JP2017519049A - 免疫原性を低減するかまたは予防するためのヒト化コブラ毒因子の使用 - Google Patents

Abstract

本明細書における実施形態は、特に生物学的治療薬の投与の結果としての、補体枯渇や、望ましくない免疫原性または他の免疫関連応答の低減または予防に有用な、方法および、医薬製剤を含むｈＣＶＦ組成物に関する。このような方法および組成物は、同一対象に複数回の投与を行う間の補体枯渇に有効であるため、長時間／反復使用に有用であることが見出された。【選択図】図５

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年６月１２日に出願された、米国仮特許出願第６２／０１１，２３６の利益を主張し、その全体が記載されているかのように参照により本明細書に援用される。

発明の分野
本開示は、補体枯渇のための、ならびに免疫原性および他の望ましくない免疫応答を低減するかまたは予防するための組成物および方法に関する。

補体系は先天性免疫および適応免疫の両方で不可欠な成分である。しかしながら、補体は多くの疾患における病原因子でもある。治療上の補体阻害のための薬剤の開発は多くの研究者が熱心に研究する主題である。

生物療法剤はタンパク質またはタンパク質含有薬剤、例えば、組換えタンパク質、融合タンパク質、種々の供給源由来のモノクローナル抗体、ヒト、動物、植物、ウイルス、細菌、微生物および他の生命体由来の医薬品で構成される。

生物学的薬剤はまた新たな治療方法、例えば、改変されたまたは最小限に操作された細胞、例えば、単系統の細胞移植物、具体的には間葉系間質（幹）細胞、膵島細胞および肝細胞、ウイルス媒介物を用いる遺伝子治療、ならびに細胞またはタンパク質に基づく医療装置を含む、天然および非天然の両方のアミノ酸から組み立てられた他の治療を含む。

多くの生物療法剤は、ヒトおよび動物における様々な疾患または欠陥を治療するのに有効で安全であるが、望ましくない免疫原性を誘発する可能性があるため、前記生物療法剤を無効にするか、さもなければ有害事象、例えば、急性アナフィラキシーや自己免疫疾患を慢性的に引き起こす可能性がある。

多くの治療状況において、生物学的薬剤は、医師と患者に実質的な臨床上の課題を生じる可能性がある、望ましくない免疫原性、例えば、中和抗体やアナフィラキシーを誘導しうる。中和抗体は潜在的に効果的な生物療法剤を無効にする可能性がある。望ましくない免疫応答は生物療法剤を損なう可能性がある。アナフィラキシーは生命を脅かす可能性がある。したがって、生物療法剤に関連する免疫原性を予防するためのより効果的でかつ／またはより安全な方法が依然として必要とされている。

第一の態様において、本明細書の実施形態は、特に反復方式で、補体枯渇の方法および免疫原性の低減または予防のための方法を提供する。生物療法は前記療法の有効性を妨害する免疫応答を生じる可能性があるため、これはそのような療法中に特に望まれる。

したがって、実施形態は、潜在的に免疫原性の生物学的治療薬を投与する対象に治療的有効量のヒト化コブラ毒因子（ｈＣＶＦ）および生物学的治療薬を投与することにより前記対象における前記治療薬に対する免疫応答を低減するかまたは予防する方法を対象とし、前記方法によってｈＣＶＦ投与が前記対象の血中の補体値を低下させる。さらに、前記治療薬およびｈＣＶＦの投与は前記対象への第二のまたはその後の投与であり、前記免疫応答は前記第二のまたはその後の投与により低減されるかまたは予防される可能性がある。好ましくは、前記ｈＣＶＦは前記生物学的治療薬の投与前に投与される。

前記対象における補体値の枯渇は、時間の長さが異なることで影響を受ける可能性がある。したがって、例えば、補体値はｈＣＶＦ投与前の値に約１２時間〜２４時間以内、約５日間〜７日間以内に戻るか、または７日を超えて戻る可能性がある。さらに、ｈＣＶＦの投与経路は、臓器内、腔内、組織内への投与、静脈内、腹腔内、動脈内、および皮下投与の１つ以上から選択される可能性がある。

別の実施形態では、対象における望ましくない補体活性化に関連する状態または疾患を治療する方法が開示される。前記方法は前記対象に補体を枯渇させるのに十分な量でヒト化コブラ毒因子（ｈＣＶＦ）を投与することを含む。さらに、前記方法は前記対象への第二回目のまたはその後の（すなわち、反復方式での）前記ｈＣＶＦの投与を含みえ、各投与により補体の枯渇を伴う。このような状態または疾患には、例えば、血液凝固障害、関節リウマチ、加齢性黄斑変性症、発作性夜間血色素尿症、重症筋無力症、クローン病、心筋虚血、再潅流、心肺バイパス、移植、心筋梗塞、および血管形成が含まれる可能性がある。

また、対象における免疫原性の低減または予防におけるｈＣＶＦの使用は、各使用中に免疫原性が低減されるかまたは予防される効果を伴う前記対象における第二のまたはその後の使用を含み、補体を枯渇させるための医薬品の製造におけるｈＣＶＦの使用と共に意図され、前記医薬品は補体枯渇を必要とする対象における各使用中に補体の枯渇を伴う。

本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は以下の詳細な説明、図面および添付の特許請求の範囲を考慮してさらに理解される。

図１。Ｃ３、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｃおよびコブラ毒因子（ＣＶＦ）の鎖状構造の模式図。前記ＣＶＦのγ鎖およびβ鎖はＣ３ｃの対応するα’鎖断片よりも長い。

図２。ＣＶＦおよびＣ３ｃの結晶構造。上方パネルはＣＶＦ（２．２Å）およびＣ３ｃ（２．４Å）の三次元ドメイン構造を示す。下方パネルは概略的な線形ドメイン構造を示す。ここで留意すべきはＣＶＦに比べＣ３ｃにはＣＵＢドメインが存在しないことである。

図３。α−ガラクトシル化Ｌｅ^ｘ構造を表示するＣＶＦの主要なオリゴ糖鎖の構造。

図４。ＣＶＦによるインビボの補体枯渇。示すようにＣＶＦの単回投与でマウスへの腹腔内注射を行った。示した時間間隔で、血清中の溶血性補体活性を測定した。

図５。ヒト化ＣＶＦ（ｈＣＶＦ）タンパク質の鎖状構造の模式図。Ｎ末端は左側にある。ヒトＣ３およびＣＶＦとの鎖相同性を示す。

図６。組換えにより産生されたｈＣＶＦタンパク質の鎖状構造。Ｓ２細胞中で産生されたｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１５５０、ＨＣ３−１３４８、およびＨＣ３−１４９６とＣＨＯ細胞中で産生されたＨＣ３−１４９６の還元条件下でクマシー染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。Ｃ３とＣ３ｂの混合物を対照として示す。

図７。ｈＣＶＦの機能特性。上方パネル：Ｃ３切断活性。ｈＣＶＦタンパク質またはＣＶＦを用いて事前に形成された転換酵素による精製されたヒトＣ３の切断の時間経過を示す。中央パネル：ｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６によるインビトロの補体枯渇。ヒトおよびサルの血清の用量反応曲線を示す。下パネル：ｈＣＶＦタンパク質のＨ因子およびＩ因子による分解に対する部分的な耐性。精製ヒトＨおよびＩ因子とｈＣＶＦタンパク質を含む反応混合物の示された時間間隔で採取したアリコートのクマシー染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。ヒトＣ３ｂを対照として用いた。Ｃ３ｂおよびｈＣＶＦタンパク質のタンパク質分解はαおよびα’鎖の消失、および対応するα鎖断片の出現により実証される。ここで留意されるのは、Ｃ３ｂのＣ３α’鎖が急速に消失するのと対照的に、ｈＣＶＦタンパク質のα鎖およびα’鎖の両方の相当量が２時間のインキュベーション後でも依然として存在していることである。

図８。ｈＣＶＦタンパク質のＣ５切断活性の欠如。パネルＡ：いくつかのｈＣＶＦタンパク質を用いて事前に形成された精製ヒトＣ５、ＥＤＴＡ、および転換酵素を含むインキュベーション混合物の還元条件下でクマシー染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。天然ＣＶＦとｒＣＶＦは陽性対照として含まれ、Ｃ５α鎖の消失およびＣ５α’鎖の対応する出現を実証する。２つの左レーンは対照としての精製ヒト第８因子とＣ５を示す。パネルＢ：ＥＬＩＳＡによって測定される天然のＣＶＦまたはｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６を用いた補体枯渇によるインビトロのカニクイザル血清中のＣ５ａアナフィラトキシンの生成を示す。パネルＣおよびＤ：肺動脈に１，０００μｇ／ｋｇでｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６を注射した後のカニクイザルにおけるＣ３ａ（パネルＣ）およびＣ５ａアナフィラトキシン（パネルＤ）の生成を示す。アナフィラトキシンは示された時間間隔でＥＬＩＳＡを用いて測定した。Ｃ５ａ値は前記したアッセイの検出限界であり；ここで留意されるのは、２つのパネルのＹ軸のスケールが１，０００倍異なることである。

図９。ｈＣＶＦによるインビボの補体枯渇。ラットにおける２８０μｇ／ｋｇでのＨＣ３−１４９６の腹腔内注射後（上方パネル）およびカニクイザルにおける１，０００μｇ／ｋｇでのＨＣ３−１４９６の動脈内注射後（下方パネル）の補体枯渇の時間経過を示す。ここで留意されるのは、注射の数分以内の補体の急速な枯渇である。さらに留意されるのは、天然のＣＶＦによるより長い期間の補体枯渇である。

図１０。レーザー光凝固により誘導される加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）のマウスモデルにおけるｈＣＶＦを用いた補体枯渇の効果。上方パネルは、ＦＩＴＣ−デキストランの静脈内注射後０日目と８日目の眼底画像を示す。下方パネルは、組織病理学検査によって決定された２８日目での病変体積を示す。ここで留意されるのは、ＰＢＳ処置対照に比べｈＣＶＦ処置マウスおよびＣＶＦトランスジェニックマウスにおける有意に小さい病変である。

図１１。胃腸虚血再潅流傷害のマウスモデルにおけるｈＣＶＦを用いた補体枯渇の効果。ｈＣＶＦで処置された動物と対照動物における虚血後の血清中のＦＩＴＣ結合デキストランの濃度を示す。ここで留意されるのは、補体枯渇マウスにおけるＦＩＴＣデキストランの大幅に低下した濃度であり、前記腸再潅流傷害の程度が有意に減少したことが示される。

図１２。心筋虚血再潅流傷害のマウスモデルにおけるｈＣＶＦを用いた補体枯渇の効果。上方パネルはＣ３ｂ沈着に関する免疫組織化学染色後の顕微鏡画像を示す。左下方パネルは、リスク領域の割合としての梗塞領域の大きさを示す。右下方の右側パネルは、心エコー検査によって決定される左心室機能の指標としての内径短縮率を示す。

図１３。人工呼吸器誘発肺傷害（ＶＩＬＩ）のマウスモデルにおけるｈＣＶＦを用いた補体枯渇の効果。上方パネルはＣ３ｂ沈着に関する免疫組織化学染色後の顕微鏡画像を示す。白矢印はＣ３ｂ陽性細胞を示す。下方パネルはＣ３ｂ陽性細胞の定量分析を示す。

図１４。コラーゲン誘導性関節炎のマウスモデルにおけるｈＣＶＦを用いた補体枯渇の効果。コラーゲンを用いた追加免疫から６日後にｈＣＶＦでの処置を開始したマウスにおける直径（後足、前足、および足首）の合計を示す。

図１５。実験的自己免疫性重症筋無力症（ＥＡＭＧ）のマウスモデルにおけるｈＣＶＦを用いた補体枯渇の効果。ここで留意されるのは、ｈＣＶＦで処置した動物において握力が免疫前のレベルに戻ることである。

図１６。リンパ腫の同系遺伝マウスモデルにおけるモノクローナル抗体療法の治療効果に関するｈＣＶＦを用いた補体枯渇の効果。ここで留意されるのは、ｈＣＶＦを用いた補体枯渇によりリンパ腫担持マウスの８０％生存が得られたことである。

図１７。カニクイザルにおける肺機能および心機能についてのｈＣＶＦを用いた補体枯渇の効果。補体枯渇は２５０μｇ／ｋｇでｈＣＶＦを用いて肺動脈に動脈注射することによって誘導された。連続的にモニターした生理肺周囲、血圧および心拍数を示す。ここで留意されるのは、肺機能および心機能の両方で変化が全くないことである。

図１８。正常コブラ血漿（ＮＣＰ）および精製ＣＶＦにおけるコブラＣ３と抗ＣＶＦ抗血清との免疫学的交差反応のオクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｉｏｎｙ）分析が示される。ここで留意されるのは、優性突出部（ｓｐｕｒ）と同様にコブラＣ３と抗ＣＶＦとの強い交差反応であり、コブラＣ３上に存在しないＣＶＦ上の重要な抗原の存在が示される。

図１９。ｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１５５０およびＨＣ３−１３４８の三次元構造のインシリカ予測。上方パネルはＨＣ３−１３４８の予測構造が重ね合わされたヒトＣ３のＸ線結晶構造を示す。中央パネルは上方パネルからのＣ３４５Ｃとアンカー・ドメインの拡大図である。下パネルはＣ３４５Ｃとアンカー・ドメインにおける、ヒトＣ３のＸ線結晶構造にＨＣ３−１４９８およびＨＣ３−１５５０の予測構造を同時に重ね合わせたものを示す。ここで留意されるのは、３つのタンパク質全ての実質的に同一な構造である。

参照による援用
米国特許第８，６３２，７８０およびこの明細書に記載された全ての他の刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照により援用されることが示されていたように、本明細書に同程度に、参照として援用される。

読者の便宜上、本明細書で使用される用語の以下の定義を示す。

本明細書で用いられる「生物療法剤」および「生物学的治療用剤」という用語は、治療またはインビボ診断の目的に適した任意の生物学的材料を指す。生物学的治療用剤には、ペプチド、タンパク質、抗体、アプタマー、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ウイルスおよび細菌が含まれる。生物学的治療用剤には、薬物療法剤、細胞療法剤、および生物学的な医療機器を含む、生物学的供給源中で製造されたかもしくは生物学的供給源から抽出された、または生命体の成分、例えば、タンパク質、核酸、糖質、もしくはオリゴ糖、またはそれらの任意の組み合わせから操作された医薬品が含まれる。例示的なタンパク質の生物学的治療用剤には、これらに限定されないが、成長因子、酵素、サイトカイン、ペプチドホルモン、サイトカイン・トラップおよび抗体が含まれる。

「免疫原性」とは、免疫系の体液性または細胞性応答を誘導する特定の物質の能力を意味する。

「望ましくない免疫原性」とは、患者が物質、例えば、治療用タンパク質産物に対して望ましくない免疫応答を開始する場合を意味する。また、望ましくない免疫原性は前記治療用タンパク質産物の生物活性を中和する抗体の産生を指し、前記産生により、前記治療用タンパク質産物の有効性を阻害することによってのみならず、内因性タンパク質の対応部分と交差反応しかつ治療物質または免疫学に基づく有害事象に対してその生理的機能を中和する抗体の喪失をもたらすことによって、有害事象がもたらされる可能性がある。免疫学に基づく有害事象には、これらに限定されないが、アナフィラキシー、自己免疫疾患、サイトカイン放出症候群、および重篤な機能を仲介する内因性タンパク質の交差反応性中和が含まれる。

本明細書で提供される方法は補体を枯渇させ、補体活性化古典経路および補体活性化副経路を阻害することに関する。具体的には、本発明は疾患の治療および予防におけるコブラ毒因子に由来する補体阻害剤の使用に関する。より具体的には、組換え治療用タンパク質または生物学的治療用剤を反復方式で患者に投与しても、前記組換え治療用タンパク質または他の生物学的治療用剤に対する免疫応答を減弱化するかまたは阻害するこのような補体阻害剤の使用が本明細書において提供される。これらの方法および組成物は、特定の免疫調節を目的とする生物療法剤により、生物療法剤が引き起こす望ましくない免疫原性を予防することができるという発見、そして理論的に免疫原性である可能性があるコブラとヒトのアミノ酸配列から構成される組換えタンパク質が相対するかつ有益な効果を有し、ヒトおよび哺乳類の生物療法剤の望ましくない免疫原性を予防することができるという発見に少なくとも部分的に基づく。

コブラ毒はコブラ毒因子（ＣＶＦ）と呼ばれるヒト補体３（Ｃ３）タンパク質の構造的および機能的類似体を含む。ＣＶＦは結果的に枯渇をもたらす消耗的な活性化の機序を介して作用する補体阻害剤である。ＣＶＦはしばしば他の薬物の抗補体活性を評価するための標準として使用される。ＣＶＦはこの強力な抗補体活性を示すが、その免疫原性に起因してヒトへの用途には適さない。組成分析により、ＣＶＦは１分子当たり３つのＮ結合オリゴ糖鎖を含有し、２つがα鎖内に、１つがβ鎖内にあることが明らかとなった（ゴウダら（Gowda et al.）, J. Immunol. 152:2977-86(1994)）。糖質部分はＣＶＦの機能に関与しないが、ＣＶＦのオリゴ糖鎖は固有の末端α−ガラクトシル化ルイスｘ（Ｌｅ^ｘ）抗原構造を含むことが発見された（ゴウダら(Gowda et al.), Mol. Immunol. 29:335-442(1992)）。

したがって、第一の態様では、対象に治療用生物製剤を投与することから生じる、前記対象における望ましくない免疫原性を予防するかまたは減弱化する方法が本明細書で提供される。本明細書で提供される方法によれば、生物学的治療用剤の投与に際し望ましくない免疫応答が惹起されるのを低減するかまたは予防するために免疫調節剤が前記対象に投与される。特定の場合において、前記免疫調節剤は組換えタンパク質である。好ましくは、前記免疫調節タンパク質はヒト化コブラ毒因子（ｈＣＶＦ）組み換えまたは融合タンパク質である。組換えまたは融合ヒト化コブラ毒因子（ｈＣＶＦ）は免疫原性を実質的に欠いているだけでなく、補体枯渇活性を有している。

任意の適切なｈＣＶＦ組換えまたは融合タンパク質は、本明細書で提供される方法のために使用することができる。本明細書に記載されるように、免疫調節剤としての使用に適したｈＣＶＦポリペプチドは、実質的に非免疫原性でありかつＣ５切断活性を実質的に欠いている。例示的なｈＣＶＦポリペプチドには、これらに限定されないが、ＨＣ３−１４９６、ＨＣ３−１５５０ｂ、およびＨＣ３−１３４８が含まれる。好ましくは、前記免疫調節剤はＨＣ３−１４９６である。

好ましい実施形態の免疫原性は低いままか残存せず、ヒトＣ３の免疫原性に相当する。本明細書で使用されるように、「実質的に非免疫原性」および「実質的に免疫原性を欠いている」とは、ｈＣＶＦが約７５％の非免疫原性から約１００％の非免疫原性である可能性を意味し、これらに限定されないが、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％が含まれる。

ある場合には、前記免疫調節剤は補体枯渇剤でもある。前記免疫調節剤は長時間作用性または短時間作用性の補体枯渇剤である可能性がある。例えば、本明細書で提供される特定のｈＣＶＦポリペプチドは短時間作用性の補体枯渇活性を示すが、ある場合には、前記免疫調節剤が投与された対象における補体値は投与後１２〜１６８時間以内に投与前の値に戻る。

補体病因によって特徴付けられるまたは補体病因と関連する疾患または状態を治療するかまたは予防するための方法が本明細書で提供される。生物学的薬剤の反復投与は前記生物学的薬剤が投与される対象において免疫応答を惹起することと関連付けることができる。治療用タンパク質産物または構造的に類似したタンパク質への曝露前に、ベースラインで既存の抗体がもたらされている可能性がある。これは、代替産物、例えば凝固因子または酵素補充療法剤が投与される患者で、類似産物と交差反応しうる旧産物に対する抗体を有しうる患者にとって特に関心事である。例えば、凝固第ＶＩＩＩ因子（ファクターＶＩＩＩ）の量が十分にない人々、または第ＶＩＩＩ因子に何らかの欠陥がある人々は、血液凝固に欠陥があり、過剰な出血につながる疾患である、血友病Ａに罹っている。血友病Ａの治療法はないが、第ＶＩＩＩ因子の治療用タンパク質の注入によりそのような慢性疾患をうまく管理することができる。ただ残念ながら、注入された第ＶＩＩＩ因子に対する抗薬剤抗体の生成がこの戦略の重大な障害となっている。免疫応答を発症する患者の治療はより複雑であり、効果が低くさらに極めて高価である。

有利には、本明細書で提供される前記方法は、置換因子に対する阻害抗体を生成するかまたは生成することが予測されるこれらの対象に対しての生物学的治療用剤、例えば凝固第ＶＩＩＩ因子の反復（第二のまたはそれ後の）投与を可能する。任意の特定の理論に拘束されることなく、ヒト化ＣＶＦの補体枯渇活性は、前記生物学的治療用剤に対する抗体（例えば、抗凝固因子抗体）の産生を抑制するかまたは防止すると考えられる。

本明細書で提供される方法に従った補体枯渇は、局所的または全身的でありうる。局所治療は、所望の効果に応じて、補体の枯渇または補体の活性化の結果を生じる多くの方法で達成することができる。一実施形態では、免疫調節剤を臓器、組織、空洞、または皮内に局所的に投与する場合、局所枯渇が達成される。これにより、前記の領域における補体の一時的かつ完全な枯渇がもたらされる。あるいは、補体の局所活性化は、前記免疫調節剤へ化学的に結合した場合、その領域に補体の継続的な活性化を引き起こすために、特定の組織、疾患、または感染細胞に前記免疫調節剤を局在化させることができる特異的なモノクローナル抗体を使用することができる。他の実施形態では、前記抗体は組換えＤＮＡ技術を用いて前記免疫調節剤に結合させることができる。

免疫調節剤を全身的に、例えば、静脈内または腹腔内に投与する場合、全身的な補体枯渇が達成される。これにより、全身的に補体の一時的かつ完全な枯渇がもたらされる。この方法は、再潅流傷害、冠状動脈性心臓手術、移植、および／または全身性疾患、特に再発または間欠性活動の間に使用することができる。

ヒト化ＣＶＦを投与する任意の適切な経路は、本明細書で提供される方法に従って使用することができる。一般的に、投与の皮内、皮下、および吸入経路は筋肉内および静脈内（ｉ．ｖ．）経路に比べて免疫原性の増大と関連する。前記静脈内経路は一般的に免疫応答を誘発する可能性が最も低いと考えられる。

本明細書で提供される方法によれば、本明細書で提供される免疫調節剤は、生物学的薬剤であり、免疫応答を付与することが可能な任意の生物に投与される。ある場合では、前記生物は脊椎動物、例えば、哺乳動物（例えば、霊長類）または鳥類である。本明細書に記載される組成物および方法のための例示的な生物には、これらに限定されないが、ヒトおよび非ヒト霊長類、家畜、牧畜、鳥類が含まれる。

前記実施形態は一定の方法および材料を参照してかなり詳細に記載されるが、例示を目的とし限定を目的とせず提示されている記載された実施形態以外によって本明細書の開示を実施できることを当業者は理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本明細書に含まれる実施形態の記載に限定されるべきではない。

実施例１――ヒト化ヘビ毒融合タンパク質による治療用生物製剤に対する免疫原性の阻害
ヒト化コブラ毒因子融合タンパク質ＨＣ３−１４９６を４回投与、４週間にわたって週に一回、各投与は治療用第ＶＩＩＩ因子の投与前に第ＶＩＩＩ因子欠損マウスへ注射した。望ましくない免疫原性応答は、対照マウスと比べて抗第ＶＩＩＩ因子ＩｇＧおよび阻害剤力価において有意な減少によって測定されたように、４週間にわたって生じなかった（ｐ＜０．０００１）。また、望ましくない免疫原性応答はＨＣ３−１４９６の投与から生じなかった。

実施例２――血友病Ａにおける治療用ＦＶＩＩＩに対する免疫応答への補体の寄与
序論。血友病Ａは凝固因子（ＦＶＩＩＩ）の欠乏による出血性疾患である。補充療法は治療用ＦＶＩＩＩの投与からなる。５〜３０％の症例で、ＦＶＩＩＩ注射により、治療用ＦＶＩＩＩの凝固促進活性を阻害する抗ＦＶＩＩＩ抗体の出現がもたらされる。

目的。本発明者らは血友病Ａにおける治療用ＦＶＩＩＩに対する免疫応答への補体の寄与を検討した。

方法。治療用ＦＶＩＩＩの投与前に、４週間にわたって週一回、ヒト化コブラ毒因子を使用してＦＶＩＩＩ欠損マウスにおいて補体を枯渇させた。抗ＦＶＩＩＩ ＩｇＧおよび阻害剤力価は、それぞれＥＬＩＳＡおよびＦＶＩＩＩ凝固促進発色性アッセイによって測定された。未成熟単球由来ＤＣ（ｉＭｏ−ＤＣ）によるＦＶＩＩＩエンドサイトーシスおよびＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマへのＦＶＩＩＩ提示に対する補体効果を検討した。

結果。ＦＶＩＩＩ欠損マウスにおける補体枯渇は、抗ＦＶＩＩＩ ＩｇＧおよび阻害剤力価において対照マウスと比較して有意に減少した（ｐ＜０．０００１）。補体枯渇は血清中のＣ３の測定によって検証された。ＦＶＩＩＩはＣ１ｑと結合することが見出された。本発明者らの結果により、補体はｉＭｏ−ＤＣによるＦＶＩＩＩエンドサイトーシスに寄与することが示される。前記エンドサイトーシスはＣ１ｑおよびＣ３枯渇化血清で正常血清と比較して減少した（それぞれ、Ｐ＝０．００６およびＰ＝０．００９）。ＦＶＩＩＩエンドサイトーシスはＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマに対するＦＶＩＩＩ提示と相関した。また、Ｃ１ｑと共にＦＶＩＩＩの事前インキュベーションにより、用量依存的にＣＤ４＋Ｔ細胞へのＦＶＩＩＩ提示は増強された。

結論。本発明者らの結果により、ヒト化コブラ毒因子を使用した補体枯渇は治療用ＦＶＩＩＩに対する免疫応答を減少させることが示される。また、Ｃ１ｑおよびＣ３によるＦＶＩＩＩのオプソニン作用はｉＭｏ−ＤＣによるＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスおよびＣＤ４＋Ｔリンパ球へのその提示を増強する。

実施例３――ヒト化コブラ毒因子は天然のＣＶＦと比較してマウスにおける免疫原性の実質的な欠如を示す
血友病Ａのマウスモデル（第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウス）において、本発明者らは、最大３０％の血友病患者における臨床的に関連した問題である、第ＶＩＩＩ因子に対する免疫応答における補体の役割を調べるためにコブラ毒因子（ＣＶＦ）を使用し補体を枯渇させた。本発明者らはＣＶＦの週一回の注射を使用した。予想通り、ＣＶＦの初回の注射は血清Ｃ３の本質的に完全な除去を得たのに対し、二回目の注射から血清Ｃ３値の低下が著しく損なわれ始めた。４週目で、ＣＶＦ注射は２匹のマウスにのみ中等度のＣ３の減少をもたらし、大多数のマウスでは効果が得られなかった。本発明者らは、その後、補体枯渇のためにヒト化ＣＶＦ（ｈＣＶＦ）タンパク質ＨＣ３−１４９６、ＣＶＦ様の機能を有するヒトＣ３誘導体を使用した。ＨＣ３−１４９６はヒトＣ３と９４％の配列同一性および９６％の配列類似性を示す。ｈＣＶＦは、４週でも血清Ｃ３の効果的な減少をもたらし、任意の機能的に関連する免疫応答の欠如が示唆された。マウスにおけるｈＣＶＦのより低い免疫原性は、おそらくＣＶＦ（５２％）と比較してマウスＣ３とヒトＣ３の間のより高いアミノ酸配列同一性（７７％）の結果であると考えられる。また、組換えにより産生されたｈＣＶＦは免疫原性である可能性が高いＣＶＦの独自のコブラオリゴ糖鎖を欠く。これに伴い、本発明者らはｈＣＶＦの免疫原性がヒトにおいて減少していることを予測する。

本発明者らは明らかに異なる治療アプローチ：阻害よりもむしろ補体枯渇を開発した。本アプローチは、安全に補体を枯渇させることが知られているＣ３類似体である、コブラ毒因子（ＣＶＦ）に基づいている。ＣＶＦとＣ３の構造／機能関係の知識を利用して、本発明者らは、ヒト化ＣＶＦ（ｈＣＶＦ）と呼ぶ、補体を枯渇させるＣＶＦ様活性を示すヒトＣ３の誘導体を創出した。以下のセクションで、本発明者らはＣ５を切断しない重要な特性を含む、ｈＣＶＦの構造および活性について記載した。

補体病変を伴う９つの前臨床モデル疾患における治療を目的とする補体枯渇のためのｈＣＶＦの有効性は、血友病Ａにおける再潅流傷害、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、および第ＶＩＩＩ因子の免疫原性を含めて、検討される。補体枯渇は、霊長類の肺動脈への動脈内注入後でも、毒性がないことを特徴とする。免疫原性は全く観察されなかった。

使用される略語：ＣＶＦ、コブラ毒因子；ｒＣＶＦ、組換えＣＶＦ；ｈＣＶＦ、ヒト化ＣＶＦ；ＭＡＣ、膜攻撃複合体；ＰＮＨ、発作性夜間血色素尿症；ＭＩ／ＲＩ、心筋虚血再潅流傷害；ＧＩ／ＲＩ、胃腸虚血再潅流傷害；ＡＭＤ、加齢性黄斑変性症；ＥＡＭＧ、実験的自己免疫症重症筋無力症；ＡＣｈＲ、アセチルコリン受容体；ａＨＵＳ、非典型溶血性尿毒症症候群；ＮＣＰ、正常コブラ血漿。

絶滅のおそれのある野生動植物の種の国際取引に関する条約（ＣＩＴＥＳ）についての情報はワールドワイドウェブcities.orgで入手できる。

ｈＣＶＦタンパク質の命名：ｈＣＶＦタンパク質の名前に付けられた番号（例えば、ＨＣ３−１４９６）はＣＶＦ配列で置換された最初のアミノ酸残基であり、ヒトＣ３プレプロタンパク質の番号付けを用いている。

１．序論
補体系は免疫系の一部であり、先天性および適応免疫の両方において重要な機能を有する。しかしながら、補体系はさらに多くの疾患の病因において重要な役割を果たし、疾患過程および組織傷害に単独でまたは有意に寄与する。表１に選択された疾患を確認された補体病因と共に示す。多くの疾患の病因におけるその役割に起因して、過去２０年間で補体カスケードに干渉するか補体カスケードを変調させるための薬剤を開発する多数のアプローチが見られた。大小の、これらの抗補体剤は２つの概念的に異なるカテゴリーにグループ分けできる。阻害剤の１グループは特異的な補体成分を狙い、その活性化を阻害することになる。このような例として、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）および非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の治療に関して承認された、その活性化を予防し、結果的に膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の形成を防ぎ次の組織損傷を予防することになるＣ５に対するヒト化抗体が挙げられる。補体阻害剤の別の例示としては、Ｃ３と結合し、その後のその活性化を予防するサイクリックβ残基ペプチドである、コンプスタチンが挙げられる。補体阻害剤の第二のグループは補体成分の活性化を予防しないが活性化された補体成分の作用を阻害する薬剤によって表される。このような例として、Ｃ５ａの炎症促進活性を阻害するように設計されたＣ５ａ受容体に対する拮抗剤が挙げられる。別の例は補体受容体２（ＣＲ２）由来のＣ３ｄ結合ドメイン（ＣＣＰ１−４）を伴うヒトＨ因子の調節ドメイン（ＣＣＰ１−５）からなるキメラタンパク質である。このキメラタンパク質は補体活性化を持続する部位を標的とし、Ｃ３ｂを不活性化することによりさらに補体活性化を阻害する。これらのアプローチは、補体病因を有する複数の疾患モデルにおいて有望な結果を示す。

本発明者らは補体成分またはその活性化断片のいずれの阻害にも基づかず補体枯渇に基づいた第三の全く異なったアプローチを開発した。本発明者らの概念は、コブラの独自の毒成分である、コブラ毒因子（ＣＶＦ）に基づく。以下に記載するように、ＣＶＦは、安定なＣ３／Ｃ５転換酵素を形成しかつ調節補体タンパク質に対する耐性を示す補体成分Ｃ３の構造的および機能的類似体であり、補体活性化の消耗をもたらし、その結果、補体枯渇をもたらす。ＣＶＦは補体枯渇のための実験動物に安全に投与できることが示されて以来、ＣＶＦはその生物学的機能と疾患の病因の両方における補体の役割を研究するための重要な研究ツールとなっている。補体枯渇動物と通常の（補体が十分な）動物を比較することにより、生理学的および病理学的状況における補体の関与を明らかにすることができた。また、多くの疾患の病因における補体の関与が、ＣＶＦを用いたそれらの補体が枯渇された動物を使用して初めて認識された。さらにＣＶＦは他の補体阻害剤の有効性を比較するためのゴールドスタンダードとしても用いられている。ここで、本発明者らは、補体病因を伴う疾患および臨床状態を治療するための新規な治療アプローチとしてＣＶＦの補体枯渇機能を有するヒトＣ３誘導体（集合的に、ヒト化ＣＶＦ（ｈＣＶＦ）と呼ぶ）を創出するための本発明者らの研究と共に、ＣＶＦの構造および機能ならびに補体成分Ｃ３とのその相同性について記載する。

２．コブラ毒因子
ＣＶＦはコブラの毒における補体活性化タンパク質である。より最近の研究により、コブラ属および他のコブラ科のヘビ（例えば、キングコブラ属、オーストラリアカパーヘッド属）の、おそらく全てのメンバーがそれらの毒中にＣＶＦを生産することが確立されたのに対して、以前の研究の大部分はインドコブラ（ナジャ・ナジャ）または緊密に関連するアジアコブラ種（ナジャ・コウシア（ｋａｏｕｔｈｉａ））から単離されたＣＶＦに基づいている。ＣＶＦは補体成分Ｃ３の構造的および機能的類似体である。

図１はＣ３、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｃ、およびＣＶＦの概略的な鎖状構造を示す。ＣＶＦは、哺乳動物および他の脊椎動物種由来のＣ３とのＤＮＡとタンパク質レベルの両方で高度な配列相同性を示し；コブラ由来のＣ３とのその相同性は９０％を超える。Ｃ３と同様に、ＣＶＦはその後成熟した三鎖タンパク質へと処理される単鎖プレプロタンパク質として合成される。Ｃ３およびＣＶＦの遺伝子は本質的に同一のエクソン／イントロン構造を伴い高度な相同性を示す。Ｃ３の対応する鎖とのＣＶＦの３つの鎖の相同性はアミノ酸相同性および免疫学的交差反応性によってのみならず、最近になって結晶構造によっても確立されている。Ｃ３とＣＶＦの三次元構造は同一ドメインを示す。前記した三鎖ＣＶＦは生理学的な三鎖分解産物Ｃ３ｃに類似するが、それは１つの重要な態様において異なる。Ｃ３ｃとは対照的に、ＣＶＦはＢ因子結合および転換酵素形成に関して重要であることが示されている無傷のＣＵＢドメインを含む（図２）。糖タンパク質である、ＣＶＦはＮ−結合オリゴ糖鎖に関して３つのグリコシル化部位を有し、そのうちの２つはα鎖中にあり、１つはβ鎖中にある。ＣＶＦの全体的な糖質含有量は７．４％（ｗ／ｗ）であり、ヒトＣ３（１．７％）および他の哺乳動物Ｃ３種の糖質含有量より有意に高い。本発明者らはその非還元末端における独自のα−ガラクトシル化Ｌｅ^ｘ構造を伴う対称フコシル化二分岐複合体型鎖である主要なオリゴ糖鎖を伴う、ＣＶＦの糖質鎖の構造を広範囲に特徴付けた（図３）。しかしながら、ＣＶＦのグリコシル化は部分的または完全な脱グリコシル化としてその生物学的活性のために必要とされていないだけでなく、糖質鎖への電荷の導入により機能的な結果はもたらされない。しかしながら、抗原としての観点から独特なオリゴ糖鎖はおそらくＣＶＦの免疫原性に寄与する可能性がある（以下のセクション４．３参照）。

ＣＶＦとＣ３の間の広範な構造上の相同性は機能的な相同性と同等である。Ｃ３ｂと同様に、ＣＶＦはＭｇ^２＋イオンの存在下でＢ因子と結合する。Ｃ３ｂ，Ｂ複合体と同じく、ＣＶＦ，Ｂ複合体は、活性化ペプチドＢａを放出し、二分子複合体ＣＶＦ，Ｂｂを生成する、Ｂ因子を切断するＤ因子の基質である。Ｃ３ｂ，Ｂｂと同様に、ＣＶＦ，ＢｂもＣ３を切断してＣ３ａとＣ３ｂにするＣ３転換酵素である。さらに、Ｃ３ｂ，Ｂｂと同様に、ＣＶＦ，ＢｂもＣ５を切断してＣ５ａとＣ５ｂにするＣ５転換酵素である。したがって、両方の酵素、Ｃ３ｂ，ＢｂとＣＶＦ，Ｂｂは、補体副経路のＣ３／Ｃ５転換酵素と呼ばれ、単一ＥＣ番号（ＥＣ ３．４．２１，４７）が付される。両方の転換酵素において、酵素活性部位は前記二分子酵素の同一のＢｂサブユニットに存在する。

両酵素は、構造サブユニット（ＣＶＦまたはＣ３ｂ）および同一の活性部位担持サブユニットＢｂからなる、分子構造を共有し、その上Ｃ３およびＣ５に関する基質特異性を共有するが、それら二酵素は著しい機能の違いを示す。第一に、両酵素は本質的に不安定であり、それぞれのサブユニットへの自然崩壊解離を示し、それにより酵素活性が無効化されるが、Ｃ３ｂ、ＢｂおよびＣＶＦ、Ｂｂ酵素の物理化学的半減期は著しく異なる。前記Ｃ３ｂ、Ｂｂ酵素は非常に不安定であり、３７℃で約１．５分の半減期で解離するが、前記ＣＶＦ、Ｂｂ酵素は非常に安定である。３７℃での崩壊解離のその半減期は約７時間である。

第二に、前記Ｃ３ｂ、Ｂｂ転換酵素は補体調節タンパク質Ｈ因子およびＩ因子による急速かつ効率的な不活性化にさらされる。Ｈ因子はＣ３ｂ、Ｂｂを解離し、Ｉ因子によるＣ３ｂのタンパク質分解性不活性化のための補因子として働く。これとは対照的に、前記ＣＶＦ、Ｂｂ転換酵素およびＣＶＦの両方がＨ因子およびＩ因子の調節作用に対して完全な耐性を示す。

第三に、両酵素はＣ５を切断することができるが、単量体の前記Ｃ３ｂ、Ｂｂ酵素のＣ５に対するＫｍ（２４μｍ）は血漿中の生理的なＣ５濃度（０．３７μｍ）よりもはるかに高いため、流体相のＣ３ｂ、ＢｂはＣ５切断活性を本質的に欠く。Ｃ３ｂ、Ｂｂとは対照的に、ＣＶＦ、Ｂｂは、血漿中の生理的なＣ５濃度よりもはるかに低い、０．０３６μｍのＫｍ値と一致する、流体相Ｃ５切断活性を示す。

ＣＶＦ、Ｂｂの物理化学的安定性およびＨ因子およびＩ因子による不活性化に対するその耐性はインビトロおよびインビボの両方で、血清補体を枯渇させる能力に関する分子的機序である。ＣＶＦを血清に添加すると、前記ＣＶＦ、Ｂｂ酵素はＣ３とＣ５の両方を形成しそして継続的に切断することになる。Ｃ５の活性化形態である、Ｃ５ｂはさらに端末膜攻撃経路の補体成分も消費することになる。血清補体活性の機能的枯渇は主にＣ３の切断の機能であり、Ｃ５の切断の機能ではないが、Ｃ３およびＣ５に対する継続作用の結果として、前記ＣＶＦ、Ｂｂ酵素が血清補体の枯渇をもたらすことになる。図４はマウスにおけるＣＶＦによる補体枯渇を実証する。ＣＶＦの単回投与後、血漿中の補体活性は急速に非常に低いレベルに低下し、７日から５日以内に正常レベルに戻る。

３． ヒト化コブラ毒因子
ＣＶＦは前述したように実験動物における実験的な補体枯渇のためのツールを示すが、補体の枯渇はさらに補体病因を伴う疾患の治療のための治療の概念を示す。血漿から補体を排除することにより、補体活性化トリガーの存在とは無関係に、補体の有害な効果を予防することになる。

いくつかの理由のために、ＣＶＦ自体は適切な薬物候補ではない。その１つには、その天然源、コブラ毒は明らかにその供給が限定されることである。また、ナジャ属の大部分の種は絶滅のおそれのある野生動植物の種の国際取引に関する条約（ＣＩＴＥＳ）によって保護されている。最後に、コブラ由来のタンパク質である、ＣＶＦは哺乳動物において高度な免疫原性である。したがって、治療を目的とする補体枯渇のための臨床的に有用な薬剤の開発には、組換え生産と大幅に低減された免疫原性の両方が必要とされることになる。以下に説明されるヒト化ＣＶＦ（ｈＣＶＦ）の生成により、両方の目的が達成された。

ＣＶＦを首尾よくクローニングした後、本発明者らはその後ＣＶＦの組換え形態（ｒＣＶＦ）を発現させることができた。バキュロ・ウイルス スポドプテラ・フルギペルダ Ｓｆ９細胞を使用して、ｒＣＶＦをプロＣ３と類似する単鎖プロタンパク質として発現させた。さらに最近では、本発明者らはｒＣＶＦの発現のために安定に形質転換されたショウジョウバエＳ２細胞を使用した。Ｓ２細胞を使用し、ＣＶＦのαおよびβ鎖等価物を分離する４つのアルギニン残基を除き、そしてＣ３ａ様ドメインを様々な程度に除いた。したがって、Ｓ２細胞で発現させたｒＣＶＦはＣ３とＣ３ｂに類似する２つの二本鎖形態の混合物である（図１との比較）。天然のＣＶＦの三鎖形態へのプロセシングは起こらなかった。驚くべきことに、ｒＣＶＦの三形態の全てが天然のＣＶＦと区別できないＣＶＦ活性を示す：ｒＣＶＦはＢ因子と安定な転換酵素を形成し、ＣＶＦ、Ｂｂ様の補体枯渇活性に加えて、Ｃ３切断およびＣ５切断の両方を示す。

組換えを利用して活性なＣＶＦを産生する能力により、潜在的な臨床用途のために大量生産する機会が示されるだけではない。さらに、その能力は免疫原性を含む、ＣＶＦとＣ３の構造／機能の関係を研究するためのツールにもなる。Ｃ３とＣＶＦの間の高度な相同性を利用することによって、本発明者らは、前記の２つのタンパク質のハイブリッドまたはキメラタンパク質を創出した。本発明者らの最初の目標は、Ｃ３とのその機能的な差に関与するＣＶＦにおける重要な構造を同定すること、すなわち、物理化学的に安定な転換酵素を形成し、Ｈ因子およびＩ因子に対して耐性を示すことであった。本発明者らの最初のアプローチにより、コブラＣ３とＣＶＦの部分を交換することにより、機能消失型ハイブリッドを生成することであった。この研究により、ＣＶＦのβ鎖のＣ末端領域（Ｃ３のα鎖に相当）が安定な転換酵素を形成する重要な構造を提供することが示され、これにより、前記β鎖のＮ末端部分の除去により活性は無効化されなかったことを示したＣＶＦの限定タンパク質分解に起因する本発明者らの以前の結果が確認された。

前記ＣＶＦ分子における重要な領域を同定した後、次のステップでは、ヒトＣ３内のＣ３のα鎖のＣ末端がＣＶＦ由来の相同配列で置換された機能獲得型ハイブリッドを創出した。本発明者らは、ヒトＣ３のα鎖のＣ末端部分にＣＶＦ配列を導入することにより、ＣＶＦの性質を示す分子が実際に創出されたことを見出した。それらはヒトＣ３誘導体であり、ヒト化ＣＶＦ（ｈＣＶＦ）と呼ぶ。図５は本明細書に言及されるｈＣＶＦタンパク質の概略的な鎖状構造を示す。Ｓ２細胞における組換えｈＣＶＦタンパク質の生産により、ｒＣＶＦと同様にＣ３様とＣ３ｂ様の形態の混合物が得られた（図６）。さらに最近では、本発明者らは、より同質なｈＣＶＦタンパク質が得られる発現用の安定に形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用し（図６）、グラム量での生産も可能にした。ｈＣＶＦタンパク質はヒトＢ因子と共に安定した転換酵素を形成し、いくつかのｈＣＶＦ，Ｂｂ転換酵素はＣＶＦ，Ｂｂの安定性と類似するかさらにそれを超える安定性を示す（表２）。同様に、ｈＣＶＦタンパク質と共に形成された転換酵素は、ＣＶＦ，ＢｂのＣ３切断活性と類似するかさらにそれを超える前記切断活性を示す（図７Ａ）。ヒト化ＣＶＦタンパク質はインビトロの血清中の補体枯渇活性も示す（図７Ｂ）。ｈＣＶＦの補体枯渇活性は完全に予想外であった。Ｂ因子とのｈＣＶＦ転換酵素の安定性の程度とは関係なく、ｈＣＶＦはそのＣ３部分内にＨ因子に関する全ての既知の結合部位とＩ因子に関する全ての３つの切断部位を含み、Ｈ因子およびＩ因子により急速に不活性化されることが予想され、血清中の補体枯渇活性が抑制される。結局のところ、前記ＣＶＦのβ鎖のＣ末端領域により、Ｂ因子との安定な転換酵素を形成することができる性質だけでなく、臨床応用に関する思いがけない特性である、Ｈ因子およびＩ因子による不活性化に対する部分的な耐性が付与される（図７Ｃ）。

ｈＣＶＦの別の特性は、臨床応用に関して等しく思いがけないことであるが、ｈＣＶＦを用いて形成された転換酵素はＣ５を切断しないため、Ｃ５ａが生成されないという事実である（図８）。ｈＣＶＦのこの特性は、天然のＣＶＦとｒＣＶＦの両方から全く予想外のことであり、同様に、少なくとも一定の条件下で、ヒトＣ３ｂ形態の転換酵素はＣ５切断活性を示す。転換酵素によるＣ５切断に関する、またはその欠如の分子的機序はわかっていない。

ｈＣＶＦタンパク質はＣＶＦと同様に急速かつ効率的にインビボで血清補体を枯渇させるのに対し、補体枯渇の期間は顕著ではなく、種変動に対して特定の種では、補体値は２４時間から４８時間以内に枯渇前の値に戻る（図９）。ｈＣＶＦによる短い補体枯渇は、ｈＣＶＦがＨ因子およびＩ因子による不活性化に対して部分耐性しか示さないという事実の結果である可能性が最も高く（図７Ｃとの比較）、その結果、不活性化されたｈＣＶＦタンパク質の除去がもたらされ、ＣＶＦとは対照的に、新たな転換酵素分子の再形成が抑制されることになる。

本発明者らは多数のキメラ・ヒトＣ３／ＣＶＦタンパク質を創出した。異なるキメラタンパク質は転換酵素の安定性、Ｃ３切断、および補体枯渇のそれらの特性において大きく異なり；本発明者らはわずか数個のアミノ酸残基の小さな変化により活性に重大な効果を持ちうることを示した。これらのキメラタンパク質はＣ３とＣＶＦの構造と機能を研究するための貴重なツールであるだけでなく、さらに改良された特性を有する新規なｈＣＶＦタンパク質を創出するための機会を提供する。

４． 疾患の前臨床モデルにおける治療用補体枯渇のためのヒト化ＣＶＦ
本発明者らは治療用補体枯渇の本発明者らの前臨床評価のためにｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６を選択した。以下に、本発明者らはヒト疾患の複数の前臨床モデルにおけるｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６を用いた補体枯渇の有効性を再検討する。

４．１． 前臨床疾患モデルにおけるヒト化ＣＶＦの有効性
４．１．１ 加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）
本発明者らはブルッフ膜のレーザー誘起光凝固および脈絡膜血管新生に基づいた加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）のマウスモデルを使用した。補体枯渇は、レーザー手術の前および後に毎日２８日間、ＨＣ３−１４９６を比較的低用量（２５μｇ／ｋｇ）で毎日腹腔内に注射することにより達成された。図１０は、ＨＣ３−１４９６を用いた補体枯渇により、０日目と８日目にＦＩＴＣ−デキストランの静脈注射後の眼底検査画像と、２８日目にホルマリンで固定された眼における網膜病変の病理組織学的検査の両方で実証されるより小さな病変が生じたことを示す。構造的にＣＶＦを発現し、低い血清Ｃ３値および低い補体活性を示すＣＶＦトランスジェニックマウスにおいて同様の結果が得られた。

４．１．２． 胃腸虚血再潅流傷害（ＧＩ／ＲＩ）
本発明者らはｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６を用いた補体枯渇の効果を評価するために胃腸虚血再潅流傷害（ＧＩ／ＲＩ）のマウスモデルを使用した。このモデルでは、腸管虚血を２０分間腸間膜動脈の閉塞により生じ、その後３時間の潅流を行った。補体枯渇は、麻酔の２時間前にＨＣ３−１４９６を２５０μｇ／ｋｇで腹腔内に注射することにより達成された。腸組織の損傷は腸管腔内投与後の血清中のＦＩＴＣ共役デキストランを測定することにより評価した。図１１に示すように、ｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６を用いた補体除去により、再潅流傷害の大幅な低減がもたらされた。

４．１．３． 心筋虚血再潅流傷害（ＭＩ／ＲＩ）
本発明者らはｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６を用いた補体枯渇の効果を評価するために心筋虚血再潅流傷害（ＭＩ／ＲＩ）のマウスモデルを使用した。このモデルでは、心筋虚血は左冠動脈前下降枝動脈を縫合することによって誘導した。虚血の３０分後、心筋を４時間再潅流した。図１２に示すように、麻酔の導入の２時間前にｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６を２５０μｇ／ｋｇで用いた補体除去により、短縮率と注入画分の両方によって示されるように心筋機能の改善された保存に付随して、Ｃ３ｂの沈着が減少したことにより免疫組織化学的にそして梗塞面積が小さくなったことにより形態学的に実証されるように再潅流傷害の有意な減少がもたらされた。

４．１．４． 人工呼吸器誘発肺傷害（ＶＩＬＩ）
人工呼吸器誘発肺傷害（ＶＩＬＩ）のマウスモデルにおいて、本発明者らはｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−Ｉ４９６を用いた補体枯渇の効果を評価した。２５０μｇ／ｋｇのｈＣＶＦを用いた補体枯渇は大幅にＣ３の減少した沈着（図１３）および気管支肺胞洗浄液の単一細胞数の増加によって測定される肺の損傷を減少させた。

４．１．５． 関節炎
本発明者らはｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６を用いた補体枯渇の効果を評価するためコラーゲン誘導関節炎のマウスモデルを使用した。このモデルでは、関節炎はコラーゲンでの免疫により誘導された。補体枯渇は、コラーゲンを用いた追加免疫の後６日間、ｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６を５００μｇ／ｋｇで腹腔内に注射することにより達成され、続いて１週間に５日で２５０μｇ／ｋｇの維持用量で３週間投与した。関節炎は、後足、前足および足首の直径を測定することによってモニターした。図１４に示すように、補体枯渇は全体の病理学的変化の減少および付随する腫脹の減少をもたらした。

４．１．６． 発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）
発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）は、比較的まれではあるが、グリコシルホスファチジルイニシトール（ＧＰＩ）アンカーにおける欠陥により、赤血球の表面に保護調節タンパク質ＣＤ５５とＣＤ５９の不在がもたされる、潜在的に生命を脅かす疾患である。本発明者らのモデルでは、ＰＮＨ細胞を正常ヒト血清（ＮＨＳ）において補体溶解を極めて起こしやすくする組換えを用いて産生された欠失型のＨ因子（ｒＨ１９−２０）の存在下でインキュベートしたヒト患者由来のＰＮＨ赤血球細胞を使用した。表３に示すように、ｈＣＶＦまたはＣＶＦによるヒト血清の補体除去により、ＰＮＨ細胞は補体溶解から保護された。

４．１．７． 血友病Ａ
血友病Ａ患者の最大３０％が組換えヒト第ＶＩＩＩ因子に対する抗体を生じる。本発明者らは、抗第ＶＩＩＩ因子抗体の産生に対するｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６を用いた補体枯渇の効果を評価するために、第ＶＩＩＩ因子欠損マウスを用いた。補体枯渇は、ヒト組換え第ＶＩＩＩ因子を静脈内に注射する前に週に一回４週間、ｈＣＶＦを腹腔内に注射することにより達成された。本発明者らはｈＣＶＦを用いた補体枯渇は抗第ＶＩＩＩ因子抗体力価の有意な減少をもたらすことを見出した。

４．１．８． 重症筋無力症
実験的自己免疫性免疫重症筋無力症（ＥＡＭＧ）は、神経筋接合部におけるアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）に対する自己抗体の出現によって特徴づけられる病因不明の自己免疫疾患である、重症筋無力症のマウスモデルである。筋力低下および麻痺の症状はＡＣｈＲの補体介在性破壊によって起こる。本発明者らはｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６を用いた補体枯渇の効果を評価するためにＥＡＭＧを使用した。マウスは初回免疫と２週間後に追加免疫を用いシビレエイ由来のアフィニティー精製ＡＣｈＲで免疫した。追加免疫の２週間後、ＨＣ３−１４９６を５００μｇ／ｋｇで３０日間、毎日腹腔内に注射することによりマウスの補体を枯渇させた。図１５に示すように、握力は初回免疫および追加免疫後に有意に低下した。握力は未処置の動物においては低いままであったのに対し、ＨＣ３−１４９６を用いた補体枯渇動物は２〜３週間以内に通常の握力を取り戻した。ｈＣＶＦ処置マウスの優れた筋肉の機能は、より多くのＡＣｈＲの存在と神経筋接合部での膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の実際の欠如に裏付けられた。

４．１．９． リンパ腫のモノクローナル抗体療法
ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体、例えば、リツキシマブ（登録商標）は、Ｂ細胞性リンパ腫の治療に広く使用されている。いくつかの研究では、補体活性化と抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の両方が抗腫瘍活性に寄与し得ることが示された。しかしながら、補体活性化は実際にＮＫ細胞のリツキシマブでコーティングされた腫瘍細胞との結合を妨害することによって、ＮＫ細胞介在性溶解を阻害しうる。本発明者らはｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６を用いた補体枯渇は、インビトロのＮＫ細胞の活性化に対する補体の阻害効果を防止することを見出した。リンパ腫のマウスモデル（３８Ｃ１３リンパ腫細胞；ＭＦ１１Ｇ６抗リンパ腫モノクローナル抗体）を使用して、本発明者らは、腫瘍細胞接種後３日間および抗体を注射する４時間前に、ＨＣ３−１４９６を４００μｇ／ｋｇで腹腔内に注射し、その後２日後に別の用量を注射することにより補体が枯渇したマウスは、８０％の生存率であった（図１６）。これは未処置マウスと、前記抗体またはＨＣ３−１４９６のいずれか単独で処置したマウスとの著しい相違である（図１６）。本発明者らはその後、リツキシマブ（登録商標）とＨＣ３−１４９６の様々な併用療法でのＲａｊｉ細胞マウスリンパ腫モデルを使用した。顕著ではないが、補体枯渇の治療効果は、最大１１５日間で２５％の生存率で観察された。

４．２． ヒト化ＣＶＦを用いた補体枯渇の毒性の欠如
補体枯渇が有害な効果を発揮する可能性のある３つの概念的に異なる経路がある。急性の副作用は液相の補体活性化の急速なプロセスの結果として起こる可能性がある。より長期的な副作用は補体が枯渇された状態の結果である可能性がある。最終的に、ＣＶＦおよびｈＣＶＦは補体活性化に関連しないオフターゲット毒性を示す可能性がある。しかしながら、ＣＶＦおよびｈＣＶＦのタンパク質特性とＢ因子に対するそれらの非常に高い結合特異性とを考慮すると、ＣＶＦまたはｈＣＶＦによるいかなるオフターゲットの副作用が起こる可能性も極めて低く、実際に、観察されたことがない。

天然のＣＶＦによる広範な流体相の補体活性化の唯一の既知の副作用は生じたアナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａの結果である。両方のアナフィラトキシンはカルボキシペプチダーゼＮによりそれぞれＣ３ａ−ｄｅｓ−ＡｒｇおよびＣ５ａ−ｄｅｓ−Ａｒｇに容易に不活性化される。しかしながら、Ｃ５ａ−ｄｅｓ−Ａｒｇは好中球を活性化するその能力を保持し、その能力は肺に隔離されることが示されており、急性であるが一過性の炎症性肺傷害を引き起こす。実験動物におけるＣＶＦの使用は４０年を優に超えているにもかかわらず、他の急性の副作用は観察されていない。

天然のＣＶＦとは対照的に、ｈＣＶＦはＣ５切断活性を欠き、Ｃ５ａを生じないため（図８との比較）、ｈＣＶＦを用いた補体枯渇から肺損傷は生じないであろうと予測される。実際、図１７に示すように、補体枯渇がｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６の肺動脈への２５０μｇ／ｋｇでまたはさらに１，０００μｇ／ｋｇでの動脈内投与によって達成されたにもかかわらず、カニクイザルにおいて肺機能への影響は観察されなかった。同様に、心機能への影響は２５０μｇ／ｋｇの用量で観察されなかった（図１７）。さらに肺動脈に直接注射された、１，０００μｇ／ｋｇという比較的高い用量でも、収縮期血圧の一時的な増加と心拍数の中等度の上昇が観察されたが、これらの効果が前記補体活性化の結果であったかは依然不明である。実験動物における補体枯渇のためのＣＶＦの長期使用と一致して、急性毒性の副作用はｈＣＶＦを用いた補体枯渇の上記の前臨床モデルのいずれにおいても観察されなかった。

他の有害な副作用は長期の補体枯渇の状態にあることの結果である可能性がある。実質的に全ての補体成分のホモ接合性遺伝的欠損はヒトおよび動物において記載されている。古典経路の初期成分の欠損に関する臨床的表現型はループス様自己免疫疾患であり、グラム陰性細菌による再発性感染性髄膜炎は末端膜攻撃経路成分の欠陥の兆候であり、グラム陽性細菌による再発性感染はＣ３欠損において生じ、補体成分の臨床的に最も重篤な遺伝的欠損である。同様に、Ｃ３ノックアウトマウスは感染に対する感受性が高まるが、他の病変は見られない。

遺伝的欠損とは対照的に、ＣＶＦを用いた枯渇はその免疫原性のためにおおよそ２〜３週間未満に限られ（以下、セクション４．３．参照）、ｈＣＶＦはこれまでのところ最長１ヶ月までの枯渇のために使用されただけだが、ＣＶＦまたはｈＣＶＦを用いた補体枯渇は長期的な枯渇からいかなる有害作用も示していない。重要なことは、構造的にＣＶＦを発現し、低いＣ３値と低い血清補体活性で生存する、ＣＶＦトランスジェニックマウスは、正常な寿命を示し異常な表現型は示さない。前記ＣＶＦトランスジェニックマウスを通常の動物飼育条件下で飼育したが、感染症にかかる傾向は観察されなかった。ＣＶＦトランスジェニックマウスにおける遺伝的Ｃ３欠損および長期の補体枯渇の間の重要な違いは、Ｃ３は後者の場合に完全に枯渇させることはないという事実である。これは、Ｃ３転換酵素ＣＶＦ、Ｂｂがミカエリス−メンテン反応速度論に従うという事実の結果であり；そして血漿中のＣ３濃度が酵素作用の結果として減少すると、Ｃ３の濃度は前記酵素のＫｍをかなり下回るためＣ３転換の速度は落ちる。明らかに、残存Ｃ３濃度は長期間の補体枯渇を深刻な結果を防止するのに十分である。

４．３． ヒト化ＣＶＦの潜在的な免疫原性
ＣＶＦは爬虫類由来のタンパク質であり、それ自体は哺乳動物における免疫原性の系統発生的な隔たりがある。その免疫原性のために、哺乳動物における補体枯渇のためのその有用性は本質的に単回投与に限定される。ＣＶＦ哺乳類Ｃ３類との間の５０％以上のタンパク質配列同一性と共に、ＣＶＦおよびＣ３の全体的な三次元構造の類似性を考慮すると、ＣＶＦに対する抗血清がヒトＣ３といくらかの弱い交差反応性を示すことが示されたことは当然のことである。対照的に、抗ＣＶＦは８５％以上のタンパク質配列同一性を有するコブラＣ３とより強い交差反応性を示す（図１８）。ＣＶＦのオリゴ糖鎖が大いにその免疫原性に寄与するという十分な状況証拠がある。前記のように、ＣＶＦのオリゴ糖鎖は通常ではない糖構造を含有する。ＣＶＦとコブラＣ３との間の交差反応のオクタロニー分析は強い優性突出部形成を実証し（図１８）、明確に糖質エピトープからの大きな貢献が示唆される。この仮説はコブラＣ３がグリコシル化されておらず、さらにＣＶＦに対して生じたモノクローナル抗体の中で糖鎖抗原に対する特異性がいくつかあったという事実によって裏付けられる。

まとめると、ＣＶＦのオリゴ糖鎖がその機能のために必要とされないという事実と共に、この知見は、大幅に低減または潜在的に存在しない免疫原性を持つＣＶＦのヒト化バージョンを開発するための本発明者らのアプローチの基礎となった。その概念はＣＶＦ由来の比較的短いアミノ酸配列を導入することによってＣＶＦ様機能を有するヒトＣ３の誘導体を生成することであった。このアプローチは、上記のように、成功した。ｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６の場合では、ヒトＣ３とＨＣ３−１４９６間のタンパク質配列の同一性は９４％であり、９６％の配列類似性を伴う。重要なことは、ＣＶＦ由来の１６８Ｃ末端残基内であっても、４４％はヒトＣ３と同一であり、６４％は類似している。また、真核細胞、例えば、昆虫またはハムスターの細胞におけるｈＣＶＦの組換え生産により、ヒトにより類似するグリコシル化がもたらされる。ｈＣＶＦの低い免疫原性に関する追加的なサポートは、ヒトＣ３に対する本質的に同一な構造を示すホモロジーモデリング・ソフトウェアを使用してＣ３４５Ｃ領域における三次元構造のインシリカ予測に起因する（図１９）。

最後に、ヒトにおけるｈＣＶＦの免疫原性を予測することはできない。しかしながら、ｈＣＶＦの低い免疫原性の予測は、３０日までのｈＣＶＦを用いた補体枯渇が前記した本発明者らの前臨床モデルのいくつかにおいて有効であった（ＡＭＤ、関節炎、重症筋無力症、血友病Ａ）という本発明者らの知見によってサポートされる。重要なことは、血友病Ａのマウスモデルにおける本発明者らの最近の結果により、天然のＣＶＦを用いた補体枯渇は週毎の注射の４週間後には本質的に無効であったことが実証された。これとは対照的に、ｈＣＶＦにより、第四回目の週毎の投与後でさえ効率的な補体枯渇がもたらされた。マウスＣ３（７４％）と比較して、ヒトＣ３（９４％）に対するＨＣ３−１４９６のより高い配列同一性を考慮すれば、ｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６はヒトにおいてさらに低い免疫原性であろうと予想するのが妥当である。

５． 結論
ｈＣＶＦは補体病変を伴う疾患における補体枯渇のための概念的に異なりかつ有望な治療薬となる。多数の前臨床試験におけるｈＣＶＦを用いた補体枯渇の非常に有望な結果を考慮すると、ｈＣＶＦを用いた補体枯渇は効果的な臨床ツールになると予測するのが妥当であると思われる。ｈＣＶＦタンパク質ＨＣ３−１４９６を、反復方式でも、短期的な補体枯渇を必要とする臨床状況に適している。より長期の補体枯渇を必要とする臨床応用のために、長期の補体枯渇を引き起こす新規なｈＣＶＦタンパク質を開発する必要がある。

Claims (17)

1. 潜在的に免疫原性の生物学的治療薬を投与する対象における前記治療薬に対する免疫応答を低減するかまたは予防する方法であって、前記対象に治療的有効量のヒト化コブラ毒因子（ｈＣＶＦ）および前記生物学的治療薬を投与することを含み、前記ｈＣＶＦの投与は前記対象の血中の補体値を枯渇させる、方法。
2. 前記治療薬およびｈＣＶＦの投与は前記対象への第二のまたはその後の投与であり、前記免疫応答は前記第二のまたはその後の投与により低減されるかまたは予防される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ｈＣＶＦは前記生物学的治療薬の投与前に投与される、請求項１に記載の方法。
4. 前記ｈＣＶＦはＨＣ３−１５５０、ＨＣ３−１３４８、ＨＣ３−１４９６、およびＨＣ３−１５０４からなる群より選択される、請求項１、２、または３に記載の方法。
5. 前記生物学的治療薬は精製されたポリペプチド、組換えポリペプチド、融合ポリペプチド、ペプチド、抗体、細胞、ウイルス、リポソーム、アプタマー、タンパク質、抗体複合体、および核酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
6. 前記対象における補体値はｈＣＶＦ投与前の値に約１２時間〜２４時間以内、約５日間〜７日間以内に戻るか、または７日を超えて戻る、請求項１に記載の方法。
7. 前記治療薬は凝固因子であり、状態または疾患は血液凝固障害である、請求項１に記載の方法。
8. 前記凝固因子は第ＶＩＩＩ因子であり、前記状態または疾患は血友病Ａである、請求項７に記載の方法。
9. 前記投与は臓器内、腔内、組織内への投与、静脈内、腹腔内、動脈内、および皮下投与からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
10. 対象における望ましくない補体活性化に関連する状態または疾患を治療する方法であって、前記対象に補体を枯渇させるのに十分な量でヒト化コブラ毒因子（ｈＣＶＦ）を投与することを含む、方法。
11. 前記ｈＣＶＦはＨＣ３−１５５０、ＨＣ３−１３４８、ＨＣ３−１４９６、およびＨＣ３−１５０４からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ｈＣＶＦの投与は前記対象への第二のまたはその後の投与であり、補体は前記第二のまたはその後の投与によって枯渇される、請求項１０または１１に記載の方法。
13. 前記状態または疾患は、血液凝固障害、関節リウマチ、加齢性黄斑変性症、発作性夜間血色素尿症、重症筋無力症、クローン病、心筋虚血、再潅流、心肺バイパス、移植、心筋梗塞、および血管形成からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
14. 前記対象における補体値はｈＣＶＦ投与前の値に約１２時間〜２４時間以内、約５日間〜７日間以内に戻るか、または７日を超えて戻る、請求項１０に記載の方法。
15. 前記投与は臓器内、腔内、組織内への投与、静脈内、腹腔内、動脈内、および皮下投与からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
16. 対象における免疫原性の低減または予防におけるｈＣＶＦの使用。
17. 前記ｈＣＶＦの使用は前記対象における第二のまたはその後の使用であり、免疫原性は低減されるかまたは予防される、請求項１６に記載の使用。