JP2021527066A - 白血病再発を予防及び治療するためのcd24の使用方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、対象におけるがんの再発を予防又は治療するためのCD24タンパク質の使用に関する。本発明は、がん幹細胞活性を低下させるためのCD24タンパク質の使用にも関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本発明は、白血病再発を予防及び治療するための組成物及び方法に関する。
移植片対宿主病(GVHD)は、組織移植片における免疫担当細胞が宿主への免疫攻撃を開始する際に発現する生命を脅かす合併症である。GVHDは、血液悪性疾患の治療のための造血細胞移植(HCT)に最も多く関連する。活性化ドナーT細胞は、前処置療法から開始する炎症カスケードの後で宿主上皮細胞に損傷を与える。正確なリスクは、幹細胞源、患者の年齢、前処置及び用いられるGVHD予防法に依存する。発現率は、ヒト白血球抗原(HLA)の不同性の程度に直接関連する。急性GVHDの発症の中央値は、典型的には、移植の21〜25日後である。発現率は、完全に組織適合性の血縁ドナー移植のレシピエントにおける30〜65%から、不適合造血細胞又は非血縁ドナーに由来する造血細胞のレシピエントにおける60%〜80%までの範囲に及ぶ。臍帯血移植は、急性GVHDのより低い発現率及びより遅い発症を伴う、より遅い好中球回復を伴ってきた。発現率を増加させる因子としては、造血細胞の源として骨髄ではなく末梢血を用いることや、レシピエントの年齢がより高いことが挙げられる。慢性GVHDの診断の時間の中央値は、HLA一致同胞移植の4.5ヵ月後、及び非血縁ドナー移植の4ヵ月後である。新規の慢性GVHDは、同種HCTの2年後にはほとんど発現しない。
20年にわたって、カルシニューリン阻害剤(例えばシクロスポリン及びタクロリムス)とメトトレキセートとの併用が、依然としてGVHDの予防のための標準治療であった。免疫予防の日常投与にもかかわらず、臨床的に重要なGVHD(グレードII〜IV)が、HLA適合血縁HCTを受けている患者の約30〜65%、及び非血縁ドナーHCTを受けている患者の60〜80%において発現する。急性GVHDは、HCTの後の初期事象であり、その発症までの時間の中央値は約25〜30日である。非常に重度のGVHDの患者において、死亡率は90%を超える。このことについての1つの説明は、一旦確立された場合、高用量のコルチコステロイドによる最先端の治療に対して無効な応答が患者の50%超に生じるということである。ステロイド不応性を示す患者、又は長期にわたる治療を必要とする患者について、生存期間は有意に減少する。成功した場合であっても、高用量のコルチコステロイドは、感染症の増加、及びTRMに対する患者のリスクを著しいものにする体調不良による罹患率の主要な原因となる。
高用量化学療法及び/又は全身照射(TBI)を含むHCT前処置レジメンによって引き起こされる宿主組織傷害は、急性GVHDの発症における最初の段階であると考えられる。前処置レジメンによって引き起こされる宿主組織傷害は、炎症誘発性サイトカイン(例えば、TNF−α、IL−1β及びIL−6)の放出を招き、損傷関連分子パターン(DAMP)や病原体関連分子パターン(PAMP)の放出も招く。DAMP及びPAMPの両方は、パターン認識受容体(PRR)に結合することによって樹状細胞(DC)などの抗原提示細胞(APC)を活性化させることができる。続いて、宿主APCは、ドナーT細胞を活性化させ、炎症誘発性サイトカインの放出と宿主組織を標的とする抗原特異的アロ反応性T細胞の膨張とを引き起こす免疫性カスケードを活性化させて、GVHDを発症させる。ゆえに、組織傷害に対する宿主応答を標的とし、GVHDの開始の主要プロセスであるAPCの活性化を阻止することによってGVHDを弱めることができるのかどうかを探究することには、大きな関心がある。
現在まで、GVHDの治療及び予防は、主に、組織傷害を媒介するアロ反応性T細胞の増殖を抑制するためのインビボ又はエクスビボにおけるアプローチによるT細胞の薬理学的な阻害又は欠失のいずれかに重点が置かれてきた。非選択的T細胞欠失戦略(例えば、抗胸腺細胞グロブリン)はGVHDを予防する際に有効であるが、それらは、再発、感染及び移植片拒絶のリスクを相殺するため、生存期間を向上させない。反対に、単一炎症誘発性サイトカインを標的とすることによる、より選択的な阻害は、GVHDの治療において臨床的有益性を示さなかった。その結果、T細胞を欠失させる抗体のほかに、GVHDのための生物製剤は承認されず、タクロリムスとメトトレキセートとの併用が、依然としてGVHDの予防のための標準治療であった。医療上の要求が著しく満たされていないことによって、GVHD及び白血病再発の予防及び治療のための、より選択的な生物学的製剤が必要とされている。
がんの再発の予防又は治療を必要とする対象におけるがんの再発を予防又は治療する方法が本明細書において提供され、上記方法は、上記対象にCD24タンパク質を投与することを含んでもよい。さらに、対象におけるがんの再発を予防又は治療するための薬物の製造におけるCD24タンパク質の使用が、本明細書において提供される。がん幹細胞活性の低下を必要とする対象におけるがん幹細胞活性を低下させる方法も本明細書において提供され、上記方法は、上記対象にCD24タンパク質を投与することを含んでもよい。さらに、対象におけるがん幹細胞活性を低下させるための薬物の製造におけるCD24タンパク質の使用が、本明細書において提供される。がん幹細胞活性を低下させることによって、上記対象のがんの再発及び転移のうちの少なくとも1つが予防又は治療されてもよい。
がん幹細胞は、白血病がん幹細胞であってもよい。対象は、造血幹細胞移植(HCT)をこれから受けてもよいか、又は造血幹細胞移植(HCT)を既に受けていてもよい。対象は、がんに罹患していてもよい。がん又はがん幹細胞は、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、骨髄異形成症候群(MDS)又は慢性骨髄単球性白血病(CMML)であってもよい。
CD24タンパク質は、240mg又は480mgの用量で投与されてもよい。CD24タンパク質は、HCTの前又は後に投与されてもよく、HCTの1日前に投与されてもよい。CD24タンパク質は、2回以上投与されてもよく、隔週の用量で投与されてもよい。この用量は、HCTの前日分の量、HTCの後の14日目分の量、及びHCTの後の28日目分の量を含んでもよく、これらの量は、それぞれ、480mg、240mg及び240mgであってもよい。
CD24タンパク質は、N末端又はC末端が哺乳類イムノグロブリン(Ig)タンパク質のFc領域と融合している成熟ヒトCD24ポリペプチドを含んでもよい。成熟ヒトCD24ポリペプチドは、配列番号1又は配列番号2で示される配列を含んでもよい。Igタンパク質はヒトあってもよい。Fc領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4又はIgAのヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含んでもよい。Fc領域は、IgMのヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメインを含んでもよい。CD24タンパク質は、配列番号6、配列番号11又は配列番号12に示される配列を含んでもよい。CD24タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号6、配列番号11又は配列番号12に示される配列からなってもよい。CD24タンパク質は可溶性であってもよく、グリコシル化されていてもよい。CD24タンパク質は、哺乳類細胞におけるベクターからの発現を含んでもよい真核生物発現系を用いて調製されてもよい。細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞であってもよい。
組織損傷は、炎症誘発性サイトカイン(例えば、TNF−α、IL−1β及びIL−6)の放出を招く場合があり、損傷関連分子パターン(DAMP)及び病原体関連分子パターン(PAMP)の放出も招く場合がある。DAMP及びPAMPの両方とも、パターン認識受容体(PRR)への結合によって樹状細胞(DC)などの抗原提示細胞(APC)を活性化し得る。続いて宿主APCは、ドナーT細胞、並びに、炎症誘発性サイトカインの放出と宿主組織を標的とする抗原特異的アロ反応性T細胞の膨張とを生じさせる免疫性カスケードを活性化させる。これらの事象により、GVHDが発症し、粘膜炎の影響を悪化させる。例えば、RIOMは、放射線療法後の口腔粘膜、舌及び咽頭の急性炎症として始まり、これにより各種炎症細胞の補充と、炎症性サイトカイン、走化性メディエータ及び増殖因子の放出とが同時に生じる。
粘膜炎及びGVHDにおける組織損傷の関与によって、GVHD治療のためにCD24FcによるDAMPに対する宿主応答の負の調節を探究することが可能であるという見通しが浮上した。本発明者の前臨床試験によって、CD24FcがDAMP媒介炎症を特異的に標的とし、ヒト化マウスモデルを含むマウスモデルにおけるGVHDを予防することが示された。重要なことに、上記薬物は、全身的免疫抑制を引き起こさず、高用量のCD24Fcの使用が非ヒト霊長類における抗体応答を阻止しないので、従来の免疫抑制剤を超える利点がある。データは、CD24FcがGVHDを予防するが、それを白血病患者におけるGVHDの予防のための理想的薬物とする移植片対白血病(GVL)に対する効果を保つことも示す。最終的に、非ヒト霊長類における本発明者の試験は、CD24Fcが抗原特異性免疫応答を抑制しないことを示し、そのことは、CD24Fcが感染のリスクを増加させる可能性がないことを示唆する。
本発明者らは、可溶形態のCD24が移植片対宿主病(GVHD)及び関連する状態(粘膜炎など)を予防し、HCTの後の白血病再発を予防するために非常に有効であることを発見した。本発明者らは、CD24Fcによって、HCT治療を受けている患者における重度の粘膜炎(グレード3以上)の用量依存的な低減が生じたということも発見した。これらの効果は、DAMPによって媒介される可能性がある。パターン認識は、PAMP及びDAMPの両方によって誘発される炎症応答に関与する。本発明者らは、最近の試験によってDAMPに対する宿主応答の悪化が炎症性疾患及び自己免疫性疾患の病原性における役割を果たす可能性があることが示されたことを実現した。DAMPは、動物モデルにおいて炎症性サイトカイン及び自己免疫性疾患を生じさせることを促進することが分かり、HMGB1及びHSP90などのDAMPの阻害剤は、結果的に、関節リウマチ(RA)を寛解させることが分かった。TLR、RAGE−R、DNGR(Clec9Aによってコードされる)及びMincleは、様々なDAMPによって開始される炎症の媒介の原因となる受容体であることが示された。
本発明者らの最近の仕事によって、CD24−Siglec G相互作用がDAMPに対する先天性免疫をPAMPから識別することが示された。Siglecタンパク質は、様々なシアル酸含有構造を認識する膜関連イムノグロブリン(Ig)スーパーファミリーメンバーである。ほとんどのSiglecは、炎症応答の主要な調節因子を制御するためにSHP−1、SHP−2及びCbl−bと関連する細胞内免疫チロシン阻害モチーフ(ITIM)を有する。本発明者らは、Siglec(マウスにおけるSiglec G及びヒトにおけるSiglec10)に対する第1の天然リガンドとしてCD24を報告した。Siglec Gは、シアル酸付加CD24と相互作用して、SHP−1/2シグナル伝達機序を介してHMGB1などのDAMPに対するTLR媒介宿主応答を抑制する。
ヒトCD24は、CD24遺伝子内の240塩基対のオープンリーディングフレームによってコードされるGPIアンカー型小分子である。80個アミノ酸の中で、最初の26個はシグナルペプチドを構成するが、最後の23個は、GPI尾部の付着を可能にする切断のためのシグナルの役割を果たす。その結果、成熟ヒトCD24分子は、31個のアミノ酸だけを有する。この31個のアミノ酸のうちの1つは、ヒト集団の中において多形である。オープンリーディングフレームのヌクレオチド170におけるC→Tトランジションによって、成熟タンパク質の残基31においてアラニン(A)がバリン(V)に置換される。この残基が切断部位に隣接してN末端であり、且つ置換が非保存的であるので、これらの2つの対立遺伝子は、細胞表面上に異なる効率性で発現され得る。実際、cDNAによるトランスフェクション試験によって、CD24v対立遺伝子が、細胞表面上に、より効率的に発現されることが示された。これに合わせて、CD24v/vPBLは、とりわけT細胞上に、より高いレベルのCD24を発現した。
本発明者らは、CD24が組織損傷又は器官損傷の結果として放出される細胞DAMPに対する宿主応答を負に調節し、少なくとも2つの重複機序がこの活性を説明することができることを示した。第1に、CD24は、HSP70、HSP90、HMGB1及びヌクレオリンを含むいくつかのDAMPに結合し、これらのDAMPへの宿主応答を抑止する。これを行うために、CD24が炎症性刺激を阻止して、それらの受容体、TLR又はRAGEとの相互作用を防止し得ると推定される。第2に、本発明者らは、肝壊死のアセトアミノフェン誘導マウスモデルを用いて、炎症を確認して、その受容体(Siglec G)との相互作用によって、CD24が、組織傷害に対する宿主応答のための強力な負の調節を提供することを示した。この活性を達成するために、CD24は結合し、Siglec Gによるシグナル伝達を刺激することが可能であり、Siglec G関連SHP1が負の調節を誘発する。いずれかの遺伝子の標的化突然変異を有するマウスが非常により強い炎症応答を開始した場合、両機序が協力して作用する可能性がある。実際、CD24−/−マウス又はSiglec G−/−マウスのいずれかに由来する骨髄から培養されたDCは、いずれのHMGB1、HSP70又はHSP90のいずれかで刺激された際により高いレベルの炎症性サイトカインを産生した。本発明者の知る限り、CD24は、DAMPによって誘発される炎症を阻止し得る唯一の阻害性DAMP受容体であり、組織傷害に対する宿主炎症応答を特異的に標的とする薬物は現在利用可能ではない。さらに、本発明者らは、RA、MS及びGvHDのマウスモデルを用いて、外因性可溶性CD24タンパク質がDAMP媒介自己免疫性疾患を緩和する能力を有することを示した。
1.定義
本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためにあり、限定することを意図するものではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲に用いられる場合、「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「上記/前記(the)」という単数形は、文脈が明確に規定しない限り、複数の指示物を含む。
本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためにあり、限定することを意図するものではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲に用いられる場合、「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「上記/前記(the)」という単数形は、文脈が明確に規定しない限り、複数の指示物を含む。
本明細書における数値範囲の説明について、同一の精度でその間にある数は、明示的に考慮される。例えば、6〜9の範囲については、6及び9に加えて7及び8の数が考慮され、6.0〜7.0の範囲については、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9及び7.0の数が明示的に考慮される。
「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結配列であり、天然物、合成物又は天然物若しくは合成物の修飾物若しくは組み合わせであってもよい。
「実質的に同一」とは、1つ目と2つ目のアミノ酸配列が、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、220個、230個、240個、250個、260個、270個、280個、290個又は300個のアミノ酸の領域にわたって、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上又は99%以上であることを意味することができる。
「治療」又は「治療すること」は、疾患からの動物の保護を指す場合、上記疾患を予防すること、抑制すること、抑止すること、又は完全に排除することを意味する。疾患を予防することは、疾患の発症前に動物に本発明の組成物を投与することを含む。疾患を抑制することは、疾患の誘発後で、その臨床的所見の前に、動物に本発明の組成物を投与することを含む。疾患を抑止することは、疾患の臨床的所見の後に動物に本発明の組成物を投与することを含む。
「変異体」とは、アミノ酸の挿入、欠失又は保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも1つの生物学的活性を保持するペプチド又はポリペプチドを意味し得る。「生物学的活性」の代表的例としては、トール様受容体に結合する能力や、特異的抗体によって結合される能力が挙げられる。変異体は、少なくとも1つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照されたタンパク質に実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味してもよい。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を同様の特性(例えば、荷電領域の親水性、程度及び分布)の異なるアミノ酸に置き換えることは、本技術分野において、典型的には小さな変更を含むものと認識される。これらの小さな変更は、本技術分野において理解されるように、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって、部分的に同定され得る。Kyte et al.,J.Mol.Biol.157:105−132(1982)。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性及び電荷の考慮に基づく。同様の疎水性親水性指標のアミノ酸が置換され得、依然としてタンパク質機能を保持することが本技術分野において知られている。一態様において、疎水性親水性指標が±2であるアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換を明らかにするために用いられてもよい。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性を考慮することによって、抗原性及び免疫原性とよく相関することが報告されている有用な測度である、そのペプチドの最大局所平均親水性の算出が可能になる。参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第4,554,101号。同様の親水性値を有するアミノ酸の置換によって、本技術分野において理解されるように、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドが生じる可能性がある。置換は、親水性値が互いに±2以内であるアミノ酸で行われてもよい。アミノ酸の疎水性(hyrophobicity)指標及び親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。その観察に合わせて、生物学的機能に適合性があるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさ及び他の性質によって示されるように、上記アミノ酸及び特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存すると理解される。
2.CD24
本明細書において、CD24タンパク質が提供され、このCD24タンパク質には成熟CD24又はその変異体が含まれ得る。成熟CD24は、CD24の細胞外ドメイン(ECD)に相当する。成熟CD24は、ヒト又は他の哺乳動物に由来してもよい。上記のように、成熟ヒトCD24タンパク質は、31アミノ酸長であり、そのC末端において変異型アラニン(A)残基又は変異型バリン(V)残基を有する。成熟CD24タンパク質は、以下の配列を含んでもよい。
本明細書において、CD24タンパク質が提供され、このCD24タンパク質には成熟CD24又はその変異体が含まれ得る。成熟CD24は、CD24の細胞外ドメイン(ECD)に相当する。成熟CD24は、ヒト又は他の哺乳動物に由来してもよい。上記のように、成熟ヒトCD24タンパク質は、31アミノ酸長であり、そのC末端において変異型アラニン(A)残基又は変異型バリン(V)残基を有する。成熟CD24タンパク質は、以下の配列を含んでもよい。
SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(V/A)(配列番号1)
C末端バリン又はC末端アラニンは免疫原性であってもよく、その免疫原性を低下させる可能性があるCD24タンパク質から除かれてもよい。ゆえに、CD24タンパク質は、C末端アミノ酸を欠いている成熟ヒトCD24のアミノ酸配列を含んでもよい:
SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(配列番号2)
マウス及びヒトに由来する成熟CD24タンパク質のアミノ酸配列におけるかなりの配列変異にもかかわらず、ヒトCD24Fcがマウスにおいて活性であることが示された場合、それらは機能的に同等である。ヒトCD24 ECDのアミノ酸配列は、マウスタンパク質(39%同一性;Genbank受入番号NP_033976)との多少の配列保存を示す。しかし、CD24 ECDが種に応じて長さが27〜31個のアミノ酸だけであり、且つSiglec10/Gなどのその(1又は複数の)受容体の一部への結合が、そのシアル酸及び/又は糖タンパク質のガラクトース糖によって媒介される場合、パーセント同一性がより高くないことは驚くことではない。ヒトSiglec−10(GenBank受入番号AF310233)の細胞外ドメイン及びそのマウス相同体Siglec−G(GenBank受入番号NP_766488)受容体タンパク質の間のアミノ酸配列同一性は63%である(図2)。主にC末端に存在し、グリコシル化部位が豊富に存在するマウスCD24とヒトCD24との間の配列保存の結果として、成熟CD24タンパク質の著しい変異は、とりわけそれらの変異がC末端における保存残基に影響を及ぼさない場合、又はマウスCD24若しくはヒトCD24のいずれかに由来するグリコシル化部位に影響を及ぼさない場合、CD24タンパク質の使用において許容され得る。ゆえに、CD24タンパク質は、以下の成熟マウスCD24のアミノ酸配列を含んでもよい。
NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATTRG(配列番号3)。
ヒトCD24 ECDのアミノ酸配列は、マウスよりもカニクイザルタンパク質(52%同一性;UniProt受入番号UniProtKB―I7GKK1)との間で多くの配列保存を示す。また、ECDが、これらの種において長さが29〜31個のアミノ酸だけであり、その(1又は複数の)受容体への結合における糖残基の役割である場合、パーセント同一性がより高くないことを考慮すると、このことは驚くことではない。カニクイザル(cynomolgous)Siglec−10受容体のアミノ酸配列は決定されなかったが、ヒト及びアカゲザルのSiglec−10(GenBank受入番号XP_001116352)タンパク質の間のアミノ酸配列同一性は89%である。ゆえに、CD24タンパク質は、以下の成熟カニクイザル(又はアカゲザル)サルCD24のアミノ酸配列を含んでもよい。
TVTTSAPLSSNSPQNTSTTPNPANTTTKA(配列番号10)
CD24タンパク質は可溶性であってもよい。CD24タンパク質は、上記タンパク質を発現する細胞からの当該タンパク質の分泌を可能にすることができるN末端シグナルペプチドをさらに含んでもよい。シグナルペプチド配列は、アミノ酸配列MGRAMVARLGLGLLLLALLLPTQIYS(配列番号4)を含んでもよい。別の場合、上記シグナル配列は、他の膜貫通タンパク質若しくは分泌タンパク質上で見出されるもの、又は本技術分野で知られている、既存のシグナルペプチドから修飾されたもののうちのいずれかを含んでもよい。
a.融合
CD24タンパク質は、そのN末端又はC末端において、ヒト若しくはマウスであってもよいか又は他の種に由来してもよい哺乳類Igタンパク質の一部を含んでもよいタンパク質標識に融合されてもよい。上記一部は、Igタンパク質のFc領域を含んでもよい。Fc領域は、Igタンパク質のヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメインの少なくとも1つを含んでもよい。Igタンパク質は、ヒトのIgG1、IgG2、IgG3、IgG4又はIgAであってもよく、Fc領域は、Igのヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含んでもよい。Fc領域は、ヒト免疫グロブリンG1(IgG1)アイソタイプ配列番号7を含んでもよい。Igタンパク質はIgMであってもよく、Fc領域は、IgMのヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメインを含んでもよい。タンパク質標識は、タンパク質の精製を促進する親和性標識、並びに/又は機能タンパク質の溶融度及び回収率を増強する溶融度強化標識であってもよい。タンパク質標識は、CD24タンパク質の原子価を増加させてもよい。タンパク質標識は、GST、His、FLAG、Myc、MBP、NusA、チオレドキシン(TRX)、低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)、ユビキチン(Ub)、アルブミン又はラクダ科動物Igを含んでもよい。融合タンパク質を作製し、融合タンパク質を精製する方法は、本技術分野においてよく知られている。
CD24タンパク質は、そのN末端又はC末端において、ヒト若しくはマウスであってもよいか又は他の種に由来してもよい哺乳類Igタンパク質の一部を含んでもよいタンパク質標識に融合されてもよい。上記一部は、Igタンパク質のFc領域を含んでもよい。Fc領域は、Igタンパク質のヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメインの少なくとも1つを含んでもよい。Igタンパク質は、ヒトのIgG1、IgG2、IgG3、IgG4又はIgAであってもよく、Fc領域は、Igのヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含んでもよい。Fc領域は、ヒト免疫グロブリンG1(IgG1)アイソタイプ配列番号7を含んでもよい。Igタンパク質はIgMであってもよく、Fc領域は、IgMのヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメインを含んでもよい。タンパク質標識は、タンパク質の精製を促進する親和性標識、並びに/又は機能タンパク質の溶融度及び回収率を増強する溶融度強化標識であってもよい。タンパク質標識は、CD24タンパク質の原子価を増加させてもよい。タンパク質標識は、GST、His、FLAG、Myc、MBP、NusA、チオレドキシン(TRX)、低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)、ユビキチン(Ub)、アルブミン又はラクダ科動物Igを含んでもよい。融合タンパク質を作製し、融合タンパク質を精製する方法は、本技術分野においてよく知られている。
前臨床研究に基づいて、上記の例において同定された融合タンパク質CD24Fcの構築のために、GPIシグナル切断部位(すなわち、配列番号2を有する成熟CD24タンパク質)の前に最後の多形性アミノ酸を欠いている30個のアミノ酸の切断型の天然CD24分子を用いた。成熟ヒトCD24配列は、ヒトIgG1 Fcドメイン(配列番号7)に融合される。全長CD24Fc融合タンパク質の配列は、配列番号5(図1A)において提供され、上記細胞から分泌されたCD24Fc融合タンパク質の処理バージョンの配列(すなわち、切断されたシグナル配列を欠く)は、配列番号6において提供される。IgG1 Fcに融合された成熟CD24の処理された多形性変異体(すなわち、配列番号1を有する成熟CD24タンパク質)は、配列番号11又は配列番号12に記載されるアミノ酸配列を含んでもよい。
b.産生
CD24タンパク質は、高度にグリコシル化されてもよく、免疫細胞の同時刺激や、損傷関連分子パターン分子(DAMP)との相互作用などのCD24の機能に関与する場合がある。CD24タンパク質は、真核生物発現系を用いて調製されてもよい。上記発現系は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの哺乳類細胞におけるベクターからの発現を伴ってもよい。上記系は、真核生物細胞に感染させるために使用され得る複製欠損レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターであってもよい。CD24タンパク質は、細胞ゲノムに組み込まれたベクター又はベクターの一部からCD24タンパク質を発現する安定細胞系から産生されてもよい。安定細胞系は、組み込まれた複製欠損レトロウイルスベクターからCD24タンパク質を発現することができる。発現系は、GPEx(商標)でもあってもよい。
CD24タンパク質は、高度にグリコシル化されてもよく、免疫細胞の同時刺激や、損傷関連分子パターン分子(DAMP)との相互作用などのCD24の機能に関与する場合がある。CD24タンパク質は、真核生物発現系を用いて調製されてもよい。上記発現系は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの哺乳類細胞におけるベクターからの発現を伴ってもよい。上記系は、真核生物細胞に感染させるために使用され得る複製欠損レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターであってもよい。CD24タンパク質は、細胞ゲノムに組み込まれたベクター又はベクターの一部からCD24タンパク質を発現する安定細胞系から産生されてもよい。安定細胞系は、組み込まれた複製欠損レトロウイルスベクターからCD24タンパク質を発現することができる。発現系は、GPEx(商標)でもあってもよい。
c.医薬組成物
CD24タンパク質は、医薬的に許容し得る量のCD24タンパク質を含み得る医薬組成物に含まれてもよい。医薬組成物は、医薬的に許容し得る担体を含んでもよい。医薬組成物は、CD24タンパク質を長期間にわたって安定なままとし得る溶剤を含んでもよい。溶媒は、CD24タンパク質を−20℃(−15〜−25℃)で少なくとも66ヵ月間安定なままとし得るPBSであってもよい。溶媒は、他の薬物と併用してCD24タンパク質を収容することが可能であってもよい。
CD24タンパク質は、医薬的に許容し得る量のCD24タンパク質を含み得る医薬組成物に含まれてもよい。医薬組成物は、医薬的に許容し得る担体を含んでもよい。医薬組成物は、CD24タンパク質を長期間にわたって安定なままとし得る溶剤を含んでもよい。溶媒は、CD24タンパク質を−20℃(−15〜−25℃)で少なくとも66ヵ月間安定なままとし得るPBSであってもよい。溶媒は、他の薬物と併用してCD24タンパク質を収容することが可能であってもよい。
医薬組成物は、非経口投与(注射又は持続注入が挙げられるがこれらに限定されない)用に製剤化されてもよい。注射用製剤は、油性ビヒクル又は水性ビヒクルにおける懸濁液、溶液又はエマルジョンの形態であってもよく、製剤化剤(懸濁化剤、安定化剤及び分散剤が挙げられるがこれらに限定されるものではない)を含んでもよい。組成物は、適切なビヒクル(滅菌した発熱性物質を含まない水が挙げられるがこれらに限定されるものではない)による再構成のための粉末形態で提供されてもよい。
医薬組成物は、埋め込み(implantation)によって又は筋肉内投与によって投与され得るデポ製剤として製剤化されてもよい。組成物は、適切なポリマー材料若しくは疎水性材料と共に(例えば、許容し得る油におけるエマルジョンとして)、イオン交換樹脂と共に、又はやや難溶の誘導体として(例えば、やや難溶の塩として)製剤化されてもよい。皮下注射用の製剤は、狼蒼などの徴候並びにその関連する症状及び合併症のために特に適切であることができる。
3.治療方法
a.GVHD
移植片対宿主病(GVHD)の予防、軽減又は治療を必要とする対象における移植片対宿主病(GVHD)を予防、軽減又は治療する方法が本明細書において提供され、上記方法は、上記対象にCD24タンパク質を投与することを含む。上記対象は、GVHDであってもよいか、又はGVHDを発症するリスクがあってもよい。上記対象は、造血幹細胞移植(HCT)を受けてもよいか、又は造血幹細胞移植(HCT)を受けている最中であってもよい。HCTを受けている対象におけるGVHDを予防するために、CD24タンパク質を予防的に用いてもよい。GVHDは、急性GVHDであってもよい。CD24タンパク質は、対象のグレードIII〜IVの急性GVHDのリスクを低下させることが可能である。
a.GVHD
移植片対宿主病(GVHD)の予防、軽減又は治療を必要とする対象における移植片対宿主病(GVHD)を予防、軽減又は治療する方法が本明細書において提供され、上記方法は、上記対象にCD24タンパク質を投与することを含む。上記対象は、GVHDであってもよいか、又はGVHDを発症するリスクがあってもよい。上記対象は、造血幹細胞移植(HCT)を受けてもよいか、又は造血幹細胞移植(HCT)を受けている最中であってもよい。HCTを受けている対象におけるGVHDを予防するために、CD24タンパク質を予防的に用いてもよい。GVHDは、急性GVHDであってもよい。CD24タンパク質は、対象のグレードIII〜IVの急性GVHDのリスクを低下させることが可能である。
対象はがんを有してもよい。がんは、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、骨髄異形成症候群(MDS)又は慢性骨髄単球性白血病(CMML)であってもよい。
b.がんの再発
さらに、HCTをこれから受けるか、又はHCTを既に受けた対象におけるがんのリスクを低下させるか、又はがんの再発を予防する方法が本明細書において提供され、上記方法は、対象にCD24タンパク質を投与することを含む。がんは、本明細書に記載されている白血病であってもよい。
さらに、HCTをこれから受けるか、又はHCTを既に受けた対象におけるがんのリスクを低下させるか、又はがんの再発を予防する方法が本明細書において提供され、上記方法は、対象にCD24タンパク質を投与することを含む。がんは、本明細書に記載されている白血病であってもよい。
HCTは、同種骨髄破壊的HCTであってもよい。対象は、哺乳動物であってもよい。哺乳動物は、サル又は類人猿であってもよい。対象は、ヒトであってもよい。
c.がん幹細胞活性を低下させること
がん幹細胞活性を低下させるか、又はがん幹細胞活性を抑制する方法が本明細書において提供され、当該方法はインビボであってもよい。上記方法は、がん幹細胞にCD24タンパク質を接触させることを含んでもよい。上記方法は、本明細書において開示されている処置等を必要とする対象にCD24タンパク質を投与することを含んでもよい。がん幹細胞は、本明細書に記載されているがんに由来してもよく、特に、白血病がん幹細胞であってもよい。がん幹細胞活性の抑制又は低下は、本明細書に記載されているがんの再発の対象のリスクを低下させてもよく、再発を予防してもよい。がん幹細胞活性の抑制又は低下は、がんの転移の対象のリスクを低下させてもよく、又は転移を予防してもよい。
がん幹細胞活性を低下させるか、又はがん幹細胞活性を抑制する方法が本明細書において提供され、当該方法はインビボであってもよい。上記方法は、がん幹細胞にCD24タンパク質を接触させることを含んでもよい。上記方法は、本明細書において開示されている処置等を必要とする対象にCD24タンパク質を投与することを含んでもよい。がん幹細胞は、本明細書に記載されているがんに由来してもよく、特に、白血病がん幹細胞であってもよい。がん幹細胞活性の抑制又は低下は、本明細書に記載されているがんの再発の対象のリスクを低下させてもよく、再発を予防してもよい。がん幹細胞活性の抑制又は低下は、がんの転移の対象のリスクを低下させてもよく、又は転移を予防してもよい。
c.薬物
本明細書に記載されている使用のための薬物の製造におけるCD24タンパク質の使用も提供される。
本明細書に記載されている使用のための薬物の製造におけるCD24タンパク質の使用も提供される。
e.用量レジメン
投与されるCD24タンパク質の用量は、GVHDに対する所望の効果及び投与経路に応じて、0.01mg/kg〜1000mg/kgであってもよく、1〜500mg/kgであってもよい。CD24タンパク質は、静脈内(IV)注入によって、又は皮下注射、壁内(すなわち、腔又は器官の壁内)注射若しくは腹腔内注射によって投与されてもよい。用量は、10〜1000mg、10〜500mg、240mg又は480mgであってもよく、これは特に対象がヒトである場合に適切であり得る。
投与されるCD24タンパク質の用量は、GVHDに対する所望の効果及び投与経路に応じて、0.01mg/kg〜1000mg/kgであってもよく、1〜500mg/kgであってもよい。CD24タンパク質は、静脈内(IV)注入によって、又は皮下注射、壁内(すなわち、腔又は器官の壁内)注射若しくは腹腔内注射によって投与されてもよい。用量は、10〜1000mg、10〜500mg、240mg又は480mgであってもよく、これは特に対象がヒトである場合に適切であり得る。
CD24タンパク質は、幹細胞移植の前又は後に投与されてもよい。CD24タンパク質は、幹細胞移植の1〜4日前、特に1日前に投与されてもよい。CD24タンパク質は、幹細胞移植の前又は後に複数の投与回数で投与されてもよい。CD24タンパク質は、隔週で2回、3回、4回、5回又は6回の投与回数で投与されてもよい。CD24タンパク質の各用量は、240mg又は480mgであってもよい。初回用量は、幹細胞移植(Day0)の日に対してDay−4〜Day0に投与されてもよく、特にDay−1に投与されてもよい。次の各用量は、その後9〜19日毎又は11〜17日毎に投与されてもよい。2回目の用量は、幹細胞移植の日に対してDay+9〜Day+19又はDay+11〜Day+17、特にDay+14に投与されてもよい。3回目の用量は、幹細胞移植の日に対してDay+18〜Day+38、Day+23〜Day+33、又はDay+22〜Day+34、特にDay+28に投与されてもよい。特に、CD24タンパク質は、幹細胞移植の日に対してDay−1、Day+14及びDay+28に、それぞれ480mg、240mg及び240mgの、隔週に3回の投与で投与されてもよい。CD24タンパク質は、特にCD24Fcであってもよい。
e.併用治療
CD24タンパク質は、標準治療のGVHD予防と併用して対象に投与されてもよい。標準治療のGVHD予防は、メトトレキセート+カルシニューリン阻害剤、例えばタクロリムス(Prograf、FK506)又はシクロスポリン(Sandimmune、Neoral)の投与を含んでもよい。タクロリムスは、幹細胞移植の日に対してDay−3に投与されてもよく、IV又はPO(経口)で投与されてもよい。持続注入としてのIV投与について、開始用量は、調整された体重に基づいて0.03mg/kg/日であってもよい。口腔内投与について、開始用量は、1日2回で、0.045mg/kg/回であってもよい。対象がタクロリムスに対して忍容性を示すことができない場合、シクロスポリンを、IVタクロリムス用量の100倍の用量(例えば、3mg/kg/日の開始用量)で、IVによって対象に投与してもよい。シクロスポリンは、IV用量の3倍の用量で経口投与されてもよい。Neoralブランドを用いる場合、より大きな生物学的利用能のため、シクロスポリンは、IV用量の2倍で経口投与されてもよい。
CD24タンパク質は、標準治療のGVHD予防と併用して対象に投与されてもよい。標準治療のGVHD予防は、メトトレキセート+カルシニューリン阻害剤、例えばタクロリムス(Prograf、FK506)又はシクロスポリン(Sandimmune、Neoral)の投与を含んでもよい。タクロリムスは、幹細胞移植の日に対してDay−3に投与されてもよく、IV又はPO(経口)で投与されてもよい。持続注入としてのIV投与について、開始用量は、調整された体重に基づいて0.03mg/kg/日であってもよい。口腔内投与について、開始用量は、1日2回で、0.045mg/kg/回であってもよい。対象がタクロリムスに対して忍容性を示すことができない場合、シクロスポリンを、IVタクロリムス用量の100倍の用量(例えば、3mg/kg/日の開始用量)で、IVによって対象に投与してもよい。シクロスポリンは、IV用量の3倍の用量で経口投与されてもよい。Neoralブランドを用いる場合、より大きな生物学的利用能のため、シクロスポリンは、IV用量の2倍で経口投与されてもよい。
GVHDがない場合、移植後の最初の100日間のみ、治療的投与についてタクロリムスレベルをモニタしてもよい。タクロリムスについての治療標的トラフレベルは、5〜15ng/mLであってもよい。CD24タンパク質注入後の最初の週(Day0〜Day7)に、最低3回(例えば、48〜72時間毎に)タクロリムスレベルをモニタしてもよい。GVHD又は再発がない場合、タクロリムスの漸減を移植後のDay+100から開始してもよい。GVHDがある場合、タクロリムスを治療的投与で継続してもよい。
メトトレキセートを標準的GVHD予防のためにタクロリムスと併用して用いてもよい。HCT後のDay1に1日1回15mg/m2/回の用量で、並びにHCT後のDay3、Day6及びDay11に10mg/m2/回の用量で、メトトレキセートを静脈内投与してもよい。
実施例1
マウスにおけるCD24薬物動態
1mgのCD24Fc(CD24Fc)を未処置C57BL/6マウスに注射し、異なる時点(5分、1時間、4時間、24時間、48時間、7日、14日及び21日)において、各時点で3匹のマウスから血液試料を回収した。血清を1:100で希釈し、捕捉抗体として精製抗ヒトCD24(3.3μg/mL)と検出抗体としてペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ヒトIgG Fc(5μg/mL)とを用いたサンドイッチELISAを用いて、CD24Fcのレベルを検出した。図3aに示される通り、CD24Fcの減衰曲線は、タンパク質の典型的な二相減衰を示した。第1の体内分布フェーズは、半減期が12.4時間であった。第2のフェーズは、中央区画からの第1次除去のモデルに従う。第2のフェーズについての半減期は、インビボにおける抗体と同様である9.54日であった。これらのデータは、融合タンパク質が血流内で非常に安定していることを示唆する。融合タンパク質を皮下注射した別の試験において、9.52日のほとんど同じ半減期が観察された(図3b)。さらに重要なことに、CD24Fcが血液中においてピークレベルを達するのに約48時間かかったが、AUCで測定された血液中の融合タンパク質の総量は、いずれの注射経路でも実質的に同じだった。したがって、治療的観点から、異なる注射経路を用いても薬物の治療的効果に影響を及ぼさない。この観察によって、霊長類の毒性試験及び臨床試験のための実験計画が大きく単純化された。
マウスにおけるCD24薬物動態
1mgのCD24Fc(CD24Fc)を未処置C57BL/6マウスに注射し、異なる時点(5分、1時間、4時間、24時間、48時間、7日、14日及び21日)において、各時点で3匹のマウスから血液試料を回収した。血清を1:100で希釈し、捕捉抗体として精製抗ヒトCD24(3.3μg/mL)と検出抗体としてペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ヒトIgG Fc(5μg/mL)とを用いたサンドイッチELISAを用いて、CD24Fcのレベルを検出した。図3aに示される通り、CD24Fcの減衰曲線は、タンパク質の典型的な二相減衰を示した。第1の体内分布フェーズは、半減期が12.4時間であった。第2のフェーズは、中央区画からの第1次除去のモデルに従う。第2のフェーズについての半減期は、インビボにおける抗体と同様である9.54日であった。これらのデータは、融合タンパク質が血流内で非常に安定していることを示唆する。融合タンパク質を皮下注射した別の試験において、9.52日のほとんど同じ半減期が観察された(図3b)。さらに重要なことに、CD24Fcが血液中においてピークレベルを達するのに約48時間かかったが、AUCで測定された血液中の融合タンパク質の総量は、いずれの注射経路でも実質的に同じだった。したがって、治療的観点から、異なる注射経路を用いても薬物の治療的効果に影響を及ぼさない。この観察によって、霊長類の毒性試験及び臨床試験のための実験計画が大きく単純化された。
実施例2
組織傷害に対する宿主応答におけるCD24−Siglec10の相互作用
約20年前、Matzingerは、一般に危険理論と呼ばれるものを提唱した。本質において、彼女は、免疫系が宿主の危険を検知する際に免疫系にスイッチが入ると論じた。危険の性質は、その時に充分に定義されなかったが、壊死は、危険関連分子パターンについての細胞内成分(DAMPと呼ばれるHMGB1及び熱ショックタンパク質など)の放出と関連していることが分かった。DAMPは、炎症性サイトカイン及び自己免疫性疾患の発現を促進することが分かった。動物モデルにおいて、HMGB1及びHSP90の阻害剤は、RAを寛解させることが分かった。DAMPの併発によって、RA治療のためにDAMPに対する宿主応答のための負の調節を探究することが可能であるという見通しが浮上した。
組織傷害に対する宿主応答におけるCD24−Siglec10の相互作用
約20年前、Matzingerは、一般に危険理論と呼ばれるものを提唱した。本質において、彼女は、免疫系が宿主の危険を検知する際に免疫系にスイッチが入ると論じた。危険の性質は、その時に充分に定義されなかったが、壊死は、危険関連分子パターンについての細胞内成分(DAMPと呼ばれるHMGB1及び熱ショックタンパク質など)の放出と関連していることが分かった。DAMPは、炎症性サイトカイン及び自己免疫性疾患の発現を促進することが分かった。動物モデルにおいて、HMGB1及びHSP90の阻害剤は、RAを寛解させることが分かった。DAMPの併発によって、RA治療のためにDAMPに対する宿主応答のための負の調節を探究することが可能であるという見通しが浮上した。
アセトアミノフェン誘導された肝壊死を用いて、炎症を確認することにより、相互作用Siglec Gを介して、CD24が、組織傷害に対する宿主応答のための強力な負の調節を提供することが観察された。CD24は、造血細胞及び他の組織幹細胞に広範に発現されたGPIアンカー型分子である。多発性硬化症、全身性エリテマトーデス(systemic lupus erythromatosus)、RA及び巨細胞動脈炎を含む、ヒトにおける様々な自己免疫性疾患の遺伝子解析は、CD24多型と自己免疫性疾患のリスクとの間における有意な関係性を示した。Siglec Gは、シアル酸含有構造を認識する能力によって規定されるI−レクチンファミリーのメンバーである。Siglec Gは、CD24上のシアル酸含有構造を認識したが、樹状細胞による炎症性サイトカインの産生を負に調節する。CD24と相互作用するその能力に関して、ヒトSiglec10及びマウスSiglec Gは、機能的に同等である。しかし、マウス相同体とヒト相同体と間に1対1の相関があるのかについては不明である。完全に説明しなければならない機序が残されているが、SiglecG関連SHP1が負の調節に関与する可能性があることは妥当と思われる。これらのデータは、CD24−Siglec G/10の相互作用がDAMPから病原体関連分子パターン(PAMP)を識別する際に重要な役割を果たす可能性がある新しいモデルをもたらす(図4)。
少なくとも2つの重複機序が、CD24の機能を説明し得る。第1に、様々なDAMPに結合することによって、CD24は、炎症性刺激を阻止して、それらのTLR又はRAGEとの相互作用を防止し得る。この見解は、CD24が、HSP70、HSP90、HMGB1及びヌクレオリンを含むいくつかのDAMP分子に会合するという観察によって支持される。第2に、おそらくDAMPに会合した後、CD24は、Siglec Gによるシグナル伝達を刺激し得る。いずれかの遺伝子の標的化突然変異を有するマウスが非常により強い炎症応答を開始した場合、両機序が協力して作用する可能性がある。実際、CD24−/−マウス又はSiglec G−/−マウスのいずれかに由来する骨髄から培養されたDCは、HMGB1、HSP70又はHSP90のいずれかで刺激された際に非常により高い炎症性サイトカインを産生した。対照的に、LPS及びPolyI:CなどのPAMPに対するそれらの応答において、効果は見出されなかった。これらのデータは、病原体を組織傷害から区別するための先天性免疫系のための機序を提供しただけでなく、組織傷害に関連する疾患に対する潜在的治療標的としてのCD24及びSiglec Gを示唆する。
実施例3
CD24Fcは、HMGB1、Siglec10と相互作用し、Siglec GとSHP−1との会合を誘導する
CD24FcとSiglec10との間の相互作用を測定するために、我々は、CHIP上にCD24Fcを固定し、Biacoreを用いて異なる濃度のSiglec−10Fcの結合性を測定した。図5aに示されるように、CD24Fcは、Kdが1.6×10−7MであるSiglec10に結合する。これは、対照Fcよりも100倍高い親和性である。CD24FcとHMGB1との間の相互作用は、CD24Fc結合型タンパク質Gビーズを用いた後、抗IgG又は抗HMGB1のいずれかによるウェスタンブロットを行うプルダウン実験によって確認された。これらのデータは、FcではなくCD24FcがHMGB1に結合し、この結合がカチオン依存性であることを示す(図5b)。CD24FcがSiglec G(ヒトSiglec 10のマウス対応物)の作動薬であるのかどうかを決定するために、我々は、CD24Fc、対照Fc又はビヒクル(PBS)対照によってCD24−/−脾臓細胞を30分間刺激した。次いで、Siglec Gを免疫沈降させ、抗ホスホ−チロシン又は抗SHP−1によって精査した。図5cに示されるように、CD24Fcは、Siglec Gの実質的リン酸化と、SHP−1(適応免疫及び先天性免疫の両方のためのよく知られた阻害剤)の会合とを誘導した。
CD24Fcは、HMGB1、Siglec10と相互作用し、Siglec GとSHP−1との会合を誘導する
CD24FcとSiglec10との間の相互作用を測定するために、我々は、CHIP上にCD24Fcを固定し、Biacoreを用いて異なる濃度のSiglec−10Fcの結合性を測定した。図5aに示されるように、CD24Fcは、Kdが1.6×10−7MであるSiglec10に結合する。これは、対照Fcよりも100倍高い親和性である。CD24FcとHMGB1との間の相互作用は、CD24Fc結合型タンパク質Gビーズを用いた後、抗IgG又は抗HMGB1のいずれかによるウェスタンブロットを行うプルダウン実験によって確認された。これらのデータは、FcではなくCD24FcがHMGB1に結合し、この結合がカチオン依存性であることを示す(図5b)。CD24FcがSiglec G(ヒトSiglec 10のマウス対応物)の作動薬であるのかどうかを決定するために、我々は、CD24Fc、対照Fc又はビヒクル(PBS)対照によってCD24−/−脾臓細胞を30分間刺激した。次いで、Siglec Gを免疫沈降させ、抗ホスホ−チロシン又は抗SHP−1によって精査した。図5cに示されるように、CD24Fcは、Siglec Gの実質的リン酸化と、SHP−1(適応免疫及び先天性免疫の両方のためのよく知られた阻害剤)の会合とを誘導した。
CD24Fcのインビトロ有効性試験
ヒトT細胞による炎症性サイトカインの産生に対するCD24Fcの影響を試験するために、異なる濃度のCD24Fc又はヒトIgG1 Fcの存在下において、一般に使用されるT細胞受容体の作動薬である抗CD3抗体(OKT3)によって、ヒトPBMLにおける成熟T細胞を活性化した。4日後、上清を回収し、活性化を確認するために酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によってIFN−γ及びTNF−αの産生を測定した。図6における結果は、2つの異なる製造ロットからのCD24Fcが、対照IgG Fc対照と比較して活性化ヒトPBMLに由来するIFN−γ及びTNF−αの産生を有意に低下させたことを示した。また、CD24Fcを加えた場合、サイトカイン産生は用量依存的に阻害された。したがって、CD24Fcは、インビトロで抗CD3誘導ヒトPBML活性化を阻害する可能性がある。この試験は、CD24Fcの作用機序がT細胞活性化の阻害によるものである可能性があることを示しただけでなく、薬物の効力及び安定性の試験のための信頼性のあるバイオアッセイも確立した。
ヒトT細胞による炎症性サイトカインの産生に対するCD24Fcの影響を試験するために、異なる濃度のCD24Fc又はヒトIgG1 Fcの存在下において、一般に使用されるT細胞受容体の作動薬である抗CD3抗体(OKT3)によって、ヒトPBMLにおける成熟T細胞を活性化した。4日後、上清を回収し、活性化を確認するために酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によってIFN−γ及びTNF−αの産生を測定した。図6における結果は、2つの異なる製造ロットからのCD24Fcが、対照IgG Fc対照と比較して活性化ヒトPBMLに由来するIFN−γ及びTNF−αの産生を有意に低下させたことを示した。また、CD24Fcを加えた場合、サイトカイン産生は用量依存的に阻害された。したがって、CD24Fcは、インビトロで抗CD3誘導ヒトPBML活性化を阻害する可能性がある。この試験は、CD24Fcの作用機序がT細胞活性化の阻害によるものである可能性があることを示しただけでなく、薬物の効力及び安定性の試験のための信頼性のあるバイオアッセイも確立した。
CD24Fcがヒト細胞系における炎症性サイトカインの産生を調節するのかどうかを決定するために、我々は、まず、RNAiを用いてヒト急性単球性白血病THP1細胞系におけるCD24を非発現化し、次いでそれらをPMAで治療することによってマクロファージへの分化を誘導した。図7aに示されるように、実質的に非発現化しているCD24は、TNFα、IL−1β及びIL−6の産生を増加させた。これらのデータは、炎症性サイトカインの産生を限定する際の内因性ヒトCD24の必須の役割を示す。重要なことに、CD24Fcは、CD24非発現化細胞系(図7b)におけるTNFα、並びにIL−1β及びIL−6の阻害を回復させた。これらのデータは、ヒト細胞の炎症応答におけるCD24の関連性を示すだけでなく、CD24Fcの生物学的活性を評価するために簡便なアッセイも提供する。
まとめると、これらのデータは、CD24Fcが適応刺激及び先天性刺激によって誘発されたサイトカイン産生を阻害することが可能であることを示す。しかし、上記薬物は、先天性エフェクターによるサイトカイン産生を低下させる際にさらにより有効であるので、我々は、その予防的機能のための一次機序が、移植の初期における組織傷害によって誘発された炎症を予防することであると考える。
実施例4
ヒトにおけるCD24の薬物動態
本実施例は、ヒトにおけるCD24タンパク質の薬物動態の解析を示す。これは、健康な男性及び女性の成人対象におけるCD24Fcの安全性、忍容性及びPKを評価するためのフェーズI無作為化二重盲検プラセボ対照単回漸増用量試験から導かれた。各々8人の対象の5コホートにおける合計40人の対象が本試験に組入れられた。各コホートにおける8人の対象のうちの6人は治験薬の投与を受け、2人の対象はプラセボ(0.9%の塩化ナトリウム、生理食塩水)の投与を受けた。第1のコホートに対して10mgを投与した。次のコホートに対して、30mg、60mg、120mg及び240mgのCD24Fc又は対応するプラセボの投与を行い、3週間以上の間隔で投与して、前の各コホートについての安全性及び忍容性のデータの再検討を可能にした。適切な安全性及び忍容性が示された場合のみ、対象の新しいコホートに対する次のより高い用量の投与を可能にした。
ヒトにおけるCD24の薬物動態
本実施例は、ヒトにおけるCD24タンパク質の薬物動態の解析を示す。これは、健康な男性及び女性の成人対象におけるCD24Fcの安全性、忍容性及びPKを評価するためのフェーズI無作為化二重盲検プラセボ対照単回漸増用量試験から導かれた。各々8人の対象の5コホートにおける合計40人の対象が本試験に組入れられた。各コホートにおける8人の対象のうちの6人は治験薬の投与を受け、2人の対象はプラセボ(0.9%の塩化ナトリウム、生理食塩水)の投与を受けた。第1のコホートに対して10mgを投与した。次のコホートに対して、30mg、60mg、120mg及び240mgのCD24Fc又は対応するプラセボの投与を行い、3週間以上の間隔で投与して、前の各コホートについての安全性及び忍容性のデータの再検討を可能にした。適切な安全性及び忍容性が示された場合のみ、対象の新しいコホートに対する次のより高い用量の投与を可能にした。
各コホートにおいて、最初の2人の対象は、1日目(Day1)において1人の治験薬レシピエント及び1人のプラセボレシピエントであった。7日目(Day7)の後、3番目〜5番目及び6番目〜8番目の対象に投与した(部分群の間では最低でも24時間の間隔を空けた)。同一部分群において、各対象に1時間以上の間隔で投与した。必要に応じて、残りの対象の投与は、そのコホートにおける第1又は第2の部分群を含む投与後期間の間に起こり得たあらゆる重要な安全性の問題の再検討まで延期された。後続のコホートに対しては、前のコホートの少なくとも3週間後に投与した。
(スクリーニング期間):
活動的治療期間(active treatment period)の最高で21日前に、スクリーニング時の来院(1回目の来院)を行った。インフォームドコンセントの提供後、対象に対して適格性に関するスクリーニング手続きを行った。
活動的治療期間(active treatment period)の最高で21日前に、スクリーニング時の来院(1回目の来院)を行った。インフォームドコンセントの提供後、対象に対して適格性に関するスクリーニング手続きを行った。
(治療期間):
対象は、Day−1(2回目の来院)に臨床薬理部(CPU)に承認され、10時間以上の夜間絶食の後、無作為化治療期間がDay1から開始した。対象は、単回投与としてのCD24Fc又はプラセボによる治療に無作為に割り付けられる。対象の拘束は、Day4の朝まで継続された。
対象は、Day−1(2回目の来院)に臨床薬理部(CPU)に承認され、10時間以上の夜間絶食の後、無作為化治療期間がDay1から開始した。対象は、単回投与としてのCD24Fc又はプラセボによる治療に無作為に割り付けられる。対象の拘束は、Day4の朝まで継続された。
(追跡調査):
全ての対象は、追跡調査のための来院(3回目の来院、4回目の来院、5回目の来院、6回目の来院及び7回目の来院)のために、Day7、Day14、Day21、Day28及びDay42(±1日)にCPUに戻った。7回目の来院は、全ての対象のための最終的な来院であった。
全ての対象は、追跡調査のための来院(3回目の来院、4回目の来院、5回目の来院、6回目の来院及び7回目の来院)のために、Day7、Day14、Day21、Day28及びDay42(±1日)にCPUに戻った。7回目の来院は、全ての対象のための最終的な来院であった。
(治療期間):各対象についての総試験期間は、最高63日間であった。単回投与は、Day1に行われた。
対象の数:
計画段階:40人の対象
スクリーニング:224人の対象
無作為化:40人の対象
完了:39人の対象
中止:1人の対象
計画段階:40人の対象
スクリーニング:224人の対象
無作為化:40人の対象
完了:39人の対象
中止:1人の対象
(診断及び主要な組入れ基準):
本試験のための集団は、年齢が18〜55歳(始めと終わりを含む)で、ボディマスインデックスが18kg/m2〜30kg/m2(始めと終わりを含む)である健康な男性及び女性であった。
本試験のための集団は、年齢が18〜55歳(始めと終わりを含む)で、ボディマスインデックスが18kg/m2〜30kg/m2(始めと終わりを含む)である健康な男性及び女性であった。
(治験薬及び対照薬の情報):
CD24Fc:IV注入により投与される10mg、30mg、60mg、120mg又は240mgの単一用量;ロット番号:09MM−036。CD24Fcは、ヒトCD24の成熟配列とヒト免疫グロブリンG1(IgG1Fc)の結晶化可能フラグメント領域とからなる完全ヒト化融合タンパク質であった。CD24Fcは、IV投与のための、滅菌で、透明で、無色の、保存剤を含まない水溶液として供給された。CD24Fcは、濃度が10mg/mLで、pHが7.2である単回投与注射溶液として製剤化された。各CD24Fcバイアルは、16mL±0.2mLのCD24Fc中において、160mgのCD24Fc、5.3mgの塩化ナトリウム、32.6mgの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、及び140mgの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物を含んだ。CD24Fcは、クロロブチルゴム栓と、アルミニウムの、指先で引張っただけで開けられるシールとを有する透明なホウケイ酸ガラスバイアル内において供給された。
CD24Fc:IV注入により投与される10mg、30mg、60mg、120mg又は240mgの単一用量;ロット番号:09MM−036。CD24Fcは、ヒトCD24の成熟配列とヒト免疫グロブリンG1(IgG1Fc)の結晶化可能フラグメント領域とからなる完全ヒト化融合タンパク質であった。CD24Fcは、IV投与のための、滅菌で、透明で、無色の、保存剤を含まない水溶液として供給された。CD24Fcは、濃度が10mg/mLで、pHが7.2である単回投与注射溶液として製剤化された。各CD24Fcバイアルは、16mL±0.2mLのCD24Fc中において、160mgのCD24Fc、5.3mgの塩化ナトリウム、32.6mgの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、及び140mgの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物を含んだ。CD24Fcは、クロロブチルゴム栓と、アルミニウムの、指先で引張っただけで開けられるシールとを有する透明なホウケイ酸ガラスバイアル内において供給された。
IV注入によって投与された、対応するプラセボ(0.9%の塩化ナトリウム、生理食塩水);ロット番号:P296855、P311852、P300715、P315952。
intent−to−treat(ITT)集団は、治験薬の1回以上の投与を受けた全ての対象からなった。ITT母集団は、対象情報及び安全性評価のための一次解析集団であった。
臨床検査値の評価(化学検査、血球計数検査及び尿検査)を治療及び来院によってまとめた。ベースライン時からの変化もまとめた。バイタルサイン(血圧、心拍数、呼吸数及び体温)を治療及び時点によってまとめた。ベースライン時からの変化もまとめた。全ての理学的検査データを示した。心電図パラメータ及びベースライン時からの変化をまとめた。全体的な解釈を示した。
(血漿CD24Fc濃度)
図8に示されるように、CD24Fcの平均血漿濃度は、投与されるCD24Fcの用量に比例して増加した。120mg以外の全ての用量群について、投与の1時間後にCD24Fcの最大平均血漿濃度に達した。120mg群については、投与の2時間後にCD24Fcの最大平均血漿濃度に達した。Day42(984時間)まで、全ての群についてのCD24Fcの平均血漿濃度は、最大平均血漿濃度の2%〜4%に低下した。
図8に示されるように、CD24Fcの平均血漿濃度は、投与されるCD24Fcの用量に比例して増加した。120mg以外の全ての用量群について、投与の1時間後にCD24Fcの最大平均血漿濃度に達した。120mg群については、投与の2時間後にCD24Fcの最大平均血漿濃度に達した。Day42(984時間)まで、全ての群についてのCD24Fcの平均血漿濃度は、最大平均血漿濃度の2%〜4%に低下した。
(血漿中CD24Fc用量比例性解析)
図9は、PK評価可能集団のための用量に対するCD24Fc Cmaxの用量比例性プロットを示す。図10は、PK評価可能集団のための用量に対するCD24Fc AUC0−42dの用量比例性プロットを示す。図11は、PK評価可能集団のための用量に対するCD24Fc AUC0−infの用量比例性プロットを示す。表2は、用量比例性の検出力解析を示す。
図9は、PK評価可能集団のための用量に対するCD24Fc Cmaxの用量比例性プロットを示す。図10は、PK評価可能集団のための用量に対するCD24Fc AUC0−42dの用量比例性プロットを示す。図11は、PK評価可能集団のための用量に対するCD24Fc AUC0−infの用量比例性プロットを示す。表2は、用量比例性の検出力解析を示す。
Cmax傾き推定は、90%CIが1.105〜1.240で1.172であった。AUC0−42dの傾き推定は、90%CIが1.027〜1.148で1.088であった。AUC0−inf傾き推定は、90%CIが1.026〜1.1で1.087であった。
(薬物動態の結論)
血漿中CD24FcのCmax及びAUCは、マウス、サル及びヒトにおいて投与される用量に比例して増加した。血漿中CD24Fcは、1.01〜1.34時間においてTmaxに達した。血漿中CD24Fcのt1/2は、280.83〜327.10時間の範囲であった。
血漿中CD24FcのCmax及びAUCは、マウス、サル及びヒトにおいて投与される用量に比例して増加した。血漿中CD24Fcは、1.01〜1.34時間においてTmaxに達した。血漿中CD24Fcのt1/2は、280.83〜327.10時間の範囲であった。
実施例5
CD24は、ヒト対象における移植片対宿主病を治療するために使用可能である
同種骨髄破壊的造血幹細胞移植(HCT)を受けているがん患者における標準治療の急性GVHD予防に対するCD24タンパク質(CD24Fc)の添加を評価するために、多施設共同前向き二重盲検無作為化プラセボ対照フェーズIIa用量漸増試験を実施した。治験デザインは、図12に示される。
CD24は、ヒト対象における移植片対宿主病を治療するために使用可能である
同種骨髄破壊的造血幹細胞移植(HCT)を受けているがん患者における標準治療の急性GVHD予防に対するCD24タンパク質(CD24Fc)の添加を評価するために、多施設共同前向き二重盲検無作為化プラセボ対照フェーズIIa用量漸増試験を実施した。治験デザインは、図12に示される。
フェーズIIa試験の主要目的は、推奨フェーズ2用量(RP2D)又は最大耐用量(MTD)を規定するために、骨髄破壊前処置の後で適合非血縁ドナーHCTを受けた患者におけるメトトレキセート及びタクロリムス予防との併用におけるCD24Fcの安全性及び忍容性を評価することを含む。また、フェーズIIa試験における副次有効性目的は、以下のものを含む。
・標準的なGVHD予防のメトトレキセート及びタクロリムスへのCD24Fcの添加が、HCTの100日後においてグレードII〜IVのaGVHDの累積発現率を低下させるのかどうかを決定すること
・HCTの180日後におけるグレードII〜IVのaGVHD無病生存率(GFS)を推定すること、
・1年目におけるcGVHDの発現率(cGVHD)を記載すること
・HCTの1年後における再発の発現率を記載すること
・HCTの1年後における移植関連死(TRM)の発現率を記載すること
・HCTの100日後における感染率を記載すること
・全生存率(OS)、グレードIII〜IVのGVHDの非存在、及びHCTの1年後における無再発生存率を評価すること
・口腔粘膜炎及び臓器不全を含む前処置毒性を評価すること
他の目的としては、CD24Fcの薬物動態(PK)プロファイルを評価すること、CD24Fc群及びプラセボ群におけるHCT後のAPC及びT細胞の免疫細胞プロファイル及び機能的応答を検討すること、並びにCD24Fc群及びプラセボ群における炎症誘発性サイトカイン、DAMP、脂質及びGVHDバイオマーカの血漿中濃度などの薬力学(PD)バイオマーカを評価すること、が挙げられる。
医療機関診療に従って同種HCTを受けている適合非血縁ドナーからの移植を受けている患者が上記試験に組入れられた。カルノフスキーパーフォーマンススコアが70%以上の、悪性血液学的状態のための適合非血縁ドナー同種HCTを受けている、年齢が18〜70歳の患者が、上記試験のために適格だった。HLA−A、HLA−B、HLA−C及びHLA−DRB1における非血縁ドナーとレシピエントと間の8/8のHLA対立遺伝子適合性が必要であった。非血縁ドナーからHCTを受けている患者に上記試験を制限することは、この集団におけるグレードII〜IVのaGVHDの発現率(60〜80%)及びグレードIII〜IVのaGVHDの発現率(20〜35%)がより大きい場合、異質性を限定し、後続の有効性の評価のためのaGVHD発現率の統計的推定を容易にするものと期待される。
これらの患者は、最も重度の組織傷害を発症したが、上記薬物は、おそらくこの設定で最も強い生物学的効果を有するので、本試験は、もっぱら骨髄破壊的前処置レジメン並びにタクロリムス及びメトトレキセートを含む標準治療(SOC)予防を利用した。フェーズIIaのプロトコルにつき、全ての患者は、骨髄破壊的前処置並びにメトトレキセート及びタクロリムスによる標準治療GVHD予防を受けた。患者は、治療医によって決定されたように、フルダラビン及びブスルファン(Flu/Bu4)又はシクロホスファミド及び全身照射(Cy/TBI)のいずれかからなる骨髄破壊的前処置レジメンを受けた後、Day0に幹細胞の注入を行った。GVHD予防は、全ての患者に投与され、投与群におけるCD24Fc又はプラセボ群における生理食塩水と併用したタクロリムス(移植前のDay−3に開始した)及びメトトレキセート(移植後のDay+1に開始した)からなった。GVHDがない場合、タクロリムスの漸減は、Day+100に開始した。ドナー幹細胞の源は、末梢血幹細胞(PBSC)又は骨髄(BM)のいずれかであった。
フェーズIIa試験は、以下の表3で概説されるように、SOC GVHD予防に加えて、CD24Fcの2つの単回漸増用量コホート(240mg及び480mg)及び単一の複数回投与コホートを含んだ。図13に示されるように、単回投与コホートにおいて、幹細胞移植の日に対してDay−1に治験剤(CD24Fc)を静脈内投与した。複数回投与コホートにおいて、患者は、480mg(Day−1)、240mg(Day+14)及び240mg(Day+28)におけるCD24Fcの3回の隔週投与を受けた。CD24FcについてのPKデータに基づいて、この隔週投与期間によって、3つ以上の半減期の経過が可能になる。投与は、固定量に基づき、重量又はBSAに基づかない。各投与コホートは、合計組入れ人数が24人の患者についての無作為化された3:1の比(6人のCD24Fc対象及び2人のプラセボ)のデザインを用いて8人の対象を組入れた。
表4は、年齢、悪性疾患及び併存疾患などのリスク因子にわたって比較的バランスが保たれたCD24Fcコホート及びプラセボコホートにおける患者についての人口統計学情報及び臨床的特性を示す。CD24Fcコホート及びプラセボコホートにおいて最もよくみられる悪性疾患は、AML/MDS(66.7%及び83.3%)であった。CD24Fcコホートにおける患者の72%及びプラセボ群における50%は、併存疾患指標が中間又は高かった。両コホートにおいて、骨髄と比較して、PBSCが移植片源としてより頻回に用いられ、Flu/Bu4は、両コホートにわたって最もよくみられる前処置レジメンであった。4人の患者(CD24Fcコホートにおける全員)がCy/TBI前処置を受けた。
上記試験の主要目的は、骨髄破壊的同種造血細胞移植(HCT)を受けている対象におけるCD24Fcの安全性及び忍容性を評価すること、並びにHCTを受けている患者におけるCD24Fcの推奨フェーズII用量(RP2D)又は最大耐量(MTD)を決定することである。
上記試験に組入れられた全ての患者は、単一投与コホートについてはHCTの30日後までの、又は複数回投与コホートについてはHCTの60日後までのCD24Fcによる治療の最初の日であり(正確な日数は、逸脱を構成することなく治験薬の投与の最終日に依存して変化してもよい)、治験薬に潜在的に関連する毒性を限定する用量を含む有害事象(AE)についての評価及び報告期間である治療期間を完了した。表5は、フェーズ2a試験において観察された毒性の概要を提供するものである。全体として、本試験によって、最高で480mgのCD24FcのIV投与はintent−to−treat(ITT)集団において概して忍容性が良好であることが示された。治験薬に起因し得るか又は起因し得る可能性がある注入毒性、用量制限毒性(DLT)又はSAEは認められず、一人の患者も上記試験から除外されなかった。
組入れられた全ての24人の対象は、図14に示されるように、移植後に生着した。好中球は、CD24Fc曝露患者及びプラセボ患者において、それぞれHCTの13.0日後及び15.5日後の中央値において生着した。血小板は、血小板が生着せず、Day49に死亡したプラセボ群の1人の患者を除いて、CD24Fc曝露患者及びプラセボ患者において、それぞれHCTの13.0日後及び15.0日後の中央値で生着した。生着不全の症例はなかった。Day+30におけるCD3キメラ現象の中央値は、CD24Fc曝露患者において82.5%(38〜100%の範囲)であり、プラセボ群において82.0%(62%〜91%の範囲)であった(図15)。ドナーCD3キメラ現象の中央値は、CD24Fc曝露患者においてDay100に86%(42%〜100%の範囲)に増加し、プラセボ群において84%(17%〜100%の範囲)に増加した。Day30及びDay100におけるドナーCD33キメラ現象は、CD24Fc群及びプラセボ群の両方において100%であった。
フェーズ2a試験のための有効性解析は、副次的であると考えられ、以下のもの:HCT後のDay180(180日目)におけるグレードIII〜IVの急性GVHDの無病生存率(GFS)を記載すること;HCT後のDay100(100日目)におけるグレードII〜IVの急性GVHDの累積発現率を記載すること;HCT後のDay180におけるグレードIII〜IVのGVHDの無再発生存率を記載すること;HCT後のDay180におけるグレードII〜IVの急性GFSを記載すること;HCTの1年後における慢性GVHDの発現率を記載すること;HCTの1年後における再発の発現率を記載すること;HCTの1年後における移植関連死(TRM)の発現率を記載すること;HCT後のDay100における感染率を記載すること;HCTの1年後における全生存率(OS)及び無病生存率(DFS)を評価すること、を含む。
フェーズIIa試験におけるプラセボ群を含めることに加えて、2012年1月〜2017年11月の期間から同じ骨髄破壊的前処置及びGVHD予防レジメン(実験的治療CD24Fcがない)の後で適合非血縁ドナーHCTを行う同一施設から同時対照(N=92)におけるデータを集めた。プラセボ対照群のおける患者が少数である場合、同時対照コホートが含まれた。同時対照コホートにおける92人の成人患者の人口統計学データを表6にまとめる。
表7及び表8は、フェーズ2a試験の臨床的転帰の概要を提供するものである。急性GVHDは、国際CIBMTRレジストリ並びに血液及び骨髄移植臨床試験ネットワークによって利用されるコンセンサスガイドラインに従って等級分けされ、毎週記録された。Day0においてHCTを受けた後、HCT後のDay100まで、aGVHDについて患者を評価した。
Day100までのグレードII〜IVの急性移植片対宿主病の発現率
表9は、mITT集団についてのDay100までのグレードII〜IVの急性GVHDの累積発現率をまとめたものである。合計で、CD24Fcの投与を受けた7人(38.9%)の患者(240mgのCD24Fcの単回投与コホートにおいて2人[33.3%]の患者、480mgのCD24Fcの単回投与コホートにおいて3人[50.0%]の患者、及び960mgのCD24Fcの複数回投与コホートにおいて2人[33.3%]の患者)及びプラセボの投与を受けた1人の患者(16.7%)が、Day100までにグレードII〜IVの急性GVHDとなった。さらに、プラセボの投与を受けた1人(16.7%)の患者が、Day100までにグレードII〜IVの急性GVHDなしで死亡した。Day100にかけてグレードII〜IVの急性GVHDを発症することなく生存した患者は、Day100までにおける急性GVHDについての上記患者の最後の評価において除外された。各治療群における患者の50.0%以上が除外された。
表9は、mITT集団についてのDay100までのグレードII〜IVの急性GVHDの累積発現率をまとめたものである。合計で、CD24Fcの投与を受けた7人(38.9%)の患者(240mgのCD24Fcの単回投与コホートにおいて2人[33.3%]の患者、480mgのCD24Fcの単回投与コホートにおいて3人[50.0%]の患者、及び960mgのCD24Fcの複数回投与コホートにおいて2人[33.3%]の患者)及びプラセボの投与を受けた1人の患者(16.7%)が、Day100までにグレードII〜IVの急性GVHDとなった。さらに、プラセボの投与を受けた1人(16.7%)の患者が、Day100までにグレードII〜IVの急性GVHDなしで死亡した。Day100にかけてグレードII〜IVの急性GVHDを発症することなく生存した患者は、Day100までにおける急性GVHDについての上記患者の最後の評価において除外された。各治療群における患者の50.0%以上が除外された。
全体的に、(95%CIと共に)Day100までのグレードII〜IVの急性GVHDの累積発現率は、CD24Fc治療群については38.9%(16.8%、60.7%)、プラセボ群については16.7%(0.5%、54.9%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、2.6(0.5、14.7)であった。グレードII〜IVのaGVHDの累積発現率は、同時対照において50%であった。CD24Fc治療群において、グレードIIのaGVHDの4つの症例は皮膚だけを含み、2つの症例は皮膚及び上部消化(GI)管を含んだ。プラセボ群においてグレードIIのaGVHDの症例はなかった。
Day180にかけてのグレードII〜IVの急性移植片対宿主病無病生存率
表10は、mITT集団についてのDay180にかけてのグレードII〜IVの急性GFSをまとめたものである。グレードII〜IVの急性GFSのカプラン−マイヤー推定の中央値には、いかなる治療群においても達しなかった。全体的に、(95%CIと共に)Day180におけるグレードII〜IVの急性GFSの割合は、CD24Fc治療群については61.1%(35.3%、79.2%)、プラセボ群については50.0%(11.1%、80.4%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、0.8(0.3、2.5)であった。データカットオフ日において生存しており、且つグレードII〜IVの急性GVHDの確定した発現がなかった患者は、Day180までの急性GVHDの評価の最終日に除外された。標本サイズが小さいことに加えて、各治療群における患者の50.0%以上が除外された。
表10は、mITT集団についてのDay180にかけてのグレードII〜IVの急性GFSをまとめたものである。グレードII〜IVの急性GFSのカプラン−マイヤー推定の中央値には、いかなる治療群においても達しなかった。全体的に、(95%CIと共に)Day180におけるグレードII〜IVの急性GFSの割合は、CD24Fc治療群については61.1%(35.3%、79.2%)、プラセボ群については50.0%(11.1%、80.4%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、0.8(0.3、2.5)であった。データカットオフ日において生存しており、且つグレードII〜IVの急性GVHDの確定した発現がなかった患者は、Day180までの急性GVHDの評価の最終日に除外された。標本サイズが小さいことに加えて、各治療群における患者の50.0%以上が除外された。
mITT集団についてのDay180にかけてのグレードIII〜IVの急性GFS
表11に示されるように、合計で、CD24Fcの投与を受けた1人(5.6%)の患者(480mgのCD24Fcの単回投与コホートにおける1人[16.7%]の患者)及びプラセボの投与を受けた2人(33.3%)の患者が、Day180までにグレードIII〜IVの急性GVHDになった。全体的に、(95%CIと共に)Day180におけるグレードIII〜IVの急性GFSの割合は、CD24Fc治療群については94.4%(66.6%、99.2%)、プラセボ群については50.0%(11.1%、80.4%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、0.1(0.0、0.7)であった。データカットオフ日において生存しており、且つグレードIII〜IVの急性GVHDの確定した発現がなかった患者は、Day180までの急性GVHDの評価の最終日に除外された。各治療群における患者の50.0%以上が除外された。Day180におけるグレードIII〜IVの急性GFSの割合は、同時対照コホートにおいて24%であった。図30は、プラセボ対照群(図31A)及び同時対照群(図31B)と比較したCD24Fc群における180日間にわたるグレードIII〜IVのGVHD無病生存率を示す。
表11に示されるように、合計で、CD24Fcの投与を受けた1人(5.6%)の患者(480mgのCD24Fcの単回投与コホートにおける1人[16.7%]の患者)及びプラセボの投与を受けた2人(33.3%)の患者が、Day180までにグレードIII〜IVの急性GVHDになった。全体的に、(95%CIと共に)Day180におけるグレードIII〜IVの急性GFSの割合は、CD24Fc治療群については94.4%(66.6%、99.2%)、プラセボ群については50.0%(11.1%、80.4%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、0.1(0.0、0.7)であった。データカットオフ日において生存しており、且つグレードIII〜IVの急性GVHDの確定した発現がなかった患者は、Day180までの急性GVHDの評価の最終日に除外された。各治療群における患者の50.0%以上が除外された。Day180におけるグレードIII〜IVの急性GFSの割合は、同時対照コホートにおいて24%であった。図30は、プラセボ対照群(図31A)及び同時対照群(図31B)と比較したCD24Fc群における180日間にわたるグレードIII〜IVのGVHD無病生存率を示す。
データカットオフ時に上記試験においてaGVHDを発症した全ての患者は、同時コホート対照において認められた50%の奏功率と比較して、ステロイド治療の効果が見られた。HCT後の最初の100日後、遅発性aGVHD(Day100の後の急性GVHDの発症と定義される)、又はHCTの1年後までのcGVHDについて年4回患者を評価した。移植後のDay100の後、CD24Fcコホートにおいて、さらなるaGVHD事象は認められなかった。
図16は、治療(CD24Fc)コホートにおけるグレードII〜IV及びグレードIII〜IVの急性GVHDの累積発現率を示す。特に、1人の患者だけに下部GIを含んだグレードIIIのGVHDがあり、肝臓GVHDは認められなかった。CD24FcコホートにおけるHCT後のDay180におけるグレードIII〜IVのaGVHDの累積発現率は、同時対照におけるDay180におけるグレードIII〜IVのaGVHDよりも低い傾向があった(P=0.097)。プラセボ群の患者において、Day184に死亡に至ったDay182におけるグレードIIIのaGVHDのさらなる症例があった。この患者は、Day145において白血病再発となった。これらの結果は、メトトレキセート及びタクロリムス予防に加えて、CD24Fcが、骨髄破壊的前処置を受けた後にHCTを受けている患者における、より重篤なグレードIII及びIVのaGVHDを発症するリスクを低下させることを示唆する。
造血幹細胞移植の1年後における無病生存率
表12は、mITT集団についてのHCTの1年後の無病生存率(DFS)をまとめたものである。いかなる治療群についても、DFSカプラン−マイヤー推定の中央値に達しなかった。全体的に、HCTの1年後のDFS率(95%CIと共に)は、CD24Fc治療群については83.3%(56.8%、94.3%)、プラセボ群については50.0%(11.1%、80.4%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、0.2(0.1、0.9)であった。追跡調査期間の終了時に生存しており、且つ疾患の再発がなかった患者は、評価の最終日に除外された。各治療群における患者の50.0%以上が除外された。図31は、プラセボ対照群(図31A)及び同時対照群(図31B)と比較したCD24Fc群における無再発生存率を示す。
表12は、mITT集団についてのHCTの1年後の無病生存率(DFS)をまとめたものである。いかなる治療群についても、DFSカプラン−マイヤー推定の中央値に達しなかった。全体的に、HCTの1年後のDFS率(95%CIと共に)は、CD24Fc治療群については83.3%(56.8%、94.3%)、プラセボ群については50.0%(11.1%、80.4%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、0.2(0.1、0.9)であった。追跡調査期間の終了時に生存しており、且つ疾患の再発がなかった患者は、評価の最終日に除外された。各治療群における患者の50.0%以上が除外された。図31は、プラセボ対照群(図31A)及び同時対照群(図31B)と比較したCD24Fc群における無再発生存率を示す。
造血幹細胞移植の1年後における全生存率
表13は、mITT集団についてのHCTの1年後における全生存率(OS)をまとめたものである。いかなる治療群についても、OS時間カプラン−マイヤー推定の中央値に達しなかった。全体的に、1年におけるOS率(95%CIと共に)は、CD24Fc治療群については83.3%(56.8%、94.3%)、プラセボ群については50.0%(11.1%、80.4%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、0.2(0.1、1.0)であった。追跡調査期間の終了時に生存していた患者は、上記患者が生存していることが知られた最終日に除外された。各治療群における患者の50.0%以上が除外された。
表13は、mITT集団についてのHCTの1年後における全生存率(OS)をまとめたものである。いかなる治療群についても、OS時間カプラン−マイヤー推定の中央値に達しなかった。全体的に、1年におけるOS率(95%CIと共に)は、CD24Fc治療群については83.3%(56.8%、94.3%)、プラセボ群については50.0%(11.1%、80.4%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、0.2(0.1、1.0)であった。追跡調査期間の終了時に生存していた患者は、上記患者が生存していることが知られた最終日に除外された。各治療群における患者の50.0%以上が除外された。
フェーズIIa試験における患者についてのHCTの約800日後の全生存率(OS)の推定も期待が持てるものとなっている。全生存率(OS)は、CD24Fcコホートにおける患者については約80%、プラセボコホートにおける患者については50%(p=0.06)(図20)、及び同時対照における患者については50%(p=0.05)であった(図21)。プラセボ患者及び同時対照患者と比較した場合におけるCD24Fc曝露患者におけるOSの向上は、メトトレキセート及びタクロリムスと併用してCD24Fcを投与することによって骨髄破壊的前処置後にHCTを受けている患者の転帰に対する実質的な改善が生じる可能性があることを示す上記の他の知見を支持する。
Day180にかけての急性移植片対宿主病無病生存率及び無再発生存率(aGRFS)
GVHDを予防するように設計された治療的戦略は、移植片対白血病(GVL)効果の低減のために白血病再発の増加をもたらす可能性がある。表7に示されるように、HCT後のDay180におけるCD24Fcに曝露された患者における白血病再発の発現率(11%)は、プラセボ群における患者(33%)及び同時対照における患者(23%)と比較して、より低かった。480mgのCD24Fcコホートにおける1人の対象は、Day146にCMMLの再発を起こし、複数回投与の960mgのCD24Fcコホートにおける1人の対象は、HCT後のDay100にALLの再発を起こした。CMMLの患者は、白血病によりDay196に死亡した。ALL再発の患者は、ブリナツモマブで治療され、完全寛解に達し、2018年8月8日のデータカットオフの時点で生存していた。プラセボコホートにおいて、1人の患者がDay94にCMMLの再発を起こし、MDSの1人の患者がDay146に再発した(CMMLの患者はDay316に死亡し、MDSの患者はDay184に死亡した)。これらの結果は、CD24Fcが、有益な移植片対腫瘍(GVT)プロセスに干渉せず、白血病再発のリスクを低下させる可能性もあることを示唆する。
GVHDを予防するように設計された治療的戦略は、移植片対白血病(GVL)効果の低減のために白血病再発の増加をもたらす可能性がある。表7に示されるように、HCT後のDay180におけるCD24Fcに曝露された患者における白血病再発の発現率(11%)は、プラセボ群における患者(33%)及び同時対照における患者(23%)と比較して、より低かった。480mgのCD24Fcコホートにおける1人の対象は、Day146にCMMLの再発を起こし、複数回投与の960mgのCD24Fcコホートにおける1人の対象は、HCT後のDay100にALLの再発を起こした。CMMLの患者は、白血病によりDay196に死亡した。ALL再発の患者は、ブリナツモマブで治療され、完全寛解に達し、2018年8月8日のデータカットオフの時点で生存していた。プラセボコホートにおいて、1人の患者がDay94にCMMLの再発を起こし、MDSの1人の患者がDay146に再発した(CMMLの患者はDay316に死亡し、MDSの患者はDay184に死亡した)。これらの結果は、CD24Fcが、有益な移植片対腫瘍(GVT)プロセスに干渉せず、白血病再発のリスクを低下させる可能性もあることを示唆する。
移植後のDay180におけるCD24Fcコホートの死亡数は、プラセボコホート及び同時対照コホートよりも少ない(表7)。HCT後のDay180において、CD24Fcコホートのいずれにも死亡はなかったが、プラセボコホートでは肺炎による1人の死亡(16.7%)があり、同時対照では22人の死亡(23.9%)があった。HCT後のDay180におけるプラセボ群(33%)(P=0.011、図18参照)及びHCT後のDay180における同時対照(53%)(P=0.017、図19参照)と比較した場合、CD24Fcコホート(83%)において、aGVHDのグレードIII〜IVの無再発生存率(RFS)の複合評価項目の統計学的に有意な改善が認められる。この種の評価項目は、理論的に、GVHD抑制だけでなく潜在的な衝撃毒性、感染及び再発に対する介入の効果を要約するので、ますます一般的になってきた。上記の観測を支持して、グレードIII〜IVのaGVHDのRFSの改善は、骨髄破壊的前処置レジメンの後に標準医療のメトトレキセート及びタクロリムスと併用してCD24Fcを投与することが、移植片のGVL効果に影響を及ぼすことなくaGVHDの発現を予防する際に患者にとって有益であることを示す。
HCT後のDay180にかけてのaGRFSは、事象がグレードIII〜IVの急性GVHD、再発又は何らかの原因による死亡を含んだ事後の複合評価項目である。表14は、mITT集団についてのDay180にかけてのグレードIII〜IVの急性GRFSをまとめたものである。
CD24Fc治療群について、グレードIII〜IVの急性GRFSの中央値のカプラン−マイヤー推定に達しなかった。プラセボ群について、グレードIII〜IVの急性GRFSの中央値のカプラン−マイヤー推定(95%CIと共に)は、120.0(46.0、推定不可能)であった。全体的に、Day180におけるグレードIII〜IVの急性GRFS率(95%CIと共に)は、CD24Fc治療群については83.3%(56.8%、94.3%)、プラセボ群については33.3%(4.6%、67.6%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、0.2(0.0、0.6)であった。データカットオフ日において生存しており、且つグレードIII〜IVの急性GVHD、全身免疫抑制療法を必要とする慢性GVHD又は再発の確定した発現がなかった患者は、最終評価日に除外された。
造血幹細胞移植の1年後における再発の発現率
表15は、mITT集団についてのHCTの1年後における再発の累積発現率をまとめたものである。全体的に、HCTの1年後における再発の累積発現率(95%CIと共に)は、CD24Fc治療群については11.1%(1.7%、30.4%)、プラセボ群については33.3%(2.9%、71.1%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、0.3(0.1、1.4)であった。追跡調査期間の終了時(Day365[1年])に生存しており、且つ再発がなかった患者は、評価の最終日に除外された。各治療群における患者の50.0%以上が除外された。
表15は、mITT集団についてのHCTの1年後における再発の累積発現率をまとめたものである。全体的に、HCTの1年後における再発の累積発現率(95%CIと共に)は、CD24Fc治療群については11.1%(1.7%、30.4%)、プラセボ群については33.3%(2.9%、71.1%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、0.3(0.1、1.4)であった。追跡調査期間の終了時(Day365[1年])に生存しており、且つ再発がなかった患者は、評価の最終日に除外された。各治療群における患者の50.0%以上が除外された。
造血幹細胞移植の1年後における移植片対宿主病無病生存率及び無再発生存率(GRFS)
HCTの1年後にかけてのこのGRFSは、事象がグレードIII〜IVの急性GVHD、全身免疫抑制療法を必要とする慢性GVHD、再発又は何らかの原因による死亡を含んだ複合評価項目である。表16は、mITT母集団についてのHCTの1年後におけるグレードIII〜IVの急性GRFSをまとめたものである。
HCTの1年後にかけてのこのGRFSは、事象がグレードIII〜IVの急性GVHD、全身免疫抑制療法を必要とする慢性GVHD、再発又は何らかの原因による死亡を含んだ複合評価項目である。表16は、mITT母集団についてのHCTの1年後におけるグレードIII〜IVの急性GRFSをまとめたものである。
GRFSの中央値のカプラン−マイヤー推定(95%CIと共に)は、全体的なCD24Fc治療群については229.0日(141.0、推定不可能)であり:240mgのCD24Fcの単回投与コホートについては247.0日(129.0、推定不可能)であり、480mgのCD24Fcの単回投与コホートについては287.0(24.0、推定不可能)であり、960mgのCD24Fcの複数回投与コホートについては193.5(100.0(推定不可能)である。GRFSの中央値のカプラン−マイヤー推定(95%CIと共に)は、プラセボ群については120.0日(46.0、推定不可能)であった。全体的には、HCTの1年後におけるGRFS率は(95%CIと共に)、CD24Fc治療群については32.4%(12.7%、54.0%)、プラセボ群については33.3%(4.6%、67.6%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、0.7(0.3、1.7)であった。データカットオフ日において生存しており、且つグレードIII〜IVの急性GVHD、全身免疫抑制療法を必要とする慢性GVHD又は再発の確定した発現がなかった患者は、最終評価日に除外された。
造血幹細胞移植の1年後における非再発死の発現率
表17は、mITT集団についてのHCTの1年後におけるNRMの累積発現率をまとめたものである。全体的に、1年目におけるNRMの累積発現率(95%CIと共に)は、CD24Fc治療群については5.6%(0.3%、23.1%)、プラセボ群については16.7%(0.5%、54.9%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、0.3(0.0、2.8)であった。再発なしで追跡調査期間の終了時(Day365[1年])に生存していた患者は、当該患者が生存していることが知られた最終日に除外された。各治療群における患者の50.0%以上が除外された。Day180におけるNRMの累積発現率(95%CIと共に)は、CD24Fc治療群については0.0%、プラセボ群については16.7%(0.5%、54.9%)であった。
表17は、mITT集団についてのHCTの1年後におけるNRMの累積発現率をまとめたものである。全体的に、1年目におけるNRMの累積発現率(95%CIと共に)は、CD24Fc治療群については5.6%(0.3%、23.1%)、プラセボ群については16.7%(0.5%、54.9%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、0.3(0.0、2.8)であった。再発なしで追跡調査期間の終了時(Day365[1年])に生存していた患者は、当該患者が生存していることが知られた最終日に除外された。各治療群における患者の50.0%以上が除外された。Day180におけるNRMの累積発現率(95%CIと共に)は、CD24Fc治療群については0.0%、プラセボ群については16.7%(0.5%、54.9%)であった。
造血幹細胞の1年後における慢性移植片対宿主病の発現率
表18は、mITT集団についてのHCTの1年後における慢性GVHDの累積発現率をまとめたものである。全体的に、HCTの1年後における慢性GVHDの累積発現率(95%CIと共に)は、CD24Fc治療群については63.3%(34.1%、82.4%)、プラセボ群については33.3%(2.5%、72.0%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、2.1(0.6、7.4)であった。240mgのCD24Fcの単回投与コホートにおいて3人の中等度の慢性GVHDがあり、480mgのCD24Fcの単回投与コホートにおいて3人の軽度及び1人の中等度の慢性GVHDがあり、960mgのCD24Fcの複数回投与コホートにおいて2人の軽度及び3人の中等度の慢性GVHDがあった。プラセボ群において、2人の患者が軽度の慢性GVHDに罹患した。全体的に、重度の慢性GVHDの例はなかった。追跡調査期間の終了時(Day365[1年])に生存しており、且つ慢性GVHDを発現しなかった患者は、評価の最終日に除外された。
表18は、mITT集団についてのHCTの1年後における慢性GVHDの累積発現率をまとめたものである。全体的に、HCTの1年後における慢性GVHDの累積発現率(95%CIと共に)は、CD24Fc治療群については63.3%(34.1%、82.4%)、プラセボ群については33.3%(2.5%、72.0%)であった。プラセボに対するCD24Fcについてのハザード比(90%CIと共に)は、2.1(0.6、7.4)であった。240mgのCD24Fcの単回投与コホートにおいて3人の中等度の慢性GVHDがあり、480mgのCD24Fcの単回投与コホートにおいて3人の軽度及び1人の中等度の慢性GVHDがあり、960mgのCD24Fcの複数回投与コホートにおいて2人の軽度及び3人の中等度の慢性GVHDがあった。プラセボ群において、2人の患者が軽度の慢性GVHDに罹患した。全体的に、重度の慢性GVHDの例はなかった。追跡調査期間の終了時(Day365[1年])に生存しており、且つ慢性GVHDを発現しなかった患者は、評価の最終日に除外された。
Day100における感染率
GVLに対する効果と同様に、全般的免疫抑制によってGVHDを予防するように設計された治療的戦略は、細菌感染及びCMV再活性化を含む感染率の増加をもたらす可能性がある。
GVLに対する効果と同様に、全般的免疫抑制によってGVHDを予防するように設計された治療的戦略は、細菌感染及びCMV再活性化を含む感染率の増加をもたらす可能性がある。
表19は、mITT集団についてのDay100にかけての感染症の発現率をまとめたものである。合計で、CD24Fcの投与を受けた13人(72.2%)の患者(240mgのCD24Fcの単回投与コホートにおける5人[83.3%]の患者、480mgのCD24Fcの単回投与コホートにおける2人[33.3%]の患者、及び960mgのCD24Fcの複数回投与コホートにおける6人の[100.0%]患者)及びプラセボの投与を受けた2人(33.3%)の患者が、Day100にかけて感染症に罹患した。
ほとんどの感染症はコントロールされ、消失したと考えられた。プラセボ群の患者103−001は、肺炎で死亡した。プラセボ群の患者102−002は、回復/消失と報告された結膜炎に罹患した。480mgのCD24Fcの単回投与コホートの患者101−010及び480mgのCD24Fcの単回投与コホートの患者101−011は、両方とも、回復せず/消失せずと報告された膿疱性皮疹に罹患した。960mgのCD24Fcの複数回投与コホートの患者102−006は、介入継続と報告された上気道感染及びクロストリジウム・ディフィシレ大腸炎に罹患した。
大部分の感染症は、細菌性(CD24Fcの投与を受けた9人[50.0%]の患者及びプラセボの投与を受けた2人[33.3%]の患者)又はウイルス性(CD24Fcの投与を受けた7人[38.9%]の患者及びプラセボの投与を受けた1人[16.7%]の患者)であった。大部分の感染症は、血液(CD24Fcの投与を受けた8人[44.4%]の患者及びプラセボの投与を受けた1人[16.7%]の患者)、尿(CD24Fcの投与を受けた4人[22.2%]の患者、しかしプラセボの投与を受けた患者には発現しなかった)又は糞便(CD24Fcの投与を受けた2人[11.1%]の患者及びプラセボの投与を受けた2人[33.3%]の患者)に発現した。血液培養から回収された大部分の細菌は、一般的な皮膚常在性のもの及び低毒性病原体(すなわち、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌)であった。
表20に示されるように、CMV再活性化のリスクが高かったCD24Fc群における9人の患者がいた(HCT前のドナー/レシピエントのCMV状態:D+/R+、5人;D−/R+、3人;不明なD/R+、1人)。D+/R−のCD24Fc群における1人の患者には、CMV再活性化の中程度のリスクがあった。CD24Fc群における8人の患者は、低リスクであると考えられたD−/R−の状態を有した。2人のD−/R+患者が、高リスク群においてDay100でCMV再活性化の22.2%の累積発現率を示すDay42及びDay48におけるCMV再活性化を有した。両患者は、CMV再活性化の検出の前に全身性ステロイド治療を行った。比較的、プラセボ群における2人の患者が、CMV再活性化のリスクが高かった(D+/R+、1人;D/R+、1人)。プラセボ群における1人の患者が、急性GVHDに対する全身性ステロイド治療の前のDay47にCMV再活性化を発現した(高リスク群において50.0%)。
全体的に、CD24Fcは、フェーズIIa試験において忍容性は良好だった。注入関連毒性はなかった。インスリンで管理された高血糖の480mg群におけるCD24Fcに曝露された患者において、関連があるかもしれないグレードIII以上の薬物関連TEAEが1例あった。プラセボ群において用量制限毒性(DLT)が1例認められたが、CD24Fc群ではDLTは認められなかった。180日以内(CD24Fcの最後の投与の少なくとも150日後)に、CD24Fcが投与された患者に死亡に至る有害事象はなかった。プラセボ群において、Day48に対象の死亡に至った肺炎の有害事象が1例あった。CD24Fc群における1人の患者がHCTの7ヵ月後に死亡したが、この死亡は治験薬におそらく関連なしと決定された。抗薬物抗体(ADA)は、HCTの100日後までの任意の時点において、24人の患者のいずれにも検出されなかった。
グレードIII以上の最もよくみられるTEAE(>10%)は、血小板数減少(プラセボにおいて83.3%及びCD24Fcにおいて94.4%)、白血球数減少(プラセボにおける66.7%及びCD24Fcにおける88.9%)、好中球数減少(プラセボにおける50%及びCD24Fcにおける83.3%)、リンパ球数減少(プラセボにおける50%及びCD24Fcにおける77.8%)、貧血(プラセボにおける50%及びCD24Fcにおける66.7%)、口内炎(プラセボにおける83.3%及びCD24Fcにおける50%)及び悪心(プラセボにおける0%及びCD24Fcにおける11.1%)を含んだ。これらのSAEは、HCTにおいて用いられる骨髄破壊的前処置レジメンの知られた安全性プロファイルに一致している。
HCTのための骨髄破壊的前処置は、多くの場合、臓器不全を含む重度のレジメン関連毒性に関連する。臓器不全は、早期発症型移植関連死(TRM)又は非再発死(NRM)の最も頻度が高い原因である。18人の患者のCD24Fc群において、HCT後の最初の100日以内に患者の誰も死亡しなかったが、プラセボ群において、6人中で1人が呼吸器不全によりDay48に死亡した。
薬物動態の結果
図22〜図23は、フェーズ2a試験の3つの漸増コホートから得られたPKデータを示す。240mg及び480mgの単回投与コホートの半減期(図22)は、約14日であったが、それは健康対象において認められるデータに一致している。480mgにおいて、より高いcmxがあったが、ピークのGVHDの発現及び生着の時間である14日後に曝露の実質的な増加はなかった。最終的複数回投与コホートにおいて、期待されるようにDay60にかけて(患者が最もGVHDを発症しやすい期間)曝露が増加した(図23)。
図22〜図23は、フェーズ2a試験の3つの漸増コホートから得られたPKデータを示す。240mg及び480mgの単回投与コホートの半減期(図22)は、約14日であったが、それは健康対象において認められるデータに一致している。480mgにおいて、より高いcmxがあったが、ピークのGVHDの発現及び生着の時間である14日後に曝露の実質的な増加はなかった。最終的複数回投与コホートにおいて、期待されるようにDay60にかけて(患者が最もGVHDを発症しやすい期間)曝露が増加した(図23)。
表21は、単回投与コホートにおけるPK集団についてのCD24Fcの血漿中PKパラメータをまとめたものである。240mg及び480mgのCD24Fc単回投与コホートについて、それぞれ、幾何平均Cmax,−1d値は、52,145.41及び84,155.08ng/mLであり、幾何平均AUC0−last,−1d値は、10,156,549.9及び15,522,686.2ng h/mLであり、幾何平均AUC0−42d値は、9,275,562.3及び13,903,718.4ng h/mLであり、幾何平均AUC0−inf値は、10,383,503.9及び15,716,616.4ng h/mLであった。240mg及び480mgのCD24Fcの単回投与コホートの両方について、tmax,−1dの中央値は、2.10hであった。240mg及び480mgのCD24Fcの単回投与コホートについて、それぞれ、t1/2の平均値は、414.739h及び406.648hであり、λzの平均値は、0.0018h−1及び0.0017h−1であった。240mg及び480mgのCD24Fcの単回投与コホートについて、それぞれ、平均Vz値は、13.83L及び18.18Lであり、平均CL値は、0.024L/h及び0.031L/hであった。
表22は、Day−1、Day28、及びDay−1〜Day100における複数回投与コホートにおけるPK集団についてのCD24Fcの血漿中PKパラメータをまとめたものである。幾何平均Cmax,−1d値及びCmax,28d値は、960mgのCD24Fc複数回投与コホートについて、それぞれ96,942.71ng/mL及び62,563.05ng/mLであった。幾何平均AUC0−last,−1d、AUC0−14d、AUC0−100d及びAUC0−lastの全体的値は、960mgのCD24Fcの複数回投与コホートについて、それぞれ12,317,971.2ng h/mL、9,688,933.9ng h/mL、37,736,555.1ng h/mL及び37,363,953.5ng h/mLであった。tmax,−1d及びtmax,28dの中央値は、960mgのCD24Fcの複数回投与コホートについて、それぞれ2.13h及び2.52hであった。
フェーズIIa試験の臨床的エビデンスは、メトトレキセート及びタクロリムスと併用して投与されたCD24Fcが、重度のaGVHD(グレードIII〜IV)の可能性及び白血病再発の可能性の両方を低下させることによって骨髄破壊的アロHCTを受けている白血病患者の転帰を大きく向上させることを強く示唆する。上記のように、グレードIII〜IVのaGVHDの累積発現率は、プラセボコホート(生理食塩水+メトトレキセート及びタクロリムス)における16.7%及び同時対照コホート(メトトレキセート及びタクロリムス単独)における24%と比較して、CD24Fc曝露患者において5.6%である。これらのデータは、予防としてのメトトレキセート及びタクロリムスと併用したCD24Fcの投与が、非再発死のリスクの増加に関連するaGVHDの最も重篤なグレードであるHCT患者におけるグレードIII〜IVのaGVHDのリスクを低下させることを示唆する。低下の傾向は、CD24Fcの投与を受けなかった患者と比較して(プラセボ群(33.3%)及び同時対照(23%)の両方と比較して)、CD24Fc(11.1%)の投与を受けた患者における再発の発現率で認められるが、このことは、CD24Fcが、移植片のGVT効果に影響を及ぼさず、白血病再発のリスクを低下させる可能性もあることを示す。標準的GVHD予防レジメンにおいてCD24Fcを含むことの有益性は、プラセボ(16.7%)と比較してCD24Fc曝露患者(5.6%)におけるより良好なNRM、より良好な1.5年全生存率(89%対50%(CD24Fc対プラセボ対照))、グレードIII〜IVのaGVHDのRFSの統計学的に有意な改善(83%対33%(それぞれCD24Fc対プラセボ対照))、重度の粘膜炎の用量依存的抑制、及び上記試験で認められた薬物関連TEAE(グレードIII)が1例のみである良好な安全性プロファイル、によってさらに支持される。
aGVHD及び白血病再発の両方のリスクを低下させる予防剤は新規であり、骨髄破壊的前処置の後でアロHCTを受けている白血病患者にとって極めて有益である。上記のように、本出願における早期臨床データは、メトトレキセート及びタクロリムスと併用したCD24Fcの投与が、グレードIII〜IVのaGVHDの予防及び白血病再発の臨床的に重要な評価項目における既存の予防レジメンを超えた実質的改善を提供し、したがって、画期的治療薬のために適格であることを強く示唆する。上記臨床試験のフェーズIIa部分で認められたCD24Fcの効果は、骨髄破壊的前処置の後でアロHCTを受けている白血病患者におけるグレードIII〜IVのaGVHD及び白血病再発を抑制する際の予防的CD24Fc投与の有効性を確認するようにデザインされたフェーズIIb部分においてさらに検討されることになるであろう。
実施例6
再発を予防するためにCD24を使用可能である
フェーズIIA臨床試験データは、標準治療を受けたプラセボ対照と比較した場合、標準治療に加えたCD24Fcによる予防によって、白血病再発が3倍の低下することを示した。これらのデータは、CD24Fcが、移植片対白血病効果を維持するその能力に加えて、造血幹細胞移植(HCT)を受けた白血病患者における白血病再発を直接低下させることが可能であることを示唆する。
再発を予防するためにCD24を使用可能である
フェーズIIA臨床試験データは、標準治療を受けたプラセボ対照と比較した場合、標準治療に加えたCD24Fcによる予防によって、白血病再発が3倍の低下することを示した。これらのデータは、CD24Fcが、移植片対白血病効果を維持するその能力に加えて、造血幹細胞移植(HCT)を受けた白血病患者における白血病再発を直接低下させることが可能であることを示唆する。
白血病再発の潜在的機序は、白血病幹細胞の残存に起因する。John Dick及び同僚は、白血病モデルを用いて、約20年前、がん幹細胞(CSC)概念の復活を導いた[1]。白血病CSC活性は、インビトロCFUモデル及びインビボ異種移植モデルによってアッセイされた[1]。両モデルは、白血病薬物としての潜在的な治療的開発のための薬物を試験するためにも用いられた[2]。CD24Fcが白血病幹細胞活性に影響を及ぼす可能性があるかどうかを試験するための第1段階として、白血病細胞の自己複製及び産生を含む白血病幹細胞活性に対するCD24Fcの潜在的影響を評価するために、CFUアッセイを行った。
(実験プロトコル)
1.室温で、又は2〜8℃で一晩、完全MethoCult培地の瓶を解凍する。
2.1分間激しく振盪した後5分間静置し、使用前に最上部まで泡を上昇させる。
3.18ゲージBlunt−End Needleに取り付けられた3mL注射器を用いて、MethoCult培地を滅菌チューブ内に分注する。3つの培養物について、1つのチューブにつき4mLを分注する。
4.12ウェル培養平板を調製し、3〜4mLの滅菌水を上記ウェル間の空間に加える。
5.白血病細胞系試料を調製し、トリパンブルー染料を用いて生存細胞を計数する。
6.2%のFBS IMDMで、上記細胞及びCD24Fc/IgG Fcを、平板培養のために必要とされる終濃度の20倍に希釈する。
例:THP−1細胞については、平板培養終濃度は1ウェルにつき500〜1000個の細胞であり、1mL当たり1×104〜2×104個の細胞の細胞懸濁液を調製する。
7.各ウェルについて、1mLのMethoCult培地に、50μLの希釈された細胞と50μLの希釈されたCD24Fc又はIgG Fc対照とを加える。3通りのアッセイについて、事前に分注された4mLのMethoCult培地チューブに、0.2mLの希釈された細胞と0.2mLのCD24Fc又はIgG Fcとを加える。
注:細胞:培地のこの1:10の(v/v)比によって、正確な粘度が得られ、最適なCFU増殖及び形態が確保される。
8.上記チューブを10秒間ボルテックスして、内容物を完全に混合する。
9.5分間静置して、泡を最上部まで上昇させる。
10.滅菌3mL注射器に滅菌18のゲージBlunt−End Needleを取り付ける。細胞を含有するMethoCult混合物を培養平板内に分注する(1ウェルにつき1.1mL)。
11.上記平板を徐々に傾け、回転させることによって、表面にわたって均一に上記培地を分布させて、全ての側面上において皿の壁に培地を付着させる。
12.7〜14日間、95%以上の湿度の5%のCO2中において、37℃でインキュベートする。
13.高品質の倒立顕微鏡を用いてコロニーを計数する
1.室温で、又は2〜8℃で一晩、完全MethoCult培地の瓶を解凍する。
2.1分間激しく振盪した後5分間静置し、使用前に最上部まで泡を上昇させる。
3.18ゲージBlunt−End Needleに取り付けられた3mL注射器を用いて、MethoCult培地を滅菌チューブ内に分注する。3つの培養物について、1つのチューブにつき4mLを分注する。
4.12ウェル培養平板を調製し、3〜4mLの滅菌水を上記ウェル間の空間に加える。
5.白血病細胞系試料を調製し、トリパンブルー染料を用いて生存細胞を計数する。
6.2%のFBS IMDMで、上記細胞及びCD24Fc/IgG Fcを、平板培養のために必要とされる終濃度の20倍に希釈する。
例:THP−1細胞については、平板培養終濃度は1ウェルにつき500〜1000個の細胞であり、1mL当たり1×104〜2×104個の細胞の細胞懸濁液を調製する。
7.各ウェルについて、1mLのMethoCult培地に、50μLの希釈された細胞と50μLの希釈されたCD24Fc又はIgG Fc対照とを加える。3通りのアッセイについて、事前に分注された4mLのMethoCult培地チューブに、0.2mLの希釈された細胞と0.2mLのCD24Fc又はIgG Fcとを加える。
注:細胞:培地のこの1:10の(v/v)比によって、正確な粘度が得られ、最適なCFU増殖及び形態が確保される。
8.上記チューブを10秒間ボルテックスして、内容物を完全に混合する。
9.5分間静置して、泡を最上部まで上昇させる。
10.滅菌3mL注射器に滅菌18のゲージBlunt−End Needleを取り付ける。細胞を含有するMethoCult混合物を培養平板内に分注する(1ウェルにつき1.1mL)。
11.上記平板を徐々に傾け、回転させることによって、表面にわたって均一に上記培地を分布させて、全ての側面上において皿の壁に培地を付着させる。
12.7〜14日間、95%以上の湿度の5%のCO2中において、37℃でインキュベートする。
13.高品質の倒立顕微鏡を用いてコロニーを計数する
(再平板培養について):
1.コロニーを計数した後、4mLの2%のFBS IMDMを各ウェルに加えることによって、コロニーを含有する培地を希釈する。
2.各ウェルについて、総量で5mLの細胞懸濁液を15mLのチューブに移す。4℃で5分間、500gの遠心分離を行う。
3.慎重に上清を除去し、1mLの2%のFBS IMDMを加えて、上記細胞を再懸濁する。
4.各チューブについてトリパンブルー染料を用いて細胞計数を行う。
5.CFUアッセイにおける上記の同じ工程(工程6〜13)の後、CFUアッセイを始める。
1.コロニーを計数した後、4mLの2%のFBS IMDMを各ウェルに加えることによって、コロニーを含有する培地を希釈する。
2.各ウェルについて、総量で5mLの細胞懸濁液を15mLのチューブに移す。4℃で5分間、500gの遠心分離を行う。
3.慎重に上清を除去し、1mLの2%のFBS IMDMを加えて、上記細胞を再懸濁する。
4.各チューブについてトリパンブルー染料を用いて細胞計数を行う。
5.CFUアッセイにおける上記の同じ工程(工程6〜13)の後、CFUアッセイを始める。
(データ解析及び統計量)
5つの白血病細胞系のCFU活性を、1つのウェルにつき500〜100個の細胞から生成されたコロニーの数として表した。示されるデータは、平均値+/−標準誤差(SEM)である。
5つの白血病細胞系のCFU活性を、1つのウェルにつき500〜100個の細胞から生成されたコロニーの数として表した。示されるデータは、平均値+/−標準誤差(SEM)である。
連続的再平板培養によってCFU活性の自己複製をアッセイした。以下の式に基づいて決定されるように、前の回における白血病子孫細胞の累積数と500個の細胞当たりのCFUの数とに基づいて、各回における累積的CFUを算出した。
累積的CFU=(白血病細胞の累積数/500)×500個の細胞当たりのCFU
式中、白血病細胞の累積数は、以下によって決定される。
式中、白血病細胞の累積数は、以下によって決定される。
累積的白血病細胞数=(前の回の白血病細胞の数/500)×現在の回の白血病細胞の数
統計的有意性(P値)は、両側独立スチューデントt検定によって決定された。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
結果
1.CD24Fcは、複数の白血病細胞系のCFU活性を低下させる
インビトロにおける白血病幹細胞能力に対するCD24Fcの効果を決定するために、5つの白血病細胞系のCFUの数を、CD24Fc又は対照IgG Fcの存在下でそれらを培養した際に評価した。表12に示されるように、細胞系は、白血病の多様な群を含んだ。
1.CD24Fcは、複数の白血病細胞系のCFU活性を低下させる
インビトロにおける白血病幹細胞能力に対するCD24Fcの効果を決定するために、5つの白血病細胞系のCFUの数を、CD24Fc又は対照IgG Fcの存在下でそれらを培養した際に評価した。表12に示されるように、細胞系は、白血病の多様な群を含んだ。
1回目のCD24Fc治療又はIgG Fc治療の後で観測されたCFU数の平均値及び標準誤差を表13及び図24に示す。これらのデータは、IgG Fcと比較した場合、CD24Fcが、試験された全ての5つの細胞系のCFU数を有意に低下させたことを示す。
2.CD24Fcは、白血病CFU活性の自己複製を進行性に低下させる
白血病CSC自己複製に対するCD24の効果を検出するために、THP−1細胞の連続的再平板培養を行った。簡潔に言えば、CD24Fc治療平板又はIgG Fc治療平板のいずれかに由来するコロニーからTHP−1細胞を単離した。再度、500個のTHP1細胞を、合計で4回、同じ薬物の存在下で、メチルセルロース培地内で培養した。1回目の500個のTHP−1細胞から得られたCFUの数は、500個の細胞に由来するTHP−1 CFUの実数値であるが、後続の回については、前の回の500個の細胞当たりのCFUから白血病細胞の数に基づいて算出した。表14及び図25Aにおいて示されるこれらのデータは、CD24Fcで治療されたTHP−1細胞によって、CFU数が、進行性に、さらに減少することを示した。4回目までは、CD24Fc治療群におけるCFUの累積数は、IgG Fc治療群よりも11.6倍少ないCFUを有する。これらのデータは、CD24Fcが、白血病幹細胞活性の自己複製を進行性に低下させることを示唆する。また、図25Bに示されるように、CD24Fc治療群におけるコロニーは、著しく、より小さかった。
白血病CSC自己複製に対するCD24の効果を検出するために、THP−1細胞の連続的再平板培養を行った。簡潔に言えば、CD24Fc治療平板又はIgG Fc治療平板のいずれかに由来するコロニーからTHP−1細胞を単離した。再度、500個のTHP1細胞を、合計で4回、同じ薬物の存在下で、メチルセルロース培地内で培養した。1回目の500個のTHP−1細胞から得られたCFUの数は、500個の細胞に由来するTHP−1 CFUの実数値であるが、後続の回については、前の回の500個の細胞当たりのCFUから白血病細胞の数に基づいて算出した。表14及び図25Aにおいて示されるこれらのデータは、CD24Fcで治療されたTHP−1細胞によって、CFU数が、進行性に、さらに減少することを示した。4回目までは、CD24Fc治療群におけるCFUの累積数は、IgG Fc治療群よりも11.6倍少ないCFUを有する。これらのデータは、CD24Fcが、白血病幹細胞活性の自己複製を進行性に低下させることを示唆する。また、図25Bに示されるように、CD24Fc治療群におけるコロニーは、著しく、より小さかった。
3.CD24Fcは、連続的再平板培養の間、白血病子孫細胞の数を進行性に減少させる
上記コロニーにおける白血病細胞の数に対するCD24Fcの効果を検討するために、方法セクションで詳細に述べられるように、CFUアッセイの各回において1つのウェル当たりの白血病細胞の数を計数し、前の回における細胞数に基づいた累積収率を算出した。表15及び図26にデータを示す。コロニーの大きさ及び数の減少(図25)に対応して、CD24Fcは、4つの連続的再平板培養においてTHP−1細胞の細胞数を有意に減少させた。4回目までは、CD24Fc治療群における累積収率は、IgG Fc治療群よりも22倍低かった。
上記コロニーにおける白血病細胞の数に対するCD24Fcの効果を検討するために、方法セクションで詳細に述べられるように、CFUアッセイの各回において1つのウェル当たりの白血病細胞の数を計数し、前の回における細胞数に基づいた累積収率を算出した。表15及び図26にデータを示す。コロニーの大きさ及び数の減少(図25)に対応して、CD24Fcは、4つの連続的再平板培養においてTHP−1細胞の細胞数を有意に減少させた。4回目までは、CD24Fc治療群における累積収率は、IgG Fc治療群よりも22倍低かった。
結論
白血病再発は白血病幹細胞活性に起因していたので、5つの白血病細胞系について、コロニー形成単位(CFU)活性に対するCD24Fcの効果(白血病幹細胞活性のための代理アッセイ)を評価した。上記データは、CD24Fcが、試験された全ての細胞系のCFU活性を広範に阻害したことを示す。CD24Fcが白血病幹細胞の自己複製に影響を及ぼすかどうかを評価するために、白血病細胞系のうちの1つ(THP−1)の4回目の連続的再平板培養を行った。上記データは、4回目を超えると、CD24Fcが累積CFU数を約12倍減少させたことを示す。また、CD24Fc治療群におけるコロニーの大きさは、著しく、より小さかった。対応して、白血病細胞の累積収率は、CFU数の累積収率よりもさらに低下した。4回の再平板培養の後、白血病細胞収率の累積数は、CD24Fcによって約22倍減少した。合わせて、上記データは、CD24Fcが白血病幹細胞活性を抑制する可能性があることを示し、白血病HCT患者のフェーズIIA臨床試験において認められた白血病再発の低下についての、妥当と思われる説明を提供する。
白血病再発は白血病幹細胞活性に起因していたので、5つの白血病細胞系について、コロニー形成単位(CFU)活性に対するCD24Fcの効果(白血病幹細胞活性のための代理アッセイ)を評価した。上記データは、CD24Fcが、試験された全ての細胞系のCFU活性を広範に阻害したことを示す。CD24Fcが白血病幹細胞の自己複製に影響を及ぼすかどうかを評価するために、白血病細胞系のうちの1つ(THP−1)の4回目の連続的再平板培養を行った。上記データは、4回目を超えると、CD24Fcが累積CFU数を約12倍減少させたことを示す。また、CD24Fc治療群におけるコロニーの大きさは、著しく、より小さかった。対応して、白血病細胞の累積収率は、CFU数の累積収率よりもさらに低下した。4回の再平板培養の後、白血病細胞収率の累積数は、CD24Fcによって約22倍減少した。合わせて、上記データは、CD24Fcが白血病幹細胞活性を抑制する可能性があることを示し、白血病HCT患者のフェーズIIA臨床試験において認められた白血病再発の低下についての、妥当と思われる説明を提供する。
参考文献
1. Lapidot T,Sirard C,Vormoor J et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.Nature.1994.367:645−648.
1. Lapidot T,Sirard C,Vormoor J et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.Nature.1994.367:645−648.
2. Jin L,Hope KJ,Zhai Q et al.Targeting of CD44 eradicates human acute myeloid leukemic stem cells.Nat Med.2006.12:1167−1174.
3. Tsuchiya S,Yamabe M,Yamaguchi Y et al.Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP−1).Int J Cancer.1980.26:171−176.
4. Lozzio BB,Lozzio CB.Properties and usefulness of the original K−562 human myelogenous leukemia cell line. Leuk Res.1979.3:363−370.
5. Asou H,Tashiro S,Hamamoto K et al.Establishment of a human acute myeloid leukemia cell line (Kasumi−1)with 8;21 chromosome translocation.Blood.1991.77:2031−2036.
6. Lanotte M,Martin−Thouvenin V,Najman S et al.NB4,a maturation inducible cell line with t(15;17)marker isolated from a human acute promyelocytic leukemia(M3).Blood.1991.77:1080−1086.
7. Sundstrom C,Nilsson K.Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line(U−937).Int J Cancer.1976.17:565−577.
CD24は、白血病幹細胞活性を低下させる
本実施例は、C24が、白血病幹細胞活性を低下させることをさらに示す。同種造血幹細胞移植(HSCT)は、造血器悪性腫瘍に対する治癒的選択肢である。しかし、HSCT患者の約25〜30%は、1年以内に再発する。フェーズII臨床試験から得られたデータは、標準治療に加えてCD24Fcによって予防することによって、標準治療を受けたプラセボ対照と比較した場合、白血病再発が3倍の低下することを明らかにした。これらのデータは、CD24Fcが、移植片対白血病効果を保つその能力に加えて、白血病再発を直接低下させる可能性があることを示唆する。特に、12例のAML患者及びMDS患者のいずれも、8〜22ヵ月の全観測期間にわたって再発しなかったことが分かった。
本実施例は、C24が、白血病幹細胞活性を低下させることをさらに示す。同種造血幹細胞移植(HSCT)は、造血器悪性腫瘍に対する治癒的選択肢である。しかし、HSCT患者の約25〜30%は、1年以内に再発する。フェーズII臨床試験から得られたデータは、標準治療に加えてCD24Fcによって予防することによって、標準治療を受けたプラセボ対照と比較した場合、白血病再発が3倍の低下することを明らかにした。これらのデータは、CD24Fcが、移植片対白血病効果を保つその能力に加えて、白血病再発を直接低下させる可能性があることを示唆する。特に、12例のAML患者及びMDS患者のいずれも、8〜22ヵ月の全観測期間にわたって再発しなかったことが分かった。
白血病再発の潜在的機序は、白血病幹細胞の残存に起因する。John Dick及び同僚は、白血病モデルを用いて、約20年前、がん幹細胞(CSC)概念の復活を導いた。白血病CSC活性は、インビトロCFUモデル及びインビボ異種移植モデルによってアッセイされた。両モデルは、白血病薬物としての潜在的な治療的開発のための薬物を試験するためにも用いられた。CD24Fcが白血病幹細胞活性に影響を及ぼす可能性があるかどうかを試験するための第1段階として、白血病細胞の自己複製及び産生を含む白血病幹細胞活性に対するCD24Fcの潜在的影響を評価するために、CFUアッセイを行った。
CD24Fcは、複数の白血病細胞系のCFU活性を低下させる
インビトロにおける白血病幹細胞能力に対するCD24Fcの効果を決定するために、5つの白血病細胞系のCFUの数を、CD24Fc又は対照IgG Fcの存在下で上記細胞を培養した際に評価した。上記細胞系は、4つのAML細胞系(THP1、K562、Kasumi−1、NB4)及び組織球性リンパ腫細胞系U937を含む白血病の多様な群を含んだ。1回目のCD24Fc治療又はIgG Fc治療の後で観測されたCFU数の平均値及び標準誤差を図24に示す。これらのデータは、IgG Fcと比較した場合、CD24Fcが、試験された全ての5つの細胞系のCFU数を有意に低下させたことを示す。
インビトロにおける白血病幹細胞能力に対するCD24Fcの効果を決定するために、5つの白血病細胞系のCFUの数を、CD24Fc又は対照IgG Fcの存在下で上記細胞を培養した際に評価した。上記細胞系は、4つのAML細胞系(THP1、K562、Kasumi−1、NB4)及び組織球性リンパ腫細胞系U937を含む白血病の多様な群を含んだ。1回目のCD24Fc治療又はIgG Fc治療の後で観測されたCFU数の平均値及び標準誤差を図24に示す。これらのデータは、IgG Fcと比較した場合、CD24Fcが、試験された全ての5つの細胞系のCFU数を有意に低下させたことを示す。
CD24Fcは、白血病CFU活性の自己複製を進行性に低下させる
白血病CSC自己複製に対するCD24の効果を評価するために、THP−1細胞の連続的再平板培養を行った。簡潔に言えば、CD24Fc治療平板又はIgG Fc治療平板のいずれかに由来するコロニーからTHP−1細胞を単離した。再度、500個のTHP1細胞を、合計で4回、同じ薬物の存在下で、メチルセルロース培地内で培養した。1回目の500個のTHP−1細胞から得られたCFUの数は、500個の細胞に由来するTHP−1 CFUの実数値であるが、後続の回については、前の回の500個の細胞当たりのCFUから白血病細胞の数に基づいて算出した。図25Aにおいて示されるこれらのデータは、CD24Fcで治療されたTHP−1細胞によって、CFU数が、進行性に、さらに減少することを示した。4回目までは、CD24Fc治療群におけるCFUの累積数は、IgG Fc治療群よりも11.6倍少ないCFUを有する。これらのデータは、CD24Fcが、白血病幹細胞活性の自己複製を進行性に低下させることを示唆する。また、図25Bに示されるように、CD24Fc治療群におけるコロニーは、著しく、より小さかった。さらに、試験は、CD24の効果が6回の平板培養にわたって持続することを示した(図28)。
白血病CSC自己複製に対するCD24の効果を評価するために、THP−1細胞の連続的再平板培養を行った。簡潔に言えば、CD24Fc治療平板又はIgG Fc治療平板のいずれかに由来するコロニーからTHP−1細胞を単離した。再度、500個のTHP1細胞を、合計で4回、同じ薬物の存在下で、メチルセルロース培地内で培養した。1回目の500個のTHP−1細胞から得られたCFUの数は、500個の細胞に由来するTHP−1 CFUの実数値であるが、後続の回については、前の回の500個の細胞当たりのCFUから白血病細胞の数に基づいて算出した。図25Aにおいて示されるこれらのデータは、CD24Fcで治療されたTHP−1細胞によって、CFU数が、進行性に、さらに減少することを示した。4回目までは、CD24Fc治療群におけるCFUの累積数は、IgG Fc治療群よりも11.6倍少ないCFUを有する。これらのデータは、CD24Fcが、白血病幹細胞活性の自己複製を進行性に低下させることを示唆する。また、図25Bに示されるように、CD24Fc治療群におけるコロニーは、著しく、より小さかった。さらに、試験は、CD24の効果が6回の平板培養にわたって持続することを示した(図28)。
CD24Fcは、連続的再平板培養の間、白血病子孫細胞の数を進行性に減少させる
上記コロニーにおける白血病細胞の数に対するCD24Fcの効果を検討するために、方法セクションで詳細に述べられるように、CFUアッセイの各回において1つのウェル当たりの白血病細胞の数を計数し、前の回における細胞数に基づいて、累積収率を算出した。図26にデータを示す。コロニーの大きさ及び数の減少(図25)に対応して、CD24Fcは、4つの連続的再平板培養においてTHP−1細胞の細胞数を有意に減少させた。4回目までは、CD24Fc治療群における累積収率は、IgG Fc治療群よりも22倍低かった。
上記コロニーにおける白血病細胞の数に対するCD24Fcの効果を検討するために、方法セクションで詳細に述べられるように、CFUアッセイの各回において1つのウェル当たりの白血病細胞の数を計数し、前の回における細胞数に基づいて、累積収率を算出した。図26にデータを示す。コロニーの大きさ及び数の減少(図25)に対応して、CD24Fcは、4つの連続的再平板培養においてTHP−1細胞の細胞数を有意に減少させた。4回目までは、CD24Fc治療群における累積収率は、IgG Fc治療群よりも22倍低かった。
まとめると、これらのデータは、CD24Fcが複数の白血病細胞系のCFU活性を広範に低下させ、CD24FcがTHP−1白血病CFU活性の自己複製を低下させ、CD24Fcが連続的再平板培養の間にTHP−1の累積数を減少させることを示した。これらのデータは、以下で詳細に述べられるように、CD24Fcが白血病幹細胞活性に直接影響を及ぼす可能性があるという仮説の試験を促す。
CD24Fcによる原発性白血病細胞のCFU活性の低下
図24〜図26における確立されたAML及び他の白血病細胞系によるデータを実証するために、診療所からの原発性白血病分離株に対するCD24Fcの効果を試験した。5人のAML患者及び5人のCML患者の臨床分離株をメリーランド大学メディカルセンターで試験した。予備試験において示されるように、CFUアッセイにおける試料を評価した。図27に示されるように、全てがCFU活性の低下を示した。
図24〜図26における確立されたAML及び他の白血病細胞系によるデータを実証するために、診療所からの原発性白血病分離株に対するCD24Fcの効果を試験した。5人のAML患者及び5人のCML患者の臨床分離株をメリーランド大学メディカルセンターで試験した。予備試験において示されるように、CFUアッセイにおける試料を評価した。図27に示されるように、全てがCFU活性の低下を示した。
CD33は、THP1細胞におけるCFUのCD24Fc媒介低下の原因となる
THP1細胞における主要なSiglecは、CD33である。白血病幹細胞活性のCD24Fc媒介抑制についてのCD33の関連性を試験するために、Crispr−Cas9法を用いてCD33−/−THP1細胞を生成し、CD24Fcに対する応答についてWT細胞及びCD33−/−THP1細胞を比較した。WT THP1細胞が7日以内にCFUを形成するが、CD33−/−CFUが14日で視認可能となるので、それらのCFUを異なる時点で計数した。図29に示されるように、CD24FcはWTのCFU活性を進行性に低下させたが、CD33−/− THP1細胞はそうではなく、このことは、CFUアッセイによって分析されるように、CD33が幹細胞活性において重要な役割を果たすことを示す。
THP1細胞における主要なSiglecは、CD33である。白血病幹細胞活性のCD24Fc媒介抑制についてのCD33の関連性を試験するために、Crispr−Cas9法を用いてCD33−/−THP1細胞を生成し、CD24Fcに対する応答についてWT細胞及びCD33−/−THP1細胞を比較した。WT THP1細胞が7日以内にCFUを形成するが、CD33−/−CFUが14日で視認可能となるので、それらのCFUを異なる時点で計数した。図29に示されるように、CD24FcはWTのCFU活性を進行性に低下させたが、CD33−/− THP1細胞はそうではなく、このことは、CFUアッセイによって分析されるように、CD33が幹細胞活性において重要な役割を果たすことを示す。
Claims (46)
- がんの再発の予防又は治療を必要する対象におけるがんの再発を予防又は治療する方法であって、
前記対象にCD24タンパク質を投与することを含む、前記方法。 - がん幹細胞活性の低下を必要とする対象におけるがん幹細胞活性を低下させる方法であって、
前記対象にCD24タンパク質を投与することを含む、前記方法。 - 前記がん幹細胞が白血病がん幹細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記対象におけるがん幹細胞活性を低下させることによって、前記対象のがんの再発及び転移のうちの少なくとも1つが予防又は治療される、請求項2又は請求項3に記載の方法。
- 前記がんが、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、骨髄異形成症候群(MDS)又は慢性骨髄単球性白血病(CMML)である、請求項1〜請求項4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CD24タンパク質が、240mg又は480mgの用量で投与される、請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、造血幹細胞移植(HCT)をこれから受けるか、又は造血幹細胞移植(HCT)を既に受けた対象である、請求項1〜請求項6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CD24タンパク質が、HCTの前又は後に投与される、請求項7に記載の方法。
- 前記CD24タンパク質が、HCTの1日前に投与される、請求項8に記載の方法。
- 前記CD24タンパク質が2回以上投与される、請求項8又は請求項9に記載の方法。
- 前記CD24タンパク質が隔週で3回量で投与され、前記3回量には、HCTの前日分の量、HCTの後の14日目分の量、及びHCTの後の28日目分の量が含まれる、請求項10に記載の方法。
- 前記CD24タンパク質の前記量が、それぞれ、480mg、240mg及び240mgである、請求項11に記載の方法。
- 前記CD24タンパク質が、N末端又はC末端が哺乳類イムノグロブリン(Ig)タンパク質のFc領域と融合している成熟ヒトCD24ポリペプチドを含む、請求項1〜請求項12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記成熟ヒトCD24ポリペプチドが、配列番号1又は配列番号2に示される配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記Igタンパク質がヒトであり、前記Fc領域がIgG1、IgG2、IgG3、IgG4又はIgAのヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記Igタンパク質がヒトであり、前記Fc領域がIgMのヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメインを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記CD24タンパク質が、配列番号6、配列番号11又は配列番号12に示される配列を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記CD24タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号6、配列番号11又は配列番号12に示される配列からなる、請求項17に記載の方法。
- 前記CD24タンパク質が可溶性である、請求項1〜請求項18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CD24タンパク質がグリコシル化されている、請求項1〜請求項19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CD24タンパク質が、真核生物発現系を用いて調製されたものである、請求項1〜請求項20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真核生物発現系が、哺乳類細胞におけるベクターからの発現を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項22に記載の方法。
- 対象におけるがんの再発を予防又は治療するための薬物の製造におけるCD24タンパク質の使用。
- 対象におけるがん幹細胞活性を低下させるための薬物の製造におけるCD24タンパク質の使用。
- 前記がん幹細胞が白血病がん幹細胞である、請求項25に記載の使用。
- 前記対象におけるがん幹細胞活性を低下させることによって、前記対象のがんの再発及び転移のうちの少なくとも1つが予防又は治療される、請求項25又は請求項26に記載の使用。
- 前記がんが、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、骨髄異形成症候群(MDS)又は慢性骨髄単球性白血病(CMML)である、請求項24〜請求項27のいずれか一項に記載の使用。
- 前記CD24タンパク質が、240mg又は480mgの用量で投与される、請求項24〜請求項28のいずれか一項に記載の使用。
- 前記対象が、造血幹細胞移植(HCT)をこれから受けるか、又は造血幹細胞移植(HCT)を既に受けた対象である、請求項24〜請求項29のいずれか一項に記載の使用。
- 前記CD24タンパク質が、HCTの前又は後に投与される、請求項30に記載の使用。
- 前記CD24タンパク質が、HCTの1日前に投与される、請求項31に記載の使用。
- 前記CD24タンパク質が2回以上投与される、請求項31又は請求項32に記載の使用。
- 前記CD24タンパク質が隔週で3回量で投与され、前記3回量には、HCTの前日分の量、HCTの後の14日目分の量、及びHCTの後の28日目分の量が含まれる、請求項33に記載の使用。
- 前記CD24タンパク質の前記量が、それぞれ、480mg、240mg及び240mgである、請求項34に記載の使用。
- 前記CD24タンパク質が、N末端又はC末端が哺乳類イムノグロブリン(Ig)タンパク質のFc領域と融合している成熟ヒトCD24ポリペプチドを含む、請求項24〜請求項35のいずれか一項に記載の使用。
- 前記成熟ヒトCD24ポリペプチドが、配列番号1又は配列番号2に示される配列を含む、請求項36に記載の使用。
- 前記Igタンパク質がヒトであり、前記Fc領域がIgG1、IgG2、IgG3、IgG4又はIgAのヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む、請求項37に記載の使用。
- 前記Igタンパク質がヒトであり、前記Fc領域がIgMのヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメインを含む、請求項37に記載の使用。
- 前記CD24タンパク質が、配列番号6、配列番号11又は配列番号12に示される配列を含む、請求項38に記載の使用。
- 前記CD24タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号6、配列番号11又は配列番号12に示される配列からなる、請求項40に記載の使用。
- 前記CD24タンパク質が可溶性である、請求項24〜請求項41のいずれか一項に記載の使用。
- 前記CD24タンパク質がグリコシル化されている、請求項24〜請求項42のいずれか一項に記載の使用。
- 前記CD24タンパク質が、真核生物発現系を用いて調製されたものである、請求項24〜請求項43のいずれか一項に記載の使用。
- 前記真核生物発現系が、哺乳類細胞におけるベクターからの発現を含む、請求項44に記載の使用。
- 前記哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項45に記載の使用。
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