MX2013004753A - Peptidos del factor viii (fviii) para la induccion de tolerancia inmune y para inmunodiagnostico. - Google Patents

Peptidos del factor viii (fviii) para la induccion de tolerancia inmune y para inmunodiagnostico.

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Abstract

Se describen péptidos que pueden usarse para reducir la respuesta inmune al FVIII o para inducir tolerancia al FVIII humano en pacientes afectados, por ejemplo, por hemofilia A. Los péptidos también pueden usarse con fines de inmunodiagnostico, para detectar células T CD4+ con especificidad por el FVIII y monitorear los pacientes con hemofilia A durante las terapias de remplazo y durante las terapias de inducción de tolerancia inmune.

Description

PEPTIDOS DEL FACTOR VIII (FVIII) PARA LA INDUCCION DE TOLERANCIA INMUNE Y PARA INMUNODIAGNOSTICO ANTECEDENTES DE LA INVENCION El Factor VIII (FVIII) es una proteína presente en el plasma sanguíneo que actúa como un cofactor en la cascada de reacciones que conduce a la coagulación de la sangre. La hemofilia A es causada por una reducción o deficiencia de una proteína FVIII funcional y es uno de los trastornos de sangrado más comunes, que afecta aproximadamente a 1 de cada 5000-10000 hombres. Los síntomas clínicos de la hemofilia son sangrados frecuentes de músculos y articulaciones, y un traumatismo hasta puede conducir a situaciones amenazantes para la vida. Actualmente, los tratamientos efectivos de la hemofilia incluyen reemplazar la proteína FVIII que falta usando la aplicación intravenosa de productos de FVIII recombinantes o derivados de plasma. Las preparaciones generalmente se administran ya sea como respuesta a un episodio de sangrado (terapia según demanda) o a intervalos frecuentes, regulares, para prevenir un sangrado descontrolado (profilaxis) . Desafortunadamente, la aparición de anticuerpos anti-FVIII neutralizantes (inhibidores de FVIII) constituye una gran complicación durante una terapia de reemplazo con productos de FVIII. Aproximadamente un 25% REF: 240730 de los pacientes que reciben tratamiento desarrollan esta inmunidad contra la proteina FVIII, dificultando aún más el control de los trastornos de sangrado.
La causa de esta respuesta inmune a la proteina FVIII no ha sido elucidada por completo, pero la situación especifica del sistema inmune del paciente puede afectar su respuesta a la terapia. Normalmente, el sistema inmune desarrolla tolerancia a determinados antigenos, por ejemplo, "auto" antigenos. Esta característica es importante porque, de lo contrario, si un autoantígeno es reconocido como un antígeno extraño, se desarrollará una enfermedad autoinmune. En particular, los pacientes con hemofilia A tienen un defecto genético en su gen FVIII, lo que provoca que el sistema inmune no reconozca a la proteína FVIII administrada como un "auto" antígeno. Por consiguiente, cuando se administra una proteína FVIII durante una terapia de reemplazo con factores de coagulación, el sistema inmune del paciente reconoce a la proteína FVIII como un antígeno extraño o como una autoproteína alterada y en consecuencia desarrolla anticuerpos anti-FVIII.
Los inhibidores de FVIII, es decir, los anticuerpos anti-FVIII, son producidos por células plasmáticas derivadas de células B específicas de FVIII. Las células B necesitan de la ayuda de células T CD4+ activadas para poder proliferar y diferenciarse en células plasmáticas productoras de anticuerpos anti-FVHI. Por ejemplo, la proteina FVIII es reconocida por los linfocitos B y T de diferentes maneras. La inducción de los anticuerpos anti-FVIII es dependiente de células T auxiliares. Las células B reconocen epitopos completos de proteínas a través de su receptor especifico de células B. Por otro lado, las células T reconocen a las proteínas en la forma de péptidos procesados formando complejos con una molécula MHG clase II presentadas sobre la superficie de una célula presentadora de antígenos. Cada clon de células T CD4+ solamente reconoce un complejo péptido- HC específico. Para la presentación de los péptidos a las células T, las moléculas MHC clase II tienen una hendidura de unión abierta que permite que péptidos de diversas longitudes encajen en la misma y se presenten sobre la superficie de una célula. Aún más, la proteína MHC clase II contiene cuatro bolsillos de unión que difieren entre los diversos haplotipos (Jones et al., Nature Rev. Immunol. 6: 271-282 (2006)). En estos bolsillos de unión solamente encajan aminoácidos específicos y el tamaño mínimo de los péptidos de unión es de nueve aminoácidos. Notablemente, diferentes haplotipos de MHC clase II pueden presentar diferentes péptidos. Por consiguiente, es probable que el haplotipo de MHC clase II de un paciente afecte el riesgo de desarrollar anticuerpos anti- FVIII. Es más, diversos estudios han mostrado que existe una correlación entre el haplotipo de MHC clase II humano HLA- DRB1*1501 y un mayor riesgo de desarrollo de anticuerpos anti-FVIII (Pavlova et al., J. Thromb. Haemost. 7: 2006-2015 (2009); Oldenburg et al., Thromb. Haemost. 77: 238-242 (1997); Hay et al., Thromb. Haemost. 77: 234-237 (1997)).
Se han explorado determinados enfoques para resolver los desafios asociados con el tratamiento de hemofilia por administración de la proteina FVIII. Por ejemplo, en WO 03/087161 se divulgan proteínas FVIII modificadas, cuyas características inmunes fueron modificadas por reducción o eliminación de la cantidad de potenciales epitopos de células T presentes sobre la proteína. Se identificaron numerosas regiones que incluyen epitopos de célula T junto con la proteína FVIII, incluyendo, por ejemplo, FVIII2030"2044. De acuerdo con la descripción, se podría emplear la eliminación de las regiones para proveer una proteína FVIII funcional que indujera la producción de anticuerpos anti-FVIII. En WO 09/071886 también se divulgan regiones específicas de la proteína FVIII que podrían originar los péptidos de unión HLA-DR2 relacionados con la respuesta inmune del paciente, tales como, por ejemplo, FVIII475"495, FVIII542"562 , FVl 111785"1805 y FVIII2158"2178. Los péptidos fueron identificados para su posible uso en la inducción de tolerancia inmune en un paciente .
Si bien ha habido avances en la identificación de regiones de la proteína FVIII involucradas en la respuesta inmune, persiste la necesidad de identificar otras regiones de la proteína FVIII que se puedan utilizar para desarrollar otros péptidos y metodologías terapéuticas que se podrán usar, por ejemplo, para tratar pacientes que sufren de hemofilia A.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se basa en la identificación de regiones de la proteína FVIII relacionadas con la respuesta inmune contra moléculas FVIII. Más específicamente, se puede usar un péptido FVIII, que incluya la región de la proteína FVIII, para inducir tolerancia al FVIII humano en pacientes que sufren, por ejemplo, de hemofilia A. Además, los péptidos FVIII se pueden usar con fines de inmunodiagnóstico para monitorear los pacientes con hemofilia A durante una terapia de reemplazo y durante una terapia de inducción de tolerancia inmune .
En un aspecto, la presente invención provee un método para inducir tolerancia inmune al FVIII en un sujeto que lo necesita, donde el método comprende un paso de: administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido cuya una secuencia de aminoácidos consiste de: (R1) - P-(R2)y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 10, 68, 344 y 740; R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 10.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 10.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 68.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 68.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 68.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 740.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 740.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 740.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 740.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, ambos x e y son cero.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, x es uno e y es cero.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, x es cero e y es uno.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, ambos x e y son cero.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, el péptido comprende entre 9 y 100 aminoácidos.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, el péptido comprende entre 9 y 50 aminoácidos.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, el péptido comprende entre 9 y 25 aminoácidos.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, la administración de la composición farmacéutica impide el desarrollo de anticuerpos anti-FVIII en el sujeto.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, la administración de la composición farmacéutica reduce la cantidad de anticuerpos anti-FVIII presente en el sujeto.
En un aspecto, la presente invención provee un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos: (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 y 740; R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 10.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 10.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 68.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 68.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 68.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 740.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 740.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 740.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, P es una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 740.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, ambos x e y son cero .
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, x es uno e y es cero.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, x es cero e y es uno.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, ambos x e y son cero.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, el péptido comprende entre 9 y 100 aminoácidos.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, el péptido comprende entre 9 y 50 aminoácidos.
En una modalidad de los péptidos provistos previamente, el péptido comprende entre 9 y 25 aminoácidos.
En un aspecto, la presente invención provee una composición que comprende un péptido descrito en la presente.
En una modalidad de las composiciones provistas previamente, la composición se formula para una administración farmacéutica.
En una modalidad de las composiciones provistas previamente, la composición comprende además un segundo polipéptido, donde el segundo polipéptido consiste de la secuencia de aminoácidos (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 10, 68, 159, 250, 477, 568, 659 y 740; R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno.
En un aspecto, la presente invención provee un método para elaborar un péptido FVIII, donde el método comprende los pasos de: a) proveer un cultivo de células que comprende un polinucleótido que codifica un péptido FVIII de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 41; y b) expresar el péptido en el cultivo de células.
En un aspecto, la presente invención provee un método para identificar una célula T específica del péptido FVIII, donde el método comprende: a) combinar una pluralidad de células T CD4+ con un péptido que forma un complejo con un multímero de HC clase II, en donde el péptido es un péptido FVIII de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 41; y b) identificar al menos uno de los miembros de la pluralidad de células T CD4+ específicas del péptido que forma un complejo con el multímero de MHC clase II.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, el multímero de MHC clase II es un tetrámero del MHC clase II .
En una modalidad de los métodos provistos previamente, el péptido o multímero de MHC clase II comprende además una porción detectable.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, el método comprende además aislar al menos una célula T CD4+ que es específica del péptido.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, la célula T CD4+ se aisla usando citometría de flujo.
En un aspecto, la presente invención provee una proteína de fusión que comprende un péptido FVIII provisto en la presente y un segundo péptido.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, el segundo péptido es un péptido informante.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, la proteína de fusión es codificada por un ácido nucleico.
En una modalidad de los métodos provistos previamente, el péptido FVIII está ligado químicamente al segundo péptido.
En un aspecto, los péptidos FVIII provistos en la presente se usan para inducir tolerancia inmune hacia el FVIII humano para prevenir el desarrollo de un inhibidor del FVIII .
En un aspecto, los péptidos FVIII provistos en la presente se usan para inducir tolerancia hacia el FVIII humano para el tratamiento de pacientes con inhibidores del FVIII establecidos.
En un aspecto, los péptidos FVIII provistos en la presente se usan para generar reactivos adecuados para una tinción directa de células T específicas del FVIII (por ejemplo, multímeros de MHC clase II o tetrámeros del MHC clase II) en el monitoreo inmune de pacientes durante una terapia de reemplazo o durante una terapia de inducción de tolerancia inmune.
En un aspecto, los péptidos FVIII provistos en la presente se usan para identificar células T específicas del antígeno. En una modalidad, estos reactivos se pueden usar para rastrear células T específicas del FVIII en pruebas in vitro y ex vivo. En otra modalidad, estos reactivos se pueden usar para aislar y caracterizar aún más las células T específicas del FVIII. En una modalidad, se puede usar separación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) o PCR de células individuales para este propósito .
En un aspecto, los péptidos FVIII provistos en la presente se usan para un monitoreo inmune de células T específicas del FVIII durante una terapia de inducción de tolerancia inmune.
En un aspecto, los péptidos FVIII provistos en la presente se usan para el monitoreo inmune de células T específicas del FVIII durante un tratamiento con FVIII.
En un aspecto, los péptidos FVIII provistos en la presente se usan en el inmunodiagnóstico de células T específicas del FVIII durante el desarrollo clínico de nuevos moduladores inmune para la prevención de los inhibidores del FVIII.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION I. Introducción La presente invención se relaciona con péptidos del Factor VIII (FVIII) que se pueden usar para inducir tolerancia a la proteína FVIII, por ejemplo, en pacientes con hemofilia A. Además, los péptidos se pueden con fines de inmunodiagnóstico para monitorear células T específicas de FVIII en pacientes con hemofilia A durante una terapia de reemplazo y durante una terapia de inducción de tolerancia inmune .
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento que diversas regiones del FVIII, específicamente FVIII102"122, FVIII246-266 y FVIII1401"1424, está relacionadas con la respuesta inmune montada contra la proteína FVIII durante una terapia de reemplazo con Factor VIII o con la hemofilia adquirida. Las secuencias de aminoácidos de las regiones identificadas son TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID N° : 740), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID N°: 68), y QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT ( SEQ ID N° : 344), respectivamente. Se cree que la presente invención permite identificar por primera vez estas regiones de la proteína FVIII y su relación con la respuesta inmune a la proteína FVIII .
Los péptidos de la presente invención incluyen péptidos 1 ??— que presentan al menos una porción de las regiones FVIII 122, FVIII246-266 y FVIII1401"1424 que forman complejos con una molécula de MHC clase II para producir un epitopo de células T que pueda ser reconocido por las células T relacionadas con una respuesta inmune del paciente. En algunas modalidades, los péptidos incluyen al menos nueve aminoácidos contiguos que corresponden a nueve aminoácidos contiguos en FVIII102"122, FVIII246"266 o FVIII1401"1424. Como se describirá más adelante, los péptidos provistos en la presente también incluyen péptidos de más de nueve aminoácidos de longitud así como variantes de las secuencias de FVIII102"122, FVIII246"266 y FVIII1401"1424. La identificación de los péptidos de la presente invención puede tener implicancias en la mejora y el avance de estrategias terapéuticas diseñadas para tratar enfermedades relacionadas con la coagulación sanguínea, tal como la hemofilia A.
II. Definiciones El término "proteína del Factor VIII" o "proteína FVIII" se refiere a cualquier molécula del FVIII que contiene al menos una porción del dominio B intacto, y que exhibe una actividad biológica asociada con la proteína FVIII humana nativa. La molécula del FVIII puede ser el FVIII de longitud completa. La molécula del FVIII también puede ser una variante modificada de manera conservadora del FVIII nativo. La proteína FVIII puede derivar de plasma humano o se puede producir mediante técnicas de ingeniería genética recombinante . Se puede consultar una caracterización adicional de la proteína FVIII, por ejemplo, en los párrafos
[0042] -
[0055] en US 2010/0168018, que se incorpora en la presente a modo de referencia.
El término "péptido del Factor VIII" o "péptido FVIII" se refiere a los péptidos que se describen en la presente que incluyen una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región de la proteína FVIII descubierta como importante en una respuesta inmune contra el FVIII. Un péptido FVIII incluye al menos nueve aminoácidos que forman un complejo con una proteína MHC clase II para su presentación a las células T involucradas en la respuesta inmune. Puede haber otros aminoácidos adicionales por cualquiera de los extremos del núcleo de al menos nueve aminoácidos del péptido. En algunas modalidades, un péptido FVIII puede incluir una secuencia idéntica a la región particular de la proteína FVIII humana nativa. En otras modalidades, el péptido FVIII puede ser una variante modificada de manera conservadora de una región de la proteína FVIII. Como se describirá también en la presente, un péptido FVIII se puede caracterizar por una determinada identidad porcentual, por ejemplo, un 85% idéntica, con relación a la secuencia de una región de la proteína FVIII humana nativa.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y no naturales, incluyendo análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales incluyen los que están codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que luego son modificados, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato y 0-fosfoserina . Los aminoácidos naturales pueden incluir, por ejemplo, D- y L-aminoácidos. Los aminoácidos usados en la presente también pueden incluir aminoácidos no naturales. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, cualquier carbono a unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metilsulfonio de metionina. Los análogos contienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos peptídicos modificados, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido natural. En la presente se designan los aminoácidos de acuerdo con los símbolos de tres letras comúnmente conocidos, o de acuerdo con los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Asimismo, los nucleótidos pueden ser denominados por su código de una única letra comúnmente aceptado.
Las "variantes modificadas de manera conservadora" se refieren a secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico particulares, las variantes modificadas de manera conservadora se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos idénticos desde un punto de vista funcional puede codificar un péptido dado. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican, todos, el aminoácido alanina. Por consiguiente, en cualquier posición donde un codón especifica una alanina, puede cambiarse el codón por cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas" que son una especie de variación modificada de manera conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente que codifica un polipéptido también describe cualquier variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un especialista en el arte comprenderá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que comúnmente es el único codón para metionina, y TGG, que comúnmente es el único codón para triptofano) puede ser modificado para obtener una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silente de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita con respecto al producto de la expresión, pero no con respecto a secuencias de sondas reales.
Con respecto a las secuencias de aminoácidos, los especialistas en el arte reconocerán que las sustituciones, supresiones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico o péptido que alteren, agreguen o eliminen un único aminoácido o un porcentaje pequeño de los aminoácidos en la secuencia codificada serán "variantes modificadas de manera conservadora" cuando la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proveen aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Las variantes modificadas de manera conservadora son adicionales y no excluyen a las variantes polimórficas , los homólogos entre especies y los alelos de la invención.
Cada uno de los siguientes ocho grupos contiene aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A) , Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D) , Ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofano (W) ; 7) Serina (S) , Treonina (T) ; y 8) Cisteína (C) , etionina (M) . Véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984) .
Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de péptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o de nucleótidos que son iguales (es decir, aproximadamente un 60% de identidad, preferentemente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad sobre una región específica, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación o región designada) medido usando algoritmos de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con los parámetros predeterminados que se describen más adelante, o por alineación manual e inspección visual.
Una "cantidad o dosis terapéuticamente eficaz" o una "cantidad o dosis suficiente" significa en la presente una dosis que produce los efectos por los cuales es administrada. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento, y será determinada por el especialista en el arte usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Augsburger & Hoag, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 3a Ed . 2008); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (3a Ed., 2008); Pickar, Dosage Calculations (8a Ed. , 2007); y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Ed., 2005, Gennaro, Ed. , Lippincott, Williams & Wilkins) .
III. Péptidos FVIII La presente invención se relaciona con péptidos FVIII que corresponden a regiones de la proteína FVIII involucradas en una respuesta inmune contra FVIII. En un aspecto, la presente invención provee un péptido FVIII que consiste de una secuencia de nueve aminoácidos consecutivos que es al menos un 85% idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en una de las siguientes secuencias de aminoácidos: AWPKMHTV GYV RSLPGLIG (SEQ ID N° : 68); QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N° : 344); o TWITLK MASHPVSLHAVGV (SEQ ID N° : 740), en donde el péptido comprende entre 9 y 180 aminoácidos.
En una modalidad específica, el péptido FVIII tiene la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 68, 344 y 740, Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x "e y son de manera independiente cero o uno. En una modalidad, R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre l y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ú 80 aminoácidos.
En una modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos. En aún otras modalidades, el péptido FVIII comprende entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22 , 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 , 61, 62 , 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, : 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110 , 115, 120, 125, 130 , 135, 140, 145 , 150 , 155, 160, 165 , 170, 175 ó 180 aminoácidos.
En general, los péptidos FVIII de la presente invención pueden incluir cualquier secuencia de aminoácidos presente en la región identificada de FVIII102"122, FVIII246"266 o FVIII1401" 1424 , o una variante modificada que, por ejemplo, ha retenido una función similar o idéntica a FVIII102"122, FVIII246"266 o FVIII1401"1424. En particular, los péptidos FVIII de la presente invención incluyen una secuencia de aminoácidos que incluye un epitopo de célula T. Los péptidos FVIII incluyen una secuencia de al menos nueve aminoácidos que pueden variar en un intervalo de porcentaje de identidad con relación a la secuencia de aminoácidos AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID N°: 68); QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N°: 344); o TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID N°: 740). Por ejemplo, un péptido FVIII puede contener nueve aminoácidos que son idénticos o al menos un 50%, 60%, 70%, 80% u 85% idénticos a 1 02 -cualquiera de los nueve aminoácidos consecutivos en FVIII 122, FVIII246"266 o FVIII1401"1424.
En otro grupo de modalidades, los péptidos FVIII pueden tener secuencias de aminoácidos mayores que nueve aminoácidos, en donde las secuencias de aminoácidos incluyen una región que puede ser idéntica o al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos consecutivos en FVIII102"122, FVIII246"266 o FVIII1401"1424. Un especialista en el arte podrá apreciar que se pueden usar técnicas de mutagénesis conocidas, tal como sustitución de alanina, para identificar variantes modificadas que retienen la función de la región FVIII102"122, FVIII246"266 o FVIII1401"1424.
Además, los péptidos FVIII pueden incluir también secuencias de aminoácidos adicionales por cualquier extremo de la secuencia de péptidos FVIII central descrita previamente. Las secuencias adicionales se denominan (R1^ y (R2)y. En determinadas modalidades, R1 y R2 pueden variar en un intervalo entre 1 y aproximadamente 80 aminoácidos de longitud. Como alternativa, R1 y R2 pueden variar en un intervalo entre 1 y aproximadamente 40 aminoácidos de longitud. En determinadas modalidades, cada uno de los subíndices x e y son de manera independiente cero o uno. En algunas modalidades, ambos x e y pueden ser cero. En otras modalidades, x puede ser uno e y puede ser cero. En aún otras modalidades, x puede ser cero e y puede ser uno. En otra modalidad, ambos x e y son uno. Se pueden agregar aminoácidos adicionales por cualquier extremo por una variedad de razones, incluyendo una mayor estabilidad de los péptidos, una unión mejorada a moléculas de MHC clase II y/o células T, así como otros aspectos como comprenderá un especialista en el arte.
En una modalidad, la presente invención provee un polipéptido que presenta la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una región del Factor VIII identificada en la Tabla 1, R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, en donde cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno. Como alternativa, R1 y R2 pueden variar en un intervalo entre 1 y aproximadamente 40 aminoácidos de longitud. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una región del Factor VIII identificada en la Tabla 1. En otra modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una región Factor VIII identificada en la Tabla 1. En algunas modalidades, ambos x e y pueden ser cero. En otras modalidades, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras modalidades, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra modalidad, ambos x e y pueden ser uno. En una modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos .
Tabla 1. Regiones de FVIII que incluyen epitopos de células T Según se describió previamente, los péptidos FVIII de la presente invención pueden incluir cualquier secuencia de aminoácidos presente en la región identificada de FVIII1401-1424 o una variante modificada que, por ejemplo, puede haber retenido una función similar o idéntica a FVIII1401-1424. En determinadas modalidades, los péptidos pueden abarcar todo el dominio B de la proteina FVIII humana. La presente invención también puede incluir otros péptidos FVIII que incluyen un péptido que tienen una secuencia de al menos nueve aminoácidos que pueden variar en un intervalo de porcentaje de identidad con relación a cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (FVIII474-494 ; SEQ ID N° : 159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (FVIII540-560 ; SEQ ID N° : 250), EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (FVIII1785-1805; SEQ ID N° : 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (FVIII2025-2045 ; SEQ ID N° : 568), NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (FVIII2160-2180 ; SEQ ID N° : 659), TWITLKNMASHPVSLHA (FVIII102-119; SEQ ID N° : 10), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (FVIII246-266 ; SEQ ID N° : 68) y TWITLKNMASHPVSLHAVGV (FVIII102-122 ; SEQ ID N° : 740).
Por ejemplo, los péptidos FVIII de nueve aminoácidos que son idénticos o al menos un 50%, 60%, 70%, 80% o 85% idénticos a cualquiera de los nueve aminoácidos consecutivos de FVIII474-494 , FVIII540-560 , FVIII1785-1805 , ?????2025"2045 , FVIII2160- 2180, FVIII102-119, FVIII246-266 o FVIII102-122. En otro grupo de modalidades, los péptidos FVIII pueden tener secuencias de aminoácidos de más de nueve aminoácidos, en donde las secuencias de aminoácidos pueden ser idénticas o al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a cualquiera de los nueve aminoácidos consecutivos en FVIII474-494 , FVIII540-560 , j jl785-1805 py-j-J-J-2025-2045 py-j- j j2160 -2180 FVIII102"119 FVIII246"266 o FVIII102-122. Un especialista en el arte podrá apreciar que se pueden usar técnicas de mutagénesis conocidas, tal como sustitución de alanina, para identificar variantes modificadas que retienen la función de las regiones FVIII474- 494 FVII i540"560 Fviii1785-1805 j j2025-2045 FVI 112160"2180 FVIII102"119, FVIII246"256 o FVIII102"122. Los péptidos FVIII descritos aquí se pueden obtener usando los métodos descritos previamente con respecto a los péptidos FVIII relacionados con FVIII1401 1424.
A. Péptidos del Factor VIII102"119 En una modalidad, la presente invención provee un polipéptido que presenta la secuencia (R1) X-P- (R2) Y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII102"119 cuya secuencia es TWITLKNMASHPVSLHA (SEQ ID N° : 10) , R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, en donde cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno.
En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII102"119 cuya secuencia es TWITLKNMASHPVSLHA (SEQ ID N° : 10) . En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 1 a 55 (SEQ ID N° : 10) . En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 1 a 55. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID N° : 1 a 55. En algunas modalidades, ambos x e y pueden ser cero. En otras modalidades, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras modalidades, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra modalidad, ambos x e y pueden ser uno.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre l y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ú 80 aminoácidos.
En determinadas modalidades, R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos. En una modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos. En aún otras modalidades, el péptido FVIII comprende entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 , 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 , 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 0, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 5, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos. 102-119 Tabla 2. Ejemplos de peptidos FVI B. Peptidos del Factor VIII246"266 En una modalidad, la presente invención provee un polipéptido que presenta la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII246"266 cuya secuencia es AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID N° : 68) , R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, en donde cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno.
En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VII I246-266 cuya secuencia es AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID N° : 68) . En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII246"266 cuya secuencia es AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID N° : 68) . En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 56 a 146. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 56 a 146. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 56 a 146. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID N° : 56 a 146. En algunas modalidades, ambos x e y pueden ser cero. En otras modalidades, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras modalidades, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra modalidad, ambos x e y pueden ser uno.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ú 80 aminoácidos.
En una modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos. En aún otras modalidades, el péptido FVIII comprende entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Tabla 3. Ejemplos de péptidos FVIII246"266 C. Peptidos del Factor VIII474"494 En una modalidad, la presente invención provee un polipéptido que presenta la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII474"494 cuya secuencia es GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (SEQ ID N° : 159) , R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, en donde cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno.
En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII474 494 cuya secuencia es GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (SEQ ID N° : 159) . En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII474"494 cuya secuencia es GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (SEQ ID N° : 159). En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 147 a 237. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 147 a 237. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 147 a 237. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID N° : 147 a 237. En algunas modalidades, ambos x e y pueden ser cero. En otras modalidades, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras modalidades, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra modalidad, ambos x e y pueden ser uno.
En determinadas modalidades, R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos. En una modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos . En aún otras modalidades , el péptido FVIII comprende entre 9 Y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26 , 27, 28 , 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 , 56 , 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 , 83, 84, 85 , 86 , 87, 88 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140 , 145 , 150, 155, 160 , 165 , 170, 175 Ó 180 aminoácidos .
Tabla 4. Ejemplos de péptidos FVIII474"494 Péptidos del Factor vill540"560 En una modalidad, la presente invención provee un polipéptido que presenta la secuencia (R1) X-P- (R2 ) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII540"560 cuya secuencia es PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID N° : 250), R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, en donde cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno.
En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII540-56o cuya secuencia es PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID N° : 250) . En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII540"560 cuya secuencia es PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID N° : 250) . En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 238 a 328. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 238 a 328. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 238 a 328. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID N° : 238 a 328. En algunas modalidades, ambos x e y pueden ser cero. En otras modalidades, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras modalidades, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra modalidad, ambos x e y pueden ser uno.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ú 80 aminoácidos.
En una modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos. En aún otras modalidades, el péptido FVIII comprende entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Tabla 5. Ejemplos de péptidos FVI E. Péptidos del Factor VIII1401"1424 En una modalidad, la presente invención provee un polipéptido que presenta la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor vill1401"1424 cuya secuencia es QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N° : 344), R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, en donde cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno.
En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII1401"1424 cuya secuencia es QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N° : 344) . En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor vill1401"1424 cuya secuencia es QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N° .- 344) . En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 329 a 464. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 329 a 464. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 329 a 464. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID N° : 329 a 464. En algunas modalidades, ambos x e y pueden ser cero. En otras modalidades, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras modalidades, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra modalidad, ambos x e y pueden ser uno.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, 1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ^ ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 15 79 ú 80 aminoácidos.
En una modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el Q péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos. En aún otras modalidades, el péptido FVIII comprende entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 5 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, , 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, , 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, , 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, , 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 0, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos. 1401-1424 Tabla 6. Ejemplos de péptidos FVI F. Péptidos del Factor VIII1785"1805 En una modalidad, la presente invención provee un polipéptido que presenta la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor vill1785"1805 cuya secuencia es EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (SEQ ID N° : 477), R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, en donde cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor yjui785-i805 CUya secuencia es EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (SEQ ID N° : 477).
En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VI I j1785"1805 cuya secuencia es EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (SEQ ID N° : 477). En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 465 a 555. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 465 a 555. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 465 a 555. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID N° : 465 a 555. En algunas modalidades, ambos x e y pueden ser cero. En otras modalidades, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras modalidades, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra modalidad, ambos x e y pueden ser uno.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre l y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ú 80 aminoácidos.
En una modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos. En aún otras modalidades, el péptido FVIII comprende entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22 , 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 , 61, 62 , 63, 64, 65, 66 , 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 , 81, 82 , 83, 84, 85, 86 , 87, 88 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110 , 115, 120 125, 130 , 135, 140, 145, 150 , 155, 160, 165, 0, 175 ó 180 aminoácidos.
Tabla 7. Ejemplos de péptidos FVIII G. Péptidos del Factor vill2025"2045 En una modalidad, la presente invención provee un polipéptido que presenta la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor vill2025"2045 cuya secuencia es LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (SEQ ID N° : 568), R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, en donde cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno.
En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VI I I2025-2045 cuya seCuencia es LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (SEQ ID N° : 568) . En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII2025"2045 cuya secuencia es LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (SEQ ID N° : 568) . En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 556 a 646. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 556 a 646. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 556 a 646. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID N° : 556 a 646. En algunas modalidades, ambos x e y pueden ser cero. En otras modalidades, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras modalidades, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra modalidad, ambos x e y pueden ser uno.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ú 80 aminoácidos.
En una modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos. En aún otras modalidades, el péptido FVIII comprende entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 5, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 0, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 5, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 0, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 5, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 40, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Tabla 8. Ejemplos de péptidos FVIII2025"2045 H. Peptidos del Factor VIII2160"2180 En una modalidad, la presente invención provee un polipéptido que presenta la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor vill2160"2180 cuya secuencia es NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (SEQ ID N° : 659), R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, en donde cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno.
En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII2i60-2iso cuya secuencia es NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (SEQ ID N° : 659). En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII2160"2180 cuya secuencia es NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (SEQ ID N° : 659). En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 647 a 737. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 647 a 737. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 647 a 737. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID N° : 647 a 737. En algunas modalidades, ambos x e y pueden ser cero. En otras modalidades, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras modalidades, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra modalidad, ambos x e y pueden ser uno.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ú 80 aminoácidos.
En una modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos. En aún otras modalidades, el péptido FVIII comprende entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos. 2160-21BO Tabla 9. Ejemplos de péptidos FVI I. Péptidos del Factor vill1^"1^ En una modalidad, la presente invención provee un polipéptido que presenta la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor vill102'122 cuya secuencia es TWITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID N° : 740), R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, en donde cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno.
En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII102"122 cuya secuencia es TWITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID N° : 740) . En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII102"122 cuya secuencia es TWITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID N° : 740) .
En el contexto de la presente invención, los péptidos FVIII102"122 también incluyen péptidos FVIII102"119. Por lo tanto, en una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 1 a 55 y 738 a 773. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 1 a 55 y 738 a 773. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos 95% de identidad con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 1 a 55 y 738 a 773. En una modalidad, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID N° : 1 a 55 y 738 a 773. En algunas modalidades, ambos x e y pueden ser cero. En otras modalidades, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras modalidades, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra modalidad, ambos x e y pueden ser uno.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ? 80 aminoácidos.
En una modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos. En aún otras modalidades, el péptido FVIII comprende entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Tabla 10. Ejemplos de péptidos FVIII102"122 IV. Métodos para producir péptidos FVIII En otro aspecto, la presente invención se relaciona además con métodos para producir péptidos FVIII. En algunas modalidades, los péptidos FVIII de la presente invención se pueden producir usando las técnicas de síntesis en fase sólida (por ejemplo, Fmoc o t-Boc) o en fase líquida conocidas en general en el arte. Véase, por ejemplo, Chan & White, Eds . , Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Oxford University Press, 2000) ; Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis (CRC Press, 2005) ; Howl , Peptide Synthesis and Applications (Humana Press, 2010) .
En una modalidad, la presente invención incluye un método para elaborar un péptido FVIII, donde el método comprende: a) sintetizar un péptido usando técnicas de síntesis en fase sólida o fase líquida, donde péptido FVIII presenta la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 68, 344 y 740, Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; 2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno. En una modalidad, R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos. En determinadas modalidades, los péptidos pueden abarcar todo el dominio B de la proteína FVIII humana.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 , 63, 64, 65, 66 , 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ú 80 aminoácidos.
En otras modalidades, los péptidos se pueden producir usando técnicas recombinantes . En una modalidad, la presente invención incluye un método para elaborar un péptido FVIII, donde el método comprende los pasos de: a) proveer un cultivo de células que comprende un vector que codifica un péptido FVIII, donde el péptido FVIII presenta la secuencia : (R1) X-P- (R2)y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 68, 344 y 740, Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno. En una modalidad, R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos. En determinadas modalidades, los péptidos pueden abarcar todo el dominio B de la proteína FVIII humana.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 Y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 , 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 , 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ? 80 aminoácidos.
En una modalidad, la presente invención provee un método para elaborar un péptido FVIII, donde el método comprende los pasos de: a) proveer un cultivo de células que comprende un polinucleótido que codifica un péptido FVIII, donde péptido presenta la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 y 740, Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno; y b) expresar el péptido en el cultivo de células.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 2, 3, 4, , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 , 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ú 80 aminoácidos.
En una modalidad de los métodos para producir péptidos FVIII, el péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos.
En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos. En aún otras modalidades, el péptido FVIII comprende entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28 , 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 , 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 , 63, 64, 65, 66 , 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos .
Los péptidos FVIII de la presente invención se pueden producir por expresión en un sistema huésped procariota o eucariota adecuado. Los ejemplos de células eucariotas incluyen, en un sentido no limitativo, células de mamífero, tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep y HepG2 ; células de insecto, por ejemplo células SF9, células SF21, células S2 y células High Five; y células de levadura, por ejemplo células Saccharomyces o Schízosaccharomyces . En una modalidad, los péptidos FVIII se pueden expresar en células bacterianas, células de levadura, células de insecto, células de aves, células de mamífero y semejantes. En algunas modalidades, los péptidos se pueden expresar en una línea celular humana, una línea celular de hámster o una línea celular de murinos . En una modalidad particular, la línea celular es una línea celular CHO, BHK o HEK.
Se puede usar una amplia variedad de vectores para la expresión de los péptidos FVIII y se pueden seleccionar entre vectores de expresión eucariotas y procariotas. Los vectores incluirán una secuencia de nucleótidos necesaria para la expresión de al menos uno de los péptidos FVIII descritos en la presente. Los ejemplos de vectores para la expresión en procariotas incluyen plásmidos tales como pRSET, pET, pBAD, etc . , en donde los promotores usados en los vectores de expresión procariotas incluyen lac, trc, trp, recA, araBAD, etc. Los ejemplos de vectores para la expresión en eucariotas incluyen (i) para la expresión en levadura, vectores tales como pAO, pPIC, pYES, p ET, usando promotores tales como A0X1, GAP, GAL1 , AUG1 , etc; (ii) para la expresión en células de insecto, vectores tales como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., usando promotores tales como PH, plO, MT, Ac5, 0pIE2, gp64, polh, etc., y (iii) para la expresión en células de mamífero, vectores tales como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3 , pBPV, etc., y vectores derivados de sistemas virales tales como virus vaccinia, virus adeno-asociados , virus herpes, retrovirus, etc., usando promotores tales como CMV, SV40, EF- 1, UbC, RSV, ADV, BPV y ß-actina.
En algunas modalidades de la presente invención, las secuencias de ácidos nucleicos para producir los péptidos FVIII incluyen además otras secuencias adecuadas para una expresión controlada de una proteína tales como secuencias promotoras, potenciadores , motivos TATA, sitios de inicio de la transcripción, policonectores , sitios de restricción, secuencias poli-A, secuencias de procesamiento de proteínas, marcadores de selección y semejantes, conocidos en general por un especialista en el arte.
El medio de cultivo usado para las células productoras de los péptidos FVIII se puede basar en un medio basal adecuado bien conocido en el arte, por ejemplo, DME , F12 de Ham, Medio 199, McCoy o RP I . El medio basal puede incluir numerosos ingredientes, incluyendo aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas y fuentes de carbohidratos. Cada ingrediente puede comprender una cantidad capaz de sustentar el cultivo de una célula, siendo las cantidades conocidas en general por un especialista en el arte. El medio puede incluir sustancias auxiliares, tales como sustancias amortiguadoras, por ejemplo, bicarbonato de sodio, antioxidantes, estabilizantes para contrarrestar el estrés mecánico o inhibidores de proteasas . Si fuera necesario, se puede agregar un agente tensioactivo no iónico, tales como copolímeros y/o mezclas de polietilenglicoles y polipropilenglicoles .
En algunas modalidades, el medio de cultivo está libre de proteínas agregadas exógenamente . El término "libre de proteínas" y términos relacionados se refiere a una proteína que proviene de una fuente exógena o que es distinta de las células del cultivo, que naturalmente desprenden proteínas durante el crecimiento. En otra modalidad, el medio de cultivo está libre de polipéptidos . En otra modalidad, el medio de cultivo está libre de suero. En otra modalidad, el medio de cultivo está libre de proteínas de animales. En otra modalidad, el medio de cultivo está libre de componentes de animales. En otra modalidad, el medio de cultivo contiene proteínas, por ejemplo, proteínas animales del suero tal como suero fetal bovino. En otra modalidad, se agregan proteínas recombinantes exógenas al cultivo. En otra modalidad, las proteínas provienen de un animal libre de patógenos certificado .
Los métodos para preparar medios de cultivo libres de proteínas animales y definidos químicamente son conocidos en el arte, por ejemplo en US 2008/0009040 y US 2007/0212770, ambas incorporadas en la presente para todo fin. En una modalidad, el medio de cultivo usado en los métodos que se describen en la presente es un medio libre de proteínas de animales o libre de oligopéptidos . En determinadas modalidades, el medio de cultivo puede estar definido químicamente. El término "definido químicamente", según se usa en la presente, significará que el medio no comprende ningún suplemento no definido, tal como, por ejemplo, extractos de componentes animales, órganos, glándulas, plantas o levadura. Por lo tanto, cada componente de un medio definido químicamente está definido con precisión.
En determinadas modalidades, los métodos de la presente invención pueden incluir el uso de un sistema de cultivo de células que funciona, por ejemplo, en modalidad por lotes, en modalidad por semilotes, en modalidad de lotes alimentados o en modalidad continua. Un cultivo por lotes puede ser un cultivo de células a gran escala en el cual el inoculo de células se cultiva hasta una densidad máxima en un tanque o fermentado, y luego se cosecha y procesa como un lote. Un cultivo de lotes alimentado puede ser un cultivo por lotes que es suplementado con nutrientes frescos (por ejemplo, sustratos limitantes del crecimiento) o aditivos (por ejemplo, precursores de productos). Un cultivo continuo puede ser un cultivo en suspensión que es alimentado de manera continua con nutrientes por medio de un flujo de entrada de medio fresco, en donde el volumen de cultivo habitualmente es constante. De manera similar, la fermentación continua se puede referir a un proceso en el cual las células o los microorganismos se mantienen en cultivo en la fase de crecimiento exponencial por la adición continua de medio fresco equilibrada exactamente con la eliminación de suspensión de células del biorreactor. Además, se puede usar un sistema de reactor de tanque agitado para cultivos en suspensión, perfusión, quimiostáticos y/o con microtransportadores. En general, el sistema con reactor de tanque agitado se puede operar como cualquier reactor de tanque agitado convencional con cualquier tipo de agitador tal como uno de tipo Rushton, Hydrofoil , de turbina axial o marino .
En determinadas modalidades, los métodos de cultivos de células de la invención pueden incluir el uso de un microtransportador . En algunas modalidades, los cultivos de células de las modalidades se pueden realizar en grandes biorreactores bajo condiciones adecuadas para proveer áreas de superficie de cultivo específicas de un volumen alto para lograr elevadas densidades celulares y una gran expresión de proteínas. Un medio para proveer tales condiciones de crecimiento comprende el uso de microtransportadores para el cultivo de células en biorreactores de tanques con agitación. El concepto de crecimiento de células sobre microtransportadores fue descrito por primera vez por van Wezel (van Wezel, A.L., Nature 216: 64-5 (1967)) y permita fijar las células sobre la superficie de pequeñas partículas sólidas suspendidas en el medio de crecimiento. Estos métodos proveen relaciones elevadas de superficie a volumen y por consiguiente permiten un uso eficaz de nutrientes. Además, para la expresión de las proteínas secretadas en líneas celulares eucariotas, una mayor relación de superficie-a-volumen permite obtener niveles de secreción mayores y por consiguiente mayores rendimientos de proteínas en el sobrenadante del cultivo. Finalmente, estos métodos permiten aumentar fácilmente la escala de los cultivos de expresión en eucariotas .
Las células que expresan los péptidos FVIII se pueden unir a un microtransportador esférico o poroso durante el crecimiento del cultivo celular. El microtransportador puede ser un microtransportador seleccionado del grupo de microtransportadores basado en dextrano, colágeno, plástico, gelatina y celulosa y otros. También es posible cultivar las células en una biomasa sobre microtransportadores esféricos y subcultivar las células cuando han alcanzado la biomasa final del termentador y antes de producir la proteína expresada sobre un microtransportador poroso o viceversa. Los microtransportadores esféricos adecuados pueden incluir microtransportadores de superficie lisa, tal como Cytodex™ 1, Cytodex™ 2 y Cytodex™ 3 (GE Healthcare) y microtransportadores macroporosos tales como Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1 y Cytoline™ 2 (GE Healthcare) .
Un especialista en el arte podrá apreciar que los péptidos FVIII producidos mediante los métodos de síntesis y/o recombinantes descritos previamente pueden incluir aminoácidos naturales y/o no naturales, incluyendo análogos de aminoácidos y/o miméticos de aminoácidos.
V. Composiciones de péptidos del Factor FVIII para la inducción de tolerancia inmune En otro aspecto, los péptidos FVIII descritos en la presente se pueden incluir en una composición farmacéutica. En una modalidad, la presente invención provee una composición farmacéutica que comprende un péptido del Factor VIII246"266 , un péptido del Factor VIII1401"1424 o un péptido del Factor VIII102"122, como se describe en la presente.
En una modalidad, la composición farmacéutica comprende un péptido del Factor vill246"266 descrito en la presente. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende además un péptido FVIII474"494 , un péptido FVIII540"560 , un péptido FVIII1785"1805 , un péptido FVIII2025"2045, un péptido FVIII2160"2180 , un péptido FVIII102"119, un péptido FVIII1401"1424 , un péptido FVIII102"122 o un segundo péptido FVIII246"266 , descritos en la presente .
En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un péptido del Factor vill1401"1424 descrito en la presente. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende además un péptido FVIII474"494 , un péptido FVIII540"560 , un péptido FVIII1785-1805 ( un péptido FVIII2025-2045 ( un péptido FVI j j 2160 -2180 _ un péptido FVIII102"119, un péptido FVIII246"266 , un péptido FVIII102"122 o un segundo péptido FVIII1401"1424 , descritos en la presente .
En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un péptido del Factor VIII102"122 descrito en la presente. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende además un péptido FVIII474"494 , un péptido FVIII540"560, un péptido FVIII1785"1805 , un péptido ?????20"-^ ? un péptido FVIII2i6o-2i80f un péptido FVIII102"119, un péptido FVIII246"266 , un péptido FVIII1401"1424 o un segundo péptido FVIII102"122, descritos en la presente .
En una modalidad específica, la presente invención provee una composición farmacéutica que comprende un péptido que tiene la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 68, 344 y 740, Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno. En una modalidad, R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 2, 3, 4, , 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 , 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ú 80 aminoácidos.
En una modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos. En aún otras modalidades, el péptido FVIII comprende entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 , 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 , 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105 ·, no, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
En una modalidad específica, la composición farmacéutica comprende además un segundo polipéptido, donde el segundo polipéptido presenta la secuencia : (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 y 740, Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno. En una modalidad, R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ú 80 aminoácidos.
En una modalidad, el segundo péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el segundo péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el segundo péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el segundo péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos. En aún otras modalidades, el segundo péptido FVIII comprende entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 6 180 aminoácidos.
A. Administración Para administrar las composiciones a un ser humano o un animal de experimentación, en un aspecto, las composiciones pueden incluir uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Las frases "farmacéuticamente" o "farmacológicamente" aceptable se refieren a entidades moleculares y composiciones que son estables, inhiben la degradación de la proteína o del péptido tales como productos de agregación y de clivaje, y además no producen reacciones alérgicas, u otras reacciones adversas cuando se administran usando las rutas bien conocidas en la técnica, como se describirá más adelante. Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" incluyen cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares clínicamente útiles.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía oral, tópica, transdérmica , parenteral, por inhalación de un espray, vaginal, rectal o por inyección intracraneal. El término parenteral, tal como se usa en la presente documentación, incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, inyección intraesternal , u otras técnicas de infusión. También se contempla la administración por inyección intravenosa, intradérmica , intramuscular, intramamaria, intraperitoneal , intratecal, retrobulbar, intrapulmonar y/o por implantación quirúrgica en un sitio particular. En general, las composiciones están esencialmente libres de pirógenos así como de otras impurezas que pueden ser nocivas para el receptor.
Las dosificaciones y la frecuencia de administración dependerán de diversos factores conocidos en general por los especialistas en el arte, incluyendo, por ejemplo, la severidad de la hemofilia del paciente y/o si la tolerancia inmune es inducida más eficazmente usando dosis mayores o menores. Las típicas dosis diarias pueden variar en un intervalo de entre aproximadamente 0.01 y 100 mg/kg. Dosis en el intervalo de 0.07-700 mg del péptido FVIII por semana pueden ser eficaces y bien toleradas, aunque dosis semanales aún mayores pueden ser apropiadas y/o bien toleradas. El principal factor determinante para definir la dosis apropiada es la cantidad de un péptido FVIII particular necesario para que sea terapéuticamente eficaz en un contexto particular. Puede ser necesario administrar administraciones repetidas con el fin de lograr una tolerancia inmune de mayor duración.
Se pueden llevar a cabo administraciones simples o múltiples de las composiciones con los niveles de dosis y el patrón elegidos por el médico a cargo.
En un aspecto, las composiciones de la invención se pueden administrar mediante un bolo. Como otro ejemplo, el péptido FVIII de la invención se administra como una dosis de una sola vez. Los especialistas en la técnica podrán optimizar fácilmente las dosificaciones y los regímenes de administración determinados por la buena práctica médica y la condición clínica de cada paciente individual. La frecuencia de la dosificación depende de la ruta de administración. La composición farmacéutica óptima será determinada por el especialista en la técnica dependiendo de la ruta de administración y la dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Remington : The Science and Practice of Pharmacy (Remington, the Science and Practice of Pharmacy) , 21a Ed. (2005, Lippincott Williams & Wilkins) cuya descripción se incorpora en la presente a modo de referencia. Las composiciones afectan el estado físico, la estabilidad, el índice de liberación in vivo y el índice de depuración in vivo de los agentes administrados. Según la ruta de administración, la dosis adecuada se calcula de acuerdo con el peso corporal, el área de superficie corporal o el tamaño del órgano. Las dosificaciones apropiadas se pueden determinar usando los ensayos establecidos para determinar las dosificaciones del nivel en sangre junto con datos apropiados de dosis-respuesta. El régimen de dosificación final es determinado por el médico a cargo, considerando los diversos factores que modifican la acción de las drogas, como por ejemplo la actividad específica de la droga, la severidad del daño y la respuesta del paciente, la edad, la condición, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos.
En algunas modalidades, las composiciones que comprenden un péptido FVIII descrito en la presente fueron liofilizadas antes de la administración. La liofilización se lleva a cabo usando técnicas comunes en la técnica y deberían optimizarse para la composición en desarrollo, como se describe, por ejemplo, en Tang et al., Pharm Res., 21: 191-200, (2004) y Chang et al., Pharm Res., 13: 243-9 (1996). Los métodos para preparar composiciones farmacéuticas pueden incluir uno o más de los siguientes pasos: agregar un agente estabilizante a la mezcla antes de la liofilización, agregar al menos un agente seleccionado entre un agente de relleno, un agente regulador de la osmolaridad y un agente tensioactivo a la mezcla antes de la liofilización. Una formulación liofilizada comprende, en un aspecto, por lo menos uno o más entre una solución amortiguadora, un agente de relleno y un estabilizante. En este aspecto, se evalúa la utilidad de un agente tensioactivo y se seleccionará en aquellos casos donde la agregación durante el paso de liofilización o durante la reconstitución se convierte en un problema. Se incluye un agente amortiguador apropiado para mantener la formulación dentro de zonas estables de pH durante la liofilización.
La práctica estándar de reconstitución de un material liofilizado comprende volver a agregar un volumen de agua pura o agua estéril para inyecciones (WFI, por sus siglas en inglés) (típicamente equivalente al volumen removido durante la liofilización) , aunque a veces se usan soluciones diluidas de agentes antibacterianos en la producción de fármacos para administración parenteral . Por consiguiente, se proveen métodos para la preparación de composiciones reconstituidas del péptido FVIII que comprenden el paso de agregar un diluyente a las composiciones liofilizadas del péptido FVIII de la invención.
En algunas modalidades, el material liofilizado se puede reconstituir como una solución acuosa. Hay una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua estéril para inyecciones, agua con conservantes para el uso de múltiples dosis o agua con cantidades apropiadas de agentes tensioactivos (por ejemplo, una suspensión acuosa que contiene al compuesto activo mezclado con los excipientes adecuados para la elaboración de suspensiones acuosas) . En diversos aspectos, los excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo y sin limitaciones, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa , hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma acacia; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido natural, por ejemplo y sin limitaciones, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo y sin limitaciones, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo y sin limitaciones, heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con esteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol, tal como monooleato de polioxietilensorbitol , o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo y sin limitaciones, monooleato de polietilensorbitano . En diversos aspectos, las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo y sin limitaciones, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo .
VI. Métodos de tratamiento La presente invención se relaciona además con métodos de tratamiento de un paciente que sufre de una enfermedad asociada con la proteína FVIII, tal como la hemofilia A o la hemofilia adquirida. Los métodos pueden incluir la administración de al menos uno de los péptidos FVIII descritos en la presente. En particular, se pueden administrar composiciones farmacéuticas que incluyen al menos uno de los péptidos FVIII para inducir tolerancia inmune a la proteína FVIII en un paciente.
En algunas modalidades, los métodos para inducir tolerancia inmune al FVIII pueden incluir prevenir el desarrollo de un inhibidor del FVIII después de la administración del FVIII. El término "prevenir" se refiere a no permitir una respuesta inmune al FVIII sustancialmente detectable. Por ejemplo, antes de la administración de la proteína FVIII un paciente no tendrá ningún anticuerpo anti-FVIII detectable. Sin embargo, después de la terapia de administración de la proteína FVIII puede aumentar el nivel de anticuerpos anti-FVIII detectables si no se administra un péptido FVIII para inducir tolerancia inmune. La administración de los péptidos FVIII descritos en la presente puede inducir tolerancia inmune, de esa manera tratando al paciente que sufre de hemofilia.
En otras modalidades, los métodos para inducir tolerancia inmune a la proteína FVIII pueden incluir tratar a los pacientes en los cuales ya se han establecido inhibidores del FVIII. En estas modalidades, la administración del péptido FVIII puede reducir o eliminar la presencia de anticuerpos anti-FVIII. El término "reducir" se refiere a una reducción parcial de una respuesta inmune a la proteína FVIII. En determinadas modalidades, la reducción de la respuesta inmune puede incluir un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de reducción en la respuesta inmune en comparación con el nivel de la respuesta inmune en un paciente antes de la administración del péptido FVIII. Por ejemplo, el porcentaje de reducción se puede analizar midiendo la cantidad de anticuerpos anti-FVIII presente en la sangre antes y después de la administración del péptido FVIII, usando métodos estándar para determinar la cantidad de anticuerpos FVIII presentes en la misma. En otras modalidades, la reducción de la respuesta inmune puede incluir medir niveles reducidos de células T CD4+ específicas del FVIII o células B específicas del FVIII que secretan anticuerpos anti-FVIII, o una combinación de las tres opciones, las células T, las células B y los anticuerpos anti-FVIII. Las células inmunes, tales como células T y B específicas del FVIII, se pueden aislar usando métodos conocidos en general en el arte.
En un aspecto, la presente invención incluye un método para inducir tolerancia inmune al FVIII en un sujeto, donde el método comprende el paso de administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un péptido FVIII descrito en la presente. En una modalidad específica, el péptido FVIII es un péptido del Factor VIII246"266, un péptido del Factor VIII1401" 14 4 o un péptido del Factor VIII102 122, descritos en la presente .
En una modalidad, el método comprende el paso de administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un péptido del Factor vill246"266 descrito en la presente. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende además un péptido FVIII474"494 , un péptido FVIII540"550 , un péptido FVIII1785-1805 , un péptido ?????2025"2045 , un péptido ?????2160"2180 , un péptido FVIII102"119, un péptido FVIII1401"1424 , un péptido FVIII102-122 o un segundo péptido FVIII246"255 , descritos en la presente .
En otra modalidad, el método comprende el paso de administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un péptido del Factor vill1401"1424 descrito en la presente. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende además un péptido FVIII474"494 , un péptido FVIII540"560 , un péptido FVIII1785"1805 , un péptido FVI1i2025"2^ un péptido FVIII2i6o-2iBO f un péptido FVIII102"119, un péptido FVIII246"266 , un péptido FVIII102"122 o un segundo péptido FVIII1401"1424 , descritos en la presente .
En otra modalidad, el método comprende el paso de administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un péptido del Factor VIII102"122 descrito en la presente. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende además un péptido FVIII474"494 , un péptido FVIII540"560 , un péptido FVIII1785"1805 , un péptido ?????2025"2045 , un péptido FVi112160"2180 , un péptido FVIII102"119, un péptido FVIII246"266, un péptido FVIII1401"1424 o un segundo péptido FVIII102"122, descritos en la presente .
En una modalidad, la presente invención provee un método para inducir tolerancia inmune a una proteína FVIII, donde el método comprende administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un péptido que tiene la secuencia: (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 68, 344 y 740, Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno; induciendo de esa manera tolerancia inmune a una proteína FVIII en el sujeto. En determinadas modalidades, R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ú 80 aminoácidos.
En una modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos. En aún otras modalidades, el péptido FVIII comprende entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 , 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Los métodos para inducir tolerancia inmune pueden incluir además terapias combinadas en las cuales se pueden administrar diversos péptidos para inducir tolerancia inmune. En una modalidad, el método para inducir tolerancia inmune comprende además la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un segundo péptido que tiene la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N°:10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 y 740, Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno; de esa manera induciendo tolerancia inmune a una proteína FVIII en el sujeto. En determinadas modalidades, R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos. En una modalidad particular, el segundo péptido comprende entre 9 y 80 aminoácidos. En otra modalidad particular, cualquier aminoácido adicional en el segundo péptido es un aminoácido natural. En otra modalidad particular, el segundo péptido comprende entre 9 y 40 aminoácidos de longitud. En una modalidad específica, el segundo péptido comprende entre 9 y 80 aminoácidos de longitud y cualquier aminoácido adicional en el segundo péptido es un aminoácido natural.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ? 80 aminoácidos.
En una modalidad, el segundo péptido FVIII comprende entre 9 y 150 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 100 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido FVIII comprende entre 9 y 25 aminoácidos. En aún otras modalidades, el péptido FVIII comprende entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,· 42, 43, 44, 45; 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
En una modalidad específica del método para inducir tolerancia inmune, en donde la composición farmacéutica administrada comprende un péptido donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 68, 344 ó 740, la composición comprende además un segundo polipéptido, donde el segundo polipéptido presenta la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 y 740, Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 , 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ú 80 aminoácidos.
En un aspecto, la presente invención provee el uso de un péptido FVIII descrito en la presente en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una respuesta inmune generada contra una terapia de reemplazo con FVIII. En una modalidad específica, el péptido FVIII es un péptido FVIII1401" 1424. En un aspecto relacionado, la presente invención provee el uso de un péptido FVIII descrito en la presente en la elaboración de un medicamento para la prevención de una respuesta inmune generada contra una terapia de reemplazo con FVIII. En una modalidad específica, el péptido FVIII es un péptido FVIII1401"1424.
En un aspecto, la presente invención provee un péptido FVIII para su uso como un medicamento. En una modalidad específica, la invención provee un polipéptido que presenta la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor vill1401"1424 cuya secuencia es QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N° : 344), R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, en donde cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno para su uso como un medicamento .
En un aspecto, la presente invención provee un péptido FVIII para el tratamiento de una respuesta inmune generada contra una terapia de reemplazo con FVIII. En una modalidad específica, la invención provee un polipéptido que presenta la secuencia (R1) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VI1i1401"1424 cuya secuencia es QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N° : 344), R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, en donde cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno para el tratamiento de una respuesta inmune generada contra una terapia de reemplazo con FVIII.
En un aspecto, la presente invención provee un péptido FVIII para la prevención de una respuesta inmune generada contra una terapia de reemplazo con FVIII. En una modalidad específica, la invención provee un polipéptido que presenta la secuencia (R1 ) x- P- (R2 ) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido del Factor VIII1401"1424 cuya secuencia es QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N° : 344), R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos, en donde cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno para la prevención de una respuesta inmune generada contra una terapia de reemplazo con FVIII.
VII. Inmunodiagnóstico En un aspecto, la presente invención provee un método para monitorear una terapia de reemplazo con FVIII o una terapia de inducción de tolerancia inmune a FVIII en un sujeto que lo necesita mediante identificación de la presencia o del nivel de un anticuerpo inhibidor del FVIII o célula T CD4+ que es específica del FVIII en una muestra biológica tomada del sujeto.
En una modalidad, el método comprende un método para monitorear una terapia de reemplazo con FVIII en un sujeto que lo necesita, donde el método comprende: poner una muestra biológica del sujeto en contacto con un péptido FVIII246"266 , un péptido FVIII1401"1424 o un péptido FVIII102"122, descritos en la presente; y detectar el complejo formado entre el péptido FVIII y un anticuerpo inhibidor del FVIII presente en la muestra. En una modalidad, el método comprende determinar el nivel de anticuerpo inhibidor del FVIII en la muestra. En aún otra modalidad, el método comprende determinar el nivel de un anticuerpo inhibidor del FVIII en al menos dos muestras tomadas del sujeto en tiempos diferentes, y comparar los niveles del anticuerpo inhibidor del FVIII entre las dos muestras, en donde un incremento en el nivel de anticuerpo en el tiempo es indicativo de la formación de una respuesta inmune contra el FVIII administrado al sujeto durante el transcurso de la terapia de reemplazo con FVIII.
En otra modalidad, el método comprende un método para monitorear una terapia de inducción de tolerancia inmune a FVIII en un sujeto que lo necesita, donde el método comprende: poner una muestra biológica del sujeto en contacto con un péptido FVIII246"266 , un péptido FVIII1401"1424 o un péptido FVIII102"122, descritos en la presente; y detectar el complejo formado entre el péptido FVIII y un anticuerpo inhibidor del FVIII presente en la muestra. En una modalidad, el método comprende determinar el nivel de anticuerpo inhibidor del FVIII en la muestra. En aún otra modalidad, el método comprende determinar el nivel de un anticuerpo inhibidor del FVIII en al menos dos muestras tomadas del sujeto en tiempos diferente, y comparar los niveles del anticuerpo inhibidor del FVIII entre las dos muestras, en donde una disminución en el nivel de anticuerpo en el tiempo es indicativa de la formación de tolerancia inmune a la proteína FVIII en el sujeto.
En una modalidad, el método comprende un método para monitorear una terapia de reemplazo con FVIII en un sujeto que lo necesita, donde el método comprende: poner una muestra biológica del sujeto en contacto con un péptido FVIII246"266 , un péptido FVIII1401"1424 o un péptido FVIII102"122, descritos en la presente; y detectar el complejo formado entre el péptido FVIII y una célula T CD4+ específica del FVIII presente en la muestra. En una modalidad, el método comprende determinar el nivel de células T CD4+ específicas del FVIII en la muestra. En aún otra modalidad, el método comprende determinar el nivel de una célula T CD4+ específica del FVIII en al menos dos muestras tomadas del sujeto en diferente tiempos, y comparar los niveles de células T CD4+ específicas del FVIII entre las dos muestras, en donde un incremento en el nivel de anticuerpo en el tiempo es indicativo de la formación de una respuesta inmune contra el FVIII administrado al sujeto durante el transcurso de la terapia de reemplazo con FVIII. En una modalidad específica, el péptido FVIII forma complejo con un multímero de MHC clase II.
En otra modalidad, el método comprende un método para monitorear una terapia de inducción de tolerancia inmune a FVIII en un sujeto que lo necesita, donde el método comprende: poner una muestra biológica del sujeto en contacto con un péptido FVIII246"266 , un péptido FVIII1401"1424 o un péptido FVIII102"122, descritos en la presente; y detectar el complejo formado entre el péptido FVIII y una célula T CD4+ específica del FVIII presente en la muestra. En una modalidad, el método comprende determinar el nivel de células T CD4+ específicas del FVIII en la muestra. En aún otra modalidad, el método comprende determinar el nivel de células T CD4+ específicas del FVIII en al menos dos muestras tomadas del sujeto en diferentes tiempos y comparar los niveles de células T CD4+ específicas del FVIII entre las dos muestras, en donde una disminución en el nivel de anticuerpo en el tiempo es indicativa de la formación de tolerancia inmune a la proteína FVIII en el sujeto. En una modalidad específica, el péptido FVIII forma complejo con un multímero de MHC clase II.
El especialista en el arte podrá apreciar que el monitoreo inmune se pueden usar, por ejemplo, para facilitar tratamiento de pacientes con hemofilia. Por ejemplo, el monitoreo inmune se puede usar para identificar si la administración de los péptidos y/o las composiciones de la presente invención previene o reduce una respuesta inmune al producto FVIII. Las cantidades de dosificación y/o los intervalos de dosificación se pueden optimizar mediante un monitoreo inmune. En algunas modalidades, las dosificaciones de administración se pueden adaptar específicamente en base a los resultados del monitoreo inmune de prevención o reducción de anticuerpos anti-FVIII. Además, se pueden determinar los intervalos entre dosis, así como las cantidades de dosificación, para un paciente o grupo de pacientes particular .
A. Métodos para identificar células T específicas del FVIII En otro aspecto, la presente invención incluye métodos para identificar células T específicas del antígeno, más específicamente células T que son específicas para la proteína FVIII y los péptidos FVIII descritos en la presente. Los métodos se pueden usar, por ejemplo, para un inmunodiagnóstico, tal como el monitoreo inmune de un paciente. En una modalidad, la presente invención incluye un método para identificar células T específicas de péptidos FVIII, donde el método comprende a) combinar una pluralidad de células T CD4+ con un péptido FVIII que forma complejo con un multímero de MHC clase II, donde el péptido FVIII presenta la secuencia (R1 ) X-P- (R2) y, en donde P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 68, 344 y 740, Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno; y b) identificar al menos uno de los miembros de la pluralidad de células T CD4+ que son específicas del péptido que forma un complejo con el multímero de MHC clase II. En algunas modalidades, R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 40 aminoácidos.
En determinadas modalidades, los péptidos FVIII descritos en la presente se pueden usar para generar los reactivos adecuados para una tinción directa de células T específicas del FVIII. Por ejemplo, los multímeros de MHC clase II que presentan los péptidos FVIII de la presente invención pueden incluir una variedad de formas, tal como un tetrámero del MHC clase II. Estas moléculas de MHC clase II se pueden modificar además para incluir un agente de diagnóstico. Como alternativa, los péptidos FVIII que forman un complejo con multímeros de MHC clase II pueden incluir un agente de diagnóstico. Los agentes de diagnóstico (es decir, una porción detectable) usados en la presente invención pueden incluir los que son conocidos en general en el arte para un monitoreo inmune. Por ejemplo, las células T específicas del FVIII se pueden identificar y/o aislar en base a la detección de un agente de diagnóstico asociado con un péptido FVIII descrito en la presente que es presentado por un tetrámero del MHC clase II. Los agentes de diagnóstico adecuados pueden incluir un agente fluorescente, un agente quimioluminiscente , un agente radioactivo, un agente de contraste y semejantes. Los agentes de fluorescencia adecuados incluyen los utilizados típicamente en citometría de flujo y pueden incluir, pero en un sentido no limitativo, isotiocianato de fluoresceína, R-Ficoeritrina, rojo Texas, Cy3 , Cy5 , Cy5.5, Cy7 y derivados de los mismos.
En determinadas modalidades, el péptido FVIII se puede usar para volver a estimular células T CD4+ específicas del FVIII in vitro. En estas modalidades, la re-estimulación de las células T se podría monitorear por detección de la proliferación, secreción de citocinas o quimioquinas , o la sobre-regulación o sub-regulación de determinados marcadores de activación que son conocidos por los especialistas en el arte.
En algunas modalidades, la detección del agente de diagnóstico se puede usar para identificar y/o aislar células T específicas de los péptidos FVIII descritos en la presente. Por ejemplo, los reactivos anteriores (por ejemplo, péptidos, tetrámeros del MHC clase II y agentes de diagnóstico) se pueden usar para rastrear células T específicas del FVIII in vitro o ex vivo. En determinadas modalidades, las células T también se pueden aislar y caracterizar usando diversas técnicas conocidas en general en el arte, tal como citometría de flujo, por ejemplo, separación de células activadas por fluorescencia (FACS) , y/o PCR, por ejemplo, PCR de células individuales .
Para efectuar los análisis de monitoreo inmune, las células T que se unen al complejo de péptido FVIII -multímero de MHC clase II incluyen células T CD4+ y se pueden aislar en un paciente usando una variedad de métodos conocidos en general en el arte. Por ejemplo, se pueden aislar y purificar células T de la sangre, de los órganos o de otros tejidos de un paciente. El aislamiento y la identificación de las células T específicas del FVIII se pueden usar en una variedad de aplicaciones de inmunodiagnóstico . En determinadas modalidades, los péptidos FVIII o reactivos asociados se pueden usar para el monitoreo inmune de células T específicas de FVIII durante el desarrollo clínico de un nuevo producto FVIII. En otras modalidades, los péptidos FVIII se pueden usar para el monitoreo inmune de células T específicas de FVIII durante una terapia de inducción de tolerancia inmune. En aún otras modalidades, los péptidos FVIII se pueden usar para el monitoreo inmune de células T específicas de FVIII durante un tratamiento con FVIII.
VIII. Kits de la invención La presente invención también provee kits para facilitar y/o normalizar el uso de las composiciones provistas por la presente invención, así como para facilitar los métodos de la presente invención. Los materiales y los reactivos para conducir estos diversos métodos se pueden proveer en kits para facilitar la ejecución de los métodos. Según se usa en la presente, el término "kit" se usa con referencia a una combinación de artículos que facilita un proceso, ensayo, análisis o manipulación.
Los kits pueden contener reactivos químicos (por ejemplo, péptidos FVIII o polinucleótidos que codifican péptidos FVIII), así como otros componentes. Además, los kits de la presente invención también pueden incluir, por ejemplo, pero en un sentido no limitativo, aparatos y reactivos para la recolección y/o purificación de muestras, aparatos y reactivos para la recolección y/o purificación de producto, reactivos para la transformación de células bacterianas, reactivos para la transfección de células eucariotas, células huésped transformadas o transfectadas previamente, tubos para muestras, soportes, bandejas, gradillas, discos, placas, instrucciones para usar el kit, soluciones, soluciones amortiguadoras u otros reactivos químicos, muestras adecuadas para usar en la estandarización, normalización y/o muestras control. Los kits de la presente invención también se pueden envasar para un almacenamiento conveniente y envío seguro, por ejemplo, en una caja que tiene una tapa.
En algunas modalidades, por ejemplo, los kits de la presente invención pueden proveer un péptido FVIII de la invención, un vector de polinucleótidos (por ejemplo, un plásmido) que codifica un péptido FVIII de la invención, cepas de células bacterianas adecuadas para propagar el vector y reactivos para la purificación de las proteína de fusión expresadas. Como alternativa, el kit de la presente invención puede proveer los reactivos necesarios para conducir la mutagénesis de un péptido FVIII con el fin de generar una variante modificada de manera conservadora del péptido FVIII.
El kit puede contener una o más composiciones de la invención, por ejemplo, una o una pluralidad de péptidos FVIII o uno o una pluralidad de pol inucleótidos que codifican los péptidos FVIII. Como alternativa, el kit puede contener reactivos (por ejemplo, péptidos, tetrámeros del MHC clase II y agentes de diagnóstico) para llevar a cabo el monitoreo inmune de un paciente.
El kit de la invención también puede contener una o una pluralidad de moléculas de ácidos nucleicos recombinantes , que codifican los péptidos FVIII, que pueden ser iguales o diferentes, y pueden incluir además, por ejemplo, un segundo polinucleót ido ligado operativamente que contiene o que codifica un sitio de reconocimiento de una endonucleasa de restricción o un sitio de reconocimiento de una recombinasa o cualquier polipéptido de interés. Además, el kit puede contener instrucciones para el uso de los componentes del kit, en particular las composiciones de la invención que están contenidas en el kit.
IX. Modalidades específicas En una modalidad, la presente invención provee un péptido FVIII que consiste de una secuencia de nueve aminoácidos consecutivos que es al menos un 85% idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en la siguiente secuencia de aminoácidos: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N° : 344) , y el péptido presenta la fórmula (Rl ) x-pépt ido- (R2 ) y, en donde Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; 2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de los subíndices x e y son de manera independiente cero o uno.
En una modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 80 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 70 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 60 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 50 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 40 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 30 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 20 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 10 aminoácidos. En otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 5 aminoácidos. En aún otra modalidad, R1 y R2 son, por separado o ambas, secuencias de aminoácidos que consisten de entre 1 y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 , 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ? 80 aminoácidos.
En una modalidad específica de los péptidos descritos previamente , ambos x e y son cero.
En una modalidad específica de los péptidos descritos previamente , x es uno e y es cero.
En una modalidad específica de los péptidos descritos previamente , x es cero e y es uno.
En una modalidad específica de los péptidos descritos previamente , ambos x e y son uno .
En una modalidad específica de los péptidos descritos previamente , la secuencia de nueve ¡aminoácidos consecutivos es idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N° : 344).
En una modalidad, la presente invención provee una composición farmacéutica que comprende un péptido FVIII que consiste de una secuencia de nueve aminoácidos consecutivos que es al menos un 85% idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en la siguiente secuencia de aminoácidos QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N° : 344) y el péptido presenta la fórmula (Rl ) x-péptido- (R2 ) y, en donde Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de los subíndices x e y son de manera independiente cero o uno.
En una modalidad específica de las composiciones descritas previamente, ambos x e y son cero.
En una modalidad específica de las composiciones descritas previamente, x es uno e y es cero.
En una modalidad específica de las composiciones descritas previamente, x es cero e y es uno.
En una modalidad específica de las composiciones descritas previamente, ambos x e y son uno.
En una modalidad específica de las composiciones descritas previamente, la composición comprende además al menos un péptido que consiste de una secuencia de nueve aminoácidos consecutivos que es al menos un 85% idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en una secuencia de aminoácidos seleccionada de manera independiente del grupo que consiste de GEVGDTLLIIFKNQASRPY I (SEQ ID N° : 159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID N° : 250), EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (SEQ ID N° : 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (SEQ ID N° : 568), NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (SEQ ID N° : 659), TWITLKNMASHPVSLHA (SEQ ID N° : 10), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID N° : 68), y TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID N°: 740), en donde al menos un péptido tiene un máximo de 80 aminoácidos de longitud y en donde cualquier aminoácido adicional en al menos un péptido es un aminoácido natural.
En una modalidad, la presente invención provee un método para inducir tolerancia inmune al FVIII en un sujeto, donde el método comprende un paso de administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un péptido FVIII que consiste de una secuencia de nueve aminoácidos consecutivos que es al menos un 85% idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en la siguiente secuencia de aminoácidos QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N°: 344), y el péptido presenta la fórmula (Rl)x-péptido- (R2 ) y, en donde Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; cada uno de los subíndices x e y son de manera independiente cero o uno; y de esa manera induce tolerancia inmune a la proteína FVIII en el sujeto.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente, la composición farmacéutica comprende además al menos un péptido que consiste de una secuencia de nueve aminoácidos consecutivos que es al menos un 85% idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en una secuencia de aminoácidos seleccionada de manera independiente del grupo que consiste de GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (SEQ ID N° : 159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID N° : 250), EVEDNIMVTFR QASRPYSFY (SEQ ID N° : 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (SEQ ID N° : 568), NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (SEQ ID N° : 659), TWITLKNMASHPVSLHA (SEQ ID N° : 10), A PKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID N° : 68), y TWITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID N° : 740), en donde al menos un péptido tiene un máximo de 80 aminoácidos de longitud y en donde cualquier aminoácido adicional en al menos un péptido es un aminoácido natural.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente, la administración de la composición farmacéutica impide el desarrollo de anticuerpos anti-FVIII en el sujeto.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente, la administración de la composición farmacéutica reduce la cantidad de anticuerpos anti-FVIII presente en el suj eto .
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente, ambos x e y son cero.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente, x es uno e y es cero.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente, x es cero e y es uno.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente, ambos x e y son uno.
En una modalidad, la presente invención provee un método para elaborar un péptido FVIII, donde el método comprende los pasos de: a) proveer un cultivo de células que comprende un vector que codifica un péptido FVIII que consiste de una secuencia de nueve aminoácidos consecutivos que es al menos un 85% idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en la siguiente secuencia de aminoácidos QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N° : 344), y el péptido presenta la formula (Rl)x-péptido- (R2 ) , en donde Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; cada uno de los subíndices x e y son de manera independiente cero o uno; y b) expresar el . péptido en el cultivo de células.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente , ambos x e y son cero.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente , x es uno e : y es cero.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente , x es cero e y es uno.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente , ambos x e y son uno.
En una modalidad, la presente invención provee un método para elaborar un péptido FVIII, donde el método comprende: a) sintetizar un péptido usando técnicas de síntesis en fase sólida o en fase líquida, donde el péptido consiste de una secuencia de nueve aminoácidos consecutivos que es al menos un 85% idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en la siguiente secuencia de aminoácidos QAMRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N° : 344), y el péptido presenta la fórmula (Rl)x-péptido- (R2 ) y, en donde Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de los subíndices x e y son de manera independiente cero o uno .
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente , ambos x e y son cero .
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente , x es uno e y es cero.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente , x es cero e y es uno.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente , ambos x e y son uno .
En una modalidad, la presente invención provee un método para identificar células T específicas de péptidos FVIII, donde el método comprende: a) combinar una pluralidad de células T CD4+ con un péptido FVIII que forma un complejo con un multímero de MHC clase II, donde el péptido FVIII consiste de una secuencia de nueve aminoácidos consecutivos que es al menos un 85% idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en la siguiente secuencia de aminoácidos QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID N° : 344), y el péptido presenta la formula (Rl ) x-péptido- (R2 ) y, en donde Rl es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; cada uno de los subíndices x e y son de manera independiente cero o uno; y b) identificar al menos uno de los miembros de la pluralidad de células T CD4+ específicas del péptido que forma un complejo con el multímero de MHC clase II.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente, el multímero de MHC clase II es un tetrámero del MHC clase II.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente, el péptido o multímero de MHC clase II comprende además un agente de diagnóstico.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente, el agente de diagnóstico permite identificar al menos un miembro de la pluralidad de células T CD4+ específicas del péptido.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente, el método comprende además aislar al menos un miembro de la pluralidad de células T CD4+ específicas del péptido en base a la detección del agente de diagnóstico.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente, al menos un miembro de la pluralidad de células T CD4+ se aisla usando citometría de flujo.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente , ambos x e y son cero.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente , x es uno e y es cero.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente , x es cero e y es uno.
En una modalidad específica de los métodos descritos previamente , ambos x e y son uno.
La presente invención se ilustrará ahora en los siguientes ejemplos, en un sentido no limitativo de los mismos .
X . EJEMPLOS Ejemplo 1 Para imitar mejor la molécula de MHC clase II humana en la identificación de péptidos FVIII, se desarrolló un modelo en ratón de hemofilia A con una molécula de MHC clase II quimérica que contiene un sitio de unión específico de HLA-DRB1*1501 humano. Este ratón se retrocruzó con un ratón en el cual se había noqueado por completo todos los genes de MHC clase II de murinos (Reipert et al., J. Thromb . Haemost . 7 Supl . 1: 92-97 (2009)). En este nuevo modelo de ratón transgénico, todas las respuestas de células T CD4+ están dirigidas por la molécula de MHC clase II humana. Este modelo en ratón se usó para identificar los péptidos FVIII presentados por HLA-DRB1*1501 que dirigen respuestas inmunes anti-FVIII en estos ratones.
Materiales y métodos FVIII: El FVIII recombinante humano (rFVIII) se produjo como un producto a granel libre de albúmina (Baxter Neuchatel) y un producto de FVIII formulado en sacarosa clínica (Advate, Baxter, Westlake Village, CA) .
Ratones HLA-DRB15 E17 hemofílicos : Ratones HLA-DRBl*1501+ ~ E17"/_ descritos en Reipert et al., J. Thromb. Haemost. 7 Supl. 1: 92-97 (2009). Todos eran ratones macho y de 8 a 12 semanas de vida al comienzo del experimento.
Inmunización con el FVIII recombinante humano: Los ratones HLA-DRB1*1501+/" E17_/" recibieron entre 4 y 8 dosis por vía intravenosa o subcutánea de 0,2 yg o 1 ]ig de rFVIII humano a intervalos semanales. El rFVIII se diluyó en la solución amortiguadora de la formulación original o en solución amortiguadora salina fosfato de Dulbecco que contiene calcio y magnesio (DPBS; Sigma Aldrich, St . Louis, Missouri, EE.UU.).
Preparación de las células: Se obtuvieron bazos 3 a 7 días después de la última inmunización con rFVIII. Las células de bazo se disgregaron y se hicieron pasar a través de un tamiz celular de 70 µt? (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Se recolectaron células individuales en medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado con suero fetal bovino preseleccionado 10% (FCS; Hyclone, Logan, UT) , L-glutamina 2 mM, penicilina/estreptomicina 100 U/ml (ambas de Gibco) y mercaptoetanol 5xl0"5 M (Sigma-Aldrich) . Los eritrocitos se lisaron usando solución amortiguadora hipotónica (pH 7,2) compuesta por cloruro de amonio 0.15 M, bicarbonato de potasio 10 mM (ambos de Merck, Darmstadt, Alemania) y ácido etilendiamintetraacético 0.1 mM (Sigma-Aldrich). Las células se lavaron y contaron usando un contador Coulter Zl.
Generación de hibridomas de células T para identificar péptidos FVIII Re-estimulación in vitro de células de bazo con el rFVIII humano: Se re-estimularon células de bazo en la presencia de FVIII humano 20 ug/ml en medio de cultivo a una concentración de 1.5 x 10s células/ml durante 3 ó 10 días. El medio de cultivo de los cultivos de 10 días se renovó después de 6 días .
Fusión de células T de ratón con células BW: Los cultivos de células de bazo re-estimuladas in vitro y células BW (a-ß-) se lavaron dos veces con medio de cultivo libre de suero y luego se combinaron a una relación de entre 1:3 y 1:10 (células T: células BW) . La línea celular BW derivaba de un linfoma de células T AKR/J de ratón. Estas células no tenían receptores de células T sobre su superficie (OÍ- ß - ) y por ello es que cualquier receptor de célula T después de la fusión con las células de bazo de ratón deriva del miembro de fusión. Después de un tercer paso de lavado, se eliminó el sobrenadante. Las condiciones de la fusión se lograron por la adición de 1 mi de polietilenglicol (PEG; HybiMax 50%, Sigma-Aldrich) en el término de 45 segundos. Después de otros 45 segundos de incubación, se agregaron 50 mi de medio libre de suero para prevenir el efecto tóxico del PEG. Las células se centrifugaron a 1300 rpm por 5 minutos sin interrupción para formar un pélet muy firme. Se descartó el sobrenadante y se agregaron 50 mi medio libre de suero nuevo muy lentamente para no dislocar el pélet. El tubo se invirtió lentamente hasta que las células se re-suspendieron y centrifugaron igual que antes. Esto se realizó dos veces para eliminar el PEG remanente. El último paso de lavado se efectuó con medio de cultivo. Las células se diluyeron y cultivaron luego en placas de 96 cavidades. El medio de cultivo se cambió por medio de selección (suplemento de medio HAT, Sigma Aldrich) después de 48 horas y se seleccionaron los clones en crecimiento. El medio de selección se mantuvo por 2 semanas, después de lo cual el medio se volvió a cambiar por medio de cultivo normal.
Especificidad de péptidos de los hibridomas de células T específicas del FVIII: Los hibridomas de célula T fueron evaluados por su especificidad de antígenos. Para ello, se co- cultivaron 1 x 105 células con células presentadoras de antígenos. Los autores usaron ya sea 5 x 104 células Mgar (que expresan HLA-DRB1*1501) o 1 x 105 células de bazo completas derivadas de ratones naive HLA-DRB1* 1501 - E17. Las células se incubaron con rFVIII humano 10 yg/ml o con péptido/agrupaciones de péptidos 1 g/ml durante 24 horas a 37°C, 5% de C02. Los sobrenadantes se recolectaron y se midió la liberación de IL-2 en el sobrenadante de cultivo usando un ELISA para IL-2 (BioLegend, San Diego, CA) o Bio-Plex para IL-2 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) de acuerdo con el protocolo del proveedor. Una liberación de IL-2 = 20 pg/ml en la presencia, pero no ausencia, de FVIII (o péptidos) era considerada positiva o, como alternativa, un incremento de 10 veces de la liberación de IL-2 en la presencia de FVIII en comparación con la ausencia de FVIII era considerado positivo.
Subclonación de hibridomas de células T: Para asegurar que cada clon solamente representa un tipo de hibridoma de células T todos los clones fueron subclonados. Los clones del hibridoma se diluyeron hasta una dilución limitante de 0,3 células/cavidad y se co-cultivaron con 200 células nutricias / cavidad. Las células nutricias se produjeron mediante tratamiento con Mitomicina C de las células del miembro de fusión, las células BW. Se trataron 2 x 108 células B con 0.1 mg de Mitomicina C de Streptomyces caespitosus (Sigma Aldrich) por 10 minutos a temperatura ambiente y 25 minutos a 37°C, 5% de C02 en el incubador. Se seleccionaron cinco subclones en crecimiento por clon y se evaluaron por su especificidad por FVIII.
Agrupaciones de péptido FVIII usadas para determinar las especificidades de hibridomas de células T: Se produjeron agrupaciones de péptido FVIII usando el método de síntesis SPOT como se describe en Ay et al., {Biopolimers 88: 64-75 (2007)). Brevemente, se sintetizaron péptidos de 15 mer sobre dos membranas de celulosa idénticas. Las membranas se cortaron en tiras verticales y horizontales. Los péptidos fueron liberados de las tiras de membrana y se usaron como agrupaciones de péptidos en pruebas de especificidad según se describió previamente. Los péptidos se disolvieron en DMSO (Hybrimax, Sigma Aldrich) y se diluyeron además con PBS.
Resul tados Se produjeron 181 clones de hibridomas específicos de FVIII. Estos clones se examinaron contra una biblioteca de péptidos que abarca el FVIII humano completo. Se usaron péptidos de 15 mer desplazados por tres aminoácidos. Con este enfoque, se identificaron seis regiones del FVIII diferentes que contenían péptidos unidos a HLA-DRB1*1501. Los autores encontraron dos dominios de péptidos en el dominio Al, dos péptidos en el dominio A2, uno en el dominio B, dos en el dominio A3 y un dominio de péptido dentro del dominio Cl del humano FVIII. El péptido FVIII1401"1424 no se había descrito antes (Tabla 11) . Los péptidos FVIII474"494 , FVIII545"559 , FVIII1788"1802 y FVIII2161"2175 ya se habían identificado en O 09/071886, en donde de usaron programas de predicción computados seguido por la tecnología de hibridomas de células péptido FVII 2030-2044 se divulgó en WO 03/087161. El péptido FVIII b iBU ya se había sido publicado por Jacquemin et al., Blood 101(4): 1351-8 (2003).
Tabla 11: Regiones de FVIII que incluyen epitopes de células T Se comprenderá que los ejemplos y las modalidades que se describen en la presente solamente se ofrecen a efectos ilustrativos y que los especialistas en el arte podrán visualizar diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos que se incluirán en el espíritu y la competencia de esta solicitud y en el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas aquí se incorporan por completo en la presente a modo de referencia para todo fin.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (40)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método para inducir tolerancia inmune al FVIII en un sujeto que lo necesita, caracterizado porque comprende el paso de: administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de: (R^x-P-ÍR'jy, en donde : P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344; R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno .
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque P es una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque ambos x e y son cero .
7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque x es uno e y es cero .
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque x es cero e y es uno .
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque ambos x e y son uno .
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el péptido comprende entre 9 y 100 aminoácidos.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el péptido comprende entre 9 y 50 aminoácidos .
12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el péptido comprende entre 9 y 25 aminoácidos .
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende además un paso de: administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un segundo péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de: (R^x-P- (R2)y, en donde : P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 y 740; R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno .
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la administración de la composición farmacéutica impide el desarrollo de anticuerpos anti-FVIII en el sujeto.
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la administración de la composición farmacéutica reduce la cantidad de anticuerpos anti-FVIII presente en el sujeto.
16. Un péptido, caracterizado porque consiste de la secuencia de aminoácidos: en donde : P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344; R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno .
17. El péptido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
18. El péptido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
19. El péptido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 95% de identidad con una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
20. El péptido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque P es una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N° : 344.
21. El péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque ambos x e y son cero.
22. El péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque x es uno e y es cero.
23. El péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque x es cero e y es uno.
24. El péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque ambos x e y son uno.
25. El péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque el péptido comprende entre 9 y 100 aminoácidos.
26. El péptido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el péptido comprende entre 9 y 50 aminoácidos .
27. El péptido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque comprende entre 9 y 25 aminoácidos.
28. Una composición, caracterizada porque comprende un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 27.
29. La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque se formula para una administración farmacéutica .
30. La composición de conformidad con la reivindicación 28 ó 29, caracterizada porque comprende además un segundo polipéptido, donde el segundo polipéptido consiste de la secuencia de aminoácidos : (R^x-P-ÍR2)^ en donde : P es una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85% de identidad con al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID N° : 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 y 740; R1 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que comprende entre 1 y 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son de manera independiente cero o uno .
31. Un método para elaborar un péptido FVIII, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proveer un cultivo de células que comprende un polinucleótido que codifica un péptido FVIII de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 27; y b) expresar el péptido en el cultivo de células.
32. Un método para identificar una célula T específica del péptido FVIII, caracterizado porque comprende: a) combinar una pluralidad de células T CD4+ con un péptido que forma un complejo con un multímero de MHC clase II, en donde el péptido es un péptido FVIII de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 27; y b) identificar al menos uno de los miembros de la pluralidad de células T CD4+ específicas del péptido que forma un complejo con el multímero de MHC clase II.
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el multímero de MHC clase II es un tetrámero del MHC clase II.
34. El método de conformidad con la reivindicación 32 ó 33, caracterizado porque el péptido o multímero de MHC clase II comprende además una porción detectable.
35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, caracterizado porque comprende además aislar la al menos una célula T CD4+ que es específica del péptido.
36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la célula T CD4+ se aisla usando citometría de flujo.
37. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende : un péptido del Factor VIII de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 27; y un segundo péptido.
38. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el segundo péptido es un informante peptídico.
39. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 37 ó 38, caracterizada porque es codificada por un ácido nucleico.
40. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 37 ó 38, caracterizada porque el péptido FVIII está ligado químicamente al segundo péptido.
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