CN112675299B - 一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法，属于兽用生物制品技术领域。本发明公开的一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法，包括病毒增殖与病毒液灭活、制备灭活疫苗。本发明制备的新型鹅星状病毒灭活疫苗，疫苗接种后，没有出现任何局部和全身的不良反应，并且各项指标检测均稳定有效；利用本发明研制的灭活疫苗对雏鹅进行免疫后，雏鹅可以快速获得免疫保护，有效降低雏鹅感染致死率，为鹅群提供高效的免疫护航。

Description

一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，更具体的说是涉及一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法。

背景技术

2017年以来，黑龙江、辽宁以及中东部地区4-25日龄雏鹅群爆发了一种严重的传染性疾病，其特征为痛风，临床表现为精神沉郁甚至死亡，该病主要发生于5-20日龄的雏鹅，死亡率最高可达50％。患病雏鹅体腔及关节发生严重尿酸盐沉积，卧地倦动，采食困难，造成雏鹅生长缓慢，料肉比升高，肉鹅出栏合格率显著降低，对肉鹅养殖业造成严重经济损失。

经研究发现，该病的爆发是由鹅星状病毒感染所致，目前尚无疫苗可以预防，常规的抗病毒和抗菌治疗方法无效。相对于弱毒疫苗的开发，灭活疫苗具有更高的安全性。但是传统灭活疫苗保护性抗体产生需要2-3周，周期较长，而雏鹅痛风主要发生在20日龄以内，尤其是10日龄左右，疫苗未产生有效保护，鹅群已经发病，不能满足雏鹅的免疫需求。

因此，提供一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法，该疫苗能够使雏鹅快速产生抗体，缩短免疫空白期，预防雏鹅星状病毒引起的鹅痛风，从而减少该疾病造成的经济损失。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：

(1)将黄芪甲苷、CPG核酸、维生素A、维生素E按比例添加到灭活鹅星状病毒液中，添加吐温-80，摇匀后添加25％w/v蜂胶乙醇溶液，摇匀，获得水相；每毫升水相中包含黄芪甲苷100μg-200μg，CPG核酸10μg-1mg，维生素A10mg-30mg，维生素E10mg-30mg；所述水相中Tween-80的占比为4％-6％；所述水相中25％w/v蜂胶乙醇溶液的占比为5％-20％；

(2)将白油、硬脂酸铝和司本-80按96：1：4的比例混合，获得油相；

(3)将步骤(1)获得的水相和步骤(2)获得的油相按1：1-1.5混匀乳化，获得鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗。

CpG核酸是含非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(OligodeoxynucleotidescontainingCpG motifs)，未甲基化的CpG ODN被机体通过TLR9(Toll-like receptor 9)识别后，通过一系列信号级联转导，触发机体防御机制，引起明显及多样化的免疫反应，包括血循环系统中的补体激活、通过分泌产生IL-12、TNF-α、IFN-α/β和IFN-γ等细胞因子，调控Th1/Th2免疫应答；间接活化NK细胞和T细胞，增强细胞因子的分泌，增强疫苗特异性的体液免疫和细胞免疫反应；活化DC、巨噬细胞和B细胞，继而提升机体的免疫应答。作为TLR9激动剂，机体对其刺激产生的促细胞免疫和体液免疫应答让其成为应用于多种预防性或治疗性疫苗的新型佐剂。

黄芪甲苷为中药黄芪的主要活性成分之一，国内外对其药理作用机制以及安全性等进行了一些研究。由于黄芪甲苷具有保护心血管、促进神经干细胞增殖、增强机体免疫功能、抗炎、抗衰老等多方面的生物学功能；在体内和体外均可增加T/B淋巴细胞的增殖与抗体的产生，并且效果优于黄芪多糖。因此可以作为免疫佐剂使用，不但可以提高细胞以及体液免疫，也可以提高机体抗病毒能力。

维生素A是一类含有视黄醇生物活性的化合物的总称，具有维持正常视觉、促进上皮组织增殖分化和促进儿童生长发育等功能。其参与人体免疫系统成熟的全过程，能够改善细胞膜的稳定性，维持黏膜屏障的完整性，是免疫力第一道防线的“守护神”。

维生素A可参与糖蛋白的合成，这对于上皮的正常形成、发育与维持十分重要。当维生素A不足或缺乏时，可导致糖蛋白合成中间体的异常，低分子量的多糖—脂的堆积，引起上皮基底层增生变厚，细胞分裂加快、张力原纤维合成增多，表面层发生细胞变扁、不规则、干燥等变化。鼻、咽、喉和其他呼吸道、胃肠和泌尿生殖系内膜角质化，削弱了防止细菌侵袭的天然屏障(结构)，而易于感染。免疫球蛋白是一种糖蛋白，所以维生素A能促进该蛋白的合成，对于机体免疫功能有重要影响，缺乏时，细胞免疫呈现下降。

维生素E能保护细胞和细胞内部结构完整，防止某些酶和细胞内部成分遭到破坏。此外，它还能增强黄体激素的分泌，促使受精作用的完成，这也是它生育酚得名的由来。维生素E(生育酚)是细胞组织中重要的脂溶性抗氧化剂，是机体对抗脂质过氧化的防线，从而保护细胞膜免受自由基的破坏，对维持免疫细胞的正常功能具有重要意义。

维生素E是动物体内重要的抗氧化剂，其主要的作用是保护细胞膜和亚细胞膜免受氧化损坏，有报道称在饲料中补充高于正常需求量的维生素E后，抗体滴度可以增加2-3倍，因此维生素E在免疫系统中的作用愈来愈受到重视。

维生素E是血清和组织中的脂溶性链式阻断抗氧化剂，其作用是清除过氧自由基，维生素E与来源于细胞膜磷脂或脂蛋白中不饱和脂肪酸产生的过氧化自由基发生反应，形成稳定的脂质脱氧过氧化物，通过这种生化反应，维生素E显著降低了有危害的脂质自由基的数量，从而保护率组织免收自由基的损害，维生素E这种抗脂质氧化能力可能是其加强免疫功能的一种机制。

蜂胶是一种具有广谱生物学活性的天然物质，包含树脂类化合物、多酚类化合物和多糖类化合物等，是一种天然的免疫增强剂。应用蜂胶或配合抗原引入机体，既能引起特异性免疫应答，又能启动非特异性防御机制，能刺激免疫系统增加抗体产量，增强补体活性和吞噬细胞的能力。蜂胶可以显著提高CD4+T细胞、CD8+T细胞数量和血清中IL-4含量。鉴于蜂胶佐剂无副作用，免疫效力高，禽霍乱蜂胶疫苗在我国已试用推广到全国30多个省市区。沈志强等用蜂胶作为佐剂研制新城疫-减蛋综合征蜂胶二联灭活疫苗，结果表明，免疫后5天，新城疫和减蛋综合征抗体效价都增强了，较传统油苗提前了10天。蜂胶可以吸附病毒粒子，并相互交联形成类免疫刺激复合物的作用，具有抗原贮存、缓释以及免疫刺激的作用，同时蜂胶颗粒与病毒颗粒保持完整的形态结构，有利于发挥各自的功效和协同作用。

进一步，步骤(1)所述灭活鹅星状病毒液的制备方法如下：将分离鉴定后的鹅星状病毒按1％比例接种到鹅胚肝细胞中，增殖培养48-72h，待细胞病变超过80％，将细胞反复冻融(冻融的次数为2次，冷冻温度为20度以下)，收取细胞液，离心除去细胞碎片，得到上清液；取上清液加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃灭活24h。

本发明所述的鹅星状病毒为从患有痛风症状的鹅肝脏中分离到的，经过病毒的鉴定纯化，形成鹅星状病毒的种子批，通过10代以上细胞传代适应，作为疫苗毒株使用。

进一步，步骤(1)所述25％w/v蜂胶乙醇溶液的制备方法如下：取蜂胶按25％w/v溶解到无水乙醇中，完全溶解后过滤除杂，得到25％w/v蜂胶乙醇溶液。

进一步，步骤(3)所述混匀方法为：将水相加入到油相中，2000rpm混合15min；乳化方法为：3000r/min乳化30min。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法，本发明利用鹅胚肝细胞增殖鹅星状病毒，细胞容易制备，易于放大生产，并且通过细胞适应后，病毒含量较高，能够满足制苗需求，具有很好的市场前景；通过离心、灭活、乳化，可以得到一种安全的、有效的、可控的灭活疫苗，有利于防控当前爆发的以痛风为主要特征的新型鹅星状病毒感染。

本发明制备的新型鹅星状病毒灭活疫苗，疫苗接种后，没有出现任何局部和全身的不良反应，并且各项指标检测均稳定有效；利用本发明研制的灭活疫苗对雏鹅进行免疫后，雏鹅可以快速获得免疫保护，有效降低雏鹅感染致死率，为鹅群提供高效的免疫护航。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所用CPG核酸为已公布的核酸序列：AACGTTAACGTT(SEQ ID NO.1)，由北京擎科生物科技有限公司合成。

实施例1

一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：

(1)病毒增殖与病毒液灭活

将分离鉴定后的鹅星状病毒按1％比例接种到生长良好的鹅胚肝细胞中，增殖培养48-72h，待细胞病变超过80％，将细胞在-20℃反复冻融两次，收取细胞液，离心除去细胞碎片，得到上清液；无菌检验为无菌生长，病毒含量达到每0.1ml病毒液10^4.5TCID50；加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃灭活24h，得灭活鹅星状病毒液；

(2)制备灭活疫苗

①每毫升水相中包含黄芪甲苷100μg，CPG核酸10μg，维生素A10mg，维生素E10mg；

②将黄芪甲苷、CPG核酸、维生素A、维生素E按上述比例要求添加到灭活鹅星状病毒液中，然后添加吐温-80，占水相比例为4％，摇匀；然后按占水相5％比例添加25％w/v蜂胶乙醇溶液摇匀，2～8℃放置3天，取样做无菌检验，合格后即可作为水相备用；其中25％w/v蜂胶乙醇溶液制备方法如下：取蜂胶按25％w/v溶解到无水乙醇中，待完全溶解过滤除杂即得；

③油相由白油、硬脂酸铝和司本-80按96：1：4的比例制备而成，将水相按1:1加入到油相中，2000rpm混合15min；3000r/min乳化30min，得鹅星状病毒灭活疫苗。

实施例2

一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：

(1)病毒增殖与病毒液灭活

同实施例1

(2)制备灭活疫苗

①每毫升水相中包含黄芪甲苷150μg，CPG核酸100μg，维生素A 20mg，维生素E20mg；

②将黄芪甲苷、CPG核酸、维生素A、维生素E按上述比例要求添加到灭活鹅星状病毒液中，然后添加吐温-80，占水相比例为5％，摇匀；然后按占水相15％比例添加25％w/v蜂胶乙醇溶液摇匀，2～8℃放置3天，取样做无菌检验，合格后即可作为水相备用；其中25％w/v蜂胶乙醇溶液制备方法如下：取蜂胶按25％w/v溶解到无水乙醇中，待完全溶解过滤除杂即得；

③油相由白油、硬脂酸铝和司本-80按96：1：4的比例制备而成，将水相按水油比1:1.5加入到油相中，2000rpm混合15min；3000r/min乳化30min，得鹅星状病毒灭活疫苗。

实施例3

一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：

(1)病毒增殖与病毒液灭活

同实施例1

(2)制备灭活疫苗

①每毫升水相中包含黄芪甲苷200μg，CPG核酸1mg，维生素A 30mg，维生素E 30mg；

②将黄芪甲苷、CPG核酸、维生素A、维生素E按上述比例要求添加到灭活鹅星状病毒液中，然后添加吐温-80，占水相比例为6％，摇匀；然后按占水相20％比例添加25％w/v蜂胶乙醇溶液摇匀，2～8℃放置3天，取样做无菌检验，合格后即可作为水相备用；其中25％w/v蜂胶乙醇溶液制备方法如下：取蜂胶按25％w/v溶解到无水乙醇中，待完全溶解过滤除杂即得；

③油相由白油、硬脂酸铝和司本-80按96：1：4的比例制备而成，将水相按1:1.5加入到油相中，2000rpm混合15min；3000r/min乳化30min，得鹅星状病毒灭活疫苗。

对比例

常规佐剂疫苗制备方法，具体步骤如下：

①油相的准备：取注射用白油、硬脂酸铝、司本-80(Span-80)按94:2:6混合，搅拌均匀后，高温高压灭菌；

②水相的准备：将灭活的鹅星状病毒液加入吐温-80(Tween-80)，震荡混匀，使Tween-80彻底溶解，水相中Tween-80的终浓度为4％；

③乳化：油相和水相按2:1的比例混合，在超净台内将2份油相加入组织匀浆机，缓缓地将1份水相，期间不断搅拌，水相全部加入3000r/min乳化15min，分装备用，即制备得到灭活疫苗。

试验例1灭活疫苗的质量检验

将实施例1-3和对比例制备的灭活疫苗进行包括外观性状、离心稳定性、粘度、无菌检测，具体方法参考《中华人民共和国兽药典》(2015版)。结果见表1。

表1

表1结果表明，本发明实施例1-3制备的复合佐剂灭活疫苗的离心稳定性、粘度和无菌检查符合《中华人民共和国兽药典》(2015版)的规定，粘度较常规疫苗低，利于吸收与注射，优势明显。同时安全试验也证明疫苗的吸收要优于常规疫苗。

试验例2灭活疫苗的安全性检验

取2日龄雏鹅40只，随机均分为4组，每组10只。其中第1-3组为实验组，颈部皮下分别注射实施例1-3中制备的灭活疫苗，0.5mL/只，第4组为对照组，颈部皮下注射等量灭菌白油佐剂，接种后每日观察每组动物的精神状态，以及注射部位是否出现红肿热痛等局部炎症反应，持续观查2周，2周后对实验动物进行解剖，观察注射部位疫苗吸收情况。

结果：实验组出现短暂的精神沉郁，但很快恢复，持续观察2周，实验组和对照组生长发育均正常，精神状态良好，剖检实验组发现注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。结果证明试制疫苗安全无害，对动物生长无影响。

试验例3灭活疫苗的保护性检验

取1日龄雏鹅50只，随机均分为5组，每组10只。其中第1-4组为免疫组，颈部皮下注射实施例1-3和对比例中制备的灭活疫苗，0.3mL/只，第5组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂，在免疫后10日，对两组雏鹅腿部注射0.2mL新型鹅星状病毒液，并分组隔离饲养，观察两组雏鹅的精神状况和死亡情况。

结果发现，注射实施例1-3灭活疫苗的第1-3组均未出现死亡，且均未出现临床症状；注射对比例常规疫苗的第4组死亡1只，且有2只出现痛风症状；第5组注射白油佐剂的对照组，雏鹅在攻毒后出现明显的临床症状(痛风)，死亡只数为6只。结果显示，本发明实施例1-3制备的灭活疫苗的免疫保护率能达到100％，保护率高于常规疫苗。同时可以较快产生抗体，阻断病毒的传播。

试验例4灭活疫苗的免疫持续期测定

取1日龄雏鹅50只，随机均分为5组，每组10只。其中第1-4组为免疫组，颈部皮下注射实施例1-3和对比例中制备的灭活疫苗，0.3mL/只，第5组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂；免疫后每隔3天采集血清采用中和抗体方法检测，结果见表2。

表2

表2结果表明，本发明佐剂疫苗组的抗体水平在第6天的时候开始显著升高，第18天达到高峰，此后10天内仍维持较高水平；而常规佐剂疫苗组的抗体水平在第9天开始显著升高，相比本发明疫苗组较低，尤其是在免疫前期，抗体水平不足以阻断病毒的繁殖传播。由于鹅星状病毒主要发病日龄为5-20日龄，免疫空白期短，方能有效阻断病毒的繁殖与传播，降低雏鹅死亡率；本发明疫苗在免疫后6-9天即可产生保护性抗体，说明本发明的灭活疫苗能够在短时间内快速达到高浓度的抗体水平，且免疫持续期长，能够为雏鹅提供快速、长期的免疫保护。

试验例5鹅胚肝细胞与鹅胚肾细胞增殖鹅星状病毒对比试验

取15-17日龄鹅胚，分别挑取鹅胚肝脏与鹅胚肾脏，用PBS漂洗后，剪碎，添加0.5％胰酶溶液进行消化处理，大约5min，除去胰酶，添加营养液，然后用刻度吸管进行吹打，待80％以上细胞分散后停止吹打，取样计数，根据计数结果，添加营养液调整细胞密度，使每ml细胞液中细胞量为50万个，然后放于二氧化碳细胞培养箱中培养，对比细胞长满所需时间以及细胞量；待细胞铺满方瓶后，按同比例接种星状病毒，记录细胞病变时间，待细胞80％以上发生病变后收取病毒液，对比病毒含量。

通过以上实验，结果显示1枚鹅胚可以产出鹅胚肝细胞的量为6×10⁷个，而产出鹅肾细胞的量为1.4×10⁷个；不同细胞长满均需要48h，生长速率差别不大；鹅胚肝细胞的病毒含量为10^4.5TCID50/0.1ml；鹅胚肾细胞的病毒含量为10^4.8TCID50/0.1ml。

综合来看，鹅胚肝细胞的产量是鹅胚肾细胞的4倍以上，效价差异并不大，并且鹅胚肝细胞所产病毒液即可满足标准要求，因此选择鹅胚肝细胞进行鹅星状病毒液的生产将会大大降低生产成本，有利于放大生产。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 黑龙江省百洲生物工程有限公司

<120> 一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

aacgttaacg tt 12

Claims (4)

1.一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将黄芪甲苷、CPG核酸、维生素A、维生素E按比例添加到灭活鹅星状病毒液中，添加吐温-80，摇匀后添加25％w/v蜂胶乙醇溶液，摇匀，获得水相；每毫升水相中包含黄芪甲苷100μg-200μg，CPG核酸10μg-1mg，维生素A10mg-30mg，维生素E10mg-30mg；所述水相中Tween-80的占比为4％-6％；所述水相中25％w/v蜂胶乙醇溶液的占比为5％-20％；

(2)将白油、硬脂酸铝和司本-80按96：1：4的比例混合，获得油相；

(3)将步骤(1)获得的水相和步骤(2)获得的油相按1：1-1.5混匀乳化，获得鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述灭活鹅星状病毒液的制备方法如下：将分离鉴定后的鹅星状病毒按1％比例接种到鹅胚肝细胞中，增殖培养48-72h，待细胞病变超过80％，将细胞反复冻融，收取细胞液，离心除去细胞碎片，得到上清液；取上清液加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃灭活24h。

3.根据权利要求1所述的一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述25％w/v蜂胶乙醇溶液的制备方法如下：取蜂胶按25％w/v溶解到无水乙醇中，完全溶解后过滤除杂，得到25％w/v蜂胶乙醇溶液。

4.根据权利要求1所述的一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述混匀方法为：将水相加入到油相中，2000rpm混合15min；乳化方法为：3000r/min乳化30min。