CN104519907A - 免疫调节剂及其用途 - Google Patents

Abstract

公开了用于治疗或预防关节损伤的免疫调节剂。特别是，公开了用于诱发聚集蛋白聚糖多肽抗原(包括其瓜氨酸化形式)特异性耐受原应答以治疗或预防患有早期RA或初期RA的个体的关节损伤(包括关节损伤)的免疫调节剂。

Description

免疫调节剂及其用途

本申请要求2012年3月23日提交的题目为“Immunomodulatory Agents and UsesTherefor(免疫调节剂及其用途)”的澳大利亚临时申请第2012901189号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明通常涉及可用于治疗或预防关节损伤的免疫调节剂。特别是，本发明涉及引发针对聚集蛋白聚糖多肽(包括瓜氨酸化形式)的抗原特异性耐受原应答的免疫调节剂治疗或预防患有早期RA或初期RA的对象中的关节损伤(包括关节损伤)的用途。

背景技术

炎性关节炎是多种自身免疫病的主要临床表现，包括类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎(PsA)、系统性红斑狼疮(SLE)、斯耶格伦氏综合征以及多发性肌炎。在体检时，这些患者中的大多数都患有关节畸形，但通常仅RA和PsA患者在显像研究时表现出骨侵蚀。

慢性炎性骨疾病如RA的发病机理尚未完全阐明。这类疾病伴有由于破骨细胞吸收增加所致的受影响的关节周围的骨丢失，所述破骨细胞吸收增加主要由促炎细胞因子的局部产生增加而介导(Teitelbaum,2000.Science 289:1504-1508；Goldring和Gravallese,2000.Arthritis Res.2(1):33-37)。这些细胞因子能够直接作用于破骨细胞谱系的细胞，或通过影响成骨细胞/基质细胞产生必须的破骨细胞分化因子即NF-κB配体的受体激活剂(RANKL)和/或其可溶性诱杀型受体即护骨蛋白(OPG)而间接发挥作用(Hossbauer等,2000.J.Bone Min.Res.15(1):2-12)。

RA是全身性炎性疾病，其影响约0.5-1％的北欧和北美的成年人群，以及世界上其他地区的稍低比例的人群(Alamanos和Drosos,2005.Autoimmun.Rev.4:130-136)。其特征是关节滑膜组织的慢性炎症，其最终由于慢性疼痛和疲劳而导致日常功能丧失。其是一种慢性炎性疾病。大多数患者还经历受影响关节中的软骨和骨的渐进性恶化，这最终可导致永久性残疾。RA的长期预后欠佳，约50％的患者在从诊断开始的10年内经历明显的功能性残疾。

描述了RA中的几个自身抗原，包括在患病关节中瓜氨酸化的多种蛋白。瓜氨酸化是在凋亡和炎症过程中发生的精氨酸瓜氨酸化(deimination)的生理过程。该过程导致含有精氨酸的蛋白得以修饰，这可在携带处于危险中的HLA等位基因的个体中产生若干组新的自身抗原(Vossenaar ER等,2004.Arthritis Res.Ther.6:107-11)。定位于DRβ-链第三高变区的氨基酸70-74的特异性HLA-DR基因变体与RA高度相关(Gregersen PK等,1987.Arthritis Rheum.30:1205-1213)。该区编码形成HLA-DR抗原结合沟中第四锚定囊(anchoring pocket)(P4)的保守氨基酸序列。这种“共同的易感性表位”(SE)发现于多种RA相关的DR等位基因中，包括白种人中的DRB1*0401、DRB1*0404以及DRB*0101(Gregersen PK等,1987,同上)。编码SE的HLA等位基因与ACPA-阳性RA尤其相关(Klareskog L等,2006.Arthritis Rheum.54:38-46；van Gaalen FA等,2004.Arthritis Rheum.50:2113-21；Hida S等,2004.J.Autoimmun.23:141-50；Hill JA等,2003.J.Immunol.171:538-41)。

SE是高度带正电荷的，位于DRβ-链的影响结合配体的P4氨基酸的特异性的区中，从而在该位置优先结合含有带负电荷的或非极性的氨基酸的肽。瓜氨酸化用不带电荷的羰基取代带电荷的精氨酸氨基侧链基团，并且增加人波形蛋白肽表位与SE⁺HLA DR分子的结合亲和性(Hill JA等,2003,同上；Snir O等,2011.Arthritis Rheum.n/a-n/a)。

约70％RA患者血清含有抗瓜氨酸化蛋白自身抗体(ACPA)(Meyer O等,2006.Arthritis Res.Ther.8:R40)。这种反应性反映了针对一组翻译后修饰的瓜氨酸化自身抗原的自身抗体的产生，包括纤维蛋白原、波形蛋白、II型胶原蛋白和烯醇化酶(Wegner N等,2010.Immunol.Rev.233:34-54)。在RA发作之前，ACPA发展高达15年，并且随着疾病发作的迫近，伴随效价和肽反应性的提高(van de Stadt LA等,2011.Arthritis Rheum.n/a-n/a)。在RA的发炎的组织中已经显示了瓜氨酸化蛋白，并且在许多小鼠炎性关节炎模型中诱导了ACPA(Masson-Bessiere C等,2001.J.Immunol.166:4177-84；Vossenaar ER等,2003.Arthritis Rheum.48:2489-500；Kuhn KA等,2006.J.Clin.Invest.116:961-73；Glant TT等,2011.Arthritis Rheum.63:1312-1321)。尽管针对响应应激和炎症，瓜氨酸化普遍存在，但是ACPA对于RA是高度特异性的，并且与较为严重的关节损伤和射线照相后果相关(Klareskog L等,2006,同上；van Gaalen FA等,2004,同上；Meyer O等,2006,同上)。

用瓜氨酸化纤维蛋白原而非天然纤维蛋白原免疫HLA-DRB1*0401转基因小鼠诱导了炎性关节炎，其特征在于B细胞和T细胞同时对瓜氨酸化HLA-DR-限制性纤维蛋白原表位和天然HLA-DR-限制性纤维蛋白原表位的自身反应性，这并不存在于幼稚HLA-DRB1*0401转基因小鼠中。瓜氨酸化纤维蛋白原而非天然纤维蛋白原诱导关节炎的能力表明：一个或多个瓜氨酸化新自身表位在引发表位扩展过程中或者由于表位扩展而破坏了T细胞对相应天然表位的耐受性(Hill JA等,2008.J.Exp.Med.205:967-979)。而且，最近的研究表明：阿巴西普(abatacept)的送递可以恢复对瓜氨酸化抗原的耐受性(YueD等,2010.Arthritis Rheum.62:2941-2952)。尽管有这些转基因小鼠的研究，但是由于自身反应性效应记忆T细胞体外进行的弱增殖应答，难以在RA患者中证明瓜氨酸特异性自身反应性T细胞。然而，几篇最近的文章已经显示了RA患者T细胞响应瓜氨酸化波形蛋白和聚集蛋白聚糖表位而进行的令人信服的细胞因子应答(Snir O等,2011,同上；vonDelwig A等,2010.Arthritis Rheum.62:143-149)。在波形蛋白的情况下，表位的免疫原性取决于肽序列中瓜氨酸修饰的位置(Snir O等,2011,同上)。

本发明人现在已经描绘了SE⁺健康对照和RA患者对一组瓜氨酸化和非修饰(天然)自身抗原的应答，并且表征了应答T细胞。发明人的目标是：(1)鉴别在ACPA⁺RA中特别相关的瓜氨酸化表位；(2)确定在瓜氨酸化自身抗原T细胞应答中个体变异程度；以及(3)鉴别有助于ACPA⁺RA发展的T细胞。

发明概述

本发明部分源于意料不到的发现，即，长期患病的RA患者更可能对多重瓜氨酸化自身抗原进行进行T淋巴细胞应答，而患有最近发作的RA的患者(包括之前未治疗的那些患者)更可能不响应抗原或仅响应瓜氨酸化聚集蛋白聚糖。基于这些发现，提出了全部或部分对应于聚集蛋白聚糖(包括瓜氨酸化聚集蛋白聚糖)的抗原可用于治疗或预防包括患有早期RA的对象(例如还不存在临床症状如关节肿胀或疼痛时)或处于发展RA(例如初期RA)风险的对象中的关节损伤的免疫治疗策略。

因此，一方面，本发明提供了治疗或预防对象的关节损伤的方法。这些方法通常包括、仅包括或基本包括(包括、由以下组成或由以下基本组成)在对象中诱发针对聚集蛋白聚糖多肽(例如瓜氨酸化聚集蛋白聚糖多肽，其在本文中也可交换地称为“cit-聚集蛋白聚糖”或“cit-agg”多肽)的抗原特异性耐受原应答，由此治疗或预防关节损伤。在一些实施方案中，对象患有早期RA或初期RA，并且在这种类型的说明性实例中，所述方法还包括，适当地在诱发抗原特异性耐受原应答之前，鉴别对象患有早期RA或初期RA。在一些实施方案中，对象对于共同的表位(SE)是阳性的，并且在这种类型的说明性实例中，所述方法还包括在诱发抗原特异性耐受原应答之前鉴别对象对SE是阳性的。适宜的是，对象具有针对聚集蛋白聚糖多肽(如cit-agg多肽)或其片段的免疫应答，或处于发展针对聚集蛋白聚糖多肽(如cit-agg多肽)或其片段的免疫应答的风险，所述免疫应答包括效应免疫应答(例如效应T淋巴细胞应答，诸如但不限于CD4⁺效应T淋巴细胞)。在非限制性实例中，免疫应答包括产生(例如分泌)至少一种选自白介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)以及白介素-10(IL-10)的细胞因子。在一些实施方案中，免疫应答包括促炎T淋巴细胞应答，其包括、仅包括或基本包括产生(例如分泌)至少一种选自IL-6、IFN-γ以及TNF的细胞因子。在这种类型的说明性实例中，促炎T淋巴细胞应答包括、仅包括或基本包括产生(例如分泌)IL-6。适宜的是，免疫应答至少部分由CD4⁺CD28^-T淋巴细胞产生。在一些实施方案中，免疫应答至少部分由CD4⁺CD28⁺T淋巴细胞产生。在具体实施方案中，免疫应答至少部分由CD4⁺CD28^-T淋巴细胞和CD4⁺CD28⁺T淋巴细胞产生。

抗原特异性耐受原应答可以利用任何合适的策略实现，其说明性实例包括：

(1)增加对象的耐受原抗原呈递细胞的数量，所述细胞呈递对应于聚集蛋白聚糖多肽(在本文中也称为“聚集蛋白聚糖特异性耐受原抗原呈递细胞”或“agg-tolAPC”)的一部分的肽(例如自身抗原)，其中所述部分与针对聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-agg多肽)的促炎或自身反应性T淋巴细胞应答相关；

(2)诱导对象中促炎或自身反应性T淋巴细胞(例如效应T淋巴细胞)的无反应性或凋亡，所述细胞对聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-agg多肽)或其部分是反应性的；以及

(3)增加对象的调节性或抑制性T淋巴细胞的数量，所述细胞抑制或以其它方式减少针对聚集蛋白聚糖多肽的促炎或自身反应性T淋巴细胞应答。

因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括、仅包括或基本包括增加对象的agg-tolAPC的数量，由此治疗或预防关节损伤。在一些实施方案中，agg-tolAPC刺激抑制或以另外方式减少针对聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的促炎或自身反应性T淋巴细胞应答的调节性或抑制性T淋巴细胞的产生。适宜的是，调节性或抑制性T淋巴细胞表达组成型调节性或抑制性T淋巴细胞的至少一(例如1、2、3、4、5等)个标记(例如选自CD4、CD25、CD62L、GITR、CTLA4中的至少一个标记)和转录因子叉头框(Forkhead box)P3(FoxP3)。说明性的调节性或抑制性T淋巴细胞包括但不限于CD4⁺CD25⁺调节性T淋巴细胞、Tr1淋巴细胞、T_h3淋巴细胞以及CD8⁺调节性T淋巴细胞。在具体实施方案中，调节性T淋巴细胞是CD4⁺CD25⁺。非限制性抗原呈递细胞包括树突细胞、巨噬细胞、朗格汉斯细胞、B淋巴细胞以及人工抗原呈递细胞。

聚集蛋白聚糖特异性耐受原抗原呈递细胞可以利用任何合适的策略产生。在一些实施方案中，它们通过使抗原呈递细胞(例如树突细胞、巨噬细胞、朗格汉斯细胞、B细胞等)与以下接触而产生：(1)至少一种NF-κB抑制剂，其量足以抑制所述抗原呈递细胞的NF-κB途径；和/或(2)至少一种mTOR抑制剂，其量足以抑制抗原呈递细胞的mTOR；和/或(3)至少一种Syk抑制剂，其量足以抑制抗原呈递细胞的Syk途径，以及使抗原呈递细胞与以下接触而产生：选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原或可表达抗原的核酸分子的抗原性分子，其量足以使抗原呈递细胞在其表面呈递抗原或其加工形式。在这种类型的说明性实例中，所述方法包括、仅包括或基本包括向对象(例如患有关节损伤或处于发展关节损伤风险的对象，如患有早期RA或初期RA的对象)共施用NF-κB抑制剂和选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原或可表达抗原的核酸分子的抗原性分子，其中以足以抑制对象的抗原呈递细胞中NF-κB活性的量施用所述抑制剂，且其中以足以使NF-κB活性受到抑制的抗原呈递细胞向对象的免疫系统呈递抗原或其加工形式的量施用所述抗原性分子。在其他说明性实例中，所述方法包括、仅包括或基本包括向对象(例如患有关节损伤或处于发展关节损伤风险的对象，如患有早期RA或初期RA的对象)共施用mTOR抑制剂和选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原或可表达抗原的核酸分子的抗原性分子，其中以足以抑制对象的抗原呈递细胞中的mTOR活性的量施用所述抑制剂，且其中以足以使mTOR活性受到抑制的抗原呈递细胞向所述对象的免疫系统呈递抗原或其加工形式的量施用所述抗原性分子。在其他说明性实例中，所述方法包括、仅包括或基本包括向对象(例如患有关节损伤或处于发展关节损伤风险的对象，如患有早期RA或初期RA的对象)共施用Syk抑制剂和选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原或可表达抗原的核酸分子的抗原性分子，其中以足以抑制所述对象的抗原呈递细胞中的Syk活性的量施用所述抑制剂，且其中以足以使NF-κB活性受到抑制的抗原呈递细胞向所述对象的免疫系统呈递抗原或其加工形式的量施用所述抗原性分子。适宜的是，当所述抗原性分子是可表达抗原的核酸分子时，所述核酸分子通常采用包含核苷酸序列的核酸构建体的形式，所述核苷酸序列编码所述抗原并且可操作地连接于在抗原呈递细胞可操作的调节元件。在这些实施方案中，一种或多种抑制剂(例如至少一种NF-κB抑制剂和/或至少一种mTOR抑制剂和/或至少一种Syk抑制剂)和/或所述抗原性分子通常采用适合引入(例如通过转化、内在化、内吞作用、吞噬作用)抗原呈递细胞或其前体的形式，其包括抑制剂和/或抗原性分子的可溶性形式和颗粒形式。

在一些实施方案中，使抗原呈递细胞与NF-κB途径的至少一种抑制剂接触，所述抑制剂的说明性实例列于下文的表2、3A、3B或4中。在具体实施方案中，NF-κB抑制剂是姜黄色素或姜黄色素衍生物。

聚集蛋白聚糖抗原可以包括、仅包括或基本包括对应于推定的全长瓜氨酸化聚集蛋白聚糖多肽(包括其未加工形式、部分加工形式和成熟形式)的氨基酸序列。可选地，聚集蛋白聚糖抗原可以包括、仅包括或基本包括瓜氨酸化聚集蛋白聚糖多肽的结构域，例如但不限于G1、G2和G3结构域。在一些实施方案中，所述抗原包括、仅包括或基本包括对应于T细胞表位的氨基酸序列。在其他实施方案中，所述抗原包括、仅包括或基本包括多个肽，其中单个肽包含对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的氨基酸序列的不同部分。在这种类型的说明性实例中，所述肽是重叠肽。

在相关的实施方案中，抑制剂(例如NF-κB抑制剂、mTOR抑制剂和/或Syk抑制剂)和抗原性分子以可溶性形式或颗粒的形式(例如抗原性分子和抑制剂都采用可溶性形式，或抗原性分子或抑制剂之一采用可溶性形式，而另一个采用颗粒形式，或抗原性分子和抑制剂都采用颗粒形式)共施用。在具体实施方案中，以颗粒的形式共施用抑制剂和抗原性分子。例如，可以将抑制剂和抗原性分子包含于一个或多个颗粒(例如纳米颗粒或微粒，如脂质体和聚合物颗粒)中，适宜的是，所述颗粒能被抗原呈递细胞摄取。在具体实施方案中，将抑制剂和抗原性分子包含于同一颗粒中。抑制剂和抗原性分子可以通过注射、通过局部应用或通过鼻或口腔途径，包括缓释给药模式，在一段时间内被施用，适宜的是，其量有效抑制或以其它方式减少针对聚集蛋白聚糖多肽的T淋巴细胞应答或改善RA的症状。在具体实施方案中，皮下共施用抑制剂和抗原性分子。

在其他实施方案中，通过在B淋巴细胞中表达编码全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原的核酸分子，产生agg-tolAPC，其中核酸分子的表达导致所述抗原或其加工形式在B淋巴细胞表面上的呈递。令人期望的是，在这些实例中，所述核酸分子还编码免疫球蛋白(例如IgG)或直接或间接与所述抗原融合(例如与所述抗原的C末端相邻)的免疫球蛋白的片段(例如Fv、Fab、Fab'以及F(ab')₂免疫球蛋白片段、免疫球蛋白重链等)。

在一些实施方案中，所述方法包括、仅包括或基本包括，以足以抑制或以另外方式减少针对聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的促炎或自身反应性T淋巴细胞应答或抑制所述应答发展的量，向所述对象施用agg-tolAPC或其前体。在这种类型的说明性实例中，agg-tolAPC或其前体通过以下方式产生：从对象或从组织相容性供体收获抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体并将其离体暴露于：(A1)至少一种NF-κB抑制剂，其量足以抑制抗原呈递细胞的NF-κB途径；和/或(A2)至少一种mTOR抑制剂，其量足以抑制抗原呈递细胞的mTOR；和/或(A3)至少一种Syk抑制剂，其量足以抑制抗原呈递细胞的Syk途径，以及暴露于(B)选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原或可表达抗原的核酸分子的抗原性分子，其量足以使抗原呈递细胞或其前体向所述对象的免疫系统呈递所述抗原或其加工形式。

在其他说明性实例中，agg-tolAPC或其前体通过以下方式产生：从所述对象或从组织相容性供体收获B淋巴细胞或B淋巴细胞前体，并向其中离体引入核酸分子，所述核酸分子与可在B淋巴细胞中操作的调节元件可操作地连接，且编码全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原，其中所述核酸分子的表达导致所述抗原或其加工形式呈递于B淋巴细胞的表面。在具体实施方案中，核酸分子还编码免疫球蛋白或直接或间接与所述抗原融合的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。适宜的是，当使用前体时，在足以从所述前体分化抗原呈递细胞的条件下培养所述前体一段时间。

在其他实施方案中，所述方法包括、仅包括或基本包括向所述对象施用MHC-肽复合体，所述复合体疾病基本上由全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原和具有抗原结合位点的分离的(例如可溶性)MHC组分(组件)组成，其中所述抗原结合所述抗原结合位点。

仍然在其他实施方案中，所述方法包括、仅包括或基本包括向所述对象施用包含免疫调节肽和免疫或T细胞结合配体(I/TCBL)的嵌合构建体，其中所述免疫调节肽包括、仅包括或基本包括对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的一部分(例如自身抗原)的氨基酸序列，适宜的是，所述部分与类风湿性关节炎(RA)相关，且结合促炎或自身反应性T淋巴细胞上的抗原受体(例如T细胞受体)，并且其中I/TCBL结合选自下述的一类或亚类T细胞：辅助T细胞、抑制性T细胞以及细胞毒性T细胞，并且调节T细胞活性。适宜的是，I/TCBL至少包含选自以下的分子的一部分：MHC I类分子、MHC II类分子、辅助分子如β2-微球蛋白、淋巴细胞功能相关分子-3(LFA-3)、免疫球蛋白分子重链Fc区、Ia⁺分子、CD2抗体、CD3抗体、CD4抗体、CD8抗体、凝集素抗体、淋巴因子。

在其他实施方案中，所述包括、仅包括或基本包括向所述对象使用改变的肽配体(APL)，所述改变的肽配体包括、仅包括或基本包括对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的一部分(例如自身抗原)的氨基酸序列，所述部分适宜地与类风湿性关节炎(RA)相关，并且结合促炎或自身反应性T淋巴细胞上的抗原受体(例如T细胞受体)，其中APL氨基酸序列与所述所述部分的氨基酸序列的区别在于至少一个氨基酸取代、缺失或增加，其通过抗原受体干扰正常的信号传导，并且具有至少一种选自以下的活性：(i)对抗T淋巴细胞对聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的应答，(ii)引起聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特异性T淋巴细胞的无反应性，(iii)引起聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特异性T淋巴细胞的凋亡，(iv)刺激或诱导聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特异性T_h2免疫应答，(v)抑制聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特异性T_h1免疫应答的发展，包括抑制促炎细胞因子的产生，(vi)刺激聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特异性调节性淋巴细胞(例如T调节性淋巴细胞(Treg))的激活，或(vii)防止或抑制炎性刺激物激活聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特异性抗原呈递细胞。

在相关方面，本发明延及剂(agent)在治疗或预防关节疾病(例如早期RA或初期RA)中的用途或在制造用于治疗或预防关节疾病(例如早期RA或初期RA)的药物中的用途，其中所述剂选自：(1)如上文广泛描述的，NF-κB途径抑制剂和选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原或可表达所述抗原的核酸分子的抗原性分子；(2)如上文广泛描述的，mTOR抑制剂和选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原或可表达所述抗原的核酸分子的抗原性分子；(3)如上文广泛描述的，Syk途径抑制剂和选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原或可表达所述抗原的核酸分子的抗原性分子；(4)如上文广泛描述的，编码全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原，用于引入B淋巴细胞的核酸分子；(5)如上文广泛描述的，MHC-肽复合体，其基本上由全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原和具有抗原结合位点的分离的(例如可溶性)MHC组分组成，其中所述抗原与抗原结合位点结合；(6)如上文广泛描述的，嵌合构建体；(7)如上文广泛描述的，聚集蛋白聚糖-特异性耐受原抗原呈递细胞；或(8)如上文广泛描述的，包括、仅包括或基本包括对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的部分的氨基酸序列的APL。

本发明的另一方面还涉及适合用于治疗或预防对象的关节损伤的组合物。这些组合物通常包括、仅包括或基本包括选自以下的剂：(1)如上文广泛描述的，NF-κB途径抑制剂和选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原或可表达所述抗原的核酸分子的抗原性分子；(2)如上文广泛描述的，mTOR抑制剂和选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原或可表达所述抗原的核酸分子的抗原性分子；(3)如上文广泛描述的，Syk途径抑制剂和选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原或可表达所述抗原的核酸分子的抗原性分子；(4)如上文广泛描述的，编码全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原，用于引入B淋巴细胞的核酸分子；(5)如上文广泛描述的，MHC-肽复合体，其基本上由全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原和具有抗原结合位点的分离的(例如可溶性)MHC组分组成，其中所述抗原与抗原结合位点结合；(6)如上文广泛描述的，嵌合构建体；(7)如上文广泛描述的，聚集蛋白聚糖-特异性耐受原抗原呈递细胞；或(8)如上文广泛描述的，包括、仅包括或基本包括对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的部分的氨基酸序列的APL。

附图说明

图1是显示用瓜氨酸化肽和天然肽刺激的健康对照和RA患者的T细胞增殖应答的图示。如所示，将20例RA患者和6名健康对照的PBMC和SFMC与0、3或30μg/mL肽或4Lfi/mL破伤风类毒素一起温育(培育)5天。通过[³H]胸苷摄取评估T细胞增殖。每一个点表示一个个体。比较多个平均值(Kruskal-Wallis检验)，对于RA患者而言***p<0.001，而对于健康对照而言**p<0.01，通过(曼-惠特尼检验)，比较健康对照和RA患者PBMC对破伤风类毒素的应答，**p<0.01。比较RA患者对瓜氨酸化和天然聚集蛋白聚糖肽的应答(曼-惠特尼检验)，*p<0.05。

图2是显示比较用瓜氨酸化和天然肽刺激的RA和健康对照单核细胞的未受刺激的细胞因子分泌和净IL-6分泌的图示。A：将17例RA患者和6名健康对照的PBMC在培养基中温育5天，并通过CBA评估上清液中的细胞因子。比较IFN-γ的产量与其他细胞因子的产量(Kruskal-Wallis检验和Dunns后验校正)，**p<0.01。B：如所示，将17例RA患者和6名健康对照的PBMC与0、3或30μg/mL肽一起温育，并通过CAB评估上清液中的IL-6。净细胞因子分泌计算为[用肽刺激的IL-6浓度]减去[无肽刺激的IL-6浓度]。每一个点代表一个个体。每一个点代表一个个体。比较IL-6对瓜氨酸化和天然肽的应答(Wilcoxon符号秩检验)，*p<0.05，**p<0.01。

图3是显示用瓜氨酸化和天然肽刺激的RA和健康对照PBMC的净TNF、IFN-γ、IL-10以及IL-17分泌的图示。如所示，将17例RA患者和6名健康对照的PBMC与0、3或30μg/mL肽一起温育，并通过CBA评估上清液中的细胞因子。按图2B，计算净细胞因子分泌。每一个点代表一个个体。比较IL-10对瓜氨酸化和天然聚集蛋白聚糖的应答(Wilcoxon符号秩检验)，*p<0.05。

图4是显示RA患者和健康对照所产生的细胞因子的呈递的图示。针对每一细胞因子，计算具有阳性应答的RA患者或健康对照的百分比(>2SD，高于针对相应天然多肽的平均应答)，并且针对对瓜氨酸化纤维蛋白原、聚集蛋白聚糖以及II型胶原蛋白的应答，将其绘制成图。

图5是显示RA患者和健康对照间瓜氨酸化肽反应性IL-6应答的多样性的图示。A：如所示，将17例RA患者和6名健康对照的PBMC和SFMC与0、3或30μg/mL肽一起温育，并且将上清液中每一个体的IL-6应答绘制成图。标示疾病病程和HLA类型。B：显示对于每一肽，患有近期发作或长期存在的疾病且具有阳性应答的RA患者的频率(>2SD，高于针对相应天然肽的平均应答)。

图6是显示CD4⁺T细胞亚群的细胞因子分泌的图示。将HLA-DR SE⁺RA患者和健康对照的PBMC与0或30μg/ml瓜氨酸化纤维蛋白原或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖一起温育，用针对CD4、CD28、IFN-γ和IL-6(A)或CD4、CD45RO、IL-6和IFN-γ(E)的mAb染色，然后通过流式细胞术进行分析。B：概述了门控策略(gating strategy)。C：荧光补偿对照(Fluorescence minus one,FMO)图，其显示门控于CD4⁺T细胞上的细胞内细胞因子染色的背景染色。D：门控的CD4^-非-T细胞的IL-6染色。在(E)中，分别针对不与肽、瓜氨酸化纤维蛋白原以及瓜氨酸化聚集蛋白聚糖一起温育，IL-6⁺CD4⁺CD45RO⁺T细胞的比例分别为2.2％、5.3％以及7.1％，IL-6⁺CD4⁺CD45RO^-T细胞的比例分别为0.8％、2.1％以及4％。显示了两例个体RA患者和1名健康对照。数据代表2名健康供体和5例RA患者。

图7显示NF-κB、mTOR或Syk抑制剂对RA患者的抗原呈递细胞的抑制阻抑它们响应瓜氨酸化聚集蛋白聚糖肽诱导T细胞细胞因子产生的能力。

图8显示RA患者中针对瓜氨酸化聚集蛋白聚糖G1表位的细胞因子应答。

图9显示瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特异性T细胞存在于类风湿性关节炎患者的外周血中，这通过四聚体染色确定。

图10显示外周血中cit-聚集蛋白聚糖-特异性T细胞的数量和荧光强度。

表A

序列简述

*Buzás等,2005.Cellular Immunology 235:98-108。

发明详述

1.定义

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的具有相同的含义。尽管在实施或检验本发明时，可使用任何与本文所述等同或相似的方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，定义了下列术语。

冠词“a(一个/种)”和“an(一个/种)”在本文中用于表示一个或多于一个(即至少一个)所述冠词的语法客体。作为实例，“一种要素(an element)”表示一个要素或多于一个要素。

术语“约”在本文中用于表示对于指定的情况可以变化多达15％、并且适宜的是多达10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的条件(例如量、浓度、时间等)。

术语“同时施用(administration concurrently或administering concurrently)”或“共施用(co-administering)”等指施用含有两种或多种活性物质的单一组合物，或将各活性物作为单独的组合物施用和/或在足够短的时期内通过单独的途径同期(contemporaneously)或同时(simultaneously)或顺序送递，其有效结果等同于作为单一组合物施用所有这些活性物质时获得的有效结果。“同时”表示基本上在同一时间，且理想的是在同一制剂中一起施用活性剂。“同期”表示在时间上接近地施用所述活性剂，例如在施用一种剂前或后约1分钟内至约一天内施用另一种剂。任何同期时间都是可用的。然而，情况往往是，当不同时施用时，在约1分钟内至约8小时内，优选小于约1至约4小时内，施用剂。当同期施用时，适宜的是，将所述剂施用于对象的同一部位。术语“同一部位”包括确切的位置，但是可以在约0.5至约15厘米，优选在约0.5至约5厘米内。本文所用术语“单独的”表示以一定间隔例如以约1天至几周或数月的间隔施用所述剂。可以以任意顺序施用所述活性剂。本文所用术语“顺序地”表示，按顺序施用所述剂，例如以一定间隔或数分钟、数小时、数天或数周的间隔。如果合适，以有规律的重复周期，施用所述活性剂。

本文所用术语“无反应性”表示免疫系统针对特异性抗原或抗原组的受到抑制的应答或非反应性状态。例如，当T淋巴细胞和B淋巴细胞在最佳刺激条件下不能响应它们的特异性抗原时，它们是无反应性的。

“抗原”表示能在脊椎动物特别是哺乳动物中诱发免疫应答的蛋白、肽、或其他分子或大分子的全部或部分。这类抗原也与以所述蛋白、肽或其他分子或大分子免疫的动物的抗体反应。

“抗原结合分子”表示对靶抗原具有结合亲和性的分子。应当理解的是，该术语延及免疫球蛋白、免疫球蛋白片段以及表现出抗原结合活性的非免疫球蛋白来源的蛋白框架。

“自体同源物(autologous)”指来源于相同生物体的事物(例如细胞、组织等)。

本文所用的术语“异源的”指遗传构成不同的细胞、组织、器官等。

“同种异体抗原”指仅在物种的一些成员中发现的抗原，如血型抗原。相比之下，“异种抗原”指存在于一个物种的成员中但是不存在于另一物种的成员中的抗原。相应地，“同种异体移植”是同一物种成员间的移植，而“异种移植”是不同物种成员间的移植。

本文所用的术语“生物样品”指可以从个提取、未处理、处理、稀释或浓缩的样品。生物样品可以包括生物流体，如全血、血清、血浆、唾液、尿液、汗液、腹水、腹膜液、滑液、羊水、脑脊液、组织活检等。在某些实施方案中，生物样品选自滑液和血液，包括外周血。

“临床改善”指由于治疗而防止RA或关节损伤进一步发展或RA或关节损伤的任何改善，如通过各种检测所确定，包括射线照相检验。因此临床改善例如可以通过以下方式确定：评估压痛或肿胀关节的数量，进行疾病活动度评分(Disease Activity Score,DAS)或美国风湿病学会(American College of Rheumatology,ACR)评分，对对象进行全局临床评估，评估红细胞沉降速率或评估C反应蛋白水平的量。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise、(comprises和comprising)”应理解为，暗示包括所述步骤或要素或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的组。因此，术语“包含”等的使用表示，所列要素是必须的或强制性的，但其他要素是任选的，且可以存在或可不存在。“仅包括(由…组成，consistingof)”表示包括且限于该词语“由……组成”后的任何事物。因此，所述词语“由……组成”表示，所列要素是必须的或强制性的，且不存在其他要素。“基本包括(基本上由……组成，consisting essentially of)”表示包括该词语后所列的任何要素且限于不干扰或有助于本文公开内容中针对所列要素指定的活性或作用的其他要素。因此词语“基本上由……组成”表示，所列要素是必须的或强制性的，但是其他元素是任选的，且可以存在或可以不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活性或作用。

“对应于(corresponds to或corresponding to)”指编码表现出与靶抗原的氨基酸序列实质相似性的氨基酸序列的抗原。通常，抗原会表现出与靶抗原的至少一部分至少约30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的相似性。

“瓜氨酸”和“Cit”指2-氨基-5-(氨基甲酰基氨基)戊酸，并且是α-氨基酸，化学式为H₂NC(O)NH(CH₂)₃CH(NH₂)CO₂H。

表述“有效量”指单一剂量或作为系列(series)的一部分的剂或药物的量，其有效治疗或预防RA或关节损伤。与施用这类量之前例如通过射线照相检验或其他检验所确定的基线相比，该量包括有效实现RA或关节损伤降低的量。有效量会随着待治疗个体的健康状况和身体状况、待治疗个体的分类学群组、组合物的配制、医疗状况的评估以及其他相关因素而变化。预期所述量会落入能通过常规试验而确定的相对宽泛的范围内。

本文所用的“基因疗法”指将一个基因或多个基因离体或体内插入个体细胞或细胞群(如组织或器官)，由此，所述一个基因或多个基因在所述细胞或细胞群中的表达提供治疗效果。这类“治疗基因”通常利用载体来送递。基因疗法靶向的细胞可以是体细胞或生殖细胞或细胞系。基因疗法包括和包含使用载体离体或体内送递需要在细胞或细胞群中超表达或异位表达的基因。载体可以促进新基因在细胞核中的整合，或导致该基因的附加型表达。

“免疫效应细胞”指能结合抗原并且介导对抗原具有选择性的免疫应答的细胞。这些细胞包括但不限于T细胞(T淋巴细胞)、B细胞(B淋巴细胞)、单核细胞、巨噬细胞、天然杀伤(NK)细胞以及细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，例如来自肿瘤、炎性或其他浸润液的CTL系、CTL克隆以及CTL。

在本文中提到“免疫相互作用”包括提到两个分子之间，特别是其中一个分子是或者模拟免疫系统的组分，的任何相互作用、反应或其他形式的联系。

“关节损伤”在本文中采用最宽泛的含义，并且指一个或多个关节——包括结缔组织和软骨——任何部分的损伤或部分或完全破坏，其中损伤包括任何原因的结构和/或功能损伤，并且可以或可以不引起关节疼痛/关节痛。其包括但不限于炎性关节疾病以及非炎性关节疾病相关或由其引起的关节损伤。这种损伤可以由任何疾病状况引起，如自身免疫病，特别是关节炎，更具体而言是RA。这种类型的示例性疾病状况包括急性和慢性关节炎、RA，包括幼年发病型RA、幼年特发性关节炎(JIA)或幼年RA(JRA)、以及诸如以下的阶段：类风湿性滑膜炎、痛风或痛风性关节炎、急性免疫关节炎、慢性炎性关节炎、变性关节炎、II型胶原蛋白诱导的关节炎、感染性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、斯蒂尔病(Still’s disease)、脊椎关节炎、骨性关节炎、慢性进育型关节炎(arthritis chronica progrediente)、关节变形、慢性原发性多关节炎(polyarthritis chronica primaria)、反应性关节炎、绝经期关节炎、雌激素衰竭性关节炎和强直性脊柱炎/类风湿性脊椎炎)、RA以外的风湿性自身免疫病和RA继发的重大系统性受累(involvement)(包括但不限于血管炎、肺纤维化或费耳提氏综合征(Felty’ssyndrome))。为本文目的，关节指(脊椎动物，诸如动物)骨骼各元件与包围和支持它的各部分之间的接触点，包括但不限于例如髋、脊柱的椎骨之间的关节、脊柱与骨盆之间的关节(骶髂关节)、腱和韧带附着于骨处的关节、肋骨与脊柱之间的关节、肩、膝、足、肘、手、指、踝和趾，尤其是手和足中的关节。

在本文中在指定细胞产生的基因表达产物(例如蛋白或转录物)的背景下提到“水平或功能活性”，应当以其最宽泛的含义考虑，并且包括在单个细胞中或在多个细胞或细胞群中产生的表达产物的水平或功能活性。因此，在后一情况下，应当理解的是，该措辞会包括多个细胞或细胞群所产生的蛋白的平均水平或功能活性。

“药学上可接受的载体”表示可以在局部或全身给药时安全使用的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质。

术语“多发性关节炎”和“滑膜炎”在本文中可交换使用，指对象的一个或多个关节的炎症，即肿胀、压痛(tenderness)或发热(warmth)。

“多肽”、“肽”以及“蛋白”在本文中可交换使用，指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于这样的氨基酸聚合物：其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。

本文所用的“预防(Prevention或prophylaxis)指预防性(prophylactic或preventative)措施。需要预防者包括待预防RA或关节损伤者，并且在一些实施方案中，可以是容易罹患RA或关节损伤或对RA或关节损伤敏感者，例如具有RA家族史的个体，或携带HLA-SE和抗-瓜氨酸化肽抗体但不满足RA的ACR/EULAR 2010标准的个体。与缺少致耐受性情况下RA或关节或结构损伤的发展相比，如果RA或关节损伤的发展完全或部分得到预防或减缓，则在本文中预防是成功的。

“调节性淋巴细胞”指参与调节或抑制其他细胞特别是其他免疫细胞如B淋巴细胞、T辅助淋巴细胞以及固有(包括NKT和γ-δT)淋巴细胞的应答和作用的淋巴细胞。

本文所用的“类风湿性关节炎”或“RA指可以根据用于RA分类的2000年修订的美国类风湿协会标准或任何相似的标准诊断的公认的疾病状态。该术语不仅包括活动性和早期RA，也包括初期RA，如下文所定义的。RA的生理指标包括对称性关节肿胀，其是典型的，尽管其在RA中不是不变的。手近端指间(PIP)关节以及掌指关节(MCP)、腕、肘、膝、踝和跖趾(MTP)关节的梭形肿胀通常受到影响，并且容易检测到肿胀。被动运动疼痛是关节炎症的最灵敏检测，并且，炎症和结构变型通常限制受影响关节运动的范围。典型的可视变化包括MCP关节处手指尺骨偏斜、MCP和PIP关节伸展过度或屈曲过度、肘屈曲挛缩以及腕骨和脚趾半脱位。RA包括例如幼年发病型RA、幼年特发性关节炎(JIA)或幼年RA(JRA)。患有“活动性类风湿性关节炎”的患者指具有活动性而非潜在RA症状的患者。患有“早期类风湿性关节炎”的对象是被诊断为患有‘明确的’RA不超过4年、不超过3年、不超过2年、不超过1年、不超过6个月的那些对象，其中根据用于RA分类的修订的2010美国风湿病学会(ACR)/欧洲抗风湿联盟(European League AgainstRheumatism,EULAR)标准(Aletaha等,2010.Arthritis&Rheumatism 62(9):2569-2581，其通过引用以其整体并入本文)，当对象的临床参数提供≥6/10的评分时诊断明确的RA。患有“初期RA”的患者患有不完全满足诊断明确的RA的ACR/EULAR标准(例如<6/10的评分)的早期多发性关节炎(滑膜炎)。在具体实例中，多发性关节炎与RA特异性预后生物标记如抗-环瓜氨酸化肽(CCP)抗体和SE⁺的存在相关。

本文所用的“共同的表位”或“SE”或“类风湿性表位”表示易患RA体质的HLA-DRB1*0401、*0404/0408、*0405、*0409、*0410、*0413、*0416、*0101、*0102、*0104、*1001、*1402和*1406等位基因编码的HLA-DRB1链第三高变区残基70-74的序列基序。具体而言，所述序列基序的特征为第三高变区中的编码序列QKRAA(SEQ ID NO:46)或QRRAA(SEQ ID NO:47)或RRRAA(SEQ ID NO:48)的氨基酸，包括主要组织相容性复合体II类分子HLA-DRB1链的氨基酸残基70-74。因为DNA分型检测给定基因座处的等位基因，因此基因座的名称位于特定等位基因名称之前(用星号将两个术语隔开)；例如HLA-DRB1*0401指HLA-DRB1基因座的0401等位基因。一个特定HLA-DR的特异性由几个HLA-DRB1等位基因结合HLA-DRA1基因座的产物编码；例如，超过11个HLA-DRB1等位基因(HLA-DRB1*0401至*0411)能够编码HLA-DR4特异性的B链。出于本文的目的，对用聚集蛋白聚糖特异性耐受原疗法治疗RA的反应性与具有纯合或杂合SE等位基因的患者中该遗传生物标记的发生率或存在正相关。

在本文中可交换使用的术语“对象(subject)”、“患者”或“个体(individual)”指需要治疗或预防的任何对象，特别是脊椎动物对象，更具体而言是哺乳动物对象。落入本发明范围内的合适的脊椎动物包括但不限于脊索动物亚门的任何成员，包括人类以及非人类灵长类动物、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)、兔类动物(例如兔子、野兔)、牛科动物(例如牛)、绵羊(ovine)(例如绵羊(sheep))、山羊(caprine)(例如山羊(goats))、猪(porcine)(例如猪(pig))、马科动物(equine)(例如马(horse))、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟(companion bird)，如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(例如海豚、鲸)、爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)以及鱼类。在具体实施方案中，“对象”、“患者”或“个体”是需要治疗或预防关节损伤的人类，包括患有早期RA的对象或处于发展RA(例如初期RA)风险的对象。在具体实施方案中，术语“对象”、“患者”或“个体”指任何单个人对象，包括符合治疗的患者，无论其例如被新诊断患有RA或关节损伤或以前被诊断患有RA或关节损伤而现在正经历复发(recurrence)或复发(relapse)或处于RA或关节损伤风险——不管什么原因，其正经历或者已经经历过RA或关节损伤的一种或多种病征、症状或其他指标。意图作为“对象”、“患者”或“个体”包括在内的是任何参与临床研究试验未表现出疾病的任何临床病征的对象，或是参与流行病学研究的对象，或曾经作为对照使用的对象。“对象”、“患者”或“个体”可能以前已经用RA或关节损伤药物进行过治疗或未进行过这样的治疗。

“抑制(阻抑，suppression、suppressing)”等表示针对抗原或抗原组的免疫应答的任何衰减或调节，所述免疫应答包括B淋巴细胞和T淋巴细胞免疫应答。在一些实施方案中，所述衰减至少部分地受抑制性T淋巴细胞(例如CD4⁺CD25⁺调节性T淋巴细胞)介导。

本文所用术语“表面活性剂”指优先吸附于两个不相混的相之间的界面的任何试剂，所述界面如水和有机聚合物溶液之间的界面，水/空气界面，或有机溶剂/空气界面。表面活性剂通常具有亲水部分和亲脂部分；从而在吸附于微粒时，它们倾向于将部分呈现给不以相似方式吸引包被(涂覆，coated)的颗粒的外部环境，从而降低颗粒凝聚。表面活性剂还可以促进治疗剂或诊断剂的吸收并增强所述剂的生物利用度。

本文所用的“掺入(incorporating)表面活性剂”的颗粒指至少在颗粒的表面具有表面活性剂的颗粒。表面活性剂可以在颗粒形成过程中掺入整个颗粒中以及表面上，或可以在颗粒形成后包被于颗粒上。表面活性剂可以通过吸附、粒子或共价附着、或被周围的基质以物理的方式“截留”而包被于颗粒表面上。可以将表面活性剂例如掺入控释颗粒，例如聚合微球中。

RA或关节损伤的“症状”是对象经历的任何病态现象或对正常的结构、功能或感觉的偏离，且指示RA或关节损伤，诸如上文提到的那些，包括压痛或肿胀关节。

“改良的Sharp总评分(Total modified Sharp score)”表示利用Genant(1983,Am.J.Med.,30:35-47)改良的Sharp方法评估射线照相而获得的评分。主要评估是总Sharp-Genant评分自筛选的变化。Sharp-Genant评分联合手足的侵蚀评分和关节空间隙狭窄评分。在这种检测评分中，通过小于基线处的评分的平均变化，估量关节损伤(当在第一次使用本文公开的耐受原组合物之前筛选或检测患者时)。

本文所用术语“转导(transduction)”或“转导的(transduced)”指将外来或外源核酸通常是DNA引入细胞，并且包括“稳定转导(stable transduction)”和“瞬时转导”。“稳定转导”或“稳定转导的”指外来或外源核酸向转导细胞基因组中的引入和整合。术语“稳定转导子(stable transductant)”指已经将外来DNA稳定整合到基因组DNA的细胞。相反，术语“瞬时转导”或“瞬时转导的”指将外来或外源核酸引入细胞中，其中外来或外源DNA未整合到转导细胞的基因组中。外来或外源DNA在转导细胞的细胞核中存留数日。在这期间，外来或外源DNA经受控制染色体中内源基因表达的调节控制。术语“瞬时转导子”指已经摄取了外来或外源DNA但是未能整合该DNA的细胞。

在本文中对象的“治疗”指治疗性处理。需要治疗者包括已经患有RA或关节损伤者以及待预防RA或关节损伤发展的那些对象。因此，对象可能已经被诊断为患有RA或关节损伤，或可能具有在缺少治疗的情况下可能发展的RA或关节症状或损伤。可选地，对象可能无症状，但是具有发展RA的风险因素，例如阳性家族史和/或在外周血中存在自身抗体如ACPA或类风湿因子或炎性表型的证据。与给药之前对象的状况相比，如果RA或关节损伤得到减轻或者愈合，或者RA或关节损伤的发展(包括其病征和症状和/或结构损伤)停止或减缓，则在本文中治疗是成功的。成功的治疗还包括完全或部分防止关节或结构损伤的发展。出于本文的目的，减缓或减少RA或关节损伤或关节损伤的发展与RA或关节损伤的抑制、减少或逆转相同。

术语“野生型”和“正常的”在本文中可交换使用，指为天然存在物种的大多数成员所特有的且与例如突变体表型形成对比的表型。

如本文所用的，基因的名称加下划线或采用斜体是表示所述基因，与其蛋白产物不同，其蛋白产物用缺少任何下划线或斜体的基因名称表示。例如“ACAN”表示ACAN基因(编码聚集蛋白聚糖的基因)，而“ACAN”则表示“ACAN”基因的蛋白产物或通过“ACAN”基因的转录和翻译以及可选的剪接而产生的产物。

2.缩写

在整个申请中，使用下述缩写：

aa＝           氨基酸

ACAN＝         聚集蛋白聚糖基因

ACAN＝         聚集蛋白聚糖多肽

ACPA＝         抗瓜氨酸化肽抗体

agg-tolAPC＝   聚集蛋白聚糖-特异性抗原呈递细胞

APC＝          抗原呈递细胞

cit-agg＝      瓜氨酸化聚集蛋白聚糖

d＝            天

GM-CSF＝       粒细胞巨噬细胞集落刺激因子

h＝            小时

IL-2＝         白介素2

IL-3＝         白介素3

IL-6＝         白介素6

IL-10＝        白介素10

IL-12＝        白介素12

IL-17＝        白介素17

kb＝           千碱基或千碱基对

kDa＝          千道尔顿

nt＝           核苷酸

nts＝          多个核苷酸

PB＝           外周血

PBMC＝         外周血单核细胞

RA＝           类风湿性关节炎

s＝            秒

SE＝           共同的表位

TCR＝          T细胞受体

tolAPC＝       耐受原抗原呈递细胞

TNF＝          肿瘤坏死因子

3.实施本发明的方式

本发明部分基于以下发现，即患有早期RA的患者更可能不对自身抗原进行T淋巴细胞应答，包括促炎性T淋巴细胞应答，或仅对瓜氨酸化聚集蛋白聚糖进行T淋巴细胞应答，包括促炎性T淋巴细胞应答，而患有长期存在的RA的患者更可能对多重自身抗原进行T淋巴细胞应答，包括促炎T淋巴细胞应答。这些结果表明，针对瓜氨酸化聚集蛋白聚糖的T淋巴细胞应答，包括促炎T淋巴细胞应答，先于随着RA的发展针对其他瓜氨酸化自身表位的T淋巴细胞应答的异质性成熟(heterogeneous maturation)。还发现，与其他瓜氨酸化自身表位相比，患有任何疾病持续时间的RA的患者更可能对瓜氨酸化聚集蛋白聚糖进行应答。基于这些发现，本发明人提出，全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽包括其瓜氨酸化形式的抗原会允许对受影响对象或易感对象(包括患有早期RA的对象和处于发展RA风险的对象)的关节损伤更早地进行治疗性和/或预防性干预，适宜的是，在所述疾病发展为慢性和衰弱形式的RA之前，并且提出，瓜氨酸化聚集蛋白聚糖抗原的治疗性应用会比其他瓜氨酸化抗原对RA群体作为整体提供更宽泛的覆盖度。

本发明因此提供了通过对针对聚集蛋白聚糖多肽的免疫应答(在本文中也称为“抗原特异性耐受原应答”)进行抗原特异性抑制来治疗或预防对象的关节损伤的方法。

3.1聚集蛋白聚糖特异性免疫应答和受影响的对象

聚集蛋白聚糖多肽通常是瓜氨酸化的，其中聚集蛋白聚糖序列中的至少一个精氨酸残基转化成瓜氨酸。如果需要，瓜氨酸化聚集蛋白聚糖多肽的存在可以利用直接检测瓜氨酸化聚集蛋白聚糖的测定(assay)进行确定，所述测定的说明性实例包括质谱分析，例如以下文献所述：等(2009,Arthritis Research&Therapy 11:R38)、Stensland等(2009,Rapid Commun Mass Spectrom.23(17):2754-2762)、Hermansson等(2010,Proteomics Clin Appl.4(5):511-518)、van Beers等(2010,Arthritis Res Ther.12(6):R219)以及De Ceuleneer等(2011,Rapid Commun Mass Spectrom.25(11):1536-1542)，上述文献通过引用整体并入本文。可选地，可以使用免疫测定，免疫测定利用例如抗修饰的瓜氨酸抗体检测目的抗原中的瓜氨酸残基，并且任选地使用抗原特异性抗体检测目的抗原自身(即无论是否瓜氨酸化)。这种类型的非限制性免疫测定描述于Tilleman等(2008,Rheumatology 47:597–604)、Tabushi等(2008,Annals of Clinical Biochemistry 45:413–417)和美国专利申请第2011/0244492号中，上述文献通过引用整体并入本文。在其他实例中，瓜氨酸化聚集蛋白聚糖的存在可以通过检测对瓜氨酸化聚集蛋白聚糖特异性的ACPA直接进行确定。这种类型的代表性测定可通过以下方式进行：利用对应于瓜氨酸化聚集蛋白聚糖多肽(cit-agg特异性肽)的一个或多个肽或对应于瓜氨酸化聚集蛋白聚糖多肽的蛋白作为抗原，并通过适当的方式检测包含于样品中的cit-agg特异性ACPA与所述肽抗原的结合。ACPA可以通过以下方式检测：均相测定形式(例如通过包被以cit-agg肽的乳胶颗粒的聚集)，异相免疫测定(例如基于直接或间接将cit-agg肽涂覆于固相，在允许ACPA抗体与肽抗原结合的条件下，将所述固相与已知或疑似包含cit-agg-特异性ACPA的样品一起温育，并直接或间接检测结合的ACPA)，或利用双抗原桥测定(double-antigen bridgeassay)，其中在该免疫测定的固相侧以及在检测侧都使用了cit-agg肽。这种类型的非限制性抗原特异性ACPA测定描述于例如Wegner等(2010，同上)和其中所列的参考文献，将其通过引用整体并入本文。

在具体实施方案中，对象被确定为患有选自本文所定义的早期RA或初期RA的RA分级(stratification)，并且在这种类型的说明性实例中，所述方法还包括在诱发抗原特异性耐受原应答之前确定对象患有RA分级。RA分级可以利用本领域从业人员已知的任何合适的临床参数进行确定，其非限制性实例包括：1)年龄；2)性别；3)有关关节的分布；4)晨僵持续时间；5)压痛关节的数量(例如掌指关节或跖趾关节间正挤压)；6)肿胀关节的数量；7)关节疼痛；8)以前的发作；9)RA家族史；10)全身流感样特征和疲劳存在与否；11)手和/或足的对称性关节受累；12)红细胞沉降速率；13)C反应性蛋白的水平；14)高敏感性C反应性蛋白的水平；15)类风湿因子(RF)的水平；16)ACPA抗体存在与否或水平；17)抗突变的瓜氨酸化波形蛋白的抗体(抗MCV抗体)存在与否或水平；18)SE存在与否；19)J蛋白即Hdj2(例如在滑液中)存在与否以及水平；20)类风湿小结；或21)射线照相变化。在具体实施方案中，利用Aletaha等(2010,同上)公开的RA的2010ACR/EULAR分类标准，评估RA的存在与否，所述标准概述于表1中。

表1

符号*、§、#、**、以及§§与Aletaha等(2010，同上)中具有相同的含义。

在说明性实例中，当对象被诊断为患有‘明确的’RA不超过4年、不超过3年、不超过2年、不超过1年、不超过6个月时，对象被确定为患有早期RA，其中当根据2010ACR/EULAR标准所述对象的评估临床参数提供的评分≥6/10时，明确的RA得以确定。在其他说明性实例中，当对象患有多发性关节炎(滑膜炎)但是未完全满足诊断明确的RA的ACR/EULAR标准(例如评分<6/10)时，所述对象被诊断为患有初期RA。在具体实例中，多发性关节炎与RA特异性预后生物标记如ACPA抗体和共同的阳性表位(SE⁺)相关。患有初期RA的对象包括ACPA抗体阳性患者，其存在多发性关节炎且仍然未诊断为明确的RA，但是处于继续发展明确的RA的高风险(例如95％的概率)，所述明确的RA根据2010ACR/EULAR标准确定。

在具体实施方案中，对象是SE⁺。当使对象容易患有RA时，利用鉴别主要组织相容性复合体II类分子HLA-DRB1链第三高变区残基70-74中的序列基序的任何合适的测定，能够检测共同的表位阳性率(positivity)。例如，所述序列基序的特征可以为氨基酸，其编码序列QKRAA(SEQ ID NO:46)或QRRAA(SEQ ID NO:47)或RRRAA(SEQ ID NO:48)，它们由例如HLA-DRB1*0401、*0404/0408、*0405、*0409、*0410、*0413、*0416、*0101、*0102、*0104、*1001、*1402以及*1406等位基因编码。所述测定可涉及利用例如序列分析、聚合酶链式反应(PCR)分型或寡核苷酸探针杂交(反向杂交)和本领域已知的免疫测定进行基因分型。在这些实施方案中，所述方法还包括在诱发抗原特异性耐受原应答之前确定对象是SE⁺。

本发明人还发现，在患有早期RA或处于发展RA风险的对象中，针对瓜氨酸化自身表位，包括瓜氨酸化聚集蛋白聚糖的T淋巴细胞(例如CD4⁺T淋巴细胞)应答包括产生(例如分泌)至少1、2、3或种细胞因子。在具体实施方案中，细胞因子选自IL-6、IFN-γ、TNF以及IL-10。T淋巴细胞应答主要包括促炎或自身反应性T淋巴细胞应答，其特征在于产生(例如分泌)至少1、2或3种促炎(例如T_h1或T_h17)细胞因子。在具体实施方案中，促炎细胞因子选自IL-6、IFN-γ以及TNF。因此，在一些实施方案中，本发明的方法还可以包括，在诱发抗原特异性耐受原应答之前，确定对象产生促炎T淋巴细胞应答(例如产生至少1、2或3种选自IL-6、IFN-γ以及TNF的促炎细胞因子)。然而，本发明人还观察到，患有早期RA或处于发展RA风险的对象更可能不针对表位或仅针对瓜氨酸化聚集蛋白聚糖产生IL-6，因此在这些对象中的T淋巴细胞应答的特征本质上在于IL-6的产生。因此，在具体实施方案中，本发明的方法还包括在诱发抗原特异性耐受原应答之前，确定对象产生IL-6。

为了确定对象是否进行T淋巴细胞应答，本发明的方法可以使用检测或评估释放的细胞因子的测定。细胞因子可以利用任何合适的技术测定。测定细胞因子水平的标准测定包括功能活性方案，诸如但不限于：(a)细胞因子诱导的指标细胞系的增殖；(b)细胞因子诱导的凋亡；(c)细胞因子诱导的防病毒感染保护；以及(d)细胞因子诱导的细胞因子产生。这类测定是本领域技术人员熟知的，可以见于例如“cytokine Bioassays(细胞因子生物测定)”(www.ebioscience.com/ebioscience/appls/BAC.htm)，其通过引用并入本文。可选地，可以利用以下手段测定细胞因子水平：常规细胞因子释放测定、细胞内细胞因子分泌测定、T细胞受体下游信号转导途径的激活检测以及指示T细胞应答的蛋白种类的mRAN的微阵列检测(如细胞因子mRNA，ELISA)，珠阵列或多重测定(multiplex assay)，这对本领域技术人员而言是熟知的。用于IL-6、IFN-γ、TNF以及IL-10的非限制性生物测定公开于实施例中。

本发明人已经确定，患有早期RA或处于发展RA风险的对象的T淋巴细胞应答至少部分地由CD4⁺CD28^-T淋巴细胞和/或CD4⁺CD28⁺T淋巴细胞产生。这类T淋巴细胞可以利用标准免疫测定按常规方式进行检测，所述标准免疫测定包括例如流式细胞术(例如利用荧光激活细胞分选仪(FACS))、免疫组织化学法、免疫磁性分离等。这种类型的非限制性免疫测定公开于实施例中。用于分析的T淋巴细胞可以从对象的任何合适的生物样品获得，其中的代表性样品包括血液(例如外周血)和滑液。

3.2用于产生聚集蛋白聚糖特异性耐受原应答的免疫调节剂

抗原特异性耐受原应答可以利用任何合适的策略诱发，其说明性实例包括：(1)增加对象的耐受原抗原呈递细胞，所述细胞呈递对应于聚集蛋白聚糖多肽的一部分的肽(例如自身抗原)(在本文中也称为“聚集蛋白聚糖-特异性耐受原抗原呈递细胞”或“agg-tolAPC”)，其中所述部分与针对聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-agg多肽)的促炎或自身反应性T淋巴细胞应答相关；(2)诱导对象的自身反应性效应淋巴细胞的无反应性或凋亡，所述细胞对聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-agg多肽)或其一部分是反应性的；以及(3)增加对象的调节性或抑制性T淋巴细胞的数量，所述细胞抑制或以另外方式减少自身反应性T淋巴细胞应答。

聚集蛋白聚糖特异性tolAPC可以通过以下方式产生：使抗原呈递细胞(例如树突细胞、巨噬细胞、朗格汉斯细胞等)与NF-κB途径的抑制剂接触，所述抑制剂的量足以抑制抗原呈递细胞的NF-κB途径，并与选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原或可表达所述抗原的核酸分子的抗原性分子接触，所述抗原性分子的量足以使抗原呈递细胞在其表面呈递抗原或其加工形式。体内和/或体外产生耐受原APC的非限制性方法描述于美国专利申请公开物20030153518、20060182726、20100151000和欧洲专利申请1462111中。在其他实施方案中，聚集蛋白聚糖特异性tolAPC通过以下方式产生：使所述抗原呈递细胞与mTOR抑制剂或Syk途径抑制剂接触以及与上文所述的抗原性分子接触，所述抑制剂的量足以抑制所述抗原呈递细胞的mTOR或Sy途径。

抗原呈递细胞包括专职型和兼性型抗原呈递细胞。专职抗原呈递细胞包括但不限于巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、骨髓谱系的细胞，包括单核细胞-粒细胞-DC前体、边缘区Küpffer细胞、小胶质细胞、T细胞、朗格汉斯细胞和树突细胞，包括指突状树突细胞和滤泡树突细胞。兼性抗原呈递细胞的实例包括但不限于激活的T细胞、星形胶质细胞、滤泡细胞、内皮细胞核成纤维细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞选自单核细胞、巨噬细胞、B-淋巴细胞、骨髓谱系细胞、树突细胞或朗格汉斯细胞。

3.2.1聚集蛋白聚糖抗原

聚集蛋白聚糖抗原可以包括、仅包括或基本包括对应于推定的全长聚集蛋白聚糖多肽(例如如SEQ ID NO:2或4所示，包括其瓜氨酸化形式)的氨基酸序列。可选地，抗原可以包括、仅包括或基本包括对应于成熟聚集蛋白聚糖多肽(例如如SEQ ID NO:37或39所示，包括其瓜氨酸化形式)或对应于其结构域例如但不限于G1结构域(例如如SEQ ID NO:41所示，包括其瓜氨酸化形式)、G2结构域(例如如SEQ ID NO:43所示，包括其瓜氨酸化形式)或G3结构域(例如如SEQ ID NO:43所示，包括其瓜氨酸化形式)的氨基酸序列。在其他实施方案中，抗原可以包括、仅包括或基本包括对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如如SEQ ID NO:5-35任一所示，包括其瓜氨酸化形式)的T细胞表位(例如自身抗原)的氨基酸序列。在具体实施方案中，抗原包括、仅包括或基本包括SEQ ID NO:32-35中任一序列所示的氨基酸序列。在非限制性实例中，所述抗原是HLA DR限制的，并且所述对象适宜的是HLA DR等位基因阳性的。在这些实例中，HLA DR结合肽(例如HLA-DRB结合肽)可以利用任何合适的方法预测，包括使用例如以下文献所述的预测算法：James等(2009,J Immunol 183:3249–3258；以及2010,Arthritis Rheum.62(10):2909–2918)、Knapp等(2011,BMC Bioinformatics 12:241)、Honeyman等(1997,Ann.Med.29:401-404)和Hu等(2010,Nucleic Acids Research 38:Web Server issue W474-W479)。

在一些实施方案中，所述抗原采用全部会部分对应于聚集蛋白聚糖多肽包括其瓜氨酸化形式的一种或多种肽的形式。通常，这类肽的长度至少为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30个氨基酸残基，并且适宜的是，长度不多于约500、200、100、80、60、50、40个氨基酸残基。在使用两种或多种肽的一些实施方案中，所述肽可以采用多个连续重叠肽的形式，其序列跨越至少聚集蛋白聚糖多肽(包括其瓜氨酸化形式)的一部分。合适的是，所述肽序列来源于对应于聚集蛋白聚糖多肽(包括其瓜氨酸化形式)的序列的至少约30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％。在一些实施方案中，多个连续重叠肽片段中的每一肽的长度可以为30-90个氨基酸，例如长度为30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、81、85、86和90个氨基酸。在各种实施方案中，多个连续重叠肽片段的氨基酸序列重叠约10个至约15个氨基酸，例如10、11、12、13、14以及15个氨基酸。适宜的是，肽的长度针对呈递至细胞毒性T淋巴细胞(例如肽的长度为约8个至约10个氨基酸)，或针对呈递至T辅助淋巴细胞(例如肽的长度为约12个至约20个氨基酸)而选择。产生这类肽抗原的示例性方法描述于例如Astori等(2000,J.Immunol.165:3497-3505；以及其引用的参考文献)和美国专利公布号2004/0241178中。如果需要，可以通过例如脂质修饰来修饰聚集蛋白聚糖抗原，以修饰其理化性质。实质上跨越整个聚集蛋白聚糖多肽长度的重叠肽的非限制性实例如SEQ IDNO:49-531所示。

聚集蛋白聚糖抗原可以从天然源(例如对象)分离。可选地，它们可以利用例如以下文献描述的标准方案以重组形式制备：Sambrook等,MOLECULAR CLONING.ALABORATORY MANUAL(分子克隆：实验室手册)(Cold Spring Harbor Press,1989)，特别是第16和17部分；Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(最新分子生物学实验方法汇编)(John Wiley&Sons,Inc.1994-1998)，特别是第10和16章；以及Coligan等,CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE(最新蛋白质科学实验指南)(John Wiley&Sons,Inc.1995-1997)，特别是第1、5和6章。在代表性实例中，聚集蛋白聚糖抗原可以通过包括以下步骤的程序制备：(a)提供可表达编码聚集蛋白聚糖抗原的核苷酸序列的表达载体；(b)将所述载体引入合适的宿主细胞；(c)培养所述宿主细胞以表达来自所述载体的重组多肽；以及(d)分离所述重组抗原。在具体实施方案中，聚集蛋白聚糖抗原对应于聚集蛋白聚糖多肽(瓜氨酸化或未瓜氨酸化)的序列，所述多肽由所述对象所属的动物物种产生。

可选地，利用例如Atherton和Sheppard(Solid Phase Peptide Synthesis:A PracticalApproach(固相肽合成：实用方法),IRL Press at Oxford University Press,Oxford,England,1989)或Roberge等(1995,Science 269:202)所述的溶液合成法或固相合成法，合成聚集蛋白聚糖抗原。

在一些实施方案中，聚集蛋白聚糖抗原包含至少一个瓜氨酸残基。瓜氨酸化抗原可以通过肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD)作用例如从天然、重组或合成形式的聚集蛋白聚糖抗原获得；它们也可以通过肽合成、通过直接将一个或多个瓜氨酸残基并入合成的聚集蛋白聚糖肽而获得。这些方法对于熟练的从业人员而言是熟知的。使用PAD酶制备瓜氨酸化抗原的说明性方法描述于美国专利公布号2011/0028399中。合成瓜氨酸化抗原的示例性方法描述于Perez等,2006.Chem Biol Drug Des 68:194–200)中。

在其他实施方案中，通常通过将编码所述抗原的核苷酸序列可操作地连接于启动子以形成核酸构建体，以核酸的形式提供聚集蛋白聚糖抗原，所述启动子可以是组成型的或诱导型的，且在目的抗原呈递细胞中是可操作的。将核酸构建体送递到抗原呈递细胞或其前体中可以通过以下方式实现：直接将患者暴露于所述核酸构建体，或首先用所述核酸构建体体外转化抗原呈递细胞或其前体，接着将转化的抗原呈递细胞或前体移植到所述患者中。

可以通过任何合适的方式将核酸构建体引入抗原呈递细胞，所述合适的方式包括例如通过使所述抗原呈递细胞与所述核酸构建体接触、电穿孔、转化、转导、接合(conjugation)或三亲本杂交、转染、用阳离子脂质进行感染膜融合、用DNA包被的微粒进行高速轰击、与磷酸钙-DNA沉淀物温育、直接微注射到单个细胞中等。其他方法也是可用的，并且是本领域技术人员已知的。在具体实施方案中，利用阳离子脂质例如脂质体引入核酸构建体。这类脂质体可商购获得(例如Lipofectamine^TM等，由Life Technologies,Gibco BRL,Gaithersburg,Md.提供)。

构建体的编码抗原的核苷酸序列可以保护天然存在的序列或其变体，所述变体已经利用重组技术进行了改造。在变体的一个实例中，对编码抗原的核苷酸序列进行密码子优化，以允许抗原在目的抗原呈递细胞中的表达增强。用于密码子优化的说明性方法描述于例如美国专利号5,795,737、WO 99/02694以及WO 00/42215中。

聚集蛋白聚糖抗原向抗原呈递细胞或其前体的送递可以通过本领域从业人员已知的方法来增强。例如已经研发了将外源抗原送递到抗原呈递细胞、特别是树突细胞的内源加工途径的若干不同策略。这些方法包括将抗原插入pH敏感性脂质体中(Zhou和Huang,1994.Immunomethods 4:229-235)，在对可溶性抗原的胞饮作用摄取后对胞饮泡进行渗透裂解(Moore等,1988.Cell 54:777-785)，将抗原偶联于有效佐剂(Aichele等,1990.J.Exp.Med.171:1815-1820；Gao等,1991.J.Immunol.147:3268-3273；Schulz等,1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:991-993；Kuzu等,1993.Euro.J.Immunol.23:1397-1400；以及Jondal等,1996.Immunity 5:295-302)，外来体(Zitvogel等,1998.Nat Med.4:594-600；2002,Nat Rev Immunol.2:569-79)，以及抗原的凋亡细胞送递(Albert等,1998.Nature392:86-89；Albert等,1998,Nature Med.4:1321-1324；国际公开WO 99/42564和WO01/85207)中。可以将重组细菌(例如大肠埃希杆菌(E.coli))或转染的哺乳动物宿主细胞脉冲到树突细胞上(分别作为颗粒抗原或凋亡小体)，用于抗原送递。已经使用重组嵌合病毒样颗粒(VLPs)作为将外源异源抗原送递到树突细胞系的MHC I类加工途径的媒介(Bachmann等,1996.Eur.J.Immunol.26(11):2595-2600)。

可选地或另外，可以将聚集蛋白聚糖抗原连接于或以另外方式结合于细胞溶素，以增强抗原向本发明的抗原呈递细胞的细胞溶胶的送递，用于送递至MHC I类途径。示例性细胞溶素包括皂苷化合物，如含有皂苷的免疫刺激复合体(ISCOMs)(见例如Cox和Coulter,1997.Vaccine 15(3):248-256以及美国专利号6,352,697)，磷脂酶(见例如Camilli等,1991.J.Exp.Med.173:751-754)，成孔毒素(例如α毒素)，革兰氏阳性细菌的天然细胞溶素，例如李斯特菌溶胞素O(LLO,例如Mengaud等,1988.Infect.Immun.56:766-772和Portnoy等,1992.Infect.Immun.60:2710-2717)，链球菌溶血素O(SLO,例如Palmer等,1998.Biochemistry 37(8):2378-2383)以及产气夹膜梭菌细胞溶素O(PFO，例如Rossjohn等,Cell 89(5),685-692)。如果抗原呈递细胞是吞噬体(phagosomal)，则可以有利地使用酸激活的细胞溶素。例如李斯特菌溶胞素在温和的酸性pH(吞噬体的pH条件)下表现出更强的成孔能力，从而促进将液泡(包括吞噬体和内体)内容物送递到细胞质(见例如Portnoy等,1992.Infect.Immun.60:2710-2717)。

可以将细胞溶素与聚集蛋白聚糖抗原一起以单个组合物的形式提供，或作为单独的组合物提供，用于接触抗原呈递细胞。在一个实施方案中，将细胞溶素融合于或以另外方式连接于抗原，其中融合或连接允许将抗原送递到靶细胞的细胞溶胶中。在另一实施方案中，细胞溶素和抗原以以下形式提供：送递媒介，例如但不限于脂质体，或选自病毒、细菌或酵母的微生物送递媒介。适宜的是，送递媒介是微生物送递媒介时，所述送递媒介是无毒的。在这种类型的优选实施方案中，送递媒介是例如描述于Portnoy等的美国专利号6,287,556中的无毒细菌，其包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸编码非分泌性功能性细胞溶素，其可操作地连接于在所述细菌中表达细胞溶素的调节性多核苷酸，所述第二多核苷酸编码一种或多种预选择的抗原。非分泌性细胞溶素可以通过各种机制提供，例如缺少功能性信号序列，分泌无能微生物，例如具有遗传损伤(例如功能性信号序列突变)的微生物或有毒的微生物等。可以使用各种无毒、非致病性细菌；优选的微生物是相对充分表征的菌株，特别是大肠埃希杆菌的实验室菌株，例如MC4100、MC1061、DH5α等。可以改造用于本发明的其他细菌包括以下细菌的充分表征的无毒、非致病性菌株：单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、分枝杆菌(mycobacterium)、沙门氏菌(Salmonella)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。在具体实施方案中，将所述细菌衰减(attenuate)为非复制性的、不整合到宿主细胞基因组中和/或细胞间或细胞内不显示活力的。

可以使用上文所述送递媒介将一个或多个聚集蛋白聚糖抗原送递到事实上任何能内吞所述媒介的抗原呈递细胞，包括吞噬和非吞噬抗原呈递细胞。在送递媒介是微生物的实施方案中，所述方法通常要求目标细胞摄取微生物并随后在抗原呈递细胞液泡(包括吞噬体和内体)中裂解。

3.2.2改变的肽配体

在一些实施方案中，改变的肽配体(APL)用于刺激聚集蛋白聚糖特异性致耐受性。适宜的是，APL包括、仅包括或基本包括对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的一部分(例如自身抗原)的氨基酸序列，所述部分适宜地与类风湿性关节炎(RA)相关，并且结合促炎或自身反应性T淋巴细胞上的抗原受体(例如T细胞受体)。APL氨基酸序列与聚集蛋白聚糖多肽部分的氨基酸序列的区别通常为至少一个氨基酸取代、缺失或增加，并且通过抗原受体干扰正常的信号传导。

可以基于利用本领域已知的任何方法鉴别的天然聚集蛋白聚糖肽表位，设计APL。例如，可以利用包括从抗原呈递细胞分离并测定MHC分子的方法鉴别结合MHC分子的肽(Chicz和Urban,1994.Immunol.Today 1-5:155-160。也可以构建噬菌体“噬菌体展示”文库。利用“噬菌体方法”(Scott和Smith,1990.Science 249:386-390；Cwirla等,1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382；Devlin等,1990.Science 249:404-406)，可以构建非常大的文库(10⁶-10⁸个化学实体)。鉴别可以使用的肽表位的其他方法主要包括化学方法，其中Geysen方法(Geysen等,1986.Molecular Immunology 23:709-715；Geysen等,1987.J.Immunologic Method 102:259-274；和Fodor等,1991.Science 251:767-773的方法)是实例。Furka等,1988.14th International Congress of Biochemistry(第十四届国际生物化学大会),卷5.摘要FR:013；Furka,1991.Int.J.Peptide Protein Res.37:487-493)。Houghton(美国专利号4,631,211)和Rutter等(美国专利号5,101,175)描述了产生可以作为激动剂或拮抗剂检测的肽的混合物的方法。可以使用的其他方法包括使用合成文库(Needels等,1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10700-4；Ohlmeyer等,1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922-10926；Lam等,国际专利公布号WO 92/00252，上述每一篇文献通过引用整体并入本文)，并且可以使用类似的方法筛选受体配体。基于cDNA差减或差别显示的技术在文献中已有充分描述，并且也可以使用，见例如Hedrick等,1984.Nature 308:149；和Lian和Pardee,1992.Science 257:967。与RNA印迹法、RNA酶保护以及反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)分析(Alwine等,1977.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5350；Zinn等,1983.Cell 34:865；Veres等,1987.Science 237:415)一样，表达序列标签(EST)方法是基因发现的有价值的工具(Adams等,1991.Science 252:1651)。可以使用的另一技术是“肽扫描”技术(Van der Zee,1989.Eur.J.Immunol.19:43-47)，其中在以96孔微量滴定板模式排列的聚乙烯棒上同时合成数打肽，与索引文库的相似之处在于每一钉(pin)的位置定义了其上的合成历史。随后从固体支持体上化学切割肽，将其提供给照射的同系胸腺细胞，用于抗原呈递。随后在通过³H胸苷掺入监测的增殖测定中检测克隆的CTL系的反应性。

SPHERE描述于WO 97/35035中。该方法利用在聚苯乙烯珠上合成的组合肽文库，其中每一珠含有一群纯的独特肽，所述肽可以以化学方式从所述珠上按离散的等份试样释放。利用检测T细胞激活的方法，包括例如.sup.3H-胸苷掺入(对CD4⁺或CD8⁺T细胞s)、⁵¹Cr释放测定(对于CTLs)或IL-2产生(对于CD4⁺T细胞)，筛选从汇集的珠阵列释放的肽，以鉴别能激活目的T细胞的肽库。通过利用迭代肽库/释放策略，仅在几天内筛选超过10⁷个肽是可能的。对相应阳性珠上的残留肽(>100pmoles)进行的分析允许快速且明确地鉴别表位序列。

鉴定结合CTL的聚集蛋白聚糖肽的测定的简单概述如下：大约说来，10个96孔板，每孔1000个珠会容纳10⁶个珠；10个96孔板，每个孔100个珠会容纳10⁵个珠。为了使每次筛选所需的CTL细胞的数量以及手动操纵的量最小化，可以将洗脱的肽进一步汇集，以产生具有任何期望的复杂性的孔。例如，基于用可溶性文库进行的实验，用少至2×10⁶个CTL细胞，在96孔板(每孔10,000个肽)中筛选10⁷个肽是可能的。在将一定比例的肽从珠上切割，将其与γ照射的培养APC和克隆的CTL系一起温育后，进一步检验通过³H-胸苷掺入确定的阳性孔。可选地，如上文所指出的，可以使用细胞因子产生或细胞溶解的⁵¹Cr释放测定。Coulie等,1992.Int.J.Cancer 50:289-291。如前所述，利用另外比例的来自每一珠的肽，逐一分离并分析来自各阳性孔的珠。随后解码阳性个体珠，从而鉴别反应性氨基酸序列。对所有阳性珠的分析会产生刺激检测的CTL克隆的保守取代的表位的部分特征(profile)。在这点上，肽可以被再合成和再检测。同时，为了列举特定CTL耐受的衍生物的完整范围(spectrum)，可以合成代表所有保守取代的(最小复杂性的)第二文库。通过同时筛选(同一MHC限制的)多重CTL，极大地促进了交叉反应性表位的研究。

所述的用于鉴别CD8⁺MHC I类限制性CTL表位的方法可用于鉴别CD4⁺MHC II类限制性CD4⁺T细胞表位。在这种情况下，合成MHC II类等位基因特异性文库，从而在适当的位置呈递单倍型特异性锚定残基。已经鉴别了常见等位基因的MHC II类限制位基序(见例如Rammensee,1995.Curr.Opin.Immunol.7:85-96；Altuvia等,1994.Mol.Immunol.24:375-379；Reay等,1994.J.Immunol.152:3946-3957；Verreck等,1994.Eur.J.Immunol.24:375-379；Sinigaglia和Hammer,1994.Curr.Opin.Immunol.6:52-56；Rotzschke和Falk,1994.Curr.Opin.Immunol.6:45-51)。肽的总长度通常为12-20个氨基酸残基，并且可以使用之前所述的方法限制文库复杂性。可以使用例如Atherton和Sheppard(1989,同上)或Roberge等(1995,同上)所述的溶液合成法或固相合成法，合成聚集蛋白聚糖APL。

在具体实施方案中，APL具有至少一种选自以下的活性：(i)对抗T淋巴细胞针对聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的应答，(ii)诱导聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖特异性T淋巴细胞的无反应性，(iii)诱导聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特异性T淋巴细胞凋亡，(iv)刺激或诱导聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖特异性Th2免疫应答，(v)抑制聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖特异性Th1免疫应答的发展，包括抑制促炎细胞因子的产生，(vi)刺激聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖特异性调节性淋巴细胞(例如T调节性淋巴细胞(Treg))的激活，或(vii)防止或抑制炎性刺激物激活聚集蛋白聚糖-或瓜氨酸化聚集蛋白聚糖-特异性抗原呈递细胞。

3.2.3NF-κB抑制剂

NF-κB抑制剂包括降低免疫细胞，特别是抗原呈递细胞中NF-κB的水平或功能活性的任何分子或化合物。NF-κB抑制剂可以采用各种形式，其非限制性实例包括小分子、核酸、肽、多肽、拟肽(peptidomimetic)等。

在一些实施方案中，NF-κB抑制剂降低NF-κB途径成员的水平或功能性活性，所述成员合适地选自BTK、LYN、BCR Igα、BCR Igβ、Syk、Blnk、PLCγ2、PKCβ、DAG、CARMA1、BCL10、MALT1、PI3K、PIP3、AKT、p38MAPK、ERK、COT、IKKα、IKKβ、IKKγ、NIK、RelA/p65、P105/p50、c-Rel、RelB、p52、NIK、Leu13、CD81、CD19、CD21和其在补体和凝血级联(coagulation cascade)中的配体、TRAF6、泛素连接酶、Tab2、TAK1、NEMO、NOD2、RIP2、Lck、fyn、Zap70、LAT、GRB2、SOS、CD3ζ、Slp-76、GADS、ITK、PLCγ1、PKCθ、ICOS、CD28、SHP2、SAP、SLAM以及2B4。在这种类型的说明性实例中，NF-κB抑制剂降低RelA/p65、P105/p50、c-Rel、RelB或p52中任一种或多种的水平或功能活性。适宜的是，在这些实施方案中，NF-κB抑制剂阻断、抑制或以另外方式对抗所述成员的至少一种功能或活性。在其他实施方案中，NF-κB抑制剂提高NF-κB途径的成员的水平或功能活性，所述成员适宜地选自SHP1、SHIP、PIR-B、CD22、CD72、FcgRIIB、IκB、P100、CTLA4、PD-1、Cbl、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DL以及Csk。在这些实施方案中，NF-κB抑制剂提高、刺激或以另外方式激动(agonize)所述成员的至少一种功能或活性。

种类繁多的NF-κB抑制剂在文献中有描述，而下表列出了其代表性实例：

表2抑制NF-ΚB激活的抗氧化剂

表3A.REL/NF-ΚB的蛋白酶体抑制剂和蛋白酶抑制剂

表3B.IκBα磷酸化和/或降解抑制剂

表4.NF-B的混杂抑制剂

在具体实施方案中，NF-κB抑制剂是IκB磷酸化抑制剂，如BAY 11-7082和BAY11-7085(BioMol,Plymouth Meeting,PA)、姜黄色素和姜黄色素衍生物或类似物。许多姜黄色素衍生物和类似物在本领域中是已知的，并且可以用于本发明中(见例如WO2007/051314；US 2006/0276536)。这类衍生物可能具有增强的溶解度或效力。姜黄色素衍生物的实例包括二甲氧基姜黄色素(Jeong等,2009.J.Clin.Biochem.Nutr.44:79–84)、3,5-二(2-氟亚苄基)-4-哌啶酮(EF24)(美国专利申请公开号20110059157)、二(芳基甲亚基)丙酮(WO 2007/000998)、去甲氧基姜黄色素以及二去甲氧基姜黄色素(WO 2006/117077)。可以使用的其他姜黄色素类似物包括二氢姜黄色素、四氢姜黄色素、六氢姜黄色素、二羟基四氢姜黄色素、益智酮A和益智酮B和它们的盐、氧化剂、还原剂、其糖苷和酯(美国专利申请公开号20030147979；美国专利号5,891,924)。姜黄色素类似物的另外的实例包括但不限于(a)阿魏酸(例如4-羟基-3-甲氧基肉桂酸；3,4-亚甲二氧基肉桂酸和3,4-二甲氧基肉桂酸)；(b)芳族酮(例如4-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3-丁烯-2-酮、姜油酮、4-(3,4-亚甲二氧基苯基)-2-丁酮、4-(p-羟苯基)-3-丁烯-2-酮、4-羟基苯戊酮(hydroxyvalerophenone)、4-羟基苄基丙酮、4-羟基二苯甲酮、1,5-二(4-二甲基氨基苯基)-1,4-戊二烯-3-酮)；(c)芳族二酮(例如6-羟基二苯甲酰基甲烷)(d)咖啡酸化合物(例如3,4-二羟基肉桂酸)；(e)肉桂酸；(i)芳族羧酸(例如3,4-二羟基氢肉桂酸、2-羟基肉桂酸、3-羟基肉桂酸和4-羟基肉桂酸)；(g)芳族酮基羧酸(aromatic ketocarboxylic acid)(例如4-羟苯基丙酮酸)；和(h)芳族醇(例如4-羟基苯乙基醇)。可用于本发明的这些类似物和其他代表性类似物还描述于WO 95/18606和WO 01/040188中。也可以使用其他姜黄色素衍生物和类似物，包括二聚体、葡聚糖以及树状聚合物共轭物(conjugate)(见例如美国专利申请公开号20100240905；Shi,W.等,2007.Org.Lett.9(26):5461-5464)。

姜黄色素或姜黄色素衍生物或类似物可以作为共轭物提供，例如前药。姜黄色素前药的实例是已知的(见例如Lu,P.等,2005.J Huazhong Univ Sci Technolog Med.Sci.25(6):668-670,678,Kapoor,N.等2007.Cancer Lett.248(2):245-250)，并且制备前药的方法也是已知的(见例如WO 2006/076734；美国专利号5,952,294；Balant,L.P.等,1990.Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinet.15:143-153；Bundgaard,H.等,1991.Drugs of the Future16:443-458)。同时，见美国专利申请公开第2007/0270464号。

期望的是，NF-κB抑制剂对宿主无毒，且副作用最小或微不足道。适宜的是，NF-κB抑制剂阻断可选的NF-κB途径或经典NF-κB途径和可选的NF-κB途径。

在一些实施方案中，NF-κB抑制剂采用核酸形式，通常通过将编码抑制剂的核苷酸序列与启动子可操作连接，从而形成核酸构建体，所述启动子可以是组成型的或者诱导型的，并且在目的抗原呈递细胞中是可操作的。将所述核酸构建体送递到抗原呈递细胞或其前体中，可以通过以下方式实现：将所述患者直接暴露于所述核酸构建体或首先用所述核酸构建体体外转化抗原呈递细胞或其前体，然后将转化的抗原呈递细胞前体移植到所述患者中。

将核酸构建体引入抗原呈递细胞并产生变异的核苷酸序列的注意事项，如3.2.1部分针对编码抗原的核酸构建体所讨论的，等同适用于可表达NF-κB抑制剂肽/多肽的核酸构建体。

3.2.4mTOR抑制剂

已知对mTOR途径的抑制刺激抗原呈递细胞(例如树突细胞、B细胞等)的致耐受性，如例如Delgoffe和Powell(2009.Immunology 127(4):459-465)和Fischer等(2009,HandbExp Pharmacol.188:215-232)所述。因此，在治疗或预防对象的关节损伤时，本发明考虑使用mTOR途径抑制剂以及抗原性分子，以抑制针对聚集蛋白聚糖多肽的免疫应答，所述抗原性分子选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原或可表达所述抗原的核酸分子。

本文所用的mTOR抑制剂包括降低免疫细胞，特别是抗原呈递细胞的mTOR水平或功能活性的任何分子或化合物。mTOR抑制剂可以采取各种形式，其非限制性实例包括小分子、核酸、肽、多肽、拟肽等。

在一些实施方案中，mTOR抑制剂选自雷帕霉素，其是已知的由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生的大环内酯抗生素，和雷帕霉素衍生物，例如在位置40和/或16和/或32取代的雷帕霉素，例如(I)的化合物：

其中R₁是CH₃或C_3-6炔基，

R₂是H、–CH₂–CH₂–OH或–CH₂–CH₂–O–CH₂–CH₃。

3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基-丙酰基(propanoyl)或四唑基，例如四唑-1-基，且X是＝O、(H,H)或(H,OH)，条件是当X是＝O且R₁是CH₃时，R₂不是H。

当式I化合物的R₂是–CH₂–CH₂–OH时，式I的化合物包括其生理上可水解的醚，例如–CH₂–CH₂–O–C_1-8)烷基。

式I化合物的代表性实例包括例如40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素(也称为依维莫司)、32-去氧雷帕霉素(deoxorapamycin)、16-O-取代的雷帕霉素如16-戊-2-炔基氧-32-去氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧-32(S或R)-二氢-雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧-32(S或R)-二氢-40-0-(2-羟乙基)-雷帕霉素、40-[3-羟基-2-(羟基-甲基)-2-丙酸甲酯]-雷帕霉素(也称为CCI779),40-表-(四唑基)-雷帕霉素(也称为ABT578)或40-O-乙氧基乙基-雷帕霉素(也称为西罗莫司类似物(biolimus)9)。

mTOR抑制剂还包括例如公开于WO9802441、WO0114387和WO0364383(其在此通过引用整体并入)的所谓的雷帕霉素类似物(rapalogs)，如AP23573，例如40-O-(二甲基膦酰基)-雷帕霉素、WO2005047295中实施例1公开的化合物，也称为西罗莫司类似物A9、以及以名称TAFA-93公开的化合物。其他mTOR抑制剂例如公开于WO2004101583、WO9205179、WO9402136、WO9402385、WO9613273中，其在此通过引用整体并入。

在一些实施方案中，mTOR抑制剂包括雷帕霉素，式I的化合物，例如且包括雷帕霉素类似物、TAFA-93，更优选雷帕霉素、式I的化合物或雷帕霉素类似物。

在具体实施方案中，mTOR抑制剂是WO9409010的实施例8公开的40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素。

在其他实施方案中，mTOR抑制剂是例如WO9641807公开的32-去氧雷帕霉素或16-戊-2-炔基氧-32(S)-二氢-雷帕霉素，或WO9516691公开的化合物。

示例性mTOR抑制剂包括：雷帕霉素和/或40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素，和/或32-去氧雷帕霉素，和/或16-戊-2-炔基氧-32-去氧雷帕霉素，和/或16-戊-2-炔基氧-32(S或R)-二氢-雷帕霉素，和/或16-戊-2-炔基氧-32(S或R)-二氢-40-0-(2-羟乙基)-雷帕霉素，和/或40-[3-羟基-2-(羟基-甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕霉素(也称为CCI779)和/或40-表-(四唑基)-雷帕霉素(也称为ABT578)，和/或AP23573，和/或西罗莫司类似物A9，例如，和/或以TAFA-93名称公开的化合物，如40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素，和/或32-去氧雷帕霉素，和/或CCI779，和/或ABT578，和/或AP23573。

在其他实施方案中，mTOR抑制剂选自吡唑并嘧啶衍生物，包括但不限于具有下述式(II)和式(III)结构的化合物：

在式(II)或(III)化合物的一些实施方案中，R¹、R³和R⁴独立地为氢、卤素、–CN、–CF₃、–OH、–NH₂、–SO₂、–COOH、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基，或取代或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R³或R⁴中至少一个为氢。在一些实施方案中，R¹、R³和R⁴独立地为氢或取代或未取代的C₁-C₁₀烷基(例如C₁-C₅烷基或C₁-C₃烷基)。R'、R³和R⁴还可以独立地为氢或未取代的C₁-C₁₀烷基(例如C₁-C₅烷基或C₁-C₃烷基)。

在式(II)或(III)的一些实施方案中，R¹、R³和R⁴独立地为氢、卤素、–CN、–CF₃、–OH、–NH₂、–SO₂、–COOH、R⁷-取代或未取代的烷基、R⁷-取代或未取代的杂烷基、R⁷-取代或未取代的环烷基、R⁷-取代或未取代的杂环烷基、R⁷-取代或未取代的芳基或R⁷-取代或未取代的杂芳基。R⁷独立地为氧代(oxo)、卤素、–CN、–CF₃、–OH、–NH₂、–SO₂、–COOH、R⁸-取代或未取代的烷基、R⁸-取代或未取代的杂烷基、R⁸-取代或未取代的环烷基、R⁸-取代或未取代的杂环烷基、R⁸-取代或未取代的芳基或R⁸-取代或未取代的杂芳基。R⁸独立地为卤素、氧代、–CN、–CF₃、–OH、–NH₂、–SO₂、–COOH、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R¹是取代或未取代的烷基或取代或未取代的杂环烷基(例如吗啉代)。在一些实施方案中，用–C(O)R^8A取代R¹，其中R^8A是未取代的烷基。

在式(II)的一些实施方案中，R²独立地为氢、卤素、–CN、–CF₃、–OR⁵、–NH₂、–SO₂、–COOH、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R²独立地为氢、–OR⁵、–CN、–NH₂、–SH、–CN、–CF₃、NO₂或取代或未取代的烷基。R⁵独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R⁵是氢或取代或未取代的烷基(例如未取代的C₁-C₅烷基)。

R²可以独立地为氢、卤素、–OR⁵、–CN、–NH₂、–SH、–CN、–CF₃、–NO₂，R⁹-取代或未取代的烷基，R⁹-取代或未取代的杂烷基，R⁹-取代或未取代的环烷基，R⁹-取代或未取代的杂环烷基，R⁹-取代或未取代的芳基或R⁹-取代或未取代的杂芳基。R⁹独立地为卤素、氧代、–CN、–CF₃、–OH、–NH₂、–SO₂、–COOH，R¹⁰-取代或未取代的烷基，R¹⁰-取代或未取代的杂烷基，R¹⁰-取代或未取代的环烷基，R¹⁰-取代或未取代的杂环烷基，R¹⁰-取代或未取代的芳基或R¹⁰-取代或未取代的杂芳基。R¹⁰独立地为卤素、氧代、–CN、–CF₃、–OH、–NH₂、–SO₂、–COOH、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在其他实施方案中，R²是–OR⁵。在一些相关实施方案中，R⁵是氢或未取代的C₁-C₅烷基(例如氢)。

在式(II)或(III)的一些实施方案中，R⁵独立地为氢、R¹¹-取代或未取代的烷基、R¹¹-取代或未取代的杂烷基、R¹¹-取代或未取代的环烷基、R¹¹-取代或未取代的杂环烷基、R¹¹-取代或未取代的芳基或R¹¹-取代或未取代的杂芳基。R¹¹独立地为卤素、氧代、–CN、–CF₃、–OH、–NH₂、–SO₂、–COOH、R¹²-取代或未取代的烷基、R¹²-取代或未取代的杂烷基、R¹²-取代或未取代的环烷基、R¹²-取代或未取代的杂环烷基、R¹²-取代或未取代的芳基或R¹²-取代或未取代的杂芳基。R¹²独立地为卤素、氧代、–CN、–CF₃、–OH、–NH₂、–SO₂、–COOH、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。

在式(III)的一些实施方案中，R⁶独立地为氢、卤素、–CN、–CF₃、–OR⁵、–NH₂、–SO₂、–COOH、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。R⁶还可以独立地为氢、–OR⁵、–CN、卤素、–NH₂、–SH、–CN、–CF₃、–NO₂、卤素或取代或未取代的烷基(例如未取代的C₁-C₅烷基)。R⁵的定义如上文式(I)的描述。在一些实施方案中，R⁶独立地为氢、–OR⁵、–CN、–NH₂、–SH、–CN、–CF₃、–NO₂、R¹³-取代或未取代的烷基、R¹³-取代或未取代的杂烷基、R¹³-取代或未取代的环烷基、R¹³-取代或未取代的杂环烷基、R¹³-取代或未取代的芳基或R¹³-取代或未取代的杂芳基。R¹³独立地为卤素、氧代、–CN、–CF₃、–OH、–NH₂、–SO₂、–COOH、R¹⁴-取代或未取代的烷基、R¹³-取代或未取代的杂烷基、R¹⁴-取代或未取代的环烷基、R¹⁴-取代或未取代的杂环烷基、R¹⁴-取代或未取代的芳基或R¹⁴-取代或未取代的杂芳基。R¹⁴独立地为卤素、氧代、–CN、–CF₃、–OH、–NH₂、–SO₂、–COOH、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。R⁶还可以独立地为氢、–OR⁵、–CN、卤素、–NH₂、–SH、–CN、–CF₃、–NO₂、卤素或未取代的C₁-C₅烷基。在一些实施方案中，R⁶是氢。

式(II)或(III)的一些实施方案中，R³和R⁴是氢。在式(II)的一些实施方案中，n是1或2。式(II)的一些相关的实施方案中，n是1。在其他相关的实施方案中，R²是–OR⁵，且n是1。仍然在其他相关实施方案中，R⁵是氢。在式(III)的一些实施方案中，z是从1-2的整数。在一些实施方案中，z是1。

在一些实施方案中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³和/或R¹⁴是大小受限的取代基。在一些实施方案中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³和/或R¹⁴是如本文所述任选取代的C₁-C₁₀、C₁-C₅烷基或C₁-C₃烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基等。在一些实施方案中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³和/或R¹⁴是如本文所述任选取代的2-10元、2-5元或2-3元杂烷基。在一些实施方案中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³和/或R¹⁴是如本文所述任选取代的C₃-C₁₀、C₃-C₈、C₃-C₆或C₃-C₅环烷基，包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。在一些实施方案中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³和/或R¹⁴是如本文所述任选取代的3元、4元、5元、6元、7元、8元、9元或10元杂环烷基，包括但不限于氮杂环丙烷、环氧乙烷、硫杂丙环、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、噻丁环(thietane)、吡咯烷、二氢呋喃、四氢吡喃、二氢噻吩、四氢噻吩、哌啶、二氢吡喃、四氢吡喃、二氢噻喃、四氢噻喃。在一些实施方案中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³和/或R¹⁴是如本文所述任选取代的C₆-C₁₀芳基，包括但不限于苯基或萘基。在一些实施方案中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³和/或R¹⁴是本文所述任选取代的5-10元、5-6元杂芳基。

在其他实施方案中，生物活性剂(例如式(II)或(III)的化合物)选自下述化合物：

3.2.5Syk抑制剂

可选地或另外，抗原呈递细胞(例如树突细胞、B细胞等)的致耐受性可以通过抑制Syk途径而受到刺激，如例如Colonna等(2010.J Immunol.185(3):1532-43),Matsubara等(2006.Am J Respir Cell Mol Biol.34(4):426-433)和Nakashima等(2004.Eur JPharmacol.505(1-3):223-228)所述。因此，本发明还考虑了联合使用Syk抑制剂与抗原性分子来抑制针对聚集蛋白聚糖多肽的免疫应答并治疗或预防对象的关节损伤，所述抗原性分子选自部分或全部对应于聚集蛋白聚糖多肽(例如cit-聚集蛋白聚糖多肽)的抗原或可表达所述抗原的核酸分子。

本文所用的Syk途径抑制剂包括降低通过Syk途径的信号传导或降低免疫细胞，特别是抗原呈递细胞中Syk的水平或功能活性的任何分子或化合物。Syk抑制剂可以采取各种形式，其非限制性实例包括小分子、核酸、肽、多肽、拟肽等。

在一些实施方案中，Syk抑制剂选自美国专利号6,432,963公开的化合物，将所述专利通过引用整体并入本文。示例性化合物例如包括在第3栏第45行至第6栏第22行之间所示的定义中，特别是选自以下的化合物：2-(2-氨乙基氨基)-4-(3-甲基苯胺基)嘧啶-5-氨甲酰、2-(2-氨乙基氨基)-4-(3-三氟甲基苯胺基)嘧啶-5-氨甲酰、2-(4-氨基丁基氨基)-4-(3-三氟甲基苯胺基)嘧啶-5-氨甲酰、2-(2-氨乙基氨基)-4-(3-溴苯胺基)嘧啶-5-氨甲酰、2-(2-氨乙基氨基)-4-(3-硝基苯胺基)嘧啶-5-氨甲酰、2-(2-氨乙基氨基)-4-(3,5-二甲基苯胺基)嘧啶-5-氨甲酰、2-(2-氨乙基氨基)-4-(2-萘氨基)嘧啶-5-氨甲酰、2-(顺式-2-氨基环己基氨基)-4-(3-甲基苯胺基)嘧啶-5-氨甲酰、2-(顺式-2-氨基环己基氨基)-4-(3-溴苯胺基)嘧啶-5-氨甲酰、2-(顺式-2-氨基环己基氨基)-4-(3,5-二氯苯胺基)嘧啶-5-氨甲酰以及2-(顺式-2-氨基环己基氨基)-4-(3,4,5-三甲氧基苯胺基)嘧啶-5-氨甲酰或其盐。合成这类化合物的方法示于第6栏第43行至第13栏第17行。

本发明所用的Syk抑制剂还包括美国专利申请公开第US2004/0029902号公开的化合物，据此将该公开通过引用整体并入本文；包括第[0109]段到第[0218]段之间所示的定义包括的化合物，特别是选自以下的化合物：N2,N4-[(2,2-二甲基-4H-苯并[1,4]噁嗪-3-酮)-6-基]-5-氟代-2,4-嘧啶二胺、N4-(3,4-二氯苯基)-5-氟代-N2-(吲唑啉(indazoline)-6-基)-2,4--嘧啶二胺、N4-(3,4-乙烯二氧苯基)-5-氟代-N2-(1-甲基-吲唑啉-5-基)-2,4--嘧啶二胺、N2,N4-二(3-羟苯基)-5-氟代-2,4-嘧啶二胺、N2,N4-二(3,4-乙烯二氧苯基)-5-氟代-2,4-嘧啶二胺、N4-(1,4-苯并噁嗪-6-基)-5-氟代-N2-[3-(N-甲氨基)羰基亚甲基氧苯基(carbonylmethyleneoxyphenyl)]-2,4-嘧啶二胺、N2,N4-二(3-氨基苯基)-5-氟代-2,4-嘧啶二胺、N4-(3,4-乙烯二氧苯基)-5-氟代-N2-[3-(N-甲氨基)-羰基亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N4-(3-羟苯基)-N2-[3-(N-甲氨基)羰基亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、N4-(3-羟苯基)-5-三氟甲基-N2-[3-(N-甲氨基)羰基亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N4-[(1H)-吲哚-6-基]-N2-[3-(N-甲氨基)羰基亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N4-(3-羟苯基)-N2-[3-(N-甲氨基)羰基亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N2-(3-甲氨基羰基亚甲基氧苯基)-N4-[2-H-吡啶并[3,2–b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮-6-基]-2,4-嘧啶二胺、N4-(3,4-乙烯二氧苯基)-5-氟代-N2-[3-(2-羟乙基-氨基)羰基亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N4-(3-羟苯基)-N2-[3-(N-甲氨基)羰基亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、N2,N4-二(吲哚-6-基)-5-氟代-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N2-[2-(2-羟基-1,1-二甲氧基乙基氨基)羰基苯并呋喃-5-基]--N4-(3-羟苯基)-2,4-嘧啶二胺、N2-[3-(N2,3-二羟基丙氨基)羰基亚甲基氧苯基]-N4-(3,4-乙烯二氧苯基)-5-氟代-2,4-嘧啶二胺、N2-(3,5-二甲氧基苯基)-N4-(3,4-乙烯二氧苯基)-5-氟代-2,4-嘧啶二胺、N4-(3,4-乙烯二氧苯基)-5-氟代-N2-[3-(1,3-噁唑-5-基)苯基]-2,4–嘧啶二胺、N4-(3,4-乙烯二氧苯基)-5-氟代-N2-[3-(N-甲氨基)-羰基亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N2-(3-羟苯基)-N4-[4-(3-苯基-1,2-4-噁二唑-5-基)亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、N4-(3,4-乙烯二氧苯基)-5-氟代-N2-(吲唑啉(indazolin)-6-基)-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N4-(3-羟苯基)-N2-(吲唑啉-6-基)-2,4-嘧啶二胺、N4-(3,4-乙烯二氧苯基)-5-氟代-N2-(1-甲基-吲唑-5-基)-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N4-(3-羟苯基)-N2-(1-甲基-吲唑啉-5-基)-2,4-嘧啶二胺、N4-(3,4-乙烯二氧苯基)-5-氟代-N2-[4-(3-苯基-1,2,4-噁二唑-5-基)亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、N4-(3,5-二甲基-4-羟苯基)-5-氟代-N2-[3-[2-(N-吗啉代)乙烯氧基]苯基]-2,4-嘧啶二胺、N4-(3,5-二甲基-4-羟苯基)-5-氟代-N2-[3-[2-(N-吗啉代)乙烯氧基]基]苯基]-2,4-嘧啶二胺、N4-(3-氯-4-羟基-5-甲苯基)-5-氟代-N2-[3-[2-(N-吗啉代)乙烯氧基]苯基]-2,4-嘧啶二胺、N2-(3-叔-丁基羰基氨基苯基)-N4-(3-羟苯基)-5-氟代-2,4-嘧啶二胺、N4-(3-叔-丁基苯基)-N2-[3-(N-甲氨基)羰基亚甲基氧苯基]–5-氟代-2,4-嘧啶二胺、N4-(3-叔-丁基苯基)-N2-[3-(N2,3-二羟基丙氨基)羰基亚甲基氧苯基]-5-氟代-2,4-嘧啶二胺、N2-[3-(N2,3-二羟基丙氨基)羰基亚甲基氧苯基]-5-氟代-N4–(3-异丙基苯基)-2,4-嘧啶二胺、N4-[4-(氰基亚甲基氧)苯基]-5-氟代-N2-(3-羟苯基)-2,4-嘧啶二胺、N4-(3,5-二甲基-4-羟苯基)-5-氟代-N2-[3-(N-哌嗪(piperazino))羰基亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、N4-(3,5-二甲基-4-羟苯基)-5-氟代-N2-[3-[2-(N-哌嗪)乙氧基]-苯基]-2,4-嘧啶二胺二盐酸盐、N4-(3,4-乙烯二氧苯基)-5-氟代-N2-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2,-4-嘧啶二胺、N4-(1,4-苯并噁嗪-3-酮(on)-6-基)-5-氟代-N2-(3-羟苯基)-2,4-嘧啶二胺、(+/-)-5-氟代-N2-[(N-甲基乙酰氨基-2)-3-苯氧基]-N4-(2-甲基-1,4-苯并噁嗪-6-基)-2,4-嘧啶二胺、N2-(1,4-苯并噁嗪-3-酮(on)-6-基)-5-氟代-N4-(3-羟苯基)-2,4-嘧啶二胺、N4-(3-氯-4-三氟甲氧基苯基)-5-氟代-N2-[3-(N-甲氨基)羰基亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N4-(3-羟基-4-甲苯基)-N2-[3-[(N-甲氨基)羰基亚甲基氧]苯基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N4-(3-羟苯基)-N2-[4-甲基-3-[(N-甲氨基)羰基亚甲基氧]苯基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-N2-[3-(N-甲氨基)羰基亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、N4-(3-氯-4-甲苯基)-5-氟代-N2-[3-(N-甲氨基)-羰基亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、N4-(3-氯-4-甲氧基苯基)-5-氟代-N2-[3-[(N-甲氨基)羰基亚甲基氧]苯基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N4-1(1H)-吲哚-5-基]-N2-[3-[(N-甲氨基)羰基亚甲基氧]-苯基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N4-(3-羟苯基)-N2-[1-(甲氧基羰基)甲基-吲唑啉-5–基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N4-(3-羟苯基)-N2-[1-(3-羟丙基)吲唑啉-6-基]-2,4--嘧啶二胺、N4-(3,4-乙烯二氧苯基)-5-氟代-N2-[1-(3-羟丙基)吲唑啉-5--基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N4-(3-羟苯基)-N2-[1-(3-羟丙基)吲唑啉-5-基]-2,4--嘧啶二胺、5-氟代-N2-[1-(3-羟丙基)吲唑啉-5-基]-N4-(4-异丙氧基苯基)–2,4-嘧啶二胺、N4-(3,4-乙烯二氧苯基)-5-氟代-N2-[1-[2(N-甲氨基羰基)乙基]-吲唑啉-5-基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N4-(4-异丙氧基苯基)-N2-[1-[2(N-甲氨基羰基)乙基]-吲唑啉-5-基]-2,4-嘧啶二胺、N4-[(2,2-二甲基-4H-苯并[1,4]噁嗪-3-酮)-6-基]-5-氟代-N2-[3-(甲基-氨基羰基亚甲基氧)苯基]-2,4-嘧啶二胺、N4-[(2,2-二甲基-4H-苯并[1,4]噁嗪-3-酮)-6-基]-5-氟代-N2-(1-甲基吲唑啉-5-基)-2,4-嘧啶二胺、N4-[(2,2-二氟-4H-苯并[1,4]噁嗪-3-酮)-6-基]-5-氟代-N2-[3-(甲基-氨基羰基亚甲基氧)苯基]-2,4-嘧啶二胺、N4-1(2,2-二甲基-4H-5-吡啶并-1,4]噁嗪-3-酮)-6-基]-5-氟代-N2-[3-(甲基-氨基羰基-亚甲基氧)苯基]-2,4-嘧啶二胺、5-氟代-N2-(3-甲氨基羰基亚甲基氧苯基)-N4-[2H-吡啶并[3,2-b-]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮-6-基]-2,4-嘧啶二胺、N4-(4-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-6-基)-5-氟代-N2-[3-(N-甲氨基)羰基亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺、N4-(3-氯-4-羟基-5-甲苯基)-5-氟代-N2-[3-[2-(N-哌嗪)乙氧基]苯基]-2,4-嘧啶二胺和N4-(3-甲基羰基肟苯基)-5-氟代-N2-[3-(N-甲氨基)羰基亚甲基氧苯基]-2,4-嘧啶二胺或其盐。这类化合物可以例如通过美国专利公布号2004/0029902的第[0218]段至第[0260]段之间所述方法合成，由此通过引用将所述公开整体并入。

在其他实施方案中，Syk抑制剂选自美国专利公布号2010/0316649所述的化合物，由此将所述公开通过引用整体并入。这种类型的代表性化合物由下述式Iz和Ib表示。

下文列出了式Iz的化合物：

其中

R¹选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、杂芳烷基、氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、酰基、酰氨基以及酰氧基；

R^2a和R^2b独立地选自氢、烷基、取代的烷基、酰基、酰氨基、酰氧基、–SO-烷基、–SO-芳基、–SO-杂芳基、–SO₂-烷基、–SO₂-芳基、–SO₂-杂芳基、芳基、取代的芳基、杂芳基、杂环基、芳烷基和杂芳烷基；其中存在R^2a或R^2b；

R³选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、卤、硝基、氰基、羟基、烷氧基、羧基、酰基、酰氨基、氨酰基、酰氧基、氧代酰基(oxyacyl)、氨基、取代的氨基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；

R⁵选自氢、烷基以及取代的烷基；以及

R⁶选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、酰基、酰氨基、酰氧基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳烷基、杂芳烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基以及取代的杂环基；

或其盐或立体异构体。

下文显示了式Ib的化合物：

其中

R¹选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、杂芳烷基、氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、酰基、酰氨基以及酰氧基；

R^2a和R^2b独立地选自氢、烷基、取代的烷基、酰基、酰氨基、酰氧基、–SO-烷基、–SO-芳基、–SO-杂芳基、–SO₂-烷基、–SO₂-芳基、–SO₂-杂芳基、芳基、取代的芳基、杂芳基、杂环基、芳烷基以及杂芳烷基，且其中存在R^2a或R^2b；

R³选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、卤、硝基、氰基、羟基、烷氧基、羧基、酰基、酰氨基、氨酰基、酰氧基、氧代酰基、氨基、取代的氨基、芳基、取代的芳基、杂芳基以及取代的杂芳基；

R⁴选自氢、烷基、取代的烷基、氨基或–NR⁵R⁶；

R⁵选自氢、烷基以及取代的烷基；以及

R⁶选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、杂芳烷基、氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、酰基、酰氨基以及酰氧基；

或其盐或立体异构体。

式Iz化合物的说明性实例可以选自：3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(2,4-二氢-2-氧代-1H-苯并[d][1,3]噁嗪–7-基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、N-(4-(3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-7-氰基-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-2-基)-苯基)乙酰胺、N-(4-(3-(3-(三氟甲基)苯基氨基)-7-氰基-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑--2-基)苯基)乙酰胺、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)-1H-咪唑并[1,2-b-]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(1H-吲哚-5-基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑–7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(1H-吲哚-6-基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑–7-腈、3-(3,4-二氯苯基氨基)-2-(2,4-二氢-2-氧代-1H-苯并[d][1,3]噁嗪-7--基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(4-苯氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3-氰基苯基氨基)-2-(3,4-二氢-3-氧代-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-6-基)–1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、甲基3-(7-氰基-2-(3,4-二氢-3-氧代-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-6-基)-1H-咪唑并[1-,2-b]吡唑-3-基氨基)苯甲酸酯、3-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并-[1,2-b]吡唑-7-腈、N-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基)-2,2,-2-三氟乙酰胺、甲基4-(7-氰基-2-(2,4-二氢-2-氧代-1H-苯并[d][1,3]噁嗪-7-基)-1H-咪唑并[1-,2-b]吡唑-3-基氨基)苯甲酸酯、3-(3-甲氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3-甲氧基苯基氨基)-2-(2,4-二氢-2-氧代-1H-苯并[d][1,3]噁嗪-7-基-)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(2,4-二氢-2-氧代-1H-苯并[d][1,3]噁嗪–7-基)-6-甲基-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-氨基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、N-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基)-3--氟代-4-(三氟甲基)苯甲酰胺、N-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基)苯甲酰胺、N-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基)--4-氟苯甲酰胺、N-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基)-3-甲氧基苯甲酰胺、3-(3,4-二氯苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(4-溴苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(6-甲氧基-1H-吲哚-3-基)-1H-咪唑并[1,2-b-]吡唑-7-腈、3-(4-吗啉代苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4,5-三甲氧基苯基氨基)-2-(1H-吲哚-6-基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(4-吗啉代苯基氨基)-2-(1H-吲哚-6-基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7--腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]-吡唑-7-腈、3-(3,4,5-三甲氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2--b]吡唑-7-腈、N-(3-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苯基)乙酰胺、N-(3-(7-氰基-2-(3,4-二氢-3-氧代-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-6-基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苯基)乙酰胺、N-(3-(7-氰基-2-(3,4-二甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)-苯基)乙酰胺、N-(3-(7-氰基-2-(4-(甲硫基)苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基-)苯基)乙酰胺、N-(4-(7-氰基-3-(3-乙酰胺基苯基氨基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-2-基)苯基)乙酰胺、3-(3-甲氧基苄基氨基)-2-(3,4-二氢-3-氧代-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-6-基-)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(2,4-二氟苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(3,4-二氟苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二二氧芑-7-基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、N-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基)-5-苯基1,3,4-噁二唑-2-氨甲酰、3-(3,4-二甲氧基苯乙基氨基)-2-(3,4-二氢-3-氧代-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-6-基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯乙基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2--b]吡唑-7-腈、N-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基)-2-(3-,4-二甲氧基苯基)乙酰胺、3-(4-吗啉代苯基氨基)-2-(3,4-二氢-3-氧代-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-6--基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3-甲氧基苯基氨基)-2-(1H-吲哚-6-基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(4-溴苯基氨基)-2-(3,4-二氢-3-氧代-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-6-基)–1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3-甲氧基苄基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、N-(3-(7-氰基-2-(1H-吲哚-6-基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苯基-)乙酰胺、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(4-(甲磺酰基)苯基)-1H-咪唑并[1,2–b]吡唑-7-腈、3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧芑-6-基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1-H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧芑-6-基氨基)-2-(3,4-二氢-3-氧代-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-6-基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(苯并[d][1,3]二噁唑-6-基)-1H-咪唑并[1,2–b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(3-氟代-4-甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2–b]吡唑-7-腈、2-溴-N-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3–基)乙酰胺、N-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基)-2-苯氧基乙酰胺、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-苄基-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、2-(3,4-二氯苯基)-N-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基)乙酰胺、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三氟苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(3-氯-4,5-二甲氧基苯基)-1H-咪唑并[-1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(4-氟代-3-甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2–b]吡唑-7-腈、3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧芑-6-基氨基)-2-(1H-吲哚-6-基)-1H-咪唑并-[1,2-b]吡唑-7-腈、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苯基)乙酰胺、N-(4-(7-氰基-2-(6-甲氧基-1H-吲哚-3-基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苯基)乙酰胺、N-(4-(7-氰基-2-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧芑-7-基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苯基)乙酰胺、3-(3,4-二氟苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、叔-丁基4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)-氨基甲酸苄酯、3-(4-(氨甲基)苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2–b]吡唑-7-腈、甲基3-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)-苯甲酸酯、N-(4-(7-氰基-2-(3,4-二氢-3-氧代-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-6-基)–1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苯基)乙酰胺、N-(4-(7-氰基-2-(3,4-二甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)-苯基)乙酰胺、3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧芑-6-基氨基)-2-(3-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、甲基4-(7-氰基-2-(3-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苯甲酸酯、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)乙酰胺、叔-丁基-4-((7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)甲基)哌啶-1-羧酸酯、3-((哌啶-4-基)甲氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2--b]吡唑-7-腈、3-(3-氟代-4-(4-(吡咯烷-1-基)哌啶-1-基)苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、(S)-甲基2-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)--3-苯基丙酸酯、甲基3-(7-氰基-2-(3,4-二甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苯甲酸酯、甲基3-(2-(3-氯-4,5-二甲氧基苯基)-7-氰基-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基-氨基)苯甲酸酯、3-(3,4,5-三甲氧基苯基氨基)-2-(4-吗啉代苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(4-溴苯基氨基)-2-(4-吗啉代苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7--腈、4-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基氨基)-7-氰基-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-2-基)-苯甲酰胺、3-氨基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-(4-甲氧基苯基)-5H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苯基)烟酰胺、甲基3-(2-(4-((甲氧基羰基)甲氧基)-3-甲氧基苯基)-7-氰基-1H-咪唑并[1,-2-b]吡唑-3-基氨基)苯甲酸酯、3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧芑-6-基氨基)-2-(4-((甲氧基羰基)甲氧基)-3-甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、2-(5-(7-氰基-3-(3-(甲氧基羰基)苯基氨基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑--2-基)-2-甲氧基苯氧基)乙酸、3-(4-氟代-3-甲氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1-,2-b]吡唑-7-腈、6-(4-氯苯基)-2-(3,4-二甲氧基苯基)-5H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)-3,4-二甲氧基苯甲酰胺、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)-3-(4-羟苯基)丙酰胺、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)-3-(哌啶-1-基)丙酰胺、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)-4-氰基苯甲酰胺、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)-1-甲基哌啶-4-氨甲酰、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)-1H-吲唑-3-氨甲酰、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)-1,6-二氢-6-氧代吡啶(oxopyridine)-3-氨甲酰、3-((1-烟酰哌啶-4-基)甲氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5H--咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、4-(3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧芑-6-基氨基)-7-氰基-1H-咪唑并[1,2-b]-吡唑-2-基)苯甲酰胺、4-(3-(4-溴苯基氨基)-7-氰基-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-2-基)苯甲酰胺-、甲基2-(4-(7-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-2-基)-2-甲氧基苯氧基)乙酸酯、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(3-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-1H-咪唑并-[1,2-b]吡唑-7-腈、2-(4-(2-羟基乙氧基)-3-甲氧基苯基)-3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(4-氟代-3-甲氧基苯基氨基)-2-(3,4-二甲氧基苯基)-5H-咪唑并[1,2–b]吡唑-7-腈、4-(3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-7-氰基-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-2-基)苯甲酰胺、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(4-吗啉代苯基)-1H-咪唑并[1,2--b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(3-吗啉代苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(3-(环戊氧基)-4-甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(4-(2-吡咯烷-1-基)乙氧基)-1H-咪唑并[1-,2-b]吡唑-7-腈、2-(4-(2-甲氧基乙氧基)-3-甲氧基苯基)-3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(4-氟代-3-甲氧基苯基氨基)-2-(3,4-二氢-3-氧代-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-6-基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3-(三氟甲氧基)苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并-[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3-氯-4-甲氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1-,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(3-羟苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、甲基2-(4-(7-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-2-基)-苯氧基)乙酸酯、N-(3-(7-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-2-基)-苯基)甲烷氨磺酰胺、3-(3-(环戊氧基)-4-甲氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H--咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、2-(4-(2-羟基乙氧基)-3-甲氧基苯基)-3-(4-氟代-3-甲氧基苯基氨基)--1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、4-(3-(4-氟代-3-甲氧基苯基氨基)-7-氰基-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-2-y-l)苯甲酰胺、3-(4-氟代-3-甲氧基苯基氨基)-2-(3-羟基-4,5-二甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(4-氟代-3-甲氧基苯基氨基)-2-(3-(环戊氧基)-4-甲氧基苯基)–1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(4-氟代-3-甲苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,-2-b]吡唑-7-腈、3-(3-氟代-4-甲苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,-2-b]吡唑-7-腈、2-(4-(2-甲氧基乙氧基)-3-甲氧基苯基)-3-(4-氟代-3-甲氧基苯基氨基)--1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、甲基2-(4-(7-氰基-3-(4-氟代-3-甲氧基苯基氨基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑–2-基)-2-甲氧基苯氧基)乙酸酯、2-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)-3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-1H-咪唑并[-1,2-b]吡唑-7-腈、2-(5-(7-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-2-基)--2-甲氧基苯氧基)乙酰胺、3-(3-异丙氧基-4-甲氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3-氟代-4-甲氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1-,2-b]吡唑-7-腈、3-(4-(环戊氧基)-3-甲氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H--咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(4-(2-(吡咯烷1-基)乙氧基)-3-甲氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(4-氟代-3-(三氟甲基)苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H--咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(4-(三氟甲氧基)苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并-[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(4-氯-3-甲氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1-,2-b]吡唑-7-腈、3-(4-氟代-3-异丙氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3-氟代-4-(吡咯烷1-基)苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H--咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、2-(4-(7-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-2-基)--2-甲氧基苯氧基)乙酰胺、3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-2-(4-甲氧基-3,5-二甲基苯基)-1H-咪唑并[-1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,4-二氢-3-氧代-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-6-基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、2-(5-(7-氰基-3-(4-氟代-3-甲氧基苯基氨基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑–2-基)-2-甲氧基苯氧基)乙酰胺、2-(4-(7-氰基-3-(4-氟代-3-甲氧基苯基氨基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑–2-基)-2-甲氧基苯氧基)乙酰胺、2-(4-(7-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基氨基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-2-基)--2-甲氧基苯氧基)-N-环丙基乙酰胺、3-(3-氯-4-异丙氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3,5-二甲氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]-吡唑-7-腈、3-(3,5-二氟-4-甲氧基苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、3-(3-乙氧基-4-氟代苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,-2-b]吡唑-7-腈、3-(3-(环戊氧基)-4-氟代苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H–-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈、N-(3-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)烟酰胺、N-(3-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)吡啶酰胺、N-(3-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)异烟酰胺、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)吡啶酰胺、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)异烟酰胺、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)-6-氰基吡啶-3-氨甲酰、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)-2-甲基吡啶-3-氨甲酰、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)-2-甲氧基吡啶-3-氨甲酰、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)-6-甲基吡啶-3-氨甲酰、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)-4-(三氟甲基)吡啶-3-氨甲酰、N-(4-(7-氰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-3-基氨基)苄基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-氨甲酰；以及3-(3-氟代-4-(甲硫基)苯基氨基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-咪唑并[1,2-b]吡唑-7-腈。

在其他实施方案中，Syk抑制剂可以选自例如美国专利公布号2011/0245205公开的氨基吡啶化合物，所述申请通过引用整体并入本文。这种类型的非限制性抑制剂化合物由式(IV)的化合物或其药学上可接受的盐所表示：

其中：

R¹选自(a)氢，(b)卤素，(c)CN，(d)任选地用独立选自OR^a、C_3-6环烷基以及卤素中的一个或多个基团取代的C_1-6烷基，(e)任选地用OC_1-6烷基取代的C_2-6烯基,(f)C_2-6炔基,(g)C_3-6环烷基，(h)OH，(i)任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代的–O–C_1-6烷基：(i)芳基，(ii)任选地用独立地选自C_1-6烷基的一个或多个基团取代的5元或6元杂芳基，(iii)任选地用独立地选自氧代、卤素、C_1-6烷基中的一个或多个基团取代的4-8元杂环基，(iv)–CO₂R^a，(v)–CONR^bR^c，(vi)–NR^bR^c，以及(vii)–OR^a，(j)-A-X，其中A是键或O，X选自(i)任选地用独立地选自卤素、C_1-6烷基、–C_1-6卤代烷基、–C_1-6羟烷基、COR^a、CO₂R^a中的一个或多个基团取代的4-8元杂环基，(ii)任选地用独立地选自C_1-6烷基、–OR^a、–CO₂R^a、–NR^bR^c中的一个或多个基团取代的C_3-6环烷基，(iii)任选地用苄基取代的杂芳基，所述苄基任选地用OR^a取代，(k)O–CH₂C.ident.C-嘧啶基、(l)–S(O)_n–C_1-6烷基、(m)–COR^a、(n)–CO₂R^a、(o)–CONR^bR^c、(p)–NR^bR^c；

R²选自(a)H，(b)卤素，(c)C_1-6烷基，(d)O–C_1-6烷基，(e)C_1-6卤代烷基以及(f)O–C_1-6卤代烷基；或R¹和邻近碳原子上的R²一起表示(CH₂)₃-4；

R³是H、卤素、OR^a或C_1-4烯丙基；

R⁴选自(a)H，(b)卤素，(c)C_1-6烷基，其任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代：(i)卤素、(ii)OR^a、(iii)OC(O)R^a、(iv)NR^bR^c、(v)NHC(O)R^a以及(vi)NHC(O)NHR^b，(d)C_2-6烯基，(e)C_2-6炔基，(f)C_3-6环烷基(g)OR^a，(h)NO₂，(i)NR^bR^c，(j)NHC(O)R^a，(k)NHC(O)NHR^b，(l)NHC(O)NHC(O)NR^bR^c；

R⁵选自(a)H，(b)卤素，(c)C_1-8烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基，其各自任选地用独立地选自R^y的一个或多个基团取代，(d)C_3-12碳环或碳连接的3-12元杂环基，其各自任选地用独立选自R^z的一个或多个基团取代，(e)任选地用C_1-3烷基(任选地用一个或多个OH或CN或杂环取代)取代的杂芳基；(f)–C(O)R^a，(g)–C(O)₂R^a，以及(h)–C(O)NR^bR^c；

R⁵⁽ⁱ⁾选自H和C_1-3烷基；

R^a选自：(a)H，(b)C_1-6烷基，其任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代：(i)卤素、(ii)CN、(iii)OH、(iv)OC_1-4烷基、(v)任选地用氧代取代的杂环基、(vi)任选地用OH取代的C(O)C_1-6烷基、(vii)CO₂H、(viii)CO₂C_1-6烷基、(ix)CONR^b(i)R^c(i)、(x)SO₂C_1-6烷基、(xi)–NR^b(i)R^c(i)、(xii)NR^b(i)C(O)NR^b(i)R^c(i)、(xiii)苯基以及(xiv)任选地用OH取代的杂芳基，(c)C_2-6烯基，(d)C_3-6环烷基，其任选地用独立地选自(i)OH、(ii)CO₂H、(iii)CO₂C_1-6烷基、(iv)CONR^b(i)R^c(i)中的一个或多个基团取代，(e)任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代的苯基：(i)C_2-6炔基、(ii)CN、(iii)卤素、(iv)OH、(vi)OC(O)C_1-6烷基、(vii)CO₂H,(viii)CO₂C_1-6烷基，(f)任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代的杂芳基：C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、(CH₂)_1-8CO₂H、OH、卤素、任选地用CO₂H取代的苯基，以及(g)任选地用氧代取代的杂环基；

R^b和R^c独立地选自：(a)H,(b)C_1-6烷基，其任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代：(i)OR^a，(ii)卤素，(iii)任选地用氧代、OH、C_1-6烷基(任选地用OH取代)取代的杂环基，(iv)任选地用选自C_1-4烷基、CH₂OH、CONR^b(i)R^c(i)以及CO₂R^a中的1个或2个基团取代的C_3-6环烷基，(v)杂芳基，其任选地用C_1-6烷基(任选地用OH取代)、CO₂H或杂芳基(任选地用杂芳基取代)取代，(vi)SO₂NR^b(i)R^c(i)，(vii)SO₂C_1-4烷基，(viii)CONR^b(i)R^c(i)，(ix)NR^b(i)R^c(i)，(x)CO₂R^a，(xi)芳基，其任选地用选自以下的一个或多个基团取代：卤素、OR^a、C_1-6烷基(任选地用卤素、杂环(任选地用氧代取代)或OR^a取代)、SO₂NH₂以及任选地用CH₂OH取代的杂芳基，(xii)SO₃H，(xiii)NR^b(i)CONR^b(i)R^c(i)，(xiv)CN，以及(xv)NHC(O)R^a，(c)任选地用F取代的C_3-6烯基；(d)C_3-6环烷基(任选地与苯环稠合)，其任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代：(i)C_1-4烷基，(ii)OR^a，(iii)CH₂OH，(iv)CO₂R^a以及(v)CONR^b(i)R^c(i)，(e)芳基，其任选地用独立地选自以下的1个或2个基团取代：(i)C_1-6烷基(任选地用OR^a取代)，(ii)CN，(iii)OR^a，(iv)卤素以及(v)OCOC_1-4烷基；(f)杂芳基，其任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代：(i)OR^a，(ii)CO₂R^a以及(iii)任选地用OH取代的C_1-6烷基，(g)杂环基，其任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代：(i)氧代，(ii)OH以及(iii)C_1-6烷基；或

R^b、R^c以及与它们相连的氮原子一起形成5-、6-或7元杂环，所述杂环具有选自O、P(O)(C_1-6烷基)、S(O)_n以及N–R^x的0或1个另外的杂原子，并且任选地用独立选自以下的一个或多个基团取代：(a)氧代，(b)硫代，(c)C_1-6烷基，其任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代：(i)OR^a，(ii)CO₂R^a，(iii)OP(O)(C_1-6烷基)₂，(iv)芳基以及(v)卤素，(d)OR^a，(e)C(O)R^a，(f)C(O)₂R^a，(g)CONR^b(i)R^c(i)，(h)P(O)(OH)₂，(i)SO₂R^a，以及(j)CN，或R^b、R^c以及与它们相连的氮原子一起形成：

其中W是CH或N；

R^b(i)和R^c(i)独立地选自：(a)H和(b)任选地用OH、CO₂H或CO₂C_1-6烷基取代的C_1-6烷基；或

R^b(i)、R^c(i)以及与它们相连的氮原子一起形成5-或6元杂环，所述杂环具有选自O、S以及N–R^x的0或1个其他杂原子，并且任选地用独立地选自氧代的一个或多个基团取代；

R^u选自：(a)C_1-6烷基，其任选地用选自以下的1-3个基团取代：卤素、OH、SO₂R^a、CONR^bR^c、NR^bR^c、苯基、杂环基以及杂芳基，(b)任选地用OH、CO₂R^a、–CONH₂取代的C₃-8环烷基，(c)任选地用氧代取代的杂环，(d)任选地用C_2-6炔基、CN、卤素、OR^a取代的芳基，(e)任选地用OH取代的杂芳基；

R^x选自(a)H，(b)任选地用杂环取代的C_1-6烷基，(c)任选地用OH或OC_1-4烷基取代的苯基，(d)–C(O)–C_1-6烷基，(e)–C(O)₂–C_1-6烷基，(f)–C(O)NH₂、–C(O)NH–C_1-6烷基、–C(O)N(C_1-6烷基)₂，(g)–C(O)₂NHC(O)NH₂、–C(O)₂NHC(O)NH–C_1-6烷基、–C(O)₂NHC(O)N(C_1-6烷基)₂，(h)–SO₂–C_1-6烷基(任选地用卤素取代)、–SO₂-杂芳基(任选地用烷基取代)，(i)–S(O)₂NH₂、–S(O)₂NH–C_1-6烷基、–S(O)₂N(C_1-6烷基)₂、(j)–SO₂NHC(O)₂–C_1-6烷基；

R^y选自：(a)芳基，其任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代：(i)卤素，(ii)任选地用OH或CO₂R^a取代的C_1-6烯丙基，(iii)任选地用CO₂R^a取代的C_2-6烯基，(iv)任选地用CO₂R^a取代的苯基，(v)COR^a，(vi)CO₂R^a，(vii)CONR^bR^c，(viii)OR^a，(ix)S(O)_nR^a，(x)SO₂NR^bR^c，(xi)SO₂NHC(O)R^a，(xii)NO₂以及(xiii)NHC(O)R^a，(b)杂芳基，其任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代：(i)卤素，(ii)任选地用CO₂R^a取代的C_1-6烷基，(iii)C_3-6环烷基，(iv)任选地用CO₂R^a取代的芳基，(v)CONR^bR^c，(vi)OR^a，(vii)SO₂R^a，以及(viii)CO₂R^a，(c)C_3-8环烷基，其任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代：(i)C_1-6烷基，(ii)CO₂R^a以及(iii)NR^bR^c，(d)C_6-8环烯基(任选地用CO₂R^a取代)，(e)卤素，(f)CN，(g)–C(O)R^a，(h)–C(O)₂R^a，(i)C(O)CO₂R^a，(j)–C(O)NR^bR^c，(k)–C(O)NHC(O)NR^bR^c，(l)–OR^a，(m)–OC(O)R^a，(n)–NR^bR^c，(o)–NHC(O)R^u，(p)–NHC(O)NR^bR^c，(q)–NHC(O)NHC(O)NH₂，(r)–NHSO.sub.mR^a，(s)–NHSO₂NR^bR^c，(t)SO_nR^a，(u)–SO₂NR^bR^c，(v)–SO₂NHC(O)R^a，(w)–SO₂NHC(O)₂R^a，(x)SO₃H，(y)–P(O)(OR^a)₂以及(z)CONHOH；(aa)任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代的杂环基：氧代、硫代、C_1-6烷基以及CO₂R^a；

R^z选自：(a)选自R^y的基团，(b)任选地用独立地选自以下的一个或多个基团取代的C_1-6烷基：卤素、NR^bR^c、OR^a、CN、苯基(任选地用C_1-6链烷酸取代)、CONR^bR^c以及–CO₂R^a，(c)氧代，以及(d)NOR^a，m是1或2，n是0、1或2。

式IV化合物的代表性实例包括但不限于：(1R,4S)-4-[5-(3-环丙基-5-{[4-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基}苯基)-1,3-噻唑-2-基]-4-羟基-2,2-二甲基环己烷羧酸、(1S,4R)-4-[5-(3-环丙基-5-{[4-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基}苯基)-1,3-噻唑-2-基]-4-羟基-2,2-二甲基环己烷羧酸、(1S,4R)-4-羟基-2,2-二甲基-4-{5-[3-甲基-5-(4-甲基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-1,3-噻唑-2-基}-环己烷羧酸、(1S,4R)-4-[5-(3-{[4-(二氟甲基)嘧啶-2-基]氨基}-5-甲苯基)--1,3-噻唑-2-基]-4-羟基-2,2-二甲基环己烷羧酸、反式-4-羟基-4-[5-(3-甲基-5-{[4-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基}苯基)-1,3-噻唑-2-基]环己烷羧酸、顺式-4-羟基-4-[5-(3-甲基-5-{[4-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基}-苯基)-1,3-噻唑-2-基]环己烷羧酸、5-羟基-5-[5-(3-甲基-5-{[4-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基}苯基)-1,3-噻唑-2-基]吖庚环(azepan)-2-酮、顺式-4-[(羟基乙酰基)氨基]-1-[5-(3-甲基-5-{[4-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基}苯基)-1,3-噻唑-2-基]环己烷氨甲酰；以及(1S,4R)-4-羟基-2,2-二甲基-4-[5-(3-甲基-5-{[4-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基}苯基)-1,3-噻唑-2-基]-N-[3-(2-氧代吡咯烷-1-基)丙基]环己烷氨甲酰、(1S,4R)-4-羟基-2,2-二甲基-4-[5-(3-甲基-5-{[4-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基}-苯基)-1,3-噻唑-2-基]环己烷羧酸；(1R,48)-4-羟基-2,2-二甲基-4-[5-(3-甲基-5-{[4-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基}-苯基)-1,3-噻唑-2-基]环己烷羧酸、(1S,4S)-4-羟基-2,2-二甲基-4-[5-(3-甲基-5-{[4-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基}-苯基)-1,3-噻唑-2-基]环己烷羧酸、(1R,4R)-4-羟基-2,2-二甲基-4-[5-(3-甲基-5-{[4-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基}-苯基)-1,3-噻唑-2-基]环己烷羧酸、(1RAS)-4-羟基-2,2-二甲基-4-[5-(3-甲基-5-{[4-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基}苯基)-1,3-噻唑-2-基]环己烷氨甲酰、(1S,4R)-4-羟基-2,2-二甲基-4-[5-(3-甲基-5-{[4-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基}苯基)-1,3-噻唑-2-基]环己烷氨甲酰、(1S,4R)4-{5-[3-({4-[(1R)-1-氟乙基]嘧啶-2-基}氨基)-5-甲苯基]-1,3--噻唑-2-基}-4-羟基-2,2-二甲基环己烷羧酸、(1S,4R)4-{5-[3-({4-[(1S)-1-氟代乙基]嘧啶-2-基}氨基)-5-甲苯基]-1,3--噻唑-2-基}-4-羟基-2,2-二甲基环己烷羧酸；或其药学上可接受的盐。

3.2.6免疫调节颗粒实施方案

在一些实施方案中，以颗粒的形式提供至少一种例如3.2.1部分所述的聚集蛋白聚糖抗原和一种或多种上文所述的抑制剂(例如至少一种例如3.2.3部分所述的NF-κB抑制剂，和/或至少一种例如3.2.4部分所述的mTOR抑制剂，和/或至少一种例如3.2.5部分所述的Syk抑制剂)或可选地至少一种例如3.2.2部分所述的聚集蛋白聚糖APL(总称为“生物活性剂”)，其在体内或体外促进所述抗原和抑制剂向抗原呈递细胞的送递。抑制剂和抗原或APL可以包含于或以另外方式结合于同一颗粒或不同颗粒中。可以用多种颗粒实施本发明，包括但不限于脂质体、微团、脂质颗粒、陶瓷颗粒/无机颗粒，其通常选自纳米颗粒和微粒。颗粒的大小设定为适合被抗原呈递细胞摄取(例如通过吞噬或内吞)。在说明性实例中，颗粒的尺寸小于约100μm，更合适的是范围小于或等于约500nm，尽管颗粒可以大至约10μm，且小至几个nm。

脂质体基本上由在水性核心周围形成壳的磷脂双层构成。益处包括“模拟”细胞外膜层的外层的亲脂性，并且所述外层相对容易地被多种细胞摄取。聚合物媒介通常由由生物相容性聚合物形成的微球/纳米球和微胶囊/纳米胶囊构成，所述生物相容性聚合物是生物可降解的(例如聚乳酸)或非生物可降解的(例如乙烯-乙酸乙烯酯(ethylenevinylacetate))。聚合物装置的一些益处是便于制造和高荷载能力，直径大小范围从纳米到微米以及控释和降解特征谱。

在一些实施方案中，所述颗粒在其表面包含与标记免疫相互作用的抗原结合分子，所述标记的表达水平在抗原呈递细胞上(例如树突细胞)比在非抗原呈递细胞上高。这种类型的说明性标记包括MGL、DCL-1、DEC-205、巨噬细胞甘露糖R、DC-SIGN或其他DC或骨髓特异性(凝集素)受体，例如公开于Hawiger等(2001,J Exp Med 194:769),Kato等2003,J Biol Chem 278:34035),Benito等(2004,J Am Chem Soc 126:10355),Schjetne等(2002,Int Immunol 14:1423)和van Vliet等,2006,Nat Immunol 7(11):1200-1208；Immunobiology 211:577-585)中。

由生物活性剂、表面活性剂、赋形剂或聚合材料的组合可以制备本发明的免疫调节颗粒。在一些实施方案中，所述颗粒是生物可降解的和生物相容性的，并且任选地能以受控的速率生物降解，以送递治疗剂或诊断剂。所述颗粒由多种材料制成。可以使用无机材料和有机材料。可以使用聚合材料和非聚合材料，例如脂肪酸。其他合适的材料包括但不限于明胶、聚乙二醇、海藻糖(trehalulose)、葡聚糖以及壳聚糖。基于诸如颗粒材料等因素，可以设计和制备降解和释放时间从数秒到数月的颗粒。

3.2.6.1聚合物颗粒

聚合物颗粒可以由任何生物相容和期望地生物可降解的聚合物、共聚物或搀和物形成。可以定制所述聚合物，从而优化所述颗粒的不同性质，包括i)待送递的生物活性剂与稳定生物活性剂并在送递后保持其活性的聚合物之间的相互作用；ii)聚合物降解率，和由此的剂释放率特征；iii)通过化学修饰的表面特性和靶向能力；以及iv)颗粒多孔性。

可以使用表面侵蚀聚合物如聚酐以形成颗粒。例如，可以使用聚酐如聚[(对-羧基苯氧基)-己烷酐](PCPH)。生物可降解聚酐描述于美国专利号4,857,311中。

在其他实施方案中，可以使用大量侵蚀聚合物(bulk-eroding polymer)，如基于聚酯的那些聚合物，包括聚(羟基酸)或聚(酯)。例如，可以使用聚乙二醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)或其共聚物以形成颗粒。聚酯还可以具有带电的或功能化基团，如氨基酸。在说明性实例中，具有控释特性的颗粒可以由掺入了表面活性剂如DPPC的聚(D,L-乳酸)和/或聚(D,L-乳酸-共-乙二醇酸)(“PLGA”)形成。

其他聚合物包括聚(氰基丙烯酸烷酯)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基(polyalkylene)，如聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚乙烯化合物，如聚乙烯醇、聚乙烯醚以及聚乙烯酯、丙烯酸和甲基丙烯酸的聚合物，纤维素和其他多糖以及肽或蛋白，或其共聚物或搀和物。针对不同的受控药物送递应用，可以选择或修饰聚合物，从而使其在体内具有合适的稳定性和降解率。

在一些实施方案中，颗粒可由功能化的聚酯移植共聚物形成，例如描述于Hrkach等(1995,Macromolecules,28:4736-4739；和“Poly(L-Lactic acid-co-amino acid)GraftCopolymers:A Class of Functional Biodegradable Biomaterials”in Hydrogels andBiodegradable Polymers for Bioapplications,ACS Symposium Series No.627,Raphael M.Ottenbrite等,Eds.,American Chemical Society,Chapter 8,pp.93-101,1996.)中。

可以使用除了生物可降解聚合物以外的材料来形成颗粒。合适的材料包括各种非生物可降解聚合物和各种赋形剂。所述颗粒还可以仅由生物活性剂和表面活性剂形成。

聚合物颗粒可以使用以下方法制备：单乳化溶剂蒸发和复乳化溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取、溶剂蒸发、相分离、单一凝聚和复合凝聚、界面聚合和本领域技术人员熟知的其他方法。可以利用本领域已知的制备微球或微胶囊的方法制备颗粒，只要优化用于形成具有期望直径的颗粒的条件即可。

为制备用于送递封装的剂(encapsulated agent)的微球而研发的方法在文献中有描述，例如描述于Doubrow,M.,Ed.,“Microcapsules and Nanoparticles in Medicine andPharmacy,”CRC Press,Boca Raton,1992。所述方法还描述于Mathiowitz and Langer(1987,J.Controlled Release 5:13-22)；Mathiowitz等(1987,Reactive Polymers 6:275-283)和Mathiowitz等(1988,J.Appl.Polymer Sci.3:,755-774)以及美国专利号5,213,812、美国专利号5,417,986、美国专利号5,360,610、美国专利号5,384,133中。所述方法的选择取决于期望的聚合物选择、大小、外部形态以及结晶度，如例如Mathiowitz等(1990,ScanningMicroscopy 4:329-340；1992,J.Appl.Polymer Sci.45:125-134)；和Benita等(1984,J.Pharm.Sci.73:1721-1724)所述。

在例如Mathiowitz等(1990)、Benita、和Jaffe的美国专利号4,272,398所述的溶剂蒸发的情况下，将所述聚合物溶解于挥发性有机溶剂例如二氯甲烷中。可以使用若干不同的聚合物浓度，例如0.05-2.0g/mL之间。将可溶形式或分散为细颗粒形式的生物活性剂添加于聚合物溶液中，并将混合物悬浮于含有表面活性剂如聚(乙烯醇)的水相中。水相可以是例如在蒸馏水中浓度为1％的聚(乙烯醇)w/v。搅拌所得溶剂，直到大多数有机溶剂挥发，留下固体微球，其可以用水洗涤并在冻干器中过夜干燥。利用这种方法可以获得不同大小(1-1000μm之间)和形态的微球。

设计溶剂去除，主要用于与较不稳定的聚合物如聚酐一起使用。在这种方法中，将试剂分散或溶解于所选聚合物在像二氯甲烷一样的挥发性有机溶剂中的溶液中。然后将所述混合物通过搅拌悬浮于油例如硅油中来形成乳液。在24小时内，溶剂分扩散到油相中，并且乳液滴变硬，成为固态聚合物微球。与例如Mathiowitz等(1987,ReactivePolymers 6:275)所述的热熔微囊化方法不同，该方法可以用于用高熔点和分子量范围宽的聚合物制备微球。用这种方法，可以获得直径介于1-300微米的微球。

使用一些聚合物系统，利用单乳化技术或者复乳化技术制备的聚合物颗粒大大小不同，这取决于所述滴的大小。如果油包水乳液中的滴不具有适当的小尺寸来形成具有期望大小范围的颗粒，则可以通过乳液的超声处理或均质化或通过添加表面活性剂来制备较小的滴。

如果通过任何上述方法制备的颗粒的大小范围超过期望的范围，则可以例如利用筛子改变颗粒的大小，并利用本领域技术人员已知的技术根据密度进一步分离。

聚合物颗粒可以通过喷雾干燥制备。喷雾干燥的方法，例如Sutton和Johnson的WO96/09814所公开的方法，披露了水溶性材料的平滑、球形微粒的制备，其中至少90％的颗粒具有1-10μm之间的平均大小。

3.2.6.2脂质体

脂质体可以利用标准方法产生，例如以下文献所报道的标准方法：Kim等(1983,Biochim.Biophys.Acta 728:339-348)；Liu等(1992,Biochim.Biophys.Acta 1104:95-101)；Lee等(1992,Biochim.Biophys.Acta.1103:185-197),Brey等(美国专利申请公布号20020041861),Hass等(美国专利申请公布号20050232984),Kisak等(美国专利申请公布号20050260260)以及Smyth-Templeton等(美国专利申请公布号20060204566)。另外，可以参考Copeland等(2005,Immunol.Cell Biol.83:95-105)，其评述了用来送递抗原的基于脂质的微粒制剂，并参考Bramwell等(2005,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.22(2):151-214；2006,J Pharm Pharmacol.58(6):717-728)，其评述了用于疫苗的微粒送递系统，包括制备装载蛋白的脂质体的方法。许多利用各种不同脂质体组分的脂质体制剂已被用于各种体外细胞培养和动物实验中。已经确定了决定脂质体特性的参数，并且在文献中有报道，例如在Lee等(1992,Biochim.Biophys.Acta.1103:185-197)；Liu等(1992,Biochim.Biophys.Acta.1104:95-101)；以及Wang等(1989,Biochem.28:9508-9510)中。

简而言之，将溶解于有机溶剂中的所选脂质(和任何有机可溶性生物活性剂)混合，并在真空中干燥于玻璃管的底部上。利用含有待通过温和旋转封装的任何水溶性生物活性剂的水性缓冲溶液使脂质膜再水合。随后可以将水合的脂质泡通过挤压进一步加工，使其进行一系列冻融循环，或再脱水然后再水合，从而促进生物活性剂的封装。然后可以通过离心洗涤脂质体，或装载到尺寸排阻柱(size-exclusion column)以从脂质体制剂中除去未截留的生物活性剂，并储存于4℃。制备脂质体的基本方法更详细地描述于Thierry等(1992,Nuc.Acids Res.20:5691-5698)中。

利用Pautot等(2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(19):10718-21)所述的方法，可以制备携带有效载荷的生物活性剂的颗粒。使用Pautot等的技术，可以利用链霉抗生物素涂覆的脂质(DPPC、DSPC以及类似的脂质)制造脂质体。可以使用Needham等(2001,Advanced Drug Delivery Reviews 53(3):285-305)所述的药物封装技术用一种或多种活性剂装载这些泡。

脂质体可以通过以下方式制备：将各种脂质混合物的氯仿溶液暴露于高度真空下，随后用pH4的缓冲液使所得脂质膜(DSPC/CHOL)水合，并在冻融程序后，通过聚碳酸化滤器挤压它们。使用补充了DSPC或胆固醇的DPPC来增强封装效率或增加稳定性等是可能的。通过添加碱化剂，将泡外介质的pH调整至7.5，产生跨膜pH梯度。随后在升高温度下，通过将小份生物活性剂溶液添加到泡溶液中，可以截留生物活性剂(例如小分子NF-κB抑制剂、mTOR抑制剂或Syk抑制剂，它们是例如弱碱)，以允许将生物活性剂容纳在脂质体中。

适合送递本发明的生物活性剂的其他基于脂质的颗粒，例如泡囊描述于Copeland等(2005,Immunol.Cell Biol.83:95-105)中。

3.2.6.3陶瓷颗粒

可以用陶瓷颗粒送递本发明的生物活性剂。这些颗粒通常使用用类似于熟知的溶胶凝胶方法的方法制备，并且通常需要简单的条件和室温条件，例如如Brinker等(“Sol-Gel Science:The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing；”Academic Press:SanDiego,1990,p-60)和Avnir等(1994,Chem.Mater.6,1605)所述。可以制备具有期望大小、形状和多孔性并且非常稳定的陶瓷颗粒。它们还有效保护掺杂的分子(多肽、药物等)，防止由于极端pH和温度导致的变性(Jain等,1998.J.Am.Chem.Soc.120:11092-11095)。此外，它们的表面可以很容易地用不同基团功能化(Lal等,2000.Chem.Mater.12:2632-2639；Badley等,1990,Langmuir 6:792-801)，因此，它们能附着于各种单克隆抗体和其他配体，从而将它们在体内靶向期望的位点。

已经描述了用于体内送递含有活性剂的有效载荷的各种陶瓷颗粒。例如英国专利1590574公开了将生物活性组分掺入溶胶凝胶基质中。国际公开WO 97/45367披露了通过溶胶凝胶方法制备的溶解可控的硅干凝胶，通过浸入到预烧结的颗粒(1-500μm)或盘中，将生物活性剂掺入所述硅干凝胶中。国际公开WO 0050349公开了通过溶胶凝胶方法制备的生物降解可控的二氧化硅纤维，在合成纤维的过程中，向所述二氧化硅纤维中并入生物活性剂。美国专利申请公开20040180096描述了截留了生物活性物质的陶瓷纳米颗粒。通过形成染料的胶束组合物，制备陶瓷纳米颗粒。将陶瓷材料添加于胶束组合物中，并且通过碱水解沉淀陶瓷纳米颗粒。美国专利申请公开20050123611披露了控释陶瓷颗粒，其包含基本上均匀分散于所述颗粒中的活性材料。这些颗粒通过以下方式制备：将表面活性剂与溶剂混合，以制备反向胶束溶液；(b)将凝胶前体、催化剂、冷凝剂以及可溶的活性材料溶解于极性溶剂中，以制备前体溶液；(c)合并反向胶束溶液和前体溶液以提供乳液；以及(d)冷凝乳液中的所述前体。美国专利申请公开20060210634披露了通过蒸发将生物活性物质吸附到包含金属氧化物(例如氧化钛、氧化锆、氧化钪、氧化铈以及氧化钇)的陶瓷颗粒上。Kortesuo等(2000,Int J Pharm.200(2):223-229)公开了产生颗粒大小范围狭窄的球形硅胶的喷雾干燥方法，用于药物如枸椽酸托瑞米芬和盐酸右美托咪定(dexmedetomidine Hcl)的可控送递。Wang等(2006,Int J Pharm.308(1-2):160-167)描述了联合通过多孔CaCO₃微粒吸附和通过聚合电解质多层膜封装来送递生物活性物质。

3.2.6.4弹道粒子(Ballistic particles)

可以将本发明的生物活性剂附着于(例如通过涂覆或共轭)或以另外方式结合于适合用于无针或“弹道”(弹射)送递的颗粒。用于弹道送递的说明性颗粒描述于例如WO02/101412；WO 02/100380；WO 02/43774；WO 02/19989；WO 01/93829；WO 01/83528；WO 00/63385；WO 00/26385；WO 00/19982；WO 99/01168；WO 98/10750；以及WO97/48485中。然而应当理解的是，这类颗粒不限于其与弹道送递装置一起使用，而且可以通过可以将所述颗粒送递到免疫细胞的任何可选技术(例如注射或微针送递)以另外方式施用。

利用本领域已知的各种技术，可以将生物活性剂涂覆或化学偶联于载体颗粒(例如核心载体(core carrier))。载体颗粒选自在用于细胞内送递的颗粒大小范围内具有合适密度的材料。当然最佳载体颗粒大小取决于靶细胞的直径。示例性颗粒的大小范围为约0.01μm至约250μm，从约10μm至约150μm，并从约20μm至约60μm；并且颗粒的密度范围为从约0.1g/cm³至约25g/cm³，体积密度为约0.5g/cm³至约3.0g/cm³或更大。这种类型的非限制性颗粒包括金属颗粒，如钨载体颗粒、金载体颗粒、铂载体颗粒以及铱载体颗粒。钨颗粒容易利用的直径平均大小为0.5-2.0μm。还可以使用金颗粒或微晶金(例如金粉A1570，可从Engelhard Corp.,East Newark,N.J.获得)。金颗粒提供均匀大小(可从Alpha Chemicals获得1-3μm的颗粒大小，或从Degussa,South Plainfield,N.J.或获得颗粒大小范围，包括0.95μm)和低毒性。微晶金提供了范围通常为0.1-5μm的多种颗粒大小分布。微晶金的不规则表面积为本发明的活性剂提供了高效涂覆。

使生物活性分子(例如亲水性分子，例如蛋白和核酸)吸附、偶联或以另外方式附着于诸如金颗粒或钨颗粒的许多方法是已知的，并且已有描述。在说明性实例中，这类方法将预定量的金或钨与生物活性分子、CaCl₂以及亚精胺组合。在其他实例中，用乙醇将生物活性分子沉淀于金或钨颗粒上(见例如Jumar等,2004,Phys Med.Biol.49:3603-3612)。在涂覆程序中适当地连续涡旋所得溶液，以确保反应混合物的均匀性。在生物活性分子附着后，可以将颗粒转移到例如合适的膜上并在使用前使其干燥、涂覆于样品模块或盒的表面上，或装载到用于特别是颗粒介导的送递仪器的送递盒中。

利用标准技术例如简单蒸发(空气干燥)、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥(冻干)、喷雾冷冻干燥、喷涂、沉淀、超临界流体颗粒形成等，将配置的组合物适合地制备为颗粒。如果需要，可以利用国际公开WO 97/48485所述的技术装扮所得的颗粒。

3.2.6.5表面活性剂

可以掺入颗粒中的表面活性剂包括磷酸甘油酯。示例性的磷酸甘油酯包括磷脂酰胆碱，诸如天然存在的表面活性剂、L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(“DPPC”)。表面活性剂通过例如降低颗粒-颗粒相互作用有利地改善表面特性，并且能使颗粒的表面较不粘着。肺内源性表面活性剂的使用避免了使用非生理表面活性剂的需要。

在颗粒的表面提供表面活性剂能减少颗粒由于相互作用而聚集的倾向，所述相互作用例如静电相互作用、范德华力以及毛细管作用。颗粒表面上存在表面活性剂能提供增加的表面皱褶(粗糙度)，由此通过降低可用于颗粒-颗粒密切相互作用的表面积而改善烟雾化(aerosolization)。

可以使用本领域已知的表面活性剂，包括任何天然存在的表面活性剂。其他示例性表面活性剂包括双磷脂酰甘油(DPPG)；十六烷醇；脂肪醇如聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9-十二烷基醚；表面活性脂肪酸，如棕榈酸或油酸；失水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)；甘胆酸盐；表面活性肽；泊咯沙姆；失水山梨糖醇脂肪酸酯，如失水山梨糖醇三油酸酯；泰洛沙泊以及磷脂。

所述颗粒可用作将抑制剂和聚集蛋白聚糖抗原离体送递到抗原呈递细胞的媒介。然而，在有利的实施方案中，所述颗粒用于将生物活性化合物体内送递到抗原呈递细胞，例如如在美国专利申请公开20100151000中所公开的，该公开据此通过引用整体并入本文。

3.2.7离体抗原呈递细胞实施方案

可以将抑制剂和聚集蛋白聚糖抗原以各种形式离体送递到抗原呈递细胞中，并且其形式实质上是可溶的或颗粒状的。抗原呈递细胞或其前体可以从待治疗的对象获得(即自身抗原呈递细胞或前体)。可选地，抗原呈递细胞或其前体获自或来源于与对象MHC-匹配或不匹配的供体(即异基因抗原呈递细胞)。适宜的是，在这些实施方案中，所述供体与所述对象是组织相容的。

在上述实施方案中，在足以抑制、降低或以另外方式损害抗原呈递细胞NF-κB活性和/或mTOR活性和/或Syk活性的条件下，使抗原呈递细胞与例如3.2.3、3.2.4以及3.2.5部分所述的一种或多种抑制剂接触或与可表达所述抑制剂的多核苷酸接触一段时间。待与抗原呈递细胞或其前体接触的可溶性或颗粒状抑制剂的量，可以通过本领域技术人员已知的常规方法根据经验确定。在一些有利的实施方案中，在存在抑制剂的情况下，温育所述抗原呈递细胞至少约2、3、4、5、6、7、8、12、24、36、48、60、72、84、96小时，或小于约96、84、72、60、48、36、24、12、8、7、6、5、4、3或2小时。在具体实施方案中，在35℃–38°下温育抗原呈递细胞与抑制剂(例如NF-κB抑制剂或mTOR抑制剂或Syk抑制剂)约48至约60h，或高达抑制、降低或以另外方式损害NF-κB、mTOR或Syk活性的时间。在这种类型的说明性实例中，可以在存在抗原呈递细胞激活剂，例如脂多糖(LPS)和任选地另外的抑制剂(例如另外的NF-κB抑制剂，如维生素D和地塞米松)的情况下，温育所述抗原呈递细胞。

在抗原呈递细胞足以呈递所述抗原或其加工形式的条件下，还使抗原呈递细胞或其前体与例如3.2.1部分所述的聚集蛋白聚糖抗原或与例如3.2.2部分所述的聚集蛋白聚糖APL，或与可表达抗原或APL的多核苷酸接触一段时间。合适的是，抑制剂和/或抗原或可表达它们的多核苷酸采用例如3.2.6部分所述的可溶形式或颗粒状形式。待与抗原呈递细胞或其前体接触的可溶性或颗粒状抗原或APL的量，可以通过本领域技术人员已知的常规方法根据经验确定。在一些有利的实施方案中，在存在聚集蛋白聚糖抗原的情况下，将抗原呈递细胞温育至少约2、3、4、5、6、7、8、12、24、36、48、60、72、84、96小时，或小于约96、84、72、60、48、36、24、12、8、7、6、5、4,3或2小时，甚至小于约60、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2分钟。细胞任选地加工和呈递聚集蛋白聚糖抗原所需的时间和多肽或肽的剂量，可以利用脉冲追踪方法确定，其中暴露于聚集蛋白聚糖抗原后，是洗出期，并暴露于读取系统，例如诱发阻抑或抑制聚集蛋白聚糖抗原特异性效应淋巴细胞应答的能力。一旦确定了细胞在其表面表达聚集蛋白聚糖抗原或其加工形式所需的最佳时间和剂量，可以使用方案制备细胞和聚集蛋白聚糖抗原，用于诱导耐受原应答。就此而言，本领域技术人员应当认识到，抗原呈递细胞在其表面呈递抗原所需的时间段可以变化，这取决于所用的抗原或抗原形式、其剂量和所用的抗原呈递细胞，进行抗原装载的条件。利用常规方法，本领域技术人员能够确定这些参数。

在一些实施方案中，将抗原呈递细胞与抗原或APL在37℃下温育约1-6h，尽管也可能在用生长因子和抑制剂温育的整个持续时间内将抗原呈递细胞暴露于抗原。通常，对于纯化的抗原和肽，0.1-10μg/mL适合产生抗原特异性抗原呈递细胞。在说明性实例中，利用更短的温育时间(例如约5、10、15、20、30、40、50分钟)、用浓度为约10-20μg/mL的抗原，能够实现肽抗原的呈递。

3.2.7.1抗原呈递细胞和其前体的来源

可以通过本领域技术人员已知的方法分离抗原呈递细胞或其前体。这类细胞的来源会不同，取决于调节指定的免疫应答所需的抗原呈递细胞。在这种情况下，抗原呈递细胞可以从树突细胞、巨噬细胞、单核细胞以及骨髓谱系的其他细胞中选择。

通常，抗原呈递细胞前体可以从任何组织中分离，但是最容易从血液、脐带血或骨髓中分离(Sorg等,2001.Exp Hematol 29:1289-1294；Zheng等,2000.J Hematother StemCell Res 9:453-464)。从患病组织例如类类风湿性滑膜组织或活检后的流体或关节液抽取(joint tap)中获得合适的前体也是可能的(Thomas等,1994a,J Immunol 153:4016-4028；Thomas等,1994b,Arthritis Rheum 37(4))。其他实例包括包括但不限于肝、脾、心脏、肾、肠以及扁桃体(Lu等,1994.J Exp Med 179:1823-1834；McIlroy等,2001.Blood97:3470-3477；Vremec等,2000.J Immunol 159:565-573；Hart and Fabre,1981.J Exp Med154(2):347-361；Hart and McKenzie,1988.J Exp Med 168(1):157-170；Pavli等,1990.Immunology 70(1):40-47)。

直接从组织分离的白细胞提供了抗原呈递细胞前体的主要来源。通常，通过在存在或不存在各种生长因子的情况下培养，这些前体仅能分化成抗原呈递细胞。根据本发明的实践，抗原呈递细胞还可以由粗混合物或由部分或基本上纯化的前体制剂分化。通过密度梯度离心，利用例如消除了嗜中性粒细胞和红细胞(外周血单核细胞或PBMCs)的聚蔗糖泛影葡胺(Ficoll Hypaque)，或通过红细胞(白细胞)的氯化铵裂解，可以从血液或骨髓中常规纯化白细胞。许多抗原呈递细胞前体作为非增值性单核细胞存在于外周血中，通过在存在特定细胞因子的情况下培养，其可以分化成特定抗原呈递细胞，包括巨噬细胞和树突细胞。

组织来源的前体，例如组织树突细胞前体或朗格汉斯细胞前体，通常通过以下方式获得：切碎组织(例如上皮基底层)并用胶原酶或分散酶消化，随后基于其对细胞表面标记的表达，对前体进行密度梯度分离或选择。例如，朗格汉斯细胞前体表达CD1以及HLA-DR，并且可基于此进行纯化。

在一些实施方案中，抗原呈递细胞前体是巨噬细胞前体。通常，这些前体可以从任何来源的单核细胞获得，并可以通过延长在存在培养基和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)情况下的温育分化成巨噬细胞(Erickson-Miller等,1990.Int J Cell Cloning8:346-356；Metcalf and Burgess,1982.J Cell Physiol 111:275-283)。

在其他实施方案中，抗原呈递细胞前体是朗格汉斯细胞前体。通常，在存在粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)即IL-4/TNFα和TGFβ的情况下，由人单核细胞或CD34⁺骨髓前体产生朗格汉斯细胞(Geissmann等,1998.J Exp Med 187:961-966；Strobl等,1997a.Blood 90:1425-1434；Strobl等,1997b.dv Exp Med Biol 417:161-165；Strobl等,1996.J Immunol 157:1499-1507)。

在其他实施方案中，抗原呈递细胞前体是树突细胞前体。可以从外周血、脐带血或骨髓中获得若干可能的树突细胞前体。这些包括单核细胞、CD34⁺干细胞、粒细胞、CD33⁺CD11c⁺DC前体，以及下文所述的定向髓样祖细胞(committed myeloidprogenitors)。

单核细胞

在存在组织培养基(例如RPMI)和血清(例如人或胎牛血清)或在无血清培养基的情况下，通过粘附于塑料1-2h，可以纯化单核细胞(Anton等,1998.Scand J Immunol47:116-121；Araki等,2001.Br J Haematol 114:681-689；Mackensen等,2000.Int J Cancer86:385-392；Nestle等,1998.Nat Med 4:328-332；Romani等,1996.J Immunol Meth196:137-151；Thurner等,1999.J Immunol Methods 223:1-15)。还可以从外周血中淘洗单核细胞(Garderet等,2001.J Hematother Stem Cell Res 10:553-567)。用抗CD14抗体，单核细胞还可以通过免疫亲和技术纯化，所述技术包括免疫磁性选择法(immunomagneticselection)、流式细胞分选或淘选(panning)(Araki等,2001,同上；Battye and Shortman,1991.Curr.Opin.Immunol.3:238-241)，以获得CD14hi细胞。循环单核细胞的数量(以及因此的产量)可以通过体内使用各种细胞因子，包括GM-CSF，来提高(Groopman等,1987.N Engl J Med 317:593-598；Hill等,1995.J Leukoc Biol 58:634-642)。通过在存在GM-CSF和IL-4的情况下延长温育，可以使单核细胞分化成树突细胞(Romani等,1994.J Exp Med180,83-93；Romani等,1996,同上)。GM-CSF和IL-4的组合，其各自浓度为约200U/mL至约2000U/mL之间，更优选约500U/mL至约1000U/mL之间，甚至更优选约800U/mL(GM-CSF)至1000U/mL(IL-4)之间，产生了显著数量的不成熟的树突细胞，即抗原捕获吞噬树突细胞。促进单核细胞分化成抗原捕获吞噬树突细胞的其他细胞因子包括例如IL-13。

CD34+干细胞

在存在GM-CSF、TNFα±干细胞因子(SCF、c-kitL)或GM-CSF、IL-4±flt3L的情况下，还可以由CD34+骨髓来源的前体产生树突细胞(Bai等,2002.Int J Oncol 20:247-53；Chen等,2001.Clin Immunol 98:280-292；Loudovaris等,2001.J Hematother Stem CellRes 10:569-578)。CD34⁺细胞可以来源于骨髓抽出物(aspirate)或来源于血液，并且可以如利用例如免疫磁性选择或免疫柱富集单核细胞一样被富集(Davis等,1994.J ImmunolMeth 175:247-257)。血液中CD34⁺细胞的比例可以通过体内使用各种细胞因子来增强，所述细胞因子包括(最通常的)G-CSF，还有flt3L和造血生长因子(progenipoietin)(Fleming等,2001.Exp Hematol 29:943-951；Pulendran等,2000.J Immunol 165:566-572；Robinson等,2000.J Hematother Stem Cell Res 9:711-720)。

其他髓样祖细胞

在存在GM-CSF和IL-4/TNF的情况下，可以以与CD34+干细胞相似的方式，由定向早期髓样祖细胞产生DC。这类髓样前体浸润许多炎症组织，包括类风湿性关节炎滑液(Santiago-Schwarz等,2001.J Immunol.167:1758-1768)。用某些细胞因子，包括flt-3配体、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或造血生长因子(pro-GP)，能够实现总体髓样细胞的扩展，所述髓样细胞包括循环树突细胞前体和单核细胞(Fleming等,2001,同上；Pulendran等,2000,同上；Robinson等,2000,同上)。向人或其他哺乳动物施用这类细胞因子数日，能使更大数量的前体获自外周血或骨髓，以用于体外操作。在存在GM-CSF、IL-4以及TNFα的情况下，还可以由外周血嗜中性粒细胞前体产生树突细胞(Kelly等,2001.Cell MolBiol(Noisy-le-grand)47,43-54；Oehler等,1998.J Exp Med.187:1019-1028)。应当指出，还可以使用相似的方法，由急性髓性白血病细胞产生树突细胞(Oehler等,2000.AnnHematol.79,355-62)。

组织DC前体以及APC前体的其他来源：

存在用于DC产生的其他方法，例如在存在IL-3+/-GM-CSF的情况下由胸腺前体产生，以及在存在GM-CSF和胶原蛋白基质的情况下，由肝DC前体产生。利用致癌基因，诸如(Paglia等,1993,同上)所述的v-myc或通过myb(Banyer和Hapel,1999,同上；Gonda等,1993,同上)，可以产生转化的或无限增殖化的树突细胞系。

循环的DC前体：

已经描述了人和小鼠外周血中的这些DC前体。也可以利用具体细胞表面标记鉴别合适的树突细胞前体。具体而言，可以通过表达CD11c以及CD14、CD19、CD56和CD3的不存在或低表达，鉴别血液中的各种树突细胞前体群(O'Doherty等,1994.Immunology82,487-493；O'Doherty等,1993.J Exp Med 178:1067-1078)。这些细胞还可以通过细胞表面标记CD13和CD33来鉴别(Thomas等,1993b.J Immunol 151(12):6840-6852)。缺少CD14、CD19、CD56以及CD3的称为类浆细胞(plasmacytoid)树突细胞前体的第二亚群不表达CD11c，而表达CD123(IL-3R链)和HLA-DR(Farkas等,2001.Am J Pathol 159.237-243；Grouard等,1997.J Exp Med 185:1101-1111；Rissoan等,1999.Science283:1183-1186)。大多数循环CD11c⁺树突细胞前体是HLA-DR⁺，然而一些前体可以是HLA-DR-。已经明确证明了外周血树突细胞前体的MHC II类表达的缺乏(del Hoyo等,2002.Nature 415:1043-1047)。

任选地，通过在培养基中或在单核细胞条件培养基中温育18-36h，CD33⁺CD14^-/lo或CD11c⁺HLA-DR⁺，即上文所述的谱系标记阴性树突细胞前体可以分化成更成熟的抗原呈递细胞(Thomas等,1993b,同上；Thomas和Lipsky,1994.J Immunol 153:4016-4028)(O'Doherty等,1993,同上)。可选地，在温育外周血非T细胞或未纯化的PBMC后，成熟的外周血树突细胞的特征是密度低，并且因此能够在密度梯度上纯化，包括三碘苯甲酰氨基葡糖和尼可登(Nycodenz)(Freudenthal和Steinman,1990.Proc Natl Acad Sci U S A87:7698-7702；Vremec和Shortman,1997.J Immunol 159:565-573)，或通过特异性单克隆抗体纯化，例如但不限于CMRF-44mAb(Fearnley等,1999.Blood 93:728-736；Vuckovic等,1998.Exp Hematol 26:1255-1264)。类浆细胞树突细胞可以基于细胞表面标记直接由外周血纯化，随后在存在IL-3的情况下温育(Grouard等,1997,同上；Rissoan等,1999,同上)。可选地，类浆细胞DC可以获自上文的温育的外周血细胞的密梯度或CMRF-44选择。

通常，对于由任何前体产生的树突细胞而言，当在存在激活因子如单核细胞来源的细胞因子、脂质多糖以及含有CpG重复的DNA的情况下温育时，诸如TNFα、IL-6、IFN-α、IL-1β的细胞因子，坏死细胞，再粘附，全细菌，膜组分，RNA或多IC(polyIC)、不成熟的树突细胞会被激活(Clark,2002.J Leukoc Biol 71:388-400；Hacker等,2002.Immunology 105:245-251；Kaisho and Akira,2002.Biochim Biophys Acta 1589:1-13；Koski等,2001.Crit Rev Immunol 21:179-189)。这种激活树突细胞的方法在存在NF-κB抑制剂的情况下受到抑制(O'Sullivan和Thomas,2002.J Immunol 168:5491-5498)。

3.2.8体内抗原呈递细胞实施方案

在其他实施方案中，通过向对象共施用NF-κB抑制剂和/或mTOR抑制剂和/或Syk抑制剂(有时在本文中统称为“抑制剂”)以及全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽包括其瓜氨酸化形式的聚集蛋白聚糖抗原，可以增加所述对象中聚集蛋白聚糖特异性耐受原抗原呈递细胞的数量。所述抑制剂和/或所述抗原可以采用核酸形式(即其中，它们由核酸构建体产生)或采用非核酸形式。所述抑制剂和抗原可以以可溶性形式或颗粒形式共施用(例如所述抗原和所述抑制剂都采用可溶性形式，或所述抗原或抑制剂之一采用可溶性形式，而另一个采用颗粒形式，或者所述抗原和所述抑制剂都采用颗粒的形式)。在具体实施方案中，以颗粒的形式共施用所述抑制剂和所述抗原。期望的是，所述抑制剂和所述抗原包含于同一颗粒中。一旦施用，所述颗粒被对象的抗原呈递细胞摄取(例如吞噬作用或内吞作用)，并且所述抑制剂/抗原有效载荷被释放到细胞内部。

3.2.9离体调节性淋巴细胞实施方案

根据3.2.7部分离体获得或制备的聚集蛋白聚糖特异性抗原呈递细胞可用于调节其他免疫细胞，包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，特别是用于产生表现出聚集蛋白聚糖抗原(包括其瓜氨酸化形式)耐受或无反应性的T淋巴细胞和B淋巴细胞。诱导淋巴细胞特别是T淋巴细胞表现出聚集蛋白聚糖抗原耐受/无反应性的功效可通过测定针对该抗原的免疫应答来确定，包括但不限于，使用例如聚集蛋白聚糖特异性抗原呈递细胞作为聚集蛋白聚糖特异性溶细胞T淋巴细胞(CTL)的靶标测定体外T淋巴细胞溶细胞活性；测定聚集蛋白聚糖特异性T淋巴细胞增殖和细胞因子应答；以及测定T调节性抑制功能(见例如Vollenweider and Groseurth,1992,J.Immunol.Meth.149:133-135)，利用例如ELISPOT测定和ELISA测定，测量B细胞对抗原的应答；询问细胞因子谱(profile)；或通过检验皮肤对聚集蛋白聚糖抗原的反应性，测量迟发型超敏反应(DTH)(见例如Chang等(1993,Cancer Res.53:1043-1050)。本发明还考虑了本领域从业人员已知的、能够检测在暴露于抗原后的抗原呈递细胞表面上所述抗原的存在的其他方法。

引发耐受性/无反应性的抗原呈递细胞能有效在MHC I类分子和MHC II类分子之一或两者上呈递聚集蛋白聚糖抗原或其加工形式。因此，本发明的agg-tolAPC使得CD4⁺T辅助淋巴细胞和CTL是耐受的/无反应性的。而且，本发明的agg-tolAPC可以装载有多重MHC上的多重聚集蛋白聚糖抗原，以产生T淋巴细胞的多克隆或克隆粒耐受性/无反应性。

因此，本发明还提供了聚集蛋白聚糖特异性耐受/无反应性或调节性B或T淋巴细胞，特别是T淋巴细胞，它们不能以抗原特异性的方式对聚集蛋白聚糖抗原的呈递进行应答，或它们主动调节以前的免疫应答或随后的对聚集蛋白聚糖抗原引发。调节通常存在较长的事件且维持例如至少月3个约，适宜的是，维持多年。

在具体实施方案中，聚集蛋白聚糖特异性调节性T淋巴细胞通过以下方式产生：使上文限定的聚集蛋白聚糖特异性抗原呈递细胞与T淋巴细胞群接触，所述细胞群获得自任何合适的来源例如脾或扁桃体/淋巴结，但是优选获得自外周血。T淋巴细胞可以作为粗制备品或部分纯化的或实质上纯化的制备品使用，适宜的是，利用例如“Immunochemical Techniques,Part G:Separation and Characterization of Lymphoid Cells”(Meth.in Enzymol.108,Edited by Di Sabato等,1984,Academic Press)所述的标准技术，获得所述制剂。这包括绵羊红细胞玫瑰花环试验(rosetting with sheep red blood cells)、跨越尼龙毛的通道(passage across columns of nylon wool)或耗尽贴壁细胞的塑料粘附(plasticadherence to deplete adherent cells)、利用适当单克隆抗体的免疫磁性或流式细胞计数选择，如(Cavanagh等,1998.Blood 92(5)inhibitor1598-1607；Thomas等,1993.J Immunol150inhibitor821-834)所述。

使T淋巴细胞制备品与3.2.7部分所述的聚集蛋白聚糖特异性抗原呈递细胞接触足够的时间段，以诱导T淋巴细胞的针对抗原或这些抗原呈递细胞所呈递的抗原的调节性功能。该时间段通常至少为约1天，并且高达约5天。通常，这种程序后所产生的调节性T淋巴细胞的增殖短暂，这取决于培养物中IL-2的浓度。这样制备的调节性淋巴细胞通常以抗原特异性方式产生IL-10和/或或其他调节性细胞因子。

在一些实施方案中，在存在适当获得自外周血的异源T淋巴细胞群、例如3.2.3、3.2.4和3.2.5部分所述的至少一种抑制剂以及聚集蛋白聚糖抗原或可表达所述聚集蛋白聚糖抗原的多核苷酸的情况下，培养聚集蛋白聚糖特异性抗原呈递细胞前体群。在以下条件下将这些细胞培养一段时间，所述条件足以使：(1)所述前体分化成抗原呈递细胞；(2)这些抗原呈递细胞中NF-κB和/或mTOR和/或Syk的水平和/或功能活性被取消或以另外方式降低；(3)抗原呈递细胞呈递聚集蛋白聚糖抗原或其加工形式；以及(4)抗原呈递细胞诱导T淋巴细胞亚群表现出针对聚集蛋白聚糖抗原的调节功能，其中所述亚群的特征是聚集蛋白聚糖特异性T细胞应答的阻抑。这可以利用Ficoll纯化的PBMC加聚集蛋白聚糖抗原加抑制剂(例如NF-κB和/或mTOR和/或Syk抑制剂)而发生，因为这样的制备品含有抗原呈递细胞前体(例如树突细胞前体)和T淋巴细胞。

适宜的是，如此产生的聚集蛋白聚糖特异性抗原呈递细胞诱导一种或多种类型的抗原特异性调节性淋巴细胞，特别是调节性T淋巴细胞(在本文中也称为“Treg”)。已经描述了若干Treg群或亚群(Shevach,2006.Immunity 25:195-201；Lee等2011,Adv Immunol.112:25-71；Sakaguchi,2011.Methods Mol Biol.707:3-17)，包括例如天然存在的不同的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg群，称为天然Treg(nTreg)，其是在胸腺中发展的，并且存在于出生后的健康个体中。nTreg的T细胞受体(TCR)的特异性主要是自我反应性。另外，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg群可以在外周在各种条件下受到体内诱导，例如在抗原呈递和细胞因子刺激的某些限定条件过程中，并且可以诱导耐受性(在Roncarolo等,2007.Nat RevImmunol.7:585-598中有评述)。诱导型Treg的其他亚群已有报道，包括T_h3细胞核Tr1细胞，和CD4⁺CD25⁺Treg。T_h3细胞产生TGFβ和各种数量的IL-4和IL-10(Chen等,1994.Science 265(5176):1237-1240)。Tr1细胞分泌IL-10(Groux等,1997.Nature389(6652):737-742)。CD8⁺Treg也有报道，其表达低水平的Foxp3(见例如Smith等,2008.Trends Immunol.29(7):337-342；Guillonneau等,2010.Curr Opin Organ Transplant15:751–756；Filaci等,2011.Autoimmunity 44(1):51-57；Picarda等,2011.Immunotherapy3(4Suppl):35-37)。

本领域已知分离和扩展Treg的许多方法，其包括例如以下文献所述的方法：Brusko等(2008.Immunological Reviews 223:371-390),Gregori等(2011.Methods MolBiol.677:31-46),Gregori等(2007.Methods Mol Biol.380:83-105),Ménoret等,2011.Methods Mol Biol.677:63-83),Wang,L.(2010.Methods Mol Biol.595:403-412)以及Daniel等(2011.Methods Mol Biol.707:173-185)。

因此本发明提供了如下方法，其通过用本发明的聚集蛋白聚糖特异性抗原呈递细胞刺激淋巴细胞例如至少约3天，合适的是至少约5天，产生大量抗原特异性淋巴细胞。

聚集蛋白聚糖特异性耐受性还可以通过以下方式实现：在B淋巴细胞(在本文中也称为B细胞)表达编码聚集蛋白聚糖抗原的核酸分子，其中所述核酸分子的表达导致所述抗原或其加工形式呈递于所述B淋巴细胞表面。

在具体实施方案中，核酸分子还编码与聚集蛋白聚糖抗原直接融合或间接融合(例如与所述抗原的C末端相邻)的免疫球蛋白(例如IgG)或免疫球蛋白片段(例如Fv、Fab、Fab'以及F(ab')₂免疫球蛋白片段、免疫球蛋白重链等)。在这种类型的说明性实例中，使用免疫球蛋白(例如IgG)作为载体将聚集蛋白聚糖抗原呈递到免疫系统，其中聚集蛋白聚糖抗原在免疫球蛋白重链支架的N末端融合而形成融合蛋白。通过用可产生所述融合蛋白的核酸分子转导(例如通过逆转录病毒感染)造血细胞(例如骨髓来源的细胞)或淋巴细胞(例如B细胞，包括已经用脂多糖刺激的B细胞母细胞(B cell blast)产生耐受原APC，在“激活的”B细胞中产生融合蛋白。聚集蛋白聚糖抗原或其加工形式被宿主组织相容性复合体(MHC)呈递于这些B细胞上，从而由于免疫球蛋白(例如IgG)融合蛋白的呈递和长期体内表达而导致耐受性。合适的是，这些B细胞表达MHC II类和共刺激分子(例如B7.1和B7.2)，它们通过结合CTLA-4有助于募集和触发表达CD25的调节性T细胞。这种类型的免疫球蛋白融合物描述于例如美国专利公布号2002/0048562，其通过引用整体并入本文。

在这种类型的说明性实例中，如Scott和其同事所述(Zambidis等,1996.Proc NatlAcad Sci U S A 93(10):5019–5024；Kang等,1999.Proc Natl Acad Sci U S A96(15):8609–8614；Agarwal等,2000.Clin Invest 106(2):245–252；El-Amine等,2002.IntImmunol 14(7):761–766；Melo等,2002.J Immunol 168(9):4788–4795；Song等,2004.Gene Ther 11(20):1487–1496；Lei等,2005.Blood 105(12):4865–4870；Xu等,2006.MolTher 13(1):42–48；Satpute等,2007.Arthritis Rheum 56(5):1490–1496；Scott,2010.Haemophilia 16(102):89–94)，利用通过逆转录病毒送递到B细胞中的抗原-Ig融合蛋白，诱导抗原特异性耐受性。

这种B细胞介导的基因治疗已经成功地用于疾病模型，例如实验性自体免疫性葡萄膜炎(EAU)(Agarwal等,2000,同上)、EAE[通过髓磷脂碱蛋白(MBP)或通过髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)引起](Melo等,2002,同上)以及非肥胖糖尿病(NOD)小鼠糖尿病模型(Melo等,2002,同上；Song等,2004,同上)。这种方法还成功用于诱导甲型血友病因子VIII抑制剂的耐受性(Lei等,2005,同上)和(与骨髓(BM)移植联合)治疗EAE(Xu等,2006,同上)。B细胞介导的基因疗法还成功用于佐剂诱导的关节炎(AA)模型(Satpute等,2007,同上)。

融合蛋白可以通过任何合适的方式送递，包括向有需要的对象施用可产生所述融合蛋白的核酸分子。在具体实施方案中，向对象施用用所述核酸分子转导的造血细胞或淋巴细胞。

在一些实施方案中，表达编码聚集蛋白聚糖抗原的核酸分子的B淋巴细胞是调节性B淋巴细胞(在本文中也成为“Breg”细胞)，包括但不限于CD1d^高CD5+B细胞亚群，其通过IL-10分泌调解T细胞介导的炎性和免疫应答，如例如Tedder在美国专利公布号2011/013566中所披露的，据此将该专利公布通过引用整体并入本文。

3.2.10MHC-肽复合体实施方案

本发明还考虑了主要组织相容性复合体(MHC)-肽复合体用于诱发聚集蛋白聚糖特异性致耐受性的用途。这些复合通常包含具有抗原结合位点的聚集蛋白聚糖肽(例如cit-聚集蛋白聚糖肽)和分离的(例如可溶性)MHC组分，其中所述抗原与所述抗原结合位点结合。MHC-肽复合体有效代替抗原呈递细胞并在自身反应性抗原特异性T淋巴细胞和免疫系统的其他细胞中引起非反应性。MHC组分可以是I类或II类分子。如果需要，可以包括MHC分子的跨膜和/或细胞内结构域。肽抗原与MHC蛋白抗原结合位点的结合可以通过共价键或通过非共价键实现。

可以利用任何合适的方案纯化MHC分子，其说明性实例包括通过用木瓜蛋白酶处理、通过用3M KC1处理或通过用去污剂处理而溶液化细胞(例如淋巴细胞)溶解。在说明性方案中，使用去污剂从淋巴细胞中提取MHC(例如II类)分子，随后进行亲和纯化。随后通过透析或选择性结合珠，例如生物珠(Bio Bead)，除去去污剂。可选地，MHC I类和II类分子每一成员的氨基酸序列都是已知的，并且已经克隆了它们的相应编码序列，从而允许重组产生MHC蛋白。

聚集蛋白聚糖抗原通常是肽(例如长度为约8至约15个氨基酸)，其利用本领域已知的标准算法通过MHC分子预测。可选地，可以使用对应于聚集蛋白聚糖氨基酸序列重叠部分的肽(例如长度为约8至约15个氨基酸)。所述肽可以是非瓜氨酸化的或瓜氨酸化的。

复合体的元件可以通过本领域已知的标准方法联合。抗原肽与MHC蛋白囊部分的非共价联合可以通过例如混合所述两种组分进行。它们还可以利用标准程序，通过例如光亲和标记法(photo affinity labeling)共价结合(见例如Hall等,1985.Biochemistry24:5702-5711)。

在掺入脂质单层或双层后，常规施用包含含有跨膜的MHC分子的复合体。通常，脂质体用于这一目的，但是可以使用任何形式的脂质膜，例如平面脂质膜或细胞(例如红细胞)的细胞膜。所述复合体也可以常规地掺入胶束中。

根据例如3.2.6.2部分所述的标准方法，可以制备脂质体。然而，如果跨膜区缺失，则以含有肽的药物所用的常规方法施用所述复合体。

胶束在本领域中通常用来增加具有非极性区的分子的溶解度，其可以有利地用于利用本领域熟知的方法合并MHC-肽复合体(见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物学),Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.,17th ed.(1985，其在此通过引用整体并入本文)。通常利用标准的表面活性剂或去污剂制备含有复合体的胶束。

产生MHC-肽复合体的示例性方法描述于例如美国专利公布号2003/0068363中，据此将其通过引用整体并入本文。

3.2.11基于配体表位抗原呈递系统的嵌合构建体

本发明还考虑了配体表位抗原呈递系统(Ligand Epitope Antigen Presenting System,L.E.A.P.S.)技术诱发聚集蛋白聚糖特性致耐受性的用途。这种技术通过以下方式将含有自身抗原的小肽转化成耐受原：将所述小肽附着于免疫或T细胞结合配体(I/TCBL)，并将其呈递给免疫细胞(Cihakova等,2008.Int Immunopharmacol 8:624；Rosenthal等,1998.Vaccine 17:535-542；Goel等,2003.Vaccine 21:4410；Goel等,2005.Front Biosci 966；Zimmerman等,1996.Vac Res 5:91–102；Zimmerman等,1996.Vac Res 5:103–13；Zimmerman等,1985.DNA.Med Virol 15:215–22.Charoenvit等,2004.Antimicrob AgentsChemother 48:2455；Charoenvit等,2004.Vaccine 10:2368；and Zimmerman等,2001.Vaccine 19(32):4750–4759)。I/TCBL通常来源于已知或疑似结合T细胞的免疫系统分子，其实例包括MHC I类和II类的一部分或辅助分子β2-微球蛋白，LFA-3的部分，免疫球蛋白重链Fc区的部分，以及Ia+分子。在具体实施方案中，使用β2微球蛋白(J)作为I/TCBL，并将其与目的自身抗原相连。已经成功地使用这种类型的融合构建体在胶原蛋白诱导的关节炎模型中阻止疾病的发展，如例如Zimmerman等(2010,Int Immunopharmacol10:412–421)所述，同时增加治疗的动物的血清中IL-12p70和IL-10以及降低IL-17和TNFα。

制备L.E.A.P.S.构建体的示例性方法公开于例如美国专利号5,652,342和美国专利申请号2011/0098444中，据此将其通过引用整体并入本文。

3.3基于细胞的疗法或预防

可以将例如3.2.7部分所述的聚集蛋白聚糖特异性抗原呈递细胞，或例如3.2.9部分所述的聚集蛋白聚糖特异性T或B调节性淋巴细胞或耐受原B淋巴细胞单独或组合适用于患者，用于抑制针对聚集蛋白聚糖抗原，包括其瓜氨酸化形式的免疫应答。这些基于细胞的组合物可用于治疗或预防受影响对象或易感对象的关节损伤，包括患有早期RA的对象和处于发展RA风险的对象，适宜的是，在所述疾病发展成为慢性和衰弱型RA之前。可以通过任何方式(例如注射)，将本发明的细胞引入患者，这产生针对聚集蛋白聚糖抗原的抗原特异性耐受原应答。所述细胞可以来源患者(即自体细胞)，或来源于与患者MHC匹配或不匹配的一个或多个个体(即异基因)。通常，将自体细胞注射回从其获得来源细胞的患者。注射部位可以是皮下、腹腔内、肌肉内、真皮内、静脉内或淋巴内。可以将所述细胞施用于已经患有关节损伤的患者(或包括患有早期RA和处于发展RA风险的对象)或易患关节损伤的对象，施用的量应足以导致对象的临床改善，或预防处于发展关节损伤风险的对象(包括处于发展RA风险的对象)的关节损伤或关节损伤症状。注射到需要治疗或预防的患者中的细胞数量可以变化，这尤其取决于聚集蛋白聚糖抗原或抗原以及对象的大小。该数量的范围可以为例如在约10³-10¹¹、通常约10⁵-10⁷个细胞(例如以血液、PMBC或纯化的树突细胞、T淋巴细胞、造血或淋巴细胞、B淋巴细胞等的形式)之间。可以进行单次或多次(2、3、4或5)细胞施用，其中由治疗医师选择细胞的数量和式样。应当以对细胞和个体无毒的药学上可接受的载体施用所述细胞。这类载体可以是生长细胞的生长培养基或任何合适的缓冲培养基，例如磷酸盐缓冲液。所述细胞可以单独施用，或作为辅助疗法与本领域已知的其他治疗剂一起施用，用于治疗或预防不需要的免疫应答，包括但不限于糖皮质激素、甲氨蝶呤、D-青霉胺(penicillamine)、羟化氯喹、金盐、柳氮磺胺吡啶、TNFα或L-1抑制剂和/或其他形式的具体免疫疗法。

3.4药物组合物

根据本发明，例如3.2.1部分所述的聚集蛋白聚糖抗原，例如3.2.2部分所述的聚集蛋白聚糖APL，例如3.2.3部分所述的NF-κB抑制剂，例如3.2.4部分所述的mTOR抑制剂，例如3.2.5部分所述的Syk抑制剂，例如3.2.6部分所述的免疫调节颗粒，例如3.2.7部分所述的抗原呈递细胞，例如3.2.9部分所述的调节性T或B淋巴细胞或耐受原B淋巴细胞，例如3.2.10部分所述的MHC-肽复合体，以及例如3.2.11部分所述的嵌合构建体(在本文中统称为“免疫调节剂”)，可用于抑制针对聚集蛋白聚糖抗原，包括其瓜氨酸化的免疫应答的组合物和方法中，并且特别是用于治疗或预防受影响的或易感对象的关节损伤，包括患有早期RA的对象和处于发展RA风险的对象的关节损伤。

本发明的含有免疫调节剂的组合物通常采用药物组合物的形式，其可以包含药学上可接受的载体或稀释剂。取决于治疗的具体病状，可以配制免疫调节剂并全身、局部(topically)或定位(locally)施用。配制和施用的技术可见于“Remington’s PharmaceuticalSciences(雷明顿药物学),”Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,最新版本。合适的途径包括例如口服给药、直肠给药、跨粘膜给药或肠给药；胃肠外送递，包括肌肉内注射、皮下注射、髓内注射，以及鞘内注射、直接心室内注射、静脉内注射、腹腔内注射、鼻内注射或眼内注射。对于注射而言，可以将本发明的免疫调节剂配制于水溶液中，优选生理相容缓冲液，如汉克溶液(Hanks’solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理盐水缓冲液。对于跨粘膜给药，在所述制剂中使用适合待被渗透的屏障的渗透剂。这类渗透剂在本领域中通常是已知的。对于例如施用免疫原性组合物、疫苗以及DNA疫苗而言，肌肉内注射和皮下注射是合适的。

利用本领域熟知的药学上可接受的载体，可以很容易地将免疫调节剂配制成适合口服给药的剂量。这类载体能使本发明的化合物被配制成诸如片剂、丸剂、胶囊、脂质、夜剂、凝胶、糖浆剂、膏剂、悬浮剂等剂型，供待治疗的患者口服消化。这些载体可以选自糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、褐藻酸、磷酸盐缓冲液、乳化剂、等渗盐水以及无致热源水。

用于胃肠外给药的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，可以将活性化合物的悬浮剂制备为适当的油性注射悬浮剂。合适的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯或脂质体。含水注射悬浮剂可以保含增加所述悬浮剂粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，所述悬浮剂还可以含有合适的稳定剂或增加所述化合物溶解度的剂，从而允许制备高浓缩溶液。

用于口服施用的药物制剂可以通过以下方式获得：将活性化合物与固体赋形剂组合，任选地研磨所得的混合物，并且如果需要在添加合适的助剂后加工所述颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。合适的赋形剂特别是填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以添加崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、糖或褐藻酸或其盐，如藻酸钠。这类组合物可以通过药学的任何方法制备，但是所有方法都包括使上文所述的一种或多种免疫调节剂与构成一种或多种必要成分的载体结合的步骤。通常，本发明的药物组合物可以以本身已知的方式制造，例如以常规混合、溶解、粒化、制备糖衣丸(dragee-making)、磨细(levigating)、乳化、封装、截留或冻干方法等方式。

为糖衣丸核心提供合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡伯波凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇或二氧化钛、漆溶液以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。也可以将颜料或着色剂添加于片剂或糖衣丸包衣，用于鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。

可以口服使用的药物包括由明胶制备的推入配合胶囊(push-fit capsule)，以及由明胶和增塑剂制成的密封的软胶囊，所述增塑剂如甘油或山梨醇。推入配合胶囊可以含有与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉或润滑剂如滑石或硬脂酸镁和任选的稳定剂混合物的活性组分。在软胶囊中，可以将活性化合物溶解或悬浮于合适的脂质中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外可以添加稳定剂。

本发明的药物剂型还可以包括特别针对这一目的设计的注入或植入控释装置，或经修饰以这种方式另外起作用的其他形式的植入体。本发明免疫调节剂的控释可以通过以下方式实现：例如用疏水聚合物，包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙二醇酸以及某些纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素涂覆所述免疫调节剂。此外，用其他聚合物基质、脂质体或微球，也可以实现控释。

还可以将本发明的免疫调节剂单独或与惰性载体如乳糖或与其他药学上可接受的赋形剂组合施用于呼吸道，作为鼻或肺吸入气溶胶或喷洒器溶液，或作为吹入用微细粉末。在本发明的一些颗粒实施方案中，有利的是，制剂颗粒的直径小于50μm，合适的是小于10μm。

在一些颗粒实施方案中，施用免疫调节剂，供APC例如通过吞噬主动摄取，例如美国专利号5,783,567(Pangaea)所述。通过维持粒径通常小于约20μm，并且优选小于约11μm，可以改善细胞的吞噬作用。

在具体颗粒实施方案中，如果期望网状内皮系统(RES)包括肝和脾的吞噬细胞进行摄取，则将颗粒形式的免疫调节剂直接送递到血流中(即通过静脉内或动脉内注射或输注)。可选地，可以通过皮下注射靶向引流淋巴结的吞噬APC摄取。例如利用弹道或微针送递，还可以真皮内(即向皮肤的APC，如树突细胞和朗格汉斯细胞)引入颗粒。示例性颗粒介导的送递技术包括向靶细胞推动载体颗粒的爆发性电或气体排放递送，例如美国专利号4,945,050、5,120,657、5,149,655和5,630,796中所述。微针送递的非限制性实例公开于国际公开第WO 2005/069736号和第WO 2005/072630号，以及美国专利号6,503,231和5,457,041中。

在其他具体颗粒实施方案中，颗粒送递途径经过胃肠道，例如经口服。可选地，可以将所述颗粒引入器官例如肺中(例如通过吸入粉状微粒或吸入含有微粒的喷洒或雾化溶液)，其中所述颗粒可以被肺泡巨噬细胞获取，或可以通过鼻内或口腔施用。一旦吞噬性APC吞噬所述颗粒，则NF-κB抑制剂以及任选的聚集蛋白聚糖抗原就释放到细胞的内部。

合适的颗粒送递途径包括例如口服给药、直肠给药、跨粘膜给药或肠给药；胃肠外送递，包括肌肉内注射、皮下注射、髓内注射，以及鞘内注射、直接心室内注射、静脉内注射、腹腔内注射；鼻内注射或眼内注射。对于注射，可以将所述颗粒配制于水溶液中，适宜的是配制于生理相容缓冲液，如汉克溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。对于跨粘膜给药，可以在制剂中使用适合待被渗透的屏障的渗透剂。这类渗透剂在本领域中通常是已知的。

用于胃肠外施用颗粒的药物制剂包括颗粒的水溶形式的水溶液。另外，可以制备颗粒的悬浮液作为适当的油性注射悬浮剂。合适的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯。含水注射悬浮剂可以含有增加悬浮剂粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮剂还可以含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度的剂，从而允许制备高浓缩溶液。

颗粒送递抑制剂(例如NF-κB抑制剂)和抗原的示例性方法描述于例如美国专利申请公开20100151000中。

本发明的免疫调节剂(例如抑制剂、抗原、APC、淋巴细胞、融合蛋白、颗粒等)可以作为具有药学上相容的抗衡离子的盐被提供。用许多酸可以形成药学上相容的盐，包括但不限于盐酸、硫磺酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。在作为相应地无碱形式的含水溶剂或其他质子溶剂中，盐倾向于更可溶。

适合用于本发明的药物组合物包括组合物，其中包含有效量的免疫调节剂，从而实现它们的预定目的。施用于患者的免疫调节剂的剂量应当足以实现对象的临床改善或者足以预防处于发展关节损伤风险的对象(包括处于发展RA风险的对象)的关节损伤或关节损伤症状。待施用的免疫调节剂的量或剂量频率可以取决于待治疗的对象，包括给药模式、其年龄、性别、体重以及总体健康情况。在这点上，施用的免疫调节剂的精确量应取决于从业人员的判断。在确定治疗或预防关节损伤的待施用的免疫调节剂的有效量时，从业人员可以评估价炎症、促炎细胞因子水平、淋巴细胞增殖、细胞溶解性T淋巴细胞活性以及聚集蛋白聚糖特异性调节性T淋巴细胞功能。无论如何，本领域技术人员可以很容易地确定免疫调节剂的合适剂量。

对于用于本发明方法中的任何免疫调节剂，最初可以根据细胞培养测定，评估治疗有效剂量。例如，可以在动物模型中配制剂量，以实现包括在细胞培养物中测定的IC50(例如检测试剂的浓度，其实现NF-κB活性或mTOR活性或Syk活性的半最大降低，聚集蛋白聚糖特异性抗原呈递细胞等的最大增加等)的循环浓度范围。这类信息可以用于更准确地确定在人类中的有用剂量。

这类免疫调节剂的毒性和治疗功效可在细胞培养物或实验动物中通过标准药学方法确定，例如用于确定LD50(50％群体致死剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性效果和治疗效果的剂量比是治疗指数，并且可以表示为LD50/ED50比。优选表现出的治疗指数大的免疫调节剂。根据这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制用于人类中的剂量范围。这类免疫调节剂的剂量优选在包括ED50同时毒性很小或无毒性的循环浓度范围内。剂量可以在这一范围内变化，这取决于所用的剂型以及所用的给药途径。提取物制剂、给药途径以及剂量可以由个体医师根据患者的状况来选择(见例如Fingl等,1975,in“The Pharmacological Basis of Therapeutics”,Ch.1p1)。

可以单独调整剂量量和间隔，以提供足以增强对免疫应答的抑制或对聚集蛋白聚糖抗原的致耐受性的免疫调节剂的血浆水平。用于全身给药的本发明的非细胞免疫调节剂的通常患者剂量的范围为0.0001-2000mg/天，通常0.0001-250mg/天，并且通常0.001-150mg/天。

可以在数小时、数日、数周或数月内施用本发明的组合物，这取决于若干因素，包括治疗的病状(例如关节损伤，包括RA中的关节损伤)的严重性，是否可能考虑病状的复发等。在数小时、数日、数周、数月等内，给药可以是不变的，例如恒量输注(constantinfusion)。可选地，给药可以是间歇性的，例如免疫调节剂可以在数日的一段时间内一天施用一次，在数小时内一小时施用一次，或被认为是合适的任何其他这类方案。在具体实施方案中，通过以下途径之一以规律的治疗方案施用本发明的免疫调节剂，例如一周一次，两周一次、每月一次、一季一次、半年一次或一年一次：皮内、肌肉内或皮下以及皮肤经皮或鼻送递，其量为每公斤体重1-100微克，通常10-50微克。

3.5评估抗原特异性致耐受性的方法

诱导效应淋巴细胞、特别是效应T淋巴细胞表现出对聚集蛋白聚糖抗原耐受性的功效可以通过以下方式测定：测定针对该抗原的免疫应答，包括但不限于，利用例如聚集蛋白聚糖特异性抗原呈递细胞作为抗原特异性细胞溶解性T淋巴细胞(CTL)的靶标，体外测定效应T淋巴细胞细胞溶解活性；测定聚集蛋白聚糖特异性T淋巴细胞增殖、凋亡或细胞因子产生(见例如Vollenweider和Groscurth,1992.J.Immunol.Meth.149:133-135)、效应T细胞的抗原特异性抑制，使用例如ELISPOT测定和ELISA测定，测量针对该抗原的B细胞抗体应答；询问细胞因子谱；或通过检测皮肤对指定抗原的反应性，测量迟发型超敏反应(DTH)(见例如Chang等1993,Cancer Res.53,1043-1050)。

在一些实施方案中，聚集蛋白聚糖特异性调节性T淋巴细胞诱导的抗原特异性耐受性/无反应性反映了抗原特异性免疫效应细胞(例如抗原特异性效应T和/或B淋巴细胞)应答聚集蛋白聚糖抗原的随后再刺激的无能。这些抗原特异性调节性淋巴细胞的特征可以是以抗原特异性方式产生细胞因子，如IL-10或IFN-γ。IL-10和IFN-γ是人类CD25^-CD127^dim CD4⁺诱导的调节性T细胞所产生的具有有效免疫抑制特性的细胞因子。因此，在一些实施方案中，无反应性T淋巴细胞的存在，可以通过利用本领域已知的标准测定如细胞内染色测定细胞因子产生来确定(Haringer等,2009.J Exp Med206(5):1009-1017)。可选地，表达作为CD127dim的CD25和FoxP3的CD4⁺调节性T细胞的比例可以变化(Fazekas de St Groth B等,2011.Methods Mol Biol 707:263-79).

可选地或另外，抗原特异性耐受性/无反应性可以通过以下方式间接测定：在施用免疫调节剂/耐受原组合物至少一个月后对治疗的对象进行射线照相检测，其测量与给药前基线相比的关节损伤的缓解或治愈或降低关节损伤发展，包括其病征和症状和/或结构损伤，其中施用的免疫调节剂/耐受原组合物的量有效实现关节损伤的缓解或治愈，或降低关节损伤的发展，包括其病征和症状和/或结构损伤，从而表示已经成功地治疗对象的关节损伤。在具体实施方案中，在施用免疫调节剂/耐受原组合物后至少约2个月，至少月10个周，至少约3个月，至少约4个月，至少约5个月，至少约24个周，至少约6个月，或至少约52个周后，进行施用免疫调节剂/耐受原组合物后的射线照相检测。在这种类型的说明性实例中，所述检测测量总修饰的Sharp得分。

为使本发明被很容易地理解和有效实施，通过下述非限制性实施例，描述本发明特别优选的实施方案。

实施例

实施例1

T细胞响应瓜氨酸化自身抗原肽增殖不充分但是产生细胞因子

基于在P4定位瓜氨酸的分子模型中预测的与RA相关DR分子的结合能力，或通过以前在HLA-DR4-IE-转基因小鼠中的研究，由已经确定的纤维蛋白原、波形蛋白、胶原蛋白以及聚集蛋白聚糖蛋白序列合成瓜氨酸化或未修饰的肽抗原(表5)(Hida等,2004.J.Autoimmun.23:141-150；Hill J等,2008.J.Exp.Med.205:967-979；von Delwig等,2010.Arthritis Rheum.62:143-149)。

表5.实施例所用的肽的序列

总计研究了21例SE⁺RA患者和6名SE⁺健康对照。除了4例RA患者外，所有研究对象也是ACPA⁺(表6)。43％的RA患者不抽烟，38％的患者过去抽烟，以及19％的患者现在抽烟。一名健康对照现在抽烟，并且2名健康对照具有RA家族史。分析SE⁺RA患者和SE⁺健康对照的外周血单核细胞(PBMC)针对不同浓度的瓜氨酸化或未修饰肽抗原的增值性应答。针对肽抗原和破伤风类毒素的增值性应答表示为SI。SI>2视为显著的。在RA患者和健康对照中，针对瓜氨酸化和未修饰肽的平均增值性SI通常介于1-2之间，在每一情况下明显低于针对破伤风类毒素的应答(图1)。在RA患者中，响应瓜氨酸化聚集蛋白聚糖肽的增值性SI明显高于响应天然聚集蛋白聚糖肽的增值性SI(图1)。当比较RA和健康对照的PBMC时，针对破伤风类毒素的增值性应答明显更低。

在最初的实验中，本发明人确定，如果在存在人而不是胎牛血清的情况下测定肽应答，则背景细胞因子分泌和增殖应答通常较低。而且，当比较在存在10％健康或自体或异基因RA供体血清进行的测定时，细胞因子产生没有差异，条件是在类风湿因子(RF)效价>100U/mL时添加Hetero Block以便防止RF结合ELISA反应中的捕获和检测抗体(Todd等,2011.Arthritis&Rheumatism 63:894-903)。在缺少肽刺激的情况下，RA患者PBMC分泌的IFN-γ和IL-6的浓度明显比其他细胞因子在不存在肽的情况下分泌的浓度高(图2A)。净细胞因子分泌评估为用瓜氨酸化肽刺激后分泌的细胞因子减去在缺少肽的情况下分泌的细胞因子。在测量的细胞因子中，IL-6分泌是所最高的，响应30μg/mL瓜氨酸化聚集蛋白聚糖，其净产量高达60ng/mL。与缺少天然表位与共同的表位HLA-DR等位基因的结合相一致(Snir等,2011,同上)，RA患者响应瓜氨酸化聚集蛋白聚糖肽所产生的IL-6、TNF以及IL-10的量显著大于响应天然聚集蛋白聚糖肽所述产生的量(图2B、图3)。响应若干瓜氨酸化肽，还分泌IL-17和在一定程度上分泌IFN-γ，但在个体之间具有相当大的变化，并且没有在统计上显著的差异(图3)。IL-2和IL-4应答通常较低。对比RA患者和健康对照时，RA患者响应瓜氨酸化聚集蛋白聚糖所分泌的IL-10和TNF显著多于健康对照所分泌的IL-10和TNF(p<0.05)和响应瓜氨酸化聚集蛋白聚糖(p＝0.065)和瓜氨酸化纤维蛋白原(p＝0.08)的IL-17的分泌具有相似的倾向。鉴于缺失天然自身肽的稳定的HLA-DR结合，本发明人确定，针对瓜氨酸化肽的阳性应答大于平均值的阈值并且比针对相应天然肽(不可以评估瓜氨酸化波形蛋白应答，因为未测量针对天然波形蛋白的应答)的应答高2SD。当与SE⁺健康对照相比时，SE⁺RA患者的瓜氨酸化肽应答产生一组更加多样化的细胞因子。值得注意的是，当对具有针对每一瓜氨酸化肽的阳性应答的RA患者和健康对照的百分比作图时，针对所检测的表位，RA患者仅产生调节性细胞因子IL-10和FN-γ(图4)。

实施例2

RA患者中IL-6应答随着疾病持续时间而改变

为了更好地理解单个RA患者和SE⁺健康对照的瓜氨酸化肽应答模式，在研究中为每一个体绘制针对每一肽的IL-6剂量应答曲线。来自4/6健康对照的PBMC响应瓜氨酸化聚集蛋白聚糖以剂量依赖性方式分泌IL-6，并且3/6响应瓜氨酸化纤维蛋白原分泌IL-6。采用上面所述的相同的阳性应答的阈值，发现在17例RA患者的PBMC应答中，6例不响应表位而分泌IL-6，8例仅响应瓜氨酸化聚集蛋白聚糖，0例响应瓜氨酸化纤维蛋白原，0例仅响应瓜氨酸化II型胶原蛋白，且3例响应多重瓜氨酸化表位。因此。在RA患者和健康对照中，针对瓜氨酸化聚集蛋白聚糖的IL-6应答最高，且最频繁观察到，从而表明，这是所检测的最具有免疫原性的表位。在至少5年前诊断为患有RA的患者中，针对多重瓜氨酸化的IL-6应答发生地更频繁(图5B)。

实施例3

效应记忆CD4⁺T细胞响应瓜氨酸化肽分泌细胞因子

IL-6是RA中的重要细胞因子，其在T细胞或抗原呈递细胞刺激PMBC时产生。为了确定分泌到瓜氨酸化肽刺激的PBMC上清液中的细胞因子的来源，在细胞内细胞因子染色和细胞表面标记分析之前，将RA PBMC与瓜氨酸化肽或天然肽一起温育5天，并且最后18个小时添加Brefeldin-A。当与瓜氨酸化聚集蛋白聚糖或纤维蛋白原一起温育时，相对于仅在培养基中温育，CD3⁺CD4⁺T细胞产生更多的细胞内IFN-γ和IL-6(图6A、B)。荧光补偿对照(FMO)染色证明测定阳性染色的阈值的门控策略，如(Herzenberg等,2006.Nat Immunol 7(7):681-685)所述(图6C)。在通过CD4^-CD28^-细胞(其中的大多数表示抗原呈递细胞)进行的这些测定中，没有观察到细胞内细胞因子染色(图6D)。已经显示分化的或老化的CD45RO^-记忆细胞再表达CD45RA，并且特征是损失CD27和CD28(Weng等,2009.Trends Immunol 30(7):306-312)。在健康对照中，CD28^-细胞仅包含小比例的CD4⁺T细胞，并且分泌细胞因子的细胞无一例外地是CD4⁺CD28⁺。在一些而非所有RA患者中，在CD4⁺PB T细胞中，CD28^-细胞更丰富。如果存在CD4⁺CD28^-T细胞，则CD28^-和CD28⁺CD4⁺T细胞均响应瓜氨酸化肽而分泌IL-6和IFN-γ。在这些培养物中注意到高背景细胞因子分泌，正如本发明人在早期分析上清液时已经观察到的(图2A和6A)。IFN-γ⁺CD4⁺和IL-6⁺CD4⁺T细胞包括CD45RO⁺和CD45RO^-细胞(图6E)。CXCR5⁺滤泡辅助T细胞不响应瓜氨酸化肽而表达IL-6或IFN-γ。

实施例1-3的讨论

在本文中，本发明人已经证明，促炎细胞因子和调节性胞因子，包括IL-6、IFN-γ、IL-10以及TNF，在SE⁺RA患者中由CD4⁺T细胞响应瓜氨酸化自身表位而产生，其中，瓜氨酸化聚集蛋白聚糖是最具有免疫原性的。不考虑肽特异性T细胞增殖应答如何弱，均观察到这些细胞因子应答。SE⁺健康对照还响应瓜氨酸化聚集蛋白聚糖和瓜氨酸化纤维蛋白原而产生细胞因子。这类T细胞应答并非必然与RA有原因地相关–而是它们证明存在于SE⁺对象中的针对瓜氨酸化自身肽的自身反应性，即使在缺少ACPA的情况下。然而，针对瓜氨酸化自身表位的细胞因子应答在RA中比在健康对照个体中更多样化。实际上，仅RA患者响应这些表位而分泌调节性细胞因子IL-10和IFN-γ(Haringer等,2009.JExp Med 206(5):1009-1017)。通过PB和滑膜T细胞的IFN-γ产生被充分描述(Steiner等,1999.Rheumatology 38(3):202-213)，并且已经证明IFN调节的基因可预测患有关节痛的ACPA⁺患者的RA发展(van Baarsen等,2010.Arthritis&Rheumatism 62(3):694-704)。通过细胞内染色，本发明人证明，至少在肽刺激5天后检查时，在这些培养物中，由记忆CD4⁺T细胞而不是CD4^-抗原呈递细胞产生IL-6和IFN-γ。这些数据证明，CD4⁺T细胞能产生细胞因子，但是不排除CD4^-抗原呈递细胞如单核细胞、B细胞以及树突细胞在培养过程中也产生可能分泌到上清液中的这些细胞因子的可能性。IL-6应答以剂量依赖性方式增加响应瓜氨酸化肽。细胞内细胞因子染色证实宽的细胞因子应答谱，这与记忆CD4⁺T细胞表型一致。

各种机制可能促进RA中自身反应性T细胞针对自身抗原和破伤风类毒素抗原所表现出来的增值性应答。例如，许多研究暗示RA T细胞通过T细胞受体-CD3复合体的信号传导不足(Emery等,1984.Clin.Exp.Immunol.57:123-129；Seitz等,1988.Rheumatol.Int.8:189-196；Allen等,1995.Eur.J.Immunol.25:1547-1554；Thomas等,1992.ArthritisRheum.35:1455-1465；Berg等,2000.Arthritis Res.2:75-84；Maurice等,1997.J.Immunol.159:2973-2978；Berg等,2000.Clin.Exp.Immunol.120:174-182)。通过结合于调节性T细胞和效应记忆T细胞在激活后所表达的高亲和力CD25受体，IL-2可能被快速消耗。对于组织培养中的T细胞增殖而言，这可能限制了IL-2可用性(Wolf等,2001.Eur.J.Immunol.31:1637-1645；Ishimaru等,2006.Nat.Immunol.7:763-772)。而且，自身反应性T细胞受到调节性细胞和细胞因子的影响，如这些文献(Berg等,2001.Ann.Rheum.Dis.60:133-139；van Amelsfort等,2004.Arthritis Rheum.50:2775-2785)所证明的。另一方面，效应记忆细胞产生高水平的促炎和调节性细胞因子，并且细胞因子产生更有效地询问人和小鼠中的高度分化的自身反应性效应记忆T细胞(Garcia de Tena等,2006.J.Clin.Immunol.26:233-242；Nanki等,2000.Arthritis Res.2:415-423；Morita等,1998.Arthritis Rheum.41:1669-1676)。

促炎细胞因子IL-6刺激B细胞抗体产生，并且在RA发病机理中发挥关键作用(Assier等,2010.Joint Bone Spine 77:532-536)。在RA患者中，细胞内IL-6和IFN-γ由CD28⁺和CD28^-和CD45RO⁺以及CD45RO^-PB CD4⁺T细胞产生。与本研究中RA T细胞响应瓜氨酸化肽的增殖不佳但良好的细胞因子应答一致，之前已经证明，来自健康供体的CD4⁺CD45RB^dimCD27^-记忆T细胞响应促分裂原增殖不佳，但是产生大量IL-4和IL-10，并为免疫球蛋白产生提供有效的B细胞辅助(Tortorella等,1995.J.Immunol.155:149-162)。相比之下，典型的CXCR5⁺滤泡辅助T细胞——已经证明其在体内促进淋巴组织中的抗体产生(Chevalier等,2011.J Immunol 186:5556-5568)——并不响应瓜氨酸化肽表达细胞因子。有意思的是，如果CD28^-T细胞存在于RA患者的PB中，它们也响应瓜氨酸化肽产生细胞因子。CD28^-T细胞代表了滑膜环境中的重要的效应记忆扩增应答，并且已经证明其对调节性T细胞的阻抑更具抗性(Weng等,2009.Trends Immunol.30:306-312；Thewissen等,2007.J.Immunol 179:6514-6523)。本文所提供的数据一起支持这样的假设：与各种瓜氨酸化自身肽反应并具有B细胞潜力的效应记忆T细胞有助于在外周血中循环，并且存在于SE⁺个体的滑液中。

以前在RA患者中进行的研究分析了针对单瓜氨酸化肽特异性的PB CD4⁺T细胞应答。在RA患者中证明了针对瓜氨酸化聚集蛋白聚糖84-103的增值性和IL-17CD4⁺T细胞应答，但在健康对照中并未得到证明，这表明这种瓜氨酸化聚集蛋白聚糖表位的免疫原性(von Delwig等,2010.Arthritis Rheum 62(1):143-149)。未修饰的聚集蛋白聚糖表位在用聚集蛋白聚糖/蛋白聚糖免疫的BALB/c小鼠中是免疫显性的(Buzás等,2005.CellImmunol 235(2):98-108)。这种瓜氨酸化聚集蛋白聚糖肽在本研究中也是最具有免疫原性的表位–应答者的频率最高，并且IL-6应答的量级最高。然而，应当指出的是，Buzás的研究既未比较早期RA和长期的RA患者，也未研究针对除了聚集蛋白聚糖以外的任何其他抗原的宿主免疫应答。

在长期的RA患者中，本发明人还发现，存在响应瓜氨酸化纤维蛋白原-α79-91的大量(robust)细胞因子产生，瓜氨酸化纤维蛋白原-α79-91经证明是用瓜氨酸化人纤维蛋白原免疫的HLA-DR4-IE转基因小鼠中的免疫显性表位(Hill等,2008.J.Exp.Med.205:967-979)。在本研究中，用瓜氨酸化波形蛋白66-78表位进行刺激产生更弱的细胞因子应答，如Snir等(2011,同上)所观察到的，Snir等发现当与瓜氨酸化波形蛋白59-78而不是66-78一起温育时，HLA-DRB1*0401⁺RA患者T细胞产生许多细胞因子。在该研究中，IFN-γ和TNF由小比例的CD154⁺CD4⁺RA患者T细胞响应瓜氨酸化而不是天然波形蛋白59-78在细胞内表达。针对细胞内细胞因子染色的T细胞的比例，比本研究低得多，其中本发明人在抗原刺激后5天进行染色，且没有第二次再刺激。可能的是，在最初用肽培养5天后，用肽再刺激可能已经诱导了无反应性，或给出了它们的效应记忆表型(DiMitri等2011.“Reversible Senescence in Human CD4+CD45RA+CD27-Memory TCells.”J.Immunol)，很少的T细胞能在体外培养延长后再表达CD154。与本研究相似，Snir等(2011,同上)并未观察到强增值性或IL-17A应答，这与von Delwig等(2010,同上)不同。细胞因子分泌的差异可能与本研究中包括健康人血清或包括Hetero Block加自体血清有关(Todd等,2011.Arthritis&Rheumatism 63:894-903)。最后由于位于84-88的疏水性氨基酸，瓜氨酸化聚集蛋白聚糖肽在含水培养基中相对不可溶，这在不同的实验室中还可能影响抗原纯度、浓度以及细胞摄取。

在SE⁺RA患者中，无论ACPA⁺与否，以及在ACPA^-健康对照中，本发明人还观察到针对瓜氨酸化自身表位的T细胞细胞因子应答。还观察到HLA-DRB1*0401⁺健康对照T细胞响应瓜氨酸化波形蛋白59-78产生细胞因子(Snir等,2011,同上)。在用瓜氨酸化人纤维蛋白原免疫DR4-IE转基因小鼠后，与针对瓜氨酸化表位的应答同时，刺激针对未修饰的天然表位的应答。根据以前的和目前对针对未修饰的表位的HLA-DR结合和应答的分析，针对瓜氨酸化表位的应答看起来对SE⁺RA PB最具有特异性。相比之下，在健康对照中针对瓜氨酸化表位的应答的量级和多样性是预料不到的。在用天然人纤维蛋白原引发的DR4-IE转基因小鼠中，不存在针对瓜氨酸化纤维蛋白原的T细胞自身反应性(Hill等,2008,同上)。在幼稚或胁迫的DR4-IE-转基因小鼠中没有检测到针对瓜氨酸化的纤维蛋白原的自发的自身反应性。然而，已经证明，在SE⁺RA患者和HLA-DR4⁺健康对照中的CD4⁺T细胞具有减少的T细胞受体删除环、总的端粒缩短，并且复制能力降低，它们均暗示：T细胞向外周库(peripheral repertoire)的输入的HLA-DR SE相关性减少、幼稚T细胞向外周自身抗原的增值性驱动提高、以及TCR库的多样性有限(Fujii等,2009.Proc Natl Acad Sci U S A 106:4360-4365；Koetz等,2000.Proc Natl Acad Sci U S A97:9203-9208；等,2003.Proc Natl Acad Sci U S A 100:13471-13476)。目前和以前在人类中进行的研究均表明：HLA-DR SE⁺个体中的PB T细胞可能有针对自身抗原的自身反应性的倾向，所述自身抗原包括瓜氨酸化修饰的那些自身抗原，在胁迫或促炎环境(包括关节创伤或抽烟)中潜在地暴露的自身抗原(Klareskog等,2006.Arthritis Rheum.54:38-46；de Jong等,2010.Ann.Rheum.Dis.69:255-262)。此外，与T细胞自身反应性不同，针对瓜氨酸化表位的B细胞自身反应性的发展看起来是发展成RA的重要关卡。已经提出，患有牙周炎的患者中，例如牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)感染，可能是通过这种关卡发展的关键触发因子，这可能是由于与细菌抗原的交叉反应性、病原体相关分子式样的佐剂效应、可选的抗原呈递细胞的靶向或上述这些的组合(Wegner等,2010.Immunol.Rev.233:34-54)。赖氨酸残基氨甲酰化为高瓜氨酸，可能是增强RA自身抗原、包括瓜氨酸化抗原的免疫原性的另一因素(Mydel等,2010.J Immunol.184:6882-6890)。

本文中提供的数据表明，患有长期存在的疾病的RA患者更可能响应多重瓜氨酸化表位，而患有近期发作的RA的患者(包括以前未治疗的患者)更可能不响应抗原或仅仅响应瓜氨酸化聚集蛋白聚糖。这些数据还表明，当疾病发展时发生表位扩展。本文所研发的测定，其中在存在不同浓度的一组瓜氨酸化表位的情况下询问T细胞细胞因子产生，被提议为鉴别最具有免疫原性的肽表位和使特异性T细胞应答与相应的ACPA“精细特异性”相关的有用生物标记(Willemze等,2011.Arthritis Rheum.63:1823-1832)。有利的是，这些测定连同四聚体特异性T细胞分析一起进行。所考虑的应用包括比较来自前RA(pre-RA)一直到诊断的PBMC的系列样品(Deane等,2010.Arthritis Rheum.62:3161-3172)和分析来自抗原特异性或非特异性免疫疗法如阿巴西普(Abatacept)的临床试验的PBMC(Yue等,2010.Arthritis Rheum.62:2941-2952)。最后，提出分析特异性肽反应性有益于对患者进行分级并为个体化抗原特异性免疫疗法鉴别合适的表位。

材料和方法

患者

包括21例满足1987年美国风湿病学会(ACR)的RA标准的患者(Aletaha等,2010,同上)和6名不抽烟的ACPA^-SE⁺健康对照。所有个体都提供外周血(PB)样品，尽管在某些情况下，产量不足以进行所有测定。患者人口统计详情概述于表6中。在昆士兰健康病理学服务处(Queensland Health Pathology Services)进行HLA-DR基因分型。该研究获得亚历山大公主医院人类研究伦理委员会(Human Research Ethics Committee of the PrincessAlexandra Hospital)的许可，并从每一位患者获得知情同意书。

肽制剂

通过Auspep(NSW,澳大利亚)合成对应于波形蛋白、II型胶原蛋白、纤维蛋白原以及聚集蛋白聚糖的含有瓜氨酸或精氨酸的SE结合表位。过滤所有肽，在无菌水中重构成300μg/mL，并储存于-70℃。用培养基制备用于工作原液的最终稀释液。

PB单核细胞的纯化和抗原呈递测定

单核细胞(MC)利用Ficoll-Paque密度梯度(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,瑞典)分离自PB和SF，并用0.9％盐水洗涤，随后重悬浮于RPMI和来自健康或自体或异基因RA供体的10％的人血清。破伤风类毒素以4Lfi/mL(ChironVaccinese)的浓度使用。在存在含有10％人血清的RPMI情况下，将2x 10⁵PBMC或SFMC与0、3以及30μg/mL每一种肽在圆底孔中以200μL终体积一起温育5天。通过最后18小时添加1μCi/孔[³H]胸苷(ICN Biochemicals)，评估T细胞增殖。将细胞收获于玻璃纤维过滤垫上，并且通过液体闪烁光谱(Packard Topcount,PackardInstrument Co.)测定[³H]-胸苷掺入。利用BD流式微珠阵列(CBA)试剂盒(BDBioscience)，测量第5天的上清液中的IL-2、IL-4、IFNγ、IL-10、IL-6、IL-17以及TNF。最初的动力学实验证明，肽刺激5天最佳地诱导抗原特异性增值性应答和细胞因子应答，并且更久的培养物并不产生更大的应答。如果在细胞因子产生测定中使用RA血清，则在CBA测量过程中添加150μg/mL HeteroBlock(OmegaBiologicals)(Todd等,2011,同上)。在BD FACSArray^TM生物分析仪系统上读取样品。将增殖应答的刺激指数(SI)计算为响应肽的相对于背景的倍数增加。每一应答的净细胞因子分泌计算为[用肽刺激的浓度]减去[无肽刺激的浓度]。对于RA患者和健康对照而言，阳性应答阈值高于针对响应天然肽的细胞因子应答2SD。

流式细胞术和细胞内细胞因子染色

在存在或不存在浓度为3和30μg/mL的肽的情况下，将来自SE⁺RA患者或健康对照的PBMC温育5天，并在最后的18个小时添加Brefeldin A(Sigma Aldrich)。对细胞进行CD3-FITC、CD4-APC/Cy7、CD28-FITC、CXCR5-PerCP/Cy5.5以及CD45RO-PerCP/Cy5.5(Biolegend)染色，随后进行透化和细胞内IL-6-APC和IFN-γPC(Biolegend)染色。在Gallios流式细胞仪上收集数据，并利用Kaluza软件(Beckman Coulter)进行分析。

统计分析

单因素非参数ANOVA(One-way non-parametric ANOVA)和后验校正(post-hoc correction)比较多重平均值(means)。不配对曼-惠特尼检验(UnpairedMann Whitney test)比较RA患者和健康对照之间的破伤风类毒素增殖应答，以及针对瓜氨酸化肽相比天然肽的特异性细胞因子应答。显著性表示为*P<0.05、**P<0.005以及**P<0.001。所有误差条都表示SEM。

实施例4

用NF-KB、MTOR或SYK抑制剂抑制来自RA患者的APC阻抑它们响应瓜氨酸化聚集蛋白聚糖肽诱导T细胞细胞因子产生的能力

外周血单核细胞(PBMC)提取自疾病持续18年的RA患者，其是阳性抗CCP和HLA-DRB1*0401共同的表位。利用免疫磁珠分离自体CD4+T细胞。非T细胞部分由抗原呈递细胞(APC)构成，所述抗原呈递细胞包括树突细胞、单核细胞以及B细胞；将其用丝裂霉素C处理，以防止增殖。在具有或不具有3uM BAY7011-82、20μg/mL姜黄色素(两者都抑制NF-kB)、10ng/mL雷帕霉素(抑制mTOR)或40μM白皮杉醇(抑制syk)的情况下，预温育APC，然后与100ng/mL LPS一起温育1h。将APC洗涤3次，随后在存在0μg/mL、3μg/mL或30μg/mL聚集蛋白聚糖肽84-103cit 93的情况下，与CD4+T细胞一起温育5天。利用细胞因子珠阵列，分析培养物上清液中的细胞因子。数据显示，响应3或30μg/mL肽，产生净(肽减去无肽的孔)IL-6和TNF。

图7提供的结果显示，预温育APC与Bay11-7082部分地抑制而其他抑制剂完全地抑制APC呈递cit-肽以诱导T细胞IL-6产生的能力。所有抑制剂都完全抑制APC呈递cit-肽以诱导T细胞TNF产生的能力。

实施例5

RA患者中，针对瓜氨酸化聚集蛋白聚糖G1表位的细胞因子应答

将来自与实施例4所述相同RA患者的PBMC与天然或瓜氨酸形式的351氨基酸人聚集蛋白聚糖G1表位(在小鼠中，含有显性和次显性表位)以1μg/mL一起温育5天，然后测量上清液中的IL-6。图8所示的净IL-6(抗原减去无抗原的孔)产量清楚地显示：与相应非瓜氨酸化表位相比，针对瓜氨酸化G1表位的IL-6应答明显更高。

实施例6

CIT聚集蛋白聚糖特异性T细胞存在于类风湿性关节炎患者的外周血中

在存在达沙替尼(dasatinib)的情况下，用CLIP、流感血凝素(HA)、聚集蛋白聚糖89-103cit 93、95或波形蛋白59-71cit 64,69,71DRB1*0401四聚体对来自2HLA-DRB1*0401⁺ACPA⁺RA患者的PBMC进行染色。利用免疫磁珠，在活细胞，CD4⁺细胞，富集四聚体的CD4⁺细胞上，对图进行门控(gated)。在图9中，显示针对每一图的富集的PBMC的％四聚体。这些结果清楚地表明，瓜氨酸化聚集蛋白聚糖特异性T细胞存在于类风湿性关节炎患者的外周血中。

实施例7

外周血中CIT-聚集蛋白聚糖特异性T细胞的数量和荧光强度

与实施例6中一样，同时包括荧光计数珠，对来自6例RA患者和3名健康对照的PBMC进行染色，然后计算每mL血液的四聚体+T细胞数量。四聚体染色的平均荧光强度(MFI)是HLA-DR分子呈递的抗原的T细胞受体亲和性的指示物。Cit-聚集蛋白聚糖特异性T细胞在这种基因型的RA患者和健康对照中循环。图10呈现的结果表示，相对于健康对照的平均值，cit-聚集蛋白聚糖特异性T细胞的数量在一部分RA患者中更高，并且在一些RA患者中，这些Ag特异性T细胞具有更高的cit-聚集蛋白聚糖亲和性。

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Claims (43)

1.治疗或预防对象的关节损伤的方法，所述方法包括以下步骤，或由以下步骤组成或基本组成：在所述对象中引起针对聚集蛋白聚糖多肽的抗原特异性耐受原应答，由此治疗或预防所述关节损伤。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述聚集蛋白聚糖多肽是瓜氨酸化聚集蛋白聚糖多肽。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述对象患有早期RA或初期RA。

4.如权利要求3所述的方法，还包在引起所述抗原特异性耐受原应答之前，鉴别所述对象患有早期RA或初期RA。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述对象对共同的表位(SE)是阳性的。

6.如权利要求5所述的方法，还包括在引起所述抗原特异性耐受原应答之前，鉴别所述对象对SE是阳性的。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述对象具有针对所述聚集蛋白聚糖多肽的免疫应答，或处于发展所述免疫应答的风险。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述免疫应答包括效应T淋巴细胞应答。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述免疫应答包括产生至少一种选自以下的细胞因子：白介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)以及白介素-10(IL-10)。

10.如权利要求7所述的方法，其中所述免疫应答包括促炎T淋巴细胞应答，其包括、仅包括或基本包括产生至少一种选自IL-6、IFN-γ以及TNF的细胞因子。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述促炎T淋巴细胞应答包括、仅包括或基本包括产生IL-6。

12.如权利要求7所述的方法，其中所述免疫应答至少部分地由CD4⁺淋巴细胞产生。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述抗原特异性耐受原应答通过以下方式实现：

(1)增加所述对象中耐受原抗原呈递细胞(agg-tolAPC)的数量，所述细胞呈递对应于所述聚集蛋白聚糖多肽一部分的肽，其中所述部分与针对所述聚集蛋白聚糖多肽的促炎或自身反应性T淋巴细胞应答有关；

(2)诱导所述对象的促炎或自身反应性T淋巴细胞的无反应性或凋亡，所述细胞对所述聚集蛋白聚糖多肽是反应性的；以及

(3)增加所述对象的调节性或抑制性T淋巴细胞的数量，所述细胞阻抑或以另外方式减少针对所述聚集蛋白聚糖多肽的促炎或自身反应性T淋巴细胞应答。

14.如权利要求13所述的方法，包括、仅包括或基本包括增加所述对象的agg-tolAPC的数量，由此治疗或预防所述关节损伤。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述agg-tolAPC刺激阻抑或以另外方式减少针对所述聚集蛋白聚糖多肽的促炎或自身反应性T淋巴细胞应答的调节性或抑制性T淋巴细胞的产生。

16.如权利要求14或15所述的方法，其中通过使所述对象的抗原呈递细胞与抗原性分子接触以及与以下接触而产生所述agg-tolAPC：(1)NF-κB抑制剂，其量足以抑制所述抗原呈递细胞中的NF-κB活性，和/或(2)mTOR抑制剂，其量足以抑制所述抗原呈递细胞中的mTOR活性，和/或(3)Syk抑制剂，其量足以抑制所述抗原呈递细胞中的Syk活性，所述抗原性分子选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽的抗原或可表达所述抗原的核酸分子，其量足以使抗原呈递细胞在其表面呈递所述抗原或其加工形式。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述抗原包含对应于全长聚集蛋白聚糖多肽的氨基酸序列。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述抗原包含对应于成熟聚集蛋白聚糖多肽的氨基酸序列。

19.如权利要求16所述的方法，其中所述抗原包含对应于选自G1结构域、G2结构域或G3结构域的聚集蛋白聚糖多肽的结构域的氨基酸序列。

20.如权利要求16所述的方法，其中所述抗原包含对应于聚集蛋白聚糖多肽的T细胞表位的氨基酸序列。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:5-35任意之一，包括其瓜氨酸化形式。

22.如权利要求20所述的方法，其中所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:32-35中的任一个。

23.如权利要求16所述的方法，其中所述抗原是HLA DR限制性的，并且所述对象对HLA DR等位基因是阳性的。

24.如权利要求16所述的方法，其中所述抗原采用一种或多种肽的形式，所述肽全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽，包括其瓜氨酸化形式。

25.如权利要求16所述的方法，其中所述抗原采用多个连续重叠肽的形式，所述重叠肽的序列跨越聚集蛋白聚糖多肽，包括其瓜氨酸化形式的至少一部分。

26.如权利要求16所述的方法，其中所述重叠肽包括选自SEQ ID NO:49-531的氨基酸序列，包括其瓜氨酸化形式，或由选自SEQ ID NO:49-531的氨基酸序列，包括其瓜氨酸化形式组成或基本组成。

27.如权利要求16所述的方法，其中所述抑制剂是NF-κB抑制剂(例如选自表2、3A、3B或4所列抑制剂中的任一种的NF-κB抑制剂)。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂是姜黄色素或姜黄色素衍生物。

29.如权利要求16所述的方法，其中以可溶形式共施用所述抑制剂和所述抗原性分子。

30.如权利要求16所述的方法，其中以颗粒的形式共施用所述抑制剂和所述抗原性分子。

31.如权利要求30所述的方法，其中在同一颗粒中共施用所述抑制剂和所述抗原性分子。

32.如权利要求30所述的方法，其中所述颗粒是聚合物颗粒。

33.如权利要求30所述的方法，其中所述颗粒是脂质体。

34.如权利要求13所述的方法，其中通过在B淋巴细胞中表达编码全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽的抗原的核酸分子产生所述agg-tolAPC，其中所述核酸分子的表达导致所述抗原或其加工形式呈递于所述B淋巴细胞的表面上。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述核酸分子还编码直接或间接融合于所述抗原的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。

36.如权利要求13所述的方法，包括向所述对象施用调节性或抑制性T淋巴细胞，所述调节性或抑制性T淋巴细胞阻抑或以另外方式减少针对所述聚集蛋白聚糖多肽的促炎或自身反应性T淋巴细胞应答。

37.如权利要求1所述的方法，包括向所述对象施用MHC-肽复合体，所述复合体由全部或部分对应于所述聚集蛋白聚糖多肽的抗原和具有抗原结合位点的分离的MHC组分基本上组成，其中所述抗原与所述抗原结合位点结合。

38.如权利要求1所述的方法，包括向所述对象施用包含免疫调节肽和免疫或T细胞结合配体(I/TCBL)的嵌合构建体，其中所述免疫调节肽包括、仅包括或基本包括对应于聚集蛋白聚糖多肽的一部分的氨基酸序列，并且，其结合促炎或自身反应性T淋巴细胞上的抗原受体，并且其中所述I/TCBL结合一类或一亚类选自辅助T细胞、抑制性T细胞以及细胞毒性T细胞的T细胞并调节T细胞活性。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述I/TCBL至少包含选自以下的分子的一部分：MHC I类分子、MHC II类分子、辅助分子如β2-微球蛋白、淋巴细胞功能相关分子-3(LFA-3)、免疫球蛋白分子重链Fc区、Ia+分子、CD2抗体、CD3抗体、CD4抗体、CD8抗体、凝集素抗体、淋巴因子。

40.组合物，包含剂或剂的组合，或由剂或剂的组合组成或基本组成，其中所述剂引起针对聚集蛋白聚糖多肽的抗原特异性耐受原应答。

41.如权利要求40所述的组合物，其中所述剂或剂的组合选自：(1)NF-κB途径抑制剂和选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽的抗原或可表达所述抗原的核酸分子的抗原性分子；(2)mTOR抑制剂和选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽的抗原或可表达所述抗原的核酸分子的抗原性分子；(3)Syk途径抑制剂和选自全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽的抗原或可表达所述抗原的核酸分子的抗原性分子；(4)用于引入到B淋巴细胞中的编码抗原的核酸分子，所述抗原全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽；(5)MHC-肽复合体，由全部或部分对应于聚集蛋白聚糖多肽的抗原和具有抗原结合位点的分离的MHC组分基本上组成，其中所述抗原与所述抗原结合位点结合；(6)本文定义的嵌合构建体；(7)聚集蛋白聚糖特异性耐受原抗原呈递细胞；或(8)APL，其包括对应于聚集蛋白聚糖多肽的一部分的氨基酸序列，或由对应于聚集蛋白聚糖多肽的一部分的氨基酸序列组成或基本组成。

42.权利要求40或41所述的引起针对聚集蛋白聚糖多肽的抗原特异性耐受原应答的剂或剂的组合，用于治疗或预防关节损伤。

43.权利要求40或41所述的引起针对聚集蛋白聚糖多肽的抗原特异性耐受原应答的剂或剂的组合在制备用于治疗或预防关节损伤的药物中的用途。