CN114835820B

CN114835820B - 用于基因改造的多能干细胞及、自然杀伤细胞的嵌合型Fc受体

Info

Publication number: CN114835820B
Application number: CN202210390237.XA
Authority: CN
Inventors: 吴理达; 顾雨春
Original assignee: Chengnuo Regenerative Medical Technology Zhuhai Hengqin New Area Co ltd
Current assignee: Chengnuo Regenerative Medical Technology Zhuhai Hengqin New Area Co ltd
Priority date: 2022-04-14
Filing date: 2022-04-14
Publication date: 2023-01-06
Anticipated expiration: 2042-04-14
Also published as: CN114835820A; WO2023197735A1

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及用于基因改造的多能干细胞及、自然杀伤细胞的嵌合型Fc受体。具体地，所述CD64嵌合受体的结构包括CD64的IgG Fc段结合结构域、CD64的近膜段、CD16a的跨膜结构域、CD16a的胞内区；优选地，所述改良的CD64嵌合受体还包括CD244的胞内区。

Description

用于基因改造的多能干细胞及、自然杀伤细胞的嵌合型Fc 受体

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及用于基因改造的多能干细胞及、自然杀伤细胞的嵌合型Fc受体。

背景技术

由于NK细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞)的杀伤活性无MHC限制，因此称为自然杀伤活性。与T细胞和B细胞不同，NK细胞不需要特异性的抗原致敏刺激就可识别并杀伤靶细胞，NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。

NK细胞的靶细胞主要包括某些肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素。NK细胞杀伤靶细胞的主要机制：1、通过释放穿孔素和颗粒酶引起细胞溶解；2、通过配体诱导的受体介导的凋亡激活途经引起靶细胞的凋亡；3、释放细胞因子(包括：NK细胞细胞毒因子、NK细胞肿瘤坏死因子)杀伤靶细胞；4、抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity)。

当抗体通过抗原结合部位结合肿瘤细胞表面抗原以及Fc部位结合免疫效应细胞表面Fc受体时，免疫效应细胞得到激活，杀死肿瘤细胞，这个过程称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)。Fc受体主要有三种：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)，其中后两种又可分为：FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb。不同的免疫细胞表达特定的Fc受体，如中性粒细胞通常表达FcγRI、FcγRII、FcγRIIIb，而NK细胞只表达FcγRIIIa。FcγRIIIa通常认为是引起ADCC的关键受体，所以虽然NK细胞、单核巨噬细胞和中性粒细胞都可以产生ADCC作用，但是NK细胞被认为是最重要的细胞种群。

ADCC强弱跟许多因素有关，比如抗体与抗原的亲和力，抗体与Fc受体的亲和力、肿瘤抗原的密度、肿瘤靶细胞的特性以及免疫效应细胞的特性等。一般情况下，肿瘤靶细胞与免疫效应细胞通过抗体的桥联结合越紧密，ADCC作用越强。因此，对抗原或Fc受体亲和力高的抗体介导的ADCC作用更强。表达靶抗原高的肿瘤细胞对ADCC更为敏感，容易被ADCC作用所杀死。

NK细胞在肿瘤部位的浸润程度也对免疫治疗的效果有影响，NK细胞向肿瘤内部募集可有效改善抗肿瘤免疫应答。肿瘤微环境中的趋化因子和黏附因子等，通过募集NK细胞，促使肿瘤组织中NK浸润程度增加，继而使得NK细胞表面活化受体识别肿瘤细胞表面相应配体，释放穿孔素等杀伤介质，发挥抗肿瘤的细胞毒性作用。

NK细胞疗法是一个很有前途的临床研究领域，已有研究验证了其对某些癌症患者具有良好的安全性和初步疗效，NK细胞疗法将在未来肿瘤免疫治疗中扮演重要的角色。随着肿瘤发病率的逐年提高，寻找一种高效、无毒副作用的治疗方法是是医生和患者共同的努力方向。NK细胞疗法既可单独用于治疗，亦可联合其他治疗方式用于各种癌症的治疗，具有极高的应用前景。

发明内容

为进一步提高NK细胞的杀伤作用，本专利提供了一种基因修饰的NK细胞，所述基因修饰的NK细胞相较于普通的NK细胞有更强的杀伤作用；进一步地，与抗体联合使用时，本发明所述的基因修饰的NK细胞识别抗体的Fc端，通过抗体识别特异性靶点，表达对肿瘤细胞的强杀伤效果。

CD64嵌合受体

本发明的第一方面，提供了一种改良的CD64嵌合受体，所述CD64嵌合受体的结构包括CD64的IgG Fc段结合结构域、CD64的近膜段、CD16a的跨膜结构域、CD16a(CD16α，CD16A)的胞内区；

优选地，所述改良的CD64嵌合受体还包括CD244的胞内区。

优选地，所述CD64的IgG Fc段结合结构域(CD64 Fc binding domain)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

优选地，所述CD64的近膜段(hinge)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示或与所示序列有1、2、3、4、5或更多个突变。

优选地，所述CD16a跨膜区(CD16 menbrane domain)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示或与所示序列有1、2、3、4、5或更多个突变。

优选地，所述CD16a胞内区(CD16 cyto)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示或与所示序列有1、2、3、4、5或更多个突变。

优选地，所述CD244胞内区(CD244 cyto)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:9所示或与所示序列有1、2、3、4、5或更多个突变。

优选地，所述改良的CD64嵌合受体即CD64的IgG Fc段结合结构域、CD64的近膜段、CD16a的跨膜结构域、CD16a的胞内区、CD244的胞内区的依次连接。

也即优选地，本发明所述CD64嵌合受体的氨基酸序列是SEQ ID NO.:1、3、5、7、9的依次连接。

分离的多核苷酸

本发明还提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明所述改良的CD64嵌合受体。

优选地，所述编码核酸依次编码CD64的IgG Fc段结合结构域、CD64的近膜段、CD16A的跨膜结构域、CD16a的胞内区、CD244的胞内区。

优选地，所述CD64的IgG Fc段结合结构域(CD64 Fc binding domain)的编码核酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

优选地，所述CD64的近膜段(hinge)的编码核酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

优选地，所述CD16A跨膜区(CD16 menbrane domain)的编码核酸序列如SEQ IDNO.:6所示。

优选地，所述CD16A胞内区(CD16 cyto)的编码核酸序列如SEQ ID NO.:8所示。

优选地，所述CD244胞内区(CD244 cyto)的编码核酸序列如SEQ ID NO.:10所示。

优选地，所述编码核酸即SEQ ID NO.:2、4、6、8、10依次连接所构成的DNA序列。

载体、宿主细胞、药物组合物

另一方面，本发明还提供了可表达本发明所述改良的CD64嵌合受体的载体。

术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。

优选地，所述载体包括质粒表达载体或病毒表达载体。

优选地，所述病毒表达载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒表达载体或其他类型病毒载体。

载体是本领域技术人员公知的，示例性的本发明具体实施例中使用了pLV-EF1a-IRES-Hygro慢病毒载体。

另一方面，本发明还提供了包含或表达前述CD64嵌合受体、多核苷酸、载体中的一种或多种的宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞是人的免疫细胞、干细胞。

更优选地，所述宿主细胞是NK细胞，或是可以诱导为NK细胞的iPSC，诱导性多能干细胞，全称为induced pluripotent stem cells。

优选地，所述NK细胞包括自体NK细胞或异体NK细胞。

优选地，所述自体NK细胞来自于人体脐带血或外周血。

优选地，所述NK细胞也可以是成熟的商品化细胞系产品。

另一方面，本发明还提供了包含前述宿主细胞、CD64嵌合受体、多核苷酸、载体中的一种或多种的药物组合物。

优选地，所述组合物中还含有其他治疗癌症的药物；更优选地，所述药物包括单克隆抗体药物。

示例性的，所述单克隆抗体药物包括已经上市的药物，例如CD20mAb抗体(CD20单抗)、马妥昔单抗(matuximab，MORAb-009)、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、达利珠单抗、他尼珠单抗、阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿夫土珠单抗、阿仑单抗、培化阿珠单抗、阿麦妥昔单抗、阿泊珠单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、莫-比伐珠单抗、贝伦妥单抗-维多汀、莫坎妥珠单抗、拉坎妥珠单抗、卡罗单抗喷地肽、卡妥索单抗、泊西他珠单抗、西妥木单抗、可那木单抗、达西珠单抗、达洛珠单抗、地莫单抗、依美昔单抗、依决洛单抗、依洛珠单抗、恩司昔单抗、依帕珠单抗、厄马索单抗、埃达珠单抗、法勒珠单抗、芬妥木单抗、加利昔单抗、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗、吉瑞昔单抗、格莱木单抗-维多汀、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、拉英达西单抗、英妥木单抗、伊珠单抗奥佐米星、伊匹木单抗、伊妥木单抗、拉贝珠单抗、来沙木单抗、林妥珠单抗、莫洛伏珠单抗，包括其抗原结合片段。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

优选地，所述药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂包括但不限于已经由美国食品和药品管理局或中国食品药品监督管理局批准可用于人或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。

本发明所述药物组合物可采用下面的任意方式施用：口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔用药、颊部用药、局部用药、非肠道用药，如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心内室、胸骨内或静脉内给药方式。

术语“药学上可接受的”是指当本发明所提供的药物组合物、宿主细胞、CD64嵌合受体、多核苷酸、载体在适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

应用

另一方面，本发明还提供了前述药物组合物、宿主细胞、CD64嵌合受体、多核苷酸、载体在制备肿瘤、自身免疫性疾病、医美以及其他代谢性疾病药物中的应用。

另一方面，本发明还提供了前述药物组合物、宿主细胞、CD64嵌合受体、多核苷酸、载体在提高单抗治疗效果中的应用；

优选地，所述单抗包括

优选地，所述治疗效果是针对淋巴瘤的治疗效果；

优选地，所述单抗是CD20mAb抗体。

本发明所述代表性癌症包括但不限于头、颈、眼、口、喉头、食道、气管、喉、咽、胸、骨、肺、结肠、直肠、胃、前列腺、膀胱、子宫、宫颈、乳腺、卵巢、睾丸或其他繁殖器官、皮肤、甲状腺、血液、淋巴结、肾、肝、胰、脑或中枢神经系统的癌症。

本发明的肿瘤的非限制性实例包括淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、造血系肿瘤、胸腺瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、子宫癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肛门癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、脑癌、血管肉瘤、血管内皮瘤、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、胃肠道癌以及任何其他现在已知或以后发现的癌症(参见，例如Rosenberg(1996)《医学年鉴》47：481-491，其全部内容通过引用并入本文)。

本发明所述自身免疫性疾病示例性的包括但不仅限于，阿狄森氏病(Addison’sdisease)、变态反应(allergy)、变应性鼻炎(allergicrhinitis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、哮喘(asthma)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、骨关节炎(osteoarthritis)、疼痛(pain)、原发性粘液水肿(primary myxedema)、天疱疮(pemphigus)、恶性贫血(pernicious anemia)、多肌炎(polymyositis)、银屑病(psoriasis)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis)、反应性关节炎(reactivearthritis)、风湿热(rheumatic fever)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、结节病(sarcoidosis)、硬皮病(scleroderma)、斯耶格伦氏综合征(Sjogren’ssyndrome)、脊椎关节病(spondyloarthropathies)、交感性眼炎(sympatheticophthalmia)、T细胞淋巴瘤(T-cell lymphoma)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-cellacute lymphoblasticleukemia)、睾丸抗中心T细胞淋巴瘤(testicular antiocentric T-cell lymphoma)、甲状腺炎(thyroiditis)、移植物排斥(transplant rejection)、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)、自身免疫性葡萄膜炎(autoimmune uveitis)和血管炎(vasculitis)。

本发明所述代谢性疾病包括高胆固醇血症、血脂异常、胆固醇结石、和高甘油三酯血症等。

方法

另一方面，本发明还提供了制备高杀伤活性的免疫细胞的方法，所述方法包括将前述CD64嵌合受体、多核苷酸、载体中的一种或多种引入免疫细胞，或者所述方法是将前述CD64嵌合受体、多核苷酸、载体中的一种或多种引入干细胞，然后诱导成为免疫细胞。

如本发明具体实施例所验证的，本发明的高杀伤活性的免疫细胞对淋巴瘤具有高杀伤活性，因此亦可成为对淋巴瘤具有高杀伤活性的免疫细胞。

如本文所用，术语“杀伤活性”当用于描述效应细胞诸如NK细胞的活性时，涉及通过多种生物学、生物化学或生物物理机制中的任一种杀灭靶细胞。

优选地，所述方法包括构建载体、将载体引入干细胞、诱导干细胞分化为NK细胞等步骤。

优选地，所述诱导干细胞分化为NK细胞的步骤中包括使用NK分化培养基培养干细胞。

优选地，所述NK分化培养基中包含heat-inactivated human AB serum/FBS、β-1um mercaptoethanol、sodium selenite、ethanolamine、L-Ascorbic acid、IL-3、SCF、IL-7、IL-15、FLT3 ligand中至少一种。

优选地，所述NK分化培养基的基础培养基是DMEM-high glucose、DMEM-F12、GlutaMAX^TM-I的一种或多种。

优选地，所述诱导干细胞分化为NK细胞的方法包括：

1)诱导形成EB(拟胚体)，优选地，所述诱导形成EB所使用的培养基中包含SCF、BMP4、VEGF；

2)诱导形成NK细胞。

所述前述CD64嵌合受体、多核苷酸、载体中的一种或多种引入免疫细胞可以通过本领域的技术人员公知的多种技术来完成所述CD64嵌合受体、多核苷酸、载体中的一种或多种向宿主细胞内的引入。这些技术包括但不限于，电泳和电穿孔、原生质体融合、磷酸钙沉淀、使用有包膜DNA的细胞融合、显微注射以及使用完整病毒转染。

术语“干细胞”是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。

优选地，本发明所述干细胞是iPSC细胞(诱导性多能干细胞)。所述iPSC全称为induced pluripotent stem cells，是通过人工诱导非多能性细胞表达某种特定基因得到的。iPSCs和天然多功能干细胞在很多方面具有相似性，比如某种干细胞基因和蛋白的表达，染色质甲基化模式，倍增之间，胚体形成，畸胎瘤形成，不同嵌合体的形成，以及分化潜能。

本发明所述iPSC细胞可以是商品化的细胞系，也可以是由供体细胞诱导而来，所述供体细胞包括绒毛细胞、皮肤(成纤维细胞和角质形成细胞)、羊水、胚外组织(胎盘和脐带)、脐带血、骨膜、牙组织、脂肪组织、神经干细胞、肝细胞、间质干细胞、外周血细胞、乳腺上皮细胞、脂肪干细胞，脐带基质和胎盘中的一种或多种。

优选地，本发明所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、K细胞和NK细胞中的一种或多种。

优选地，所述免疫细胞是NK细胞。

如本发明具体实施例所使用的通过慢病毒转染技术将病毒载体导入宿主细胞，从而获得了稳定表达所述CD64嵌合受体的宿主细胞，也就代表了所述宿主细胞中含有多核苷酸、以及多核苷酸所在的载体。

另一方面，本发明还提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括施用前述药物组合物、宿主细胞、CD64嵌合受体、多核苷酸、载体中的一种或多种。

所述方法所针对的受试者是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有癌症或自身免疫性疾病，或者，疑似患有上述疾病的风险。

在本发明的上下文中，在涉及任一本文所引用病症的范围内，术语“治疗”、“疗法”等意味着缓解或减轻与此类病症相关的至少一种症状，或减缓或逆转这种病症的进展。在本发明的含义中，术语“治疗”还表示抑制、延缓病症发作(即，疾病临床表现之前的时期)和/或降低疾病发展或恶化的风险。例如，与癌症相关的术语“治疗”可以指消除或减少病人的肿瘤负荷，或预防、延迟或抑制转移等。

本发明所述疾病包括肿瘤(癌症)、抗衰老、医美以及其他代谢性疾病药物中的应用。

优选地，本发明所提供的治疗方法还可与其他治疗手段联合使用，所述其他治疗手段包括放疗、手术治疗等。

另一方面，本发明还提供了体外杀伤靶细胞的方法，所述方法包括将前述药物组合物、宿主细胞、CD64嵌合受体、多核苷酸、载体与靶细胞相接触。

优选地，所述靶细胞是癌症细胞(癌细胞，或来着癌症患者的细胞)。

附图说明

图1是本发明所述CD64嵌合受体的结构示意图。

图2是稳转后iPSC干性基因OCT4表达情况的鉴定结果图。

图3是稳转后iPSC干性基因SSEA4表达情况的鉴定结果图。

图4是Chimeric-CD64-iPSC细胞外源基因Chimeric-CD64表达统计结果图。

图5是Chimeric-CD64-iPSC细胞外源基因Chimeric-CD64琼脂糖凝胶电泳结果图。

图6是对Chimeric-CD64-iPSC细胞来源的Chimeric-CD64-iNK细胞进行NK特异性基因检测的结果图，A：NC，B：CD94，C：NKG2D，D：NKP30，E：NKP44，F：Granzyme B，G：IFN-γ。

图7是NK细胞激活后，细胞表面CD64阳性的细胞百分比的统计结果图。

图8是Chimeric-CD64-iNK的抗体介导的细胞毒性实验统计结果图。

图9是Chimeric-CD64和其变体在激活后，表达细胞毒性因子的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1：构建载体、慢病毒包装、Chimeric-FcγR-iPSC稳转细胞筛选及鉴定

载体构建

1、实验材料

骨架载体：pLV-EF1a-IRES-Hygro质粒(addgene，货号Plasmid#85134)

2、实验方法

1、以pLV-EF1a-IRES-Hygro质粒(addgene，货号Plasmid#85134)为Chimeric-CD64表达的骨架载体，酶切位点是EcoRI和Hpa1；

2、基因合成Chimeric-CD64序列(即SEQ ID NO.:2、4、6、8、10依次连接的DNA序列，在本发明中亦称为Chimeric-FcγR，结构示意图如图1)，将Chimeric-FcγR序列插入pLV-EF1a-IRES-Hygro质粒的EcoRI和Hpa1之间，载体命名为pLV-EF1a-Chimeric-CD64-IRES-Hygro。

3、Chimeric-CD64的结构胞外部分包括CD64的IgG Fc段结合结构域，以及CD64的近膜段，跨膜部分为CD16A的跨膜结构域，胞内部分为CD16a的胞内串联CD244的胞内部分。本发明所述Chimeric-CD64的氨基酸序列是SEQ ID NO.：1、3、5、7、9的依次连接。

慢病毒包装

1、实验材料

名称	公司	货号
			FBS	hyclone	SH30084.03
DMEM	赛默飞世尔科技	11965084
			PEI	POLYSCIENCES	23966
pMD2.G	addgene	#12259
			pCMV-VSVG	addgene	#8454
pRSV-Rev	addgene	#12253
			Lenti-XTM Concentrator	clonetech	631232

2、实验方法

1.细胞接种：10cm dish接种1.5×10⁷个293T细胞。加10ml含10％FBS的DMEM培养基，37℃，5％CO₂培养箱过夜培养，16-24h后转染。

2.细胞转染：细胞生长的交汇度达到80-90％，准备转染。转染体系如下：

B液逐滴加入A液中，边加边摇匀，室温22-26℃静置15min。逐滴加到培养皿中，轻轻摇匀，5％CO₂，37℃过夜培养。

3.转染换液：16-18h后，去掉含转染试剂的培养基，加入10ml含10％FBS的DMEM，5％CO₂、37℃条件下继续培养。

4.病毒第一次收获：从转染开始算48h后，收获细胞上清，转移到50ml离心管中，3,000rpm离心10min，上清用0.45μm滤膜过滤，4℃保存。细胞加入10ml含10％FBS的DMEM，5％CO₂、37℃条件下继续培养。

5.病毒第二次收获：收获细胞上清，转移到50ml离心管中，3,000rpm离心10min，上清用0.45μm滤膜过滤，4℃保存。细胞用10％消毒液(84消毒液)处理后丢弃。

6.病毒浓缩：将收集到的慢病毒组分用0.45μm滤器过滤去除细菌污染，将过滤后组分与Lenti-XTM Concentrator按照体积比3:1混合，轻轻颠倒混匀。

7.4℃孵育30min或过夜。

8.4℃1,500g离心45min，离心后会在管底看到白色沉淀。

9.小心吸去上清液，不能破坏白色沉淀。

10.用适当体积慢病毒保存液重悬沉淀，并将pLV-EF1a-Chimeric-CD64-IRES-Hygro慢病毒分装、保存于-80℃。

Chimeric-FcγR-iPSC稳转细胞筛选

1、实验材料

名称	公司	货号
			嘌呤霉素	Merck	P9620
mTeSR1	Stem cell technologies	#85850
			Dispase II	Merck	D4693
Hexadimethrine bromide	Merck	H9268
			PE anti-Oct4(Oct3)Antibody	Biolegend	653704
APC anti-human SSEA-4 Antibody	Biolegend	330418

2、实验方法

1.第0天，在初始转导前约24小时，当细胞密度达到80％左右，使用1mg/mLDispase II进行细胞传代。

2.以1:3的比例将iPSC细胞接种到24孔培养板中，注意将细胞团保持在直径约为50-60μm。

3.第一天，用500μL的预热(37℃)mTeSR1孵育细胞，培养基中添加6μg/mLHexadimethrine bromide，将细胞放入培养箱中孵育15分钟。

4.按每孔10μL的1x10⁶ TU/mL pLV-EF1a-Chimeric-CD64-IRES-Hygro病毒颗粒感染iPSC细胞。在37℃，5％CO₂和95％湿度下孵育18-20小时。

5.第2天，去除培养基，加500μL的预热(37℃)mTeSR1孵育细胞，培养基中添加6μg/mL Hexadimethrine bromide，将细胞放入培养箱中孵育15分钟。

6.在培养基中加入三倍于初始量(从第1天开始)的pLV-EF1a-Chimeric-CD64-IRES-Hygro病毒颗粒。即30μL的1x10⁶ TU/mL病毒颗粒进行二次感染。在37℃，5％CO₂和95％湿度下孵育18-20小时。

7.第3天和第4天，每天去除培养基，并更换为500μL不含Hexadimethrine bromide的预热培养基

8.第5-8天，每天使用500μL的预热培养基换液，培养基中添加1μg/mL嘌呤霉素。

9.持续使用1μg/mL嘌呤霉素筛选阳性细胞，直到细胞稳定为止。

10.稳转细胞系分别命名为Chimeric-CD64-iPSC。

11.收获200万的Chimeric-CD64-iPSC细胞，使用PE anti-Oct4(Oct3)Antibody，APC anti-human SSEA-4 Antibody对Chimeric-CD64-iPSC细胞干性进行流式细胞检测。

Chimeric-CD64稳转细胞鉴定

1、实验材料

2、实验方法

1.收集细胞200W Chimeric-CD64-iPSC，iPSC细胞加1ml TRIZOL，提取RNA并测定RNA浓度，取1μgRNA反转为cDNA，按如下表体系进行预混，

2.然后将上述体系放入Light cycler仪器中按照3步法进行反应，循环数为45，反应体系如下：

3.检测引物序列如下

Chimeric-FcγR结构检测引物：

Forward Primer GCATGGGAAAGCATCGCTAC

Reverse Primer GCAAGAGCAACTTTGTTTCACA

3、实验结果

对慢病毒转染获得的iPSC进行检测，干性基因OCT4，SSEA4表达正常(结果如图2、3所示)，证明基因改造没有改变Chimeric-CD64-iPSC的干性。

通过图4、5对Chimeric-CD64表达量的检测，结果说明，通过病毒感染后，外源基因Chimeric-CD64在Chimeric-CD64-iPSC中正常表达。

实验三：Chimeric-FcγR-iPSC来源的Chimeric-FcγR-iNK激活条件下Chimeric-FcγR稳定性检测

1、实验材料

2、实验方法

1.当Chimeric-CD64-iPSC融合达70-80％时，应进行传代保证细胞有足够的生长空间和培养基。具体步骤如下。

2.提前一天包被matrigel细胞培养6孔板及准备TeSR-E8完全培养基；

3.使用DPBS溶液，洗1-2遍。沿着T25瓶壁加入3ml TrypLE^TM Express Enzyme工作液，置于培养箱3-5分钟。

4.加入5ml DMEM/F12培养基稀释并终止细胞消化，轻轻地吹打2-3次。

5.将细胞混悬液转移至15ml离心管。

6.室温下200g，离心5分钟。

7.用1ml培养基轻轻吹起细胞重悬。并用细胞计数板计数。

8.计数后铺在提前用matrigle包被好的细胞培养6孔板中，铺板密度为30w/孔，每孔培养基为2ml，添加终浓度为10uM rock inhibitor。

9. 2-3天细胞可以长到70-80％汇合度，然后可以开始EB形成分化。

EB(拟胚体)的形成(DAY0-5)

10.配置EB分化培养基：STEMdiff^TM APEL^TM2 Medium+50ng/mL SCF+20ng/mL BMP4+20ng/mL VEGF；

11.当6孔板细胞长至70％-80％汇合度时，开始形成EB。去除上清，PBS清洗细胞两遍，加1mL 37℃预热的TrypLE^TM Express Enzyme，37℃孵育5min。

12.吹散细胞至单细胞，转移至15ml离心管，加5mL中和液(DMEM/F12加10％FBS)，70uM细胞滤器过滤，去除细胞团块；

13.离心后，5mLPBS清洗细胞；然后将细胞重悬在1mL EB分化培养基；

14.使用EB分化培养基调整密度细胞密度至8万细胞/mL,以100μl/孔分装到96孔板

15. 300g/min离心96孔板5min,37度培养，此处标记为第0天。

16.DAY3半换液(EB分化培养基)，继续培养。

NK细胞分化(DAY6-28)

17.配制NK分化培养基：DMEM+high glucose+DMEM-F12+GlutaMAX^TM-I+15％heat-inactivated human AB serum/FBS+β-1um mercaptoethanol+sodium selenite，5ng/ml+ethanolamine，50uM+L-Ascorbic acid，20ug/ml+IL-3，5ng/mL+SCF，20ng/ml+IL-7，20ng/mL+IL-15，10ng/mL+FLT3 ligand，10ng/mL。

18.使用滴管轻柔将EB转移至基质胶包被的6孔板培养皿中。

19.去除大部分上清液，加2mLNK分化培养基，按14-16个/孔的量，将EB转移到6孔板。

20.DAY12换液3-4ml每孔(NK分化培养基)。

21.DAY13-28去除IL3，每3天半换一次液。

NK细胞流式检测

22.取200万细胞，将上清转移到15mL离心管中，250g离心5min，去除上清；

23.加入1mL DPBS清洗细胞1次；

24.用100μL含4％FBS的DPBS重悬细胞；

25.加入相应的流式检测抗体，4℃孵育30min；

26. 250g离心去除上清，加入1mL DPBS清洗细胞3次；

27. 200μL DPBS重悬细胞后进行上机检测。

3、实验结果

图6中，NC为对照，Chimeric-CD64-NK细胞正常表达CD94，NKG2D，NKP30，NKP44，IFN-γ，Granzyme B等NK特异性基因。

以上结果表明Chimeric-CD64-iPSC细胞能够分化为成熟，功能正常NK。

实验四：细胞杀伤试验

1、实验材料

名称	公司	货号
			PMA/Ionomycin mixture(250X)	MμltiSciences	70-CS1001
DPBS	赛默飞世尔科技	14190144
			Anti-Human CD16	BD Biosciences	560995
K-562	武汉普诺赛生命科技有限公司	CL-0130
			丝裂霉素C	Sigma	M5353
FITC anti-human CD64 Antibody	Biolegend	399506

2、实验方法

1.将iPSC、Chimeric-CD64-iPSC分化为iNK细胞，得到的iNK细胞分别命名为iNK、Chimeric-CD64A-iNK。

2.取200万iNK、Chimeric-CD64A-iNK，使用1乘PMA/Ionomycin mixture(250X)刺激细胞4小时。或者使用等比列的丝裂霉素C处理过后的K562细胞，分别与iNK、Chimeric-CD64A-iNK孵育4小时。同时设置空白对照，不对上述NK细胞进行任何刺激。

3.细胞激活后，使用DPBS清洗细胞2遍，将细胞重悬在100μl 2％FBS的DPBS中，按照厂商说明，将细胞分别与Anti-Human CD64孵育1h。

4.孵育结束后，使用DPBS清洗细胞2遍，将细胞重悬在100μl 2％FBS的DPBS中，然后对上述细胞进行流式分析。

3、实验结果

图7是NK细胞激活后，细胞表面CD64A以及Chimeric-CD64A表达情况的检测结果。结果说明，NK细胞在激活的状态下，CD16A会被金属酶(ADAM17)切除。上述结果可以看出CD64A在未经改造的iNK细胞表面几乎没有表达，Chimeric-CD64A在Chimeric-CD64A-iNK细胞表面大量表达，NK激活后，Chimeric-CD64A不受金属酶切除，持续高表达CD64A。

实验四：Chimeric-CD64-iPSC来源的Chimeric-CD64-iNK的ADCC效应

1、实验材料

名称	公司	货号
			Raji细胞(淋巴瘤细胞)	武汉普诺赛生命科技有限公司	CL-0189
Caspase-3/7Green Apoptosis Assay Reagent	Essen Bioscience	4440
			CD20mAb抗体	MCE	HY-P9913

2、实验方法

1.以每孔40,000个细胞将Raji细胞铺种到96孔板，室温孵育30min。

2.分别将96孔板的Raji细胞与Caspase-3/7Green Apoptosis Assay Reagent孵育30分钟。

3.根据计数，分别将iNK、Chimeric-CD64A-iNK和Chimeric-CD64A -iNK+antiCD20mAb和肿瘤细胞按照1:1的靶标比接种到96孔板中，anti CD20mAb设置浓度梯度为0.01ug/mL，0.1ug/mL，1ug/mL；放置37度培养像孵育培养。

4.之后每隔3小时拍照记录，收集记录分析。

实验结果

图8是Chimeric-CD64A-iNK的抗体介导的细胞毒性实验，结果说明：

1.iNK组和Chimeric-CD64A-iNK组比较显示，iChimeric-CD64A-iNK组明显具有更强的肿瘤杀伤效果，表明Chimeric-CD64A的表达，具有激活NK细胞作用，促进NK细胞对肿瘤的杀伤。

2.Chimeric-CD64A -iNK组与Chimeric-CD64A -iNK+anti CD20mAb组比较，Chimeric-CD64A-iNK+anti CD20mAb组明显具有更强的肿瘤杀伤效果，同时，随着抗体的浓度增加，杀伤作用更加明显，表明Chimeric-CD64A具有ADCC效应，促进NK细胞对肿瘤的杀伤。

实验五：CD244胞内部分对NK细胞的激活效应

1、实验材料

名称	公司	货号
			人脐血NK细胞	Stem cell technolosies	#70019
人IFN gamma ELISA试剂盒	Abcam	ab46025
			人Granzyme B ELISA试剂盒	Abcam	ab235635

2、实验方法

载体构建

按照实施例1的方法将Chimeric-CD64-VaR序列插入pLV-EF1a-IRES-Hygro质粒的EcoRI和Hpa1之间，载体命名为pLV-EF1a-Chimeric-CD64-VaR-IRES-Hygro；

所述Chimeric-CD64-VaR的结构胞外部分包括CD64的IgG Fc段结合结构域，以及CD64的近膜段,跨膜部分为CD16A的跨膜结构域，胞内部分为CD16a的胞内串部分(即SEQ IDNO.：2、4、6、8依次连接的DNA序列插入到载体中，表达的氨基酸序列是SEQ ID NO.：1、3、5、7的依次连接，也即Chimeric-CD64-VaR相对于本发明嵌合受体CD64删除了CD244胞内区(CD244 cyto)部分)。

制备iNK细胞

1.以1×10⁶/mL的浓度将人脐血NK细胞铺种到T25培养瓶；

2.按照实施例1的方法，分别将人脐血NK细胞感染pLV-EF1a-Chimeric-CD64-IRES-Hygro和pLV-EF1a-Chimeric-CD64-VaR-IRES-Hygro慢病毒，获得的细胞标记为Chimeric-CD64-NK和Chimeric-CD64-VaR-NK

3.以每孔40 000个细胞将Chimeric-CD64-NK和Chimeric-CD64-VaR-NK细胞分别铺种到96孔板，室温孵育2小时。

4.按照1：1比列，将Raji细胞分别和Chimeric-CD64-NK和Chimeric-CD64-VaR-NK细胞混合孵育，放置37度培养像孵育培养4小时

5.孵育结束后，收集细胞上清液，按照厂商说明，使用人IFN gamma ELISA试剂盒和人Granzyme B ELISA试剂盒，检测IFN gamma以及Granzyme B的分泌水平。

3、实验结果

1.Chimeric-CD64-NK和Chimeric-CD64-VaR-NK细胞激活后，Chimeric-CD64-NK分泌的细胞毒性因子IFN gamma以及Granzyme B明显高于Chimeric-CD64-VaR-NK细胞，表明Chimeric-CD64-NK细胞对肿瘤细胞杀伤更强，CD244胞内部分联合到本发明的嵌合受体CD64时有活性，且起到了促进NK细胞表达细胞毒因子的作用。

序列表

<110> 呈诺再生医学科技（珠海横琴新区）有限公司

<120> 用于基因改造的多能干细胞及、自然杀伤细胞的嵌合型Fc受体

<141> 2022-04-12

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 277

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln

1 5 10 15

Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser

20 25 30

Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu

35 40 45

Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln

50 55 60

Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser

65 70 75 80

Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile

85 90 95

Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg

100 105 110

Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys

115 120 125

Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe

130 135 140

Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile

145 150 155 160

Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr

165 170 175

Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro

180 185 190

Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val

195 200 205

Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln

210 215 220

Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn

225 230 235 240

Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly

245 250 255

Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg

260 265 270

Ser Pro Glu Leu Glu

275

<210> 2

<211> 831

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtggttct tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggacaccaca 60

aaggcagtga tcactttgca gcctccatgg gtcagcgtgt tccaagagga aaccgtaacc 120

ttgcactgtg aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc 180

acagccactc agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt 240

ggtgaataca ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc 300

cacagaggct ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg 360

gccttgaggt gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat 420

ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaat tctaacctca ccattctgaa aaccaacata 480

agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga 540

atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc 600

ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg 660

cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac 720

acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc 780

gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga g 831

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro Val Trp Phe His

1 5 10 15

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttcaagtgc ttggcctcca gttaccaact cctgtctggt ttcat 45

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly

1 5 10 15

Leu Tyr Phe Ser Val

20

<210> 6

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtctctttct gcttggtgat ggtactcctt tttgcagtgg acacaggact atatttctct 60

gtg 63

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe

1 5 10 15

Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys

20 25

<210> 8

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aagacaaaca ttcgaagctc aacaagagac tggaaggacc ataaatttaa atggagaaag 60

gaccctcaag acaaa 75

<210> 9

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu

1 5 10 15

Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn

20 25 30

His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser

35 40 45

Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr

50 55 60

Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys

65 70 75 80

Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly

85 90 95

Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu

100 105 110

Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser

115 120

<210> 10

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggaggagaa agaggaagga gaagcagtca gagaccagtc ccaaggaatt tttgacaatt 60

tacgaagatg tcaaggatct gaaaaccagg agaaatcacg agcaggagca gacttttcct 120

ggagggggga gcaccatcta ctctatgatc cagtcccagt cttctgctcc cacgtcacaa 180

gaacctgcat atacattata ttcattaatt cagccttcca ggaagtctgg atccaggaag 240

aggaaccaca gcccttcctt caatagcact atctatgaag tgattggaaa gagtcaacct 300

aaagcccaga accctgctcg attgagccgc aaagagctgg agaactttga tgtttattcc 360

tag 363

Claims

1.一种改良的CD64嵌合受体，所述改良的CD64嵌合受体的结构依次由CD64的IgG Fc段结合结构域、CD64的近膜段、CD16a的跨膜结构域和CD16a的胞内区组成；

或者，

所述改良的CD64嵌合受体的结构依次由CD64的IgG Fc段结合结构域、CD64的近膜段、CD16a的跨膜结构域、CD16a的胞内区和CD244的胞内区组成；

所述CD64的IgG Fc段结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示；

所述CD64的近膜段的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示；

所述CD16a的跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示；

所述CD16a的胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示；

所述CD244的胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:9所示。

2.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1所述改良的CD64嵌合受体。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，所述CD64的IgG Fc段结合结构域的编码核酸序列与SEQ ID NO.:2所示序列有85%及以上同源性或如SEQ ID NO.:2所示。

4.如权利要求2所述的多核苷酸，所述CD64的近膜段的编码核酸序列与SEQ ID NO.:4所示序列有85%及以上同源性或如SEQ ID NO.:4所示。

5.如权利要求2所述的多核苷酸，所述CD16a的跨膜结构域的编码核酸序列与SEQ IDNO.:6所示序列有85%及以上同源性或如SEQ ID NO.:6所示。

6.如权利要求2所述的多核苷酸，所述CD16a的胞内区的编码核酸序列与SEQ ID NO.:8所示序列有85%及以上同源性或如SEQ ID NO.:8所示。

7.如权利要求2所述的多核苷酸，所述CD244的胞内区的编码核酸序列与SEQ ID NO.:10所示序列有85%及以上同源性或如SEQ ID NO.:10所示。

8.如权利要求2所述的多核苷酸，所述多核苷酸是SEQ ID NO.:2、4、6、8、10依次连接所构成的DNA序列。

9.一种载体，所述载体上包含权利要求2所述的多核苷酸或表达权利要求1所述的改良的CD64嵌合受体。

10.如权利要求9所述载体，所述载体包括质粒表达载体或病毒表达载体。

11.如权利要求10所述载体，所述病毒表达载体包括慢病毒载体或腺病毒载体。

12.如权利要求10所述载体，所述病毒表达载体是慢病毒载体。

13.一种宿主细胞，所述宿主细胞中包含或表达权利要求1所述的CD64嵌合受体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求9所述的载体中的一种或多种。

14.如权利要求13所述宿主细胞，所述宿主细胞是人的免疫细胞、干细胞。

15.如权利要求14所述宿主细胞，所述免疫细胞是NK细胞。

16.如权利要求14所述宿主细胞，所述干细胞是iPSC。

17.如权利要求13所述宿主细胞，所述宿主细胞是自体细胞或异体细胞。

18.一种药物组合物，所述药物组合物中包含权利要求1所述的CD64嵌合受体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求9所述的载体、权利要求13所述的宿主细胞中的一种或多种的。

19.如权利要求18所述的药物组合物，所述药物组合物中还含有其他治疗癌症的药物。

20.如权利要求19所述的药物组合物，所述药物包括单克隆抗体药物。

21.如权利要求20所述的药物组合物，所述单克隆抗体药物包括CD20单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、达利珠单抗、他尼珠单抗、阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿夫土珠单抗、阿仑单抗、培化阿珠单抗、阿麦妥昔单抗、阿泊珠单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、莫比伐珠单抗、贝伦妥单抗、莫坎妥珠单抗、拉坎妥珠单抗、卡罗单抗喷地肽、卡妥索单抗、泊西他珠单抗、西妥木单抗、可那木单抗、达西珠单抗、达洛珠单抗、地莫单抗、依美昔单抗、依决洛单抗、依洛珠单抗、恩司昔单抗、依帕珠单抗、厄马索单抗、埃达珠单抗、法勒珠单抗、芬妥木单抗、加利昔单抗、吉妥珠单抗、吉瑞昔单抗、格莱木单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、拉英达西单抗、英妥木单抗、伊珠单抗奥佐米星、伊匹木单抗、伊妥木单抗、拉贝珠单抗、来沙木单抗、林妥珠单抗、莫洛伏珠单抗。

22.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

23.如权利要求22所述的药物组合物，所述药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂包括助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料、着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、表面活性剂或乳化剂。

24.如权利要求18所述的药物组合物，所述药物组合物可采用下面的任意方式施用：口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔用药、颊部用药、皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心内室或胸骨内给药方式。

25.权利要求1所述的CD64嵌合受体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求9所述的载体、权利要求13所述的宿主细胞、权利要求18所述的药物组合物任意一种在制备治疗癌症的药物中的应用或在制备提高单抗治疗效果的产品中的应用。

26.如权利要求25所述的应用，所述癌症包括头、颈、眼、口、喉头、食道、气管、喉、咽、胸、骨、肺、结肠、直肠、胃、前列腺、膀胱、子宫、宫颈、乳腺、卵巢、睾丸、皮肤、甲状腺、血液、淋巴结、肾、肝、胰、脑或中枢神经系统的癌症。

27.如权利要求25所述的应用，所述癌症包括骨髓瘤、胸腺瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、子宫癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肛门癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、血管内皮瘤、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、胃肠道癌。

28.如权利要求25所述的应用，所述治疗效果是针对淋巴瘤的治疗效果。

29.如权利要求25所述的应用，所述单抗是CD20单抗。

30.一种在体外制备高杀伤活性的宿主细胞的方法，所述方法包括将权利要求1所述的CD64嵌合受体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求9所述的载体中的一种或多种引入宿主细胞；

或者，所述方法是将权利要求1所述的CD64嵌合受体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求9所述的载体中的一种或多种引入干细胞，然后诱导成为宿主细胞。

31.如权利要求30所述的方法，所述宿主细胞是免疫细胞。

32.如权利要求31所述的方法，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、K细胞和NK细胞中的一种或多种。

33.如权利要求31所述的方法，所述宿主细胞是NK细胞。

34.如权利要求30所述的方法，所述引入的方法包括电穿孔、原生质体融合、磷酸钙沉淀、使用有包膜DNA的细胞融合、显微注射以及使用完整病毒转染。

35.如权利要求30所述的方法，所述干细胞是iPSC细胞。

36.如权利要求35所述的方法，所述iPSC细胞包括商品化的细胞系或是由供体细胞诱导而来。

37.如权利要求36所述的方法，所述供体细胞包括绒毛细胞、皮肤细胞、羊水、胚外组织、脐带血、骨膜、牙组织、脂肪组织、神经干细胞、肝细胞、间质干细胞、外周血细胞、乳腺上皮细胞、脂肪干细胞和脐带基质中的一种或多种。

38.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述方法还包括构建载体、将载体引入干细胞、诱导干细胞分化为NK细胞的步骤。

39.如权利要求38所述的方法，所述诱导干细胞分化为NK细胞的步骤中包括使用NK分化培养基培养干细胞。

40.如权利要求39所述的方法，所述NK分化培养基中包含heat-inactivated human ABserum/FBS、β-1um mercaptoethanol、sodium selenite、ethanolamine、L-Ascorbic acid、IL-3、SCF、IL-7、IL-15、FLT3 ligand中至少一种。

41.如权利要求39所述的方法，所述NK分化培养基的基础培养基是DMEM-highglucose、 DMEM-F12、GlutaMAX™-I的一种或多种。

42.一种体外杀伤癌症细胞的方法，所述方法包括将权利要求1所述的CD64嵌合受体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求9所述的载体、权利要求13所述的宿主细胞、权利要求18所述的药物组合物任意一种或多种与癌症细胞相接触。

43.如权利要求42所述方法，所述癌症细胞是淋巴瘤细胞或来自淋巴瘤患者的细胞。