WO2022114798A1 - 자연살해세포 nkg2d 수용체에 결합하는 sars-cov-2 s 단백질 유래 펩타이드를 이용한 자연살해세포 활성 증가 및 감염병, 암 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

자연살해세포 nkg2d 수용체에 결합하는 sars-cov-2 s 단백질 유래 펩타이드를 이용한 자연살해세포 활성 증가 및 감염병, 암 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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김한나
정해용
변재은
윤석란
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    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for preparing natural killer cells with improved activity and uses thereof.
  • COVID-19 caused by SARS-CoV-2 infection, causes a respiratory illness and was declared Pandemic on March 11, 2020 by the WHO.
  • SARS-CoV-2 infection induces abnormalities in the patient's immune system and causes severe immunodeficiency by causing deficiency of T cells and natural killer cells (NK, natural killer cells).
  • NK natural killer cells
  • Natural killer cells are immune cells that maintain the body's innate immunity and remove cancer cells or virus-infected cells. Natural killer cells recognize cancer cells or virus-infected cells through active receptors and remove these cells. Natural killer cells have activating receptors and inhibitory receptors, and their activity is regulated by balancing these two types of signal transduction. It has been reported that the expression of NKG2A, a natural killer cell receptor, is increased in corona patients, and this receptor is considered as one of the targets for therapeutic development. However, the role of natural killer cells and natural killer cell receptors in corona patients is still not well known.
  • NK cells present in the body in a normal state exist in an inactivated state.
  • activated NK cells are needed, so it is from normal blood or from inactivated patient blood. Studies on activating NK cells are being actively conducted.
  • NK cells The high cytotoxicity of NK cells achieved by activating NK cells in vitro confirmed the potential of NK cells to treat immune cells.
  • NK cells activated in vitro by administering them after allogeneic bone marrow transplantation for various cancer types, especially blood cancers such as leukemia.
  • a clinically clear therapeutic effect on NK cells has not yet been demonstrated for solid cancer other than blood cancer.
  • NK cells can be administered before tumors appear to interfere with tumor engraftment, but it is difficult to see them as a suitable treatment model. It is unclear whether the effect is due to NK cells.
  • the NKG2D receptor is a very important receptor. Specifically, the NKG2D receptor is an active receptor of NK cells and controls the killing ability of NK cells. In humans, at least eight ligands that bind to the NKG2D receptor are known. Human NKG2D binds to DAP10 and transduces an activation signal into the cell through DAP10. Mouse NKG2D binds to DAP10 and DAP12 for signal transduction. Cancer cells or viruses secrete these ligands out of the cell to evade the attack of the NK cells and evade them from the NK cells.
  • viruses such as influenza virus and HIV have various immune evasion functions while interacting with natural killer cells. Viruses directly bind to NK cells and inhibit signal transduction of NK receptors or regulate cytokine secretion. Some viruses prevent natural killer cells from recognizing ligands through their receptors. Cowpox virus expresses the OMCP protein, which is similar to the NKG2D ligand and inhibits the binding of the ligand to NKG2D in natural killer cells.
  • coronaviruses need strategies to evade the antiviral function of natural killer cells. Possible strategies include that the coronavirus increases the inhibitory receptors of NK cells, exhaustion of NK cells by increasing HLA-I protein, or perforin or granzyme, which are killer substances possessed by NK cells. Reducing the back would be a strategy. Or, the corona virus induces apoptosis of natural killer cells, thereby drastically reducing the number of cells.
  • the present inventors tried to examine the direct binding of the corona virus to the natural killer cell receptor, and completed the present invention by identifying that the coronavirus S protein-derived peptide binds to NKG2D and regulates the function of natural killer cells.
  • the present inventors looked at the binding of the peptide of the Spike (S) protein of the corona virus and NKG2D, the receptor of the natural killer cells, to examine the correlation between the corona virus (SARS-CoV-2) and natural killer cells, and these By observing that the peptide increases the activity of natural killer cells through the binding of NKG2D, the present invention was completed by identifying that the corona virus directly regulates immune cell functions.
  • S Spike
  • NKG2D the receptor of the natural killer cells
  • the present invention provides at least one peptide selected from the group consisting of a peptide of SEQ ID NO: 1 and a peptide of SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also provides a composition for culturing natural killer cells comprising one or more peptides selected from the group consisting of the peptide of SEQ ID NO: 1 and the peptide of SEQ ID NO: 2.
  • the present invention provides natural killer cells cultured by treatment with the peptide of SEQ ID NO: 1 and/or the peptide of SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the natural killer cells and a pharmaceutical use thereof.
  • the present invention also includes the step of treating one or more peptides selected from the group consisting of the peptide of SEQ ID NO: 1 and the peptide of SEQ ID NO: 2 to Natural Killer cells, the activity of which is enhanced Natural Killer (Natural Killer) Killer) provides a method for producing cells.
  • the present invention also comprises the steps of 1) removing only CD3-positive T cells from monocytes to obtain CD3-negative cells; and
  • the CD3-negative cells of step 1) are mixed with IL-15 and IL-21, and one or more peptides selected from the group consisting of the peptide of SEQ ID NO: 1 and the peptide of SEQ ID NO: 2 are treated and cultured. It provides a method for producing a natural killer (Natural Killer) cell.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating cancer or an infectious disease, comprising administering the Natural Killer cells to a subject.
  • the terms “optionally” or “optionally” mean that the subsequently described event or circumstance may or may not occur, and the description includes instances in which the event or circumstance occurred and instances in which the event or circumstance did not occur. .
  • NK cell refers to a CD3-negative CD56-positive monocyte, and in particular has a cytotoxic activity against cells in which the expression of MHC class I molecules is low or the expression is lost.
  • cytokine induction refers to contacting with, and thereby activating, stimulating, or restimulating a natural killer cell with, cytokines and/or peptides.
  • Such induction may be, for example, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 36, 48 hours. , 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 10 days, 12 days, 14 days, 3 weeks or more.
  • 'stimulation' refers to inducing changes in the characteristics of natural killer cells by adding cytokines, peptides, and the like.
  • 'Restimulation' refers to re-inducing natural killer cell proliferation and characteristic changes by re-adding appropriate cytokines and peptides to the medium after a certain incubation period has elapsed.
  • the increase and decrease in the expression of the natural killer cell receptor is based on the average intensity analysis results through FACS. Specifically, the increase and decrease can be expressed in % compared to the untreated control. In addition, it can be expressed as a relative increase or decrease multiple in comparison with this based on the expression level of the conventional general natural killer cells, natural killer cells that are not stimulated with cytokines, or the like.
  • the term "conventional natural killer cells” refers to natural killer cells that are separated from the human body and the like and maintain their characteristics as they are separated from the human body without a separate additional stimulation process. Specifically, it refers to natural killer cells that can be obtained by isolating cells having characteristics such as CD3 negative and/or CD56 positive from monocytes, which is a known method for isolating natural killer cells.
  • the present invention provides a peptide of SEQ ID NO: 1 (FQFCND, hereinafter also referred to as cov1) and/or a peptide of SEQ ID NO: 2 (KCVNFNF, hereinafter also referred to as cov2).
  • the peptide according to the present invention has functional characteristics capable of binding to NKG2D of natural killer cells and regulating the function of natural killer cells.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 corresponds to the 133-138 amino acid sequence of the S protein sequence of Sars-CoV-2.
  • the S protein sequence of Sars-CoV-2 is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the peptide according to the present invention may include a peptide encompassing the above position in the sequence of each of the S protein.
  • the S protein may further include a sequence in front of.
  • the rear sequence of the S protein is added. may contain more.
  • it may further include about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more of front and rear sequences. .
  • the peptide of SEQ ID NO: 2 corresponds to the 537-543 amino acid sequence of the S protein sequence of Sars-CoV-2.
  • the peptide according to the present invention may include a peptide encompassing the above position in the sequence of each of the S protein.
  • the S protein may further include a sequence in front of.
  • the sequence containing the 537-543 amino acid sequence of the S protein sequence, such as 537-544, 537-545, 537-546, 537-547, etc., based on 537-543, the back sequence of the S protein is added may contain more.
  • it may further include approximately 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more of front and rear sequences. .
  • the peptide one or more peptides selected from the group consisting of a peptide of SEQ ID NO: 1 and a peptide of SEQ ID NO: 2 may be used, and the peptide is a peptide of SEQ ID NO: 1 and a peptide of SEQ ID NO: 2, respectively. may be included individually or simultaneously.
  • it may include a sequence in which the peptide of SEQ ID NO: 1 and the peptide of SEQ ID NO: 2 are fused.
  • peptide and “protein” are used interchangeably and include reference to a polymer of amino acid residues.
  • the terms apply to natural amino acid polymers as well as amino acid polymers in which one or more amino acid residues are artificial chemical analogues of the corresponding natural amino acid.
  • the terms also apply to those polymers containing conservative amino acid substitutions such that the protein remains functional.
  • the peptide may be synthesized using a gene recombination and protein expression system, preferably synthesized in vitro through a peptide synthesizer or the like.
  • biologically active refers to a peptide fragment having a structural function similar to that of the polypeptide of SEQ ID NO: 1, and/or a similar regulatory function, and/or a similar biochemical function, and also a peptide according to the present invention. do.
  • the present invention may include variants of the sequences of SEQ ID NO: 1 and/or SEQ ID NO: 2. Specifically, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96% with the peptide sequence of SEQ ID NO: 1 and/or SEQ ID NO: 2 %, at least 97%, at least 98%, or at least 99% sequence homology, and sequences that retain biological activity may be included within the scope of the present invention.
  • a “deletion” is defined as a change in the nucleotide or amino acid sequence that lacks one or more nucleotide or amino acid residues, respectively, compared to a wild-type polynucleotide or polypeptide.
  • insertion or “addition” is a change in nucleotide or amino acid sequence resulting from the addition of one or more nucleotide or amino acid residues, respectively, compared to a wild-type polynucleotide or polypeptide.
  • substitution results from the replacement of one or more nucleotides or amino acids by different nucleotides or amino acids, respectively, compared to a wild-type polynucleotide or polypeptide.
  • preferred amino acid mutation at the substitution position may be performed based on the similarity of residues in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphiphilic properties.
  • negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid
  • positively charged amino acids include lysine and arginine
  • amino acids having an uncharged polar head group having a similar hydrophilicity value include leucine, isoleucine and valine; glycine and alanine; asparagine and glutamine; serine, threonine, phenylalanine and tyrosine;
  • Such mutations may include conservative substitutions.
  • a 'conservative substitution' refers to a substitution in which an amino acid is substituted with another amino acid having similar properties so that those skilled in the art can predict that the secondary structure and hydropathic nature (hydropathic nature) of the polypeptide are substantially unchanged. to be.
  • the following groups of amino acids exhibit conservative changes: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; and (5) phe, tyr, trp, his.
  • the variant is phosphorylation (phosphorylation), sulfation (sulfation), acrylation (acrylation), glycosylation (glycosylation), methylation (methylation), farnesylation (farnesylation), acetylation (acetylation) and amylation (amidation) It can also be modified (modification) and the like.
  • nucleic acid sequences encoding one or more of any of the peptides described herein are included.
  • nucleic acid sequences and vectors for recombinant expression of one or more of the peptides described herein are well known to those skilled in the art.
  • Nucleic acids and vectors can be used to express peptides in a wide variety of host cells, including, for example, bacterial, yeast, or mammalian cells.
  • Nucleic acids and vectors can also be used in in vivo and ex vivo methods, eg, as described below.
  • the peptide coding sequence may be operably linked to a promoter, regulatory element, or expression control sequence. Promoter and/or enhancer elements may direct expression of the peptide encoded by the nucleic acid.
  • Enhancers provide expression specificity in terms of time, location, and level. Unlike promoters, enhancers can function when located at variable distances from the transcription initiation site in the presence of a promoter. Enhancers may also be located downstream of the transcription initiation site or in exons of related genes. In order to put the coding sequence under the control of the promoter, it is necessary to position the translation initiation site of the translation reading frame of the peptide between 1 and about 50 nucleotides downstream (3') of the promoter.
  • Promoters of interest include, but are not limited to, cytomegalovirus hCMV immediate early gene, early or late promoter of SV40 adenovirus, lac system, trp system, TAC system, TRC system, major operator and promoter region of phage A, fd coat protein , a promoter for 3 phosphoglycerate kinase, a promoter for acid phosphatase, and a promoter for yeast ⁇ mating factor, an adenovirus EIb minimal promoter, or a thymidine kinase minimal promoter.
  • Recombinant vectors may be introduced into cells using a variety of methods, which may depend, at least in part, on the type of cell into which the nucleic acid is introduced.
  • bacterial cells can be transformed using methods such as electroporation or heat shock.
  • Methods for transfecting yeast cells include, for example, spheroplast technology or whole-cell lithium chloride yeast transformation methods.
  • Transfection of animal cells can be accomplished using, for example, calcium phosphate, electroporation, heat shock, liposomes, or transfection reagents such as FUGENE or LIPOFECT AMINE®, or contacting a naked nucleic acid vector with the cells in solution. It can be characterized by introducing the vector into the cell.
  • Expression systems that can be used for small-scale or large-scale production of the peptides described herein include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria transformed with recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA, or cosmid DNA expression vectors; fungi (eg, yeast (eg, Saccharomyces and Pichia)) transformed with recombinant yeast expression vectors; insect cell systems (eg, baculovirus) infected with recombinant viral expression vectors; plant cell systems infected with recombinant viral expression vectors (eg, cauliflower mosaic virus (CaMV) and tobacco mosaic virus (TMV)) or transformed with recombinant plasmid expression vectors (eg, Ti plasmid); or a promoter derived from the genome of a mammalian cell (eg, a metallothionein promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (eg, adenovirus late promoter,
  • mammals transfected with plasmid vectors or infected with viral vectors eg, viral vectors such as, inter alia, herpes virus, retrovirus, vaccinia virus, attenuated vaccinia virus, canary pox virus, adenovirus and adeno-associated virus.
  • viral vectors such as, inter alia, herpes virus, retrovirus, vaccinia virus, attenuated vaccinia virus, canary pox virus, adenovirus and adeno-associated virus.
  • Primary or secondary cells obtained directly from an animal are useful as host cells.
  • the peptides can be isolated from the cultured cells or from the medium in which the cells were cultured using standard techniques.
  • Methods for isolating proteins include, for example, liquid chromatography (eg, HPLC), affinity chromatography (eg, metal chelation or immunoaffinity chromatography), ion exchange chromatography, hydrophobic-interaction. chromatography, precipitation, or differential solubilization.
  • a peptide e.g., a peptide having less than 200 (e.g., less than 175, less than 150, less than 125, less than 100, less than 90, less than 80, less than 70, or less than 60) amino acids
  • It can be chemically synthesized by standard chemical methods such as FMOC solid phase synthesis.
  • the present invention also provides a composition for culturing natural killer cells comprising one or more peptides selected from the group consisting of the peptide of SEQ ID NO: 1 and the peptide of SEQ ID NO: 2.
  • Natural killer cells cultured after administering the composition may have increased secretion of IFN-gamma (interferon-gamma) compared to the group cultured by administering other cytokines.
  • the natural killer cells cultured after administering the composition may have increased cytotoxicity to cancer cells, compared to the group cultured by administering other cytokines, and may promote apoptosis of cancer cells. .
  • the natural killer cells may be derived from, for example, mammals, humans, monkeys, pigs, horses, cattle, sheep, dogs, cats, mice or rabbits.
  • the natural killer cells may be obtained from a normal person or a cancer patient.
  • the natural killer cells may be isolated from blood or peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • a method for isolating blood, a method for isolating PBMCs therefrom, and a method for isolating natural killer cells therefrom may be performed by known methods.
  • the natural killer cells may have surface antigen properties of CD3- and CD56+.
  • the concentration of the peptides in the natural killer cell culture medium may be, for example, about 1 nM to 1000 nM, 10 nM to 800 nM, 20 nM to 600 nM, etc., and the conditions may vary depending on the culturing environment and conditions.
  • the culture medium according to the present invention may more preferably further include cytokines, and these cytokines include, for example, IL-15, IL-21, IL-2, etc., more preferably IL-15 and IL-21.
  • cytokines include, for example, IL-15, IL-21, IL-2, etc., more preferably IL-15 and IL-21.
  • IL-15 and IL-21 may be treated at 5 ng/ml to 50 ng/ml, preferably 10 to 30 ng/ml, respectively.
  • the medium refers to a material capable of supporting the growth and survival of cells in vitro .
  • the medium is not particularly limited as long as it can be used for cell culture, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10 , F-12, DMEM/F12, MEM- ⁇ (Minimal Essential Medium- ⁇ ), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A medium, AmnioMax complete medium, AminoMax ⁇ medium, It may include one or more selected from the group consisting of Endothelial Basal Medium (EBM) medium, and Chang's Medium medium.
  • EBM Endothelial Basal Medium
  • the medium may further include nutrients, pH adjusters, antibiotics, albumin, serum, and the like.
  • the culture may be carried out in a normal cell culture condition, that is, about 37° C., in a CO 2 incubator, and the culture solution may be continuously cultured while adding the culture medium once every 2 or 3 days.
  • the culture period may be, for example, 7 to 20 days, 8 to 18 days, 10 to 16 days, 10 to 15 days, or 10 to 14 days, but is not limited thereto, and it is possible to obtain the desired number of natural killer cells. For this, it can be appropriately set within or outside the range of the number of incubation days.
  • the culture vessel may include commercially available dishes, flasks, plates, multi-well plates, and culture bags.
  • the present invention also includes the step of treating one or more peptides selected from the group consisting of the peptide of SEQ ID NO: 1 and the peptide of SEQ ID NO: 2 to Natural Killer cells, the activity of which is enhanced Killer) provides a method for producing cells.
  • the above-mentioned matters in the medium may be appropriately applied.
  • peripheral blood mononuclear cells Peripheral blood mononuclear cell: PBMC
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • the present invention also comprises the steps of 1) removing only CD3-positive T cells from monocytes to obtain CD3-negative cells; and
  • the CD3-negative cells of step 1) are mixed with IL-15 and IL-21, and one or more peptides selected from the group consisting of the peptide of SEQ ID NO: 1 and the peptide of SEQ ID NO: 2 are treated and cultured. It provides a method for producing a natural killer (Natural Killer) cell.
  • the step 1) provides a method performed by allowing CD3-positive T cells and red blood cells to cross-link and then separating CD3-negative cells using a density gradient during centrifugation.
  • the separation of CD3-negative cells using a density gradient during centrifugation can be performed using an antibody using CD3-negative cells,
  • it may be performed using a product called RosetteSep TM Human NK Cell Enrichment Cocktail manufactured and sold by STEMCELL Technologies.
  • the product is a cocktail of tetrameric antibodies that recognize CD3, CD4, CD19, CD36, CD66b, CD123, and glycophorin A.
  • CD3-positive cells, CD4-positive cells, CD19-positive cells, CD36-positive cells, CD66b-positive cells, and CD123-positive cells bind to and crosslink the tetrameric antibody with erythrocytes expressing glycophorin A. After centrifugation, the cells are pelleted by a density gradient, and a medium in which CD3-negative natural killer cells are densely concentrated in the upper layer can be obtained.
  • the culture in step 2) may be cultured for 10 to 24 days, but the culture period can be determined by confirming that the cultured cells exhibit CD3 - CD56 + characteristics.
  • the culture in step 2) may use a stationary culture or suspension culture method, and the stationary culture is cultured in a state in which it is left without agitating or shaking in an incubator.
  • the suspension culture means that the cells are cultured in a suspended state without being attached to the lower part or side part of the reactor through aeration or agitation.
  • the reactor for stationary culture and the reactor for suspension culture may be the same or different.
  • a medium containing necessary nutrients such as cytokines is additionally supplied and cultured in a suspension culture method.
  • the culture can be transferred to a reactor for suspension culture and suspended culture.
  • the present invention provides a cultured natural killer cell treated with the peptide of SEQ ID NO: 1 and/or SEQ ID NO: 2.
  • the natural killer cells may be CD3 - CD56 + ones.
  • the natural killer cells according to the present invention may have increased secretion of IFN-gamma (interferon-gamma).
  • IFN-gamma interferon-gamma
  • cytotoxicity may be increased, and may promote cell death (apoptosis) of cancer cells.
  • vav1 Vav Guanine Nucleotide Exchange Factor 1
  • activity may be enhanced.
  • the natural killer cells cultured by treatment with the peptide of SEQ ID NO: 1 and/or SEQ ID NO: 2 according to the present invention may be cells prepared through the above-mentioned culturing processes.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the natural killer cells and a pharmaceutical use thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the natural killer cells prepared by the above method.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the natural killer cells prepared by the above method and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition refers to a cellular therapeutic agent.
  • cellular therapeutic agent refers to a cell prepared through isolation, culture, and special manipulation from a subject. And as a drug (U.S. FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention of tissue, living autologous, allogeneic, or xenogeneic cells are proliferated in vitro to restore the function of cells or tissues, or the biological process of cells is performed by other methods. It refers to medicines used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as changing characteristics.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared using pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvants other than the active ingredient, and the adjuvants include excipients, disintegrants, sweeteners, binders, coating agents, swelling agents, lubricants, and lubricants. agent or flavoring agent, etc. may be used.
  • composition according to the present invention may be formulated into a pharmaceutical composition including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredients described above for administration.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be used in a mixture of saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, and one or more of these components, and, if necessary, an antioxidant , buffers, bacteriostatic agents, and other conventional additives may be added.
  • diluents, dispersing agents, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to form injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules or tablets, and may act specifically on target organs.
  • a target organ-specific antibody or other ligand may be used in combination with the carrier.
  • it can be preferably formulated according to each disease or component using an appropriate method in the art or a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (recent edition), Mack Publishing Company, Easton PA). have.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be a solution, suspension, dispersion, emulsion, gel, injectable solution, sustained-release formulation of the active compound, and the like, preferably injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is formulated for injection, it is physically and chemically very stable by adjusting the pH by using an aqueous acid solution or a buffer solution such as phosphate that can be used for injection in order to ensure product stability according to the distribution of the injection prescription. It can be prepared as an injection.
  • the injection can be prepared by dissolving in water for injection together with a stabilizing agent or solubilizing agent, and then sterilizing it by sterilization, in particular, high-temperature sterilization or aseptic filtration.
  • a stabilizing agent or solubilizing agent for example, a phosphate buffer solution or sodium dihydrogen phosphate (NaH 2 PO 4 )-citrate buffer solution in a pH range of 3.5 to 7.5 may be used.
  • the phosphate used may be in the form of sodium salt or potassium salt, anhydrous or hydrate form, or citric acid or anhydride or hydrate form.
  • the stabilizer used in the present invention includes sodium pyrosulfite, sodium bisulfite (NaHSO 3 ), sodium metabisulfite (Na 2 S 2 O 3 ) or ethylenediaminetetraacetic acid (ethylenediaminetetraacetic acid),
  • Dissolution aids include bases such as sodium hydroxide (NaOH), sodium hydrogen carbonate (NaHCO 3 ), sodium carbonate (NaCO 3 ) or potassium hydroxide (KOH), or acids such as hydrochloric acid (HCl) or acetic acid (CH 3 COOH) .
  • the injection according to the present invention may be formulated to be bioabsorbable, biodegradable, and biocompatible.
  • bioabsorbable it is meant that the injectable can disappear from the initial application in the body, without degradation or degradation of the dispersed injectable.
  • Biodegradability means that the injection can be broken down or degraded in the body by hydrolysis or enzymatic degradation. Biosynthesis means that all of the ingredients are non-toxic in the body.
  • the injection according to the present invention can be prepared using conventional fillers, weight agents, binders, wetting agents, diluents such as surfactants, or excipients.
  • composition or active ingredient of the present invention may be administered by intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, transdermal, intranasal, subcutaneous, intrauterine, inhalation, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal routes depending on the purpose. It may be administered in a conventional manner through the etc., preferably intravenously.
  • the composition or active ingredient of the present invention may be administered by injection or catheter.
  • the dosage of the active ingredient is 1 x 10 based on an adult weighing 60 kg One - 1 x 10 50 dog / kg, preferably 1 x 10 One - 1 x 10 30 dog / kg, more preferably 1 x 10 5 - 1 x 10 20 dog / kg, most preferably 1 x 10 7 - 1 x 10 9 dog It can be adjusted within the range of / kg.
  • the optimal dosage to be administered can be easily determined by those skilled in the art, and the type of disease, the severity of the disease, the content of active ingredients and other components contained in the composition, the type of formulation, and the age, weight, and general health of the patient It can be adjusted according to various factors including condition, sex and diet, administration time, administration route and secretion rate of the composition, treatment period, and concurrently used drugs.
  • the active ingredient may be contained in an amount of 0.001 to 50% by weight based on the total weight of the composition.
  • the content is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the natural killer cells prepared by the above method.
  • the cancer is not limited as long as it can be treated by natural killer cells, for example, liver cancer, lung cancer, colorectal cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, cervical cancer, thyroid cancer, laryngeal cancer , leukemia, brain tumor, neuroblastoma, retinoblastoma, head and neck cancer, salivary gland cancer, may be any one selected from the group consisting of lymphoma, preferably any one selected from the group consisting of colorectal cancer, lung cancer, liver cancer, pancreatic cancer and leukemia It could be cancer.
  • natural killer cells for example, liver cancer, lung cancer, colorectal cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, cervical cancer, thyroid cancer, laryngeal cancer , leukemia, brain tumor, neuroblastoma, retinoblastoma, head and neck cancer, salivary gland cancer, may be any one selected from the group consisting of lymphom
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an infectious disease comprising the natural killer cells prepared by the above method.
  • Infectious disease is a disease caused by infection with a virus or pathogen, and is a concept that includes all diseases that can be transmitted and infected through respiratory, blood, and skin contact.
  • Non-limiting examples of such infectious diseases include hepatitis B and C, human papilloma virus (HPV) infection, cytomegalovirus infection, viral respiratory disease, influenza, etc., but are limited thereto not.
  • HPV human papilloma virus
  • the viral respiratory disease may be a Sars-Cov-2 infection.
  • the disease caused by the type 2 severe acute respiratory syndrome coronavirus infection may be a respiratory disease.
  • the type 2 severe acute respiratory syndrome coronavirus-infected disease may exhibit symptoms after, for example, an incubation period of 2 to 14 days after viral infection. These symptoms include, for example, high fever, cough, shortness of breath, pneumonia, gastrointestinal symptoms such as diarrhea, organ failure (kidney failure, renal failure, etc.), septic shock, and in severe cases death. Any symptoms caused by
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer by administering the natural killer cells or a composition comprising the same to a subject in need of cancer treatment in a therapeutically effective amount.
  • the present invention provides a method for preventing or treating an infectious disease by administering the natural killer cells or a composition comprising the same to a subject in need of treatment for an infectious disease in a therapeutically effective amount.
  • the subject in need of treatment may be a mammal including a human.
  • a human for example, it can be a human, dog, cat, horse, etc.
  • the present invention provides the use of natural killer cells for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer and/or infectious disease.
  • said natural killer cell for use in the treatment of cancer and/or infectious disease.
  • the natural killer cells prepared according to the present invention have improved activity in the killing ability of the natural killer cells, the IFN- ⁇ production ability, etc.
  • it has an excellent invention in that it is possible to produce natural killer cells that can exhibit excellent activity by directly regulating the function of natural killer cells through a peptide derived from the coronavirus S protein.
  • 1A shows the total amino acid sequence of the S protein of coronavirus (SARS-CoV-2), the first peptide (FQFCND, cov1 peptide #1, the peptide between 133-138), the second peptide (KCVNFNF, cov2 peptide #2, The positions of the peptides between positions 537-543) and control peptides (QELGKYE, control peptide, peptides 1201-1207) are indicated (bold underline). Here, the underlined part indicates the receptor binding domain that the corona virus binds to the target cell receptor, ACE2. 1B and 1C show the predicted binding of cov1 peptide #1 and NKG2D (B) and the predicted binding of cov2 peptide #2 and NKG2D (C).
  • Figure 2A is a flow cytometry analysis of the binding of FITC-bound control peptide and cov2 peptide to NK92 cells.
  • the cov2 peptide binds well to the natural killer cells, but the control control peptide does not bind to the natural killer cells at all.
  • FIG. 2B shows the results of quantitatively indicating the degree of binding thereof.
  • Figure 2C is a flow cytometry analysis of the binding of the FITC-bound control peptide and the cov2 peptide to primary NK cells.
  • the cov2 peptide binds well to the natural killer cells, but the control control peptide does not bind to the natural killer cells at all.
  • 2D shows the results of quantitatively indicating the degree of binding thereof.
  • 3 shows the results of the peptide increasing the ability to kill natural killer cells.
  • 3A shows the results confirming that the killing ability against the H460 lung cancer cell line was further increased when the cov1 and cov2 peptides were added than the killing ability when the control peptide was added.
  • Figure 3B shows that the killing ability is also increased against other lung cancer cell lines, H385 and H3122 cells.
  • Figure 3C shows that cov1 peptide and cov2 peptide increase the killing ability against H460 lung cancer cell line even when primary natural killer cells are used. (*p ⁇ 0.05; **p ⁇ 0.01, student t-test).
  • Figure 5 is a result of analyzing the effect of the peptide on natural killer cell apoptosis.
  • Figure 5A is the result of measuring the effect on apoptosis of primary NK cells when the peptide alone is treated with primary NK cells for 48 hours, This is the result of measuring the effect on apoptosis of NK cells.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of confirming that cov1 and cov2 peptides induce the activity of natural killer cells through vav1 activity.
  • NK92 cells were cultured in a 37°C water jacketed incubator (Thermo electron corporation) supplied with 5% CO 2 . According to the ATCC culture conditions, 0.2 mM myo inositol, 0.1 mM 2 -mercaptoethanol, 0.02 mM folic acid, 1% antibiotics-antimycotic (Gibco) and IL-2 cytokine (Peprotech) were added at a concentration of 20 ng/ml and used as a culture medium.
  • Cells were cultured at a concentration of 1x10 5 /ml in a 75T Flask (Thermo) to about 20-30 ml, and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes every 2-3 days to remove the supernatant and then the culture medium. was exchanged for
  • the lung cancer cell line H460 was cultured and used as a target cell line.
  • H460 cells were cultured with 1% antibiotics-antimycotic (Gibco) added to RPMI (Welgene) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV) according to ATCC culture conditions. , 5 % CO 2 was supplied and cultured in a water jacketed incubator (Thermo electron corporation) at 37°C. The cells were cultured at a concentration of 2x10 5 /ml to about 10 ml in a 100mm x 20mm cell culture dish (corning).
  • the CD3 isolated cells were reacted with 10 ml of ACK buffer for 10 minutes to remove the remaining red blood cells, and then washed twice using PBS (phosphate-buffered saline) supplemented with 2% Fetal Bovine Serum. Washing was performed by centrifugation at 1500 rpm for 5 minutes with a centrifuge (Beckman Coulter) to remove the supernatant. The cells thus obtained were used for culturing into NK cells.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • NK cell culture conditions were 10 ng/ml IL-15 (Peprotech), 10 ng/ml IL- in alpha-MEM (Welgene) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV). 21 (Peprotech), 10 -6 M HC (Peprotech) and 1% antibiotics-antimycotic (Gibco) were added and cultured. The cell culture concentration was cultured in a 6 well plate at a concentration of 2x10 6 /ml, centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes every 2-3 days with a centrifuge (Beckman Coulter) to remove the supernatant, and then the culture medium was exchanged.
  • the degree of differentiation of NK cells was checked every 3 days with a FACSCanto II (BD Biosciences) flow cytometer.
  • FACS analysis 2x10 4 cells were placed in each FACS tube (Falcon) and washed by centrifugation with a centrifuge (Beckman Coulter) at 1500 rpm for 3 minutes with PBS (phosphate-buffered saline) containing Fetal Bovine Serum used as FACS buffer. After removing the supernatant, 100 ul of FACS buffer was added. After adding 1ul each of CD56 APC (BD) antibody and CD3 PE (BD) antibody, and staining at 4°C for 20 minutes, add 500ul of FACS buffer each, and centrifuge at 1500 rpm for 3 minutes with a centrifuge (Beckman Coulter). and washed. After removing the supernatant, 200 ul of FACS buffer was added, and analysis was performed with FACSCanto II (BD Biosciences).
  • FACSCanto II BD Biosciences
  • SARS-CoV-2 virus enters the cell by binding to the cell surface through the S protein.
  • S protein In order to examine the binding of S protein to NKG2D, a natural killer cell receptor, peptides capable of binding to NKG2D among S protein-derived peptides were searched through sequencing and two peptides with high double binding probability were selected (Fig. 1A). ).
  • the first peptide consists of 6 amino acids (FQFCND, cov1 peptide #1 - SEQ ID NO: 1) and is a peptide between positions 133 and 138 of the S protein.
  • the second peptide consists of 7 amino acids (KCVNFNF, cov2 peptide #2-SEQ ID NO: 2) and is a peptide between positions 537-543 of the S protein.
  • the control peptide (con peptide) is a peptide 1201-1207 of the S protein composed of 7 amino acids (QELGKYE, control peptide-SEQ ID NO: 3).
  • Control peptide Q-E-L-K-Y-E
  • cov1 peptide F-Q-F-C-N-D
  • cov2 peptide K-C-V-N-F-N-F
  • FITC-control peptide FITC-Ahx-Q-E-L-K-Y-E
  • FITC-cov2 peptide FITC-Ahx-K-C-V-N-F-N-F
  • NK92 2x10 4 cells were placed in each FACS tube and centrifuged with PBS (phosphate-buffered saline) to which Fetal Bovine Serum used as FACS buffer was added at 1500 rpm for 3 minutes with a centrifuge (Beckman Coulter), and then the supernatant was washed. After removal, 100 ul of FACS buffer was added. Control FITC and cov2 FITC were added at each concentration of 10 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, and 300 nM, and stained at 4° C. for 20 min.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the stained cells were washed by adding 500ul of FACS buffer at a time and centrifuging at 1500 rpm for 3 minutes with a centrifuge (Beckman Coulter). After removing the supernatant, 200 ul of FACS buffer was added, and analysis was performed with FACSCanto II (BD Biosciences).
  • the cov2 peptide bound well to NK-92 cells in a concentration-dependent manner, but it was confirmed that the control peptide did not bind to natural killer cells at all (Fig. 2A, B), and when the binding of the same peptides to primary natural killer cells was analyzed. It was observed that only the cov2 peptide binds in a concentration-dependent manner (Fig. 2C,D).
  • NK92 cells were incubated in NK92 media supplemented with 0.1% BSA instead of 12.5% Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV) and 12.5% Horse serum (Gibco) in the existing NK92 culture medium condition with 5% CO 2 Incubated overnight in a 37°C incubator supplied with After centrifugation at 1000 rpm, 5 min, the supernatant of the existing culture medium was discarded, and a new 0.1% BSA culture medium was added again at a concentration of 1x10 5 /ml.
  • BSA Fetal Bovine Serum
  • NK92 cells were reacted with peptides (control, cov1, cov2) at concentrations of 0 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, and 200 nM for 2 hours at 37° C. in an incubator, and used as effect cells for the killing ability test. .
  • the killing ability test was conducted by calcein-AM method.
  • the target cells H460 cells
  • calcein-AM invitrogen
  • 1x10 6 cells/1ml culture medium 5 ul
  • centrifuge Beckman Coulter
  • Count the Calcein-AM-stained target cells in the desired ratio to the effector cells of each condition put them in a 96-well round plate (corning), centrifuge at 100 rcf for 1 minute, and then centrifuge at 37°C for 4 hours. incubated.
  • the E:T ratio was set to 20:1, and in the case of primary NK, the E:T ratio was set to 10:1 because the killing ability was high. After centrifugation at 100 rcf for 5 minutes, 100ul of the supernatant was carefully transferred to a 96-well black plate, followed by ELISA (fluorescence 480nm/ 530nm, MD) analysis.
  • ELISA fluorescence 480nm/ 530nm, MD
  • H385 and H3122 cells which are other lung cancer cell lines
  • the killing ability in NK92 treated at a concentration of 100 nM of the peptide was compared.
  • the peptide was treated it was found that the killing ability on H385 and H3122 cells was increased (FIG. 3B).
  • NK92 cells were incubated in NK92 media supplemented with 0.1% BSA instead of 12.5% Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV) and 12.5% Horse serum (Gibco) in the existing NK92 culture medium condition with 5% CO 2 Incubated overnight in a 37°C incubator supplied with After centrifugation at 1000 rpm, 5 min, the supernatant of the existing culture medium was discarded, and a new 0.1% BSA culture medium was added again at a concentration of 1x10 5 /ml.
  • BSA Fetal Bovine Serum
  • NK92 cells were reacted with peptide peptides (control, cov1, cov2) at a concentration of 0 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, and 200 nM for 2 hours at 37°C in an incubator, and then the supernatant for 24 hours and 48 hours. collected
  • the H460 lung cancer cell line was pre-cultured and adhered to each well 1 day before at a concentration of 1x10 5 /ml, and then NK92 co-cultured with peptides for 2 hours at each concentration. The supernatant was collected.
  • the amount of IFN- ⁇ in the supernatant obtained using Human IFN Gamma uncoated ELISA kit (invitrogen) was analyzed by ELISA (absorption 450 nm, MD).
  • NK92 cells were incubated in NK92 media supplemented with 0.1% BSA instead of 12.5% Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV) and 12.5% Horse serum (Gibco) in the existing NK culture medium condition with 5% CO 2 Incubated overnight in a 37°C incubator supplied with After centrifugation at 1000 rpm, 5 min, the supernatant of the existing culture medium was discarded, and a new 0.1% BSA culture medium was added again at a concentration of 1x10 5 /ml.
  • BSA Fetal Bovine Serum
  • peptides (control, cov1, cov2) were added to NK cells at concentrations of 0 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, and 200 nM, and incubated in an incubator at 37° C. for 48 hours.
  • the H460 lung cancer cell line was pre-cultured and attached to each well at a concentration of 1x10 5 /ml at the same ratio, and then co-cultured with NK cells to which peptides were added at each concentration to obtain cells while culturing in an incubator at 37°C for 48 hours. .
  • the cells thus obtained are placed in a FACS tube and centrifuged with PBS (phosphate-buffered saline) with Fetal Bovine Serum added as a FACS buffer at 1500 rpm for 3 minutes with a centrifuge (Beckman Coulter), and then the supernatant is removed. 100 ul of FACS buffer was added. 1ul of CD56 APC (BD) FACS antibody was added and incubated on ice for 20 minutes. Then, after washing with a centrifuge at 1700 rpm, 200 ul of FACS buffer was added, and then Annexin IV and 7-AAD (BD) 1 ul each were added, followed by FACS analysis on ice for 15 min. The FACS instrument was taken with a FACSCanto II (BD Biosciences) and analyzed with a Flowjo v10.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • Fetal Bovine Serum added as a FACS buffer at 1500 rpm for 3 minutes with a centrifuge (Beck
  • NK92 cells were added to NK92 media with 0.1% BSA instead of 12.5% Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV) and 12.5% Horse serum (Gibco) in 5% CO 2 Incubated overnight in a 37°C incubator supplied with After centrifugation at 1000 rpm, 5 min, the supernatant of the existing culture medium was discarded, and a new 0.1% BSA culture medium was added again at a concentration of 1x10 5 /ml. Thereafter, peptides (control, cov1, cov2) were added to the NK92 cells at a concentration of 100 nM, and incubated in an incubator at 37° C.
  • Protein concentration was measured using a pierce BCA protein assay (thermo), and the concentration value was obtained after measuring with an ELISA (absorption 562 nm, MD) instrument.
  • the transferred membrane was blocked with 10 ml of 5% skim milk (LPS solution) for 1 hour, and then washed 3 times with PBST (phosphate-buffered saline + tween 20) for 5 minutes each.
  • PBST phosphate-buffered saline + tween 20
  • the primary antibodies, vav (Santa Cruz Biotechnology), p-vav (Santa Cruz Biotechnology), and beta-actin (Santa Cruz Biotechnology) were diluted 1000:1 with 1% BSA, and 10ml each was added to the membrane to be checked. The reaction was carried out for 1 hour and 30 minutes.
  • PBST phosphate-buffered saline + tween 20
  • the secondary antibody, mouse IgG was diluted 3000:1 with PBST, added 10ml each, reacted for 1 hour, and then again PBST (phosphate- Buffered saline + tween 20) was washed 3 times for 10 minutes each, and it was confirmed with a disposal (ATTA, LuminoGraph) device.

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Abstract

본 발명은 자연살해세포의 활성이 개선된 신규의 자연살해세포 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제조된 자연살해세포는 자연살해세포의 살상능, IFN-γ 생산능 등에서 개선된 활성을 가짐으로써 바이러스 감염에 대한 치료제, 면역 치료제, 암 치료제 등으로써 다양한 용도로 활용될 수 있다.

Description

자연살해세포 NKG2D 수용체에 결합하는 SARS-COV-2 S 단백질 유래 펩타이드를 이용한 자연살해세포 활성 증가 및 감염병, 암 예방 및 치료용 조성물
본 발명은 활성이 개선된 신규의 자연살해세포 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
SARS-CoV-2 감염으로 인한 COVID-19는 호흡기 질환을 일으키며 WHO에 의해 2020년 3월 11일에 Pandemic으로 선포되었다.
SARS-CoV-2의 감염은 환자의 면역체계 이상을 유도하며 T 세포와 natural killer cell (NK, 자연살해세포)의 결핍을 일으킴으로 심각한 면역결핍을 유도한다.
SARS-CoV-2 환자에서는 자연살해세포의 감소현상과 질환의 진행정도가 상관관계가 있음이 보고되었다. 자연살해세포는 인체의 선천성 면역을 유지하는 면역세포로 암세포나 바이러스가 감염이 된세포를 제거한다. 암세포나 바이러스가 감염이 된 세포를 자연살해세포가 활성 수용체를 통해 인식하고 이들 세포를 제거한다. 자연살해세포는 활성 수용체와 저해 수용체를 가지고 있고 이들 두 종류의 신호전달의 균형을 통해 활성을 조절한다. 코로나 환자에서 자연살해세포 수용체인 NKG2A 발현이 증가됨이 보고되었고 이 수용체가 치료제 개발의 타겟의 하나로 여겨지고 있다. 그러나 아직 코로나 환자에서 자연살해세포와 자연살해세포 수용체들의 역할은 잘 안 알려져 있다.
한편, 정상 상태에서 체내에 존재하는 대부분의 NK 세포는 비활성화 상태(inactivated state)로 존재하지만, 실제로 NK 세포를 치료용으로 이용하기 위해서는 활성화된 NK 세포가 필요하기 때문에 정상혈액으로부터 또는 비활성화된 환자 혈액으로부터 NK 세포를 활성화 시키는 연구가 활발히 진행되고 있다.
체외에서 NK 세포를 활성화시킴으로써 달성된 NK 세포의 높은 세포독성(cytotoxicity)은 NK 세포의 면역세포 치료 가능성을 확인시켜 주었다. 체외에서 활성화된 NK 세포는 다양한 암 종류, 특히 백혈병과 같은 혈액암을 대상으로 동종 골수이식 후에 투여함으로써 그 치료효과를 확인한 보고가 있다. 그러나, 혈액암이 아닌 고형암에 대해서는 NK 세포에 대하여 아직 임상적으로 뚜렷한 치료 효과가 입증되지 않고 있다. 구체적으로 NK 세포를 종양이 생기기 전부터 투여하여 종양의 생착을 방해할 수 있다는 보고가 있으나, 적합한 치료모델이라고 보기 어렵고, 복강으로 NK 세포를 투여하여 유방암 세포의 성장을 저해한 동물 실험결과도 있으나, NK 세포에 의한 효과인지 불분명하다.
NK세포에서 NKG2D 수용체는 매우 중요한 역할을 하는 수용체이다. 구체적으로, NKG2D 수용체는 자연살해세포의 활성 수용체로서 자연살해세포의 살상능을 조절하는 수용체이다. 인간의 경우 NKG2D 수용체에 결합하는 리간드가 최소 8종이 알려져 있다. 인간 NKG2D는 DAP10과 결합되어 있고 DAP10을 통해 세포내에 활성 신호를 전달한다. 생쥐 NKG2D는 DAP10, DAP12와 결합되어 신호전달을 한다. 암세포나 바이러스는 자연살해세포의 공격을 회피하기 위해 이들 리간드를 세포 밖으로 분비하여 자연살해세포로부터 회피한다.
인플루엔자 바이러스, HIV 등 여러 종류의 바이러스는 자연살해세포와 상호작용을 하면서 다양한 면역회피 기능을 갖고 있다. 바이러스는 자연살해세포와 직접 결합하여 자연살해세포 수용체의 신호전달을 억제하거나 혹은 사이토카인 분비를 조절한다. 일부 바이러스는 자연살해세포가 수용체를 통해 리간드를 인식하는 것을 방해한다. Cowpox 바이러스는 OMCP 단백질을 발현하는데 이 단백질은 NKG2D 리간드와 유사하여서 자연살해세포 NKG2D와 리간드의 결합을 억제한다.
이런 면에서 코로나 바이러스는 자연살해세포의 항바이러스 기능을 회피하기 위한 전략이 필요하다. 가능한 전략으로는 코로나 바이러스가 자연살해세포의 억제 수용체를 증가시키거나, HLA-I 단백질을 증가시켜 자연살해세포를 탈진 (exhaustion)시키거나, 혹은 자연살해세포이 가지고 있는 살상물질인 퍼포린이나 그랜자임 등을 감소시키는 것 등이 전략이 될 것이다. 혹은 코로나 바이러스가 자연살해세포의 세포사멸을 유도하여서 세포수를 격감시키는 것이다.
이런 관점에서 본 발명자들은 코로나 바이러스와 자연살해세포 수용체의 직접적인 결합을 살펴보고자 하였고 코로나 바이러스 S 단백질 유래 펩타이드가 NKG2D에 결합하고 자연살해세포의 기능을 조절함을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명자들은 코로나 바이러스 (SARS-CoV-2) 와 자연살해세포의 상호관계를 살펴보기 위해 코로나 바이러스의 Spike (S) 단백질의 펩타이드와 자연살해세포의 수용체인 NKG2D의 결합을 살펴보았고, 이들 펩타이드가 NKG2D의 결합을 통해 자연살해세포의 활성을 증가시킴을 관찰하여 코로나 바이러스가 직접 면역세포기능을 조절함을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에 따라, 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 펩타이드를 제공한다.
본 발명에서는 또한 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 펩타이드를 포함하는 자연 살해세포 배양용 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1의 펩타이드 및/또는 서열번호 2의 펩타이드로 처리되어 배양된 자연살해 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 자연살해 세포를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 약학적 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 펩타이드를, 자연살해(Natural Killer) 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 활성이 증진된 자연살해(Natural Killer) 세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 1) 단핵구로부터 CD3 양성인 T세포만을 제거하여 CD3 음성세포를 수득하는 단계; 및
2) 단계 1)의 CD3 음성세포에 IL-15 및 IL-21를 혼합처리하고, 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 펩타이드를 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 자연살해(Natural Killer) 세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 자연살해(Natural Killer) 세포를, 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명에서 쓰인 어떤 용어 및 과학적 용어는 당업계의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가지는 것을 의미한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 단수 형태인 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 분명히 지시하지 않는 한 복수형 지시대상을 포함한다.
또한, 용어 "선택적" 또는 "선택적으로"는 후속으로 기술되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수 있음을 의미하고, 상기 기술은 상기 사건 또는 상황이 발생한 예시 및 발생하지 않은 예시를 포함한다.
용어의 정의
용어 "자연 살해 세포(NK cell)"는 CD3 음성 CD56 양성의 단핵구를 말하고, 특히 MHC 클래스 I 분자의 발현이 적거나, 상기 발현이 소실되어 있는 세포에 대한 세포 상해 활성을 갖는다.
용어 "사이토카인 유도", "펩타이드 유도"는 사이토카인 및/또는 펩타이드와 접촉시킴으로서 이를 통해 자연살해 세포를 활성화, 자극, 또는 재자극하는 것을 언급한다. 이러한 유도는 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 36, 48 시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 10일, 12일, 14일, 3주 또는 그 이상 동안 접촉을 의미할 수 있다.
용어 '자극'이란 사이토카인, 펩타이드 등을 첨가하여 자연살해 세포의 특성의 변화를 유도하는 것을 의미한다. '재자극'이란 일정 배양 기간이 경과한 후, 배지에 적절한 사이토카인, 펩타이드 등을 다시 첨가하여 자연살해 세포 증식 및 특성 변화를 재유도하는 것을 의미한다.
본 발명에서 자연살해세포 수용체의 발현 증가 및 감소는 FACS를 통한 평균 Intensity 분석 결과를 기초로 한다. 구체적으로, 미처리된 대조군과 비교하여 %로 증가 및 감소를 표기할 수 있다. 또한, 종래의 일반적인 자연살해 세포, 사이토카인 등으로 자극되지 않은 자연살해세포 등의 발현 수준을 기초로 이와 대비하여 상대적인 증가 및 감소 배수로 나타낼 수 있다.
본 발명에서 "종래의 일반적인 자연살해 세포"란 인체 등으로부터 분리되어 별도의 추가적인 자극 공정 없이 인체에서 분리된 상태 그대로의 특성을 유지하는 자연살해 세포를 의미한다. 구체적으로, 통상의 알려진 자연살해 세포 분리 방법인 CD3 음성 및/또는 CD56 양성과 같은 특성을 지니는 세포를 단핵구 등으로부터 분리하는 방법 등을 통해 수득할 수 있는 자연살해세포를 의미한다.
발명의 내용
본 발명은 서열번호 1(FQFCND, 이하 cov1으로도 언급함)의 펩타이드 및/또는 서열번호 2(KCVNFNF, 이하 cov2로도 언급함)의 펩타이드를 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드는 자연살해세포의 NKG2D에 결합하고 자연살해세포의 기능을 조절할 수 있는 기능적 특징을 가진다.
본 발명에 따른 펩타이드로 서열번호 1의 펩타이드는 Sars-CoV-2의 S 단백질의 서열의 133-138번째 아미노산 서열에 해당한다. Sars-CoV-2의 S 단백질 서열은 서열번호 4에 나타내었다.
본 발명의 범주에서 본 발명에 따른 펩타이드는 상기 각각의 S 단백질의 서열에서 위 위치를 포괄하는 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, S 단백질의 서열의 133-138번째 아미노산 서열을 포함하는 서열로 132-138, 131-138, 130-138, 129-138 등과 같이, 상기 133-138 번째 아미노산 서열을 기초로 S 단백질의 앞쪽 서열을 추가로 더 포함할 수 있다. 또한, S 단백질의 서열의 133-138번째 아미노산 서열을 포함하는 서열로 133-139, 133-140, 133-141, 133-142 등과 같이, 상기 133-138를 기초로 S 단백질의 뒤쪽 서열을 추가로 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 S 단백질의 133-138번째 아미노산 서열을 기초로 앞쪽 및 뒤쪽 서열을 추가로 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드로 서열번호 2의 펩타이드는 Sars-CoV-2의 S 단백질의 서열의 537-543번째 아미노산 서열에 해당한다.
본 발명의 범주에서 본 발명에 따른 펩타이드는 상기 각각의 S 단백질의 서열에서 위 위치를 포괄하는 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, S 단백질의 서열의 537-543번째 아미노산 서열을 포함하는 서열로 536-543, 535-543, 534-543, 533-543 등과 같이, 상기 537-543 번째 아미노산 서열을 기초로 S 단백질의 앞쪽 서열을 추가로 더 포함할 수 있다. 또한, S 단백질의 서열의 537-543번째 아미노산 서열을 포함하는 서열로 537-544, 537-545, 537-546, 537-547 등과 같이, 상기 537-543를 기초로 S 단백질의 뒤쪽 서열을 추가로 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 S 단백질의 537-543번째 아미노산 서열을 기초로 앞쪽 및 뒤쪽 서열을 추가로 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 펩타이드를 이용할 수 있으며, 상기 펩타이드는, 서열번호 1의 펩타이드와 서열번호 2의 펩타이드를 각각 개별적으로 또는 동시에 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드를 융합한 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, "펩타이드", 및 "단백질"은 호환적으로 사용되며 아미노산 잔기의 중합체에 대한 언급을 포함한다. 상기 용어들을 천연 아미노산 중합체들뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체들에 적용한다. 상기 용어들을 또한 단백질이 작용성으로 남아있도록 보존적인 아미노산 치환을 함유하는 상기 중합체들에 적용한다. 본 발명에서 펩타이드는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 합성된 것일 수 있고, 바람직하게는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관 내에서 합성된 것일 수 있다.
본 발명에서, "생물학적으로 활성이 있는"은 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드와 유사한 구조적 기능, 및/또는 유사한 조절 기능, 및/또는 유사한 생화학적 기능을 갖는 펩타이드 단편 또한 본 발명에 따른 펩타이드를 의미한다.
본 발명은 상기 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 펩타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가지는 것으로, 생물학적 활성이 유지되는 서열을 본 발명의 범주에서 포함할 수 있다.
본 발명에서, "결실"은 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 없는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화로 정의된다.
본 발명에서, "삽입" 또는 "부가"는 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 부가로 인한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화이다.
본 발명에서, "치환"은 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 의해 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 교체에서 비롯된다.
한편, 치환 위치에서 바람직한 아미노산 변이는 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성의 유사성에 기반하여 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니나, 음으로 하전된(negatively charged) 아미노산으로서는 아스파르트산 및 글루타민산을 포함하며; 양으로 하전된(positively charged) 아미노산으로서는 리신 및 아르기닌을 포함하고; 그리고 유사한 친수성값을 가지는 비하전성 극성 헤드기를 가지는 아미노산으로서는 류신, 이소류신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신;을 들 수 있다. 상기 변이는 보존적 치환을 포함할 수 있다. '보존적 치환'이란, 어느 아미노산이 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산으로 치환되어 당업자라면 그 폴리펩타이드의 2차 구조 및 감수성질(hydropathic nature, 소수성 또는 친수성 성질)이 실질적으로 비변화되었다고 예측할 수 있는 치환이다. 일반적으로 하기 아미노산 군이 보존성 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.
경우에 따라서는, 상기 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 본원에 기재된 임의의 펩타이드 중 하나 이상을 코딩하는 핵산 서열(뿐만 아니라 핵산 서열을 함유하는 핵산 벡터), 및 이를 생산하는 방법을 포함한다.
본원에 기재된 하나 이상의 펩타이드의 재조합 발현을 위한 핵산 서열 및 벡터(예컨대, 발현 벡터)를 제작하기 위한 적합한 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 핵산 및 벡터는, 예컨대, 박테리아, 효모, 또는 포유동물 세포를 포함하는 광범위한 숙주 세포에서 펩타이드를 발현하는데 사용될 수 있다. 핵산 및 벡터는 또한, 예컨대, 하기에 기재된 바와 같은 생체내 및 생체외 방법에서 사용될 수 있다. 펩타이드 코딩 서열은 프로모터, 조절 요소, 또는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터 및/또는 인핸서 요소는 핵산에 의해 코딩된 펩타이드의 발현을 지시할 수 있다. 인핸서는 시간, 위치, 및 수준의 측면에서 발현 특이성을 제공한다. 프로모터와 달리, 인핸서는 프로모터가 존재하면 전사 개시 부위로부터 가변적인 거리에 위치할 때 기능할 수 있다. 인핸서는 또한 전사 개시 부위의 하류에 또는 관련 유전자의 엑손에 위치할 수 있다. 코딩 서열을 프로모터의 제어 하에 두기 위해, 펩타이드의 번역 리딩 프레임의 번역 개시 부위를 프로모터의 하류(3')의 1 내지 약 50 뉴클레오타이드 사이에 위치시킬 필요가 있다.
관심있는 프로모터는, 비제한적으로, 사이토메갈로바이러스 hCMV 즉시 초기 유전자, SV40 아데노바이러스의 초기 또는 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, 파아지 A의 주요 조작자 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질의 제어 영역, 3 포스포글리세레이트 키나제에 대한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 및 효모 α 교배 인자의 프로모터, 아데노바이러스 EIb 최소 프로모터, 또는 티미딘 키나제 최소 프로모터를 포함한다.
재조합 벡터는 다양한 방법을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있고, 상기 방법은, 적어도 부분적으로, 핵산이 도입되는 세포의 유형에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 세포는 전기천공 또는 열 충격과 같은 방법을 사용하여 형질전환될 수 있다. 효모 세포를 형질감염시키기 위한 방법은, 예컨대, 스페로플라스트(spheroplast) 기술 또는 전체-세포 염화리튬 효모 형질전환 방법을 포함한다. 동물 세포의 형질감염은, 예를 들어, 인산칼슘, 전기천공, 열 충격, 리포솜, 또는 형질감염 시약, 예컨대 FUGENE 또는 LIPOFECT AMINE　을 사용하거나, 또는 네이키드(naked) 핵산 벡터를 용액 중의 세포와 접촉시킴으로써 벡터를 세포에 도입하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본원에 기재된 펩타이드의 소규모 또는 대규모 생산에 사용될 수 있는 발현 시스템은, 비제한적으로, 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물; 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 진균(예컨대, 효모(예를 들어, 사카로마이세스 및 피키아)); 재조합 바이러스 발현 벡터로 감염된 곤충 세포 시스템(예를 들어, 배큘로바이러스); 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 및 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, CMV 프로모터, SV40 프로모터, 또는 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 작제물을 갖는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, VERO, HeLa, MDCK, WI38, 및 NIH 3T3 세포)을 포함한다. 또한, 플라스미드 벡터로 형질감염되거나 또는 바이러스 벡터(예컨대, 특히 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 약독화 백시니아 바이러스, 카나리아수두 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스와 같은 바이러스 벡터)로 감염된 포유동물로부터 직접 수득된 일차 또는 이차 세포가 숙주 세포로서 유용하다.
본원에 기재된 임의의 펩타이드의 발현 후, 펩타이드는 표준 기술을 사용하여 배양 세포로부터, 또는 세포가 배양된 배지로부터 단리될 수 있다. 단백질을 단리하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예컨대, 액체 크로마토그래피(예컨대, HPLC), 친화성 크로마토그래피(예컨대, 금속 킬레이션 또는 면역친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피, 소수성-상호작용 크로마토그래피, 침전, 또는 차등 가용화(differential solubilization)를 포함한다.
펩타이드(예컨대, 200개 미만(예컨대, 175개 미만, 150개 미만, 125개 미만, 100개 미만, 90개 미만, 80개 미만, 70개 미만, 또는 60개 미만)의 아미노산을 갖는 펩타이드)는 FMOC 고상 합성과 같은 표준 화학적 방식에 의해 화학적으로 합성될 수 있다.
본 발명에서는 또한 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 펩타이드를 포함하는 자연 살해세포 배양용 조성물을 제공한다.
상기 조성물을 투여하고 배양된 자연 살해 세포는, 다른 사이토카인을 투여하여 배양한 군에 비하여, IFN-감마 (interferon-gamma)의 분비가 증가된 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물을 투여하고 배양된 자연 살해 세포는, 다른 사이토카인을 투여하여 배양한 군에 비하여, 암세포에 대한 세포 독성이 증가한 것일 수 있고, 암세포의 세포사멸(apoptosis)을 촉진하는 것일 수 있다.
상기 자연살해 세포는, 예를 들면, 포유동물, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 자연살해 세포는 정상인 또는 암환자로부터 수득한 것일 수 있다. 상기 자연살해 세포는 혈액, 말초혈액 단핵구(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC)로부터 분리된 것일 수 있다. 혈액을 분리하는 방법, 이로부터 PBMC를 분리하는 방법, 이로부터 자연살해 세포를 분리하는 방법은 공지된 방법으로 수행되는 것 일 수 있다. 상기 자연살해 세포는 CD3- 및 CD56+의 표면 항원 특성을 갖는 것일 수 있다.
자연살해 세포 배양 배지 중에 상기 펩타이드들의 농도는 예를 들어 약 1 nM 내지 1000 nM, 10 nM 내지 800 nM, 20 nM 내지 600 nM 등일 수 있으며, 해당 조건은 배양하는 환경 및 조건에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에 따른 배양 배지는 보다 바람직하게 사이토카인을 더 포함할 수 있으며, 이러한 사이토카인은 예를 들어, IL-15, IL-21, IL-2 등을 포함하며, 보다 바람직하게 IL-15 및 IL-21를 포함한다. IL-15, IL-21는 각각 5 ng/ml 내지 50 ng/ml, 바람직하게 10 내지 30 ng/ml로 처리할 수 있다.
상기 배지는 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 물질을 의미한다. 상기 배지는 세포 배양에 이용될 수 있는 것이라면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, MEM-α (Minimal Essential Medium-α), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax ±배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, 및 Chang's Medium 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 배지는 영양성분이나, pH 조정제, 항생물질, 알부민, 혈청 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 그 외 배양조건은 통상의 자연 살해세포 배양 조건에 따른다.
예를 들어, 배양은 통상의 세포배양 조건 즉, 약 37℃, CO2 배양기에서 수행될 수 있으며, 배양액을 2일 혹은 3일에 한 번씩 첨가해 주면서 계속적으로 배양할 수 있다. 배양기간은 예를 들면 7~20일, 8~18일, 10~16일, 10~15일 또는 10~14일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 원하는 자연살해 세포 수의 수득을 위해 상기 배양일 수 범위 내 또는 범위 밖에서 적절히 설정할 수 있다. 배양 용기는, 상업적으로 입수 가능한 디쉬, 플라스크, 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 배양백을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 펩타이드를, 자연살해 (Natural Killer) 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 활성이 증진된 자연살해(Natural Killer) 세포의 제조방법을 제공한다.
상기 활성이 증진된 자연살해 세포의 제조 방법은 앞서 배지에서 언급된 사항이 적절히 적용될 수 있다.
또한, 상기 배양하는 단계 전에, 말초혈액으로부터 말초혈액 단핵구(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC)를 수득하는 단계; 및 수득된 PBMC로부터 자연살해 세포를 분리하는 단계;를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 1) 단핵구로부터 CD3 양성인 T세포만을 제거하여 CD3 음성세포를 수득하는 단계; 및
2) 단계 1)의 CD3 음성세포에 IL-15 및 IL-21를 혼합처리하고, 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 펩타이드를 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 자연살해(Natural Killer) 세포의 제조방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 단계 1)은 CD3 양성인 T 세포와 적혈구가 교차결합하도록 한 후 원심분리 시 밀도구배를 이용하여 CD3 음성세포를 분리함으로써 수행되는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 1)의 CD3 양성인 T 세포와 적혈구가 교차결합하도록 한 후 원심분리 시 밀도구배를 이용하여 CD3 음성세포의 분리는 CD3 음성세포를 이용하는 항체를 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 STEMCELL Technologies 사에서 제조, 판매하는 RosetteSepTM Human NK Cell Enrichment Cocktail 이라는 제품을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 제품은 CD3, CD4, CD19, CD36, CD66b, CD123, 및 글라이코포린 A(glycophorin A)을 인식하는 사합체 항체(tetrameric antibody)의 칵테일(cocktail)이다. CD3 양성 세포, CD4 양성 세포, CD19 양성 세포, CD36 양성 세포, CD66b 양성 세포, CD123 양성 세포는 글라이코포린 A를 발현하는 적혈구와 함께 사합체 항체에 결합하여 교차결합을 이룬다. 그 후 원심분리를 하면 상기 세포들은 밀도구배에 의해 펠렛을 이루고, 상층부에서 CD3 음성인 자연살해 세포가 고농도로 밀집된 배지를 수득할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 단계 2)의 배양은 10 내지 24일간 배양하는 것일 수 있으나, 배양된 세포가 CD3-CD56+의 특징을 나타내는 것을 확인함으로써 배양기간을 결정할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 배양은 정치배양(stationary culture) 또는 부유배양(suspension culture) 방법을 사용할 수 있고, 정치배양은 배양기에 교반(agitating) 또는 진탕(shaking)없이 방치한 상태에서 배양하는 것을 의미하며, 부유배양은 통기(aeration)나 교반 등을 통해 세포들이 반응기의 하부 또는 측면부에 부착되지 않고 현탁된 상태에서 배양하는 것을 의미한다. 또한, 정치배양을 위한 반응기와 부유배양을 위한 반응기는 동일한 것일 수도 있고, 상이한 것일 수도 있다. 예를 들어, 정치배양을 위한 반응기와 부유배양을 위한 반응기가 동일한 것인 경우에는 동일한 반응기에서 정치배양이 완료된 후, 사이토카인 등의 필요한 영양성분을 포함하는 배지를 추가적으로 공급하여 부유배양 방식으로 배양하는 것이 가능하며, 상이한 종류의 배양기를 사용하는 경우에는 정치배양이 완료된 후에 배양물을 부유배양을 위한 반응기로 옮겨 부유배양 할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 펩타이드로 처리되어 배양된 자연살해 세포를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 자연살해 세포는 CD3-CD56+인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 자연 살해 세포는, IFN-감마 (interferon-gamma)의 분비가 증가된 것일 수 있다. 또한 세포 독성이 증가한 것일 수 있고, 암세포의 세포사멸(apoptosis)을 촉진하는 것일 수 있다. 또한, vav1 (Vav Guanine Nucleotide Exchange Factor 1)활성이 증진된 것일 수 있다.
즉, 우수한 자연살해 세포 활성화 수용체 발현능, 암세포, 바이러스 감염 세포 및 특정 면역 세포 등에 대한 우수한 살상능, 높은 인터페론-γ의 발현 등을 통해 기능적으로 우수한 자연살해 세포가 제공된다.
보다 바람직하게 본 발명에 따른 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 펩타이드로 처리되어 배양된 자연살해 세포는 앞서 언급된 배양 공정들을 통해 제조된 세포일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 자연살해 세포를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 약학적 용도를 제공한다.
본 발명은 상기 방법으로 제조된 자연살해 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 방법으로 제조된 자연살해 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 세포치료제(cellular therapeutic agent)"를 의미한다. 본 발명의 용어 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"란, 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 제제화할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 액제, 현탁제, 분산액, 유제, 겔제, 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 주사제가 될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 주사제로 제제화하는 경우, 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여 주사제로 사용가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 주사제는 안정화제 또는 용해 보조제와 함께 주사용수에 용해시킨 후, 멸균처리, 특히 고온감압멸균법 또는 무균여과법에 의해 멸균처리하여 제조될 수 있다. 상기 주사용수로는 주사용 증류수 또는 주사용 완충용액, 예를 들어 pH 3.5 내지 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨(NaH2PO4)-구연산 완충용액을 사용할 수 있다. 사용되는 인산염은 나트륨염 또는 칼륨염 형태이거나 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하고, 구연산 또는 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하다.
또한, 본 발명에서 사용되는 안정화제는 나트륨 피로설파이트(sodium pyrosulfite), 중아황산나트륨(NaHSO3), 메타중아황산나트륨(Na2S2O3) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)을 포함하고, 용해 보조제는 수산화나트륨(NaOH), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 탄산나트륨(NaCO3) 또는 수산화칼륨(KOH)과 같은 염기, 또는 염산(HCl) 또는 아세트산(CH3COOH)과 같은 산을 포함한다.
본 발명에 따른 주사제는 생체흡수성, 생체 분해성, 생체적합성으로 제형화될 수 있다. 생체흡수성이라 함은 주사제가 체내에서, 분산된 주사제의 분해 또는 분해 없이, 초기 적용에서 사라질 수 있음을 의미하는 것이다. 생체 분해성은 가수분해 또는 효소 분해에 의해 주사제가 체내에서 파쇄 또는 분해될 수 있음을 의미한다. 생체적 합성은 성분 모두가 체내에서 무독성임을 의미한다.
본 발명에 따른 주사제는 통상의 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 계면활성제 등의 희석제, 또는 부형제 등을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 유효성분은 목적에 따라 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 피하, 자궁내 경막, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로 등을 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 정맥내로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 유효성분은 주사 또는 카테터로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 유효성분의 투여량은 체중 60 kg 성인기준으로 1 x 101 - 1 x 1050개 / kg, 바람직하게는 1 x 101 - 1 x 1030개 / kg, 보다 바람직하게는 1 x 105 - 1 x 1020개 / kg, 가장 바람직하게는 1 x 107 - 1 x 109개 / kg의 범위 내에서 조절할 수 있다. 다만, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서 유효성분은, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 함유될 수 있다. 그러나 함량은 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 상기 방법으로 제조된 자연살해 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 자연살해 세포에 의해 치료될 수 있는 암이면 제한이 없으며, 예컨대 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 대장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 대장암, 폐암, 간암, 췌장암 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 암일 수 있다.
본 발명은 상기 방법으로 제조된 자연살해 세포를 포함하는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 감염성 질환은 바이러스 또는 병원균의 감염에 의해 발생하는 질환으로, 호흡기 및 혈액, 피부접촉 등을 통해 전염되어 감염될 수 있는 질환을 모두 포함하는 개념이다.
이러한 감염성 질환의 비제한적인 예로서는 B형 및 C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus: HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환, 인플루엔자 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로 바이러스성 호흡기 질환은 Sars-Cov-2 감염 질환일수도 있다. 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염에 따른 질환은 호흡기 질환일 수 있다. 상기 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환은 예를 들어 바이러스 감염 후 2일 내지 14일의 잠복기를 거친 뒤 증상이 나타날 수 있다. 이러한 증상은 예를 들어, 고열, 기침, 숨가쁨, 폐렴, 설사와 같은 위-장관 증상, 기관 기능 부전(신부전, 신장 기능장애 등), 패혈성 쇼크, 심한 경우 사망을 포함하여, 상기 바이러스 감염에 의해 발생되는 증상이라면 어떠한 것이라도 포함된다.
본 발명은 상기 자연살해 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 암 치료가 필요한 대상체에게 치료학적으로 유효한 양으로 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 자연살해 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 감염성 질환 치료가 필요한 대상체에게 치료학적으로 유효한 양으로 투여하여 감염성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어 치료가 필요한 대상체는 인간을 포함하는 포유류가 될 수 있다. 예를 들어 인간, 개, 고양이, 말 등이 될 수 있다.
본 발명은 암 및/또는 감염성 질환 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 자연살해 세포의 용도를 제공한다.
암 및/또는 감염성 질환 치료에 사용하기 위한 상기 자연살해 세포를 제공한다.
본 발명에 따라 제조된 자연살해세포는 자연살해세포의 살상능, IFN-γ 생산능 등에서 개선된 활성을 가짐으로써 바이러스 감염에 대한 치료제, 면역 치료제, 암 치료제 등으로써 다양한 용도로 활용될 수 있다. 특히, 코로나 바이러스 S 단백질 유래 펩타이드를 통해 자연살해세포의 기능을 직접 조절함으로서 우수한 활성을 나타낼 수 있는 자연살해세포를 제조할 수 있다는 점에서도 또한 우수한 발명의 특징을 가진다.
도 1A는 코로나 바이러스 (SARS-CoV-2)의 S 단백질의 전체 아미노산 서열과 첫째 펩타이드 (FQFCND, cov1 peptide #1, 133-138번째 사이의 펩타이드), 두 번째 펩타이드 (KCVNFNF, cov2 peptide #2, 537-543번째 사이의 펩타이드), 대조군 펩타이드 (QELGKYE, control peptide, 1201-1207번째 펩타이드) 위치를 나타낸다 (굵은 밑줄). 여기서, 밑줄 부분은 코로나 바이러스가 타겟세포 수용체인 ACE2에 결합하는 수용체 결합 도메인을 나타낸다. 도 1B 및 1C는 cov1 peptide #1과 NKG2D의 결합 예측도 (B)와 cov2 peptide #2과 NKG2D의 결합 예측도 (C)를 나타낸다.
도 2A는 FITC가 결합된 대조군 펩타이드와 cov2 펩타이드가 NK92세포와 결합하는 것을 유세포 분석기로 분석한 도면이다. cov2 펩타이드는 자연살해세포와 잘 결합을 하였지만 대조군 control 펩타이드는 자연살해세포와 전혀 결합을 하지 않음을 확인한 결과를 나타낸다. 또한, 도 2B는 이의 결합정도를 정량적으로 표시한 결과를 나타낸다. 도 2C는 FITC가 결합된 대조군 펩타이드와 cov2 펩타이드가 primary NK세포와 결합하는 것을 유세포 분석기로 분석한 도면이다. cov2 펩타이드는 자연살해세포와 잘 결합을 하였지만 대조군 control 펩타이드는 자연살해세포와 전혀 결합을 하지 않음을 확인한 결과를 나타낸다. 도 2D는 이의 결합정도를 정량적으로 표시한 결과를 나타낸다.
도 3은 펩타이드가 자연살해세포 살상능를 증가시키는 결과를 나타낸다. 도 3A는 대조군 펩타이드 첨가한 경우의 살상능보다 cov1, cov2 펩타이드를 첨가한 경우에서 H460 폐암세포주에 대한 살상능이 더욱 증가함을 확인한 결과를 나타낸다. 또한, 도 3B는 다른 폐암세포주인 H385, H3122 세포에 대한 살상능도 증가함을 나타낸다. 도 3C는 Primary 자연살해세포를 사용하였을 경우에도 H460 폐암세포주에 대한 살상능을 cov1 펩타이드, cov2 펩타이드가 증가시키는 것을 나타낸다. (*p<0.05; **p<0.01, student t-test).
도 4는 펩타이드가 자연살해세포의 IFN-γ의 생산에 미치는 영향을 분석한 결과이다. NK-92세포와 H460 폐암세포의 co-culture시 다양한 농도의 펩타이드를 처리하고 24시간 후에 배양액에서의 IFN-γ 생산을 측정한 결과이다.
도 5는 펩타이드가 자연살해세포 세포사멸에 미치는 효과를 분석한 결과이다. 도 5A는 펩타이드를 단독으로 primary NK세포에 48시간을 처리하였을 시, primary NK세포의 세포사멸에는 효과 측정한 결과이며, 도 5B는 primary NK와 H460 폐암세포주의 48 시간 co-culture시 펩타이드가 primary NK세포의 세포사멸에 미치는 효과를 측정한 결과이다.
도 6은 cov1 및 cov2 펩타이드가 vav1 활성을 통해 자연살해세포의 활성을 유도함을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> NK92 세포, 폐암 세포주 H460 세포 및 primary NK 세포 배양
NK92 세포 배양
NK92 세포는 5 % CO2가 공급되는 37℃ water jacketed incubator (Thermo electron corporation)에서 배양하였다. ATCC 배양조건을 따라 12.5 % Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV) 과 12.5 % Horse serum (Gibco)을 첨가한 alpha-MEM (Welgene) 배양액에 0.2 mM myo inositol, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.02 mM folic acid, 1 % antibiotics-antimycotic (Gibco) 와 IL-2 cytokine (Peprotech) 20 ng/ml 농도로 첨가하여 배양액으로 사용하였다. 세포는 1x105/ml 의 농도로 75T Flask (Thermo)에 20-30 ml 정도로 배양하였으며, 2-3일 마다 1000 rpm, 5분 동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 배양액을 교환하였다.
폐암 세포주 H460 세포 배양
살상능 시험에서 타겟 세포주로 폐암 세포주인 H460을 배양하여 사용하였다. H460 세포는 ATCC 배양조건을 따라 10 % Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV)이 첨가된 RPMI (Welgene)배양액에 1 % antibiotics-antimycotic (Gibco)를 추가한 배양액을 사용하였으며, 5 % CO2가 공급되는 37℃ water jacketed incubator (Thermo electron corporation)에서 배양하였다. 세포는 2x105/ml의 농도로 100mm x 20mm cell culture dish (corning) 에 10 ml 정도로 배양하였다. 2-3일 마다 세포 관찰 및 배양액을 교환하였으며, H460은 부착세포이기 때문에 배양액 교환시 상층액을 모두 덜어내어, 0.25% Trysin-EDTA (Gibco) 2 ml로 3분간 37℃에서 반응시킨 후, 부착세포를 떼어내어 1000 rpm, 5분동안 centrifuge(Beckman Coulter)로 원심분리하여 새로운 배양액으로 교환하는 방법을 사용하였다.
primary NK 세포 배양
병원으로부터 기증받은 제대혈 (IRB승인번호 P01-201610-31-002)에 혈액 ml 당 2 ul 씩 Rosettesep cocktail (STEMCELL technologies)을 첨가하여 20분간 반응시킨 후, 15ml씩 분주된 Ficoll (GE healthcare, Ficoll-paque premium) 에 Rosettesep 반응시킨 혈액 35ml 씩 서서히 올린다. 이때 혈액과 ficoll층이 섞이지 않도록 주의해야 한다. 혈액에서의 세포층 분리를 위해 2000 rpm, Decel 0, 25분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 혈액으로부터 적혈구 및 CD3 세포를 분리 배출하였다. CD3가 분리된 세포를 ACK buffer 10ml로 10분 동안 반응시켜 남아있는 적혈구를 제거해 준 후, 2% Fetal Bovine Serum가 첨가된 PBS(phosphate-buffered saline)를 사용하여 2회 세척을 진행하였다. 세척은 1500 rpm, 5분간 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이렇게 얻어진 세포를 사용하여 NK 세포로 배양을 진행하였다.
NK 세포 배양 조건은 10 % Fetal Bovine Serum(Corning, united states origin, 35-015-CV)을 첨가한 alpha-MEM (Welgene) 에 10 ng/ml IL-15(Peprotech), 10 ng/ml IL-21(Peprotech), 10-6 M HC(Peprotech)과 1 % antibiotics-antimycotic (Gibco)를 추가하여 배양하였다. 세포배양농도는 2x106/ml 의 농도로 6 well plate에 배양하였으며, 2-3일 마다 1200 rpm, 5분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 배양액을 교환하였다.
NK세포의 분화정도는 3일마다 FACSCanto II (BD Biosciences) 유세포 분석기로 확인하였다.
FACS 분석은 2x104 세포를 각 FACS tube (Falcon) 에 담아 FACS buffer로 사용되는 Fetal Bovine Serum가 첨가된 PBS(phosphate-buffered saline)로 1500 rpm, 3분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 세척한 후 상층액을 제거하여 100 ul의 FACS buffer를 첨가하였다. CD56 APC (BD) antibody와 CD3 PE (BD) antibody를 각각 1ul 씩 첨가한 후 4℃에서 20분간 염색한 후, FACS buffer를 500ul씩 추가하여 1500 rpm, 3분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 세척하였다. 상층액을 제거한 후 200 ul의 FACS buffer를 첨가하여 FACSCanto II (BD Biosciences)로 분석을 진행하였다.
보통 배양 7-9 일째 CD56 분화도가 90% 정도 확인되었으며, 분화가 확인된 NK세포를 사용하여 실험을 진행하였다.
<실시예 2> Sars-Cov2의 S 단백질 유래 펩타이드의 제조
SARS-CoV-2 바이러스는 S 단백질을 통해 세포표면에 결합하여 세포내로 침투한다. S 단백질과 자연살해세포 수용체인 NKG2D의 결합을 살펴보기 위해, S 단백질 유래 펩타이드 중에 NKG2D에 결합할 수 있는 펩타이드를 염기서열 분석을 통해 탐색하였고 이중 결합 확률이 높은 2개의 펩타이드를 선별하였다(도 1A).
첫째 펩타이드는 6개의 아미노산으로 구성되었고 (FQFCND, cov1 peptide #1-서열번호 1) S 단백질의 133-138번째 사이의 펩타이드이다. 두 번째 펩타이드는 7개의 아미노산을 구성되었고 (KCVNFNF, cov2 peptide #2-서열번호 2) S 단백질의 537-543 번째 사이의 펩타이드이다. 대조군 펩타이드 (con peptide)는 7개의 아미노산으로 (QELGKYE, control peptide-서열번호 3)구성된 S 단백질의 1201-1207번째 펩타이드이다.
이들 펩타이드와 NKG2D의 결합을 PepSite2 단백질-펩타이드 결합예측 프로그램으로 분석하였다. cov1 (도 1B) 및 cov2 (도 1C) 펩타이드가 NKG2D의 표면 단백질과 잘 결합할 수 있는 구조를 가지고 있음을 예측할 수 있었다.
위 내용을 기초로 펩타이드 합성을 수행하였다. Control 펩타이드(Q-E-L-K-Y-E), cov1 펩타이드(F-Q-F-C-N-D), cov2 펩타이드 (K-C-V-N-F-N-F)를 peptron사로부터 제작하였다. 추가로 FITC-control 펩타이드 (FITC-Ahx-Q-E-L-K-Y-E), FITC-cov2 펩타이드 (FITC-Ahx-K-C-V-N-F-N-F)를 peptron사로부터 제작하였다. 펩타이드를 각 용매액에 녹인 후 100uM 농도로 분주하여 deep freezer에 보관하였다.
<실시예 3> 펩타이드와 NK세포의 결합 분석
NK92 2x104 세포를 각 FACS tube에 담아 FACS buffer로 사용되는 Fetal Bovine Serum가 첨가된 PBS(phosphate-buffered saline) 로 1500 rpm, 3분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 세척한 후 상층액을 제거하여 100 ul의 FACS buffer를 첨가하였다. Control FITC와, cov2 FITC를 각 농도에 맞게 10 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 300 nM 씩 첨가하여 4℃에서 20min 동안 염색하였다. 염색이 완료한 세포를 FACS buffer를 500ul씩 추가하여 1500 rpm, 3분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 세척하였다. 상층액을 제거한 후 200 ul의 FACS buffer를 첨가하여 FACSCanto II (BD Biosciences)로 분석을 진행하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
cov2 펩타이드는 농도의존적으로 NK-92 세포와 잘 결합하였으나, 대조군 펩타이드는 자연살해세포와 전혀 결합하지 않음을 확인할 수 있었고(도 2A,B), 동일한 펩타이드들의 primary 자연살해세포와 결합을 분석하였을 때도 cov2 펩타이드만 농도의존적으로 결합함을 관찰할 수 있었다(도 2C,D).
이로써 cov2 펩타이드가 선택적으로 자연살해세포와 결합함을 확인하였다.
<실시예 4> 펩타이드 농도별 살상능 비교
기존 NK92 배양액 조건에서 12.5 % Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV) 과 12.5 % Horse serum (Gibco)을 대신하여 0.1% BSA를 첨가된 NK92 media에 NK92 세포를 5% CO2가 공급되는 37℃ incubator에서 밤새 배양하였다. 1000 rpm, 5 min 원심분리를 하여 기존 배양액의 상층액을 버린 후, 1x105/ml 농도로 다시 새로운 0.1% BSA 배양액을 첨가해주었다. 이후, NK92 세포에 펩타이드 (control, cov1, cov2)를 0 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM 농도로 2시간 동안 37℃ incubator에서 반응시킨 후, 살상능 시험의 effect 세포로 사용하였다. 살상능 시험은 calcein-AM법으로 진행하였다.
살상능 시험은 먼저 타겟 세포인 H460 세포를 1x106 세포/1ml 배양액에 calcein-AM (invitrogen) 5 ul 첨가하여 1시간동안 37℃ incubator에서 염색한 후 1000 rpm, 5분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 세척하였다. Calcein-AM 염색된 타겟 세포를 각 조건의 effect 세포에 확인하고자 하는 비율대로 세포수를 계산하여 96-well round plate (corning)에 넣어준 후 100 rcf, 1분간 원심분리 하여 37℃에서 4시간동안 인큐베이션하였다. NK92 세포가 effector로 사용될 경우 E:T 비율은 20:1로 하였으며, primary NK의 경우는 살상능이 높게 나오기 때문에 E:T 비율을 10:1로 진행하였다. 이후 100 rcf, 5 분 원심분리 후 상층액만을 사용하여 96well black plate에 100ul 씩 조심스레 옮겨준 후 ELISA(형광 480nm/ 530nm, MD) 분석을 하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
NK92 세포에 cov1 펩타이드, cov2 펩타이드 모두 농도별로 첨가 시, 살상능이 증가하는 것으로 보였으며, 특히 control 펩타이드 첨가한 경우의 살상능보다 cov1, cov2 펩타이드를 첨가한 경우에서 살상능이 더욱 증가함을 확인하였다 (도 3A).
또한, 다른 폐암세포주인 H385, H3122세포를 타겟으로 하여, 펩타이드 100 nM의 농도로 처리한 NK92에서의 살상능을 비교하였다. 펩타이드를 처리한 경우 H385, H3122세포에 대한 살상능이 증가됨을 알 수 있었다 (도 3B).
한편 Primary 자연살해세포에 대한 효과를 측정하기 위해 각각의 펩타이드를 분화된 자연살해세포에 100 nM 첨가하여 2시간 반응시킨 후, 폐암세포주인 H460을 타겟으로 하여 살상능을 시험한 결과, 펩타이드를 첨가하지 않은 군과 control 펩타이드 100 nM을 첨가한 군보다 cov1 펩타이드, cov2 펩타이드 100 nM 첨가한 군에서 살상능이 증가하는 것을 확인하였다 (도 3C).
<실시예 5> IFN-γ 측정
기존 NK92 배양액 조건에서 12.5 % Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV) 과 12.5 % Horse serum (Gibco)을 대신하여 0.1% BSA를 첨가된 NK92 media에 NK92 세포를 5% CO2가 공급되는 37℃ incubator에서 밤새 배양하였다. 1000 rpm, 5 min 원심분리를 하여 기존 배양액의 상층액을 버린 후, 1x105/ml 농도로 다시 새로운 0.1% BSA 배양액을 첨가해주었다. 이후, NK92 세포에 펩타이드 펩타이드 (control, cov1, cov2)를 0 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM 농도로 2시간 동안 37℃ incubator에서 반응 시킨 후, 24시간, 48 시간 상층액을 모았다. 또한, H460 폐암세포주를 1x105/ml 농도로 각 well에 1일전 미리 배양하여 부착시킨 후, 각 농도별로 peptide를 2시간 동안 전처리한 NK92 co-culture하여 24시간, 48시간 37℃ incubator에서 배양하면서 상층액을 모았다. Human IFN Gamma uncoated ELISA kit (invitrogen) 를 사용하여 얻어진 상층액의 IFN-γ 양을 ELISA (흡광 450nm, MD) 분석을 하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
NK세포가 활성화가 되면 IFN-γ를 생산하는데, 본 발명에 따른 cov1, cov2 펩타이드를 처리한 경우에서 control 펩타이드를 처리한 경우에 비해 IFN-γ 생산이 증가함을 알 수 있었다 (도 4).
<실시예 5> 세포사멸 측정
펩타이드가 자연살해세포의 활성을 증가시키는 결과를 바탕으로 펩타이드를 오랜시간 처리하였을 때 면역세포들에서 관찰되는 활성-유도 세포사멸(activation-induced cell death)을 측정하였다.
기존 NK 배양액 조건에서 12.5 % Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV)과 12.5 % Horse serum (Gibco)을 대신하여 0.1% BSA를 첨가된 NK92 media에 NK92 세포를 5% CO2가 공급되는 37℃ incubator에서 밤새 배양하였다. 1000 rpm, 5 min 원심분리를 하여 기존 배양액의 상층액을 버린 후, 1x105/ml 농도로 다시 새로운 0.1% BSA 배양액을 첨가해주었다. 이후, NK 세포에 펩타이드(control, cov1, cov2)를 0 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM 농도로 첨가하여 37℃ incubator에서 배양하면서, 48시간 동안 배양하였다. 또한 전날 H460 폐암세포주를 같은 비율인 1x105/ml 농도로 각 well에 미리 배양하여 부착시킨 후, 각 농도별로 펩타이드가 첨가된 NK세포와 co-culture하여 48시간 37℃ incubator에서 배양하면서 세포를 얻었다.
이렇게 얻은 세포는 FACS tube에 담아 FACS buffer로 사용되는 Fetal Bovine Serum가 첨가된 PBS(phosphate-buffered saline) 로 1500 rpm, 3분동안 centrifuge (Beckman Coulter)로 원심분리하여 세척한 후 상층액을 제거하여 100 ul의 FACS buffer를 첨가하였다. CD56 APC (BD) FACS antibody를 1ul 첨가하여, ice에서 20분 인큐베이션하였다. 그 후 1700 rpm, 분 centrifuge로 세척하여 다시 200 ul의 FACS buffer를 첨가한 후 Annexin IV와 7-AAD (BD) 1ul씩 추가하여 ice에서 15min 뒤 FACS 분석을 진행하였다. FACS 기기는 FACSCanto II (BD Biosciences)로 찍었으며, Flowjo v10으로 분석하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 펩타이드를 단독으로 primary NK세포에 48시간을 처리하였을 때, 살상능 유도와는 달리 NK세포의 세포사멸에는 커다란 차이가 없었다(도 5A). 또한 primary NK와 H460 폐암세포주를 co-culture하면서 펩타이드를 처리하였을 때도 NK세포의 세포사멸에는 커다란 영향을 주지 못하였다 (도 5B). 이러한 결과로부터, 펩타이드가 자연살해세포의 세포사멸에는 영향을 주지 않음을 관찰할 수 있었다.
<실시예 6> vav1 신호전달 측정
기존 NK92 배양액 조건에서 12.5 % Fetal Bovine Serum (Corning, united states origin, 35-015-CV)과 12.5 % Horse serum (Gibco)을 대신하여 0.1% BSA를 첨가된 NK92 media에 NK92 세포를 5% CO2가 공급되는 37℃ incubator에서 밤새 배양하였다. 1000 rpm, 5 min 원심분리를 하여 기존 배양액의 상층액을 버린 후, 1x105/ml 농도로 다시 새로운 0.1% BSA 배양액을 첨가해주었다. 이후, NK92 세포에 세포에 펩타이드(control, cov1, cov2)를 100 nM 농도로 첨가하여 37℃ incubator에서 0분, 5분, 10분, 30분 동안 배양하였다. 세포는 즉시 13,000 rpm에서 5분 원심분리를 하여 상층액은 버리고, 세포만을 얻었다. RIPA II cell lysis buffer (genDEPOT) 에 protease inhibitor 와 phosphotase inhibitor를 첨가한 buffer를 100ul을 넣어 세포를 잘 풀어준 후, ice에서 15분간 lysis 시켰다. 13,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액만을 얻어 농도를 측정하였다.
단백질 농도측정은 pierce BCA protein Assay (thermo)를 사용하여 진행하였으며, ELISA (흡광 562nm, MD) 기기로 측정한 후 농도값을 얻었다.
10ug의 농도로 동일하게 SDS-PAGE에 전기영동을 진행한 후 immobilon-P transfer membrane(0.45um size, Merck millipore) 에 30v로 밤새 트랜스퍼하였다.
트랜스퍼된 멤브레인을 5% skim milk(LPS solution) 10ml로 1시간동안 blocking 한 후, PBST (phosphate-buffered saline + tween 20) 로 5분씩 3회 세척하였다. 1차 항체인 vav (Santa Cruz Biotechnology), p-vav (Santa Cruz Biotechnology), beta-actin (Santa Cruz Biotechnology)를 1% BSA로 1000:1로 희석하여 각 확인하고자 하는 membrane에 10ml씩 넣어준 후 1시간 30분간 반응시켰다. 다시 PBST (phosphate-buffered saline + tween 20)로 5분씩 3회 세척한 후 2차 항체인 mouse IgG를 PBST로 3000:1로 희석하여 10ml씩 넣어준 후 1시간동안 반응시킨 후 다시 PBST (phosphate-buffered saline + tween 20)로 10분씩 3회 세척하여 disposal(ATTA, LuminoGraph) 기기로 확인하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
cov1, cov2 펩타이드를 5, 10, 30분 처리하였을시 vav1의 인산화가 뚜렷이 관찰되었고 control 펩타이드에서는 관찰되지 않았다. 이를 통해 cov1, cov2 펩타이드가 vav1 활성을 통해 자연살해세포의 활성을 유도함을 알 수 있었다.

Claims (18)

  1. 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 펩타이드는 서열번호 4의 Sars-CoV-2의 S 단백질의 서열의 133-138번째 아미노산 서열인, 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 2의 펩타이드는 서열번호 4의 Sars-CoV-2의 S 단백질의 서열의 537-543번째 아미노산 서열인, 펩타이드.
  4. 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 펩타이드를 포함하는 자연 살해세포 배양용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 IL-15, IL-21 및 IL-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인을 더 포함하는 것인, 자연 살해세포 배양용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 IL-15 및 IL-21를 포함하는 것인, 자연 살해세포 배양용 조성물.
  7. 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 펩타이드를, 자연살해(Natural Killer) 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 활성이 증진된 자연 살해 세포의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 자연 살해 세포는 CD3-CD56+의 특징을 가지는 것인, 활성이 증진된 자연 살해 세포의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 활성 증진은 자연살해 세포 활성화 수용체 발현능 증진, 살상능 증진, 또는 인터페론-γ의 발현 증진인, 활성이 증진된 자연 살해 세포의 제조방법.
  10. 1) 단핵구로부터 CD3 양성인 T세포만을 제거하여 CD3 음성세포를 수득하는 단계; 및
    2) 단계 1)의 CD3 음성세포에 IL-15 및 IL-21를 혼합처리하고, 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 2의 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 펩타이드를 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 자연 살해 세포의 제조방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조된 자연 살해 세포.
  12. 제11항에 따른 자연 살해 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 대장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제11항에 따른 자연 살해 세포를 포함하는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 감염성 질환은 B형 및 C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus: HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환 및 인플루엔자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 바이러스성 호흡기 질환은 Sars-Cov-2 감염 질환인, 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  17. 제11항에 따른 자연 살해 세포를 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
  18. 제11항에 따른 자연 살해 세포를 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법.
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