KR20210018294A - 이식편 대 숙주 질환 및 점막염의 예방 및 치료를 위한 cd24의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이식편 대 숙주 질환 및 점막염을 예방 또는 치료하기 위한 CD24 단백질의 용도에 관한 것이다.

Description

이식편 대 숙주 질환 및 점막염의 예방 및 치료를 위한 CD24의 사용 방법

본 발명은 이식편 대 숙주 질환(Graft versus Host Disease) 및 점막염을 예방 및 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

동종(allogeneic) 조혈 줄기세포 이식(hematopoietic stem cell transplantation)(HCT)은 성인에서 고위험 백혈병 및 골수이형성증의 폭넓은 효능을 위해 유일하게 입증된 치료 요법이다. 동종 이식의 중요한 기능은 동종 백혈병 세포를 제거하기 위해 도너(donor) T 세포를 사용하는 것이며, 이 효과는 GVL로 불린다. 그러나 이식편 대 숙주 질환(GVHD)은 도너 줄기세포 이식편으로부터의 면역 적격 세포가 숙주에 대한 면역 공격을 시작할 때 발생하는 생명을 위협하는 합병증이다. 활성화된 도너 T 세포는 예비 요법으로 시작하는 염증성 캐스케이드(cascade)에 이어서 숙주 상피 세포를 손상시킨다. 정확한 위험은 줄기세포 공급원, 환자의 나이, 컨디셔닝(conditioning), 및 사용되는 GVHD 예방에 의존한다. 발생률은 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigens)(HLA) 상위의 정도에 직접적으로 관련된다. 급성 GVHD의 중간 개시는 이식 후 전형적으로 21 내지 25일이다. 발생률은 완전히 조직 적합성이 있는 관련된 도너 이식물의 수용자에서 30-65%의 범위로부터 비관련된 도너로부터 조혈 세포 또는 부정합된 조혈 세포의 수용자에서 60% 내지 80%까지이다. 제대혈 이식은 더 낮은 발생률 및 더 늦은 급성 GVHD의 개시와 함께 더 느린 호중구 회복과 관련되어 왔다. 발생률을 증가시키는 요인은 조혈 세포 및 오래된 수령 연령의 공급원으로서 골수보다는 말초 혈액의 사용을 포함한다. 만성 GVHD의 진단의 중앙값 시간은 HLA-동일한 형제 이식 후 4.5개월이고, 비관련된 도너 이식 후 4개월이다. 데 노보(de novo) 만성 GVHD는 동종 HCT 후 2년 후에 거의 발생하지 않았다.

20년 동안, 메토트렉세이트(methotrexate)와 칼시네우린(calcineurin) 억제제(예를 들어, 사이클로스포린(cyclosporine) 및 타크롤리무스(tacrolimus))의 조합은 GVHD의 예방을 위한 치료 표준(standard of care)을 유지하였다. 면역 예방의 통상적인 투여에도 불구하고, 임상적으로 유의한 GVHD(등급 II-IV)는 HLA가 정합된 관련된 HCT를 받는 환자의 약 30 내지 65% 및 비관련된 도너 HCT를 수용하는 환자의 60 내지 80%에서 발생한다. 급성 GVHD는 HCT 후, 약 25 내지 30일의 개시에 대한 중앙값 시간을 갖는, 조기 사태이다. 매우 심각한 GVHD를 갖는 환자에서, 사망률은 90%를 초과한다. 이에 대한 하나의 설명은, 일단 확립되면, 50% 초과의 환자에게 고용량의 코르티코스테로이드(corticosteroid)를 갖는 프론트-라인(front-line) 치료에 비효과적인 반응이 일어난다는 것이다. 생존은 스테로이드 무반응을 입증하는 또는 연장된 치료를 요하는 환자에 대해 상당히 감소된다. 성공적일지라도, 고용량의 코르티코스테로이드는 증가된 감염 및 TRM에 대한 상당한 위험에 환자를 놓이게 하는 디컨디셔닝(deconditioning)으로 인한 이환율(morbidity)의 주요 원인이다.

고-용량 화학치료 및/또는 전신 방사선 조사(total body irradiation)(TBI)를 포함하는, HCT 컨디셔닝 요법(conditioning regimen)에 의해 야기된 숙주 조직 손상은 급성 GVHD의 발생에서 첫 번째 단계인 것으로 간주 된다. 컨디셔닝 요법에 의해 야기된 숙주 조직 손상은 (TNF-α, IL-1β and IL-6과 같은) 전염증성 사이토카인의 방출, 및 또한 손상-관련 분자 패턴(damage-associated molecular patterns)(DAMPs) 및 병원체-관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular patterns)(PAMPs)의 방출을 유도한다. DAMPs 및 PAMPs 모두는 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptors)(PRRs)에 결합함으로써, 수지상 세포(DCs)와 같은, 항원 제공 세포(antigen-presenting cells)(APCs)를 활성화시킬 수 있다. 숙주 APCs는 후속적으로 도너 T 세포 및 면역 캐스캐이드를 활성화시켜, 전염증성 사이토카인의 방출 및 숙주 조직을 표적하는 항원 특이적 동종 이식편 반응성 T 세포의 팽창을 유발하여, GVHD를 가져온다. 따라서, 조직 손상에 대한 숙주 반응을 표적화하고 APCs의 활성화를 예방함으로써 GVHD가 감쇠될 수 있는지 여부를 조사하는 것은 큰 관심사이며, GVHD의 개시에서의 핵심 과정이다.

지금까지, GVHD의 치료 및 예방은 생체 내 또는 생체 외 접근법을 통해 T 세포의 약리학적 억제 또는 고갈 중 어느 하나에 주로 집중하여 조직 손상을 매개하는 동종 이식편 반응성 T 세포의 팽창을 제한한다. 비-선택적 T-세포 고갈 전략(예를 들어, 항흉선세포 글로불린)은 GVHD를 예방하는데 효과적이지만, 이들은 재발, 감염 및 이식편 거부에 대한 상쇄위험으로 인한 생존을 개선시키지 않는다. 반대로, 단일 전-염증성 사이토카인을 표적화함으로써 보다 선택적인 억제는 GVHD를 치료하는데 임상적 이점을 입증하지 못했다. 그 결과, T 세포를 고갈시키는 항체 외에도, GVHD에 대해 어떠한 생물제제도 승인되지 않았고 메토트렉세이트와 타크롤리무스의 조합은 GVHD의 예방을 위한 치료 표준을 유지하였다. 현저한 미충족적 의학적 욕구는 GVHD의 예방 및 치료 둘 다에 대해 보다 선택적인 생물학적 생성물을 요한다.

점막염은 소화관 내벽 점막의 염증 및 궤양을 초래하는 종양에 대한 화학 치료 및 방사선 치료의 공통적 및 고통스러운 부작용이다. 이는 방사선/방사선 치료(RT) 또는 화학 치료에 의해 야기된 조직 손상의 결과이다. 점막염은 위장관(gastrointestinal)(GI)을 따라 어디에서나 발생할 수 있지만, 구강 점막염은 입에서 발생하는 특정 염증 및 궤양을 의미한다. 경구 및 위장관(GI) 점막염은 시타라빈 및 고-용량 5-플루오로우라실, 알킬화제 및 백금계 화합물과 함께 고-용량 화학 치료를 받는 거의 모든 환자 및 방사선 치료를 받는 머리 및 목의 악성종양을 갖는 환자의 대부분에 영향을 미친다. 방사선 유도된 구강 점막염(Radiation induced oral mucositis)(RIOM)은 머리 및 목 종양 환자의 변경된 분획화 방사선 치료의 100%에서 발생한다. 구강 점막염에 고통받는 환자는 심각한 통증, 염증, 궤양 및 출혈을 경험하고, 이는 환자의 삼킬 능력을 상당히 방해할 수 있으며, 이는 또한 종양 치료의 중단에 기인하여 종양 조절을 제한할 수 있다. 따라서, 구강 점막염은 머리 및 목에 대한 화학 치료 및/또는 방사선 치료에서 종양 환자에서 보여지는 중요한 부작용이다. 소화관 점막염은 사망률 및 이환율을 증가시키고 건강관리 비용을 상승시키는 데 기여한다. 미국에서, RIOM의 경제적 비용은 머리 및 목 종양을 갖는 환자당 17,000.00USD에 도달하는 것으로 추정되었다.

가장 극심한 점막염 부담은 조혈 줄기세포 이식(HCT)에 사용되는 컨디셔닝 요법의 결과로서 체험된다. HCT에 대한 치료요법은 이식하기 전에 수용자의 종양성 조혈 세포를 사멸시키는 데 필요한 전신 방사선 조사(TBI)를 갖거나 갖지 않는 고점액 독성(mucotoxic) 화학 치료를 포함하는 사전-컨디셔닝 요법을 포함한다. 이러한 사전-컨디셔닝 치료는 소화관 전체에 걸쳐 심각한 손상을 유도한다. 저등급 점막염은 점막의 홍반 및 군데군데 궤양 또는 가성 막을 포함한다. 심각한 점막염(등급≥3)은 작은 외상으로 융합성 궤양 또는 가성 막 및 출혈과 관련되며, 이는 조직 괴사, 상당한 자발적 출혈 및 생명을 위협하는 결과들로 진행될 수 있다. HCT를 받는 환자에서 점막염과 관련된 또 다른 징후는 만성 GVHD의 형태인 경구 이식편-대-숙주 질환(GVHD)이다. 화학 치료 및 방사선 유도 점막염에서와 같이, 경구 GVHD는 점막 홍반, 궤양, 및 고통스러운 박리성 구강 병변을 포함한다. 그러나 경구 급성 GVHD의 진정한 임상적 케이스 정의는, 몇몇 인자, 특히 병행 방사선이 있거나 없는 컨디셔닝 화학 치료, HCT 후 처음 28일 동안 경구 병변 발생에 기여에 따라 결여되어 있다.

지적된 바와 같이, GVHD, 점막염 및 관련 징후 모두는 조직 손상의 요소를 포함한다. 이러한 과제를 해결하기 위해, 당업계에서는 GVHD 및 점막염을 효과적으로 치료 및 예방하는 방법에 대한 요구가 존재한다.

본 발명의 요약

CD24 단백질을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함할 수 있는, 이식편 대 숙주 질환(GvHD) 또는 점막염을 예방 또는 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 본 발명은 피험자에서 GvHD 또는 점막염을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 제조에서 CD24 단백질의 용도가 본원에 제공된다. 본 방법 또는 용도는 등급 III-IV 급성 GvHD의 피험자의 위험을 감소시킬 수 있다. 피험자는 인간일 수 있다. 피험자는 조혈 줄기세포 이식(HCT)을 받았거나 받을 수 있다. 상기 피험자는 급성 골수성 백혈병(Acute Myeloid Leukemia)(AML), 급성 림프아구성 백혈병(Chronic Myelogenous Leukemia)(ALL), 만성 골수성 백혈병(Chronic Myelogenous Leukemia)(CML), 골수이형성 증후군(Myelodysplastic syndrome)(MDS), 또는 만성 골수단핵구성 백혈병(Chronic Myelomonocytic Leukemia)(CMML)일 수 있는 종양을 가질 수 있다.

CD24 단백질은 240mg 또는 480mg의 용량으로 투여될 수 있다. CD24 단백질은 HCT 전 또는 후에 투여될 수 있고, HCT 전 1일째에 투여될 수 있다. CD24 단백질은 1회 이상 투여될 수 있고, 격주 용량으로 투여될 수 있다. 용량은 HCT 전의 1일째에 용량, HTC 후 14일째에 용량, 및 HCT 후 28일째에 용량을 포함할 수 있고, 그 용량은 각각 480mg, 240mg 및 240mg일 수 있다.

CD24 단백질은 그의 N-말단 또는 C-말단에서 포유동물 면역글로불린(immunoglobulin)(Ig) 단백질의 Fc 영역에 융합된 성숙한 인간 CD24 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 성숙한 인간 CD24 폴리펩타이드는 서열 식별 번호 1 또는 2에 표시된 서열을 포함할 수 있다. Ig 단백질은 인간일 수 있다. Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgA의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. Fc 영역은 IgM의 힌지 영역 및 CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함할 수 있다. CD24 단백질은 서열 식별 번호 6, 11 또는 12에 표시된 서열을 포함할 수 있다. CD24 단백질의 아미노산 서열은 서열 식별 번호 6, 11 또는 12에 표시된 서열로 이루어질 수 있다. CD24 단백질은 가용성일 수 있고, 글리코실화될 수 있다. CD24 단백질은 포유동물 세포에서의 벡터로부터의 발현을 포함할 수 있는 진핵 발현 시스템을 사용하여 제조될 수 있다. 세포는 중국 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary cell)일 수 있다.

도 1A는 전장 CD24 융합 단백질의 아미노산 조성, CD24Fc(본원에서 CD24Ig 로도 지칭됨)(서열 식별 번호 5)를 나타낸다. 밑줄 친 26개의 아미노산은 CD24의 신호 펩타이드(서열 식별 번호 4)이며, 이는 단백질을 발현하는 세포로부터의 분비 동안 절단되고, 따라서 단백질의 가공된 버전으로부터 누락된다(서열 식별 번호 6). 서열의 굵은 체 부분은 융합 단백질(서열 식별 번호 2)에서 사용된 성숙한 CD24 단백질의 세포 외 도메인이다. 성숙한 CD24 단백질에 통상적으로 존재하는 마지막 아미노산(A 또는 V)은 면역원성을 피하기 위해 구조물로부터 삭제되었다. 밑줄이 없는, 굵지 않은 글자는 힌지 영역 및 CH1 및 CH2 도메인(서열 식별 번호 7)을 포함하는 IgG1 Fc의 서열이다. 도 1B는 성숙한 인간 CD24 단백질(굵은 체)이 서열 식별 번호 1의 발린 다형성 변이체인 CD24^AFc(서열 식별 번호 8)의 서열을 나타낸다. 도 1C는 성숙한 인간 CD24 단백질(굵은 체)이 서열 식별 번호 1의 알라닌 다형성 변이체인 CD24^AFc(서열 식별 번호 9)의 서열을 나타낸다. 도 1B 및 1C의 융합 단백질의 다양한 부분은 도 1A에서와 같이 표시되어 있고, 변이체 발린/알라닌 아미노산은 이중 밑줄로 표시되어 있다.
도 2는 마우스(서열 식별 번호 3) 및 인간(서열 식별 번호 2)으로부터의 성숙한 CD24 단백질 사이의 아미노산 서열 변이를 나타낸다. 잠재적인 O-글리코실화 부위는 굵게 표시되고, N-글리코실화 부위는 밑줄이 그어져 있다.
도 3A-C. CD24IgG1(CD24Fc)의 약물 동역학의 윈논린(WinNonlin) 구획 모델링 분석. 열린 원은 평균 3마리의 마우스의 평균을 나타내고, 선은 예측된 약물 동역학적 곡선이다. 도 3A. 1mg CD24IgG1의 정맥 내(i.v.) 주사. 도 3B. 1mg CD24IgG1(CD24Fc)의 피하(s.c.) 주사. 도 3C. 곡선 하 면적(AUC), 반감기 및 최대 혈중 농도에 의해 측정된 바와 같이 혈중 항체의 총량의 비교. 전체적으로, 피하 주사의 AUC 및 Cmax는 정맥 내 주사의 약 80%이지만, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않다.
도 4A-B. CD24-시글렉(Siglec) G(10) 상호작용은 PAMP와 DAMP 사이를 구별한다. 도 4A. PAMP에 대한 숙주 반응은 CD24-시글렉 G(10) 상호작용에 의해 영향을 받지 않았다. 도 4B. CD24-시글렉 G(10) 상호작용은 아마도 시글렉 G/10-관련 SHP-1을 통해 DAMP에 대한 숙주 반응을 억제한다.
도 5A-C. CD24 Fc는 시글렉 10 및 HMGB1에 결합하고, 시글렉 G, 인간 시글렉 10의 마우스 상동체를 활성화 시킨다. 도 5A. CD24Fc-시글렉 10 상호작용의 친화성 측정. 도 5B. CD24Fc는 특히 양이온-의존성 방식으로 HMGB-1과 상호작용한다. CD24Fc를 양이온 킬레이터(chelator) EDTA의 존재 또는 부재하에 0.1mM CaCl₂ 및 MgCl₂에서 HMGB1과 함께 배양하였다. CD24Fc는 단백질 G-비드로 풀다운(pull down)되고, HMGB1, CD24Fc 또는 대조군 Fc의 양은 웨스턴 블롯에 의해 결정된다. 도 5C. CD24Fc는 티로신 인산화(중간 패널)을 유도하고 SHP-1(상부 패널)과의 결합을 유도함으로써 마우스 시글렉 G를 활성화 시킨다. 시글렉 G의 양을 하부 패널에 나타낸다. CD24^-/-비장 세포를 1㎍/㎖의 CD24Fc, 대조군 Fc 또는 비히클(PBS) 대조군으로 30분 동안 자극하였다. 이어서, 시글렉 G를 면역 침강시키고 항-인산-티로신 또는 항-SHP-1로 탐침 하였다.
도 6A-B. CD24Fc는 항-CD3 활성화된 인간 T 세포에 의한 TNF-α 및 IFN-γ의 생성을 억제한다. 인간 PBML을 CD24Fc의 존재 또는 부재하에 4일 동안 항-CD3으로 자극하고, 세포 배양물의 상층액에서 방출된 IFN-γ 및 TNF-α의 양을 ELISA로 측정하였다. 도시된 데이터는 3회의 평균이다. 에러 바(bars), SEM.
도 7A-B. CD24는 인간 대식세포에 의한 염증성 사이토카인 생성을 억제한다. 도 7A. CD24의 shRNA 사일런싱은 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 자발적인 생성을 유도한다. THP1 세포는 스크램블(scrambled) 또는 2개의 독립적인 CD24 shRNA 분자를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 형질도입된 세포를 PMA(15ng/㎖)로 4일 동안 배양하여 대식세포로 분화시켰다. PMA 및 비-부착성 세포를 세척한 후, 세포를 사이토카인 비드 어레이에 의해 염증성 사이토카인의 측정을 위해 또 다른 24시간 동안 배양하였다. 도 7B. 주어진 농도의 CD24Fc 또는 대조군 IgG Fc 를 마지막 24시간 동안 대식세포에 첨가한 것을 제외하고는, 도 7A의 경우와 같다. 도 7A에 도시된 데이터는 3회의 독립적인 실험으로부터 평균 및 표준편차(S.D.)인 반면, 도 7B의 데이터는 적어도 3회의 독립적인 실험의 대표적인 것이다.
도 8은 인간 피험자에서 PK 평가 가능한 집단에 대한 처리에 의한 평균 혈장 CD24Fc 농도(±SD)의 플롯을 나타낸다. PK=약물 동역학; SD=표준 편차.
도 9는 PK 평가 가능한 집단에 대한 CD24Fc C_max 대 용량의 용량 비례 플롯을 나타낸다.
도 10은 PK 평가 가능한 집단에 대한 CD24Fc AUC_{0 -42d} 대 용량의 용량 비례 플롯을 나타낸다.
도 11은 PK 평가 가능한 집단에 대한 CD24Fc AUC_{0 - inf} 대 용량의 용량 비례 플롯을 나타낸다.
도 12는 동종 골수 소멸성(myeloablative) 조혈 줄기세포 이식(HCT)을 받는 종양 환자의 치료 표준 급성 GVHD 예방에 대해 CD24Fc의 추가를 평가하기 위해, 무작위, 위약-제어된 상 IIa(Phase IIa) 용량 에스컬레이션(escalation) 시험을 위한 시험 설계를 도시한다.
도 13은 상 IIa 시험에서 단일 용량 및 다중-용량 코호트에 대한 투여 방식을 나타낸다.
도 14는 시험에 등록된 환자들에 대한 이식(engraftment)에 대한 중앙값 시간을 나타낸다.
도 15는 시험에 등록된 환자들에 대한 골수 도너 키메리즘(chimerism)을 나타낸다.
도 16은 치료(CD24Fc) 코호트에서 등급 II-IV 및 등급 III-IV 급성 GVHD의 발생률을 나타낸다.
도 17은 메토트렉세이트/타크롤리무스를 받은 동시성의 대조군(contemporary control) 환자와 비교하여 메토트렉세이트/타크롤리무스+CD24Fc를 받은 환자에서 HCT 후 180일 등급 III-IV aGVHD의 누적 발생률을 나타낸다.
도 18은 CD24Fc 또는 위약 대조군 중 어느 하나를 받은 환자에서 180일 등급 III-IV aGVHD, 재발-없는(relapse-free) 생존을 비교하는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 분석을 나타낸다.
도 19는 동시성의 대조군으로 CD24Fc를 받은 환자에서 180일 등급 III-IV aGVHD, 재발-없는 생존을 비교하는 카플란-마이어 생존 분석을 나타낸다.
도 20은 이식 후 800일에 CD24Fc 또는 위약 대조군 중 어느 하나를 받은 환자의 전체 생존을 비교하는 카플란-마이어 생존 분석을 나타낸다.
도 21은 이식 후 800일에 CD24Fc 또는 동시성의 대조군을 받은 환자의 전체 생존을 비교하는 카플란-마이어 생존 분석을 나타낸다.
도 22A-B는 240 및 480mg 단일 용량 코호트로부터 PK 데이터를 나타낸다. 도 22A. 선형 스케일에 대한 평균(±표준 편차) 혈장 CD24Fc 농도(ng/mL) 대 시간의 플롯. 도 22B. 세미-로그 스케일에 대한 평균(±표준 편차) 혈장 CD24Fc 농도(ng/mL) 대 시간의 플롯.
도 23A-B는 다중-용량 코호트로부터의 PK 데이터를 나타낸다. 도 23A. 선형 스케일에 대한 평균(±표준 편차) 혈장 CD24Fc 농도(ng/mL) 대 시간의 플롯. 도 23B. 세미-로그 스케일에 대한 평균(±표준 편차) 혈장 CD24Fc 농도(ng/mL) 대 시간의 플롯.
도 24A-B는 경구 점막염에 대한 CD24Fc 치료의 효과를 나타낸다. 도 24A. 조합된 점막염 스코어. 점막염에 대한 효과의 측정으로서, 본 발명자들은 환자가 심각한(등급 3 또는 4) 점막염을 가지고 지낸 일수의 배수를 생성하였고, 이는 괄호 안에 점막염을 갖는 pts의 수와 함께 바(bar)로 제공된다. 도 24B. CD24Fc에 의한 점막염 스코어의 용량-의존성 감소. 개별 점막염 스코어의 평균 및 표준 오차가 도시되어 있다. 환자들의 약물 용량 및 점막염 스코어 간의 상관 계수 및 P-값을 피어슨 방법을 사용하여 측정하였다. R=-0.9983, P=0.0009.
도 25A-B는 위약 대조군(도 25A) 및 동시성의 대조군(도 25B)과 비교하여 CD24Fc 그룹에서 180일 등급 III-IV GVHD 없는 생존을 나타낸다.
도 26A-B는 위약 대조군(도 26A) 및 동시성의 대조군(도 26B)과 비교하여 CD24Fc 그룹에서 재발 없는 생존을 나타낸다.

조직 손상은 염증성 사이토카인(예컨대, TNF-α, IL-1β 및 IL-6)의 방출, 및 또한, 손상-관련 분자 패턴(DAMPs) 및 병원체-관련 분자 패턴(PAMPs)의 방출을 유도할 수 있다. DAMPs 및 PAMPs 모두는 패턴 인식 수용체(PRRs)에 결합함으로써, 수지상 세포(DCs)와 같은 항원 제공 세포(APCs)를 활성화시킬 수 있다. 이어서, 숙주 APCs는 도너 T 세포 및 면역 캐스케이드를 활성화시켜 전-염증성 사이토카인의 방출 및 숙주 조직을 표적화 하는 항원 특이적 동종 이식편 반응성 T 세포의 팽창을 초래한다. 이는 GVHD의 발생을 유도하고 점막염의 효과를 악화시키는 것이다. 예를 들어, RIOM은 방사선 치료에 따른 구강 점막, 혀 및 인두의 급성 염증으로 시작하며, 이는 다양한 염증성 세포의 점증 및 염증성 사이토카인, 주화성 매개체, 및 생장 인자의 방출과 동시에 일어난다.

점막염 및 GVHD에서 조직 손상의 관여는 CD24Fc에 의한 DAMPs에 대한 숙주 반응을 음성적으로 조절하는 것이 GVHD 치료에 대해 조사될 수 있다는 전망을 불러일으켰다. 본 발명자들의 전임상 연구들은 CD24Fc가 DAMP-매개 염증을 특이적으로 표적화하고, 인간화된 마우스 모델을 포함하는 마우스 모델에서 GVHD를 예방하는 것을 입증하였다. 중요하게는, 약물은 일반적인 면역 억제를 유발하지 않고 CD24Fc 의 고용량의 사용은 비-인간 영장류에서 항체 반응을 차단하지 않기 때문에 통상적인 면역억제에 비해 이점을 갖는다. 이 데이터는 또한 CD24Fc는 GVHD를 예방하지만 이식편 대 백혈병(graft versus leukemia)(GVL) 효과를 보전하여, 백혈병 환자에서 GVHD의 예방을 위한 이상적인 약물을 만드는 것을 입증한다. 마지막으로, 비-인간 영장류의 본 발명자들의 연구들은 CD24Fc가 항원-특이적 면역 반응을 억제하지 않는다는 것을 입증하며, 이는 CD24Fc가 감염의 위험을 증가시키지 않음을 시사한다.

본 발명자들은 CD24의 가용성 형태가 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 및 점막염과 같은 관련 질환뿐만 아니라 HCT에 따른 백혈병 재발을 예방하기에 매우 효과적이라는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 CD24Fc가 HCT 치료를 받는 환자 중에서 심각한 점막염(등급≥3)에서 용량-의존적 감소를 생성한다는 것을 발견하였다. 이러한 효과는 DAMPs를 통해 매개될 수 있다. 패턴 인식은 PAMPs 및 DAMPs 모두에 의해 촉발된 염증 반응에 관여한다. 본 발명자들은 최근 연구들이 DAMPs에 대한 악화된 숙주 반응이 염증성 및 자가면역 질환의 발병기전에 관여할 수 있다는 것을 입증하였다. DAMPs는 염증성 사이토카인의 생성 및 자가면역 질환을 촉진하는 것으로 밝혀졌고, 동물 모델에서, HMGB1 및 HSP90과 같은 DAMPs의 억제제는 결과적으로 류마티스성 관절염(RA)을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. TLRs, RAGE-R, DNGR(Clec9A 에 의해 인코드됨), 및 Mincle은 다양한 DAMPs에 의해 개시된 염증을 매개하는 역할을 하는 수용체로 나타났다.

본 발명자들의 최근 연구는 CD24-시글렉 G 상호작용이 PAMPs로부터 DAMPs에 대한 선천성 면역성을 식별한다는 것을 입증하였다. 시글렉 단백질은 다양한 시알산-함유 구조를 인식하는 막-관련 면역글로불린(Ig) 슈퍼 패밀리 구성원이다. 대부분의 시글렉은 염증 반응의 주요 조절기를 제어하기 위해 SHP-1, -2 및 Cbl-b와 결합하는 세포 내 면역-티로신 억제 모티프(intra-cellular immune-tyrosine inhibitory motif)(ITIM)를 갖는다. 본 발명자들은 CD24를 시글렉, 특히, 마우스의 시글렉 G 및 인간의 시글렉 10에 대한 첫 번째 천연 리간드로서 보고하였다. 시글렉 G는 시알릴화 CD24와 상호작용하여 SHP-1/2 시그널링 메커니즘을 통해 HMGB1과 같은 DAMPs에 대한 TLR-매개 숙주 반응을 억제한다.

인간 CD24는 CD24 유전자에서 240 염기쌍의 오픈-리딩 프레임(open-reading frame)에 의해 인코드 되는 작은 GPI-고정(anchored)분자이다. 80개의 아미노산 중, 처음 26개는 신호 펩타이드를 구성하고, 마지막 23개는 절단을 위한 신호로서 작용하여 GPI 꼬리의 부착을 가능하게 한다. 결과적으로, 성숙한 인간 CD24분자는 단지 31개의 아미노산만을 갖는다. 31개의 아미노산 중 하나는 인간 집단 중에서 다형성이다. 오픈-리딩 프레임의 뉴클레오타이드 170에서의 C에서 T로의 전이는 성숙한 단백질의 잔기 31에서 알라닌(A)을 발린(V)으로 치환을 초래한다. 이 잔기는 절단 부위에 바로 N-말단이고, 교체가 비보존적이기 때문에, 이들 두 대립유전자는 세포 표면 상에서 상이한 효율로 발현될 수 있다. 실제로, cDNA에 의한 형질감염 연구는 CD24^V 대립유전자가 세포 표면 상에서 보다 효율적으로 발현된다는 것을 입증하였다. 이와 일치하여, CD24^{v /v} PBL은 특히 T 세포 상에서 더 높은 수준의 CD24를 발현하였다.

본 발명자들은 CD24가 조직 또는 기관 손상의 결과로서 방출되는 세포 DAMPs에 대한 숙주 반응을 음성적으로 조절한다는 것을 입증하였으며, 적어도 2개의 중첩 메커니즘은 이러한 활성을 설명할 수 있다. 먼저, CD24는 HSP70, HSP90, HMGB1 및 뉴클레오린을 포함하는 여러 DAMPs에 결합하여 이들 DAMPs에 대한 숙주 반응을 억제한다. 이를 위해, CD24는 그들의 수용체, TLR 또는 RAGE와의 상호작용을 방지하기 위해 염증성 자극을 포착(trap) 할 수 있는 것으로 추정된다. 둘째, 간 괴사의 아세트아미노펜-유도된 마우스 모델을 사용하고 염증을 보장함으로써, 본 발명자들은 그의 수용체, 시글렉 G와 상호작용을 통해, CD24가 조직 손상에 대한 숙주 반응에 대해 강력한 음성 조절을 제공함을 입증하였다. 이러한 활성을 달성하기 위해, CD24는 시글렉 G에 의한 시그널링을 결합하여 자극할 수 있고, 여기서 시글렉 G-관련 SHP1은 음성 조절을 촉발시킨다. 두 메커니즘은 모두 더 강한 염증 반응을 나타내는 유전자의 표적화된 돌연변이를 갖는 마우스와 같이 협력하여 작용할 수 있다. 사실상, CD24 ^-l- 또는 시글렉 G ^-l- 마우스로부터 골수에서 배양된 DC는 HMGB1, HSP70 또는 HSP90 중 어느 하나로 자극될 때 더 높은 수준의 염증성 사이토카인을 생성하였다. 본 발명자들의 지식에 따르면, CD24는 DAMPs에 의해 촉발된 염증을 차단할 수 있는 유일한 억제 DAMP 수용체이고, 조직 손상에 대한 숙주 염증 반응을 구체적으로 표적하는 약물이 현재 이용 가능하지 않다. 또한, 본 발명자들은 RA, MS 및 GvHD의 마우스 모델을 사용하여 DAMP-매개 자가면역 질환을 완화시키기 위한 외인성 가용성 CD24 단백질의 능력을 입증하였다.

1. 정의

본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시 양태를 설명하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "하나(a)", "하나(an)", 및 "그(the)"는 문맥상 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.

본원에서 수치 범위의 인용을 위해, 동일한 정도의 정밀도를 갖는 그 사이에 있는 각각의 중간 숫자가 명시적으로 고려된다. 예를 들어, 6-9의 범위에 대해, 6 및 9 이외 숫자 7 및 8이 고려되며, 그리고 6.0-7.0의 범위에 대해, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명시적으로 고려된다.

"펩타이드" 또는 "폴리펩타이드"는 아미노산의 연결된 서열이며, 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 변형 또는 조합일 수 있다.

"실질적으로 동일한"은 제1 및 제2 아미노산 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 300개 아미노산의 영역 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 것을 의미할 수 있다.

질병으로부터 동물의 보호를 언급할 때, "치료" 또는 "치료하는"은 질병을 예방, 억제, 억압 또는 완전히 제거하는 것을 의미한다. 질병을 예방하는 것은 본 발명의 조성물을 질병의 발병 전에 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 질병을 억제하는 것은 본 발명의 조성물을 질병의 유도 후 그러나 이의 임상적 출현 전에 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 질병을 억압하는 것은 본 발명의 조성물을 질병의 임상적 출현 후에 동물에게 투여하는 것을 포함한다.

"변이체"는 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열에서 상이하지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미할 수 있다. "생물학적 활성"의 대표적인 예는 톨-유사 수용체에 결합하고 특정 항체에 의해 결합 되도록 하는 능력을 포함한다. 변이체는 또한, 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 유사한 특성(예를 들어, 친수성 및 하전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 아미노산을 대체하는 것은 당업계에서 전형적으로 작은 변화를 수반하는 것으로 인식된다. 이들 작은 변화는 당업계에서 이해되는 바와 같이, 아미노산의 수치요법 지수(hydropathic index)를 고려함으로써 부분적으로 확인될 수 있다. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). 아미노산의 수치요법 지수는 이의 소수성 및 전하의 고려에 기초한다. 유사한 수치요법 지수의 아미노산이 치환될 수 있고 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 일 측면에서, ±2의 수치요법 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 초래하는 치환을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 펩타이드와 관련하여 아미노산의 친수성을 고려하면, 그 펩타이드의 가장 큰 국소 평균 친수성을 계산할 수 있는데, 이는 항원성 및 면역원성과 잘 상관되는 것으로 보고된 유용한 척도이다. 미국 특허 제4,554,101호는 본원에 참고로 완전히 포함되어 있다. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 당업계에서 이해되는 바와 같이, 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 보유하는 펩타이드를 초래할 수 있다. 치환은 서로 ±2 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값 둘 다는 그 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 이러한 관찰과 일치하게, 생물학적 기능과 양립할 수 있는 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 특성에 의해 밝혀진 바와 같이 아미노산의 상대적인 유사성, 특히 이들 아미노산의 측쇄에 의존하는 것으로 이해된다.

2. CD24

성숙한 CD24 또는 이의 변이체를 포함할 수 있는 CD24 단백질이 본원에 제공된다. 성숙한 CD24는 CD24의 세포 외 도메인(extracellular domain)(ECD)에 상응한다. 성숙한 CD24는 인간 또는 다른 포유동물로부터 유래된 것일 수 있다. 상기한 바와 같이, 성숙한 인간 CD24 단백질은 31개의 아미노산 길이이며, 그의 C-말단에서 가변 알라닌(A) 또는 발린(V) 잔기를 갖는다:

SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(V/A)(서열 식별 번호 1)

C-말단 발린 또는 알라닌은 면역원성일 수 있고 CD24 단백질로부터 생략될 수 있으며, 이는 이의 면역원성을 감소시킬 수 있다. 따라서, CD24 단백질은 C-말단 아미노산이 결여된 인간 CD24의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:

SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(서열 식별 번호 2)

마우스 및 인간으로부터 성숙한 CD24 단백질의 아미노산 서열에서 상당한 서열 변이에도 불구하고, 이들은 기능적으로 동일한데, 이는 인간 CD24Fc가 마우스에서 활성인 것으로 밝혀졌기 때문이다. 인간 CD24 ECD의 아미노산 서열은 마우스 단백질(39% 동일성; Genbank 기탁 번호 NP_033976)에 의한 일부 서열 보존을 나타낸다. 그러나 CD24 ECD가 종에 따라 길이가 단지 27-31개의 아미노산이고, 시글렉 10/G와 같은 일부 그의 수용체(들)에 대한 결합이 당단백질의 시알산 및/또는 갈락토오스당에 의해 매개 되기 때문에 동일성 백분율이 높지 않다는 것은 놀라운 것은 아니다. 인간 시글렉-lO의 세포 외 도메인들(GenBank 기탁 번호 AF310233)과 그의 뮤린 상동체 시글렉-G((GenBank 기탁 번호 NP_766488) 수용체 단백질들 사이의 아미노산 서열 동일성은 63%이다(도 2). 주로 C-말단 및 글리코실화 부위가 풍부한 곳에서의 마우스와 인간 CD24 사이의 서열 보존의 결과로서, 성숙한 CD24 단백질의 상당한 변이가 CD24 단백질을 사용하여 견딜 수 있으며, 특히, 이들 변이가 C-말단에서 보존된 잔기에 영향을 미치지 않거나 마우스 또는 인간 CD24로부터의 글리코실화 부위에 영향을 미치지 않는 경우에 그러하다. 따라서, CD24 단백질은 성숙한 뮤린 CD24의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:

NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATTRG(서열 식별 번호 3).

인간 CD24 ECD의 아미노산 서열은 마우스보다 시노몰구스 원숭이 단백질(52% 동일성; UniProt 기탁 번호 UniProtKB-I7GKK1)에 의한 더 많은 서열 보존을 나타낸다. 다시 한번, ECD가 이들 종에서 길이가 단지 29-31개의 아미노산이고, 그의 수용체(들)에 결합하는 당 잔기의 역할로 인해 동일성 백분율이 더 높지 않다는 것을 고려하면, 이것은 놀라운 것이 아니다. 시노몰구스 시글렉-lO 수용체의 아미노산 서열은 결정되지 않았지만, 인간과 붉은 털 원숭이 시글렉-10(GenBank 기탁 번호 XP 001116352) 단백질 사이의 아미노산 서열 동일성은 89%이다. 따라서, CD24 단백질은 또한, 성숙한 시노몰구스(또는 붉은 털) 원숭이 CD24의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:

TVTTSAPLSSNSPQNTSTTPNPANTTTKA(서열 식별 번호 10)

CD24 단백질은 가용성일 수 있다. CD24 단백질은 단백질을 발현하는 세포로부터 단백질의 분비를 가능하게 하는 N-말단 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩타이드 서열은 아미노산 서열 MGRAMVARLGLGLLLLALLLPTQIYS(서열 식별 번호 4)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 신호 서열은 다른 막 관통 또는 분비 단백질 상에서 발견되는 것, 또는 당업계에 공지된 기존의 신호 펩타이드로부터 변형된 것 중 임의의 것일 수 있다.

a. 융합

CD24 단백질은 그의 N- 또는 C-말단에서 단백질 태그에 융합될 수 있으며, 이는 인간 또는 마우스 또는 다른 종으로부터 유래할 수 있는 포유동물 Ig 단백질의 부분을 포함할 수 있는 단백질 태그이다. 이 부분은 Ig 단백질의 Fc 영역을 포함할 수 있다. Fc 영역은 Ig 단백질의 힌지 영역, CH2, CH3 및 CH4 도메인 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. Ig 단백질은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgA일 수 있고, Fc 영역은 Ig의 힌지 영역, 및 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. Fc 영역은 인간 면역글로불린 G1(IgG1) 동종형 서열 식별 번호 7을 포함할 수 있다. Ig 단백질은 또한 IgM일 수 있고, Fc 영역은 IgM의 힌지 영역 및 CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함할 수 있다. 단백질 태그는 단백질의 정제를 돕는 친화성 태그, 및/또는 기능성 단백질의 용해도 및 회수를 향상시키는 용해도-향상 태그일 수 있다. 단백질 태그는 또한 CD24 단백질의 원자가를 증가시킬 수 있다. 단백질 태그는 또한 GST, His, FLAG, Myc, MBP, NusA, 티오레독신(thioredoxin)(TRX), 작은 유비퀴틴(ubiquitin)-유사 개질제(SUMO), 유비퀴틴(Ub), 알부민, 또는 카멜리드(Camelid) Ig를 포함할 수 있다. 융합 단백질을 제조하고 융합 단백질을 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

전임상 연구에 기초하여, 실시예에서 동정된 융합 단백질 CD24Fc의 구성을 위해, GPI 신호 절단 부위 전에 최종 다형성 아미노산이 결여되어 있는, 30개의 아미노산의 절단된 형태의 천연 CD24분자(즉, 서열 식별 번호 2를 갖는 성숙한 CD24 단백질)가 사용되었다. 성숙한 인간 CD24 서열은 인간 IgG1 Fc 도메인(서열 식별 번호 7)에 융합된다. 전장 CD24Fc 융합 단백질은 서열 식별 번호 5(도 1A)에 제공되고, 세포로부터 분비되는 CD24Fc 융합 단백질의 가공된 버전(즉, 절단된 신호 서열이 결여된)이 서열 식별 번호 6에 제공된다. IgG1 Fc에 융합된 성숙한 CD24의 가공된 다형성 변이체(즉, 서열 식별 번호 1을 갖는 성숙한 CD24 단백질)는 서열 식별 번호 11 또는 12에 표시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

b. 생산

CD24 단백질은 크게(heavily) 글리코실화될 수 있고, 면역 세포의 공동자극 및 손상-관련 분자 패턴 분자(DAMP)와의 상호작용과 같은 CD24의 기능에 관여할 수 있다. CD24 단백질은 진핵 발현 시스템을 사용하여 제조될 수 있다. 발현 시스템은 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유동물 세포에서의 벡터로부터의 발현을 수반할 수 있다. 시스템은 또한 진핵 세포를 감염시키는데 사용될 수 있는 복제-결함 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터일 수 있다. CD24 단백질은 또한 세포 게놈에 통합된 벡터의 일부 또는 벡터로부터 CD24 단백질을 발현하는 안정 세포주로부터 생산될 수 있다. 안정 세포주는 통합된 복제-결함 레트로바이러스 벡터로부터 CD24 단백질을 발현할 수 있다. 발현 시스템은 GPEx^TM일 수 있다.

c. 약학적 조성물

CD24 단백질은 약학적으로 허용 가능한 양의 CD24 단백질을 포함할 수 있는 약학적 조성물에 함유될 수 있다. 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 용매를 포함할 수 있으며, 이는 연장된 기간에 걸쳐 CD24 단백질을 안정하게 유지할 수 있다. 용매는 PBS 일 수 있으며, 이는 -20℃(-15 ~ -25℃)에서 CD24 단백질을 적어도 66개월 동안 안정하게 유지할 수 있다. 용매는 다른 약물과 조합하여 CD24 단백질을 수용할 수 있다.

약학적 조성물은 주사 또는 연속 주입을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 주사를 위한 제제는 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유제의 형태일 수 있고, 현탁제, 안정화제 및 분산제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 제제화제를 함유할 수 있다. 조성물은 또한 멸균 수사용 증류수를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적합한 비히클로 재구성하기 위한 분말 형태로 제공될 수 있다.

약학적 조성물은 또한 이식 또는 근육 내 주사에 의해 투여될 수 있는 데포 제제로서 제제화될 수 있다. 조성물은 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용 가능한 오일 중의 유제), 이온 교환 수지, 또는 난용성 유도체(예를 들어, 난용성 염으로서)로 제제화될 수 있다. 피하 주사와 같은 제제는 루푸스와 같은 투약 지시(indication) 및 그의 관련된 징후 및 합병증에 특히 관련될 수 있다.

3. 치료 방법

a. GVHD

CD24 단백질을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여함으로써 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 예방, 완화 또는 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 피험자는 GVHD 를 발생할 위험이 있거나 있을 수 있다. 피험자는 조혈 줄기세포 이식(HCT)을 받을 수 있거나 이를 받고 있을 수 있다. CD24 단백질은 HCT를 받고 있는 피험자에서 GVHD를 방지하기 위해 예방적으로 사용될 수 있다. GVHD는 급성 GVHD일 수 있다. CD24 단백질은 등급 III-IV 급성 GVHD의 피험자의 위험을 감소시킬 수 있다. GVHD는 경구 GVHD를 포함하는 만성 GVHD일 수 있다.

피험자는 종양을 가질 수 있다. 상기 종양은 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 골수이형성 증후군(MDS), 또는 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)일 수 있다.

b. 점막염

CD24 단백질을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여함으로써 점막염을 예방, 완화 또는 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, CD24 단백질을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여함으로써 GVHD 또는 HCT와 관련된 다른 질환을 예방, 완화 또는 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 관련 질환은 점막염일 수 있으며, 이는 구강 점막염일 수 있다. 점막염은 일반적으로 HCT에 대한 사전컨디셔닝(preconditioning) 화학 치료 및/또는 방사선 치료의 부작용으로써 소화관 점막 내벽의 통증적인 염증 및 궤양이다. 점막염은 위장관(GI)을 따라 어디에서나 발생할 수 있다. 구강 점막염은 입에서 발생하는 특정 염증 및 궤양을 의미한다. 구강 점막염은 흔하고 종종 종양 치료의 합병증을 약화시킨다. 많은 조혈 줄기세포 이식 수용자는 점막염을 경험하고, 그 중 경구 점막염은 가장 흔하고 가장 쇠약하다.

피험자는 점막염이 발생할 위험에 있거나 점막염을 가길 수 있으며, 이는 구강 점막염일 수 있다. 피험자는 화학 치료 및 방사선 치료 중 적어도 하나를 받고 있거나 받을 수 있다. CD24 단백질은 피험자에서 점막염을 방지하기 위해 예방적으로 사용될 수 있다. CD24 단백질은 심각한 점막염의 환자의 위험을 감소시킬 수 있다.

c. 약물

또한, 본원에 기재된 바와 같은 용도를 위한 약물(medicament)의 제조에 있어서 CD24 단백질의 용도가 제공된다.

d. 용량 요법

투여되는 CD24 단백질의 용량은 0.01mg/kg 내지 1000mg/kg 일 수 있고, GVHD 또는 점막염 및 투여 경로에 대한 원하는 효과에 따라, 1 내지 500mg/kg 일 수 있다. CD24 단백질은 정맥 내(IV) 주입 또는 피하, 벽 내(즉, 공동 또는 기관의 벽 내), 또는 복강 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 용량은 10-1000mg, 10-500mg, 240mg, 또는 480mg 일 수 있으며, 이는 특히 피험자가 인간인 경우에 적합할 수 있다.

CD24 단백질은 줄기세포 이식 전 또는 후에 투여될 수 있다. CD24 단백질은 줄기세포 이식 전 1 내지 4일째, 특히 1일째 투여될 수 있다. CD24 단백질은 또한 줄기세포 이식 전 또는 후에 다중 용량으로 투여될 수 있다. CD24 단백질은 2, 3, 4, 5 또는 6 격주의 용량으로 투여될 수 있다. CD24 단백질의 각 용량은 240mg 또는 480mg 일 수 있다. 제 1 용량은 줄기세포 이식(0일) 날에 대해 -4일째 내지 0일째에 투여될 수 있고, 특히 -1일째에 투여될 수 있다. 각각의 후속 용량은 그 후 매 9-19 또는 11-17일째마다 투여될 수 있다. 제 2 용량은 줄기세포 이식 날에 대해 +9 내지 +19 또는 +11 내지 +17, 특히 +14일째에 투여될 수 있다. 제 3 용량은 줄기세포 이식 날에 대해 +18 내지 +38일, +23 내지 +33일째, 또는 +22 내지 +34일째, 특히 + 28일째에 투여될 수 있다. 특히, CD24 단백질은 줄기세포 이식 날에 대해 각각 480mg, 240mg, 및 240mg의 3회 격주 투여로 -1일째, +14일째 및 +28일째에 투여될 수 있다. CD24 단백질은 특히 CD24Fc일 수 있다.

CD24 단백질은 화학 치료 및 방사선 치료 중 적어도 하나 치료 전 또는 중에 투여될 수 있고, 피험자에게 투여된다. CD24 단백질은 DAMPs가 방출될 때 존재하도록 투여될 수 있다.

e.복합 치료

CD24 단백질은 치료 표준 GVHD 예방과 조합하여 피험자에게 투여될 수 있다. 치료 표준 GVHD 예방은 다음을 포함할 수 있다. 메토트렉세이트+칼시네우린 억제제, 예를 들어 타크롤리무스(Prograf, FK506) 또는 사이클로스포린(Sandimmune, Neoral)의 투여를 포함한다. 타크롤리무스는 줄기세포 이식 날에 대해 -3일째에 투여될 수 있고, IV 또는 PO(경구)에 의해 투여될 수 있다. 연속 주입으로서 IV 투여의 경우, 출발 용량은 조절된 신체 중량을 기준으로 0.03mg/kg/일 일수 있다. 경구 투여의 경우, 출발 용량은 1일 2회 0.045mg/kg/용량 일 수 있다. 피험자가 타크롤리무스를 용인할 수 없다면, 사이클로스포린은 100x의 IV 타크롤리무스 용량(예를 들어, 3mg/kg/일 출발 용량)의 용량으로 IV에 의해 피험자에게 투여될 수 있다. 사이클로스포린은 또한 3x의 IV 용량으로 경구로 투여될 수 있다. Neoral 브랜드가 사용될 때, 더 큰 생체이용률 때문에, 사이클로스포린은 2x의 IV 용량으로 경구로 투여될 수 있다.

GVHD의 부재하에, 타크롤리무스 수준은 이식 후 처음 100일 동안만 치료 투여를 위해 모니터링될 수 있다. 타크롤리무스에 대한 치료 표적 최저치는 5 내지 15ng/mL 일 수 있다. 타크롤리무스 수준은 CD24 단백질 주입 후 1주 동안(0일부터 7일) 최소 3회(예를 들어, 매 48-72시간) 모니터링될 수 있다. GVHD 또는 재발의 부재하에, 타크롤리무스 테이퍼링(tapering)은 이식 후 +100일째에 시작할 수 있다. GVHD의 존재하에, 타크롤리무스는 치료 투여로 계속될 수 있다.

메토트렉세이트는 표준 GVHD 예방을 위한 타크롤리무스와 조합하여 사용될 수 있다. 메토트렉세이트는 HCT 후 1일째에 1일 1회 15mg/㎡/용량의 용량으로, HCT 후 3, 6 및 11일째에 10mg/㎡/용량의 용량으로 정맥 내 투여될 수 있다.

점막염에 대해, CD24 단백질은 적어도 하나의 면역조절제(즉, CD24 단백질 이외)와 함께 투여될 수 있어 염증성 성분을 악화시키는 것을 최소화한다. CD24 단백질은 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)로 치료된 피험자에 대해 알로푸리놀(alloprinol)과 함께 투여될 수 있다.

CD24 단백질은 하나 이상의 하기 골수 소멸성 컨디셔닝 요법과 조합하여 투여될 수 있고, 컨디셔닝 요법 전 또는 동안 투여될 수 있다. CD24 단백질은 골수 소멸성 컨디셔닝 요법 및 HCT 중 적어도 하나에 반응하여 DAMPs가 방출될 때 존재하도록 투여될 수 있다.

부설판( Busulfan ) 및 플루다라빈 ( fludarabine )

부설판은 줄기세포 이식 날에 대해 -5 내지 -2일째에 투여될 수 있다. 용량은 3.2mg/kg/일 또는 130mg/㎡/일 일 수 있고, 정맥 내 투여될 수 있다. 총 용량은 12.8mg/kg 또는 520mg/㎡ 일 수 있다. 플루다라빈은 줄기세포 이식 날에 대해 -5 내지 -2일째에 투여될 수 있다. 용량은 30-45mg/㎡/일 일수 있고, 총 용량은 120-180mg/㎡ 일 수 있다. 부설판 및 플루다라빈의 순서 및 타이밍은 당업계에 공지된 골수 소멸성 컨디셔닝에 대한 기관 표준(institutional standard)에 따라 수행될 수 있다.

부설판 및 시클로포스파미드 ( cyclophosphamide )

부설판은 줄기세포 이식 날에 대해 -7 내지 4일째에 투여될 수 있다. 용량은 3.2mg/kg/일 또는 130mg/㎡/일 일 수 있고, 정맥 내 투여될 수 있다. 총 용량은 12.8mg/kg 또는 520mg/㎡ 일 수 있다. 시클로포스파미드는 줄기세포 이식 날에 대해 -3일 내지 -2일째에 투여될 수 있다. 용량은 60mg/kg/일 일 수 있고, 총 용량은 120mg/kg일 수 있다.

시클로포스파미드 및 전신 방사선 조사

전신 방사선 조사(TBI)는 줄기세포 이식에 대해 -7 내지 -4일째에 투여될 수 있다. 시클로포스파미드는 줄기세포 이식 일에 대해 -3 내지 -2일째에 투여될 수 있다. 용량은 60mg/kg/일 일 수 있고, 총 용량은 120mg/kg 일 수 있다. 골수 소멸성 요법에 대한 시클로포스파미드, TBI 및 TBI 투여 방법의 순서는 당업계에 공지된 골수 소멸성 컨디셔닝에 대한 기관 표준에 따라 수행될 수 있다.

CD24 단백질은 또한 상기 기재된 개별적인 골수 소멸성 치료 또는 이들의 조합으로 투여될 수 있다.

실시예 1

마우스에서 CD24 약물 동역학

1mg의 CD24Fc(CD24Fc)를 나이브(naive) C57BL/6 마우스에 주사하고, 각 시점에서 3마리의 마우스로 상이한 시점(5분, 1시간, 4시간, 24시간, 48시간, 7일, 14일 및 21일)에서 혈액 샘플을 수집하였다. 혈청을 1:100으로 희석하고, 포획 항체로서 정제된 항-인간 CD24(3.3㎍/ml) 및 검출 항체로서 페록시다아제 접합된 염소 항-인간 IgG Fc(5㎍/ml)를 사용하여 샌드위치 ELISA를 사용하여 CD24Fc의 수준을 검출하였다. 도 3a에 도시된 바와 같이, CD24Fc의 붕괴 곡선(decay curve)은 단백질의 전형적인 2 상 붕괴를 나타냈다. 첫 번째 생체 분포 단계는 12.4시간의 반감기를 가졌다. 두 번째 단계는 중앙 구획으로부터 1차 제거의 모델을 따른다. 두 번째의 반감기는 9.54일이었고, 이는 생체 내 항체의 반감기와 유사하다. 이들 데이터는 융합 단백질이 혈류에서 매우 안정하다는 것을 시사한다. 융합 단백질을 피하 주사한 다른 연구에서, 9.52일의 거의 동일한 반감기가 관찰되었다(도 3b). 더욱 중요하게는, CD24Fc가 혈액에서 피크 수준에 도달하는데 약 48시간이 걸렸지만, AUC에 의해 측정된 바와 같이, 혈액에서 융합 단백질의 총량은 어느 주사 경로에서도 실질적으로 동일하였다. 따라서, 치료적 관점에서, 상이한 주사 경로를 사용하는 것은 약물의 치료 효과에 영향을 미치지 않아야 한다. 이러한 관찰은 영장류 독성 및 임상 시험을 위한 실험 설계를 크게 단순화시켰다.

실시예 2

조직 손상에 대한 숙주 반응에서 CD24-시글렉 10 상호작용

거의 20년 전에, Matzinger는 대중적으로 위험 이론으로 불리는 것을 제안하였다. 본질적으로, 그녀는 면역 시스템이 숙주에서 위험을 감지할 때 턴 온(turn on) 된다고 주장했다. 비록 위험의 본질은 당시에 잘 정의되지 않았지만, 손상-관련 분자 패턴에 대해, 괴사가 DAMP로 불리는, 열-충격 단백질 및 HMGB1과 같은 세포 내 성분의 방출과 관련이 있는 것으로 확인되었다. DAMP는 염증성 사이토카인 및 자가면역 질환의 생성을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 동물 모델에서, HMGB1 및 HSP90의 억제제는 RA를 개선시키는 것으로 밝혀졌다. DAMP의 관여는 DAMP에 대한 숙주 반응에 대한 음성 조절이 RA 치료에 대해 탐구될 수 있다는 전망을 높였다.

아세트아미노펜-유도된 간 괴사를 사용하여 염증을 보장함으로써, 시글렉 G 상호작용을 통해, CD24가 조직 손상에 대한 숙주 반응을 위한 강력한 음성 조절을 제공한다는 것이 관찰되었다. CD24는 조혈 세포 및 다른 조직 줄기세포에서 광범위하게 발현되는 GPI 고정 분자이다. 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, RA 및 거대 세포 관절염을 포함하는 인간의 다양한 자가면역 질환의 유전적 분석은 CD24 다형성 및 자가면역 질환의 위험 사이에 유의적인 연관성을 나타내었다. 시글렉 G는 시알산 함유 구조를 인식하는 능력에 의해 정의되는 I-렉틴 패밀리의 구성원이다. 시글렉 G는 CD24 상의 시알산 함유 구조를 인지하고 수지상 세포에 의한 염증성 사이토카인의 생성을 음성적으로 조절한다. CD24와 상호작용할 수 있는 능력에 있어서, 인간 시글렉 10 및 마우스 시글렉 G는 기능적으로 동등하다. 그러나 마우스와 인간 동족체 사이에 1 대 1 상관관계가 있는지는 불명확하다. 메커니즘은 완전히 밝혀져 있지만, 시글렉 G-관련 SHP1은 음성 조절에 관여할 가능성이 있다. 이들 데이터는 CD24-시글렉 G/10 상호작용이 DAMP로부터의 병원체-관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern)(PAMP) 식별에서 결정적인 역할을 할 수 있는 새로운 모델로 이어진다(도 4).

적어도 2개의 중첩 메커니즘은 CD24의 기능을 설명할 수 있다. 첫째, 다양한 DAMP에 결합함으로써, CD24는 염증성 자극을 포착하여 TLR 또는 RAGE와의 상호작용을 방지할 수 있다. 이 개념은 CD24가 HSP70, 90, HMGB1 및 뉴클레오린을 포함하는 여러 DAMP 분자와 관련된다는 관찰에 의해 뒷받침된다. 둘째로, 아마도 DAMP와 관련된 후, CD24는 시글렉 G에 의한 시그널링을 자극할 수 있다. 두 메커니즘 모두는 어느 쪽이든 더 강한 염증 반응이 장착된 유전자의 표적화된 돌연변이를 갖는 마우스로서 협력하여 작용할 수 있다. 사실상, CD24-/- 또는 시글렉 G-/- 마우스로부터 골수에서 배양된 DC는 HMGB1, HSP70 또는 HSP90으로 자극될 때 훨씬 더 높은 염증성 사이토카인을 생성하였다. 대조적으로, LPS 및 PolyI:C와 같은 PAMP에 대한 반응에서 어떠한 효과도 발견되지 않았다. 이들 데이터는 선천성 면역 시스템이 조직 손상으로부터 병원체를 구별하기 위한 메커니즘만을 제공했을 뿐만 아니라, 질환에 대한 잠재적 치료 표적으로서 CD24 및 시글렉 G는 조직 손상과 관련된다는 것을 시사한다.

실시예 3

CD24Fc는 HMGB1 , 시글렉 10과 상호작용하여 시글렉 G와 SHP -1 사이의 회합(association)을 유도한다

CD24Fc와 시글렉 10 사이의 상호작용을 측정하기 위해, CD24F는 CHIP 상에 고정화되었고, 상이한 농도의 시글렉-lOFc의 결합을 측정하기 위해 바이아코어(Biacore)를 사용하였다. 도 5a에 도시된 바와 같이, CD24Fc는 1.6x10^-7M의 Kd로 시글렉 10과 결합한다. 이는 대조군 Fc 보다 lOO-배 더 높은 친화성이다. CD24Fc와 HMGB1 사이의 상호작용은 CD24Fc-결합 단백질 G 비드를 사용한 풀 다운 실험에 이어 항-IgG 또는 항-HMGB1로 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다. 이들 데이터는 Fc는 아니나 CD24Fc는 HMGB1에 결합하며, 이러한 결합은 양이온-의존적임을 입증한다(도 5b). CD24Fc가 시글렉 G의 작용제인지를 결정하기 위해, 인간 시글렉 10의 마우스 대응물, CD24-/-비장 세포를 CD24Fc, 대조군 Fc 또는 비히클(PBS) 대조군으로 30분 동안 자극하였다. 이어서, 시글렉 G를 면역 침강시키고, 항-인산-티로신 또는 항-SHP-1로 탐침 하였다. 도 5c에 도시된 바와 같이, CD24Fc는 시글렉 G의 상당한 인산화와, 적응성 및 선천성 면역 모두에 대해 잘 알려진 억제제인 SHP-1의 회합을 유도하였다.

CD24Fc의 시험관 내(in vitro) 효능 연구.

인간 T 세포에 의한 염증성 사이토카인의 생성에 대한 CD24Fc의 영향을 연구하기 위해, 인간 PBML에서의 성숙한 T 세포를 항-CD3 항체(OKT3), 즉, 상이한 농도의 CD24Fc 또는 인간 IgG1 Fc의 존재하에 T 세포 수용체의 통상적으로 사용되는 효능제에 의해 활성화 시켰다. 4일 후에, 상청액을 수집하고 IFN-γ 및 TNF-α의 생성을 효소-연결된 면역흡착분석(Enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA)에 의해 측정하여 활성화를 확인하였다. 도 6에서 그 결과는 2개의 상이한 제조 로트로부터의 CD24Fc는 대조군 IgG Fc 대조군과 비교하여 활성화된 인간 PBML로부터 IFN-γ 및 TNF-α 생성을 유의적으로 감소시킨다는 것이 입증되었다. 또한, CD24Fc를 첨가한 경우, 사이토카인 생성은 용량-의존적 방식으로 억제되었다. 따라서, CD24Fc는 시험관 내에서 항-CD3 유도된 인간 PBML 활성화를 억제할 수 있다. 이 연구는 CD24Fc의 작용 메커니즘이 T 세포 활성화의 억제를 통한 것일 수 있다는 것을 나타냈을뿐만 아니라, 약물 효능 및 안정성 시험에 대한 신뢰성 있는 생물학적 검정을 확립시켰다.

CD24Fc가 인간 세포주에서 염증성 사이토카인의 생성을 조절하는지 여부를 결정하기 위해, 인간 급성 단핵구 백혈병 THP1 세포주에서 CD24를 먼저 RNAi를 사용하여 침묵시킨 후, 이들을 PMA로 치료함으로써 대식세포 내로의 분화를 유도하였다. 도 7a에 도시된 바와 같이, CD24 침묵은 실질적으로 TNFα, IL-1β 및 IL-6의 생성을 증가시켰다. 이들 데이터는 염증성 사이토카인의 생성을 제한하는 내인성 인간 CD24에 대한 필수적인 역할을 입증한다. 중요하게는, CD24Fc는 CD24-침묵된 세포주에서 TNFα뿐만 아니라 IL-1β 및 IL-6의 억제를 복원했다(도 7b). 이들 데이터는 인간 세포의 염증 반응에서 CD24의 관련성을 증명할 뿐만 아니라, CD24Fc 의 생물학적 활성을 평가하기 위한 간단한 분석을 제공한다.

함께 취합하면, 이들 데이터는 CD24Fc가 적응성 및 선천적 자극에 의해 촉발된 사이토카인 생성을 억제할 수 있다는 것을 입증한다. 그러나 약물은 선천적 이펙터에 의한 사이토카인 생성을 감소시키는데 훨씬 더 효과적이기 때문에, 예방적 기능을 위한 주요 메커니즘은 이식 초기 단계에서 조직 손상에 의해 촉발된 염증의 방지인 것으로 간주 되었다.

실시예 4

인간에서 CD24 약물 동역학

이 실시예는 인간에서 CD24 단백질의 약물 동역학의 분석을 나타낸다. 이는 건강한 남성 및 여성 성인 피험자에서 CD24Fc의 안전성, 내성 및 PK를 평가하기 위한 I 상, 무작위, 이중-맹험, 위약-제어, 단일 상승 용량 연구로부터 도출되었다. 8명의 피험자의 5개의 코호트에서 총 40명의 피험자를 이 연구에 등록하였다. 각 코호트에서 8명의 피험자 중 6명은 연구 약물을, 2명의 피험자는 위약(0.9% 염화나트륨, 식염수)을 받았다. 첫 번째 코호트는 10mg으로 투여되었다. 후속 코호트는 30mg, 60mg, 120mg 및 240mg의 CD24Fc 또는 매칭 위약을 투여받았고, 각각의 이전 코호트에 대한 안전성 및 내성 데이터를 검토할 수 있도록 적어도 3주 간격을 두고 투여되었다. 적절한 안전성 및 내성이 입증된 경우에만, 새로운 코호트의 피험자에게 다음 더 높은 용량을 투여하는 것이 허용되었다.

각 코호트에서, 초기 2명의 피험자는 1일째에 1 연구 약물 수용자 1명 및 1 위약 수용자 1명 이였다. 제3 내지 제5 및 제6 내지 제8 피험자는 7일 후에 투여하였다(서브그룹 사이에 최소 24시간 간격). 각 피험자는 동일한 서브그룹에서 적어도 1시간 간격을 두고 투여되었다. 필요한 경우, 피험자의 나머지의 투약은 그 코호트에서 제1 또는 제2 서브그룹과 관련된 투여-후 기간 동안 발생할 수 있는 임의의 중대한 안전성 문제를 검토하는 동안 지연되었다. 후속 코호트는 이전 코호트 후 적어도 3주에 투여되었다.

스크리닝 기간:

스크리닝 방문(방문 1)은 활성 치료 기간의 시작 전 21일까지 발생하였다. 사전 동의를 제공한 후, 피험자는 적격성에 대한 스크리닝 절차를 거쳤다.

처리 기간:

피험자를 -1일째(방문 2)에 임상 약리학 유닛(Clinical Pharmacology Unit)(CPU)에 입원시켰고, 무작위 치료 기간은 최소 10시간 밤새 금식 후 1일째에 시작하였다. 피험자를 단일 용량으로서 CD24Fc 또는 위약으로의 치료에 무작위로 할당하였다. 피험자는 4일째 아침까지 갇혀 있었다.

후속 조치:

모든 피험자는 후속 방문(방문 3, 방문 4, 방문 5, 방문 6 및 방문 7)을 위해 7일, 14일, 21일, 28일 및 42일(±1일)에 CPU로 돌아왔다. 방문 7은 모든 피험자에 대한 최종 방문이었다.

치료 기간:

각 피험자에 대해 총 연구 기간은 최대 63일이었다. 1일째에 단일-용량 투여가 발생했다.

피험자 수:

계획: 40명 피험자

스크리닝: 224명 피험자

무작위: 40명 피험자

완료: 39명 피험자

중단: 1명 피험자

포함을 위한 진단 및 주요 기준:

이 연구를 위한 집단은 18kg/m² 내지 30kg/m²까지의 체질량지수를 가지는 18 내지 55세까지의 건강한 남성과 여성이었다.

조사 제품 및 비교기 정보:

CD24Fc: IV 주입을 통해 투여되는 10mg, 30mg, 60mg, 120mg 또는 240mg의 단일 용량; 로트 번호: 09MM-036. CD24Fc는 인간 CD24의 성숙 서열 및 인간 면역 글로불린 G1(IgG1Fc)의 결정화 가능한 영역으로 이루어진 완전 인간화된 융합 단백질이었다. CD24Fc는 IV 투여를 위해 무균, 투명, 무색, 방부제가 없는 수용액으로서 공급되었다. CD24Fc를 10mg/mL의 농도 및 pH 7.2의 단일 용량 주사 용액으로 제제화하였다. 각각의 CD24Fc 바이알은 16mgL±0.2mL의 CD24Fc에 160mg의 CD24Fc, 5.3mg의 염화나트륨, 32.6mg의 인산나트륨 이염기성 칠수화물 및 140mg의 인산나트륨 일염기성 일수화물을 함유하였다. CD24Fc를 클로로부틸 고무마개 및 알루미늄 플립-오프 씰과 함께 투명한 붕규산 유리 바이알에 공급하였다.

IV 주입을 통해 투여되는 매칭 위약(0.9% 염화나트륨, 식염수); 로트 번호: P296855, P311852, P300715, P315952.

치료 의도(intent-to-treat)(ITT) 집단은 적어도 1회 용량의 연구 약물을 받은 모든 피험자로 구성되었다. ITT 집단은 피험자 정보 및 안전성 평가를 위한 주요 분석 집단이었다.

임상 실험실 평가(화학, 혈액학 및 소변 검사)는 치료 및 방문에 의해 요약되었다. 기준선(baseline)으로부터의 변화도 요약되었다. 활력 징후(혈압, 심박수, 호흡 수 및 온도)를 치료 및 시점으로 요약하였다. 기준선으로부터의 변화도 요약되었다. 모든 신체검사 데이터가 나열되었다. 심전도 매개변수 및 기준선으로부터의 변화가 요약되었다. 전반적인 해석이 나열되었다.

혈장 CD24Fc 농도

도 8에 도시된 바와 같이, CD24Fc의 평균 혈장 농도는 투여된 CD24Fc의 용량에 비례하여 증가하였다. 120mg을 제외한 모든 용량 그룹에 대해, CD24Fc의 최대 평균 혈장 농도는 투여-후 1시간에 도달하였다. 120mg 그룹에 대한 CD24Fc의 최대 평균 혈장 농도는 투여-후 2시간에 도달하였다. 42일째(984시간)까지, 모든 그룹에 대한 CD24Fc의 평균 혈장 농도는 최대 평균 혈장 농도의 2% 내지 4%로 감소하였다.

표 1은 PK 평가 가능한 집단에 대해 치료에 의한 혈장 CD24Fc PK 매개 변수를 요약한 것이다.

[표 1] 치료에 의한 혈장 CD24Fc 약물 동역학 매개 변수의 요약 - PK 평가 가능 집단

혈장 CD24Fc 용량 비례 분석

도 9는 PK 평가 가능한 집단에 대한 CD24Fc C_max 대 용량의 용량 비례 플롯을 나타낸다. 도 10은 PK 평가 가능한 집단에 대한 CD24Fc AUC_{0 -42d} 대 용량의 용량 비례 플롯을 나타낸다. 도 11은 PK 평가 가능한 집단에 대한 CD24Fc AUC_{0 - inf} 대 용량의 용량 비례 플롯을 나타낸다. 표 2는 용량 비례의 파워 분석을 보여준다.

C_max 기울기 추정치는 90% CI가 1.105 내지 1.210인 1.172이었다. AUC_{0 -42d} 기울기 추정치는 90% CI가 1.027 내지 1.148인 1.088이었다. AUC_{0 - inf} 기울기 추정치는 90% CI가 1.026 내지 1.1인 1.087이었다.

약물 동역학적 결론

혈장 CD24Fc의 C_max 및 AUC는 마우스, 원숭이 및 인간에서 투여된 용량에 비례하여 증가하였다. 혈장 CD24Fc는 1.01과 1.34시간 사이에 T_max에 도달했다. 혈장 CD24Fc의 t_1/2는 280.83 내지 327.10시간 범위였다.

실시예 5

CD24는 인간 피험자에서 이식편 대 숙주 질환을 치료하는데 사용될 수 있다

동종 골수 소멸성 조혈 줄기세포 이식(HCT)을 받는 종양 환자에서 치료 표준 급성 GVHD 예방에 대해 CD24 단백질, CD24Fc의 첨가를 평가하기 위해 다중심, 예상, 이중-맹험, 무작위, 위약-제어된 상 IIa 용량 에스컬레이션 실험을 수행하였다. 시험 설계는 도 12에 도시되어 있다.

상 IIa 연구의 주요 목적은 골수 소멸성 컨디셔닝 후 매치된 비관련된 도너 HCT를 받는 환자에서 메토트렉세이트 및 타크롤리무스 예방과 조합하여 CD24Fc의 안전성 및 내성을 평가하는 것, 및 권장 상 2 용량(recommended phase 2 dose)(RP2D) 또는 최대 허용 용량(maximum tolerated dose)(MTD)을 정의하는 것을 포함한다. 또한, 상 IIa 연구에서 2차 효능 목적은 다음을 포함한다:

표준 GVHD 예방 메토트렉세이트 및 타크롤리무스에 대한 CD24Fc의 첨가가 HCT 후 100일째에 등급 II-IV aGVHD의 누적 발생률을 감소시키는 지를 결정하는 것

HCT 후 180일째에 등급 II-IV aGVHD 없는 생존(aGVHD free survival)(GFS)을 평가하는 것,

1년째에 cGVHD(cGVHD)의 발생률을 설명하는 것

HCT 후 1년째에 재발의 발생률을 설명하는 것

HCT 후 1년째에 이식-관련 사망률(transplant-related mortality)(TRM)의 발생률을 설명하는 것

HCT 후 100일째에 감염률을 설명하는 것

HCT 후 1년째에 전체 생존율(overall survival)(OS), 등급 III-IV GVHD의 부재, 및 재발-없는 생존을 평가하는 것

구강 점막염 및 기관 장애를 포함하는 컨디셔닝 독성을 평가하는 것

다른 목적은 CD24Fc의 약물 동역학(pharmacokinetic)(PK) 프로파일을 평가하는 것, CD24Fc 및 위약 그룹에서 HCT 후 APCs 및 T 세포의 면역 세포 프로파일 및 기능적 반응을 조사하는 것, 및 CD24Fc 및 위약 그룹에서 전-염증성 사이토카인, DAMPs, 지질, 및 GVHD 바이오마커(biomaker)의 혈장 농도와 같은 약물 동역학(pharmacodynamics)(PD) 바이오마커를 평가하는 것을 포함한다.

시험은 기관 관행에 따라 동종 HCT를 받고 있는 매치된 비관련된 도너로부터 이식을 받는 환자를 등록했다. 카르노프스키 수행 스코어(Karnofsky performance score)≥70%인 악성 혈액학적 상태에 대한 매치된 비관련된 도너 동종 HCT를 받고 있는 18-70세 연령들 사이의 환자들은 연구에 자격이 있었다. HLA-A, HLA-B, HLA-C 및 HLA-DRB1에서 비관련된 도너와 수용자 사이의 8/8 HLA 대립유전자 정합이 요구되었다. 비관련된 도너로부터 HCT를 받는 환자에게 연구를 제한하는 것은, 이러한 집단에서 등급 II-IV aGVHD(60-80%) 및 등급 III-IV aGVHD(20-35%)의 더 큰 발생률을 고려하면, 이종성을 제한하고 후속 효능 평가를 위한 aGVHD 발생률의 통계적 추정을 용이하게 할 것으로 예상된다.

이러한 시험은 이러한 환자가 가장 심각한 조직 손상을 경험하고 약물이 이러한 설정에서 가장 강한 생물학적 효과를 가질 가능성이 있기 때문에, 타크롤리무스 및 메토트렉세이트를 포함하는 치료 표준(standard of care)(SOC) 예방 및 골수 소멸성 컨디셔닝 요법을 배타적으로 이용하였다. 모든 환자는 상 IIa 프로토콜에 대하여 메토트렉세이트 및 타크롤리무스로 골수 소멸성 컨디셔닝 및 치료 표준 GVHD 예방을 받았다. 환자는 플루다라빈 및 부설판(Flu/Bu 4) 또는 시클로포스파미드 및 전신 방사선 조사(Cy/TBI)로 이루어진 골수 소멸성 컨디셔닝 요법을 받았으며, 치료 의사에 의해 결정된 바와 같이, 이어서 0일째에 줄기세포의 주입이 있었다. GVHD 예방이 모든 환자에게 투여되고, 위약 팔에서 식염수 또는 치료 팔에서 CD24Fc와 조합하여 타크롤리무스(이식 전 -3일 개시) 및 메토트렉세이트(이식 후 +1일 개시)로 구성되었다. GVHD의 부재하에, 타크롤리무스 테이퍼링은 +100일째에 시작하였다. 도너 줄기세포의 공급원은 말초 혈액 줄기세포(peripheral blood stem cells)(PBSC) 또는 골수(bone marrow)(BM)이다.

상 IIa 시험은 하기 표 3에 약술한 바와 같이 SOC GVHD 예방에 부가하여 2개의 단일 상승 용량 코호트(240mg 및 480mg) 및 CD24Fc의 단일 다중-용량(multi-dose) 코호트를 포함하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 단일 용량 코호트에서, 연구 제제, CD24Fc는 줄기세포 이식 날짜에 대해 -1일째에 정맥 내로 투여되었다. 다중-용량 코호트에서, 환자들은 480mg(-1일), 240mg(+14일) 및 240mg(+28일)로 CD24Fc의 3회의 격주 투여를 받았다. CD24Fc에 대한 PK 데이터에 기초하여, 이 격주 용량 기간은 2개 이상의 반감기의 통과를 허용할 것이다. 용량은 고정된 양을 기초로 하고, 중량 또는 BSA에 기초하지 않는다. 각각의 용량 코호트는 24명의 환자의 총 등록을 위해 무작위 3:1 비율(6명의 CD24Fc 피험자 및 2명의 위약) 설계를 사용하여 8명의 피험자를 등록하였다.

[표 3] 상 2a 용량 에스컬레이션 계획

표 4는 CD24Fc 및 위약 코호트의 환자에 대한 디모그래피(demography) 정보 및 임상 특성을 열거하며, 이는 연령, 악성종양(malignancy), 및 공존이환(comorbidity)과 같은 위험 인자에 걸쳐 비교적 균형을 이룬다. CD24Fc 및 위약 코호트 모두에서 가장 흔한 악성종양은 AML/MDS(66.7% 및 83.3%)이었다. CD24Fc 코호트에서 환자의 72% 및 위약 그룹에서 50%는 중간 또는 높은 공존이환 지수를 가졌다. PBSCs는 양 코호트에서 골수와 비교하여 이식편 공급원(graft source)으로서 더 자주 사용되고, Flu/Bu 4는 양 코호트에 걸쳐 가장 일반적인 컨디셔닝 요법이다. 모든 CD24Fc 코호트에서 4명의 환자는 Cy/TBI 컨디셔닝을 받았다.

[표 4] 상 2a 환자 특성

본 연구의 주요 목적은: 골수 소멸성 동종 조혈 세포 이식(HCT)을 받는 피험자에서 CD24Fc의 안전성 및 내성을 평가하는 것; 및 HCT를 받는 환자에서 CD24Fc 의 권장 상 II 용량(RP2D) 또는 최대 허용 용량(MTD)을 결정하는 것이다.

연구에 등록된 모든 환자들은 치료 기간을 완료하였으며, 이는 단일 용량 코호트에 대해 HCT 후 30일 또는 다중 용량 코호트에 대해 HCT 후 60일(정확한 날은 편차를 구성하지 않고 연구 약물의 투여 마지막 날에 따라 달라질 수 있음)까지의 CD24Fc로 치료의 첫날이고, 연구 약물과 잠재적으로 관련된 용량 제한 독소를 포함하는 부작용(adverse events)(AE)에 대한 평가 및 보고 기간이다. 표 5는 상 2a 시험에서 관찰된 독성의 요약을 제공한다. 전체적으로 본 연구는 480mg까지의 CD24Fc 의 IV 투여가 일반적으로 치료-의도(intent-to-treat)(ITT) 집단에서 잘 용인됨을 입증하였다. 어떠한 주입 독성(infusion toxicities), 용량-제한 독성(Dose-limiting toxicities)(DLTs) 또는 연구 약물에 기인할 수 있거나 기인할 가능성이 있는 SAEs는 관찰되지 않았고, 어떤 환자들도 연구로부터 제거되지 않았다.

등록된 24명 모두의 피험자는 도 14에 나타낸 바와 같이 이식에 따라 등록되었다. 각각 CD24Fc 노출 및 위약 환자에서 HCT 후 13.0 및 15.5일의 중앙값에 호중구가 이식되었다. 혈소판은 각각 CD24Fc 노출 및 위약 환자에서 HCT 후 13.0 및 15.0일의 중앙값에 이식되었으며, 위약 그룹에서의 혈소판이 이식되지 않았고, 49일째에 사망했던 한 환자를 제외했다. 이식 실패의 경우는 없었다. +30일째에 중앙값 CD3 키메리즘은 CD24Fc 노출 환자에서 82.5%(범위 38-100%)이고, 위약 그룹에서 82.0%(범위, 62%-91%)이었다(도 15). 중앙값 도너 CD3 키메리즘은 CD24Fc 노출 환자에서 100일째에 86%(범위, 42%-100%)로 증가하였고, 위약 그룹에서 84%(범위, 17%-100%)로 증가하였다. 30일 및 100일째에 도너 CD33 키메리즘은 CD24Fc 및 위약 그룹 모두에서 100%였다.

[표 5] 독성의 요약

상 2a에 대한 효능 분석은 이차적으로 고려되며 다음을 포함한다: HCT 후 180일째에 등급 III-IV 급성 GVHD 없는 생존(GFS)을 설명; HCT 후 100일째에 등급 II-IV 급성 GVHD의 누적 발생을 설명; HCT 후 180일째에 등급 II-IV 급성 GVHD, 재발 없는 생존을 설명; HCT 후 180일째에 등급 II-IV 급성 GFS를 설명; HCT 후 1년째에서 만성 GVHD의 발생률을 설명; HCT 후 1년째에 재발의 발생률을 설명; HCT 후 1년째에 이식-관련 사망률(TRM)의 발생률을 설명; HCT 후 100일째에 감염 비율을 설명; HCT 후 1년째에 전체 생존(OS) 및 질병 없는 생존(disease-free survival)(DFS)을 평가.

상 IIa 연구에서 위약 팔의 포함에 부가하여, 동시성의 대조군(N=92)에 대한 데이터는 2012년 1월부터 2017년 11월 기간까지 동일한 골수 소멸성 컨디셔닝 및 GVHD 예방 요법(실험 치료 CD24Fc를 제외한) 후 매치된 비관련된 도너 HCT를 받는 동일한 기관으로부터 수집되었다. 위약 대조군 팔에서 적은 수의 환자를 고려하여 동시성의 대조 코호트가 포함되었다. 동시성의 대조 코호트에서 92명의 성인 환자의 디모그래피 데이터는 표 6에 요약되어 있다.

[표 6] 동시성의 대조 코호트에 등록된 환자의 특성

표 7 및 표 8은 상 2a 연구의 임상 결과의 개요를 제공한다. 급성 GVHD는 국제 CIBMTR 레지스트리(registry) 및 혈액 및 골수 이식 임상 시험 네트워크(Blood and Marrow Transplant Clinical Trials Network)에 의해 이용되는 컨센서스 가이드라인(consensus guideline)에 따라 등급화되고 매주 기록되었다. HCT 후 100일까지 0일째에 HCT를 받은 후 aGVHD에 대해 환자들을 평가하였다.

[표 7] 등급 II-IV 및 등급 III-IV aGVHD의 누적 발생률을 포함하는 임상 결과의 개요를 나타낸다.

* 180일 후 사망(n=2): 코호트 1 폐렴 2/2 감염(d 210) 및 코호트 2 CMML의 재발(d 196)

[표 8] 임상 결과의 요약

100일째까지 등급 II 내지 IV 급성 이식편 대 숙주 질환의 발생률

표 9는 mITT 집단에 대해 100일째까지 등급 II 내지 IV 급성 GVHD의 누적 발생률을 요약한 것이다. 전체로서, CD24Fc를 받은 7명(38.9%)의 환자들(240mg CD24Fc 단일 용량 코호트에서 2명[33.3%]의 환자들, 480mg CD24Fc 단일 용량 코호트에서 3명[50.0%]의 환자들, 및 960mg CD24Fc 다중 용량 코호트에서 2명[33.3%]의 환자들) 및 위약을 받은 1명(16.7%)의 환자는 100일째까지 등급 II 내지 IV 급성 GVHD를 가졌다. 또한, 위약을 받은 1명(16.7%)의 환자는 100일까지 등급 II 내지 IV 급성 GVHD 없이 사망했다. 100일까지 등급 II 내지 IV 급성 GVHD의 발생 없이 살아있는 환자는 100일째에 또는 그 이전에 급성 GVHD에 대한 최종 평가에서 검열되어 삭제되었다(censored). 각 치료 그룹에서 적어도 50.0%의 환자들은 검열되어 삭제되었다.

[표 9] 100일째까지 등급 II 내지 IV 급성 이식편 대 숙주 질환의 누적 발생률-mITT 집단

전체적으로, 100일째까지(95% CI를 가짐) 등급 II 내지 IV 급성 GVHD의 누적 발생률은 CD24Fc 치료 그룹에 대해 38.9%(16.8%, 60.7%) 및 위약 그룹에 대해 16.77%(0.5%, 54.9%)이었다. CD24Fc 대 위약에 대한 위험 비율(90% CI를 가짐)은 2.6(0.55, 14.7) 이었다. 등급 II-IV aGVHD의 누적 발생률은 동시성의 대조군에서 50%였다. CD24Fc 치료된 그룹에서, 등급 II aGVHD의 4개의 경우는 단지 피부를 포함하였고, 2개의 경우는 피부 및 상부 위장관(GI)을 포함하였다. 위약 그룹에서 등급 II aGVHD는 없었다.

180일째까지 등급 II-IV 급성 이식편 대 숙주 질환-없는 생존

표 10은 mITT 집단에 대해 180일째까지 등급 II 내지 IV 급성 GFS를 요약한 것이다. 중앙값 등급 II 내지 IV 급성 GFS 카플란-마이어 추정치는 임의의 치료 그룹에 도달하지 않았다. 전체적으로, 180일째에(95% CI를 가짐) 등급 II 내지 IV 급성 GFS 비율은 CD24Fc 치료 그룹에 대해 61.1%(35.3%, 79.2%)이고, 위약 그룹에 대해 50.0%(11.1%, 80.4%)이었다. CD24Fc 대 위약에 대한 위험 비율(hazard ratio)(90% CI를 가짐)은 0.8(0.3, 2.5)이었다. 살아있었고 데이터 컷오프 날짜에 등급 II 내지 IV 급성 GVHD의 문서화된 발생을 갖지 않는 환자들은 180일째 또는 그 이전에 급성 GVHD 평가의 마지막 날짜에 검열하여 삭제되었다. 작은 샘플 크기 이외에, 각 치료 그룹에서 환자의 적어도 50.0%가 검열되어 삭제되었다.

[표 10] 180일째까지 등급 II 내지 IV 급성 이식편 대 숙주 질환-없는 생존-mITT 집단

mITT 집단에 대한 180일째까지 등급 III 내지 IV 급성 GFS

표 11에 나타낸 바와 같이, 전체로서, CD24Fc를 받은 1명(5.6%)의 환자(480mg CD24Fc 단일 용량 코호트에서 1명[16.7%]의 환자) 및 위약을 받은 2명(33.3%)의 환자들은 180일째까지 등급 II 내지 IV 급성 GVHD를 가졌다. 전체적으로, 180일째에(95% CI를 가짐) 등급 III 내지 IV 급성 GFS 비율은 CD24Fc 치료 그룹에 대해 94.4%(66.6%, 99.2%)이고, 위약 그룹에 대해 50.0%(11.1%, 80.4%)이었다. CD24Fc 대 위약에 대한 위험 비율(90% CI를 가짐)은 0.1(0.0, 0.7)이었다. 살아있었고 데이터 컷오프 날짜에 등급 III 내지 IV 급성 GVHD의 문서화된 발생을 갖지 않는 환자들은 180일째 또는 그 이전에 급성 GVHD 평가의 마지막 날짜에 검열되어 삭제되었다. 각 치료 그룹에서 환자의 적어도 50.0%가 검열되어 삭제되었다. 180일째에 등급 III 내지 IV 급성 GFS 비율은 동시성의 대조 코호트에서 24%였다. 도 25는 위약 대조군(도 25A) 및 동시성의 대조군 그룹(도 25B)에 비해 CD24Fc 그룹에서 180일 등급 III-IV GVHD 없는 생존을 나타낸다.

[표 11] 180일째까지 등급 III 내지 IV 급성 이식편 대 숙주 질환-없는 생존-mITT 집단

데이터 컷오프의 시간에 연구에서 aGVHD를 발생한 모든 환자는 스테로이드 치료에 반응했는데, 이는 동시성의 코호트 대조군에서 관찰된 50% 반응 속도와 비교된다. HCT 후 처음 100일 후에, 환자는 HCT 후 1년까지 후기 개시(onset) aGVHD(100일 후 급성 GVHD 개시로서 정의됨) 또는 cGVHD에 대해 분기별로 평가되었다. 이식 후 100일 후 CD24Fc 코호트에서 추가의 aGVHD 사건이 관찰되지 않았다.

도 16은 치료(CD24Fc) 코호트에서 등급 II-IV 및 등급 III-IV 급성 GVHD의 누적 발생률을 나타낸다. 특히, 단지 한 명의 환자는 낮은 GI를 포함하고 어떤 간(liver) GVHD도 관찰되지 않았다. CD24Fc 코호트에서 HCT 후 180일째에 등급 III-IV aGVHD의 누적 발생률은 동시성의 대조군(P=0.097)에서 180일째에 등급 III-IV aGVHD 보다 더 낮은 경향을 보였다. 182일째에 등급 III aGVHD의 추가적인 경우가 있었으며, 이는 위약 그룹의 환자에서 184일째에 사망을 초래하였다. 이 환자는 145일째에 백혈병 재발했다. 이러한 결과는 메토트렉세이트 및 타크롤리무스 예방뿐만 아니라 CD24Fc가 골수 소멸성 컨디셔닝을 받은 후 HCT를 받는 환자에서 더욱 심각한 등급 III 및 IV aGVHD를 발생할 위험을 감소시킨다는 것을 시사한다.

조혈 줄기세포 이식 1년 후 질병 없는 생존

표 12는 mITT 집단에 대한 HCT 1년 후 질병 없는 생존(DFS)을 요약한 것이다. 중앙값 DFS 카플란-마이어 추정치는 임의의 치료 그룹에 대해 도달하지 않았다. 전체적으로, HCT 1년 후에(95% CI를 가짐) DFS 비율은 CD24Fc 치료 그룹에 대해 83.3%(56.8%, 94.3%)이고, 위약 그룹에 대해 50.0%(11.1%, 80.4%)이었다. CD24Fc 대 위약에 대한 위험 비율(90% CI를 가짐)은 0.2(0.1,0.9)이었다. 살아있었고 후속 조치 기간의 말기에 질병재발을 경험하지 않은 환자들은 평가의 마지막 날짜에 검열되어 삭제되었다. 각 치료 그룹에서 적어도 50.0%의 환자들이 검열되어 삭제되었다. 도 26은 위약 대조군(도 26A) 및 동시성의 대조군(도 26B)과 비교하여 CD24Fc 그룹에서 재발성 없는 생존을 나타낸다.

[표 12] 조혈 줄기세포 이식 1년 후 질병 없는 생존-mITT 집단

조혈 줄기세포 이식 1년 후 전체 생존

표 13은 mITT 집단에 대한 HCT 1년 후 전체 생존(OS)을 요약한다. 중앙값 OS 시간 카플란-마이어 추정치는 임의의 치료 그룹에 대해 도달하지 않았다. 전체적으로, 1년째에 OS 비율(95% CI를 가짐)은 위약 그룹에 대해 50.0%(11.1%, 80.4%) 및 CD24Fc 치료 그룹에 대해 83.3%(56.8%, 94.3%)이었다. CD24Fc 대 위약에 대한 위험 비율(90% CI를 가짐)은 0.2(0.1, 1.0)이었다. 후속 조치 기간의 말기에 살아있는 환자들은 이들이 살아있는 것으로 알려졌다는 마지막 날짜에 검열되어 삭제되었다. 각 치료 그룹에서 적어도 50.0%의 환자들이 검열되어 삭제되었다.

[표 13] 조혈 줄기세포 이식 1년 후 질병 없는 생존-mITT 집단

상 IIa 연구에서의 환자에 대한 HCT 후 약 800일째에 전체 생존(OS)의 추정치는 또한, 고무적이다. 전체 생존율(OS)은 CD24Fc 코호트에서의 환자에 대해 약 80%, 위약 코호트(p=0.06)에서의 환자에 대해 50%(도 20), 및 동시성의 대조군(p=0.05)에서의 환자에 대해 50%였다(도 21). 위약 및 동시성의 대조군 환자와 비교하여 CD24Fc 노출된 환자들에서 개선된 OS는, 메토트렉세이트 및 타크롤리무스와 조합하여 CD24Fc의 투여가 골수 소멸성 컨디셔닝 후 HCT를 받는 환자에서의 결과에 실질적인 개선을 가져올 수 있음을 보여주는, 상기 기재된 다른 연구 결과를 지원한다.

180일째까지 급성 이식편 대 숙주 질환 없는 생존 및 재발 없는 생존( aGRFS )

GVHD를 방지하도록 설계된 치료 전략은 이식편 대 백혈병(GVL) 효과의 감소로 인한 백혈병 재발의 증가를 초래할 수 있다. 표 7에 나타낸 바와 같이, HCT(11%) 후 180일째에 CD24Fc에 노출된 환자에서 백혈병 재발의 발생률은 위약 그룹(33%) 및 동시성의 대조군(23%)에서의 환자와 비교하여 더 낮다. 480mg CD24Fc 코호트에서의 1명의 피험자는 146일째에 CMML의 재발을 경험하였고, 다중-용량 960mg CD24Fc 코호트에서의 1명의 피험자는 HCT 후 100일째에 ALL의 재발을 경험하였다. CMML를 갖는 환자는 백혈병으로 인해 196일째에 사망하였다. ALL 재발을 갖는 환자는 브리나튜모맙(blinatumomab)으로 처리되었고, 완전한 차도를 달성하였고, 데이터 컷오프 2018년 8월 8일 현재로 살아있었다. 위약 코호트에서, 1명의 환자는 94일째에 CMML의 재발을 경험하였고, MDS를 갖는 1명의 환자는 146일째에 재발되었다(CMML를 갖는 환자는 316일째에 사망하였고, MDS를 갖는 환자는 184일째에 사망하였다). 이러한 결과는 CD24Fc가 유익한 이식편 대 종양(graft-versus-tumor)(GVT) 과정을 방해하지 않고, 심지어 백혈병 재발의 위험을 감소시킬 수 있음을 시사한다.

이식 후 180일째에 CD24Fc 코호트에서의 사망 수는 위약 및 동시성의 대조군 코호트보다 낮다(표 7). HCT 후 180일째에, CD24Fc 코호트에서 어떤 환자에서도 사망은 없었고, 위약 코호트(16.7%)에서 폐렴으로 인한 1명의 사망, 및 동시성의 대조군(23.9%)에서 22명의 사망이 있었다. HCT 후 180일째에서 위약 그룹(33%)(P=0.011, 도 18 참조) 및 HCT 후 180일째에서 동시성의 대조군(53%)(P=0.017, 도 19 참조)과 비교하여 CD24Fc 코호트(83%)에서 aGVHD 등급 III-IV의, 재발 없는 생존(RFS)의 복합 종점(composite endpoint)에서의 통계적으로 유의적인 개선이 관찰되었다. 이러한 종류의 종점은 점점 대중화되고 있고, 그것은 원칙적으로 GVHD 억제뿐만 아니라 잠재적인 충격 독성, 감염 및 재발에 대한 간섭의 영향을 요약하고 있기 때문이다. 상기 관찰의 지지로서, 등급 III-IV aGVHD, RFS의 개선은 골수 소멸성 컨디셔닝 요법 후 치료 표준 메토트렉세이트 및 타크롤리무스와 조합하여 CD24Fc를 투여하는 것이 이식편의 GVL 효과에 영향을 미치지 않으면서 aGVHD의 발생을 방지하는 환자에게 유익하다는 것을 보여준다.

HCT 후 180일째까지 aGRFS는 등급 III 내지 IV 급성 GVHD, 재발, 또는 임의의 원인으로부터의 사망을 포함하는 사건인 사후(post hoc) 복합 종점이다. 표 14는 mITT 집단에 대해 180일째까지 등급 III 내지 IV 급성 GRFS를 요약한 것이다.

중앙값 등급 III 내지 IV 급성 GRFS의 카플란-마이어 추정치는 CD24Fc 치료 그룹에 대해 도달하지 않았다. 위약 그룹에 대해, 중앙값 등급 III 내지 IV 급성 GRFS(95% CI를 가짐)의 카플란-마이어 추정치는 120.0(46.0, 추정 가능하지 않음(not estimable))이었다. 전체적으로, 180일(95% CI를 가짐)에서의 등급 III 내지 IV 급성 GRFS 비율은 CD24Fc 치료 그룹에 대해 83.3%(56.8%, 94.3%)이고, 위약 그룹에 대해 33.3%(4.6%, 67.6%)이었다. CD24Fc 대 위약에 대한 위험 비율(90% CI를 가짐)은 0.2(0.0, 0.6)이었다. 살아있었고 등급 III 내지 IV의 급성 GVHD, 전신 면역억제 치료를 요하는 만성 GVHD, 또는 데이터 컷오프 날짜에서 재발의 문서화된 발생을 갖지 않는 환자들은 최종 평가 날짜에 검열되어 삭제되었다.

[표 14] 180일째까지 등급 III 내지 IV 급성 이식편 대 숙주 질환 없는 생존 및 재발 없는 생존-mITT 집단

조혈 줄기세포 이식 1년 후 재발의 발생률

표 15는 mITT 집단에 대한 HCT 1년 후 재발의 누적 발생률을 요약한다. 전체적으로, HCT 1년 후(95% CI를 가짐)에서의 재발의 누적 발생률은 CD24Fc 치료 그룹에 대해 11.1%(1.7%, 30.4%)이었고, 위약 그룹에 대해 33.3%(2.9%, 71.1%)이었다. CD24Fc 대 위약에 대한 위험 비율(90% CI를 가짐)은 0.3(0.1, 1.4)이었다. 살아있었고 후속 조치 기간의 말기(365일[1년])에 재발을 경험하지 않은 환자들은 평가 마지막 날짜에 검열되어 삭제되었다. 각 치료 그룹에서 적어도 50.0%의 환자들은 검열되어 삭제되었다.

[표 15] 조혈 줄기세포 이식 1년 후 재발의 누적 발생률-mITT 집단

조혈 줄기세포 이식 1년 후 이식편 대 숙주 질환 없는 생존 및 재발-없는 생존(GRFS)

HCT 후 1년째까지 GRFS는 등급 III 내지 IV 급성 GVHD, 전신 면역억제 치료를 요하는 만성 GVHD, 재발, 또는 임의의 원인으로부터의 사망을 포함하는 사건인 복합 종점이다. 표 16은 mITT 집단에 대한 HCT 1년 후 등급 III 내지 IV 급성 GRFS를 요약한 것이다.

중앙값 GRFS(95% CI를 가짐)의 카플란-마이어 추정치는 전체 CD24Fc 치료 그룹에 대해 229.0일(141.0, 추정 가능하지 않음): 240mg CD24Fc 단일 용량 코호트에 대해 247.0일(129.0, 추정 가능하지 않음), 480mg CD24Fc 단일 용량 코호트에 대해 287.0(24.0, 추정 가능하지 않음), 및 960mg CD24Fc 다중 용량 코호트에 대해 193.5(100.0. 추정 가능하지 않음)이었다. 중앙값 GRFS(95% CI를 가짐)의 카플란-마이어 추정치는 위약 그룹에 대해 120.0일(46.0, 추정 가능하지 않음)이었다. 전체적으로, HCT 1년 후에서의 GRFS 비율(95% CI를 가짐)은 CD24Fc 치료 그룹에 대해 32.4%(12.7%, 54.0%) 및 위약 그룹에 대해 33.3%(4.6%, 67.6%)이었다. CD24Fc 대 위약에 대한 위험 비율(90% CI를 가짐)은 0.7(0.3, 1.7)이었다. 살아있었고 등급 III 내지 IV 급성 GVHD, 전신 면역억제 치료를 요하는 만성 GVHD, 또는 데이터 컷오프 날짜에서의 재발의 문서화된 발생을 갖지 않는 환자들은 최종 평가 날짜에 검열되어 삭제되었다.

[표 16] 조혈 줄기세포 이식 1년 후 이식편 대 숙주 질환 없는 생존 및 재발 없는 생존-mITT 집단

조혈 줄기세포 이식 1년 후 비-재발 사망률의 발생률

표 17은 mITT 집단에 대한 HCT 1년 후 NRM의 누적 발생률을 요약한 것이다. 전체적으로, 1년째에서 NRM의 누적 발생률(95% CI를 가짐)은 CD24Fc 치료 그룹에 대해 5.6%(0.3%, 23.1%)이었고, 위약 그룹에 대해 16.7%(0.5%, 54.9%)이었다. CD24Fc 대 위약에 대한 위험 비율(90% CI를 가짐)은 0.3(0.09, 2.8)이었다. 재발 없이 후속 조치 기간(365[1년])의 말기에 살아있는 환자들은 이들이 살아있는 것으로 알려진 마지막 날짜에 검열되어 삭제되었다. 각 치료 그룹에서 적어도 50.0%의 환자들이 검열되어 삭제되었다. 180일째에서 NRM의 누적 발병률(95% CI를 가짐)은 CD24Fc 치료 그룹에 대해 0.0%이었고, 위약 그룹에 대해 16.7%(0.5%, 54.9%)이었다.

[표 17] 조혈 후줄기세포 이식 1년 후의 비-재발 사망률의 누적 발생률-mITT 집단

조혈 줄기세포 이식 1년 후에 만성 이식편 대 숙주 질환의 발생률

표 18은 mITT 집단에 대한 HCT 1년 후 만성 GVHD의 누적 발생률을 요약한다. 전체적으로, HCT 1년 후 만성 GVHD의 누적 발생률(95% CI를 가짐)은 CD24Fc 치료 그룹에 대해 63.3%(34.1%, 82.4%)이었고, 위약 그룹에 대해 33.3%(2.5%, 72.0%)이었다. CD24Fc 대 위약에 대한 위험 비율(90% CI를 가짐)은 2.1(0.6, 7.4)이었다. 240mg CD24Fc 단일 용량 코호트에서 3명의 중간 만성 GVHD, 480mg CD24Fc 단일 투여량 코호트에서 3명의 온화한 및 1명의 중간 만성 GVHD, 및 960mg CD24Fc 다중 용량 코호트에서 2명의 온화한 및 3명의 중간 만성 GVHD가 있었다. 2명의 환자는 위약 그룹에서 온화한 만성 GVHD를 가졌다. 전체적으로, 심각한 만성 GVHD의 경우는 없었다. 살아있었고 후속 처리 기간의 말기(365일[1년)에 만성 GVHD를 경험하지 않은 환자들은 최종 평가 날짜에 검열되어 삭제되었다.

[표 18] 조혈 줄기세포 이식 1년 후 만성 이식편 대 숙주 질환의 누적 발생률-mITT 집단

100일째에 감염률

GVL에 대한 효과와 같이, 글로벌 면역 억제를 통한 GVHD를 방지하도록 설계된 치료 전략은 박테리아 감염 및 CMV 재활성화를 포함하는 감염률의 증가를 초래할 수 있다.

표 19는 mITT 집단에 대한 100일째까지 감염의 발생률을 요약한다. 전체로서, CD24Fc를 받은 13명(72.2%)의 환자들(240mg CD24Fc 단일 용량 코호트에서의 5명[83.3%]의 환자들, 480mg CD24Fc 단일 용량 코호트에서의 2명[33.3%]의 환자들, 및 960mg CD24Fc 다중 용량 코호트에서의 6명[100.0%] 환자들) 및 위약을 받은 2명(33.3%)의 환자들은 100일째까지 감염을 가졌다.

대부분의 감염은 제어되고 해결되는 것으로 간주 되었다. 폐렴으로부터 사망한 위약 그룹에서 환자 103-001. 위약 그룹에서 환자 102-002는 회복(recovering)/해결(resolving)로 보고된 결막염을 가졌다. 480mg CD24Fc 단일 용량 코호트에서 환자 101-010 및 480mg CD24Fc 단일 용량 코호트에서 환자 101-011은 모두 회복되지 않은/해결되지 않는 것으로 보고던 발진 농포(rash pustular)를 가졌다. 960mg CD24Fc 다중 용량 코호트에서 환자 102-06은 계속적인 개입으로 보고된 상부 호흡기 감염 및 클로스트리듐 디피실레 대장염(Clostridium difficile colitis)을 가졌다.

대부분의 감염은 박테리아(CD24Fc를 받은 9명[50.0%]의 환자 및 위약을 받은 2명[33.3%]의 환자) 또는 바이러스(CD24Fc를 받은 7명[38.9%]의 환자 및 위약을 받은 1명[16.7%]의 환자)이었다. 대부분의 감염은 혈액(CD24Fc를 받은 8명[44.4%]의 환자 및 위약을 받은 1명[16.7%]의 환자), 소변(CD24Fc를 받은 4명[22.2%]의 환자 및 위약을 받은 환자 없음), 또는 대변(CD24Fc를 받은 2명[11.1%]의 환자 및 위약을 받은 2명[33.3%]의 환자)에서 발생했다. 혈액 배양물로부터 회수된 대부분의 박테리아는 통상적인 피부 서식체(skin inhabitants) 및 낮은 독성 병원체(즉, 응고효소 음성 포도상구균(coagulase negative staphylococci))였다.

[표 19] 100일째까지 감염의 발생률-mITT 집단의 요약

표 20에 나타낸 바와 같이, CMV 재활성화의 고위험을 갖는 CD24Fc 그룹에서 9명의 환자가 있었다(HCT 전 도너/수용자 CMV 상태: D+/R+, 5; D-/R+, 3; 미지(unknown)의 D/R+, 1). D+/R-를 갖는 CD24Fc 그룹에서 1명의 환자는 CMV 재활성화에 대해 중간 위험성을 가졌다. CD24Fc 그룹에서 8명의 환자는 D-/R-의 상태를 가졌으며, 이는 낮은 위험으로 간주 되었다. 2명의 D-/R+ 환자들은 42일째 및 48일째에 CMV 재활성화를 가졌으며, 이는 고위험 그룹에서 100일째에 CMV 재활성화의 22.2% 누적 발생률을 나타낸다. 두 환자는 CMV 재활성화의 검출 전에 전신 스테로이드 치료를 가졌다. 비교로서, 위약 그룹의 2명의 환자는 CMV 재활성화의 고위험을 가졌다(D+/R+,1; D-/R+, 1). 위약 그룹의 1명의 환자는 급성 GVHD에 대한 전신 스테로이드 치료 전 47일째에 CMV 재활성화를 가졌다(고위험 그룹에서 50.0%).

HCT 환자에서 CMV 감염률은 이식 전에 도너 및 수용자 CMV 상태에 의해 계층화된다. D=도너, R=수용자, +는 양성이고, -는 음성이며, U는 미지(unknown)이다.

전체적으로, CD24Fc는 상 IIa 연구에서 잘 용인되었다. 주입 관련 독성은 존재하지 않았다. 인슐린으로 관리되는 480mg 그룹의 고혈당증에서 CD24Fc에 노출된 환자에서 하나의 가능한 약물 관련 TEAE≥등급 III 있었다. 위약 그룹에서 1회 용량-제한 독성(one dose-limiting toxicity)(DLT)이 관찰되었고, CD24Fc 그룹에서 어떠한 DLTs도 관찰되지 않았다. 180일 이내에(CD24Fc의 마지막 용량 후 적어도 150일 후에) CD24Fc를 투여한 환자에게서 사망으로 이어지는 부작용은 없었다. 위약 그룹에서 48일째에 피험자의 사망을 유도하는 1건의 폐렴의 부작용이 있었다. CD24Fc 그룹에서 1명의 환자는 HCT 7개월 후에 사망했지만, 사망은 연구 약물과 관련이 없는 것으로 확인되었다. 항-약물 항체(Anti-drug antibodies)(ADA)는 HCT 후 100일까지 임의의 시점에서 24명의 환자 중 어느 환자에서도 검출되지 않았다.

가장 흔한 TEAEs≥등급 III(>10%)은 혈소판 수의 감소(83.3% 위약 및 94.4% CD24Fc), WBC 수의 감소(66.7% 위약 및 88.9% CD24Fc), 호중구 수의 감소(50% 위약 및 83.3% CD24Fc), 림프구 수의 감소(50% 위약 및 77.8% CD24Fc), 빈혈(50% 위약 및 66.7%), 구내염(83.3% 위약 및 50% CD24Fc), 및 메스꺼움(0% 위약 및 11.1% CD24Fc)을 포함하였다. 이들 SAEs은 HCT에서 사용되는 골수 소멸성 컨디셔닝 요법의 공지된 안전 프로파일과 일치한다.

HCT에 대한 골수 소멸성 컨디셔닝은 종종 기관 장애를 포함하는 심각한 요법 관련 독성과 관련된다. 기관 장애는 조기 개시 이식 관련 사망률(TRM) 또는 비-재발 사망률(non-relapse mortality)(NRM)의 가장 빈번한 원인이다. 18명의 환자의 CD24Fc 그룹에서, 환자들 중 어느 환자도 HCT 후 처음 100일 이내에 사망하지 않은 반면, 위약 그룹에서 6명 중 1명은 호흡 장애로 인해 48일째에 사망했다.

약물 동역학적 결과

도 22-23은 상 2a 시험으로부터의 3개의 에스컬레이션 코호트로부터 PK 데이터를 나타낸다. 240 및 480mg 단일 용량 코호트(도 22)로부터의 반감기는 약 14일쯤이었고, 이는 건강한 피험자에서 보여지는 데이터와 일치한다. 480mg에서, cmx가 더 높지만, 14일, 피크 GVHD 발생률 및 이식 시간, 후 노출시 실제 증가가 없었다. 최종 다중-용량 코호트에서 예상한 바와 같이 60일째까지 노출이 증가하였다(도 23), 이는 환자가 가장 GVHD를 발생할 수 있는 기간이다.

표 20은 단일 용량 코호트에서 PK 집단에 대한 CD24Fc의 혈장 PK 매개변수를 요약한다. 240 및 480mg CD24Fc 단일 용량 코호트에 대해, 각각 기하 평균 C_{max ,-1d} 값은 52,145.41 및 84,155.08ng/mL이고, 기하학적 평균 AUC_{0 -last,-1d} 값은 10,156,549.9 및 15,522,686.2ng h/mL이고, 기하학적 평균 AUC_{0 -42d} 값은 9,275,562.3 및 13,903,718.4ng h/mL이고, 기하학적 평균 AUC_{0 - inf} 값은 10,383,503.9 및 15,716,616.4ng h/mL이었다. 중앙값 t_{max ,-1d}는 240 및 480mg CD24Fc 단일 용량 코호트 둘 다에 대해 2.10h였다. 240 및 480mg CD24Fc 단일 용량 코호트에 대해, 각각 T_1/2의 평균값은 414.739 및 406.648h이었고, λ_z의 평균값은 0.0018 및 0.0017h-1이었다. 240 및 480mg CD24Fc 단일 용량 코호트에 대해, 각각 평균 V_z 값은 13.83 및 18.18L이었고, 평균 CL 값은 0.024 및 0.031 L/h이었다.

[표 20] CD24Fc-PK 집단-단일 용량 코호트의 혈장 약물 동역학 매개변수의 요약

표 21은 -1일, 28일 및 -1일 내지 100일째에 다중 용량 코호트에서 PK 집단에 대한 CD24Fc의 혈장 PK 매개변수를 요약한다. 960mg CD24Fc 다중 용량 코호트에 대해 기하학적 평균 C_{max ,-1d} 및 C_max,28d 값은 각각 96,942.71ng/mL 및 62,563.05ng/mL이었다. 960mg CD24Fc 다중 용량 코호트에 대해 기하 평균 AUC_{0 -last,-1d}, AUC_{0 -14d}, AUC_0-100d, 및 AUC_{0 -last}, 전체 값은 각각 12,317,971.2ng h/mL, 9,688,933.9ng h/mL, 37,736,555.1ng h/mL, 및 37,363,953.5ng h/mL이었다. 960mg CD24Fc 다중 용량 코호트에 대해 중앙값 t_max,-1d 및 t_max,28d은 각각 2.13h and 2.52h이었다.

[표 21] CD24Fc-PK 집단-다중 용량 코호트- -1일, 28일 및 -1일 내지 100일째의 혈장 약물 동역학적 매개변수의 요약

상 IIa 연구로부터의 임상적 증거는 메토트렉세이트 및 타크롤리무스와 조합하여 투여된 CD24Fc가 심각한 aGVHD(등급 III-IV)의 가능성 및 백혈병 재발의 가능성을 감소시킴으로써 골수 소멸성 동종(allo)-HCT를 받는 백혈병 환자에서 결과를 크게 개선 시킨다는 것을 강하게 시사한다. 전술한 바와 같이, 등급 III-IV aGVHD의 누적 발생률은 위약 코호트(식염수+메토트렉세이트 및 타크롤리무스)에서 16.7% 및 동시성의 대조군 코호트(메토트렉세이트 및 타크롤리무스 단독)에서 24%에 비해 CD24Fc 노출 환자에서 5.6%이다. 이들 데이터는 메토트렉세이트 및 타크롤리무스와 조합하여 CD24Fc의 투여가 HCT 환자에서 등급 III-IV aGVHD의 위험을 감소시킨다는 것을 시사하고, 가장 심각한 등급의 aGVHD는 비-재발 사망률의 증가된 위험과 관련된다. 위약 팔(33.3%) 및 동시성의 대조군(23%)과 비교하여, 둘을 행하지 않은 환자와 비교하여, CD24Fc(11.1%)를 받은 환자에서 재발의 발생률에서 감소의 경향이 관찰되며, 이는 CD24Fc가 이식편의 GVT 효과에 영향을 미치지 않고, 심지어 백혈병 재발의 위험을 감소시킬 수 있음을 입증한다. 표준 GVHD 예방 요법에서 CD24Fc를 포함하는 이점은 위약(16.7%)과 비교하여 CD24Fc 노출된 환자(5.6%)에서 더 양호한 NRM, 더 우수한 1.5-년의 전체 생존(89% 대 50%, CD24Fc 대 위약 대조군), 등급 III-IV aGVHD RFS(각각 83% 대 33%, CD24Fc 대 위약 대조군)에서의 통계적으로 유의적인 개선, 심각한 점막염의 용량-의존성 감소, 및 본 연구에서 관찰된 단지 하나의 약물-관련 TEAE(등급 III)만을 갖는 양호한 안전 프로파일에 의해 추가로 지지된다.

aGVHD 및 백혈병 재발 모두의 위험을 감소시키는 예방제는 골수 소멸성 컨디셔닝 후 동종-HCT를 받는 백혈병 환자에게 신규하고 매우 유익할 것이다. 상기한 바와 같이, 본 출원에서 초기 임상 데이터는 메토트렉세이트 및 타크롤리무스와 조합하여 CD24Fc의 투여가 등급 III-IV aGVHD 예방 및 백혈병 재발의 임상적으로 유의적인 종점에 대한 기존의 예방 요법에 비해 상당한 개선을 제공한다는 것을 강하게 시사하고, 따라서 돌파구 지정(Breakthrough Designation)을 위해 적합해야 한다. 임상 연구의 상 IIa 부분에서 관찰된 CD24Fc의 효과는, 골수 소멸성 컨디셔닝 후 모든-HCT를 받는 백혈병 환자에서 등급 III-IV aGVHD 및 백혈병 재발을 감소시키는데 있어서 예방적 CD24Fc 투여의 효능을 확인하기 위해 고안된, 상 IIb 부분에서 추가로 조사될 것이다.

실시예 6

CD24는 HCT를 경험하는 피험자에서 점막염을 감소시키는데 사용될 수 있다

HCT를 위한 골수 소멸성 컨디셔닝은 종종 등급 3-4 점막염을 포함하는 심각한 요법 관련 독성과 관련된다. 심각한 구강 점막염은 그들이 경험한 가장 고통받는 증상으로서 HCT 환자에 의해 보고되었다. 실시예 5에 기재된 상 IIa GVHD 예방 시험에서의 피험자에서 점막염에 대한 CD24Fc 치료의 효과의 측정으로서, 본 발명자들은 결과를 연구하기 위해 조합된 점막염 스코어링 시스템(combined mucositis scoring system)을 생성하였다. 이 데이터는 도 24A에 도시되어 있고 환자가 심각한(등급 3 또는 4) 점막염을 가지고 지낸 일수의 배수를 포함한다. 이 스코어는 괄호 안에 점막염을 갖는 pts의 수와 함께 바(bar)로 제공된다. 경구 점막염을 CTCAE 4.01에 따라 스코어링 하였다. 도 24B에 나타낸 바와 같이, 점막염 등급-일 스코어에서 용량-의존성 감소는 위약(R=-0.9983; P=0)과 비교하여 모든 CD24Fc 코호트에 걸쳐 관찰되었고, 통계적으로 유의적인 감소가 다중-용량 코호트(위약 대 960mg 다중-용량: P=0.035, 스튜던트 t-검사)에서 관찰되었다.

SEQUENCE LISTING <110> OncoImmune, Inc. Liu, Yang Zheng, Pan Devenport, Martin <120> METHODS OF USE OF CD24 FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF GRAFT VERSUS HOST DISEASE AND MUCOSITIS <130> 060275.0403.01PC00 <150> 62/680,218 <151> 2018-06-04 <150> 62/739,742 <151> 2018-10-01 <150> 62/739,719 <151> 2018-10-01 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (31)...(31) <223> Valine or Alanine <400> 1 Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser 1 5 10 15 Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Xaa 20 25 30 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser 1 5 10 15 Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys 20 25 30 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Asn Gln Thr Ser Val Ala Pro Phe Pro Gly Asn Gln Asn Ile Ser Ala 1 5 10 15 Ser Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Arg Gly 20 25 <210> 4 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser 20 25 <210> 5 <211> 287 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <400> 5 Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly 20 25 30 Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro 35 40 45 Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 50 55 60 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 65 70 75 80 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 85 90 95 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 100 105 110 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 115 120 125 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 130 135 140 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 145 150 155 160 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 165 170 175 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 180 185 190 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 195 200 205 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 210 215 220 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 225 230 235 240 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 245 250 255 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 260 265 270 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 280 285 <210> 6 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <400> 6 Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser 1 5 10 15 Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Pro Lys 20 25 30 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 35 40 45 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 50 55 60 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 65 70 75 80 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Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 8 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <400> 8 Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly 20 25 30 Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro 35 40 45 Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Val Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 50 55 60 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 65 70 75 80 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 85 90 95 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 100 105 110 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 115 120 125 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 130 135 140 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 145 150 155 160 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 165 170 175 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 180 185 190 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 195 200 205 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 210 215 220 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 225 230 235 240 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 245 250 255 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 260 265 270 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 280 285 <210> 9 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <400> 9 Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly 20 25 30 Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro 35 40 45 Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Ala Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 50 55 60 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 65 70 75 80 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 85 90 95 Thr Pro Glu Val Thr 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Ser Asn Ser Pro Gln Asn Thr 1 5 10 15 Ser Thr Thr Pro Asn Pro Ala Asn Thr Thr Thr Lys Ala 20 25 <210> 11 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <400> 11 Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser 1 5 10 15 Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Val Pro 20 25 30 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 35 40 45 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 50 55 60 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 65 70 75 80 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 85 90 95 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 100 105 110 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 115 120 125 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 130 135 140 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 145 150 155 160 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 165 170 175 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 180 185 190 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 195 200 205 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 210 215 220 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 225 230 235 240 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 245 250 255 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 260 <210> 12 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <400> 12 Ser Glu Thr Thr Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser 1 5 10 15 Asn Ser Gly Leu Ala Pro Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Ala Pro 20 25 30 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 35 40 45 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 50 55 60 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 65 70 75 80 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 85 90 95 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 100 105 110 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 115 120 125 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 130 135 140 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 145 150 155 160 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 165 170 175 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 180 185 190 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 195 200 205 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 210 215 220 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 225 230 235 240 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 245 250 255 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 260

Claims (46)

1. CD24 단백질을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 이식편 대 숙주 질환(Graft versus Host Disease)(GVHD)을 치료 또는 예방하는 방법.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 방법은 등급 III-IV 급성 GVHD의 피험자의 위험을 감소시키는, 방법.
3. CD24 단백질을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 점막염을 치료 또는 예방하는 방법.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 피험자는 종양을 갖는, 방법.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 종양은 급성 골수성 백혈병(Acute Myeloid Leukemia)(AML), 급성 림프아구성 백혈병(Acute Lymphoblastic Leukemia)(ALL), 만성 골수성 백혈병(Chronic Myelogenous Leukemia)(CML), 골수이형성 증후군(Myelodysplastic syndrome)(MDS), 또는 만성 골수단핵구성 백혈병(Chronic Myelomonocytic Leukemia)(CMML)인, 방법.
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 CD24 단백질은 240mg 또는 480mg의 용량으로 투여되는, 방법.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 피험자는 조혈 줄기세포 이식(hematopoietic stem cell transplantation)(HCT)을 받았거나 받게 되는, 방법.
8. 제 7항에 있어서,
   상기 CD24 단백질은 HCT 전 또는 후에 투여되는, 방법.
9. 제 8항에 있어서,
   상기 CD24 단백질은 HCT 전 1일째에 투여되는, 방법.
10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 1회 이상 투여되는, 방법.
11. 제 10항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 HCT 전 1일째에 용량, HCT 후 14일째에 용량, 및 HCT 후 28일째에 용량을 포함하는, 3회 격주 용량으로 투여되는, 방법.
12. 제 11항에 있어서,
    상기 CD24 단백질의 상기 용량은 각각 480mg, 240mg 및 240mg인, 방법.
13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 그의 N-말단 또는 C-말단에서 포유동물 면역글로불린(Ig) 단백질의 Fc 영역에 융합된 성숙한 인간 CD24 폴리펩타이드를 포함하는, 방법.
14. 제 13항에 있어서,
    상기 성숙한 인간 CD24 폴리펩타이드는 서열 식별 번호 1 또는 2에 표시된 서열을 포함하는, 방법.
15. 제 14항에 있어서,
    상기 Ig 단백질은 인간이고, 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgA의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는, 방법.
16. 제 14항에 있어서,
    상기 Ig 단백질은 인간이고, 상기 Fc 영역은 IgM의 힌지 영역 및 CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함하는, 방법.
17. 제 15항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 서열 식별 번호 6, 11 또는 12에 표시된 서열을 포함하는, 방법.
18. 제 17항에 있어서,
    상기 CD24 단백질의 아미노산 서열은 서열 식별 번호 6, 11 또는 12에 표시된 서열로 구성되는, 방법.
19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 가용성인, 방법.
20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 글리코실화되는, 방법.
21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 진핵 발현 시스템을 사용하여 제조되는, 방법.
22. 제 21항에 있어서,
    상기 진핵 발현 시스템은 포유동물 세포에서의 벡터로부터의 발현을 포함하는, 방법.
23. 제 22항에 있어서,
    상기 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소 세포인, 방법.
24. 피험자에서 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 치료 또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 CD24 단백질의 용도.
25. 제 24항에 있어서,
    상기 용도는 등급 III-IV 급성 GVHD의 피험자의 위험을 감소시키는, 용도.
26. 피험자에서 점막염을 치료 또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 CD24 단백질의 용도.
27. 제 24항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험자는 종양을 갖는, 용도.
28. 제 27항에 있어서,
    상기 종양은 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 골수이형성 증후군(MDS), 또는 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)인, 용도.
29. 제 24항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 240mg 또는 480mg의 용량으로 투여되는, 용도.
30. 제 24항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서,
    피험자는 조혈 줄기세포 이식(HCT)을 받았거나 받게 되는, 용도.
31. 제 30항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 HCT 전 또는 후에 투여되는, 용도.
32. 제 31항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 HCT 전 1일째에 투여되는, 용도.
33. 제 31항 또는 제 32항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 1회 이상 투여되는, 용도.
34. 제 33항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 HCT 전 1일째에 용량, HCT 후 14일째에 용량, 및 HCT 후 28일째에 용량을 포함하는 3회 격주 용량으로 투여되는, 용도.
35. 제 34항에 있어서,
    상기 CD24 단백질의 상기 용량은 각각 480mg, 240mg 및 240mg인, 용도.
36. 제 24항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 그의 N-말단 또는 C-말단에서 포유동물 면역글로불린(Ig) 단백질의 Fc 영역에 융합된 성숙한 인간 CD24 폴리펩타이드를 포함하는, 용도.
37. 제 36항에 있어서,
    상기 성숙한 인간 CD24 폴리펩타이드는 서열 식별 번호 1 또는 2에 표시된 서열을 포함하는, 용도.
38. 제 37항에 있어서,
    상기 Ig 단백질은 인간이고, 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgA의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는, 용도.
39. 제 37항에 있어서,
    상기 Ig 단백질은 인간이고, 상기 Fc 영역은 IgM의 힌지 영역 및 CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함하는, 용도.
40. 제 38항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 서열 식별 번호 6, 11 또는 12에 표시된 서열을 포함하는, 용도.
41. 제 40항에 있어서,
    상기 CD24 단백질의 아미노산 서열은 서열 식별 번호 6, 11 또는 12에 표시된 서열로 구성되는, 용도.
42. 제 24항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 가용성인, 용도.
43. 제 24항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 글리코실화되는, 용도.
44. 제 24항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD24 단백질은 진핵 발현 시스템을 사용하여 제조되는, 용도.
45. 제 44항에 있어서,
    상기 진핵 발현 시스템은 포유동물 세포에서의 벡터로부터의 발현을 포함하는, 용도.
46. 제 45항에 있어서,
    상기 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소 세포인, 용도.

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