KR20220075081A

KR20220075081A - 자연살해세포 NKG2D 수용체 결합하는 SARS-CoV-2 S 단백질 유래 펩타이드를 이용한 자연살해세포 활성 증가 및 감염병,암 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220075081A
Application number: KR1020200162287A
Authority: KR
Inventors: 최인표; 김한나; 정해용; 윤석란; 변재은
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2022-06-07
Also published as: WO2022114798A1

Abstract

본 발명은 자연살해세포의 활성이 개선된 신규의 자연살해세포 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따라 제조된 자연살해세포는 자연살해세포의 살상능, IFN-γ 생산능 등에서 개선된 활성을 가짐으로써 바이러스 감염에 대한 치료제, 면역 치료제, 암 치료제 등으로써 다양한 용도로 활용될 수 있다.

Description

자연살해세포 NKG2D 수용체 결합하는 SARS-CoV-2 S 단백질 유래 펩타이드를 이용한 자연살해세포 활성 증가 및 감염병,암 예방 및 치료용 조성물 {Anti-viral and anti-tumor peptides derived from SARS-CoV-2 S protein which binds to NKG2D receptor of natural killer cells and regulates natural killer cell functions thereof}

본 발명은 활성이 개선된 신규의 자연살해세포 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

SARS-CoV-2 감염으로 인한 COVID-19는 호흡기 질환을 일으키며 WHO에 의해 2020년 3월 11일에 Pandemic으로 선포되었다.

SARS-CoV-2의 감염은 환자의 면역체계 이상을 유도하며 T 세포와 natural killer cell (NK, 자연살해세포)의 결핍을 일으킴으로 심각한 면역결핍을 유도한다.

SARS-CoV-2 환자에서는 자연살해세포의 감소현상과 질환의 진행정도가 상관관계가 있음이 보고되었다. 자연살해세포는 인체의 선천성 면역을 유지하는 면역세포로 암세포나 바이러스가 감염이 된세포를 제거한다. 암세포나 바이러스가 감염이 된 세포를 자연살해세포가 활성 수용체를 통해 인식하고 이들 세포를 제거한다. 자연살해세포는 활성 수용체와 저해 수용체를 가지고 있고 이들 두 종류의 신호전달의 균형을 통해 활성을 조절한다. 코로나 환자에서 자연살해세포 수용체인 NKG2A 발현이 증가됨이 보고되었고 이 수용체가 치료제 개발의 타겟의 하나로 여겨지고 있다. 그러나 아직 코로나 환자에서 자연살해세포와 자연살해세포 수용체들의 역할은 잘 안 알려져 있다.

한편, 정상 상태에서 체내에 존재하는 대부분의 NK 세포는 비활성화 상태(inactivated state)로 존재하지만, 실제로 NK 세포를 치료용으로 이용하기 위해서는 활성화된 NK 세포가 필요하기 때문에 정상혈액으로부터 또는 비활성화된 환자 혈액으로부터 NK 세포를 활성화 시키는 연구가 활발히 진행되고 있다.

체외에서 NK 세포를 활성화시킴으로써 달성된 NK 세포의 높은 세포독성(cytotoxicity)은 NK 세포의 면역세포 치료 가능성을 확인시켜 주었다. 체외에서 활성화된 NK 세포는 다양한 암 종류, 특히 백혈병과 같은 혈액암을 대상으로 동종 골수이식 후에 투여함으로써 그 치료효과를 확인한 보고가 있다. 그러나, 혈액암이 아닌 고형암에 대해서는 NK 세포에 대하여 아직 임상적으로 뚜렷한 치료 효과가 입증되지 않고 있다. 구체적으로 NK 세포를 종양이 생기기 전부터 투여하여 종양의 생착을 방해할 수 있다는 보고가 있으나, 적합한 치료모델이라고 보기 어렵고, 복강으로 NK 세포를 투여하여 유방암 세포의 성장을 저해한 동물 실험결과도 있으나, NK 세포에 의한 효과인지 불분명하다.

NK세포에서 NKG2D 수용체는 매우 중요한 역할을 하는 수용체이다. 구체적으로, NKG2D 수용체는 자연살해세포의 활성 수용체로서 자연살해세포의 살상능을 조절하는 수용체이다. 인간의 경우 NKG2D 수용체에 결합하는 리간드가 최소 8종이 알려져 있다. 인간 NKG2D는 DAP10과 결합되어 있고 DAP10을 통해 세포내에 활성 신호를 전달한다. 생쥐 NKG2D는 DAP10, DAP12와 결합되어 신호전달을 한다. 암세포나 바이러스는 자연살해세포의 공격을 회피하기 위해 이들 리간드를 세포 밖으로 분비하여 자연살해세포로부터 회피한다.

인플루엔저 바이러스, HIV 등 여러 종류의 바이러스는 자연살해세포와 상호작용을 하면서 다양한 면역회피 기능을 갖고 있다. 바이러스는 자연살해세포와 직접 결합하여 자연살해세포 수용체의 신호전달을 억제하거나 혹은 사이토카인 분비를 조절한다. 일부 바이러스는 자연살해세포가 수용체를 통해 리간드를 인식하는 것을 방해한다. Cowpox 바이러스는 OMCP 단백질을 발현하는데 이 단백질은 NKG2D 리간드와 유사하여서 자연살해세포 NKG2D와 리간드의 결합을 억제한다.

이런 면에서 코로나 바이러스는 자연살해세포의 항바이러스 기능을 회피하기 위한 전략이 필요하다. 가능한 전략으로는 코로나 바이러스가 자연살해세포의 억제 수용체를 증가시키거나, HLA-I 단백질을 증가시켜 자연살해세포를 탈진 (exhaustion)시키거나, 혹은 자연살해세포이 가지고 있는 살상물질인 퍼포린이나 그랜자임 등을 감소시키는 것 등이 전략이 될 것이다. 혹은 코로나 바이러스가 자연살해세포의 세포사멸을 유도하여서 세포수를 격감시키는 것이다.

이런 관점에서 본 발명자들은 코로나 바이러스와 자연살해세포 수용체의 직접적인 결합을 살펴보고자 하였고 코로나 바이러스 S 단백질 유래 펩타이드가 NKG2D에 결합하고 자연살해세포의 기능을 조절함을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명자들은 코로나 바이러스 (SARS-CoV-2) 와 자연살해세포의 상호관계를 살펴보기 위해 코로나 바이러스의 Spike (S) 단백질의 펩타이드와 자연살해세포의 수용체인 NKG2D의 결합을 살펴보았고, 이들 펩타이드가 NKG2D의 결합을 통해 자연살해세포의 활성을 증가시킴을 관찰하여 코로나 바이러스가 직접 면역세포기능을 조절함을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에 따라, 본 발명은 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 펩타이드를 제공한다.

본 발명에서는 또한 서열번호 1, 서열번호 2 또는 이들 모두의 펩타이드를 포함하는 자연 살해세포 배양용 조성물을 제공한다.

본 발명은 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 펩타이드로 처리되어 배양된 자연살해 세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 자연살해 세포를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 약학적 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 이들 모두의 펩타이드를 자연살해(Natural Killer) 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 활성이 증진된 자연살해(Natural Killer) 세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 1) 단핵구로부터 CD3 양성인 T세포만을 제거하여 CD3 음성세포를 수득하는 단계; 및

2) 단계 1)의 CD3 음성세포에 IL-15 및 IL-21를 혼합처리하고 서열번호 1, 서열번호 2 또는 이들 모두의 펩타이드를 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 자연살해(Natural Killer) 세포의 제조방법을 제공한다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 발명에서 쓰인 어떤 용어 및 과학적 용어는 당업계의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가지는 것을 의미한다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 단수 형태인 “a”, “an” 및 “the”는 문맥에서 분명히 지시하지 않는 한 복수형 지시대상을 포함한다.

또한, 용어 "선택적" 또는 "선택적으로"는 후속으로 기술되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수 있음을 의미하고, 상기 기술은 상기 사건 또는 상황이 발생한 예시 및 발생하지 않은 예시를 포함한다.

용어의 정의

용어 “자연 살해 세포(NK cell)”는 CD3 음성 CD56 양성의 단핵구를 말하고, 특히 MHC 클래스 I 분자의 발현이 적거나, 상기 발현이 소실되어 있는 세포에 대한 세포 상해 활성을 갖는다.

용어 “사이토카인 유도”, “펩타이드 유도”는 사이토카인 및/또는 펩타이드와 접촉시킴으로서 이를 통해 자연살해 세포를 활성화, 자극, 또는 재자극하는 것을 언급한다. 이러한 유도는 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 36, 48 시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 10일, 12일, 14일, 3주 또는 그 이상 동안 접촉을 의미할 수 있다.

용어 '자극'이란 사이토카인, 펩타이드 등을 첨가하여 자연살해 세포의 특성의 변화를 유도하는 것을 의미한다. '재자극'이란 일정 배양 기간이 경과한 후, 배지에 적절한 사이토카인, 펩타이드 등을 다시 첨가하여 자연살해 세포 증식 및 특성 변화를 재유도하는 것을 의미한다.

본 발명에서 자연살해세포 수용체의 발현 증가 및 감소는 FACS를 통한 평균 Intensity 분석 결과를 기초로 한다. 구체적으로, 미처리된 대조군과 비교하여 %로 증가 및 감소를 표기할 수 있다. 또한, 종래의 일반적인 자연살해 세포, 사이토카인 등으로 자극되지 않은 자연살해세포 등의 발현 수준을 기초로 이와 대비하여 상대적인 증가 및 감소 배수로 나타낼 수 있다.

본 발명에서 “종래의 일반적인 자연살해 세포”란 인체 등으로부터 분리되어 별도의 추가적인 자극 공정 없이 인체에서 분리된 상태 그대로의 특성을 유지하는 자연살해 세포를 의미한다. 구체적으로, 통상의 알려진 자연살해 세포 분리 방법인 CD3 음성 및/또는 CD56 양성과 같은 특성을 지니는 세포를 단핵구 등으로부터 분리하는 방법 등을 통해 수득할 수 있는 자연살해세포를 의미한다.

발명의 내용

본 발명은 서열번호 1(FQFCND, 이하 cov1으로도 언급함) 및/또는 서열번호 2(KCVNFNF, 이하 cov2로도 언급함)의 펩타이드를 제공한다.

본 발명에 따른 펩타이드는 자연살해세포의 NKG2D에 결합하고 자연살해세포의 기능을 조절할 수 있는 기능적 특징을 가진다.

본 발명에 따른 펩타이드로 서열번호 1의 펩타이드는 Sars-CoV-2의 S 단백질의 서열의 133-138번째 아미노산 서열에 해당한다. Sars-CoV-2의 S 단백질 서열은 서열번호 4에 나타내었다.

본 발명의 범주에서 본 발명에 따른 펩타이드는 상기 각각의 S 단백질의 서열에서 위 위치를 포괄하는 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, S 단백질의 서열의 133-138번째 아미노산 서열을 포함하는 서열로 132-138, 131-138, 130-138, 129-138 등과 같이, 상기 133-138 번째 아미노산 서열을 기초로 S 단백질의 앞쪽 서열을 추가로 더 포함할 수 있다. 또한, S 단백질의 서열의 133-138번째 아미노산 서열을 포함하는 서열로 133-139, 133-140, 133-141, 133-142 등과 같이, 상기 133-138를 기초로 S 단백질의 뒤쪽 서열을 추가로 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 S 단백질의 133-138번째 아미노산 서열을 기초로 앞쪽 및 뒤쪽 서열을 추가로 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드로 서열번호 2의 펩타이드는 Sars-CoV-2의 S 단백질의 서열의 537-543번째 아미노산 서열에 해당한다.

본 발명의 범주에서 본 발명에 따른 펩타이드는 상기 각각의 S 단백질의 서열에서 위 위치를 포괄하는 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, S 단백질의 서열의 537-543번째 아미노산 서열을 포함하는 서열로 536-543, 535-543, 534-543, 533-543 등과 같이, 상기 537-543 번째 아미노산 서열을 기초로 S 단백질의 앞쪽 서열을 추가로 더 포함할 수 있다. 또한, S 단백질의 서열의 537-543번째 아미노산 서열을 포함하는 서열로 537-544, 537-545, 537-546, 537-547 등과 같이, 상기 537-543를 기초로 S 단백질의 뒤쪽 서열을 추가로 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 S 단백질의 537-543번째 아미노산 서열을 기초로 앞쪽 및 뒤쪽 서열을 추가로 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상 포함할 수 있다.

본 발명에서, "펩타이드", 및 "단백질"은 호환적으로 사용되며 아미노산 잔기의 중합체에 대한 언급을 포함한다. 상기 용어들을 천연 아미노산 중합체들뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체들에 적용한다. 상기 용어들을 또한 단백질이 작용성으로 남아있도록 보존적인 아미노산 치환을 함유하는 상기 중합체들에 적용한다. 본 발명에서 펩타이드는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 합성된 것일 수 있고, 바람직하게는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관 내에서 합성된 것일 수 있다.

본 발명에서, "생물학적으로 활성이 있는"은 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드와 유사한 구조적 기능, 및/또는 유사한 조절 기능, 및/또는 유사한 생화학적 기능을 갖는 펩타이드 단편 또한 본 발명에 따른 펩타이드를 의미한다.

본 발명은 상기 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 펩타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가지는 것으로, 생물학적 활성이 유지되는 서열을 본 발명의 범주에서 포함할 수 있다.

본 발명에서, "결실"은 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 없는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화로 정의된다.

본 발명에서, "삽입" 또는 "부가"는 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 부가로 인한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화이다.

본 발명에서, "치환"은 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 의해 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 교체에서 비롯된다.

한편, 치환 위치에서 바람직한 아미노산 변이는 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성의 유사성에 기반하여 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니나, 음으로 하전된(negatively charged) 아미노산으로서는 아스파르트산 및 글루타민산을 포함하며; 양으로 하전된(positively charged) 아미노산으로서는 리신 및 아르기닌을 포함하고; 그리고 유사한 친수성값을 가지는 비하전성 극성 헤드기를 가지는 아미노산으로서는 류신, 이소류신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신;을 들 수 있다. 상기 변이는 보존적 치환을 포함할 수 있다. '보존적 치환'이란, 어느 아미노산이 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산으로 치환되어 당업자라면 그 폴리펩타이드의 2차 구조 및 감수성질(hydropathic nature, 소수성 또는 친수성 성질)이 실질적으로 비변화되었다고 예측할 수 있는 치환이다. 일반적으로 하기 아미노산 군이 보존성 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.

경우에 따라서는, 상기 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

본 발명에 있어서, 본원에 기재된 임의의 펩타이드 중 하나 이상을 코딩하는 핵산 서열(뿐만 아니라 핵산 서열을 함유하는 핵산 벡터), 및 이를 생산하는 방법을 포함한다.

본원에 기재된 하나 이상의 펩타이드의 재조합 발현을 위한 핵산 서열 및 벡터(예컨대, 발현 벡터)를 제작하기 위한 적합한 방법은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 예컨대, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition vol. 1, 2 and 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, USA, Nov. 1989]에 기재되어 있고, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다. 핵산 및 벡터는, 예컨대, 박테리아, 효모, 또는 포유동물 세포를 포함하는 광범위한 숙주 세포에서 펩타이드를 발현하는데 사용될 수 있다. 핵산 및 벡터는 또한, 예컨대, 하기에 기재된 바와 같은 생체내 및 생체외 방법에서 사용될 수 있다. 펩타이드 코딩 서열은 프로모터, 조절 요소, 또는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터 및/또는 인핸서 요소는 핵산에 의해 코딩된 펩타이드의 발현을 지시할 수 있다. 인핸서는 시간, 위치, 및 수준의 측면에서 발현 특이성을 제공한다. 프로모터와 달리, 인핸서는 프로모터가 존재하면 전사 개시 부위로부터 가변적인 거리에 위치할 때 기능할 수 있다. 인핸서는 또한 전사 개시 부위의 하류에 또는 관련 유전자의 엑손에 위치할 수 있다. 코딩 서열을 프로모터의 제어 하에 두기 위해, 펩타이드의 번역 리딩 프레임의 번역 개시 부위를 프로모터의 하류(3')의 1 내지 약 50 뉴클레오타이드 사이에 위치시킬 필요가 있다.

관심있는 프로모터는, 비제한적으로, 사이토메갈로바이러스 hCMV 즉시 초기 유전자, SV40 아데노바이러스의 초기 또는 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, 파아지 A의 주요 조작자 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질의 제어 영역, 3 포스포글리세레이트 키나제에 대한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 및 효모 α 교배 인자의 프로모터, 아데노바이러스 EIb 최소 프로모터, 또는 티미딘 키나제 최소 프로모터를 포함한다.

재조합 벡터는 다양한 방법을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있고, 상기 방법은, 적어도 부분적으로, 핵산이 도입되는 세포의 유형에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 세포는 전기천공 또는 열 충격과 같은 방법을 사용하여 형질전환될 수 있다. 효모 세포를 형질감염시키기 위한 방법은, 예컨대, 스페로플라스트(spheroplast) 기술 또는 전체-세포 염화리튬 효모 형질전환 방법을 포함한다(예컨대, 미국 특허 제4,929,555호; Hinnen et al.(1978) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito et al.(1983) J. Bacteriol. 153: 163; 미국 특허 제4,879,231호; 및 Sreekrishna et al.(1987) Gene 59: 115 참고, 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 동물 세포의 형질감염은, 예를 들어, 인산칼슘, 전기천공, 열 충격, 리포솜, 또는 형질감염 시약, 예컨대 FUGENE® 또는 LIPOFECT AMINE®을 사용하거나, 또는 네이키드(naked) 핵산 벡터를 용액 중의 세포와 접촉시킴으로써 벡터를 세포에 도입하는 것을 특징으로 할 수 있다(예컨대, 상기 Sambrook et al 참고).

본원에 기재된 펩타이드의 소규모 또는 대규모 생산에 사용될 수 있는 발현 시스템은, 비제한적으로, 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물; 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 진균(예컨대, 효모(예를 들어, 사카로마이세스 및 피키아)); 재조합 바이러스 발현 벡터로 감염된 곤충 세포 시스템(예를 들어, 배큘로바이러스); 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 및 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, CMV 프로모터, SV40 프로모터, 또는 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 작제물을 갖는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, VERO, HeLa, MDCK, WI38, 및 NIH 3T3 세포)을 포함한다. 또한, 플라스미드 벡터로 형질감염되거나 또는 바이러스 벡터(예컨대, 특히 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 약독화 백시니아 바이러스, 카나리아수두 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스와 같은 바이러스 벡터)로 감염된 포유동물로부터 직접 수득된 일차 또는 이차 세포가 숙주 세포로서 유용하다.

본원에 기재된 임의의 펩타이드의 발현 후, 펩타이드는 표준 기술을 사용하여 배양 세포로부터, 또는 세포가 배양된 배지로부터 단리될 수 있다. 단백질을 단리하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예컨대, 액체 크로마토그래피(예컨대, HPLC), 친화성 크로마토그래피(예컨대, 금속 킬레이션 또는 면역친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피, 소수성-상호작용 크로마토그래피, 침전, 또는 차등 가용화(differential solubilization)를 포함한다.

펩타이드(예컨대, 200개 미만(예컨대, 175개 미만, 150개 미만, 125개 미만, 100개 미만, 90개 미만, 80개 미만, 70개 미만, 또는 60개 미만)의 아미노산을 갖는 펩타이드)는 FMOC 고상 합성과 같은 표준 화학적 방식에 의해 화학적으로 합성될 수 있다.

상기 조성물을 투여하고 배양된 자연 살해 세포는, 다른 사이토카인을 투여하여 배양한 군에 비하여, IFN-감마 (interferon-gamma)의 분비가 증가된 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물을 투여하고 배양된 자연 살해 세포는, 다른 사이토카인을 투여하여 배양한 군에 비하여, 암세포에 대한 세포 독성이 증가한 것일 수 있고, 암세포의 세포사멸(apoptosis)을 촉진하는 것일 수 있다.

상기 자연살해 세포는, 예를 들면, 포유동물, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 자연살해 세포는 정상인 또는 암환자로부터 수득한 것일 수 있다. 상기 자연살해 세포는 혈액, 말초혈액 단핵구(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC)로부터 분리된 것일 수 있다. 혈액을 분리하는 방법, 이로부터 PBMC를 분리하는 방법, 이로부터 자연살해 세포를 분리하는 방법은 공지된 방법으로 수행되는 것 일 수 있다. 상기 자연살해 세포는 CD3- 및 CD56+의 표면 항원 특성을 갖는 것일 수 있다.

자연살해 세포 배양 배지 중에 상기 펩타이드들의 농도는 예를 들어 약 1 nM 내지 1000 nM, 10 nM 내지 800 nM, 20 nM 내지 600 nM 등일 수 있으며, 해당 조건은 배양하는 환경 및 조건에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에 따른 배양 배지는 보다 바람직하게 사이토카인을 더 포함할 수 있으며, 이러한 사이토카인은 예를 들어, IL-15, IL-21, IL-2 등을 포함하며, 보다 바람직하게 IL-15 및 IL-21를 포함한다. IL-15, IL-21는 각각 5 ng/ml 내지 50 ng/ml, 바람직하게 10 내지 30 ng/ml로 처리할 수 있다.

상기 배지는 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 물질을 의미한다. 상기 배지는 세포 배양에 이용될 수 있는 것이라면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, MEM-α (Minimal Essential Medium-α), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax Ⅱ complete 배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, 및 Chang's Medium 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

상기 배지는 영양성분이나, pH 조정제, 항생물질, 알부민, 혈청 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 그 외 배양조건은 통상의 자연 살해세포 배양 조건에 따른다.

예를 들어, 배양은 통상의 세포배양 조건 즉, 약 37℃, CO₂ 배양기에서 수행될 수 있으며, 배양액을 2일 혹은 3일에 한 번씩 첨가해 주면서 계속적으로 배양할 수 있다. 배양기간은 예를 들면 7~20일, 8~18일, 10~16일, 10~15일 또는 10~14일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 원하는 자연살해 세포 수의 수득을 위해 상기 배양일 수 범위 내 또는 범위 밖에서 적절히 설정할 수 있다. 배양 용기는, 상업적으로 입수 가능한 디쉬, 플라스크, 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 배양백을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 이들 모두의 펩타이드를 자연살해 (Natural Killer) 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 활성이 증진된 자연살해(Natural Killer) 세포의 제조방법을 제공한다.

상기 활성이 증진된 자연살해 세포의 제조 방법은 앞서 배지에서 언급된 사항이 적절히 적용될 수 있다.

또한, 상기 배양하는 단계 전에, 말초혈액으로부터 말초혈액 단핵구(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC)를 수득하는 단계; 및 수득된 PBMC로부터 자연살해 세포를 분리하는 단계;를 더 포함하는 것일 수 있다.

2) 단계 1)의 CD3 음성세포에 IL-15 및 IL-21를 혼합처리하고, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 이들 모두의 펩타이드를 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 자연살해(Natural Killer) 세포의 제조방법을 제공한다.

바람직하게, 상기 단계 1)은 CD3 양성인 T 세포와 적혈구가 교차결합하도록 한 후 원심분리 시 밀도구배를 이용하여 CD3 음성세포를 분리함으로써 수행되는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 1)의 CD3 양성인 T 세포와 적혈구가 교차결합하도록 한 후 원심분리 시 밀도구배를 이용하여 CD3 음성세포의 분리는 CD3 음성세포를 이용하는 항체를 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 STEMCELL Technologies 사에서 제조, 판매하는 RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail 이라는 제품을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 제품은 CD3, CD4, CD19, CD36, CD66b, CD123, 및 글라이코포린 A(glycophorin A)을 인식하는 사합체 항체(tetrameric antibody)의 칵테일(cocktail)이다. CD3 양성 세포, CD4 양성 세포, CD19 양성 세포, CD36 양성 세포, CD66b 양성 세포, CD123 양성 세포는 글라이코포린 A를 발현하는 적혈구와 함께 사합체 항체에 결합하여 교차결합을 이룬다. 그 후 원심분리를 하면 상기 세포들은 밀도구배에 의해 펠렛을 이루고, 상층부에서 CD3 음성인 자연살해 세포가 고농도로 밀집된 배지를 수득할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 단계 2)의 배양은 10 내지 24일간 배양하는 것일 수 있으나, 배양된 세포가 CD3^-CD56⁺의 특징을 나타내는 것을 확인함으로써 배양기간을 결정할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 배양은 정치배양(stationary culture) 또는 부유배양(suspension culture) 방법을 사용할 수 있고, 정치배양은 배양기에 교반(agitating) 또는 진탕(shaking)없이 방치한 상태에서 배양하는 것을 의미하며, 부유배양은 통기(aeration)나 교반 등을 통해 세포들이 반응기의 하부 또는 측면부에 부착되지 않고 현탁된 상태에서 배양하는 것을 의미한다. 또한, 정치배양을 위한 반응기와 부유배양을 위한 반응기는 동일한 것일 수도 있고, 상이한 것일 수도 있다. 예를 들어, 정치배양을 위한 반응기와 부유배양을 위한 반응기가 동일한 것인 경우에는 동일한 반응기에서 정치배양이 완료된 후, 사이토카인 등의 필요한 영양성분을 포함하는 배지를 추가적으로 공급하여 부유배양 방식으로 배양하는 것이 가능하며, 상이한 종류의 배양기를 사용하는 경우에는 정치배양이 완료된 후에 배양물을 부유배양을 위한 반응기로 옮겨 부유배양 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 자연살해 세포는 CD3^-CD56⁺인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 자연 살해 세포는, IFN-감마 (interferon-gamma)의 분비가 증가된 것일 수 있다. 또한 세포 독성이 증가한 것일 수 있고, 암세포의 세포사멸(apoptosis)을 촉진하는 것일 수 있다. 또한, vav1 (Vav Guanine Nucleotide Exchange Factor 1)활성이 증진된 것일 수 있다.

즉, 우수한 자연살해 세포 활성화 수용체 발현능, 암세포, 바이러스 감염 세포 및 특정 면역 세포 등에 대한 우수한 살상능, 높은 인터페론-γ의 발현 등을 통해 기능적으로 우수한 자연살해 세포가 제공된다.

보다 바람직하게 본 발명에 따른 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 펩타이드로 처리되어 배양된 자연살해 세포는 앞서 언급된 배양 공정들을 통해 제조된 세포일 수 있다.

본 발명은 상기 방법으로 제조된 자연살해 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 방법으로 제조된 자연살해 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 “세포치료제(cellular therapeutic agent)"를 의미한다. 본 발명의 용어 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"란, 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 제제화할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 액제, 현탁제, 분산액, 유제, 겔제, 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 주사제가 될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 주사제로 제제화하는 경우, 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여 주사제로 사용가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 주사제는 안정화제 또는 용해 보조제와 함께 주사용수에 용해시킨 후, 멸균처리, 특히 고온감압멸균법 또는 무균여과법에 의해 멸균처리하여 제조될 수 있다. 상기 주사용수로는 주사용 증류수 또는 주사용 완충용액, 예를 들어 pH 3.5 내지 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨(NaH₂PO₄)-구연산 완충용액을 사용할 수 있다. 사용되는 인산염은 나트륨염 또는 칼륨염 형태이거나 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하고, 구연산 또는 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하다.

또한, 본 발명에서 사용되는 안정화제는 나트륨 피로설파이트(sodium pyrosulfite), 중아황산나트륨(NaHSO₃), 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₃) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)을 포함하고, 용해 보조제는 수산화나트륨(NaOH), 탄산수소나트륨(NaHCO₃), 탄산나트륨(NaCO₃) 또는 수산화칼륨(KOH)과 같은 염기, 또는 염산(HCl) 또는 아세트산(CH₃COOH)과 같은 산을 포함한다.

본 발명에 따른 주사제는 생체흡수성, 생체 분해성, 생체적합성으로 제형화될 수 있다. 생체흡수성이라 함은 주사제가 체내에서, 분산된 주사제의 분해 또는 분해 없이, 초기 적용에서 사라질 수 있음을 의미하는 것이다. 생체 분해성은 가수분해 또는 효소 분해에 의해 주사제가 체내에서 파쇄 또는 분해될 수 있음을 의미한다. 생체적 합성은 성분 모두가 체내에서 무독성임을 의미한다.

본 발명에 따른 주사제는 통상의 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 계면활성제 등의 희석제, 또는 부형제 등을 사용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 유효성분은 목적에 따라 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 피하, 자궁내 경막, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로 등을 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 정맥내로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 유효성분은 주사 또는 카테터로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 유효성분의 투여량은 체중 60 kg 성인기준으로 1 x 10¹- 1 x 10⁵⁰개/ kg, 바람직하게는 1 x 10¹ - 1 x 10³⁰개/ kg, 보다 바람직하게는 1 x 10⁵ - 1 x 10²⁰개/ kg, 가장 바람직하게는 1 x 10⁷- 1 x 10⁹개/ kg의 범위 내에서 조절할 수 있다. 다만, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서 유효성분은, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 함유될 수 있다. 그러나 함량은 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 상기 방법으로 제조된 자연살해 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 자연살해 세포에 의해 치료될 수 있는 암이면 제한이 없으며, 예컨대 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 대장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 대장암, 폐암, 간암, 췌장암 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 암일 수 있다.

본 발명은 상기 방법으로 제조된 자연살해 세포를 포함하는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 감염성 질환은 바이러스 또는 병원균의 감염에 의해 발생하는 질환으로, 호흡기 및 혈액, 피부접촉 등을 통해 전염되어 감염될 수 있는 질환을 모두 포함하는 개념이다.

이러한 감염성 질환의 비제한적인 예로서는 B형 및 C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus: HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환, 인플루엔자 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로 바이러스성 호흡기 질환은 Sars-Cov-2 감염 질환일수도 있다. 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염에 따른 질환은 호흡기 질환일 수 있다. 상기 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환은 예를 들어 바이러스 감염 후 2일 내지 14일의 잠복기를 거친 뒤 증상이 나타날 수 있다. 이러한 증상은 예를 들어, 고열, 기침, 숨가쁨, 폐렴, 설사와 같은 위-장관 증상, 기관 기능 부전(신부전, 신장 기능장애 등), 패혈성 쇼크, 심한 경우 사망을 포함하여, 상기 바이러스 감염에 의해 발생되는 증상이라면 어떠한 것이라도 포함된다

본 발명은 상기 자연살해 세포를 암 치료가 필요한 대상체에게 치료학적으로 유효한 양으로 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 자연살해 세포를 감염성 질환 치료가 필요한 대상체에게 치료학적으로 유효한 양으로 투여하여 감염성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어 치료가 필요한 대상체는 인간을 포함하는 포유류가 될 수 있다. 예를 들어 인간, 개, 고양이, 말 등이 될 수 있다.

본 발명은 암 및/또는 감염성 질환 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 자연살해 세포의 용도를 제공한다.

암 및/또는 감염성 질환 치료에 사용하기 위한 상기 자연살해 세포를 제공한다.

본 발명에 따라 제조된 자연살해세포는 자연살해세포의 살상능, IFN-γ 생산능 등에서 개선된 활성을 가짐으로써 바이러스 감염에 대한 치료제, 면역 치료제, 암 치료제 등으로써 다양한 용도로 활용될 수 있다. 특히, 코로나 바이러스 S 단백질 유래 펩타이드를 통해 자연살해세포의 기능을 직접 조절함으로서 우수한 활성을 나타낼 수 있는 자연살해세포를 제조할 수 있다는 점에서도 또한 우수한 발명의 특징을 가진다.

도 1의 A는 코로나 바이러스 (SARS-CoV-2)의 S 단백질의 전체 아미노산 서열과 첫째 펩타이드 (FQFCND, cov1 peptide #1, 133-138번째 사이의 펩타이드), 두 번째 펩타이드 (KCVNFNF, cov2 peptide #2, 537-543번째 사이의 펩타이드), 대조군 펩타이드 (QELGKYE, control peptide, 1201-1207번째 펩타이드) 위치를 나타낸다 (붉은색). 여기서, 밑줄 부분은 코로나 바이러스가 타겟세포 수용체인 ACE2에 결합하는 수용체 결합 도메인을 나타낸다.
도 1의 B 및 C는 cov1 peptide #1과 NKG2D의 결합 예측도 (B)와 cov2 peptide #2과 NKG2D의 결합 예측도 (C)를 나타낸다.
도 2의 A는 FITC가 결합된 대조군 펩타이드와 cov2 펩타이드가 NK92세포와 결합하는 것을 유세포 분석기로 분석한 도면이다. cov2 펩타이드는 자연살해세포와 잘 결합을 하였지만 대조군 control 펩타이드는 자연살해세포와 전혀 결합을 하지 않음을 확인한 결과를 나타낸다. 또한, 도 2의 B는 이의 결합정도를 정량적으로 표시한 결과를 나타낸다. 도 2의 C는 FITC가 결합된 대조군 펩타이드와 cov2 펩타이드가 primary NK세포와 결합하는 것을 유세포 분석기로 분석한 도면이다. cov2 펩타이드는 자연살해세포와 잘 결합을 하였지만 대조군 control 펩타이드는 자연살해세포와 전혀 결합을 하지 않음을 확인한 결과를 나타낸다. 도 2의 D는 이의 결합정도를 정량적으로 표시한 결과를 나타낸다.
도 3은 펩타이드가 자연살해세포 살상능를 증가시키는 결과를 나타낸다. 도 3의 A는 대조군 펩타이드 첨가한 경우의 살상능보다 cov1, cov2 펩타이드를 첨가한 경우에서 H460 폐암세포주에 대한 살상능이 더욱 증가함을 확인한 결과를 나타낸다. 또한, 도 3의 B는 다른 폐암세포주인 H385, H3122 세포에 대한 살상능도 증가함을 나타낸다. 도 3의 C는 Primary 자연살해세포를 사용하였을 경우에도 H460 폐암세포주에 대한 살상능을 cov1 펩타이드, cov2 펩타이드가 증가시키는 것을 나타낸다. (*p<0.05; **p<0.01, student t-test).
도 4는 펩타이드가 자연살해세포의 IFN-γ의 생산에 미치는 영향을 분석한 결과이다. NK-92세포와 H460 폐암세포의 co-culture시 다양한 농도의 펩타이드를 처리하고 24시간 후에 배양액에서의 IFN-γ 생산을 측정한 결과이다.
도 5는 펩타이드가 자연살해세포 세포사멸에 미치는 효과를 분석한 결과이다. 도 5의 A는 펩타이드를 단독으로 primary NK세포에 48시간을 처리하였을 시, primary NK세포의 세포사멸에는 효과 측정한 결과(도면 5A)이며, 도 5의 B는 primary NK와 H460 폐암세포주의 48 시간 co-culture시 펩타이드가 primary NK세포의 세포사멸에 미치는 효과를 측정한 결과이다 (도면 5B).
도 6은 cov1, cov2 펩타이드가 vav1 활성을 통해 자연살해세포의 활성을 유도함을 확인한 결과를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> NK92 세포, 폐암 세포주 H460 세포 및 primary NK 세포 배양

NK92 세포 배양

NK92 세포는 5 % CO₂가 공급되는 37 ℃ water jacketed incubator (Thermo electron corporation) 에서 배양하였다. ATCC 배양조건을 따라 12.5 % Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV) 과 12.5 % Horse serum (Gibco)을 첨가한 alpha-MEM (Welgene) 배양액에 0.2 mM myo inositol, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.02 mM folic acid, 1 % antibiotics-antimycotic (Gibco) 와 IL-2 cytokine (Peprotech) 20 ng/ml 농도로 첨가하여 배양액으로 사용하였다. 세포는 1x10⁵/ml 의 농도로 75T Flask (Thermo)에 20-30 ml 정도로 배양하였으며, 2-3일 마다 1000 rpm, 5분 동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 배양액을 교환하였다.

폐암 세포주 H460 세포 배양

살상능 시험에서 타겟 세포주로 폐암 세포주인 H460을 배양하여 사용하였다. H460 세포는 ATCC 배양조건을 따라 10 % Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV)이 첨가된 RPMI (Welgene)배양액에 1 % antibiotics-antimycotic (Gibco)를 추가한 배양액을 사용하였으며, 5 % CO₂가 공급되는 37 ℃ water jacketed incubator (Thermo electron corporation) 에서 배양하였다. 세포는 2x10⁵/ml 의 농도로 100mm x 20mm cell culture dish (corning) 에 10 ml 정도로 배양하였다. 2-3일 마다 세포 관찰 및 배양액 교환을 해주었으며, H460은 부착세포이기 때문에 배양액 교환시 상층액을 모두 덜어내어, 0.25% Trysin-EDTA (Gibco) 2 ml로 3분간 37 ℃에서 반응 시킨 후, 부착세포를 때어내어 1000 rpm, 5분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 새로운 배양액으로 교환하는 방법을 사용하였다.

primary NK 세포 배양

병원으로부터 기증받은 제대혈 (IRB승인번호 P01-201610-31-002)에 혈액 ml 당 2 ul 씩 Rosettesep cocktail (STEMCELL technologies)을 첨가하여 20분간 반응시킨 후, 15ml씩 분주된 Ficoll (GE healthcare, Ficoll-paque premium) 에 Rosettesep 반응시킨 혈액 35ml 씩 서서히 올린다. 이때 혈액과 ficoll층이 섞이지 않도록 주의해야 한다. 혈액에서의 세포층 분리를 위해 2000 rpm, Decel 0, 25분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 혈액으로부터 적혈구 및 CD3 세포를 분리 배출한다. CD3가 분리된 세포를 ACK buffer 10ml로 10분 동안 반응시켜 남아있는 적혈구를 제거해 준 후, 2% Fetal Bovine Serum가 첨가된 PBS(phosphate-buffered saline)를 사용하여 2회 washing을 진행하였다. washing은 1500 rpm, 5분간 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이렇게 얻어진 세포를 사용하여 NK 세포로 배양을 진행하였다.

NK 세포 배양 조건은 10 % Fetal Bovine Serum(Corning, united states origin, 35-015-CV)을 첨가한 alpha-MEM (Welgene) 에 10 ng/ml IL-15(Peprotech), 10 ng/ml IL-21(Peprotech), 10^-6M HC(Peprotech)과 1 % antibiotics-antimycotic (Gibco)를 추가하여 배양하였다. 세포배양농도는 2x10⁶/ml 의 농도로 6 well plate에 배양하였으며, 2-3일 마다 1200 rpm, 5분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 배양액을 교환하였다.

NK세포의 분화정도는 3일마다 FACSCanto II (BD Biosciences) 유세포 분석기로 확인하였다.

FACS 분석은 2x10⁴ 세포를 각 FACS tube (Falcon) 에 담아 FACS buffer로 사용되는 Fetal Bovine Serum가 첨가된 PBS(phosphate-buffered saline) 로 1500 rpm, 3분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 washing을 해준 후 상층액을 제거하여 100 ul의 FACS buffer를 첨가하였다. CD56 APC (BD) antibody와 CD3 PE (BD) antibody를 각각 1ul 씩 첨가한 후 4℃에서 20분간 염색 한 후, FACS buffer를 500ul씩 추가하여 1500 rpm, 3분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 washing 한다. 상층액을 제거한 후 200 ul의 FACS buffer를 첨가하여 FACSCanto II (BD Biosciences)로 분석을 진행한다.

보통 배양 7-9 일째 CD56 분화도가 90% 정도 확인되었으며, 분화가 확인된 NK세포를 사용하여 실험을 진행하였다.

<실시예 2> Sars-Cov2의 S 단백질 유래 펩타이드의 제조

SARS-CoV-2 바이러스는 S 단백질을 통해 세포표면에 결합을 하고 세포내로 침투를 한다. S 단백질과 자연살해세포 수용체인 NKG2D의 결합을 살펴보기 위해, S 단백질 유래 펩타이드 중에 NKG2D에 결합할 수 있는 펩타이드를 염기서열 분석을 통해 탐색하였고 이중 결합 확률이 높은 2개의 펩타이드를 선별하였다 (도면 1A). 첫째 펩타이드는 6개의 아미노산으로 구성되었고 (FQFCND, cov1 peptide #1-서열번호 1) S 단백질의 133-138번째 사이의 펩타이드이다. 두 번째 펩타이드는 7개의 아미노산을 구성되었고 (KCVNFNF, cov2 peptide #2-서열번호 2) S 단백질의 537-543 번째 사이의 펩타이드이다. 대조군 펩타이드 (con peptide)는 7개의 아미노산으로 (QELGKYE, control peptide-서열번호 3)구성된 S 단백질의 1201-1207번째 펩타이드이다.

이들 펩타이드와 NKG2D의 결합을 PepSite2 단백질-펩타이드 결합예측 프로그램으로 분석하여 보았다. cov1 (도면 1B) 및 cov2 (도면 1C) 펩타이드가 NKG2D의 표면 단백질과 잘 결합할 수 있는 구조를 가지고 있음을 예측할 수 있었다.

위 내용을 기초로 펩타이드 합성을 수행하였다. Control 펩타이드(Q-E-L-K-Y-E), cov1 펩타이드(F-Q-F-C-N-D), cov2 펩타이드 (K-C-V-N-F-N-F)를 peptron사로부터 제작하였다. 추가로 FITC-control 펩타이드 (FITC-Ahx-Q-E-L-K-Y-E), FITC-cov2 펩타이드 (FITC-Ahx-K-C-V-N-F-N-F)를 peptron사로부터 제작하였다. 펩타이드를 각 용매액에 녹인 후 100uM 농도로 분주하여 deep freezer에 보관하였다.

<실시예 3> 펩타이드와 NK세포의 결합 분석

NK92 2x10⁴ 세포를 각 FACS tube에 담아 FACS buffer로 사용되는 Fetal Bovine Serum가 첨가된 PBS(phosphate-buffered saline) 로 1500 rpm, 3분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 washing을 해준 후 상층액을 제거하여 100 ul의 FACS buffer를 첨가하였다. Control FITC와, cov2 FITC를 각 농도에 맞게 10 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 300 nM 씩 첨가하여 4℃에서 20min 동안 염색하였다. 염색이 완료한 세포를 FACS buffer를 500ul씩 추가하여 1500 rpm, 3분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 washing 하였다. 상층액을 제거한 후 200 ul의 FACS buffer를 첨가하여 FACSCanto II (BD Biosciences)로 분석을 진행하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다.

cov2 펩타이드는 농도의존적으로 NK-92 세포와 잘 결합을 하였지만 대조군 펩타이드는 자연살해세포와 전혀 결합을 하지 않음을 확인할 수 있었고 (도면 2A,B), 동일한 펩타이드들의 primary 자연살해세포와 결합을 분석하였을 때도 cov2 펩타이드만 농도의존적으로 결합함을 관찰할 수 있었다 (도면 2C,D). 이로써 cov2 펩타이드가 선택적으로 자연살해세포와 결합함을 확인하였다.

<실시예 4> 펩타이드 농도별 살상능 비교

기존 NK92 배양액 조건에서 12.5 % Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV) 과 12.5 % Horse serum (Gibco)을 대신하여 0.1% BSA를 첨가된 NK92 media에 NK92 세포를 5% CO₂가 공급되는 37℃ incubator에서 overnight 배양 하였다. 1000 rpm, 5 min 원심분리를 하여 기존 배양액의 상층액을 버린 후, 1x10⁵ / ml 농도로 다시 새로운 0.1% BSA 배양액을 첨가해주었다. 이후, NK92 세포에 펩타이드 (control, cov1, cov2)를 0 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM 농도로 2시간 동안 37℃ incubator에서 반응 시킨 후, 살상능 시험의 effect 세포로 사용하였다. 살상능 시험은 calcein-AM법으로 진행하였다.

살상능 시험은 먼저 타겟 세포인 H460 세포를 1x10⁶ 세포 /1ml 배양액에 calcein-AM (invitrogen) 5 ul 첨가하여 1시간동안 37℃ incubator에서 staining 한 후 1000 rpm, 5분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 washing 한다. Calcein-AM 염색된 타겟 세포를 각 조건의 effect 세포에 확인하고자 하는 비율대로 세포수를 계산하여 96well round plate (corning)에 넣어준 후 100 rcf, 1분간 원심분리 하여 37 ℃에서 4시간동안 incubation 한다. NK92 세포가 effector로 사용될 경우 E:T 비율은 20:1로 하였으며, primary NK의 경우는 살상능이 높게 나오기 때문에 E:T 비율을 10:1로 진행하였다. 이후 100 rcf, 5 분 원심분리 후 상층액만을 사용하여 96well black plate에 100ul 씩 조심스레 옮겨준 후 ELISA(형광 480nm/ 530nm, MD) 분석을 하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다.

NK92 세포에 cov1 펩타이드, cov2 펩타이드 모두 농도별로 첨가 시, 살상능이 증가하는 것으로 보였으며, 특히 control 펩타이드 첨가한 경우의 살상능보다 cov1, cov2 펩타이드를 첨가한 경우에서 살상능이 더욱 증가함을 확인하였다 (도면 3A).

또한, 다른 폐암세포주인 H385, H3122세포를 타겟으로 하여, 펩타이드 100 nM의 농도로 처리한 NK92에서의 살상능을 비교하였다. 펩타이드를 처리한 경우 H385, H3122세포에 대한 살상능이 증가됨을 알 수 있었다 (도면 3B).

한편 Primary 자연살해세포에 대한 효과를 측정하기 위해 각각의 펩타이드를 분화된 자연살해세포에 100 nM 첨가하여 2시간 반응시킨 후, 폐암세포주인 H460을 타겟으로 하여 살상능을 시험한 결과, 펩타이드를 첨가하지 않은 군과 control 펩타이드 100 nM을 첨가한 군보다 cov1 펩타이드, cov2 펩타이드 100 nM 첨가한 군에서 살상능이 증가하는 것을 확인하였다 (도면 3C).

<실시예 5> IFN-γ 측정

기존 NK92 배양액 조건에서 12.5 % Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV) 과 12.5 % Horse serum (Gibco)을 대신하여 0.1% BSA를 첨가된 NK92 media에 NK92 세포를 5% CO₂가 공급되는 37℃ incubator에서 overnight 배양 하였다. 1000 rpm, 5 min 원심분리를 하여 기존 배양액의 상층액을 버린 후, 1x10⁵ / ml 농도로 다시 새로운 0.1% BSA 배양액을 첨가해주었다. 이후, NK92 세포에 펩타이드 펩타이드 (control, cov1, cov2)를 0 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM 농도로 2시간 동안 37℃ incubator에서 반응 시킨 후, 24시간, 48 시간 상층액을 모았다. 또한, H460 폐암세포주를 1x10⁵/ml 농도로 각 well에 1일전 미리 배양하여 부착시킨 후, 각 농도별로 peptide를 2시간 동안 전처리한 NK92 co-culture하여 24시간, 48시간 37 ℃ incubator에서 배양하면서 상층액을 모았다. Human IFN Gamma uncoated ELISA kit (invitrogen) 를 사용하여 얻어진 상층액의 IFN-γ 양을 ELISA (흡광 450nm, MD) 분석을 하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다.

NK세포가 활성화가 되면 IFN-γ를 생산하는데, 본 발명에 따른 cov1, cov2 펩타이드를 처리한 경우에서 control 펩타이드를 처리한 경우에 비해 IFN-γ 생산이 증가함을 알 수 있었다 (도면 4).

<실시예 5> 세포사멸 측정

펩타이드가 자연살해세포의 활성을 증가시키는 결과를 바탕으로 펩타이드를 오랜시간 처리하였을 때 면역세포들에서 관찰되는 activation-induced cell death (활성유도 세포사멸)을 측정하였다.

기존 NK 배양액 조건에서 12.5 % Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV) 과 12.5 % Horse serum (Gibco)을 대신하여 0.1% BSA를 첨가된 NK92 media에 NK92 세포를 5% CO₂가 공급되는 37℃ incubator에서 overnight 배양 하였다. 1000 rpm, 5 min 원심분리를 하여 기존 배양액의 상층액을 버린 후, 1x10⁵ / ml 농도로 다시 새로운 0.1% BSA 배양액을 첨가해주었다. 이후, NK 세포에 펩타이드(control, cov1, cov2)를 0 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM 농도로 첨가하여 37℃ incubator에서 배양하면서, 48시간 동안 배양하였다. 또한 전날 H460 폐암세포주를 같은 비율인 1x10⁵/ml 농도로 각 well에 미리 배양하여 부착시킨 후, 각 농도별로 펩타이드가 첨가된 NK세포와 co-culture하여 48시간 37 ℃ incubator에서 배양하면서 세포를 얻었다.

이렇게 얻은 세포는 FACS tube에 담아 FACS buffer로 사용되는 Fetal Bovine Serum가 첨가된 PBS(phosphate-buffered saline) 로 1500 rpm, 3분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 washing을 해준 후 상층액을 제거하여 100 ul의 FACS buffer를 첨가하였다. CD56 APC (BD) FACS antibody를 1ul 첨가하여, ice에서 20분 incubation 하였다. 그 후 1700 rpm, 분 centrifuge로 washing 하여 다시 200 ul의 FACS buffer를 첨가한 후 Annexin IV와 7-AAD (BD) 1ul씩 추가하여 ice에서 15min 뒤 FACS 분석을 진행하였다. FACS 기기는 FACSCanto II (BD Biosciences)로 찍었으며, Flowjo v10으로 분석하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 펩타이드를 단독으로 primary NK세포에 48시간을 처리하였을 때, 살상능 유도와는 달리 NK세포의 세포사멸에는 커다란 차이가 없었다 (도면 5A). 또한 primary NK와 H460 폐암세포주를 co-culture하면서 펩타이드를 처리하였을 때도 NK세포의 세포사멸에는 커다란 영향을 주지 못하였다 (도면 5B). 이러한 결과로부터, 펩타이드가 자연살해세포의 세포사멸에는 영향을 주지 않음을 관찰할 수 있었다.

<실시예 6> vav1 신호전달 측정

기존 NK92 배양액 조건에서 12.5 % Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV) 과 12.5 % Horse serum (Gibco)을 대신하여 0.1% BSA를 첨가된 NK92 media에 NK92 세포를 5% CO₂가 공급되는 37℃ incubator에서 overnight 배양 하였다. 1000 rpm, 5 min 원심분리를 하여 기존 배양액의 상층액을 버린 후, 1x10⁵ / ml 농도로 다시 새로운 0.1% BSA 배양액을 첨가해주었다. 이후, NK92 세포에 세포에 펩타이드(control, cov1, cov2)를 100 nM 농도로 첨가하여 37℃ incubator에서 0분, 5분, 10분, 30분 동안 배양하였다. 세포는 즉시 13,000 rpm에서 5분 원심분리를 하여 상층액은 버리고, 세포만을 얻었다. RIPA II cell lysis buffer (genDEPOT) 에 protease inhibitor 와 phosphotase inhibitor를 첨가한 buffer를 100ul을 넣어 세포를 잘 풀어준 후, ice에서 15분간 lysis 시켰다. 13,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액만을 얻어 농도를 측정하였다.

단백질 농도측정은 pierce BCA protein Assay (thermo)를 사용하여 진행하였으며, ELISA (흡광 562nm, MD) 기기로 측정한 후 농도값을 얻었다.

10ug의 농도로 동일하게 SDS-PAGE에 전기영동을 진행한 후 immobilon-P transfer membrane(0.45um size, Merck millipore) 에 30v로 overnight transfer 하였다.

Transfer된 membrane을 5% skim milk(LPS solution) 10ml로 1시간동안 blocking 한 후, PBST (phosphate-buffered saline + tween 20) 로 5분씩 3회 washing을 한다. 1차 항체인 vav (Santa Cruz Biotechnology), p-vav (Santa Cruz Biotechnology), beta-actin (Santa Cruz Biotechnology)를 1% BSA로 1000:1로 희석하여 각 확인하고자 하는 membrane에 10ml씩 넣어준 후 1시간 30분간 반응시킨다. 다시 PBST (phosphate-buffered saline + tween 20)로 5분씩 3회 washing 한 후 2차 항체인 mouse IgG를 PBST로 3000:1로 희석하여 10ml씩 넣어준 후 1시간동안 반응시킨 후 다시 PBST (phosphate-buffered saline + tween 20)로 10분씩 3회 washing 하여 disposal(ATTA, LuminoGraph) 기기로 확인 하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다.

cov1, cov2 펩타이드를 5, 10, 30분 처리하였을시 vav1의 인산화가 뚜렷이 관찰되었고 control 펩타이드에서는 관찰되지 않았다. p65의 인산화는 vav1에 비해 현저히 나타나지 않았다. 이를 통해 cov1, cov2 펩타이드가 vav1 활성을 통해 자연살해세포의 활성을 유도함을 알 수 있었다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Anti-viral and anti-tumor peptides derived from SARS-CoV-2 S protein which binds to NKG2D receptor of natural killer cells and regulates natural killer cell functions thereof <130> 183 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S protein Sars-CoV-2_133-138 <400> 1 Phe Gln Phe Cys Asn Asp 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S protein Sars-CoV-2_537-543 <400> 2 Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S protein Sars-CoV-2_1201-1207 <400> 3 Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu 1 5 <210> 4 <211> 1273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S protein Sars-CoV-2 <400> 4 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 180 185 190 Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 195 200 205 Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 210 215 220 Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 225 230 235 240 Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 245 250 255 Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 260 265 270 Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 275 280 285 Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 290 295 300 Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 305 310 315 320 Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 325 330 335 Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 340 345 350 Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 370 375 380 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 385 390 395 400 Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 405 410 415 Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 420 425 430 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 435 440 445 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 450 455 460 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 465 470 475 480 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 500 505 510 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 530 535 540 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 545 550 555 560 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 565 570 575 Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 580 585 590 Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 595 600 605 Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 610 615 620 His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 625 630 635 640 Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 645 650 655 Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 660 665 670 Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 675 680 685 Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 690 695 700 Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 705 710 715 720 Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 725 730 735 Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 740 745 750 Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 755 760 765 Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 770 775 780 Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 785 790 795 800 Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 805 810 815 Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 820 825 830 Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 835 840 845 Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 850 855 860 Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 865 870 875 880 Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 885 890 895 Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 900 905 910 Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 915 920 925 Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 930 935 940 Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 945 950 955 960 Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 965 970 975 Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 980 985 990 Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile 995 1000 1005 Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu 1010 1015 1020 Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met 1025 1030 1035 1040 Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Ser Phe Pro Gln Ser Ala 1045 1050 1055 Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu 1060 1065 1070 Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His 1075 1080 1085 Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val 1090 1095 1100 Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr 1105 1110 1115 1120 Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr 1125 1130 1135 Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu 1140 1145 1150 Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp 1155 1160 1165 Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp 1170 1175 1180 Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu 1185 1190 1195 1200 Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile 1205 1210 1215 Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile 1220 1225 1230 Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys 1235 1240 1245 Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val 1250 1255 1260 Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1265 1270

Claims

서열번호 1, 서열번호 2 또는 이들 모두의 펩타이드.
제1항에 있어서, 서열번호 1의 펩타이드는 서열번호 4의 Sars-CoV-2의 S 단백질의 서열의 133-138번째 아미노산 서열인, 펩타이드.
제1항에 있어서, 서열번호 2의 펩타이드는 서열번호 4의 Sars-CoV-2의 S 단백질의 서열의 537-543번째 아미노산 서열인, 펩타이드.
서열번호 1, 서열번호 2 또는 이들 모두의 펩타이드를 포함하는 자연 살해세포 배양용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 IL-15, IL-21 및 IL-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인을 더 포함하는 것인, 자연 살해세포 배양용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 IL-15 및 IL-21를 포함하는 것인, 자연 살해세포 배양용 조성물.
서열번호 1, 서열번호 2 또는 이들 모두의 펩타이드를 자연살해(Natural Killer) 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 활성이 증진된 자연 살해 세포의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 자연 살해 세포는 CD3^-CD56⁺의 특징을 가지는 것인, 활성이 증진된 자연 살해 세포의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 활성 증진은 자연살해 세포 활성화 수용체 발현능 증진, 살상능 증진, 또는 인터페론-γ의 발현 증진인, 활성이 증진된 자연 살해 세포의 제조방법.
1) 단핵구로부터 CD3 양성인 T세포만을 제거하여 CD3 음성세포를 수득하는 단계; 및
2) 단계 1)의 CD3 음성세포에 IL-15 및 IL-21를 혼합처리하고, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 이들 모두의 펩타이드를 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 자연 살해 세포의 제조방법.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조된 자연 살해 세포.
제11항에 따른 자연 살해 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 대장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제11항에 따른 자연 살해 세포를 포함하는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제14항에 있어서, 상기 감염성 질환은 B형 및 C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus: HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환 및 인플루엔자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제15항에 있어서, 상기 바이러스성 호흡기 질환은 Sars-Cov-2 감염 질환인, 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.