TW201708251A - 用於免疫耐受誘導及免疫診斷之ｆｖｉｉｉ胜肽 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於可用於減少針對FVIII之免疫反應或誘導患有例如A型血友病之患者對人類FVIII之耐受性的胜肽。此外，該等胜肽可出於免疫診斷目的用於偵測FVIII特異性CD4+ T細胞，以便在替補療法期間及在免疫耐受誘導療法期間監測患有A型血友病之患者。

Description

用於免疫耐受誘導及免疫診斷之FVIII胜肽
本發明係關於可用於減少針對FVIII之免疫反應或誘導患者中對人類FVIII之耐受性且可出於免疫診斷目的用於偵測FVIII特異性CD4+ T細胞的胜肽。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2010年10月27日申請之美國臨時專利申請案第61/407,402號、2011年4月13日申請之美國臨時專利申請案第61/467,894號及2011年6月29日申請之美國臨時專利申請案第61/502,476號的優先權，該等臨時專利申請案之揭示內容係以全文引用的方式併入本文中以用於所有目的。
關於在聯邦贊助之研究或開發下建立之發明之權利的陳述
無。
參考在壓縮光碟上提交的「序列表」、表格或電腦程式列表附件
如附件。
因子VIII(FVIII)為一種在血漿中發現的在引起血液凝固之級聯反應中充當輔因子之蛋白質。A型血友病由功能性FVIII蛋白質之減少 或缺乏造成且為最常見的出血病症之一，每5000至10000個人中約1人患病。血友病之臨床症狀為頻繁的肌肉及關節出血，且外傷甚至會引起危及生命的狀況。目前，血友病之有效治療包括使用重組或由血漿得到的FVIII產物之靜脈內施加替換缺少的FVIII蛋白質。該等製劑一般回應於出血發作投予(按需療法(on-demand therapy))或按頻繁、定期之時間間隔投予以防止不受控制的出血(預防)。不幸的是，中和抗FVIII抗體(FVIII抑制劑)之出現為在使用FVIII產物之替補療法期間的主要併發症。約25%接受治療之患者對FVIII蛋白質產生此免疫性，由此使得進一步控制出血極其困難。
未完全闡明此針對FVIII蛋白質之免疫反應的原因，但患者免疫系統之特異性會影響其對於療法之反應。通常，免疫系統對某些抗原(例如「自體」抗原)產生耐受性。此特徵至關重要，因為在不同情況下，若自體抗原被認為是外來抗原，則導致自體免疫疾病。特定言之，A型血友病患者在其FVIII基因中具有遺傳缺陷，此導致免疫系統不將所投予之FVIII蛋白質識別為「自體」抗原。因此，當在凝血因子替補療法期間投予FVIII蛋白質時，患者免疫系統將FVIII蛋白質識別為外來抗原或改變的自體蛋白質且因此產生抗FVIII抗體。
FVIII抑制劑(亦即抗FVIII抗體)由來源於FVIII特異性B細胞之漿細胞產生。B細胞需要活化CD4+ T細胞之幫助以增殖且分化為產生抗FVIII抗體之漿細胞。舉例而言，FVIII蛋白質由B淋巴細胞及T淋巴細胞以不同方式識別。抗FVIII抗體之誘導為T輔助細胞依賴型。B細胞經由其特異性B細胞受體識別完整的蛋白質抗原決定基。另一方面，T細胞識別呈加工之胜肽與抗原呈現細胞表面上所呈現之MHC II類分子複合之形 式的蛋白質。各CD4+ T細胞純系僅識別一種特異性胜肽-MHC複合物。為將胜肽呈現於T細胞，MHC II類分子具有開放的結合槽(binding groov)，其允許各種長度之胜肽適合插入且呈現於細胞表面上。此外，MHC II類蛋白質含有四個結合袋(binding pocket)，不同單純型之結合袋不同(Jones等人，Nature Rev.Immunol.6：271-282(2006))。僅特異性胺基酸適合裝入此等結合袋中，且結合胜肽之最小尺寸為九個胺基酸。值得注意的是，不同MHC II類單純型可呈現不同胜肽。因此，患者MHC II類單純型可能影響產生抗FVIII抗體之危險性。實際上，數項研究已顯示人類MHC II類單純型HLA-DRB1*1501與抗FVIII抗體產生之危險性增大存在相關性(Pavlova等人，J.Thromb.Haemost.7：2006-2015(2009)；Oldenburg等人，Thromb.Haemost.77：238-242(1997)；Hay等人，Thromb.Haemost.77：234-237(1997))。
已研究某些方法以解決與藉由投予FVIII蛋白質來治療血友病有關的難題。舉例而言，WO 03/087161揭示經修飾之FVIII蛋白質，其中該FVIII蛋白質之免疫特徵藉由減少或移除該蛋白質上呈現之潛在T細胞抗原決定基的數目來改變。識別沿著FVIII蛋白質包括T細胞抗原決定基之許多區域，包括例如FVIII2030-2044。根據本發明，移除該等區域可用以提供不誘導抗FVIII抗體產生之功能性FVIII蛋白質。WO 09/071886亦揭示預計會產生患者免疫反應中所涉及之HLA-DR2結合胜肽的FVIII蛋白質特定區域，諸如FVIII475-495、FVIII542-562、FVIII1785-1805及FVIII2158-2178。識別可能用以誘導患者免疫耐受性之胜肽。
雖然在識別FVIII蛋白質之與免疫反應有關之區域中已有進展，但仍需要識別FVIII蛋白質之可用於產生其他治療性胜肽之其他區域及 可例如用以治療A型血友病患者的方法。
本發明係基於識別FVIII蛋白質的與針對FVIII分子之免疫反應相關之區域。更特定言之，包括FVIII蛋白質之該區域的FVIII胜肽可用於誘導患有例如A型血友病之患者對人類FVIII的耐受性。此外，該等FVIII胜肽可用於免疫診斷目的，以便在替補療法期間及在免疫耐受誘導療法期間監測患有A型血友病之患者。
在一態樣中，本發明提供一種誘導有需要之個體對於FVIII之免疫耐受性的方法，該方法包含以下步驟：向該個體投予治療有效量之具有由(R1)x-P-(R2)y組成之胺基酸序列的胜肽，其中：P為與選自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：344及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸具有至少85%一致性的胺基酸序列；R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且x及y各獨立地為0或1。
在上文所提供方法之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：10之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供方法之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：10之至少九個連續胺基酸的序列一致的胺基酸序列。
在上文所提供方法之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：68之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供方法之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：68之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供方法之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：68之至少九個連續胺基酸的序列一致的胺基酸序列。
在上文所提供方法之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：344之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供方法之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：344之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供方法之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：344之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供方法之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：344之至少九個連續胺基酸的序列一致的胺基酸序列。
在上文所提供方法之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：740之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供方法之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：740之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供方法之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：740之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供方法之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：740之至少九個連續胺基酸的序列一致的胺基酸序列。
在上文所提供方法之一個具體實例中，x及y皆為0。
在上文所提供方法之一個具體實例中，x為1且y為0。
在上文所提供方法之一個具體實例中，x為0且y為1。
在上文所提供方法之一個具體實例中，x及y皆為0。
在上文所提供方法之一個具體實例中，該胜肽由9至100個胺基酸組成。
在上文所提供方法之一個具體實例中，該胜肽由9至50個胺基酸組成。
在上文所提供方法之一個具體實例中，該胜肽由9至25個胺基酸組成。
在上文所提供方法之一個具體實例中，投予醫藥組成物可防止個體產生抗FVIII抗體。
在上文所提供方法之一個具體實例中，投予醫藥組成物可減少個體中存在之抗FVIII抗體的量。
在一態樣中，本發明提供一種由胺基酸序列(R1)x-P-(R2)y組成的胜肽，其中：P為與選自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：659及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列；R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且x及y各獨立地為0或1。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：10之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：10之至少九個連續胺基酸的序列一致的胺基酸序列。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：68之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：68之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：68之至少九個連續胺基酸的序列一致的胺基酸序列。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：344之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：344之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：344之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：344之至少九個連續胺基酸的序列一致的胺基酸序列。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：740之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：740之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：740之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，P為與SEQ ID NO：740之至少九個連續胺基酸的序列一致的胺基酸序列。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，x及y皆為0。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，x為1且y為0。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，x為0且y為1。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，x及y皆為0。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，該胜肽由9至100個胺基酸組成。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，該胜肽由9至50個胺基酸組成。
在上文所提供胜肽之一個具體實例中，該胜肽由9至25個胺基酸組成。
在一態樣中，本發明提供一種包含如本文所述之胜肽的組成物。
在上文所提供之組成物的一個具體實例中，該組成物經調配用於藥物投予。
在上文所提供之組成物的一個具體實例中，該組成物進一步包含第二多胜肽，該第二多胜肽由胺基酸序列(R1)x-P-(R2)y組成，其中：P為與選自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：659及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列；R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且x及y各獨立地為0或1。
在一態樣中，本發明提供一種製造FVIII胜肽之方法，該方法包含以下步驟：a)提供包含編碼如技術方案第24項至第41項中任一項之FVIII胜肽之聚核苷酸的細胞培養物；及b)在該細胞培養物中表現該胜 肽。
在一態樣中，本發明提供一種識別FVIII胜肽特異性T細胞之方法，該方法包含：a)使複數個CD4+ T細胞與MHC II類多聚體複合之胜肽組合，其中該胜肽為如技術方案第24項至第41項中任一項之FVIII胜肽；及b)識別對該與MHC II類多聚體複合之胜肽具有特異性的該複數個CD4+ T細胞中之至少一員。
在上文所提供方法之一個具體實例中，該MHC II類多聚體為MHC II類四聚體。
在上文所提供方法之一個具體實例中，該胜肽或MHC II類多聚體進一步包含可偵測部分。
在上文所提供方法之一個具體實例中，該方法進一步包含分離對該胜肽具有特異性之至少一個CD4+ T細胞。
在上文所提供方法之一個具體實例中，該CD4+ T細胞係使用流動式細胞測量術分離。
在一態樣中，本發明提供一種融合蛋白，其包含如本文中所提供之FVIII胜肽及第二胜肽。
在上文所提供方法之一個具體實例中，該第二胜肽為報導體胜肽。
在上文所提供方法之一個具體實例中，該融合蛋白係由核酸編碼。
在上文所提供方法之一個具體實例中，該FVIII胜肽以化學方式連接至該第二胜肽。
在一態樣中，本文中所提供之FVIII胜肽用以誘導針對人類FVIII之免疫耐受性以便防止FVIII抑制劑產生。
在一態樣中，本文中所提供之FVIII胜肽用以誘導針對人類FVIII之免疫耐受性以便治療具有確定的FVIII抑制劑之患者。
在一態樣中，本文中所提供之FVIII胜肽用以產生適於在替補療法期間或在免疫耐受誘導療法期間在免疫監測患者時使FVIII特異性T細胞直接染色的試劑(例如MHC II類多聚體或MHC II類四聚體)。
在一態樣中，本文中所提供之FVIII胜肽用以識別抗原特異性T細胞。在一個具體實例中，此等試劑可用於在試管內及活體外背景下追蹤FVIII特異性T細胞。在另一具體實例中，此等試劑可用於分離及進一步特性化FVIII特異性T細胞。在一個具體實例中，螢光活化細胞分選(fluorescent activated cell sorting；FACS)或單細胞PCR可用於此等目的。
在一態樣中，本文中所提供之FVIII胜肽用於在免疫耐受誘導療法期間免疫監測FVIII特異性T細胞。
在一態樣中，本文中所提供之FVIII胜肽用於在FVIII治療期間免疫監測FVIII特異性T細胞。
在一態樣中，本文中所提供之FVIII胜肽用於在臨床開發用於防止FVIII抑制劑產生之新免疫調節劑的期間FVIII特異性T細胞之免疫診斷。
I. 引言
本發明係關於因子VIII(FVIII)胜肽，其可用於誘導例如患有A型血友病之患者對FVIII蛋白質之耐受性。此外，該等胜肽可用於免疫診斷目的，以便在替補療法期間及在免疫耐受誘導療法期間監測患有A型血友病之患者的FVIII特異性T細胞。
本發明部分基於以下發現：FVIII之數個區域(特定言之有FVIII102-122、FVIII246-266及FVIII1401-1424)與因子VIII替補療法期間針對FVIII蛋白質產生之免疫反應有關或與後天性血友病相關聯。所識別之區域的胺基酸序列分別為TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO：740)、AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO：68)及QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO：344)。咸信本發明提供此等FVIII蛋白質區及其與對於FVIII蛋白質之免疫反應的關係之第一次識別。
本發明之胜肽包括具有區域FVIII102-122、FVIII246-266及FVIII1401-1424之至少一部分的胜肽，其與MHC II類分子複合而產生能夠由患者免疫反應中所涉及之T細胞識別的T細胞抗原決定基。在一些具體實例中，該等胜肽包括至少九個鄰接胺基酸，該至少九個鄰接胺基酸與FVIII102-122、FVIII246-266或FVIII1401-1424中之九個鄰接胺基酸相對應。如下文進一步描述，本文中所提供之胜肽亦包括比九個胺基酸長度長之胜肽以及FVIII102-122、FVIII246-266及FVIII1401-1424序列之變異體。本發明胜肽之該種識別可在改良及改善經設計以治療與血液凝固相關的疾病(諸如A型血友病)之治療性策略方面具有意義。
II. 定義
術語「因子VIII蛋白質」或「FVIII蛋白質」係指具有完整B域之至少一部分且展現與天然人類FVIII蛋白質有關之生物活性的任何FVIII分子。FVIII分子可為全長FVIII。FVIII分子亦可為天然FVIII經保守修飾之變異體。FVIII蛋白質可來源於人類血漿或藉由重組工程改造技術產生。FVIII蛋白質之其他特性可例如見於US 2010/0168018之段落[0042]-[0055]，該文獻係以引用的方式併入本文中。
術語「因子VIII胜肽」或「FVIII胜肽」係指本文所述之胜肽，其包括對應於經發現在針對FVIII之免疫反應中至關重要的FVIII蛋白質之區域的胺基酸序列。FVIII胜肽包括至少九個胺基酸，該至少九個胺基酸與MHC II類蛋白質複合以便呈現於免疫反應所涉及之T細胞。其他胺基酸可呈現於該胜肽之該至少九個胺基酸核心的任一端。在一些具體實例中，FVIII胜肽可包括與天然人類FVIII蛋白質之特定區域一致的序列。在其他具體實例中，FVIII胜肽可為FVIII蛋白質之一區域經保守修飾之變異體。如本文中進一步描述，FVIII胜肽之特徵可為相對於天然人類FVIII蛋白質之一區域之序列的特定一致性百分比(例如85%一致)。
術語「胺基酸」係指天然存在之胺基酸及非天然胺基酸，包括以類似於天然存在之胺基酸的方式起作用的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸包括由遺傳密碼子編碼之胺基酸以及後來經修飾之胺基酸，例如羥基脯胺酸、y-羧基麩胺酸及O-磷酸絲胺酸。天然存在之胺基酸可包括例如D-胺基酸及L-胺基酸。本文中所用之胺基酸亦可包括非天然胺基酸。胺基酸類似物係指具有與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構(亦即任何碳與氫、羧基、胺基及R基鍵接)的化合物，例如高絲胺酸、 正白胺酸、甲硫胺酸亞碸或甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基(例如正白胺酸)或經修飾之胜肽骨架，但保留與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有不同於一般胺基酸化學結構之結構但以類似於天然存在之胺基酸之方式起作用的化合物。胺基酸可在本文中用其通常已知的三字母符號或用由IUPAC-IUB生化命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦的一字母符號提及。同樣，核苷酸可用其通常經認可的單字母代碼提及。
「經保守修飾之變異體」適用於胺基酸及核酸序列兩者。關於特定核酸序列，經保守修飾之變異體係指編碼一致或基本上一致之胺基酸序列的核酸，或當核酸並不編碼胺基酸序列時，係指基本上一致之序列。由於遺傳密碼子之簡併，大量功能上相同之核酸編碼任何既定胜肽。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU皆編碼胺基酸丙胺酸。因此，在丙胺酸由密碼子指定之每個位置上，密碼子可在不改變所編碼之多胜肽的情況下變成所描述之相應密碼子中之任一者。該等核酸變異為「沉默變異」，其為一種經保守修飾之變異。本文中每個編碼多胜肽之核酸序列亦說明每種可能之核酸沉默變異。一般熟習此項技術者將認識到核酸中之各密碼子(除通常為甲硫胺酸之唯一密碼子的AUG及通常為色胺酸之唯一密碼子的TGG之外)可經修飾以獲得功能上相同之分子。因此，編碼多胜肽之核酸的各沉默變異在相對於表現產物而非相對於實際探測序列所述之各序列中為隱含的。
關於胺基酸序列，一般熟習此項技術者將認識到改變、添加或刪除編碼序列中之單個胺基酸或小百分比之胺基酸的對於核酸或胜肽序 列之個別取代、刪除或添加為「經保守修飾之變異」，其中變化使得胺基酸經化學上類似之胺基酸取代。提供功能上類似之胺基酸的保守性取代表格在此項技術中為熟知的。該等經保守修飾之變異體為除了本發明之多晶變異體、種間同系物及等位基因以外的變異體且並不排除本發明之多晶變異體、種間同系物及等位基因。
以下八組各含有可保守取代彼此之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)。參見例如Creighton,Proteins(1984)。
在兩個或兩個以上核酸或胜肽序列之情形中，術語「一致」或「一致性」百分比係指如使用BLAST或BLAST 2.0序列比較算法與如下所述之預設參數或藉由人工比對及目視檢查所量測，兩個或兩個以上序列或子序列相同或具有指定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸(亦即，當比較及比對與比較窗或指定區相比之最大對應性時，相比於指定區約60%一致性，較佳為65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性)。
「治療有效量或劑量」或「足夠量或劑量」在本文中意指在投予時產生效應之劑量。精確劑量將取決於治療目的且可由熟習此項技術者使用已知技術來確定(參見例如Augsburger及Hoag,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，第3版，2008)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(第3版，2008)；Pickar,Dosage Calculations(第8版，2007)；及Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，2005,Gennaro編，Lippincott,Williams & Wilkins)。
III. FVIII胜肽
本發明係關於與FVIII蛋白質的與針對FVIII之免疫反應有關之區域對應的FVIII胜肽。在一態樣中，本發明提供一種FVIII胜肽，其由與以下胺基酸序列之一中的九個連續胺基酸至少85%一致的九個胺基酸之連續序列組成：AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO：68)；QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO：344)；或TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO：740)，其中該胜肽由9至180個胺基酸組成。
在一個特定具體實例中，該FVIII胜肽具有以下序列：(R1)x-P-(R2)y，其中P為與選自SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：344及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列；R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且x及y各獨立地為0或1。在一個具體實例中，R1為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2 單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，FVIII胜肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、 160、165、170、175或180個胺基酸組成。
一般而言，本發明之FVIII胜肽可包括FVIII102-122、FVIII246-266或FVIII1401-1424之識別區中所存在之任何胺基酸序列，或經修飾之變異體，該變異體可例如具有與FVIII102-122、FVIII246-266或FVIII1401-1424相似或相同的保留功能。詳言之，本發明之FVIII胜肽包括一種包括T細胞抗原決定基之胺基酸序列。該等FVIII胜肽包括相對於胺基酸序列AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO：68)、QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO：344)、或TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO：740)之一致性百分比可在一定範圍內變化的至少九個胺基酸之序列。舉例而言，FVIII胜肽可具有與FVIII102-122、FVIII246-266或FVIII1401-1424中任意九個連續胺基酸一致或至少50%、60%、70%、80%或85%一致的九個胺基酸。
在另一組具體實例中，FVIII胜肽可具有多於九個胺基酸之胺基酸序列，其中該等胺基酸序列包括可與FVIII102-122、FVIII246-266或FVIII1401-1424中之連續胺基酸序列一致或至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之區域。一般熟習此項技術者應瞭解已知突變誘發技術(諸如丙胺酸取代)可用以識別保留FVIII102-122、FVIII246-266或FVIII1401-1424區之功能的經修飾之變異體。
另外，FVIII胜肽可在上文所論述之FVIII胜肽核心序列任一端另外包括其他胺基酸序列。其他序列表示為(R1)x及(R2)y。在某些具體實例中，R1及R2長度範圍可介於1至約80個胺基酸長。或者，R1及R2長度範圍 可介於1至約40個胺基酸長。在某些具體實例中，下標x及y各獨立地為0或1。在一些具體實例中，x及y可均為0。在其他具體實例中，x可為1且y可為0。在其他具體實例中，x可為0且y可為1。在另一具體實例中，x及y均為1。由於以下各種原因可在任一端添加其他胺基酸，包括增加胜肽穩定性、改良與MHC II類分子及/或T細胞之結合以及一般熟習此項技術者所將瞭解之其他態樣。
在一個具體實例中，本發明提供一種具有序列(R1)x-P-(R2)y之多胜肽，其中P為與表1中所識別之因子VIII區之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，其中x及y各獨立地為0或1。或者，R1及R2長度範圍可介於1至約40個胺基酸長。在一個具體實例中，P為與表1中所識別之因子VIII區之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在另一具體實例中，P為與表1中所識別之因子VIII區之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一些具體實例中，x及y可均為0。在其他具體實例中，x可為1且y可為0。在其他具體實例中，x可為0且y可為1。在另一具體實例中，x及y可均為1。在一個具體實例中，FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。
如上所述，本發明之FVIII胜肽可包括FVIII1401-1424之識別區中所存在之任何胺基酸序列或經修飾之變異體，該變異體可例如具有與FVIII1401-1424相似或一致的保留功能。在某些具體實例中，該等胜肽可涵蓋人類FVIII蛋白質之完整B域。本發明亦可包括其他FVIII胜肽，該等胜肽包括具有相對於以下胺基酸序列中任一者之一致性百分比可在一定範圍內變化的至少九個胺基酸之序列的胜肽：GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(FVIII474-494；SEQ ID NO：159)、PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(FVIII540-560；SEQ ID NO：250)、EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(FVIII1785-1805；SEQ ID NO：477)、LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(FVIII2025-2045；SEQ ID NO：568)、NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(FVIII2160-2180；SEQ ID NO：659)、TVVITLKNMASHPVSLHA(FVIII102-119；SEQ ID NO：10)、AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(FVIII246-266；SEQ ID NO：68)及TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(FVIII102-122；SEQ ID NO：740)。
舉例而言，FVIII胜肽具有與FVIII474-494、FVIII540-560、FVIII1785-1805、 FVIII2025-2045、FVIII2160-2180、FVIII102-119、FVIII246-266或FVIII102-122中任意九個連續胺基酸一致或至少50%、60%、70%、80%或85%一致的九個胺基酸。在另一組具體實例中，FVIII胜肽可具有多於九個胺基酸之胺基酸序列，其中該等胺基酸序列可與FVIII474-494、FVIII540-560、FVIII1785-1805、FVIII2025-2045、FVIII2160-2180、FVIII102-119、FVIII246-266或FVIII102-122中任意九個連續胺基酸一致或至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。一般熟習此項技術者應瞭解，已知突變誘發技術(諸如丙胺酸取代)可用以識別保留FVIII474-494、FVIII540-560、FVIII1785-1805、FVIII2025-2045、FVIII2160-2180、FVIII102-119、FVIII246-266或FVIII102-122區域之功能的經修飾之變異體。此處所揭示之FVIII胜肽可使用以上關於與FVIII1401-1424有關的FVIII胜肽所述之方法製得。
A. 因子VIII 102-119 胜肽
在一個具體實例中，本發明提供一種具有序列(R1)x-P-(R2)y之多胜肽，其中P為與具有序列：TVVITLKNMASHPVSLHA(SEQ ID NO：10)之因子VIII102-119胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，其中x及y各獨立地為0或1。
在一個具體實例中，P為與具有序列：TVVITLKNMASHPVSLHA(SEQ ID NO：10)之因子VIII102-119胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：55(SEQ ID NO：10)之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：1至 SEQ ID NO：55之序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：55之胺基酸序列。在一些具體實例中，x及y可均為0。在其他具體實例中，x可為1且y可為0。在其他具體實例中，x可為0且y可為1。在另一具體實例中，x及y可均為1。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在某些具體實例中，R1為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在一個具體實例中， FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，FVIII胜肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180個胺基酸組成。
B. 因子VIII 246-266 胜肽
在一個具體實例中，本發明提供一種具有序列(R1)x-P-(R2)y之多胜肽，其中P為與具有序列：AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO：68)之因子VIII246-266胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，其中x及y各獨立地為0或1。
在一個具體實例中，P為與具有序列：AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO：68)之因子VIII246-266胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與具有序列：AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO：68)之因子VIII246-266胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：56至SEQ ID NO：146之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：56至SEQ ID NO：146之序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：56至SEQ ID NO：146之序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為選自SEQ ID NO：56至SEQ ID NO：146之胺基酸序列。在一些具體實例中，x及y可均為0。在其他具體實例中，x可為1且y可為0。在其他具體實例中，x可為0且y可為1。在另一具體實例中，x及y可均為1。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者 均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，FVIII胜肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180個胺基酸組成。
C. 因子VIII 474-494 胜肽
在一個具體實例中，本發明提供一種具有序列(R1)x-P-(R2)y之多胜肽，其中P為與具有序列：GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ ID NO：159)之因子VIII474-494胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，其中x及y各獨立地為0或1。
在一個具體實例中，P為與具有序列：GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ ID NO：159)之因子VIII474-494胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與具有序列：GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ ID NO：159)之 因子VIII474-494胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：147至SEQ ID NO：237之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：147至SEQ ID NO：237之序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：147至SEQ ID NO：237之序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為選自SEQ ID NO：147至SEQ ID NO：237之胺基酸序列。在一些具體實例中，x及y可均為0。在其他具體實例中，x可為1且y可為0。在其他具體實例中，x可為0且y可為1。在另一具體實例中，x及y可均為1。
在某些具體實例中，R1為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在一個具體實例中，FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，FVIII胜肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180個胺基酸組成。
D. 因子VIII 540-560 胜肽
在一個具體實例中，本發明提供一種具有序列(R1)x-P-(R2)y之多胜肽，其中P為與具有序列：PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ ID NO：250)之因子VIII540-560胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，其中x及y各獨立地為0或1。
在一個具體實例中，P為與具有序列：PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ ID NO：250)之因子VIII540-560胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與具有序列：PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ ID NO：250)之因子VIII540-560胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：238至SEQ ID NO：328 之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：238至SEQ ID NO：328之序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：238至SEQ ID NO：328之序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為選自SEQ ID NO：238至SEQ ID NO：328之胺基酸序列。在一些具體實例中，x及y可均為0。在其他具體實例中，x可為1且y可為0。在其他具體實例中，x可為0且y可為1。在另一具體實例中，x及y可均為1。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，FVIII胜肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180個胺基酸組成。
E. 因子VIII 1401-1424 胜肽
在一個具體實例中，本發明提供一種具有序列(R1)x-P-(R2)y之多胜肽，其中P為與具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO：344)之因子VIII1401-1424胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，其中x及y各獨立地為0或1。
在一個具體實例中，P為與具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO：344)之因子VIII1401-1424胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO：344)之因子VIII1401-1424胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：329至SEQ ID NO：464之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：329至SEQ ID NO：464之序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：329至SEQ ID NO：464之序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為選自SEQ ID NO：329至SEQ ID NO：464之胺基酸序列。在一些具體實例中，x及y可均為0。在其他具體實例中，x可為1且y可為0。在其他具體實例中，x可為0且y可為1。在另一具體實例中，x及y可均為1。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者 均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，FVIII胜肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180個胺基酸組成。
F. 因子VIII 1785-1805 胜肽
在一個具體實例中，本發明提供一種具有序列(R1)x-P-(R2)y之多胜肽，其中P為與具有序列：EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID NO：477)之因子VIII1785-1805胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，其中x及y各獨立地為0或1。 在一個具體實例中，P為與具有序列：EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID NO：477)之因子VIII1785-1805胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。
在一個具體實例中，P為與具有序列：EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID NO：477)之因子VIII1785-1805胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：465至SEQ ID NO：555之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：465至SEQ ID NO：555之序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：465至SEQ ID NO：555之序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為選自SEQ ID NO：465至SEQ ID NO：555之胺基酸序列。在一些具體實例中，x及y可均為0。在其他具體實例中，x可為1且y可為0。在其他具體實例中，x可為0且y可為1。在另一具體實例中，x及y可均為1。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基 酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，FVIII胜肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180個胺基酸組成。
G. 因子VIII 2025-2045 胜肽
在一個具體實例中，本發明提供一種具有序列(R1)x-P-(R2)y之多胜肽，其中P為與具有序列：LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ ID NO：568)之因子VIII2025-2045胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，其中x及y各獨立地為0或1。
在一個具體實例中，P為與具有序列：LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ ID NO：568)之因子VIII2025-2045胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與具有序列：LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ ID NO：568)之因子VIII2025-2045胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：556至SEQ ID NO：646之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：556至SEQ ID NO：646之序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：556至SEQ ID NO：646之序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為選自SEQ ID NO：556至SEQ ID NO：646之胺基酸序列。在一些具體實例中，x及y可均為0。在其他具體實例中，x可為1且y可為0。在其他具體實例中，x可為0且y可為1。在另一具體實例中，x及y可均為1。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，FVIII胜肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180個胺基酸組成。
H. 因子VIII 2160-2180 胜肽
在一個具體實例中，本發明提供一種具有序列(R1)x-P-(R2)y之多胜肽，其中P為與具有序列：NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ ID NO：659)之因子VIII2160-2180胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，其中x及y各獨立地為0或1。
在一個具體實例中，P為與具有序列：NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ ID NO：659)之因子VIII2160-2180胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與具有序列：NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ ID NO：659)之因子VIII2160-2180胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：647至SEQ ID NO：737之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：647至SEQ ID NO：737之序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：647至SEQ ID NO：737之序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為選自SEQ ID NO：647至SEQ ID NO：737之胺基酸序列。在一些具體實例中，x及y可均為0。在其他具體實例中，x可為1且y可為0。在其他具體實例中，x可為0且y可為1。在另一具體實例中，x及y可均為1。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者 均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，FVIII胜肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180個胺基酸組成。
I. 因子VIII 102-122 胜肽
在一個具體實例中，本發明提供一種具有序列(R1)x-P-(R2)y之多胜肽，其中P為與具有序列：TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO：740)之因子VIII102-122胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，其中x及y各獨立地為0或1。
在一個具體實例中，P為與具有序列：TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO：740)之因子VIII102-122胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與具有序列：TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO：740) 之因子VIII102-122胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。
在本發明之情形中，FVIII102-122胜肽亦包括FVIII102-119胜肽。因此，在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：738至SEQ ID NO：773之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：738至SEQ ID NO：773之序列具有至少90%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為與選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：738至SEQ ID NO：773之序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，P為選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：738至SEQ ID NO：773之胺基酸序列。在一些具體實例中，x及y可均為0。在其他具體實例中，x可為1且y可為0。在其他具體實例中，x可為0且y可為1。在另一具體實例中，x及y可均為1。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組 成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，FVIII胜肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180個胺基酸組成。
IV. 製造FVIII胜肽之方法
在另一態樣中，本發明進一步係關於製造FVIII胜肽之方法。在一些具體實例中，本發明之FVIII胜肽可使用此項技術中通常已知的固相(例如Fmoc或t-Boc)或液相合成技術來製造。參見例如Chan及White編，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach(Oxford University Press,2000)；Benoiton,Chemistry of Peptide Synthesis(CRC Press,2005)；Howl,Peptide Synthesis and Applications(Humana Press,2010)。
在一個具體實例中，本發明包括一種製造FVIII胜肽之方法，該方法包含：a)使用固相或液相合成技術合成胜肽，該FVIII胜肽具有以下序列：(R1)x-P-(R2)y，其中P為與選自SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：344及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且x及y各獨立地為0或1。在一個具體實例中，R1為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在某些具體實例中，該等胜肽可涵蓋人類FVIII蛋白質之完整B域。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例 中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在其他具體實例中，該等胜肽可使用重組技術來製造。在一個具體實例中，本發明包括一種製造FVIII胜肽之方法，該方法包含以下步驟：a)提供包含編碼FVIII胜肽之載體的細胞培養物，該FVIII胜肽具有以下序列：(R1)x-P-(R2)y，其中P為與選自SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：344及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且x及y各獨立地為0或1。在一個具體實例中，R1為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在某些具體實例中，該等胜肽可涵蓋人類FVIII蛋白質之完整B域。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺 基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，本發明提供一種製造FVIII胜肽之方法，該方法包含以下步驟：a)提供包含編碼FVIII胜肽之聚核苷酸的細胞培養物，該胜肽具有以下序列：(R1)x-P-(R2)y，其中P為與選自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：659及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且 x及y各獨立地為0或1；及b)在該細胞培養物中表現該胜肽。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在製造FVIII胜肽之方法之一個具體實例中，FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，FVIII胜肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180個胺基酸組成。
本發明之FVIII胜肽可藉由在合適原核或真核宿主系統中表現來產生。真核細胞之實例包括(但不限於)哺乳動物細胞，諸如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep及HepG2；昆蟲細胞，例如SF9細胞、SF21細胞、S2細胞及High Five細胞；及酵母細胞，例如酵母屬(Saccharomyces)細胞或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)細胞。在一個具體實例中，FVIII胜肽可在細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、禽類細胞、哺乳動物細胞及其類似細胞中表現。在一些具體實例中，胜肽可在人類細胞系、倉鼠細胞系或鼠類細胞系中表現。在一個特定具體實例中，細胞系為CHO、BHK或HEK細胞系。
多種載體可用於表現FVIII胜肽且可選自真核及原核表現載體。該等載體將包括為表現至少一種本文中所揭示之FVIII胜肽所必需的核苷酸序列。原核表現載體之實例包括質體，諸如pRSET、pET、pBAD等，其中原核表現載體中所用之啟動子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。真核表現載體之實例包括：(i)對於在酵母中表現，諸如pAO、pPIC、pYES、pMET之載體，使用諸如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等之啟動子；(ii)對於在昆蟲細胞中表現，諸如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等之載體，使 用諸如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等之啟動子，及(iii)對於在哺乳動物細胞中表現，諸如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等之載體，及來源於病毒系統(諸如牛痘病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、反轉錄病毒等)之載體，使用諸如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV及β-肌動蛋白之啟動子。
在本發明之一些具體實例中，產生FVIII胜肽之核酸序列進一步包括適用於受控蛋白質表現之其他序列，諸如啟動子序列、強化子、TATA盒、轉錄起始位點、多酶切點接頭、限制性位點、聚A序列、蛋白質加工序列、選擇標記及其類似序列，其通常為一般熟習此項技術者所已知。
對產生FVIII胜肽之細胞所用的培養基可以此項技術中熟知的合適基礎培養基為主，例如DMEM、漢姆氏F12(Ham's F12)、培養基199(Medium 199)、McCoy或RPMI。基礎培養基可包括許多成分，包括胺基酸、維生素、有機鹽及無機鹽、及碳水化合物來源。各成分可以支持細胞培育之量存在，該等量通常為熟習此項技術者已知。培養基可包括輔助物質，諸如緩衝物質(例如碳酸氫鈉)、抗氧化劑、抵消機械應力之穩定劑、或蛋白酶抑制劑。必要時，可添加非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇及聚丙二醇之共聚物及/或混合物。
在一些具體實例中，培養基不含外源添加之蛋白質。「無蛋白質」及相關術語係指來自由培養物中之細胞外界產生或除培養物中之細胞以外的來源之蛋白質，其中該等細胞在生長期間天然排出蛋白質。在另一具體實例中，培養基不含多胜肽。在另一具體實例中，培養基不含血清。 在另一具體實例中，培養基不含動物蛋白質。在另一具體實例中，培養基不含動物組分。在另一具體實例中，培養基含有蛋白質，例如來自血清(諸如胎牛血清)之動物蛋白質。在另一具體實例中，培養物具有外源添加之重組蛋白質。在另一具體實例中，蛋白質來自經證實無病原體之動物。
製備無動物蛋白質且化學成分確定之培養基的方法為此項技術中已知，例如在US 2008/0009040及US 2007/0212770中，該等文獻皆併入本文中以用於所有目的。在一個具體實例中，本文所述之方法中所用的培養基為無動物蛋白質或無寡胜肽之培養基。在某些具體實例中，培養基可為化學成分確定之培養基。如本文所用之術語「化學成分確定」應意指培養基不包含任何不確定之補充物，諸如動物組分、器官、腺體、植物或酵母之提取物。因此，化學成分確定的培養基之各組分為精確確定的。
在某些具體實例中，本發明之方法可包括使用例如以分批方式、半分批方式、進料分批方式或連續方式操作之細胞培養系統。分批培養可為大規模細胞培養，其中細胞接種物在槽或醱酵罐中培養至最大密度，且以分批形式收集及加工。進料分批培養可為供給新鮮營養物(例如生長限定性受質)或添加劑(例如產物前驅物)之分批培養。連續培養可為藉由流入新鮮培養基連續供給營養物之懸浮培養，其中該培養物體積一般為恆定的。類似地，連續醱酵可指藉由連續添加新鮮培養基(其藉由自生物反應器移除細胞懸浮液而恰好平衡)而使細胞或微生物在培養物中維持在指數生長期的過程。此外，攪拌槽反應器系統可用於懸浮培養、灌注培養、恆化培養(chemostatic culture)及/或微載體培養。通常，攪拌槽反應器系統可如同具有任何類型之攪拌器(諸如Rushton型、水翼型、斜葉槳型 或船用型(marine))之任何習知攪拌槽反應器般操作。
在某些具體實例中，本發明之細胞培養法可包括使用微載體。在一些具體實例中，具體實例之細胞培養可在適於提供高體積比培養表面積之條件下於大規模生物反應器中進行以獲得高細胞密度及蛋白質表現。一種提供該等生長條件之方法為在攪拌槽生物反應器中使用微載體進行細胞培養。細胞在微載體上生長之概念首先由van Wezel(van Wezel,A.L.,Nature 216：64-5(1967))描述且允許細胞附著於懸浮於生長培養基中之小固體顆粒表面上。此等方法提供高表面-體積比且因此允許有效的營養物利用。此外，對於在真核細胞系中表現分泌蛋白，表面-體積比增大允許較高程度之分泌且因此在培養物上清液中的蛋白質產率較高。最後，此等方法允許真核表現培養物可容易地按比例擴大。
表現FVIII胜肽之細胞可在細胞培養生長期間結合於球形或多孔微載體。微載體可為選自基於葡聚糖、膠原蛋白、塑膠、明膠及纖維素等之微載體之群的微載體。亦可能使細胞在球形微載體上生長至生物量且當其已達到最終醱酵罐生物量時且在多孔微載體上產生表現蛋白質之前繼代培養細胞，或反之亦然。合適球形微載體可包括光滑表面微載體，諸如CytodexTM 1、CytodexTM 2及CytodexTM 3(GE Healthcare)；及大孔微載體，諸如CytoporeTM 1、CytoporeTM 2、CytolineTM 1及CytolineTM 2(GE Healthcare)。
一般熟習此項技術者應瞭解，藉由上述合成及/或重組方法產生之FVIII胜肽可包括天然及/或非天然胺基酸，包括胺基酸類似物及/或胺基酸模擬物。
V. 用於誘導免疫耐受性之因子FVIII胜肽組成物
在另一態樣中，本文中所揭示之FVIII胜肽可包括於醫藥組成物中。在一個具體實例中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含如本文所述之因子VIII246-266胜肽、因子VIII1401-1424胜肽或因子VIII102-122胜肽。
在一個具體實例中，該醫藥組成物包含如本文所述之因子VIII246-266胜肽。在另一具體實例中，該醫藥組成物進一步包含如本文所述之FVIII474-494胜肽、FVIII540-560胜肽、FVIII1785-1805胜肽、FVIII2025-2045胜肽、FVIII2160-2180胜肽、FVIII102-119胜肽、FVIII1401-1424胜肽、FVIII102-122胜肽或第二FVIII246-266胜肽。
在另一具體實例中，該醫藥組成物包含如本文所述之因子VIII1401-1424胜肽。在另一具體實例中，該醫藥組成物進一步包含如本文所述之FVIII474-494胜肽、FVIII540-560胜肽、FVIII1785-1805胜肽、FVIII2025-2045胜肽、FVIII2160-2180胜肽、FVIII102-119胜肽、FVIII246-266胜肽、FVIII102-122胜肽或第二FVIII1401-1424胜肽。
在另一具體實例中，該醫藥組成物包含如本文所述之因子VIII102-122胜肽。在另一具體實例中，該醫藥組成物進一步包含如本文所述之FVIII474-494胜肽、FVIII540-560胜肽、FVIII1785-1805胜肽、FVIII2025-2045胜肽、FVIII2160-2180胜肽、FVIII102-119胜肽、FVIII246-266胜肽、FVIII1401-1424胜肽或第二FVIII102-122胜肽。
在一個特定具體實例中，本發明提供一種包含胜肽之醫藥組成物，該胜肽具有以下序列：(R1)x-P-(R2)y，其中P為與選自SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：344及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且x及y各獨立地為0或1。在一個具體實例中，R1為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，FVIII胜肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180個胺基酸組成。
在一個特定具體實例中，該醫藥組成物進一步包含第二多胜肽，該第二多胜肽具有以下序列：(R1)x-P-(R2)y，其中P為與選自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：659及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且x及y各獨立地為0或1。在一個具體實例中，R1為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組 成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，第二FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，第二FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，第二FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，第二FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，第二FVIII胜肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180個胺基酸組成。
A. 投藥
為向人類或測試動物投予組成物，在一態樣中，該等組成物可包括一或多種醫藥學上可接受之載劑。短語「醫藥學上」或「藥理學上」可接受係指當使用如下所述之此項技術中熟知的途徑投藥時，保持穩定、 抑制蛋白質或胜肽降解(諸如聚集及分裂產物)且另外不產生過敏性或其他不良反應的分子實體及組成物。「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有臨床上有用之溶劑、分散介質、塗層、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及其類似物。
醫藥組成物可經口、局部、經皮、非經腸、藉由吸入噴霧、經陰道、直腸或藉由顱內注射投予。如本文所用之術語非經腸包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、腦池內注射或輸注技術。亦涵蓋藉由靜脈內、皮內、肌肉內、乳房內、腹膜內、鞘內、眼球後、肺內注射及/或手術植入特定部位而進行之投予。通常，組成物基本上不含熱原質以及可能對接受者有害的其他雜質。
投藥之劑量及頻率將取決於熟習此項技術者通常所瞭解之各種因素，包括例如患者血友病之嚴重程度及/或使用較大或較小劑量是否更有效地誘導免疫耐受性。典型每日劑量可在約0.01mg/kg至100mg/kg範圍內。每週0.07-700mg FVIII胜肽範圍內之劑量可為有效且被完全耐受的，不過更高的每週劑量可能為合適且/或被完全耐受的。在確定合適劑量中主要決定因素為在特定情形下在治療上有效所必需之特定FVIII胜肽的量。為獲得較長持續時間的免疫耐受性，可能需要重複投藥。可使用由治療醫師所選的劑量水準及模式進行組成物之單次或多次投藥。
在一態樣中，本發明之組成物可藉由團注(bolus)投予。作為另一實例，FVIII胜肽可以一次劑量形式投予。一般熟習此項技術者將容易地如由良好醫療操作及個別患者臨床情況所判定使有效劑量及投藥方案最佳化。給藥頻率取決於投藥途徑。最佳醫藥組成物由熟習此項技術者視 投藥途徑及所需劑量而確定。參見例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(Remington the Science and Practice of Pharmacy)，第21版.(2005,Lippincott Williams & Wilkins)，其揭示內容據此以引用的方式併入本文中。該等組成物影響所投予藥劑之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除率。視投藥途徑而定，根據體重、體表面積或器官大小計算合適劑量。合適劑量可經由使用測定血液水準劑量連同合適的劑量-反應資料的已確立之檢定來確定。最終給藥方案由主治醫師考慮改變藥物作用之各種因素來確定，因素例如有藥物比活性、患者之損傷嚴重程度及反應性、患者年齡、病狀、體重、性別及飲食、任何感染之嚴重程度、投藥時間及其他臨床因素。
在一些具體實例中，包含本文中所揭示之FVIII胜肽的組成物在投藥之前凍乾。凍乾係使用此項技術中常見的技術來進行且應如例如Tang等人，Pharm Res.21：191-200,(2004)及Chang等人，Pharm Res.13：243-9(1996)中所述經最佳化而用於所開發之組成物。製備醫藥組成物之方法可包括一或多個以下步驟：在凍乾之前添加穩定劑至混合物中；在凍乾之前添加至少一種選自增積劑、容積滲透濃度(osmolarity)調節劑及界面活性劑之藥劑至混合物中。在一態樣中，凍乾調配物至少包含緩衝劑、增積劑及穩定劑中之一或多者。在此態樣中，在凍乾步驟期間或在復原期間聚集成為問題的情況下評估及選擇界面活性劑之應用。包括合適緩衝劑以使調配物在凍乾期間維持在穩定pH值範圍內。
凍乾物質之標準復原操作為添加回一定體積之純水或無菌注射用水(WFI)(通常等於在凍乾期間所減小之體積)，但是有時在適於非 經腸投予之藥物之製造中使用抗細菌劑之稀釋溶液。因此，提供製備復原FVIII胜肽組成物之方法，其包含添加稀釋劑至凍乾FVIII胜肽組成物中之步驟。
在一些具體實例中，凍乾物質可復原為水溶液。存在多種水性載劑，例如無菌注射用水、供多劑量使用的含防腐劑之水、或含合適量的界面活性劑之水(例如含有與適於製造水性懸浮液之賦形劑混合之活性化合物的水性懸浮液)。在各種態樣中，該等賦形劑為懸浮劑，例如(但不限於)羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、褐藻酸鈉、聚乙烯吡咯啶酮、黃蓍膠及阿拉伯膠；分散或濕潤劑為天然存在之磷脂，例如(但不限於)卵磷脂；或環氧烷與脂肪酸之縮合產物，例如(但不限於)聚氧乙烯硬脂酸酯；或環氧乙烷與長鏈脂族醇之縮合產物，例如(但不限於)十七伸乙基氧基十六醇；或環氧乙烷與自脂肪酸及己糖醇衍生之偏酯的縮合產物，諸如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯；或環氧乙烷與自脂肪酸及己糖醇酐衍生之偏酯的縮合產物，例如(但不限於)聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。在各種態樣中，水性懸浮液亦含有一或多種防腐劑，例如(但不限於)對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸正丙酯。
VI. 治療方法
本發明進一步係關於治療患有與FVIII蛋白質有關之疾病(諸如A型血友病或後天性血友病)之患者的方法。該等方法可包括投予至少一種本文中所揭示之FVIII胜肽。詳言之，可投予包括至少一種FVIII胜肽之醫藥組成物以誘導患者對於FVIII蛋白質之免疫耐受性。
在一些具體實例中，誘導對於FVIII之免疫耐受性的方法可 包括在投予FVIII之後防止FVIII抑制劑產生。術語「防止」係指不允許產生實質上可偵測的針對FVIII之免疫反應。舉例而言，患者在投予FVIII蛋白質之前可能不具有任何可偵測之抗FVIII抗體。然而，在使用FVIII蛋白質之投藥療法之後，若未投予FVIII胜肽來誘導免疫耐受性，則可偵測之抗FVIII抗體的含量會增加。投予本文中所揭示之FVIII胜肽可誘導免疫耐受性，由此治療患有血友病之患者。
在其他具體實例中，誘導對於FVIII蛋白質之免疫耐受性的方法可包括治療已具有確定的FVIII抑制劑之患者。在此等具體實例中，投予FVIII胜肽可減少或消除抗FVIII抗體之存在。術語「減少」意指針對FVIII蛋白質之免疫反應部分減少。在某些具體實例中，減少免疫反應可包括與患者在投予FVIII胜肽之前的免疫反應程度相比免疫反應減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。舉例而言，減少百分比可藉由使用測定FVIII抗體存在量之標準方法量測在投予FVIII胜肽之前及之後血液中所存在之抗FVIII抗體的量來分析。在其他具體實例中，免疫反應減少可包括量測對FVIII有特異性之CD4+ T細胞，或分泌FVIII抗體之FVIII特異性B細胞，或T細胞、B細胞及抗FVIII抗體所有三者之組合的減少量。可使用此項技術中通常已知的方法分離免疫細胞，諸如對FVIII有特異性之T細胞及B細胞。
在一態樣中，本發明包括一種誘導個體對於FVIII之免疫耐受性的方法，該方法包含向該個體投予治療有效量的包含如本文所述之FVIII胜肽之醫藥組成物的步驟。在一個特定具體實例中，該FVIII胜肽為如本文所述之因子VIII246-266胜肽、因子VIII1401-1424胜肽或因子VIII102-122胜肽。
在一個具體實例中，該方法包含向該個體投予治療有效量的包含如本文所述之因子VIII246-266胜肽之醫藥組成物的步驟。在另一具體實例中，該醫藥組成物進一步包含如本文所述之FVIII474-494胜肽、FVIII540-560胜肽、FVIII1785-1805胜肽、FVIII2025-2045胜肽、FVIII2160-2180胜肽、FVIII102-119胜肽、FVIII1401-1424胜肽、FVIII102-122胜肽或第二FVIII246-266胜肽。
在另一具體實例中，該方法包含向該個體投予治療有效量的包含如本文所述之因子VIII1401-1424胜肽之醫藥組成物的步驟。在另一具體實例中，該醫藥組成物進一步包含如本文所述之FVIII474-494胜肽、FVIII540-560胜肽、FVIII1785-1805胜肽、FVIII2025-2045胜肽、FVIII2160-2180胜肽、FVIII102-119胜肽、FVIII246-266胜肽、FVIII102-122胜肽或第二FVIII1401-1424胜肽。
在另一具體實例中，該方法包含向該個體投予治療有效量的包含如本文所述之因子VIII102-122胜肽之醫藥組成物的步驟。在另一具體實例中，該醫藥組成物進一步包含如本文所述之FVIII474-494胜肽、FVIII540-560胜肽、FVIII1785-1805胜肽、FVIII2025-2045胜肽、FVIII2160-2180胜肽、FVIII102-119胜肽、FVIII246-266胜肽、FVIII1401-1424胜肽或第二FVIII102-122胜肽。
在一個具體實例中，本發明提供一種誘導對於FVIII蛋白質之免疫耐受性的方法，該方法包含向個體投予治療有效量之包含胜肽之醫藥組成物，該胜肽具有以下序列：(R1)x-P-(R2)y，其中P為與選自SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：344及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列；R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且x及y各獨立地為0或1；由此誘導該個體對於FVIII蛋白質之免疫耐受性。在某些具體實 例中，R1為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，FVIII胜肽由9至10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180個胺基酸組成。
誘導免疫耐受性之方法可進一步包括組合療法，其中可投予數種胜肽以誘導免疫耐受性。在一個具體實例中，誘導免疫耐受性之方法進一步包含投予治療有效量之至少具有序列(R1)x-P-(R2)y之第二胜肽，其中P為與選自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：659及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列；R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且x及y各獨立地為0或1；由此誘導個體對於FVIII蛋白質之免疫耐受性。在某些具體實例中，R1為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在一個特定具體實例中，該第二胜肽由9至80個胺基酸組成。在另一個特定具體實例中，該第二胜肽中之任何其他胺基酸為天然胺基酸。在另一個特定具體實例中，該第二胜肽由9至40個胺基酸長度組成。在一個特定具體實例中，該第二胜肽由9至80個胺基酸長度組成且該第二胜肽中之任何其他胺基酸為天然胺基酸。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一個具體實例中，第二FVIII胜肽由9至150個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至100個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至50個胺基酸組成。在另一具體實例中，FVIII胜肽由9至25個胺基酸組成。在其他具體實例中，FVIII胜肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180個胺基酸組成。
在誘導免疫耐受性之方法之一個特定具體實例中，其中所投予之醫藥組成物包含胜肽，其中P為與SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：344或SEQ ID NO：740之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，該組成物進一步包含第二多胜肽，該第二多胜肽具有以下序列：(R1)x-P-(R2)y，其中P為與選自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：659及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列；R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且x及y各獨立地為0或1。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基 酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在一態樣中，本發明提供如本文所述之FVIII胜肽的用途，其係用於製造用以處理針對FVIII替補療法產生之免疫反應的藥物。在一個特定具體實例中，該FVIII胜肽為FVIII1401-1424胜肽。在相關態樣中，本發明提供如本文所述之FVIII胜肽的用途，其係用於製造用以防止針對FVIII替補療法產生之免疫反應的藥物。在一個特定具體實例中，該FVIII胜肽為FVIII1401-1424胜肽。
在一態樣中，本發明提供一種適用作藥物之FVIII胜肽。在一個特定具體實例中，本發明提供一種適用作藥物的具有序列(R1)x-P-(R2)y之多胜肽，其中P為與具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO：344)之因子VIII1401-1424胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，其中x及y各獨立地為0或1。
在一態樣中，本發明提供一種用於處理針對FVIII替補療法產生之免疫反應的FVIII胜肽。在一個特定具體實例中，本發明提供一種用 於處理針對FVIII替補療法產生之免疫反應的具有序列(R1)x-P-(R2)y之多胜肽，其中P為與具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO：344)之因子VIII1401-1424胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，其中x及y各獨立地為0或1。
在一態樣中，本發明提供一種用於防止針對FVIII替補療法產生之免疫反應的FVIII胜肽。在一個特定具體實例中，本發明提供一種用於防止針對FVIII替補療法產生之免疫反應的具有序列(R1)x-P-(R2)y之多胜肽，其中P為與具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO：344)之因子VIII1401-1424胜肽之至少九個連續胺基酸的序列具有至少85%一致性的胺基酸序列，R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列，其中x及y各獨立地為0或1。
VII. 免疫診斷
在一態樣中，本發明提供一種監測有需要之個體之FVIII替補療法或FVIII免疫耐受誘導療法的方法，其係藉由識別自該個體獲取之生物樣品中對FVIII有特異性之FVIII抑制抗體或CD4+ T細胞之存在或含量來達成。
在一個具體實例中，該方法包含一種監測有需要之個體之FVIII替補療法的方法，該方法包含：使該個體之生物樣品與如本文所述之FVIII246-266胜肽、FVIII1401-1424胜肽或FVIII102-122胜肽接觸；及偵測在該FVIII胜肽與該樣品中所存在之FVIII抑制抗體之間形成的複合物。在一個具體實例中，該方法包含測定該樣品中FVIII抑制抗體之含量。在另一具體實例中， 該方法包含測定在不同時間自該個體獲取之至少兩個樣品中FVIII抑制抗體之含量，且比較該兩個樣品之間FVIII抑制抗體之含量，其中抗體含量隨時間增加表明針對向該個體投予之FVIII的免疫反應在FVIII替補療法期間形成。
在另一具體實例中，該方法包含一種監測有需要之個體之FVIII免疫耐受誘導療法的方法，該方法包含：使該個體之生物樣品與如本文所述之FVIII246-266胜肽、FVIII1401-1424胜肽或FVIII102-122胜肽接觸；及偵測在該FVIII胜肽與該樣品中所存在之FVIII抑制抗體之間形成的複合物。在一個具體實例中，該方法包含測定該樣品中FVIII抑制抗體之含量。在另一具體實例中，該方法包含測定在不同時間自該個體獲取之至少兩個樣品中FVIII抑制抗體之含量，且比較該兩個樣品之間FVIII抑制抗體之含量，其中抗體含量隨時間減少表明該個體針對FVIII蛋白質之免疫耐受性形成。
在一個具體實例中，該方法包含一種監測有需要之個體之FVIII替補療法的方法，該方法包含：使該個體之生物樣品與如本文所述之FVIII246-266胜肽、FVIII1401-1424胜肽或FVIII102-122胜肽接觸；及偵測在該FVIII胜肽與該樣品中所存在之對FVIII有特異性之CD4+ T細胞之間形成的複合物。在一個具體實例中，該方法包含測定該樣品中對FVIII有特異性之CD4+ T細胞的含量。在另一具體實例中，該方法包含測定在不同時間自該個體獲取之至少兩個樣品中對FVIII有特異性之CD4+ T細胞的含量，且比較該兩個樣品之間對FVIII有特異性之CD4+ T細胞的含量，其中抗體含量隨時間增加表明針對向該個體投予之FVIII的免疫反應在FVIII替補療法期間形成。在一個特定具體實例中，該FVIII胜肽與MHC II類多聚體複合。
在另一具體實例中，該方法包含一種監測有需要之個體之FVIII免疫耐受誘導療法的方法，該方法包含：使該個體之生物樣品與如本文所述之FVIII246-266胜肽、FVIII1401-1424胜肽或FVIII102-122胜肽接觸；及偵測在該FVIII胜肽與該樣品中所存在之對FVIII有特異性之CD4+ T細胞之間形成的複合物。在一個具體實例中，該方法包含測定該樣品中對FVIII有特異性之CD4+ T細胞的含量。在另一具體實例中，該方法包含測定在不同時間自該個體獲取之至少兩個樣品中對FVIII有特異性之CD4+ T細胞的含量，且比較該兩個樣品之間對FVIII有特異性之CD4+ T細胞的含量，其中抗體含量隨時間減少表明該個體針對FVIII蛋白質之免疫耐受性形成。在一個特定具體實例中，該FVIII胜肽與MHC II類多聚體複合。
如一般熟習此項技術者應瞭解，免疫監測可例如用以幫助治療患有血友病之患者。舉例而言，免疫監測可用於識別投予本發明之胜肽及/或組成物是否可防止或減少針對FVIII產物之免疫反應。劑量及/或劑量間隔可藉由免疫監測而最佳化。在一些具體實例中，投藥劑量可特別基於防止或減少抗FVIII抗體之免疫監測結果而調節。另外，可確定特定患者或患者群之給藥間隔以及劑量。
A. 識別FVIII特異性T細胞之方法
在另一態樣中，本發明包括識別抗原特異性T細胞，更特定言之為對本文所述之FVIII蛋白質及FVIII胜肽有特異性之T細胞的方法。該等方法可例如用於患者之免疫診斷，諸如免疫監測。在一個具體實例中，本發明包括一種識別FVIII胜肽特異性T細胞之方法，該方法包含a)使複數個CD4+ T細胞與MHC II類多聚體複合之FVIII胜肽組合，該FVIII 胜肽具有以下序列：(R1)x-P-(R2)y，其中P為與選自SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：344及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸之序列具有至少85%一致性的胺基酸序列；R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且x及y各獨立地為0或1；及b)識別該對與MHC II類多聚體複合之胜肽有特異性的複數個CD4+ T細胞中之至少一員。在一些具體實例中，R1為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列，且R2為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。
在某些具體實例中，本文中所揭示之FVIII胜肽可用於產生適於使FVIII特異性T細胞直接染色之試劑。舉例而言，呈現本發明之FVIII胜肽的MHC II類多聚體可包括多種形式，諸如MHC II類四聚體。此等MHC II類分子可經進一步修飾而包括診斷劑。或者，與MHC II類多聚體複合之FVIII胜肽可包括診斷劑。本發明所用之診斷劑(亦即可偵測部分)可包括免疫監測技術中通常已知的診斷劑。舉例而言，可基於偵測與本文所述之由MHC II類四聚體呈現之FVIII胜肽締合的診斷劑識別及/或分離FVIII特異性T細胞。合適診斷劑可包括螢光劑、化學發光劑、放射性藥劑、對比劑及其類似藥劑。合適螢光劑包括典型用於流動式細胞測量術之螢光劑且可包括(但不限於)異硫氰酸螢光素、R-藻紅素、得克薩斯紅(Texas Red)、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7及其衍生物。
在某些具體實例中，FVIII胜肽可用於試管內再刺激CD4+ FVIII特異性T細胞。在此等具體實例中，再刺激T細胞可藉由偵測增殖、細胞激素或趨化激素之分泌或熟習此項技術者已知的某些活化標記之上調或下調來監測。
在一些具體實例中，診斷劑偵測可用於識別及/或分離對本文中所揭示之FVIII胜肽有特異性的T細胞。舉例而言，上述試劑(例如胜肽、MHC II類四聚體及診斷劑)可用於試管內或活體外追蹤FVIII特異性T細胞。在某些具體實例中，可使用此項技術中通常已知的各種技術進一步分離及特性化T細胞，諸如流動式細胞測量術，例如螢光活化細胞分選(FACS)；及/或PCR，例如單細胞PCR。
為進行免疫監測分析，結合FVIII胜肽-MHC II類多聚體複合物之T細胞包括CD4+ T細胞且可使用此項技術中通常已知的多種方法自患者分離。舉例而言，T細胞可自患者血液、器官或其他組織分離及純化。FVIII特異性T細胞之分離及識別可用於多種免疫診斷應用。在某些具體實例中，FVIII胜肽或相關試劑可在新FVIII產品臨床開發期間用於免疫監測FVIII特異性T細胞。在其他具體實例中，FVIII胜肽可在免疫耐受誘導療法期間用於免疫監測FVIII特異性T細胞。在其他具體實例中，FVIII胜肽可在FVIII治療期間用於免疫監測FVIII特異性T細胞。
VIII. 本發明之套組
本發明亦提供有助於及/或標準化由本發明提供之組成物之使用以及有助於本發明之方法的套組。可在套組中提供用於實施此等不同方法之物質及試劑以有助於方法實施。如本文中所用，術語「套組」用以指有助於方法、檢定、分析或操作之物品組合。
套組可含有化學試劑(例如FVIII胜肽或編碼FVIII胜肽之聚核苷酸)以及其他組分。另外，本發明之套組亦可包括例如(但不限於)用於樣品收集及/或純化之設備及試劑、用於產物收集及/或純化之設備及試 劑、用於細菌細胞轉型之試劑、用於真核細胞轉染之試劑、預先轉型或轉染之宿主細胞、樣品管、固持器、塔盤、支架、器皿、平板、套組使用者之說明書、溶液、緩衝劑或其他化學試劑、適用於標準化、校正之樣品及/或對照樣品。本發明之套組亦可封裝於例如具有蓋子之盒子中以便方便儲存及安全運送。
在一些具體實例中，舉例而言，本發明之套組可提供本發明之FVIII胜肽、編碼本發明之FVIII胜肽的聚核苷酸載體(例如質體)、適於繁殖載體之細菌細胞菌株及用於純化所表現的融合蛋白之試劑。或者，本發明之套組可提供為進行FVIII胜肽突變誘發所需之試劑，以便產生FVIII胜肽之經保守修飾之變異體。
套組可含有一或多種本發明之組成物，例如一種或複數種FVIII胜肽或一種或複數種編碼FVIII胜肽之聚核苷酸。或者，套組可含有用於進行患者的免疫監測之試劑(例如胜肽、MHC II類四聚體及診斷劑)。
本發明之套組亦可含有一種或複數種編碼FVIII胜肽之重組核酸分子，其可為相同或不同的，且可進一步包括(例如)操作性連接之含有或編碼限制性核酸內切酶識別位點或重組酶識別位點之第二聚核苷酸，或任何相關多胜肽。另外，套組可含有有關使用套組組分(尤其套組中所含有之本發明之組成物)之說明書。
IX. 特定具體實例
在一個具體實例中，本發明提供一種FVIII胜肽，其由與以下胺基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO：344)中之九個連續胺基酸至少85%一致的九個胺基酸之連續序列組成，且該胜肽具有式： (R1)x-胜肽-(R2)y，其中R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且下標x及y各獨立地為0或1。
在一個具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至70個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至60個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至50個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至40個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至30個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至20個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至10個胺基酸組成之胺基酸序列。在另一具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至5個胺基酸組成之胺基酸序列。在其他具體實例中，R1及R2單獨或兩者均為由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個胺基酸組成之胺基酸序列。
在上述胜肽之一個特定具體實例中，x及y皆為0。
在上述胜肽之一個特定具體實例中，x為1且y為0。
在上述胜肽之一個特定具體實例中，x為0且y為1。
在上述胜肽之一個特定具體實例中，x及y皆為1。
在上述胜肽之一個特定具體實例中，九個胺基酸之連續序列與胺基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO：344)中之九個連續胺基酸一致。
在一個具體實例中，本發明提供一種包含FVIII胜肽之醫藥組成物，該FVIII胜肽由與以下胺基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO：344)中之九個連續胺基酸至少85%一致的九個胺基酸之連續序列組成，且該胜肽具有式：(R1)x-胜肽-(R2)y，其中R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；且下標x及y各獨立地為0或1。
在上述組成物之一個特定具體實例中，x及y皆為0。
在上述組成物之一個特定具體實例中，x為1且y為0。
在上述組成物之一個特定具體實例中，x為0且y為1。
在上述組成物之一個特定具體實例中，x及y皆為1。
在上述組成物之一個特定具體實例中，該組成物進一步包含至少一種胜肽，該胜肽由與獨立地選自由以下組成之群之胺基酸序列中的九個連續胺基酸至少85%一致的九個胺基酸之連續序列組成：GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ ID NO：159)、PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ ID NO：250)、EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID NO：477)、LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ ID NO：568)、NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ ID NO：659)、TVVITLKNMASHPVSLHA(SEQ ID NO：10)、AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO：68)及 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO：740)，其中該至少一種胜肽長度為最多80個胺基酸且其中該至少一種胜肽中之任何其他胺基酸為天然胺基酸。
在一個具體實例中，本發明提供一種誘導個體對於FVIII之免疫耐受性的方法，該方法包含向該個體投予治療有效量之包含FVIII胜肽之醫藥組成物的步驟，該FVIII胜肽由與以下胺基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT中之九個連續胺基酸至少85%一致的九個胺基酸之連續序列組成，且該胜肽具有式：(R1)x-胜肽-(R2)y，其中R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；下標x及y各獨立地為0或1；且由此誘導該個體對於FVIII蛋白質之免疫耐受性。
在上述方法之一個特定具體實例中，該醫藥組成物進一步包含至少一種胜肽，該胜肽由與獨立地選自由以下組成之群之胺基酸序列中的九個連續胺基酸至少85%一致的九個胺基酸之連續序列組成：GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ ID NO：159)、PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ ID NO：250)、EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID NO：477)、LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ ID NO：568)、NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ ID NO：659)、TVVITLKNMASHPVSLHA(SEQ ID NO：10)、AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO：68)及TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO：740)，其中該至少一種胜肽長度為最多80個胺基酸且其中該至少一種胜肽中之任何其他胺基酸為天然胺 基酸。
在上述方法之一個特定具體實例中，投予醫藥組成物可防止個體產生抗FVIII抗體。
在上述方法之一個特定具體實例中，投予醫藥組成物可減少個體中存在之抗FVIII抗體的量。
在上述方法之一個特定具體實例中，x及y皆為0。
在上述方法之一個特定具體實例中，x為1且y為0。
在上述方法之一個特定具體實例中，x為0且y為1。
在上述方法之一個特定具體實例中，x及y皆為1。
在一個具體實例中，本發明提供一種製造FVIII胜肽之方法，該方法包含以下步驟：a)提供包含編碼FVIII胜肽之載體的細胞培養物，該FVIII胜肽由與以下胺基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT中之九個連續胺基酸至少85%一致的九個胺基酸之連續序列組成，且該胜肽具有式：(R1)x-胜肽-(R2)y，其中R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；下標x及y各獨立地為0或1；及b)在該細胞培養物中表現該胜肽。
在上述方法之一個特定具體實例中，x及y皆為0。
在上述方法之一個特定具體實例中，x為1且y為0。
在上述方法之一個特定具體實例中，x為0且y為1。
在上述方法之一個特定具體實例中，x及y皆為1。
在一個具體實例中，本發明提供一種製造FVIII胜肽之方法，該方法包含：a)使用固相或液相合成技術合成胜肽，該胜肽由與以下 胺基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT中之九個連續胺基酸至少85%一致的九個胺基酸之連續序列組成，且該胜肽具有式：(R1)x-胜肽-(R2)y，其中R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；下標x及y各獨立地為0或1。
在上述方法之一個特定具體實例中，x及y皆為0。
在上述方法之一個特定具體實例中，x為1且y為0。
在上述方法之一個特定具體實例中，x為0且y為1。
在上述方法之一個特定具體實例中，x及y皆為1。
在一個具體實例中，本發明提供一種識別FVIII胜肽特異性T細胞之方法，該方法包含：a)使複數個CD4+ T細胞與MHC II類多聚體複合之FVIII胜肽組合，該FVIII胜肽由與以下胺基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT中之九個連續胺基酸至少85%一致的九個胺基酸之連續序列組成，且該胜肽具有式：(R1)x-胜肽-(R2)y，其中R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；下標x及y各獨立地為0或1；及b)識別對該與MHC II類多聚體複合之胜肽有特異性的複數個CD4+ T細胞中之至少一員。
在上述方法之一個特定具體實例中，該MHC II類多聚體為MHC II類四聚體。
在上述方法之一個特定具體實例中，該胜肽或MHC II類多聚體進一步包含診斷劑。
在上述方法之一個特定具體實例中，該診斷劑識別該對胜肽有特異性之複數個CD4+ T細胞之至少一員。
在上述方法之一個特定具體實例中，該方法進一步包含基於該診斷劑偵測分離對該胜肽有特異性之該複數個CD4+ T細胞之至少一員。
在上述方法之一個特定具體實例中，該複數個CD4+ T細胞之至少一員係使用流動式細胞測量術分離。
在上述方法之一個特定具體實例中，x及y皆為0。
在上述方法之一個特定具體實例中，x為1且y為0。
在上述方法之一個特定具體實例中，x為0且y為1。
在上述方法之一個特定具體實例中，x及y皆為1。
現將在以下實施例中進一步說明本發明，但本發明不受限於此等實施例。
X. 實施例
實施例1
為了更好地模擬人類MHC II類分子以識別FVIII胜肽，開發具有攜帶人類HLA-DRB1*1501特異性結合位點之嵌合MHC II類分子之A型血友病的小鼠模型。此小鼠與完全剔除所有鼠類MHC II類基因之小鼠回交(Reipert等人，J.Thromb.Haemost.7增刊1：92-97(2009))。在此新基因轉殖小鼠模型中，所有CD4+ T細胞反應係由人類MHC II類分子驅動。此小鼠模型用以識別由HLA-DRB1*1501呈現之FVIII胜肽，此驅動此等小鼠中之抗FVIII免疫反應。
材料及方法
FVIII：製得重組人類FVIII(rFVIII)，其呈無白蛋白散裝產物(Baxter Neuchatel)及臨床蔗糖調配之FVIII產物(Advate,Baxter,Westlake Village,CA)形式。
血友病HLA-DRB15 E17小鼠：如Reipert等人，J.Thromb.Haemost.7增刊1：92-97(2009)中所述之HLA-DRB1*1501+/- E17-/-小鼠。小鼠全部為雄性且在實驗開始時為8至12週大。
用人類重組FVIII免疫：HLA-DRB1*1501+/- E17-/-小鼠每週接受4至8次0.2μg或1μg人類rFVIII之靜脈內或皮下劑量。將rFVIII稀釋於初始調配物緩衝液或杜爾貝科磷酸鹽緩衝生理鹽水(含有鈣及鎂)(DPBS，Sigma Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)中。
細胞製備：在使用rFVIII最後一次免疫後3至7天取得脾臟。切碎脾細胞且使其通過70μm細胞過濾器(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。將單一細胞收集於以下培養基中：補充有10%預選胎牛血清(FCS；Hyclone,Logan,UT)、2mM L-麩醯胺酸、100U/mL青黴素/鏈黴素(兩者均來自Gibco)及5×10-5M巰基乙醇(Sigma-Aldrich)之RPMI 1640培養基(Gibco,Invitrogen,Life Technologies,Carlsbad,CA)。使用由0.15M氯化銨、10mM碳酸氫鉀(兩者均來自Merck,Darmstadt,Germany)及0.1mM乙二胺四乙酸(Sigma-Aldrich)構成之低滲緩衝液(pH 7.2)裂解紅血球。洗滌細胞且使用庫爾特計數器Z1計數。
產生T細胞融合瘤以識別FVIII胜肽
用人類rFVIII試管內再刺激脾細胞：在20μg/mL人類FVIII存在下以1.5×106個細胞/毫升之濃度於培養基中再刺激脾細胞3或10天。在6天後更新用於10天培養之培養基。
小鼠T細胞與BW細胞之融合：用無血清培養基洗滌試管 內再刺激之脾細胞培養物及BW細胞(α-β-)兩次且隨後以1：3至1：10(T細胞：BW細胞)之比率組合。BW細胞系來源於小鼠AKR/J T細胞淋巴瘤。此等細胞在其表面上不具有T細胞受體(α-β-)且因此在與小鼠脾細胞融合後之任何T細胞受體來源於融合搭配物。在第三次洗滌步驟後，移除上清液。藉由在45秒內添加1ml聚乙二醇(PEG；50% HybiMax,Sigma-Aldrich)來獲得融合條件。再培育45秒後，接著添加50ml無血清培養基以防止PEG之毒性效應。在1300rpm下不間斷離心細胞5分鐘以形成非常結實的集結塊。棄去上清液且非常緩慢地添加50ml新的無血清培養基，旨在不使集結塊移位。緩慢顛倒試管直至細胞再懸浮且如前所述離心。進行此操作兩次以移除剩餘PEG。用培養基進行最後的洗滌步驟。接著稀釋細胞且培養於96孔板中。在48小時後將培養基更換為選擇培養基(HAT培養基補充物，Sigma Aldrich)且選擇生長純系。保留選擇培養基2週，其後接著將培養基更換回正常培養基。
FVIII特異性T細胞融合瘤之胜肽特異性：測試T細胞融合瘤之抗原特異性。為此，使1×105個細胞與抗原呈現細胞共培養。吾等使用5×104個Mgar細胞(表現HLA-DRB1*1501)或1×105個來源於未處理的HLA-DRB1*1501-E17小鼠之完整脾細胞。在37℃、5% CO2下用10μg/mL人類rFVIII或1μg/mL胜肽/胜肽池培育細胞24小時。收集上清液且根據製造商方案使用IL-2 ELISA(BioLegend,San Diego,CA)或IL-2 Bio-Plex(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)量測釋放於培養上清液中之IL-2。在FVIII(或胜肽)存在(而非不存在)下IL-2釋放量20pg/ml視為陽性，或者在FVIII存在下，與不存在FVIII相比IL-2釋放量增加10倍視為陽性。
T細胞融合瘤之次選殖：為確保各純系僅表示一類T細胞，次選殖所有融合瘤純系。將融合瘤純系稀釋至0.3個細胞/孔之限制稀釋度且與每孔200個餵養細胞共培養。餵養細胞係藉由以絲裂黴素C處理融合搭配物細胞BW細胞來產生。在室溫下用0.1mg來自頭狀鏈黴菌(Streptomyces caespitosus)之絲裂黴素C(Sigma Aldrich)處理2×108個BW細胞10分鐘且在37℃、5% CO2下於培育箱中保持25分鐘。每個純系選擇五個生長次純系且測試其FVIII特異性。
用以確定T細胞融合瘤特異性之FVIII胜肽池：如Ay等人(Biopolymers 88：64-75(2007))所述，使用SPOT合成法產生FVIII胜肽池。簡言之，在兩種相同的纖維素膜上合成15聚體胜肽。將膜切割為垂直及水平條帶。自膜條帶釋放胜肽且在如上所述之特異性測試中用作胜肽池。將胜肽溶解於DMSO(Hybrimax,Sigma Aldrich)中且用PBS進一步稀釋。
結果
產生181種FVIII特異性融合瘤純系。針對覆蓋完整人類FVIII之胜肽庫篩選此等純系。使用偏移三個胺基酸之15聚體胜肽。使用此方法識別含有與HLA-DRB1*1501結合之胜肽的六個不同FVIII區。吾等發現人類FVIII之兩個胜肽域在A1域內、兩個胜肽在A2域內、一個在B域內、兩個在A3域內且一個胜肽域在C1域內。先前並未描述FVIII胜肽1401-1424(表11)。已在WO 09/071886中使用電腦預測程式繼之以T細胞融合瘤技術識別胜肽FVIII474-494、FVIII545-559、FVIII1788-1802及FVIII2161-2175。胜肽FVIII2030-2044揭示於WO 03/087161中。胜肽FVIII2161-2180已由Jacquemin等人，Blood 101(4)：1351-8(2003)公開。
應瞭解，本文所述之實施例及具體實例僅用於說明性目的且由其產生之各種變化或更改可為熟習此項技術者所想到且欲包括於本申請案之精神及範圍以及隨附申請專利範圍之範疇內。本文所引用之所有公開案、專利及專利申請案據此以全文引用的方式併入本文中以用於所有目的。
<110> 巴克斯歐塔公司 巴克斯歐塔有限公司
<120> 用於免疫耐受誘導及免疫診斷之FVIII胜肽
<130> 100139078
<150> 61/502,476
<151> 2011-06-29
<150> 61/467,894
<151> 2011-03-25
<150> 61/407,402
<151> 2010-10-27
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<170> PatentIn 3.5版
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Claims (36)

  1. 一種胜肽之用途，其係用於製造供誘導有需要之個體對於FVIII之免疫耐受性之用的醫藥品，其中該胜肽具有由下式組成之胺基酸序列：(R1)x-P-(R2)y，其中：P為與SEQ ID NO：68之序列具有至少90%一致性的胺基酸序列；R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；及x及y各自獨立地為0或1。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中P為與SEQ ID NO：68之序列具有至少95%一致性的胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中P為與SEQ ID NO：68之序列一致的胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之用途，其中x及y皆為0。
  5. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之用途，其中x為1且y為0。
  6. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之用途，其中x為0且y為1。
  7. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之用途，其中x及y皆為1。
  8. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之用途，其中該胜肽由24至100個胺基酸組成。
  9. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該胜肽由24至50個胺基酸組成。
  10. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該胜肽由24至25個胺基酸組成。
  11. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥品係與 具有由下式組成之胺基酸序列的第二胜肽組合投予：(R1)x-P-(R2)y，其中：P為與選自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：659及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸具有至少85%一致性的胺基酸序列；R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；及x及y各自獨立地為0或1。
  12. 如申請專利範圍第1項之用途，其中投予該醫藥品防止該個體產生抗FVIII抗體。
  13. 如申請專利範圍第1項之用途，其中投予該醫藥品減少該個體中所存在之抗FVIII抗體的量。
  14. 一種胜肽，其由以下胺基酸序列組成：(R1)x-P-(R2)y，其中：P為與SEQ ID NO：68之序列具有至少90%一致性的胺基酸序列；R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；及x及y各自獨立地為0或1。
  15. 如申請專利範圍第14項之胜肽，其中P為與SEQ ID NO：68之序列具有 至少95%一致性的胺基酸序列。
  16. 如申請專利範圍第14項之胜肽，其中P為與SEQ ID NO：68之序列一致的胺基酸序列。
  17. 如申請專利範圍第14項至第16項中任一項之胜肽，其中x及y皆為0。
  18. 如申請專利範圍第14項至第16項中任一項之胜肽，其中其中x為1且y為0。
  19. 如申請專利範圍第14項至第16項中任一項之胜肽，其中其中x為0且y為1。
  20. 如申請專利範圍第14項至第16項中任一項之胜肽，其中x及y皆為1。
  21. 如申請專利範圍第14項至第16項中任一項之胜肽，其中該胜肽由24至100個胺基酸組成。
  22. 如申請專利範圍第21項之胜肽，其中該胜肽由24至50個胺基酸組成。
  23. 如申請專利範圍第21項之胜肽，其中該胜肽由24至25個胺基酸組成。
  24. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第14項至第23項中任一項之胜肽。
  25. 如申請專利範圍第24項之組成物，其中該組成物經調配用於醫藥投予。
  26. 如申請專利範圍第24項或第25項之組成物，其中該組成物進一步包含第二多胜肽，該第二多胜肽由以下胺基酸序列組成：(R1)x-P-(R2)y，其中：P為與選自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：659及SEQ ID NO：740之序列的至少九個連續胺基酸具有至少85%一致性的 胺基酸序列；R1為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；R2為由1至80個胺基酸組成之胺基酸序列；及x及y各自獨立地為0或1。
  27. 一種製造FVIII胜肽之方法，該方法包含以下步驟：a)提供包含編碼如申請專利範圍第14項至第23項中任一項之FVIII胜肽之聚核苷酸的細胞之培養物；及b)在該細胞之培養物中表現該胜肽。
  28. 一種識別FVIII胜肽特異性T細胞之方法，該方法包含：a)使複數個CD4+ T細胞和與MHC II類多聚體複合之胜肽組合，其中該胜肽為如申請專利範圍第14項至第23項中任一項之FVIII胜肽；及b)識別對該與MHC II類多聚體複合之胜肽有特異性的該複數個CD4+ T細胞中之至少一員。
  29. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該MHC II類多聚體為MHC II類四聚體。
  30. 如申請專利範圍第28項或第29項之方法，其中該胜肽或MHC II類多聚體進一步包含可偵測部分。
  31. 如申請專利範圍第28項之方法，其進一步包含分離該至少一種對該胜肽有特異性之CD4+ T細胞。
  32. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該CD4+ T細胞係使用流動式細胞測量術分離。
  33. 一種融合蛋白，其包含：如申請專利範圍第14項至第23項中任一項之因子VIII胜肽；及第二胜肽。
  34. 如申請專利範圍第33項之融合蛋白，其中該第二胜肽為報導體胜肽。
  35. 如申請專利範圍第33項或第34項之融合蛋白，其中該融合蛋白係由核酸編碼。
  36. 如申請專利範圍第33項或第34項之融合蛋白，其中該FVIII胜肽係化學連接至該第二胜肽。
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