD24Fc (83%) conforme comparado ao grupo de placebo (33%) no Dia 180 pós HCT (P = 0,011, ver FIG. 18) e o controle contemporâneo (53%)

no Dia 180 pós HCT (P = 0,017, ver FIG. 19). Este tipo de desfecho tem se tornado aumentadamente popular porque ele na teoria encap- sula o efeito de uma intervenção não somente na supressão de GVHD, mas toxicidade de impacto potencial, infecção e recaída. Em suporte das observações acima, aperfeiçoamentos na aGVHD de grau III-IV, RFS mostra que a administração de CD24Fc em combinação com um metotrexato de padrão ou de cuidado e tacrolimus após um regime de condicionamento mieloablativo é benéfico para pacientes na prevenção de ocorrência de aGVHD, enquanto que não afetando os efeitos de GVL do enxerto.

[00134] A aGRFS através do Dia 180 pós-HCT é um ponto final composto pós hoc em que eventos incluem GVHD aguda de Grau III a IV, recaída, ou morte de qualquer causa. A Tabela 14 resume a GRFS aguda de Grau III a IV através do Dia 180 para a População de mITT.

[00135] A estimativa de Kaplan-Meier da GRFS aguda média de Grau III a IV não foi alcançada para os grupos de tratamento de CD24Fc. Para o grupo de placebo, a estimativa de Kaplan-Meier da GRFS aguda média de Grau III a IV (com 95% de CI) foi 120.0 (46,0, não estimável). Em geral, a taxa de GRFS aguda de Grau III a IV no Dia 180 (com 95% de CI) foi 83,3% (56,8%, 94,3%) para o grupo de tratamento de CD24Fc e 33,3% (4,6%, 67,6%) para o grupo de place- bo. A razão de perigo (com 90% de CI) para CD24Fc versus placebo foi 0,2 (0,0, 0,6). Pacientes que estavam vivos e não tinham documen- tado ocorrência de GVHD aguda de Grau III a IV, GVHD crônica, re- querem terapia imunossupressora sistêmica, ou recaída na data de corte de dados foram censurados na data da última avaliação. Tabela 14 Sobrevivência Livre de Doença Aguda de Enxerto-Versus- Hospedeiro de Grau III a IV e Sobrevivência Livre de Recaída Através do Dia 180 – População de mITT

CD24Fc24 CD24Fc48 CD24Fc96 CD24Fc Placebo 0 mg Dose 0 mg Dose 0 mg Dos- Estatística Total (N=6) Única Única es Múlti- (N=18) (N=6) (N=6) plas (N=6) No. de pacientes com eventos 4 (66,7) 0 (0,0) 2 (33,3) 1 (16,7) 3 (16,7) (n, %) Evento que mais cedo contribuiu GVHD aguda 1 (16,7) 0 (0,0) 1 (16,7) 0 (0,0) 1 (5,6) (Grau III-IV) Recaída 2 (33,3) 0 (0,0) 1 (16,7) 1 (16,7) 2 (11,1) Morte 1 (16,7) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) No. de pacientes censurados 2 (33,3) 6 (100,0) 4 (66,7) 5 (83,3) 15 (83,3) (n, %) Sobrevivência livre de GVHD aguda de Grau III-IV e sobrevivência livre de recaída (dias) Estimativa de Kaplan-Meier [1] Média 120,0

NE NE NE NE (95% de CI) (46,0, NE) 120,8 158,3 179,2 177,5 Média (SD) [2] 195,0(0,00) (67,99) (68,67) (38,78) (45,47) Median [2] 120,0 195,0 195,0 195,0 195,0 Mín, Máx [2] 46, 195+ 195+, 195+ 24, 195+ 100, 195+ 24, 195+ Comparação de tratamento: CD24Fc versus placebo [3] 0,2(0,0, Razão de perigo (90% CI) 0,6) Taxa (%) de seres vivos sem GVHD aguda de 33,3 66,7 83,3 83,3 Grau III-IV ou 100,0(NE) (4,6, 67,6) (19,5, 90,4) (27,3, 97,5) (56,8, 94,3) recaída no Dia 180 (95% de CI)

[4] Nota: Dia 180 = Dia 180 (+14 dias) pós-transplante (isto é, Estudo Dia 195).Percentagem foi calculada usando o número de pacientes no título da coluna como o deniminador.O 95% de CI para média foi computado usando o método de Brookmeyer e Crowley com transformação de log-log.Censura foi ignorada no cálculo para média (SD) e mediano. A "+" após o mín ou máx indica uma observação censurada.Razão de perigo e 90% de CI foram baseados em um modelo de perigo proporcional de Cox com tratamento como uma covariante.Estimativa de Kaplan-Meier.CI = intervalo de confidên- cia; GVHD = doença de enxerto versus hospedeiro; log = logaritmo; máx = máximimo; mín = mínimo; NE = não estimável; No. = número; SD = desvio padrão. Incidência de recaída 1 ano após transplante de células estami- nais hematopoiéticas

[00136] A Tabela 15 resume a incidência cumulativa de recaída 1 ano pós-HCT para a População de mITT.

Em geral, a taxa de incidên- cia cumulativa de recaída em 1 ano pós-HCT (com 95% de CI) foi 11,1% (1,7%, 30,4%) para o grupo de tratamento de CD24Fc e 33,3% (2,9%, 71,1%) para o grupo de placebo.

A razão de perigo (com 90% de CI) para CD24Fc versus placebo foi 0,3 (0,1, 1,4). Pacientes que estavam vivos e não experimentaram recaída no final do período de seguimento (Dia 365 [1 ano]) foram censurados na última data de ava- liação.

Pelo menos 50,0% de pacientes em cada grupo de tratamento foram censurados.

Tabela 15 Incidência Cumulativa de Recaída 1 Ano Após Transplante de Células Estaminais Hematopoiéticas – População de mITT 11 Placebo CD24Fc240 CD24Fc480 CD24Fc960 CD24Fc (N=6) mg Dose mg Dose mg Doses Total Única Única Múltiplas (N=18) (N=6) (N=6) (N=6) No. de pacientes 2 (33,3) 0 (0,0) 1 (16,7) 1 (16,7) 2 (11,1) com recaída por 1 ano pós-HCT (n, %) No. de pacientes que 1 (16,7) 1 (16,7) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (5,6) morreram sem re- caída por 1 ano pós- HCT (n, %) No. de pacientes 3 (50,0) 5 (83,3) 5 (83,3) 5 (83,3) 15 (83,3) censurados (n, %) Incidência cumulativa 33,3 0,0(NE) 16,7 16,7 11,1 (%) de recaída em 1 (2,9, 71,1) (0,5, 54,9) (0,5, 54,9) (1,7, 30,4) ano pós-HCT (95% de CI) [1] Comparação de tratamento: CD24Fc versus placebo [2] Razão de perigo (90% de CI) 0,3 (0,1, 1,4) Nota: Um ano = Dia 365 (+14 dias) pós-transplante (isto é, Estudo Dia 380).Percentagem foi calculada usando o número de pacientes no título da coluna como o deniminador.A incidência cumulativa (%) de recaída 1 ano pós-HCT e o 95% de CI foram estimados usando a função de incidência cumulativa com morte sem recaída como um risco de competição.

Para Dia 365, se o tempo máximo ob- servado foi <Estudo Dia 380, a incidência cumulativa no tempo máximo observado é apresentada para um grupo de tratamento.Razão de perigo e 90% de CI foram baseados em um modelo Fino e Cinza com tratamento como uma covariante e morte sem recaída como um risco de competição.CI = intervalo de confidência; HCT = transplante de células estaminais hematopoiéticas; NE = não estimável; No. = número.

Sobrevivência livre de doença de enxerto versus hospedeiro e sobrevivência livre de recaída (GRFS) 1 ano após transplante de células estaminais hematopoiéticas

[00137] Este GRFS através de 1 ano pós-HCT é um ponto final composto em que eventos incluem GVHD agudo de Grau III a IV, GVHD crônico que requer terapia imunossupressora sistêmica, recaí- da, ou morte de qualquer cause. A Tabela 16 resume GRFS aguda de Grau III a IV 1 ano pós-HCT para a População de mITT.

[00138] A estimativa de Kaplan-Meier da GRFS média (com 95% de CI) foi 229,0 dias (141,0, não estimável) para o grupo de tratamento total de CD24Fc: 247,0 dias (129,0, não estimável) para o coorte de dose única de 240 mg de CD24Fc, 287,0 (24,0, não estimável) para o coorte de dose única de 480 mg de CD24Fc, e 193,5 (100,0, não esti- mável) para coorte de dose múltipla de 960 mg de CD24Fc. A estima- tiva de Kaplan-Meier da GRFS média (com 95% de CI) foi 120,0 dias (46,0, não estimável) para o grupo de placebo. Em geral, a taxa de GRFS em 1 ano pós-HCT (com 95% de CI) foi 32,4% (12,7%, 54,0%) para o grupo de tratamento de CD24Fc e 33,3% (4,6%, 67,6%) para o grupo de placebo. A razão de perigo (com 90% de CI) para CD24Fc versus placebo foi 0,7 (0,3, 1,7). Pacientes que estavam vivos e mão tinham ocorrência documentada da GVHD aguda de Grau III a IV, GVHD crônica requer terapia imunossupressora sistêmica, ou recaída na data de corte de dados foram censurados na última data de avalia- ção. Tabela 16 Sobrevivência Livre de Doença de Enxerto Versus Hospe- deiro e Sobrevivência Livre de Recaída 1 Ano Após Transplante de Células Estaminais Hematopoiéticas – População de mITT

CD24Fc24 CD24Fc480 CD24Fc960 0 mg CD24Fc Placebo mg Dose mg Doses Estatística Dose Úni- Total (N=6) Única Múltiplas ca (N=18) (N=6) (N=6) (N=6) No. de pa- cientes com 4 (66,7) 4 (66,7) 4 (66,7) 4 (66,7) 12 (66,7) evento (n, %) Evento que mais cedo contribuiu GVHD Aguda 1 (16,7) 0 (0,0) 1 (16,7) 0 (0,0) 1 (5,6) (Grau III-IV) GVHD crônica que requer terapia imo- 0 (0,0) 3 (50,0) 2 (33,3) 3 (50,0) 8 (44,4) nosuprresora sistêmica Recaída 2 (33,3) 0 (0,0) 1 (16,7) 1 (16,7) 2 (11,1) Morte 1 (16,7) 1 (16,7) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (5,6) No. de pa- cientes cen- 2 (33,3) 2 (33,3) 2 (33,3) 2 (33,3) 6 (33,3) surados (n, %) Sobrevivência livre de GVHD e sobrevivência livre de recaída (dias) Estimativa de Kaplan-Meier [1] 247,0 229,0 Média 120,0 287,0 193,5(100,0, (129,0, (141,0, (95% de CI) (46,0, NE) (24,0, NE) NE) NE) NE) Média 178,7 260,5 250,3 227,2 246,0 (SD) [2] (151,48) (99,54) (149,68) (123,63) (119,19) Mediano [2] 120,0 247,0 287,0 193,5 229,0 Mín, Máx [2] 46, 371+ 129, 378+ 24, 380+ 100, 376+ 24, 380+ Comparação de tratamento: CD24Fc versus placebo [3] 0,7 Razão de perigo (90% de CI) (0,3, 1,7) Taxa (%) de seres vivos sem GVHD 33,3 33,3 33,3 33,3 32,4 ou recaída a 1 (4,6, 67,6) (4,6, 67,6) (4,6, 67,6) (4,6, 67,6) (12,7, 54,0) ano pós-HCT (95% de CI)

[4]

CD24Fc24 CD24Fc480 CD24Fc960 0 mg CD24Fc Placebo mg Dose mg Doses Estatística Dose Úni- Total (N=6) Única Múltiplas ca (N=18) (N=6) (N=6) (N=6) Nota: Um ano = Dia 365 (+14 dias) pós-transplante (isto é, Estudo Dia 380).Percentagem foi calculada usando o número de pacientes no título da coluna como o deniminador.O 95% de CI para mádia foi computado usando o método de Brookmeyer e Crowley com transformação de log-log.Censura foi ignorada no cálculo para média (SD) e mediano. A "+" após o mín ou máx indica uma observação censurada.Razão de perigo e 90% de CI foram baseados em um modelo de perigo proporcional de Cox com tratamento como uma covariante.Estimativa de Kaplan-Meier.CI = intervalo de confidên- cia; GVHD = doença de enxerto versus hospedeiro; HCT = transplante de células estaminais hematopoiéticas; log = logaritmo; máx = máximo; mín = mínimo; NE = não estimável; No. = número; SD = desvio padrão. Incidência de mortalidade de não recaída 1 ano após transplante de células estaminais hematopoiéticas

[00139] A Tabela 17 resume a incidência cumulativa de NRM 1 ano pós-HCT para a População de mITT. Em geral, a taxa de incidência cumulativa de NRM em 1 ano (com 95% de CI) foi 5,6% (0,3%, 23,1%) para o grupo de tratamento de CD24Fc, e 16,7% (0,5%, 54,9%) para o grupo de placebo. A razão de perigo (com 90% de CI) para CD24Fc versus placebo foi 0,3 (0,0, 2,8). Pacientes que estavam vivos no final do período de seguimento (Dia 365 [1 ano]) sem recaída foram censu- rados na último data em que eram conhecidos por estarem vivos. Pelo menos 50,0% de pacientes em cada grupo de tratamento foram censu- rados. A taxa de incidência cumulativa de NRM no Dia 180 (com 95% de CI) foi 0,0% para o grupo de tratamento de CD24Fc e 16,7% (0,5%, 54,9%) para o grupo de placebo. Tabela 17 Incidência Cumulativa de Mortalidade de Não Recaída 1 Ano Após Transplante de Células Estaminais Hematopoiéticas – popu- lação de mITT

Estatística Placebo CD24Fc24 CD24Fc48 CD24Fc96 CD24FcT (N=6) 0 mg 0 mg 0 mg Dos- otal Dose Úni- Dose Úni- es Múlti- (N=18) ca ca plas (N=6) (N=6) (N=6) No. de pacientes 1 (16,7) 1 (16,7) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (5,6) que morreram sem recaída por 1 ano pós-HCT (n, %) No. de pacientes 2 (33,3) 0 (0,0) 1 (16,7) 1 (16,7) 2 (11,1) com recaída por 1 ano pós-HCT (n, %) No. de pacientes 3 (50,0) 5 (83,3) 5 (83,3) 5 (83,3) 15 (83,3) censurados (n, %) Incidência cumula- 16,7 16,7 0,0(NE) 0,0(NE) 5,6 tiva (%) de NRM a (0,5, 54,9) (0,5, 54,9) (0,3, 23,1) 1 ano pós-HCT (95% de CI) [1] Comparação de tratamento: CD24Fc versus placebo [2] Razão de perigo (90% CI) 0,3 (0,0, 2,8) Nota: Um ano = Dia 365 (+14 dias) pós-transplante (isto é, Estudo Dia 380).Percentagem foi calculada usando o número de pacientes no título da coluna como o deniminador.A incidência cumulativa (%) de NRM a 1 ano pós-HCT e o 95% de CI foram estimados usando a função de incidência cu- mulativa com recaída como um risco de competição. Para Dia 365, se o tempo máximo observado foi <Estudo Dia 380, a incidência cumulativa no tempo máximo observado é apresentada para um grupo de tratamen- to.Razão de perigo e 90% CI foram baseados em um modelo Fino e Cinza com tratamento como uma covariante e recaída como um risco de com- petição.CI = intervalo de confidência; HCT = transplante de células estami- nais hematopoiéticas; NE = não estimável; No. = número; NRM = mortalidade de não recaída. Incidência de doença de enxerto versus hospedeiro crônica 1 ano após célula estaminal hematopoiética

[00140] A Tabela 18 resume a incidência cumulativa de GVHD crô- nica 1 ano pós-HCT para a População de mITT. Em geral, a taxa de incidência cumulativa de GVHD crônica a 1 ano pós-HCT (com 95% de CI) foi 63,3% (34,1%, 82,4%) para o grupo de tratamento de CD24Fc e 33,3% (2,5%, 72,0%) para o grupo de placebo. A razão de perigo (com 90% de CI) para CD24Fc versus placebo foi 2,1 (0,6, 7,4). Existem 3 GVHDs crônicas moderadas no coorte de dose única de 240 mg de CD24Fc, 3 GVHDs brandas e 1 GVHD crônica moderada no coorte de dose única de 480 mg de CD24Fc, e 2 GVHDs brandas e 3 GVHDs crônicas moderadas no coorte de dose múltipla de 960 mg de CD24Fc.

Dois pacientes têm GVHD crônica branda no grupo de placebo.

Em geral, não existem exemplos de GVHD crônica severa.

Pacientes que estavam vivos e não experimentaram GVHD crônica no final do período de seguimento (Dia 365 [1 ano]) foram censurados na última data de avaliação.

Tabela 18 Incidência Cumulativa de Doença de Enxerto Versus Hos- pedeiro Crônica 1 Ano Após Transplante de Células Estaminais Hema- topoiéticas – População de mITT CD24Fc CD24Fc CD24Fc 240 mg 480 mg 960 mg CD24Fc Placebo Estatística Dose Dose Doses Total (N=6) Única Única Múltiplas (N=18) (N=6) (N=6) (N=6) No. de pacientes com GVHD crônica 2 (33,3) 3 (50,0) 3 (50,0) 5 (83,3) 11 (61,1) por 1 ano pós-HCT (n, %) No. de pacientes que morreram sem 3 (50,0) 1 (16,7) 1 (16,7) 1 (16,7) 3 (16,7) GVHD crônica por 1 ano pós-HCT (n, %) No. de pacientes 1 (16,7) 2 (33,3) 2 (33,3) 0 (0,0) 4 (22,2) censurados (n, %) Incidência cumula- tiva (%) de GVHD 33,3 50,0 50,0 83,3 63,3 crônica a 1 ano pós- HCT [1] 95% de CI (2,5, 72,0) (7,0, 83,5) (6,9, 83,6) (0,5, 99,4) (34,1, 82,4) Comparação de tratamento: CD24Fc versus placebo [2] 2,1 Razão de perigo (90% CI) (0,6, 7,4)

CD24Fc CD24Fc CD24Fc 240 mg 480 mg 960 mg CD24Fc Placebo Estatística Dose Dose Doses Total (N=6) Única Única Múltiplas (N=18) (N=6) (N=6) (N=6) Nota: Um ano = Dia 365 (+14 dias) pós-transplante (isto é, Estudo Dia 380). Percentagem foi calculada usando o número de pacientes no título da coluna como o deniminador. A incidência cumulativa (%) de GVHD crônica em 1 ano pós-HCT e o 95% de CI foram estimados usando a função de incidência cumulativa com morte sem GVHD crônica como um risco de competição. Se o tempo máximo observado foi <Estudo Dia 380, a incidência cumulativa no tempo máximo observado é apresentada para um grupo de tratamento. Razão de perigo e 90% de CI foram baseadps em um modelo Fino e Cinza com tratamento como uma covariante e morte sem GVHD crônica como um risco de competição. CI = intervalo de confidência; GVHD = doença de enxerto versus hospedeiro; HCT = transplante de células estaminais hema- topoiéticas; No. = número. Taxa de infecção no Dia 100

[00141] Como com o efeito no GVL, estratégias terapêuticas desig- nadas para impedir GVHD através de supressão imune global podem resultar em um aumento nas taxas de infecção, incluindo infecções bacteriais e reativação de CMV.

[00142] A Tabela 19 resume a incidência de infecções através do Dia 100 para a População de mITT. No total, 13 (72,2%) pacientes que receberam CD24Fc (5 [83,3%] pacientes no coorte de dose única de 240 mg de CD24Fc, 2 [33,3%] pacientes no coorte de dose única de 480 mg de CD24Fc, e 6 [100,0%] pacientes no coorte de dose múltipla de 960 mg de CD24Fc) e 2 (33,3%) pacientes que receberam placebo tem uma infecção através do Dia 100.

[00143] Muitas infecções foram consideradas para serem controla- das e resolvidas. Paciente 103-001 no grupo de placebo morreu de pneumonia. Paciente 102-002 no grupo de placebo tem conjuntivite que foi reportada como recuperação/resolução. Paciente 101-010 no coorte de dose única de 480 mg de CD24Fc e Paciente 101-011 no coorte de dose única de 480 mg de CD24Fc ambos têm erupção cutâ- nea pustular que foi reportada como não recuperada/não resolvida.

Paciente 102-006 no coorte de dose múltipla de 960 mg de CD24Fc tem infecção do trato respiratório superior e colite de Clostridium diffici- le que foram reportados como intervenção continuada.

[00144] A maioria das infecções foram pacientes bacteriais (9 [50,0%] que receberam CD24Fc e 2 [33,3%] pacientes que receberam placebo) ou pacientes virais (7 [38,9%] que receberam CD24Fc e 1 [16,7%] paciente que recebeu placebo). A maioria das infecções ocor- reram no sangue (8 [44,4%] de pacientes que receberam CD24Fc e 1 [16,7%] paciente que recebeu placebo), urina (4 [22,2%] de pacientes que receberam CD24Fc e nenhum paciente que recebeu placebo), ou fezes (2 [11,1%] de pacientes que receberam CD24Fc e 2 [33,3%] pa- cientes que receberam placebo). A maioria da bactéria recuperada de cultura de sangue foram inabitantes de pele comum e patógenos de baixa virulência (isto é, estafilococci de ocoagulase negativa). Tabela 19 Resumo de Incidência de Infecções Através do Dia 100 – População de mITT CD24Fc CD24Fc CD24Fc 240 mg 480 mg 960 mg CD24Fc Placebo Dose Dose Doses Total Estatística (N=6) n Única Única Múltiplas (N=18) n (%) (N=6) n (N=6) n (N=6) n (%) (%) (%) (%) No. de pa- cientes com quaisquer in- 2 (33,3) 5 (83,3) 2 (33,3) 6 (100,0) 13 (72,2) fecções Atra- vés do Dia 100 Tipo de infecção Bacterial 2 (33,3) 2 (33,3) 2 (33,3) 5 (83,3) 9 (50,0) Fungal 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (33,3) 0 (0,0) 2 (11,1) Viral 1 (16,7) 3 (50,0) 1 (16,7) 3 (50,0) 7 (38,9) Local de infecção Sangue 1 (16,7) 2 (33,3) 2 (33,3) 4 (66,7) 8 (44,4) Disseminado (2 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (16,7) 1 (5,6) ou mais locais)

CD24Fc CD24Fc CD24Fc 240 mg 480 mg 960 mg CD24Fc Placebo Dose Dose Doses Total Estatística (N=6) n Única Única Múltiplas (N=18) n (%) (N=6) n (N=6) n (N=6) n (%) (%) (%) (%) Fezes 2 (33,3) 1 (16,7) 0 (0,0) 1 (16,7) 2 (11,1) Sistema gas- 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (16,7) 1 (5,6) trointestinal Genitália 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (16,7) 0 (0,0) 1 (5,6) Sistema res- 1 (16,7) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) piratório inferior Pele 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (16,7) 1 (16,7) 2 (11,1) Sistema res- piratório supe- 0 (0,0) 1 (16,7) 0 (0,0) 2 (33,3) 3 (16,7) rior Urina 0 (0,0) 1 (16,7) 1 (16,7) 2 (33,3) 4 (22,2) Percentagem foi calculada usando o número de pacientes no título da coluna como o denominator. No. = número.

[00145] Conforme mostrado na Tabela 20, existem 9 pacientes no grupo de CD24Fc que têm alto risco de reativação de CMV (estado de CMV de Doador/Recipiente antes do HCT: D+/R+, 5; D-/R+, 3; D/R+, 1 desconhecido). Um paciente no grupo CD24Fc com D+/R- tem risco intermediário para reativação de CMV. Oito pacientes no grupo de CD24Fc tem estado de D-/R-, que foi considerado ser de baixo risco. Dois D-/R+ pacientes tem reativação de CMV no Dia 42 e Dia 48, re- presentando 22.2% Incidência cumulativa de reativação de CMV no Dia 100 no grupo de alto risco. Ambos pacientes têm tratamento este- roidal sistêmico antes da detecção de reativação de CMV. Em compa- ração, 2 pacientes no grupo de placebo foram de alto risco de reativa- ção de CMV (D+/R+, 1; D-/R+, 1). Um paciente no grupo de placebo tem reativação de CMV no Dia 47 antes do tratamento esteroidal sis- têmico para GVHD aguda (50,0% em grupo de alto risco).

[00146] Tabela 20 Taxas de infecção de CMV em pacientes de HTC estratificados por estado de CMV doador e recipiente antes do transplante. D=doador, R=recipiente, + é positivo, - é negativo, U é desconhecido. Estado do Citomegalovírus Grupo de CD24Fc Grupo de placebo D+, R+ 5 1 D+, R- 1 0 D-, R+ 3 1 D-, R- 8 4 DU, R+ 1 0

[00147] Em geral, CD24Fc foi bem tolerada no estudo de fase IIa. Não existem toxicidades relacionadas a infusão. Existe um fármaco possível relacionada a TEAE ≥ grau III em pacientes expostos a CD24Fc no grupo de hiperglicemia de 480 mg, que foi controlado com insulina. Uma toxicidade limitante de dose (DLT) foi observada no gru- po de placebo, e nenhum DLT foi observado nos grupos de CD24Fc. Não existem efeitos adversos que conduzem a morte em pacientes administrados com CD24Fc dentro de 180 dias (pelo menos 150 dias após a última dosagem de CD24Fc). Existe um efeito adverso de pneumonia que conduz a morte de um indivíduo no Dia 48 no grupo de placebo. Um paciente no grupo de CD24Fc morreu 7 meses após HCT, embora a morte seja determinada para ser diferentemente rela- cionada ao fármaco de estudo. Anticorpos antidroga (ADA) não foram detectados em qualquer dos 24 pacientes em qualquer ponto fora do dia 100 após HCT.

[00148] Os TEAEs mais comuns ≥ grau III (> 10%) incluem uma diminuição nas contagens de plaquetas (83,3% de placebo e 94,4% de CD24Fc), diminuição nas contagens de WBC (66,7% de placebo e 88,9% de CD24Fc), diminuição nas contagens de neutrófilos (50% de placebo e 83,3% de CD24Fc), diminuição nas contagens de linfócitos (50% de placebo e 77,8% de CD24Fc), anemia (50% de placebo e 66,7% de CD24Fc), estomatite (83,3% de placebo e 50% de CD24Fc), e náusea (0% de placebo e 11,1% de CD24Fc). Estes SAEs são con-

sistentes com o perfil de segurança conhecido de regimes de condici- onamento mioeloablativos usados no HCT.

[00149] O condicionamento mieloablativo para HCT é frequente- mente associado com várias toxicidades relacionadas a regimes inclu- indo falha de órgão. A falha de órgão é a causa mais frequente de mortalidade relacionada a transplante de começo precoce (TRM) ou mortalidade de não recaída (NRM). No grupo de CD24Fc de 18 paci- entes, nenhum dos pacientes morreu dentro dos primeiros 100 dias pós HCT, enquanto que 1 de 6 no grupo de placebo morreu no Dia 48 devido a falha respiratória. Resultados Farmacocinéticos

[00150] As Figuras 22-23 mostram os dados de PK a partir dos três coortes de escalação do ensaio de Fase 2a. A meia-vida dos coortes de dose única de 240 e 480 mg (FIG. 22) foi ao redor de cerca de 14 dias, que é consistente com os dados vistos em indivíduos saudáveis. Em 480mg existe cmx mais alto, mas no aumento real na exposição após 14 dias, o tempo de incidência de espreita e gravação. No coorte de multidose final existe exposição aumentada através do dia 60 con- forme esperado (FIG. 23), o período durante o qual pacientes são mais susceptíveis a desenvolver GVHD.

[00151] A Tabela 21 resume os parâmetros de PK de plasma de CD24Fc para a População de PK nos coortes de dose única. A média geométrica, valores de Cmáx,-1d foram 52,145,41 e 84,155,08 ng/mL, a média geométrica, valores de AUC0-último,-1d foram 10,156,549,9 e 15,522,686,2 ng h/mL, a média geométrica, valores de AUC0-42d foram 9,275,562,3 e 13,903,718,4 ng h/mL, e a média geométrica, valores de AUC0-inf foram 10,383,503,9 e 15,716,616,4 ng h/mL para os coortes de dose única de 240 e 480 mg de CD24Fc, respectivamente. Média tmáx,-1d foi 2,10 h para ambos os coortes de dose única de 240 e 480 mg de CD24Fc. Os valores médios de t½ foram 414,739 e 406,648 h e os valores médios de λz foram 0,0018 e 0,0017 h-1 para os coortes de dose única de 240 e 480 mg de CD24Fc, respectivamente. Os valores médios Vz foram 13,83 e 18,18 L, e os valores médios CL foram 0,024 e 0,031 L/h para os coortes de dose única de 240 e 480 mg de CD24Fc, respectivamente. Tabela 20 Resumo de Parâmetros Farmacocinéticos de Plasma de CD24Fc – Popuçação de PK – Coortes de Dose Única CD24Fc 240 mg Dose CD24Fc 480 mg Dose Parâmetro de PK Única Única (Unidade) N Estatística N Estatística Cmáx,-1d (ng/mL) [0] 6 52,145,41 (22,3) 6 84,155,08 (24,6) tmáx,-1d (h) [0] 6 2,10 (2,1, 2,4) 6 2,10 (2,0, 2,2) AUC0-42d (ngh/mL) 13,903,718,4 6 9,275,562,3 (23,2) 6

[0] (19,7) AUC0-último,-1d 10,156,549,9 15,522,686,2 6 6 (ngh/mL) [0] (26,2) (21,3) 10,383,503,9 15,716,616,4 AUC0-inf (ngh/mL) [0] 6 6 (25,2) (21,5) AUCextrap (%) [0] 6 2,17 (1,669) 6 1,23 (0,519) -1 λz (h ) [0] 6 0,0018 (0,0005) 6 0,0017 (0,0002) 414,739 t½ (h) [0] 6 6 406,648 (62,3044) (110,4483) Vz (L) [0] 6 13,83 (3,586) 6 18,18 (4,529) CL (L/h) [0] 6 0,024 (0,0059) 6 0,031 (0,0071) 2 0,5 CV% geométrico = 100*(exp(SD )-1) , onde SD é o desvio padrão dos dados de transformada de logaritmo. 1. Média geométrica (CV% geométrico) 2. Média (mínima, máxima) Média (SD) λz = Constante de taxa de eliminação terminal aparente; AUC0-42d = a área sob a con- cetração de plasma versus curva de tempo 0 para Dia 42; AUC0-inf = a área sob a concentração versus curva de tempo do tempo 0 extrapo- lado a infinito; AUC0-último,-1d = a área sob a concentração de plasma versus curva de tempo de tempo 0 à última concentração de fármaco de plasma mensurável para dosagem do Dia -1; AUCextrap = percent- agem de AUC0-inf que foi devido a extrapolação a partir da última con- centração de fármaco de plasma mensurável para infinito; CL = limpe- za do corpo total após administração intravenosa; Cmáx,-1d = concen- tração de plasma máxima observada para dosagem do Dia -1; CV% = coeficiente de variação; PK = farmacocinética; SD = desvio padrão; t½ = meia-vida de eliminação termimal aparente; tmáx,-1d = o tempo de concentração de plasma máxima observada para dosagem do Dia -1; Vz = volume de distribuição baseado na fase de eliminação terminal.

[00152] A Tabela 22 resume os parâmetros de PK de plasma de CD24 Fc para a população PK no coorte de dose múltipla no Dia -1, Dia 28, e Dia -1 a Dia 100. A média geométrica, valores de Cmáx,-1d e Cmáx,28d foram 96,942,71 ng/mL e 62,563,05 ng/mL, respectivamente, para o coorte de dose múltipla de 960 mg de CD24Fc. A média geo- métrica, valores totais de AUC0-último,-1d, AUC0-14d, AUC0-100d, e AUC0- último, foram 12,317,971,2 ng h/mL, 9,688,933,9 ng h/mL, 37,736,555,1 ng h/mL, e 37,363,953,5 ng h/mL, respectivamente, para coortes de dose múltipla de 960 mg de CD24Fc. A média tmáx,-1d e tmáx,28d foram 2,13 h e 2,52 h, respectivamente, para coortes de dose múltipla de 960 mg de CD24Fc. Tabela 20 Resumo de Parâmetros Farmacocinéticos de Plasma de CD24Fc – População de PK – Coorte de Dose Múltipla– Dia -1, Dia 28, e Dia -1 a Dia 100 Parâmetro CD24Fc 960 mg CD24Fc 960 mg CD24Fc 960 mg PK (Uni- Doses Múltiplas Doses Múltiplas Doses Múltiplas Dia dade) Dia -1 Dia 28 -1 a Dia 100 N Estatística N Estatística N Estatística Cmáx,-1d 6 96,942,71 (41,5) - - - - (ng/mL) [0] tmáx,-1d (h) [0] 6 2,13 (2,0, 3,2) - - - - AUC0-último,-1d 6 12,317,971,2 - - - - (ngh/mL) [0] (24,9) Cmáx,28d - - 6 62,563,05 (34,1) - - (ng/mL) [0] tmáx,28d (h) [0] - - 6 2,52 (2,0, 4,0) - - Cmín (ng/mL) - - 6 13,233,79 (33,6) - -

[0] Tmin (h) [0] - - 6 0,00 (0,0, 308,2) - - AUC0-14d - - 6 9,688,933,9 - - (ngh/mL) [0] (30,9) Cmédio - - 6 28,836,11 (30,9) - - (ng/mL) [0] Clss (L/h) [0] - - 6 0,026 (0,0078) - - AUC0-último,total - - - - 6 37,363,953,5 (ngh/mL) [0] (27,6)

Parâmetro CD24Fc 960 mg CD24Fc 960 mg CD24Fc 960 mg PK (Uni- Doses Múltiplas Doses Múltiplas Doses Múltiplas Dia dade) Dia -1 Dia 28 -1 a Dia 100 N Estatística N Estatística N Estatística AUC0-100d - - - - 6 37,736,555,1 (ngh/mL) [0] (29,3) 2 0,5 CV% geométrico = 100*(exp(SD )-1) , onde SD é o desvio padrão deos dados de transformada de logaritmo. 1. Média geométrica (CV% geométrico) Média (mínimo, máximo) Média (SD) AUC0-14d = a área sob a concentração de plasma versus curva de tempo do tempo 0 a Tau; AUC0-100d = a áres sob a concentração versus curva de tempo do tempo 0 no Dia -1 a Dia 100; AUC0-último,-1d = a áres sob a concentração de plasma versus curva de tempo do tempo 0 à última concentração de fármaco de plasma mensurável para dosagem do Dia -1; AUC0-último,total = a áres sob a concentração de plasma versus curva de tempo do tempo 0 no Dia -1 à última concentração de fár- maco de plasma mensurável após a última dose no Dia 28; Cmé- dio = calculado como AUC0-14d dividido por Tau; Clss = calculado como Dose/AUC0-14d; Cméx,-1d = concentração de plasma observada máxima para dosagem do Dia -1; Cmáx,28d = concentração de plasma observada máxima entre tempo de dose e tempo de dose + Tau para dosagem do Dia 28; Cmín = concentração mínima entre tempo de dose e tempo de dose + Tau (no tempo de concentração mínima amostrada durante um interval de dos- agem); CV% = coeficiente de variação; PK = farmacocinética; SD = desvio padrão; tmáx,-1d = o tempo de concentração de plasma observada máxima para dosagem do Dia -1; tmáx,28d = o tempo de concentração de plasma ob- servada máxima durante um intervalo de dosagem para dosagem do Dia 28; Tmin = tempo de concentração mínima amostrada durante um intervalo de dosagem.

[00153] A evidência clínica do estudo de fase IIa sugere fortemente que CD24Fc, administrada em combinação com metotrexato e tacroli- mus, aperfeiçoa grandemente os resultados em pacientes de leucemia suportando alo-HCT mieloablativo por redução de ambos a probabili- dade de aGVHD severa (graus III-IV) e a probabilidade de recaída de leucemia. Conforme descrito acima, a incidência cumulativa de aGVHD de grau III-IV é 5,6% em pacientes de CD24Fc expostos con- forme comparado a 16,7% no coorte de placebo (salina mais metotre- xato e tacrolimus) e 24% no coorte de controle contemporâneo (meto- trexato e tacrolimus sozinhos). Estes dados sugerem que administra- ção de CD24Fc em combinação com metotrexato e tacrolimus como profilaxia reduz o risco de aGVHD de grau III-IV em pacientes de HCT, os graus mais sérios de aGVHD que estão associados com risco au- mentado de mortalidade de não recaída. Uma tendência de redução é observada na incidência de recaída em pacientes que receberam CD24Fc (11,1%) conforme comparado a pacientes que não recebe- ram, ambos conforme comparados ao braço de placebo (33,3%) e o controle contemporâneo (23%), demonstrando que CD24Fc não afeta os efeitos de GVT do enxerto, e podem ainda reduzir o risco de recaí- da de leucemia. O benefício de incluir CD24Fc em regimes de profila- xia de GVHD padrões é adicionalmente suportado pelo melhor NRM em pacientes de CD24Fc expostos (5,6%) conforme comparado0s a placebo (16,7%), melhor sobrevivência total de 1,5 anos (89% versus 50%, controle de CD24Fc versus placebo), uma aperfeiçoamento esta- tisticamente significante em aGVHD RFS de grau III-IV (83% versus 33%, controle de CD24Fc versus placebo, respectivamente), uma re- dução dependente da dose em várias mucosites, e um bom perfil de segurança com somente um TEAE relacionado ao fármaco (grau III) observado no estudo.

[00154] Um agente de profilaxia que reduz o risco de ambos aGVHD e recaída de leucemia seria novo e extremamente benéfico a pacientes com leucemia suportando alo-HCT após condicionalento mi- eloablativo. Conforme descrito acima, os dados clínicos anteriores neste pedido sugerem fortemente que administração de CD24Fc em combinação com metotrexato e tacrolimus proporciona um substancial aperfeiçoamento sobre regimes de profilaxia existentes nos pontos fi- nais clinicamente significantes de prevenção de aGVHD de grau III-IV e recaída de leucemia, e, desse modo, deve ser elegível para Break- through Designation. Os efeitos de CD24Fc observados na porção de fase IIa do estudo clínico serão adicionalmente investigados na porção de fase IIb, que foi designada para confirmar a eficácia de administra-

ção profilática de CD24Fc ne redução de aGVHD de Grau III-IV e reca- ída de leucemia em pacientes com leucemia suportando alo-HCT após condicionamento mieloablativo. Exemplo 6 CD24 pode ser usado para impedir recaída.

[00155] Os dados de ensaio clínico de fase IIA revelam que profila- xia com CD24Fc em adição a padrão de resultados de cuidado em re- dução 3 vezes de recaída de leucemia quando comparado a controle de placebo que recebeu padrão de cuidado. Estes dados sugerem que, em adição a sua capacidade de preservar efeito de enxerto vs leucemia, CD24Fc pode diretamente reduzir recaída de leucemia em pacientes com leucemia que suportam transplante de células estami- nais hematopoiéticas (HCT).

[00156] Um mecanismo potencial de recaída de leucemia é devido a persistência de células estaminais de leucemia. John Dick e colegas conduziram a reavivamento do conceito de célula estaminal cancerí- gena (CSC) quase 20 anos atrás usando um modelo de leucemia [1]. A atividade de CSC de leucemia foi ensaiada por CFU in vitro e mode- los de transplante xenogenêico in vivo [1]. Ambos modelos foram tam- bém usados para testar drogas para desenvolvimento terapêutico po- tencial como drogas de leucemia [2]. Como a primeira etapa para tes- tar se CD24Fc pode afetar atividade de célula estaminal de leucemia, ensaios de CFU foram realizados para avaliar o efeito potencial de CD24Fc em atividades de célula estaminal de leucemia, incluindo au- to-renovação e produção de células de leucemia. Protocolo experimental

1. Garrafa de descongelar de meio completo de MethoCult à temperatura ambiente durante a noite a 2 - 8°C.

2. Sacudir vigorosamente por 1 min e então deixar assentar a 5 min para permitir que bolhas se elevam para o topo antes do uso.

3. Usar uma seringa de 3 mL fixada a uma Blunt-End Ne- edle de calibrer 18 para dispensar meio MethoCult em tubos estéreis. Dispensar 4 mL por tubo para culturas em triplicata.

4. Preparar placas de cultura de 12 cavidades, adicionar 3- 4 ml de água estéril aos espaços vazios entre as cavidades.

5. Preparar amostras de linha de célula de leucemia, contar células viáveis usando corante azul de trypan.

6. Diluir as células e CD24Fc/IgG Fc de 2% de FBS IMDM a 20X a concentração final requerida para deposição. Exemplo: Para célula THP-1, concentração de deposição final é 500-1000 células por cavidade, preparar uma suspensão de cé- lula de 1x104 - 2x104 células por mL.

7. Para cada cavidade, adicionar 50 µl de células diluídas e 50 µl de CD24Fc diluída ou controle de IgG Fc a 1 mL de meio Metho- Cult. Para um ensaio em triplicata, adicionar 0,2 mL de células diluídas e 0,2 ml de CD24Fc ou IgG Fc a um tubo de meio MethoCult pré- aliquotado de 4 mL. Nota: Esta razão 1:10 (v/v) de células: meio dá a viscosida- de correta para assegurar crescimento ótimo de CFU e morfologia.

8. Vortex o tubo por 10 segundos para misturar os conteú- dos totalmente.

9. Deixar assentar por 5 minutos para permitir que as bo- lhas se elevem para o topo.

10. Fixar uma Blunt-End Needle estéril de calibre 18 a uma seringa estéril de 3 mL. Dispensar a mistura de MethoCult contendo células na placa de cultura, 1,1 ml por cavidade.

11. Distribuir o meio uniformemente através da superfície por inclinação e rotação brandamente da placa para permitir que a placa permita que o meio se fixe à parede do prato em todos os lados.

12. Incubar a 37°C, em 5% de CO2 com ≥ 95% de hu-

midade por 7-14 dias.

13. Contar as colônias usando um microscópio invertido de alta qualidade. Para deposição:

1. Após contagem das colônias, diluir o meio contendo co- lônias por adição de 4 ml de 2% de FBS IMDM a cada cavidade.

2. Para cada cavidade, transferir o total de 5 ml de suspen- são de célula a um tubo de 15 ml. Centrifugar a 500 g por 5 minutos a 4ºC.

3. Remover cuidadosamente o sobrenadante, adicionar 1 ml de 2% FBS IMDM para resuspender as células.

4. Realizar uma contagem de célula usando corante azul trypan para cada tubo.

5. Configurar ensaios de CFU após as mesmas etapas acima (etapas 6-13) em ensaio de CFU. Análise de dados e estatísticas

[00157] As atividades de CFU de 5 linhas de células de leucemia foram expressas como número de colônias gerado de 500-100 células por cavidade. Dados apresentados são médias+/-erros padrões (SEM).

[00158] A auto-renovação de atividades de CFU foi ensaiada por deposição em série. CFUs cumulativos em cada etapa foram calcula- dos baseado nos números cumulativos de células de progenia de leu- cemia nas etapas anteriores e o número de CFU por 500 células, con- forme determinado baseado nas seguintes fórmulas.

[00159] CFU Cumulativo = (Número cumulativo de células de leu- cemia/500)x CFU por 500 células em que o número cumulativo de cé- lulas de leucemia é determinado por

[00160] Número de célula de leucemia cumulativo =(número de cé- lulas de leucemia na etapa prévia/500)x número de células de leuce-

mia na etapa atual.

[00161] Significância estatística (valores P) foram determinados por teste t de duas caudas emparelhadas para estudantes. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. Resultados

1. CD24Fc reduz atividade de CFU de linhas de célula de leucemia múltiplas

[00162] Para determinar o efeito de CD24Fc na capacidade de célu- la estaminal de leucemia in vitro, o número de CFU de cinco linhas de célula de leucemia foi avaliado quando elas foram cultivadas na pre- sença de CD24Fc ou IgG Fc de controle. Conforme mostrado na Tabe- la 12, as linhas de célula incluíam um grupo diverso de leucemia. Tabela 12. Linhas de célula de leucemia Nome Doença Referência THP-1 Leucemia Monocítica Aguda [3] K562 Leucemia Mielógena Crônica [4] Kasumi-1 Leucemia Mieloblástica Aguda [5] NB4 Leucemia Promielocítica Aguda [6] U937 Linfoma Histiocítica [7]

[00163] As médias e erro padrão de números de CFU observados após uma etapa de CD24Fc ou tratamento de IgG Fc são mostrados na Tabela 13 e FIG. 24. Estes dados demonstram que quando compa- rado com IgG Fc, a CD24Fc reduziu significantemente o número de CFU de todas cinco linhas de célula testadas. Tabela 13. CD24Fc suprime amplamente atividades de CFU de leu- cemia in vitro. Linhas de célula Colônias de grupo Colônias de grupo Valor P de leucemia IgG por 103 células de CD24Fc por 103 células THP-1 306 ± 2,5 238 ± 19,4 0,0254 K562 739 ± 21,5 623,3 ± 16 0,0125 Kasumi-1 258,8 ± 1,4 227 ± 10,5 0,0239

Colônias por 500 Colônias por 500 células células NB4 208 ± 5,2 176,4 ± 3,1 0,0009 U937 131,4 ± 3,5 107,2 ± 5,6 0,0064

2. CD24Fc reduz progressivamente auto-renovação de atividades de CFU de leucemia

[00164] Para detectar o efeito de CD24 na auto-renovação de CSC de leucemia, deposição em série de células THP-1 foi realizada. Bre- vemente, células THP-1 foram isoladas de colônias de ou CD24Fc ou placas tratadas com IgG Fc. Quinhentas células THP1 foram cultiva- das novamente em meio de metilcelulose na presença do mesmo fár- maco para um total de 4 etapas. O número de CFU produzido das pri- meiras 500 células THP-1 são número atual de THP-1 CFU de 500 células, enquanto que aquelas etapas subsequentes foram calculadas baseado no número de células de leucemia de tempos de etapa pré- vios do CFU por 500 células. Estes dados, apresentados na Tabela 14 e na FIG. 25A, demonstram que células THP-1 tratadas com CD24Fc conduzem a progressivamente maior diminuição nos números de CFU. Pela 4ª etapa, o número cumulativo de CFU em grupo tratado com CD24Fc tem 11,6 vezes menos CFU do que o grupo tratado com IgG Fc. Estes dados sugerem que CD24Fc reduz progressivamente auto- renovação de atividade de célula estaminal de leucemia. Em adição, conforme mostrado na FIG. 25B, as colônias em grupos tratados com CD24Fc foram consideravelmente menores. Tabela 14. Efeito cumulativo de CD24Fc em número de CFU de célu- las THP-1 em deposição em série. THP-1 Colônias totais de Colônias totais de Valor P grupo IgG grupo CD24Fc 1ª etapa 178,5 ± 3,3 163,3 ± 4,2 0,0283 2ª etapa 1,73E+05 ± 1,15E+05 ± 0,0067 1,06E+04 9,39E+03

THP-1 Colônias totais de Colônias totais de Valor P grupo IgG grupo CD24Fc 3ª etapa 1,10E+08 2,83E+07 ± 0,0057 ±1,85E+07 5,66E+06 4ª etapa 9,00E+10 ± 7,76E+09 ± 0,0193 2,59E+10 2,12E+09

3. CD24Fc reduz progressivamente o número de células de progenia de leucemia durante deposição em série

[00165] Para investigar o efeito de CD24Fc no número de células de leucemia nas colônias, o número de células de leucemia por cavi- dade foi contados em cada etapa do ensaio de CFU e o rendimento cumulativo baseado nos números de célula nas etapas anteriores foi calculado, conforme detalhado na seção de método. Os dados são mostrados na Tabela 15 e FIG. 26. Correspondente a redução de ta- manhos e números de colônia (FIG. 25), CD24Fc diminui significante- mente o número de célula de células THP-1 em quatro deposições em série. Pela quarta etapa, o rendimento cumulativo em grupo tratado com CD24Fc foi 22 vezes menor do que aquele do grupo tratado com IgG Fc. Tabela 15. Efeito cumulativo de CD24Fc nos números de célula de THP-1 durante deposição em série THP-1 Número de célula total Número de célula total Valor P de IgG de CD24Fc 1ª etapa 7,18E+05 ± 2,86E+04 5,81E+05 ± 2,61E+04 0,0125 2ª etapa 4,05E+08 ± 6,26E+07 1,26E+08 ± 2,08E+07 0,0055 3 etapa 3,50E+11 ± 1,02E+11 5,25E+10 ± 1,29E+10 0,0279 4ª etapa 2,49E+14 ± 8,75E+13 1,15E+13 ± 4,01E+12 0,0351 Conclusões

[00166] Desde que recaída de leucemia tenha sido atribuída a ativi- dade de célula estaminal de leucemia, o efeito de CD24Fc na atividade de unidade de formação colônia (CFU), um ensaio de substituição pa- ra atividade de célula estaminal de leucemia, foi avaliado para cinco linhas de célula de leucemia. Os dados demonstram que CD24Fc ini-

biu amplamente a atividade de CFU de todas linhas de célula testadas. Para avaliar se CD24Fc afeta auto-renovação de células estaminais de leucemia, 4 etapas de deposição em série de uma das linhas de célula de leucemia, THP-1, foram realizadas. Os dados demonstram que acima de 4 etapas, CD24Fc reduziu números de CFU cumulativos por quase 12 vezes. Em adição, o tamanho de colônias em grupo tratado com CD24Fc foi consideravelmente menor. Correspondentemente, o rendimento cumulativo de células de leucemia foi reduzido mesmo mais do que aquele dos números de CFU. O número cumulativo de célula de leucemia foi reduzido por CD24Fc por quase 22 vezes após 4 etapas de deposição. Juntos, os dados demonstram que CD24Fc pode suprimir atividade de célula estaminal de leucemia, e proporciona uma explanação plausível para recaída de leucemia reduzida obser- vada em ensaios clínicos de fase IIA de pacientes de HCT de leuce- mia. Referências

1. Lapidot T, Sirard C, Vormoor J et al. A cell initiating hu- man acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Na- ture. 1994. 367: 645-648.

2. Jin L, Hope KJ, Zhai Q et al. Targeting of CD44 eradica- tes human acute myeloid leukemic stem cells. Nat Med. 2006. 12: 1167-1174.

3. Tsuchiya S, Yamabe M, Yamaguchi Y et al. Establish- ment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 1980. 26: 171-176.

4. Lozzio BB, Lozzio CB. Properties and usefulness of the original K-562 human myelogenous leukemia cell line. Leuk Res. 1979. 3: 363-370.

5. Asou H, Tashiro S, Hamamoto K et al. Establishment of a human Leucemia Myeloid Acute cell line (Kasumi-1) com 8;21 chromo-

some translocation. Blood. 1991. 77: 2031-2036.

6. Lanotte M, Martin-Thouvenin V, Najman S et al. NB4, a maturation inducible cell line with t(15;17) marker isolated from a hu- man acute promyelocytic leukemia (M3). Blood. 1991. 77: 1080-1086.

7. Sundstrom C, Nilsson K. Establishment and characteriza- tion of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). Int J Cancer.

1976. 17: 565-577.

[00167] CD24 reduz atividade de célula estaminal de leucemia

[00168] Este exemplo adicionalmente demonstra que C24 reduz atividade de célula estaminal de leucemia. Transplante de células es- taminais hematopoiéticas alogenêicas (HSCT) é uma opção curativa para malignidades hematopoiéticas. Contudo, aproximadamente 25- 30% de pacientes recaída de HSCT dentro de um ano. Dados de en- saios clínicos de fase II revelaram que profilaxia com CD24Fc em adi- ção a padrão de cuidado resulta em redução 3 vezes de recaída de leucemia quando comparado a controle de placebo que receber pa- drão de cuidado. Estes dados sugerem que, em adição a sua capaci- dade de preservar efeito de enxerto vs. leucemia, CD24Fc pode dire- tamente reduzir recaída de leucemia. Em particular, foi verificado que nenhum dos 12 casos de pacientes de AML e MDS, recaída sobre o período de observação total de 8-22 meses.

[00169] Um mecanismo potencial de recaída de leucemia é devido a persistência de células estaminais de leucemia. John Dick e colegas conduzem ao reavivamento do conceito de célula estaminal cancerí- gena (CSC) quase 20 anos atrás usando modelo de leucemia. Ativida- de de CSC de leucemia foi ensaiada por CFU in vitro e modelos de transplante xenogenêico in vivo. Ambos modelos foram também usa- dos para testar drogas para desenvolvimento terapêutico potencial como drogas de leucemia. Como a primeira etapa de testar se CD24Fc pode afetar atividade de célula estaminal de leucemia, ensai-

os de CFU foram realizados para avaliar o efeito potencial de CD24Fc nas atividades de célula estaminal de leucemia, incluindo auto- renovação e produção de células de leucemia. CD24Fc reduz atividade de CFU de linhas de célula de leucemia múltiplas.

[00170] Para determinar o efeito de CD24Fc em capacidade de cé- lula estaminal de leucemia in vitro, o número de CFU de cinco linhas de célula de leucemia foi avaliado quando as células foram cultivadas na presença de CD24Fc ou IgG Fc de controle. As linhas de célula in- cluem um grupo diverso de leucemia, incluindo 4 linhas de célula de AML, THP1, K562, Kasumi-1, NB4 e linha de célula de linfoma histiocí- tica U937. As médias e erro padrão de números de CFU observados após uma etapa de CD24Fc ou tratamento de IgG Fc é mostrado na Figura 24. Estes dados demonstram que quando comparados com IgG Fc, CD24Fc significantemente reduz o número de CFU de todas as cinco linhas de célula. CD24Fc reduz progressivamente auto-renovação de atividades de CFU de leucemia

[00171] Para avaliar o efeito de CD24 na auto-renovação de CSC de leucemia, deposição em série de células THP-1 foi realizada. Bre- vemente, células THP-1 foram isoladas de colônias de ou CD24Fc ou placas tratadas com IgG Fc. Quinhentas células de THP1 foram culti- vadas novamente em meio de metilcelulose na presença do mesmo fármaco para um total de 4 etapas. O número de CFU produzido das primeiras 500 células de THP-1 são número atual de THP-1 CFU de 500 células, enquanto que aquele para subsequentes etapas foram calculados baseado no número de células de leucemia de etapa ante- rior vezes a CFU por 500 células. Estes dados, apresentados na Figu- ra 25A, demonstram que células de THP-1 tratadas com CD24Fc con- duzem a diminuição progressivamente maior nos números de CFU.

Pela 4ª etapa, o número cumulativo de CFU em grupo tratado com CD24Fc tem 11,6 vezes menos CFU do que o grupo tratado com IgG Fc. Estes dados sugerem que CD24Fc reduz progressivamente auto- renovação de atividade de célula estaminal de leucemia. Em adição, conforme mostrado na Fig. 25B, as colônias nos grupos tratados com CD24Fc foram consideravelmente menores. Estudos adicionais mos- tram que o efeito de CD24 persistiu sobre 6 etapas de deposição (Fig. 28). CD24Fc reduz progressivamente o número de células de progenia de leucemia durante deposição em série

[00172] Para investigar o efeito de CD24Fc no número de células de leucemia nas colônias, o número de células de leucemia por cavi- dade foi contado em cada etapa do ensaio de CFU, e o rendimento cumulativo foi calculado baseado nos números de célula nas etapas anteriores, conforme detalhado na seção de método. Os dados são mostrados na Fig. 26. Correspondente a redução de tamanhos e nú- meros de colônia (Fig. 25), CD24Fc significantemente diminui o núme- ro de célula de células de THP-1 em quatro deposições em série. Pela quarta etapa, o rendimento cumulativo em grupo tratado com CD24Fc foi 22 vezes menor do que aquele do grupo tratado com IgG Fc.

[00173] Tomados juntos, estes dados demonstram que CD24Fc re- duz amplamente atividade de CFU de linhas de célula de leukemia múltiplas, que CD24Fc reduz auto-renovação de atividade de CFU de leucemia THP-1, e que CD24Fc reduz o número cumulativo de THP-1 durante deposição em série. Estes dados permitem testar rapidamente a hipótese que CD24Fc pode afetar diretamente a atividade de célula estaminal de leucemia, conforme detalhado abaixo. Redução de atividade de CFU de células de leucemia primárias por CD24Fc

[00174] Para substanciar os dados com AML estabelecido e outras linhas de célula de leucemia na Fig. 24-26, o efeito de CD24Fc nos isolados de leucemia primária de clínicas foi testado. Isolados clínicos de pacientes de 5 AML e 5 CML foram testados na University of Maryland Medical Center. As amostras em ensaios de CFU foram ava- liadas conforme demonstrado em estudos preliminares. Conforme mostrado na Fig. 27, todos mostraram atividade de CFU reduzida. CD33 é responsável para redução mediada por CD24Fc de CFU em células de THP1

[00175] A maior Siglec em células de THP1 é CD33. Para testar relevância de CD33 para supressão mediada por CD24Fc de atividade de célula estaminal de leucemia, células de CD33-/- THP1 foram gera- das usando o método de Crispr-Cas9, e células de WT e CD33-/- THP1 foram comparadas para resposta a CD24Fc. Desde que células de WT THP1 formam CFU dentro de 7 dias, enquanto que CD33-/- CFU é visí- vel nos 14 dias, suas CFUs foram contadas em pontos de tempo dife- rentes. Conforme mostrado na Fig. 29, CD24Fc reduzir progressiva- mente atividade de CFU de WT, mas não células de CD33-/- THP1, que demonstram que CD33 desempenha um papel crítico em ativida- de de célula estaminal, conforme analisado pelo ensaio de CFU.

Claims (46)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de prevenção ou tratamento de recaída de um câncer em um indivíduo em necessidade deste, caracterizado pelo fato de compreender administrar uma proteína CD24 ao indivíduo.

2. Método de redução de atividade das células estaminais cancerígenas em um indivíduo em necessidade deste, caracterizado pelo fato de compreender administrar uma proteína CD24 ao indivíduo.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a célula estaminal cancerígena é uma célula estami- nal cancerígena de leucemia.

4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracte- rizado pelo fato de que a redução da atividade das células estaminais cancerígenas no indivíduo impede ou trata pelo menos um de recaída e metástase de um câncer do indivíduo.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o câncer é Leucemia Mie- lóide Aguda (AML), Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL), Leucemia Mielógena Crônica (CML), Síndrome Mielodisplástica (MDS), ou Leu- cemia Mielomonocítica Crônica (CMML).

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5 caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 é adminis- trada a uma dose de 240 mg ou 480 mg.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o indivíduo suportará ou su- porta um transplante de células estaminais hematopoiéticas (HCT).

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 é administrada antes ou após o HCT.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 é administrada um dia após o HCT.

10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracte- rizado pelo fato de que a proteína CD24 é administrada mais do que uma vez.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que a proteína CD24 é administrada em três doses bissemanais, compreendendo uma dose no dia antes do HCT, uma dose no dia 14 após o HCT, e uma dose no dia 28 após o HCT.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que as doses da proteína CD24 são 480 mg, 240 mg, e 240 mg, respectivamente.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 compre- ende um polipeptídeo humano maduro CD24 fundido em seu terminal N ou terminal C a uma região Fc de uma proteína de imunoglobulina (Ig) de mamíferos.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que o polipeptídeo humano maduro CD24 compreende sequência colocada em SEQ ID NO: 1 ou 2.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que a proteína Ig é humana, e no qual a região Fc compreende uma região de articulação e domínios CH2 e CH3 de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, ou IgA.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que a proteína Ig é humana, e no qual a região Fc compreende uma região de articulação e domínios CH2, CH3 e CH4 de IgM.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que a proteína CD24 compreende sequência colocada em SEQ ID NO: 6, 11, ou 12.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracteriza-

do pelo fato de que a sequência de aminoácido de uma proteína CD24 consiste em sequência colocada em SEQ ID NO: 6, 11, ou 12.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 é solúvel.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 é glicosi- latada.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 é prepa- rada usando um sistema de expressão eucariótico.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- do pelo fato de que o sistema de expressão eucariótico compreende expressão de um vetor em células de mamíferos.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracteriza- do pelo fato de que as células de mamíferos são células do Ovário de Hamster Chinês.

24. Uso de uma proteína CD24 caracterizado pelo fato de ser na produção de um medicamento para prevenção ou tratamento de recaída de um câncer em um indivíduo.

25. Uso de uma proteína CD24 caracterizado pelo fato de ser na produção de um medicamento para redução de atividade das células estaminais cancerígenas em um indivíduo.

26. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a célula estaminal cancerígena é uma célula estami- nal cancerígena de leucemia.

27. Uso de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracteri- zado pelo fato de que a redução da atividade das células estaminais cancerígenas no indivíduo impede ou trata pelo menos um de recaída e metástase de um câncer do indivíduo.

28. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de que o câncer é Leucemia Mielóide Aguda (AML), Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL), Leucemia Mieló- gena Crônica (CML), Síndrome Mielodisplástica (MDS), ou Leucemia Mielomonocítica Crônica (CMML).

29. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 é administrada a uma dose de 240 mg ou 480 mg.

30. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 29, caracterizado pelo fato de que o indivíduo suportará ou suporta um transplante de células estaminais hematopoiéticas (HCT).

31. Uso de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 é administrada antes ou após o HCT.

32. Uso de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 é administrada um dia antes do HCT.

33. Uso de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracteri- zado pelo fato de que a proteína CD24 é administrada mais do que uma vez.

34. Uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 é administrada em três doses bis- semanais, compreendendo uma dose no dia antes do HCT, uma dose no dia 14 após o HCT, e uma dose no dia 28 após o HCT.

35. Uso de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que as doses de uma proteína CD24 são 480 mg, 240 mg, e 240 mg, respectivamente.

36. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 35, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 compreende um polipeptídeo humano maduro CD24 fundido em seu terminal N ou ter- minus C a uma região Fc de uma proteína de imunoglobulina (Ig) de mamíferos.

37. Uso de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo humano maduro CD24 compreende sequência colocada em SEQ ID NO: 1 ou 2.

38. Uso de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a proteína Ig é humana e no qual a região Fc com- preende uma região de articulação e domínios CH2 e CH3 de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, ou IgA.

39. Uso de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pe- lo fato de que a proteína Ig é humana, e no qual a região Fc compreen- de uma região de articulação e domínios CH2, CH3 e CH4 de IgM.

40. Uso de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 compreende sequência colocada em SEQ ID NO: 6, 11, ou 12.

41. Uso de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de uma proteína CD24 consiste em sequência colocada em SEQ ID NO: 6, 11, ou 12.

42. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 41, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 é solúvel.

43. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 42, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 é glicosilatada.

44. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 43, caracterizado pelo fato de que a proteína CD24 é preparada usando um sistema de expressão eucariótico.

45. Uso de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o sistema de expressão eucariótico compreende ex- pressão de um vetor em células de mamíferos.

46. Uso de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que as células de mamíferos são células do Ovário de Hamster Chinês.