CN110201158B - 药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种药物组合物，其包括表达FcγRⅠ嵌合受体的T细胞以及至少一种带有IgG Fc段的抗体；所述FcγRⅠ嵌合受体包含A)FcγRⅠ胞外区，B)CD8α铰链区，C)CD28跨膜域和D)4‑1BB以及CD3ζ的胞内信号传导区。该药物组合物FcγRⅠ嵌合受体T细胞可通过ADCC效应，提高抗体药物的治疗效果。

Description

药物组合物

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种药物组合物。

背景技术

FcR为一类能结合免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)可结晶段(fragmentcrystallizable，Fc)的受体，在免疫调节过程中发挥重要作用。人Ig根据其重链的差异可分为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE五类，各类Ig的功能差异主要与其Fc段结构有关。机体内许多细胞表面表达不同类Ig的Fc受体，通过Fc受体与Fc的结合，参与Ig介导的生理功能或病理损伤过程。目前已鉴定明确属于簇分化抗原(cluster of differentiation，CD)的Fc受体有FcγR、Fca R、FcεR，它们分别可以结合IgG、IgA和IgE。

小鼠FcγR有四种，分别为FcγRI、FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIV。FcγR很保守，相应的人类蛋白为FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIC、FcyRIIIA(CD16A)和FcyRIIIB(CD16B)。从结构上说，FcR及其配体都属于一个免疫球蛋白的大家族。

FcγRⅠ是一种大小70KD左右的跨膜糖蛋白，是一种IgG高亲和力激活型受体，属于细胞因子诱导型受体，在IFN-γ和G-CSF的刺激下，其表达水平可以增加5～10倍。激活型FcγRⅠ的胞内区含有酪氨酸受体活化基序(ITAM)，作用是介导相应效应细胞的免疫功能，参与抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)和抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)，同时可以调节淋巴细胞的增殖和分化，发挥细胞因子和炎性因子分泌等免疫功能。FcγRⅠ主要分布于单核细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞等，尤其在单核细胞和巨噬细胞中的表达水平较高，然而淋巴细胞中很少发现FcγR的表达，尤其是T淋巴细胞表面其表达量几乎为零。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种药物组合物，其包括表达FcγRⅠ嵌合受体的T细胞以及至少一种带有IgG Fc段的抗体；

所述FcγRⅠ嵌合受体包含A)FcγRⅠ胞外区，B)CD8α铰链区，C)CD28跨膜域和D)4-1BB以及CD3ζ的胞内信号传导区。

该药物组合物FcγRⅠ嵌合受体T细胞可通过ADCC效应，提高抗体药物的治疗效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1FcγRⅠ嵌合受体结构示意图；

图2pCAR慢病毒过表达载体结构示意图；

图3pCAR-FcγRⅠ慢病毒过表达载体构建双酶切电泳图；

将构建好的pCAR-FcγRⅠ慢病毒载体用Xba I和BstB I双酶切后获取目的基因片段和载体，其中目的基因片段长度为1692bp；泳道1为未酶切的重组pCAR-FcγRⅠ质粒，泳道2为重组pCAR-FcγRⅠ质粒经Xba I和BstB I双酶切的产物；

DL15000：15000bp DNA Ladder Marker；

1：pCAR-FcγRⅠ；2：pCAR-FcγRⅠ/BstBⅠ+XbaⅠ；

图4pCAR-FcγRⅠ慢病毒滴度检测结果图；

pCAR为不含FcγRⅠ嵌合基因的空病毒，pCAR-FcγRⅠ为含有FcγRⅠ嵌合基因的病毒；

图5Jurkat细胞验证FcγRⅠ的过表达；

A：Jurkat细胞转染FcγRⅠ的Q-PCR检测结果；

B：Jurkat细胞转染FcγRⅠ的流式检测结果；

图6PBMC的分离；

由图可见，经密度梯度离心后的人血可分为清晰可见的四层，从上到下依次为血浆层、淋巴细胞层、分离液层和红细胞层，收集第二层雾状淋巴细胞层即为PBMC；

图7CD3⁺T细胞的磁珠分选；

采用hCD3磁珠对PBMC进行阳性分选；A：磁珠分选前B：磁珠分选后；

图8最佳感染条件的摸索；

A：病毒感染48h后荧光显微镜检测结果(设置MOI＝20、50、100、150，polybrene浓度为0、2、4、6、8、10μg/ml，例如20-0表示MOI＝20，polybrene＝0μg/ml)；

B：台盼蓝染色检测细胞活率；

图9FcγRⅠ嵌合受体T细胞的构建；

blank为空白对照组，是指不加病毒、不加polybrene的细胞对照组，pCAR为空病毒感染对照组，pCAR-FcγRⅠ为实验组；该图所用检测方法为流式细胞术检测法；

图10WB检测CD3ζ的磷酸化水平结果图；

图11EGFR高表达细胞株的鉴定；

使用流式细胞术法对图中细胞表面EGFR进行检测；其中sgc7901为人胃腺癌细胞，HCT116为人结肠癌细胞，BGC-823为人胃腺癌细胞，Caco-2为人结肠腺癌细胞，MKN-45为人胃癌细胞；

图12FcγRⅠ嵌合受体T细胞联合尼妥珠单抗的ADCC效应检测(LDH乳酸脱氢酶检测法)；

A：不同效靶比(E:T)对ADCC作用的影响结果；靶细胞为sgc7901、HCT116和MKN-45，抗体浓度为0.01ug/ml，孵育时间为4h；

B：不同抗体浓度对ADCC作用的影响结果；靶细胞为sgc7901、HCT116和MKN-45，E:T为10:1，孵育时间为4h；

C：sgc7901、HCT116、MKN-45的ADCC效应；

图13FcγRⅠ嵌合受体T细胞联合尼妥珠单抗肿瘤杀伤相关细胞因子的ELISA检测结果；

检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01μg/ml，孵育时间为24h，靶细胞为HCT116、sgc7901、BGC-823、Caco-2、MKN-45；

图A、图B、图C分别为hIL-2、hIFNγ、和hTNF-α的ELISA检测结果；

图14FcγRⅠ嵌合受体T细胞与EGFR高表达肿瘤细胞和尼妥珠单抗共孵育的“玫瑰花环”实验；

检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01μg/ml，孵育时间为4h，靶细胞为HCT116、sgc7901、BGC-823、Caco-2、MKN-45；

图15FcγRⅠ嵌合受体T细胞与EGFR高表达肿瘤细胞和尼妥珠单抗共孵育后CD107a的流式检测结果；

检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01μg/ml，孵育时间为4h，靶细胞为HCT116、sgc7901、BGC-823、Caco-2、MKN-45；CD107a为免疫细胞活化后脱颗粒的标记；

图16FcγRⅠ嵌合受体T细胞表面FasL以及EGFR高表达肿瘤细胞表面Fas的流式检测结果；

检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01μg/ml，孵育时间为4h，靶细胞为HCT116、sgc7901、BGC-823、Caco-2、MKN-45；FasL是能够结合到死亡受体TNFRSF6/FAS的细胞因子，在T-cell发育中介导其由于细胞毒性引起的凋亡；Fas主要表达在肿瘤细胞表面，FasL主要表达在T细胞表面；

图17PD-L1高表达细胞株的鉴定；

使用流式细胞术法对图中细胞表面PD-L1进行检测；

图18FcγRⅠ嵌合受体T细胞联合pembrolizumab的ADCC效应检测；

图19FcγRⅠ嵌合受体T细胞联合pembrolizumab肿瘤杀伤相关细胞因子的ELISA检测结果；

图20FcγRⅠ嵌合受体T细胞与PD-L1高表达肿瘤细胞和pembrolizumab共孵育后CD107a的流式检测结果；

图21FcγRⅠ嵌合受体T细胞与PD-L1高表达肿瘤细胞和单pembrolizumab共孵育后CD107a的流式检测结果(A：Fas；B：FasL；检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01μg/ml，孵育时间为4h，靶细胞为HCT116、sgc7901、BGC-823、Caco-2、MKN-45)；

图22Her-2高表达细胞株的鉴定；Her-2高表达细胞株：SKBr-3、skov-3、JIMT-1(乳腺癌细胞株)阴性对照细胞株：MCF-7(乳腺癌细胞株)；

图23FcγRⅠ嵌合受体T细胞联合曲妥珠单抗的ADCC效应检测；

图24FcγRⅠ嵌合受体T细胞联合曲妥珠单抗肿瘤杀伤相关细胞因子的ELISA检测结果(A:hIL-2；B：hIFN-γ；C：hTNF-α；检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01μg/ml，孵育时间为24h)；

图25FcγRⅠ嵌合受体T细胞与Her-2高表达肿瘤细胞和曲妥珠单抗共孵育后CD107a的流式检测结果(检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01μg/ml，孵育时间为4h，靶细胞为SKBr-3、skov-3、JIMT-1、MCF-7)；

图26FcγRⅠ嵌合受体T细胞表面FasL以及EGFR高表达肿瘤细胞表面Fas的流式检测结果；检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01μg/ml，孵育时间为4h，靶细胞为H460、H358、EKVX、H1993；FasL是能够结合到死亡受体TNFRSF6/FAS的细胞因子，在T-cell发育中介导其由于细胞毒性引起的凋亡；Fas主要表达在肿瘤细胞表面，FasL主要表达在T细胞表面。

具体实施方式

本发明涉及一种药物组合物，其包括表达FcγRⅠ嵌合受体的T细胞以及至少一种带有IgG Fc段的抗体；

所述FcγRⅠ嵌合受体包含A)FcγRⅠ胞外区，B)CD8α铰链区，C)CD28跨膜域和D)4-1BB以及CD3ζ的胞内信号传导区。

不管是体内免疫细胞产生的抗体，还是人工开发的用于治疗各种疾病的单克隆抗体，大多数均为IgG类型抗体，因此，较其他类型的Fc受体，FcγRⅠ的适用范围更广。

“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体以及这些抗体的抗原化合物结合片段，在本发明中，至少有一种抗体带有Fc段(例如最常见的带有Fab段和Fc段的天然抗体，或者某些基因工程抗体，例如scFv-Fc，scIgG等)，以配合表达FcγRⅠ嵌合受体的T细胞发挥ADCC作用。功能片段包括例如Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。

在本发明中，“抗体”的定义也包括被修饰的抗体，括抗体的部分被缺失、添加或替换的抗体，例如，可通过缺失一种抗体的恒定区并用一种恒定区替换从而修饰该抗体以提高抗体的半衰期，如血清半衰期，稳定性或亲和性，例如被转铁蛋白等进行修饰。只要该抗体能结合靶点，并诱发免疫反应，优选至少一种抗体诱发ADCC，则任何修饰都是在本发明的范围内的。

T细胞包括CD3⁺CD4⁺T(辅助性T细胞)、CD3⁺CD8⁺T(细胞毒性T细胞)、CD3⁺CD4⁺CD8⁺T细胞、CD25⁺CD4⁺T细胞(调节/抑制T细胞)、MAIT细胞(粘膜相关恒定T细胞)、γδT细胞以及记忆T细胞等。

在一些实施方式中，所述T细胞是动物(例如禽类，爬行动物，两栖动物)T细胞。

在一些实施方式中，所述T细胞是哺乳动物T细胞。

在一些实施方式中，所述T细胞是灵长类动物T细胞。

在一些实施方式中，所述T细胞是人类T细胞。

在一些实施方式中，所述T细胞来源于所述组合物施用对象自身T细胞。

“施用对象”，或称“受治疗者”、“患者”。此用语包括人类及所有畜养(如家畜和宠物)和野生的动物及禽鸟，其非限制性地包括牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡等。

自身T细胞可最大限度地避免免疫排斥反应的发生。

在一些实施方式中，所述FcγRⅠ嵌合受体还包括信号肽区；

在一些实施方式中，所述信号肽区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

在一些实施方式中，所述FcγRⅠ胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

在一些实施方式中，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

在一些实施方式中，所述CD28跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

在一些实施方式中，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

在一些实施方式中，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

在一些实施方式中，所述抗体为嵌合抗体，优选为人与其他物种的嵌合抗体，例如人与小鼠的嵌合抗体。“嵌合抗体”是用于包括一种抗体，其可变区源自一种动物而其恒定区源自另一种动物。例如，一种嵌合抗体可以是含有源自小鼠单克隆抗体的可变区和源自人的恒定区的抗体。

在一些实施方式中，所述抗体为人源化抗体。术语“人源化抗体”是用于包括一种抗体，其高变区，也称为互补决定区(CDRs)源自一种动物，而其框架区和恒定区源自不同不同种的动物。例如，在本发明的一个优选的实施方式中，一种人源化抗体中CDRs是源自小鼠而该抗体的其它区域源自人类。

在一些实施方式中，所述抗体为人抗体。术语“人抗体”或称“全人抗体”是通过转基因或噬菌体展示技术等手段，将抗体的CDRs、框架区和恒定区都采用源自人的序列。

在一些实施方式中，所述抗体为选自嵌合抗体、人源化抗体或人抗体中的2种类型，或全部3种类型。

在一些实施方式中，所述抗体用于治疗病毒或异常细胞。

异常细胞包括肿瘤细胞、被上述病毒所感染的细胞，或者为并其他病原体(细菌，真菌等)所感染的细胞，或者为在某些免疫系统疾病中异常的靶点细胞，例如牛皮癣、遗传性过敏皮炎、硬皮病、皮肤红斑狼疮、人类免疫缺陷病毒感染、多发性硬化症、风湿性关节炎、慢性多形性光照皮肤病、慢性梗阻性肺病和Wegener’s肉芽肿病的靶点细胞。

在一些实施方式中，所述抗体识别以下抗原组成的组中的任一种：α-甲胎蛋白(AFP)、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、碳酸酐酶IX、CASP-8/m、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM-5)、CEACAM-6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、纤维母细胞生长因子(FGF)、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和它的亚单位、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导性因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、胰腺癌粘蛋白、PD1受体、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆逊-弗雷登里希抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志物、bc1-2、bc1-6、Kras、致癌基因标志物和致癌基因产物。

在一些实施方式中，所述抗体选自下列抗体所组成的组：

抗GD2抗体3F8、阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、ACZ885(卡那单抗(canakinumab))、阿达木单抗(Adalimumab)、阿德木单抗(Adecatumumab)、阿非莫单抗(Afelimomab)、阿托珠单抗(Afutuzumab)、培化阿珠单抗(Alacizumab pegol)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomab pentetate)、麻安莫单抗(Anatumomabmafenatox)、安芦珠单抗(Anrukinzumab)(IMA-638)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿替珠单抗(Atezolizumab)、阿托木单抗(Atorolimumab)、阿维单抗(Avelumab)、巴匹珠单抗(Bapineuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴土昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝利木单抗(Belimumab)、桕替莫单抗(Bertilimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、比西单抗(Biciromab)、比伐单抗-DMl(Bivatuzumab mertansine)、兰妥莫单抗(Blinatumomab)、Brentuximab vedotin、Briakinumab、卡那单抗(Canakinumab)、美坎珠单抗(Cantuzumab mertansine)、卡罗单抗喷地妝(Capromab pendetide)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、西利珠单抗(Cedelizumab)、培舍珠单抗(Certolizumabpegol)、西妥昔单抗(Cetuximab)、泊西他珠单抗(Citatuzumab bogatox)、西妥木单抗(Cixutumumab)、克立昔单抗(Clenoliximab)、Clivatuzumab tetraxetan、CNTO148(戈利木单抗(golimumab))、CNTO 1275(优特克单抗(ustekinumab))、可那木单抗(Conatumumab)、达西珠单抗(Dacetuzumab)、达克珠单抗(Daclizumab)、地诺单抗(Denosumab)、地莫单抗(Detumomab)、阿托度单抗(Dorlimomab aritox)、Dorlixizumab、度伐单抗(durvalumab)、依美昔单抗(Ecromeximab)、依库珠单抗(Eculizumab)、埃巴单抗(Edobacomab)、依决洛单抗(Edrecolomab)、依法珠单抗(Efalizumab)、依夫单抗(Efungumab)、艾西莫单抗(Elsilimomab)、培戈赖莫单抗(Enlimomab pegol)、西依匹莫单抗(Epitumomabcituxetan)、依帕珠单抗(Epratuzumab)、厄利珠单抗(Erlizumab)、厄马索单抗(Ertumaxomab)、埃达珠单抗(Etaracizumab)、艾韦单抗(Exbivirumab)、法索单抗(Fanolesomab)、法拉莫单抗(Faralimomab)、非维珠单抗(Felvizumab)、非扎奴单抗(Fezakinumab)、芬妥木单抗(Figitumumab)、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、福拉韦单抗(Foravirumab)、夫苏木单抗(Fresolimumab)、力口利昔单抗(Galiximab)、GantenerumabΛ加维莫单抗(Gavilimomab)、吉妥珠单抗奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)、戈利木单抗(Golimumab)、戈利昔单抗(Gomiliximab)、Ibalizumab、替伊莫单抗(Ibritumomabtiuxetan)、伊戈伏单抗(Igovomab)、英西单抗(Imciromab)、英利昔单抗(Infliximab)、英妥木单抗(Intetumumab)、伊诺莫单抗(Inolimomab)、伊珠单抗奥佐米星(Inotuzumabozogamicin)、伊匹木单抗(Ipilimumab)、伊妥木单抗(Iratumumab)、凯利昔单抗(Keliximab)、拉贝珠单抗(Labetuzumab)、来金珠单抗(Lebrikizumab)、来马索单抗(Lemalesomab)、乐地单抗(Lerdelimumab)、来沙木单抗(Lexatumumab)、利韦单抗(Libivirumab)、林妥珠单抗(Lintuzumab)、鲁卡木单抗(Lucatumumab)、鲁昔单抗(Lumiliximab)、马帕木单抗(Mapatumumab)、马司莫单抗(Maslimomab)、马妥珠单抗(Matuzumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)、美替木单抗(Metelimumab)、米拉珠单抗(Milatuzumab)、明瑞莫单抗(Minretumomab)、米妥莫单抗(Mitumomab)、莫罗木单抗(Morolimumab)、莫他珠单抗(Motavizumab)、莫罗单抗-CD3(Muromonab_CD3)、MY0-029(司他莫单抗(stamulumab))、他那可单抗(Nacolomab tafenatox)、他那莫单抗(Naptumomabestafenatox)、那他珠单抗(Natalizumab)、奈巴库单抗(Nebacumab)、奈昔木单抗(Necitumumab)、奈瑞莫单抗(Nerelimomab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、纳武单抗(Nivolumab)、巯诺莫单抗(Nofetumomab merpentan)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、奥度莫单抗(Odulimomab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、莫奥珠单抗(Oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(Oregovomab)、奥昔珠单抗(Otelixizumab)、帕昔单抗(Pagibaximab)JQ利珠单抗(Palivizumab)、帕木单抗(Panitumumab)、帕诺库单抗(Panobacumab)、帕考珠单抗(Pascolizumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、帕尼单抗(Pemtumomab)、培妥珠单抗(Pertuzumab)、培克珠单抗(Pexelizumab)、平妥莫单抗(Pintumomab)、普立昔单抗(Priliximab)、普立木单抗(Pritumumab)、PRO 140、雷韦单抗(Rafivirumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、雷昔库单抗(Raxibacumab)、瑞加韦单抗(Regavirumab)、瑞利珠单抗(Reslizumab)、利妥木单抗(Rilotumumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、罗妥木单抗(Robatumumab)、罗利珠单抗(Rontalizumab)、罗维珠单抗(Rovelizumab)、鲁利珠单抗(Ruplizumab)、沙妥莫单抗(Satumomab)、司韦单抗(Sevirumab)、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)、西法木单抗(Sifalimumab)、Siltuximab、西利珠单抗(Siplizumab)、苏兰珠单抗(Solanezumab)、单抗(Sonepcizumab)、松妥珠单抗(Sontuzumab)、司他芦单抗(Stamulumab)、硫索单抗(Sulesomab)、他珠单抗(Tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(Tadocizumab)、他利珠单抗(Talizumab)、他尼珠单抗(Tanezumab)、帕他莫单抗(Taplitumomab paptox)、替非珠单抗(Tefibazumab)、阿替莫单抗(Telimomab aritox)、替妥莫单抗(Tenatumomab)、替奈昔单抗(Teneliximab)、替利珠单抗(Teplizumab)、TGN1412、替西木单抗(Ticilimumab)、曲美木单抗(tremeIimumab)、替加珠单抗(Tigatuzumab)、TNX-355(伊巴珠单抗(ibalizumab))、TNX-650、TNX-901(他利珠单抗(talizumab))、托珠单抗(Tocilizumab)、托利珠单抗(Toralizumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、曲美木单抗(Tremelimumab)、西莫白介素单抗(Tucotuzumabcelmoleukin)、妥韦单抗(Tuvirumab)、乌珠单抗(Urtoxazumab)、优特克单抗(Ustekinumab)、伐利昔单抗(Vapaliximab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、维妥珠单抗(Veltuzumab)、维帕莫单抗(Vepalimomab)、维西珠单抗(Visilizumab)、伏洛昔单抗(Volociximab)、伏妥昔单抗(Votumumab)、扎芦木单抗(Zalutumumab)、扎木单抗(Zanolimumab)、齐拉木单抗(Ziralimumab)以及阿佐莫单抗(Zolimomab aritox)。

在一些实施方式中，所述抗体选自派姆单抗(Pembrolizumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)以及尼妥珠单抗(Nimotuzumab)。

在一些实施方式中，所述组合物还包括免疫细胞治疗药物、化学药物、促进粘膜免疫吸收或粘膜粘附的物质、免疫调节剂、药物可接受的盐或赋形剂中的一种或多种。

当本发明的组合物作为药物施用于人和动物时，它们可以单独施用或作为药用组合物施用，该药用组合物包括，例如，0.01-99.5％(更优选的是0.1-90％)的活性组分并且和药用上可接受的载体结合在一起。

在一些实施方式中，所述免疫细胞治疗药物选自树突状细胞、细胞因子诱导杀伤细胞、树突细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞、自然杀伤细胞、CD3AK、sc-Fv-CAR-T和TCR-T中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述化学药物选自烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗肿瘤药、激素类药物和杂类药物中的一种或多种；

其中所述杂类药物选自左旋门冬酰胺酶、草酸铂、顺铂、氮烯咪胺、卡铂、六甲嘧胺类药物，或上述药物的衍生物。

在一些具体的实施方式中，所述烷化剂选自环磷酰胺、弹烯咪胺、顺氯氨铂、白消安、苯丙氨酸氮芥、二氯甲二乙胺、亚硝脲类和上述药物的衍生物；

在一些具体的实施方式中，所述抗代谢药选自5-氟脲嘧啶、阿糖胞苷、环胞苷、家氨蝶呤、羟基脲和上述药物的衍生物；

在一些具体的实施方式中，所述抗肿瘤抗生素选自放线菌素、丝裂霉素、阿霉素、红必霉素、更生霉素、黄胆素、博来霉素和上述药物的衍生物；

在一些具体的实施方式中，所述激素类药物选自性激素、皮质类固醇激素和上述药物的衍生物。

在一些具体的实施方式中，所述促进粘膜免疫吸收或粘膜粘附的物质选自阴离子表面活性剂(如羧酸盐类、磺酸盐类、硫酸酯类、磷酸酯类等)、阳离子表面活性剂(如胺盐类、季铵盐类、杂环类、鎓盐类等)、两性离子表面活性剂如羧酸盐型、磺酸盐型、磷酸酯型、甜菜碱型、咪唑啉型、氨基酸型等)、非离子表面活性剂(如烷基多苷型、聚氧乙烯型、多元醇型、烷醇酰胺型、嵌段聚醚型)、特种表面活性剂(如含氟型、含硅型、含硼型、高分子型等)、螯合剂(如多磷酸盐、氨基羧酸、1,3-二酮，羟基羧酸、多胺等)、粘合剂【水溶型粘合剂(如淀粉、糊精、聚乙烯醇、羧甲基纤维素等)、热熔型粘合剂(如聚氨酯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯共聚物等)、溶剂型粘合剂(如虫胶、丁基橡胶等)、乳液型粘合剂(如醋酸乙烯树脂、丙烯酸树脂、氯化橡胶等)、无溶剂液体粘合剂(如环氧树脂等)】、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、右旋糖酐、多聚糖中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述免疫调节剂选自趋化因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL)、干细胞生长因子、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和干细胞生长因子中的一种或多种。

本发明还涉及一种在受治疗者中产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的方法，其包括以下步骤：在允许在受治疗者中产生CTL应答的条件下，向受治疗者施用上述药物组合物。

本发明还涉及一种预防和/或治疗和/或辅助治疗患者疾病方法，包括在给患者施用上述组合物；

在一些实施方式中，所述疾病为肿瘤、病毒性感染或异常细胞所导致的疾病。

在上述方法中：

在一些实施方式中，当所述抗体为尼妥珠单抗时，抗体浓度为0.005～0.015μg/ml，还可以选择0.007μg/ml、0.010μg/ml或0.013μg/ml；

在一些实施方式中，当所述抗体为派姆单抗时，抗体浓度为0.05～0.15μg/ml，还可以选择0.07μg/ml、0.10μg/ml或0.13μg/ml；

在一些实施方式中，当所述抗体为曲妥珠单抗时，抗体浓度为0.005～0.015μg/ml，还可以选择0.007μg/ml、0.010μg/ml或0.013μg/ml；

在一些实施方式中，治疗时以(5～15)：1的效靶比添加组合物中的T淋巴细胞，还可以选择6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1或14:1。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1pCAR-FcγRⅠ慢病毒过表达载体的构建

NCBI获取FcγRⅠ的信号肽区和胞外区基因序列以及对应氨基酸序列，同样方法获取跨膜区CD28、胞内信号区4-1BB以及CD3ζ的基因序列以及对应氨基酸序列，构成FcγRⅠ嵌合基因，图1为FcγRⅠ嵌合基因结构示意图。基因两端分别加上BstBI和XbaI酶切位点，全长1692bp，送至上海捷瑞生物工程有限公司合成后，获得克隆有目的基因的载体PGH-Z1528G。慢病毒过表达载体pCAR购自爱康得生物医学技术(苏州)有限公司和汉恒生物，具体图谱参照图2。

将PGH-Z1528G和pCAR质粒载体分别转化至感受态大肠杆菌DH5α中扩增，试剂盒抽提新鲜的PGH-Z1528G和pCAR质粒，用BstBI和XbaI限制性内切酶对PGH-Z1528G和pCAR质粒分别进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳、割胶回收获得FcγRⅠ嵌合基因片段和载体片段，随后用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接子转化至感受态大肠杆菌DH5α中，次日挑取单菌落，重新接种后提取质粒，进行双酶切验证及测序分析，确保目的基因的完整性及插入片段的正确性。

对双酶切验证正确及测序比对正确的质粒，我们将其命名为pCAR-FcγRⅠ，图3为双酶切验证图，泳道1为未酶切的重组pCAR-FcγRⅠ质粒，泳道2为重组pCAR-FcγRⅠ质粒经Xba I和BstB I双酶切的产物。结果显示，双酶切后目的基因片段和载体片段位置大小正确，结合测序序列比对结果，说明FcγRⅠ嵌合基因已成功构建至载体pCAR上，可以用于下一步实验。将pCAR-FcγRⅠ重新转化感受态大肠杆菌DH5α扩增，按照无内毒素质粒提取试剂盒说明书的要求，抽提无内毒素质粒，通过微量分光光度计测定相应质粒的浓度(一般要求质粒浓度大于500ng/ul)后待用。

本发明采用三质粒慢病毒包装系统，因此，除了表达质粒pCAR-FcγRⅠ之外，另外两个辅助质粒我们选用了本实验室保存的pMD2.G和psPAX2，同样转化大肠杆菌扩增后提取无内毒素质粒，测序验证正确后待用。

实施例2pCAR-FcγRⅠ慢病毒的制备

嵌合基因FcγRⅠ的慢病毒制备、纯化和浓缩采用如下所述方法：

1.复苏一支-80℃冻存的HEK293T细胞至T75一次性塑料培养皿中，待细胞长满后用胰酶消化，传代至新的100mm培养皿中，37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。第二天，待细胞融合度为70％-80％时最适合进行转染，转染试剂为abm2500G PLUS(南京爱必梦生物科技有限公司)，按照abm2500G PLUS转染试剂说明书进行转染。

2.转染后6h将培养基更换为新鲜的含10％FBS的DMEM高糖培养基。转染48h后收集细胞上清至干净的50ml无菌离心管，4℃保存，并添加新的培养基，重新放回培养箱继续培养，转染72h后二次收集培养上清至同一离心管中并丢弃细胞及培养皿。

3.4℃，2000g离心5min去除细胞及大的细胞碎片，将上清用0.45μm滤器过滤至新的无菌离心管中，4℃可暂存过夜，长期保存需置于-80℃，但是要尽量避免反复冻融。

慢病毒浓缩方法包括但不限于超速离心法、透析法、超滤法等，本发明优选超高速离心法，具体步骤如下：无菌条件下，将上述纯化好的病毒上清装至超速离心管中，注意配平，4℃，72000g/min离心120分钟，弃除上清，用新鲜培养基重悬沉淀，集中后的病毒悬液分装成110μl每份，保存在成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃冰箱中，另留取少量病毒悬液用于后续滴度检测。

pCAR-FcγRⅠ慢病毒滴度检测采用如下所述方法：

由于表达载体pCAR-FcγRⅠ上无荧光标记，故本发明采用Q-PCR的方法对上述病毒进行滴度检测，选用慢病毒滴度检测试剂盒(南京爱必梦生物科技有限公司)检测其滴度，按照说明书进行病毒裂解、加样、上机。图4是Q-PCR检测病毒滴度结果，其中pCAR为不含FcγRⅠ嵌合基因的空病毒，pCAR-FcγRⅠ为含有FcγRⅠ嵌合基因的病毒，结果显示，浓缩后的病毒滴度可达到10⁸以上，可满足后续实验的要求。

实施例3Jurkat细胞初步验证FcγRⅠ的过表达

Jurkat细胞是人外周血白血病细胞，在血液肿瘤及免疫学研究中具有广泛应用，因其生理特性与T淋巴细胞最为接近，故本发明用Jurkat细胞初步验证FcγRⅠ的过表达情况，一方面可判断包装的病毒是否正确和具有感染性，另一方面，可判断FcγRⅠ蛋白是否可以正确转录和翻译。

提前一天将Jurkat细胞按照适当的细胞密度铺至24孔板，37℃，5％CO₂培养过夜，次日取出平板，1000rpm室温平板离心10min，轻轻移除细胞上清，加入正常体积一半的含10％FBS的1640培养基，按照MOI＝20加入适当体积的上述浓缩好的病毒，放回培养箱继续培养，4h后将培养基补足至正常体积，继续培养。于感染后24h换液，感染96h后即可收集细胞用于检测。

本发明采用Q-PCR法和流式细胞术法检测Jurkat细胞中FcγRⅠ的表达情况。收集细胞，提取总RNA，经逆转录成cDNA后进行Q-PCR检测，检测结果如图5-A所示，结果表明，与对照组相比，实验组在基因转录水平上具有显著差异。流式细胞术检测细胞表面FcγRⅠ的表达，结果显示，实验组较对照组的FcγRⅠ表达量有明显提高，由0.6％提高至77.2％。综上，本发明使用的慢病毒具有较强的感染性，可介导FcγRⅠ正确表达于细胞表面。

实施例4T淋巴细胞的分离制备

新鲜血液来源于患者或者健康供者，采用经典的Ficoll密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(PBMC)。取15ml新鲜人抗凝血液，与磷酸盐缓冲液PBS按照1：1比例混匀稀释。于15ml离心管中预先加入3ml淋巴细胞分离液，用滴管沿离心管壁缓慢加入5ml稀释后的新鲜血液于分离液液面上，保持界面清晰，水平离心1690rpm，30min。离心后离心管内液体分为如图6所示的四层，上层为血浆，下层主要为红细胞和粒细胞沉淀，中间层为淋巴细胞分离液，在中上层液面交界处有一层明显的乳白色云雾状狭带，此带富含淋巴细胞和单个核细胞(PBMCs)。用一次性滴管轻轻吸取云雾状的细胞，转移入另一新的离心管中。按照1：10比例(V/V)加入PBS，充分混合均匀后，水平离心1200rpm，10min，弃去上清液，细胞沉淀以同样方法再洗涤2次。最后一次洗涤后进行细胞计数，置于培养皿中过夜贴壁，去除贴壁细胞。

CD3⁺T淋巴细胞的磁珠分选：

1.细胞收集：用移液枪吸取上述经过夜贴壁处理的细胞上清，置于15ml无菌离心管中，300g室温离心10min，弃上清，沉淀用PBS重悬，计数。

2.根据实验需求，吸取适量细胞悬液，300g室温离心10min，弃上清。

3.按照每10⁷个细胞加80μl MACS buffer和20μl human anti-CD3磁珠的标准，向细胞沉淀中加入适当体积的MACS buffer和anti-CD3磁珠，重悬，磁珠在使用前最好用移液枪轻轻吹打均匀。

4.4℃，暗处孵育15min，中间轻弹一次。

5.孵育结束后，加1-2ml MACS buffer，300g室温离心10min，清洗细胞一次。

6.弃上清，按照每10^8个细胞加入500μl MACS buffer的比例加入适量MASCbuffer重悬，标本液制备完毕。

7.将LS磁珠分选柱正确放置在磁力架上，加入3ml MACS buffer润洗柱子。

8.待液体快要流尽时，缓慢加入步骤6中的标本液，柱子下面放置一个干净的离心管收集阴性细胞。

9.待液体快要流尽时，加入3ml MACS buffer洗柱子，重复洗涤2次，充分回收阴性细胞。

10.待液体彻底流尽后，取下柱子，置于一个干净的15ml离心管上，加入5ml MACSbuffer，使用磁珠分选柱配套的活塞快速推尽液体，收集的细胞即为CD3阳性细胞。

11.加入适量的MACS buffer，300g室温离心10min，弃上清，清洗细胞。

12.加入含10％FBS的1640培养基，细胞计数，调整细胞密度至适当浓度后铺于预先包被好anti-CD3单克隆抗体的24孔板中，加入终浓度为1ug/ml human anti-CD28使T细胞活化，加入终浓度为100U/ml的hIL-2维持T细胞生长并使其扩增。

图7为CD3⁺T淋巴细胞的磁珠分选结果，其中A图为磁珠分选前的流式检测结果，图B为磁珠分选后的流式检测结果图。对比可看出，分选前CD3⁺T细胞的比例为38.4％，磁珠分选后CD3⁺T细胞的比例可达到97.6％，说明磁珠分选效果好，分选后CD3⁺T细胞的纯度高，为下一步实验奠定了基础。

实施例5慢病毒感染CD3⁺T细胞

使用上述浓缩好的慢病毒感染human CD3⁺T淋巴细胞，具体步骤如下：

1)polybrene的预处理：T细胞活化36h后，取出平板，1200r/min室温平板离心10min，小心吸除培养上清，更换为正常培养体积一半的含10％FBS的1640新鲜培养基，设置polybrene的浓度为0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL的浓度梯度，37℃预处理15min；

2)提前从-80℃冰箱取出病毒，4℃溶解彻底，然后按照MOI＝20、50、100和150加入对应体积的病毒液，封好，放入平板离心机中，400g室温离心1h使病毒颗粒与细胞混合均匀，离心有利于病毒颗粒与细胞的接触；

3)离心结束后，将96孔板重新放回37℃，5％CO₂培养箱中继续培养；

4)感染6h后补齐培养液至正常体积。感染24h后，更换新鲜培养基，并补加anti-CD28和hIL-2，继续放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；

5)于病毒感染48h后，利用相同的感染条件进行二次感染，具体操作见步骤1到4；

6)继续培养48h后，荧光显微镜下观察感染情况，收集细胞，使用1％台盼蓝染色，Countstar仪下观察细胞活率。结果图如图8-A和8-B所示。

实施例6流式细胞术检测FcγRⅠ的表达情况

1.设置分组：空白组、pCAR双染组和pCAR-FcγRⅠ双染组。

2.每组取1×10⁶个上述细胞，加入1ml PBS 1200rpm，4℃离心5min清洗细胞。

3.重复清洗细胞1次。

4.加入1:100稀释的APC Mouse anti-human CD3和FITC Mouse anti-human CD64表面标记流式抗体，轻轻振荡混匀，冰上暗处孵育30min，孵育期间可取出混匀一次。

5.加入1ml PBS 1200rpm，4℃离心5min清洗细胞，重复清洗2次，加500μl PBS重悬即可上机检测。流式检测结果如图9所示，由图可知，pCAR感染效率为2.6％，pCAR-FcγRⅠ感染效率为55.2％，与对照组相比，pCAR-FcγRⅠ组的FcγRⅠ(CD64)的表达量有显著提高，说明约有55.2％的T细胞成功表达了FcγRⅠ。

实施例7WB检测CD3ζ的磷酸化水平结果图

收集对照组和实验组的病毒感染的T细胞，细胞裂解提取总蛋白，WB检测内源性的CD3ζ和磷酸化CD3ζ的蛋白表达情况，本发明检测的CD3ζ磷酸化位点为Y83，使用的抗体为anti-CD3zeta(phospho Y83)，检测结果如图10所示，检测结果表明FcγRⅠ融合蛋白在T细胞中已成功表达，并可在外源分子的刺激下成功激活。

实施例8EGFR高表达细胞株的鉴定

流式细胞术法检测几个肿瘤细胞株表面EGFR的表达情况，流式染色步骤参考实施例6，流式抗体选用PE Mouse anti-human EGFR，肿瘤细胞株为sgc7901、HCT116、BGC-823、Caco-2和MKN-45。其中sgc7901为人胃腺癌细胞，为HCT116人结肠癌细胞，BGC-823为人胃腺癌细胞，Caco-2为人结肠腺癌细胞，MKN-45为人低分化胃癌细胞。检测结果如图11所示。结果显示，sgc7901、HCT116、BGC-823、Caco-2表面EGFR的表达均处于较高水平，但MKN-45表面EGFR的表达量几乎为零，因此本发明将MKN-45作为EGFR阴性对照细胞。

实施例9FcγRⅠ嵌合受体T细胞联合尼妥珠单抗的ADCC效应检测(LDH乳酸脱氢酶检测法)

杀伤功能是机体免疫功能的一个重要方面，目前常用的反映ADCC效应的指标有⁵¹Cr释放、乳酸脱氢酶释放。⁵¹Cr释放法的原理是通过将同位素⁵¹Cr掺入到靶细胞中，按一定细胞比例与效应细胞孵育4小时，根据细胞上清中靶细胞被杀伤后所释放的⁵¹Cr水平计算出杀伤细胞的杀伤活性。乳酸脱氢酶检测法的原理是细胞裂解后可释放LDH，通过检测细胞培养液中的LDH的量来可以评价ADCC活性。本发明采用的方法是LDH检测法，靶细胞为sgc7901，具体操作步骤如下：

1.提前一天铺板，同时设置试验分组：

(1)靶细胞自发LDH释放：将靶细胞以固定细胞数，按三个复孔加入，终体积与实验孔相等。

(2)效应细胞自发LDH释放：按照E/T比例，将适当细胞数的效应细胞按三个复孔铺入，终体积与实验孔相等。

(3)靶细胞最大LDH释放：将靶细胞以固定细胞数，按三个复孔加入，终体积与实验孔相等，并在收获上清前15min，加入10％实验孔体积的细胞裂解液。

(4)体积校正对照：将10％实验孔体积的细胞裂解液，按三个复孔加到含培养基的孔中，用于校正靶细胞最大LDH释放孔加入细胞裂解后终体积大于实验孔而影响最终测量值。

(5)培养基背景：将培养基按三个复孔加入，终体积与实验孔相等，用于校正反应产物引起的背景吸光值。

(6)实验孔：向96孔板中的所有实验孔加入固定细胞数的靶细胞，将不同浓度的抗体或不同E/T比例的效应细胞按三个复孔加入实验孔，终体积相等。

2.靶细胞孵育过夜后，弃去培养基上清，用含5％FBS的1640培养基洗细胞三次，按照实验要求加入抗体和病毒感染过的上述T细胞作为效应细胞，放置于37℃，5％CO₂培养箱中共孵育4h。

3.孵育结束前15min，于靶细胞最大释放孔和体积校正孔各加入5μl lysissolution，37℃避光孵育。

4.取出平板，室温平板离心1200rpm×10min，将100μl上清转移至新的96孔平底板中。

5.配置混合液：按照100tests需要250μl的solution1和11.25ml的solution2，配置所需体积的混合液。

6.每孔加入100μl上述新鲜配置的反应混合液，5℃-25℃避光孵育30min。

7.孵育结束后，每孔加入50μl反应终止液，轻摇10s，于490nm或492nm处检测吸光值(检测波长)，600nm处检测吸光值(校正波长)。

本发明对不同抗体浓度和不同的E/T对ADCC效应的影响进行了探究，抗体浓度设置梯度：0.001、0.01、0.1、1μg/ml，E/T设置比例：2:1、5:1、10:1、20:1，结果如图12所示。B图反映了不同抗体浓度对ADCC效应的影响，由图可知，当抗体浓度为0.01μg/ml时，效应细胞对肿瘤细胞的杀伤能力最强。A图反映了不同E/T比例对ADCC效应的影响，由图可知，当E/T为10:1时，细胞裂解率最大，ADCC效应最强。综上，本发明确定了ADCC效应的最佳条件为抗体浓度为0.01μg/ml，E/T为10:1。在上述最佳条件下，检测sgc7901、HCT116、MKN-45的ADCC效应，结果如C图所示，由图可知，同等条件下，与对照组相比，FcγRⅠ嵌合受体T细胞可介导更强的ADCC效应。

实施例10FcγRⅠ嵌合受体T细胞联合尼妥珠单抗肿瘤杀伤相关细胞因子的ELISA检测结果

肿瘤杀伤过程中会释放肿瘤杀伤相关细胞因子，如IL-2、IFN-γ、TNF-α等，通过检测这些细胞因子的水平，可以反映肿瘤杀伤的强弱。本发明使用ELISA法对肿瘤细胞sgc7901和HCT116与效应细胞FcγRⅠ嵌合受体T细胞共孵育24h后的细胞上清进行了检测，检测指标为hIL-2、hIFN-γ和hTNF-α，检测结果如图13所示。图A、图B、图C分别为hIL-2、hIFNγ、和hTNF-α的ELISA检测结果。结果显示，与对照组相比，pCAR-FcγRⅠ组的hIL-2、hIFN-γ、和hTNF-α的表达量均有显著提高，提示FcγRⅠ-T细胞较单纯的T细胞可通过释放肿瘤杀伤细胞因子引发更强的细胞杀伤。

实施例11FcγRⅠ嵌合受体T细胞与EGFR高表达肿瘤细胞和尼妥珠单抗共孵育的“玫瑰花环”实验

体外一定条件下，T淋巴细胞表面的Fc受体和肿瘤细胞表面的特异性抗原可以在抗体的介导下结合，形成以肿瘤细胞为中心，T细胞环绕在周围，宛似一朵玫瑰花样的花环，称为“玫瑰花环”。本发明将FcγRⅠ嵌合受体T细胞与HCT116、sgc7901、BGC-823共孵育4h，PBS洗去未结合的T细胞，显微镜下观察“玫瑰花”的形态、大小、数量，结果如图所示。图14可以看出，对照组基本没有出现“玫瑰花环”现象，实验组则可以明显看出上文所述的“玫瑰花环”样细胞团，由此推断，本发明构建的FcγRⅠ-T细胞可以通过尼妥珠单抗靶向肿瘤细胞，发挥杀伤作用。

实施例12FcγRⅠ嵌合受体T细胞与EGFR高表达肿瘤细胞和尼妥珠单抗共孵育后CD107a的流式检测结果

FcγRⅠ嵌合受体T细胞与sgc7901、HCT116、Caco-2、BGC-823、MKN-45和尼妥珠单抗共孵育24h后，流式检测T淋巴细胞表面CD107a的表达，检测结果如图15所示，由图可知，较对照组，sgc7901、HCT116、Caco-2、BGC-823实验组FcγRⅠ-T细胞表面CD107a的表达量分别提高了约26％、16％、17％、23％。CD107a反映了免疫细胞脱颗粒，活化具备杀伤功能的情况，其表达量的上升说明尼妥珠单抗可诱导FcγRⅠ-T细胞脱颗粒为具有杀伤功能的T细胞。

实施例13FcγRⅠ嵌合受体T细胞表面FasL以及EGFR高表达肿瘤细胞表面Fas的流式检测结果

FcγRⅠ嵌合受体T细胞与sgc7901、HCT116、Caco-2、BGC-823、MKN-45和尼妥珠单抗共孵育24h后，流式检测肿瘤细胞表面的Fas和T细胞表面的FasL，FasL是能够结合到死亡受体TNFRSF6/FAS的细胞因子，在T-cell发育中介导其由于细胞毒性引起的凋亡。检测结果如图16所示，由图可知，较对照组，sgc7901、HCT116、Caco-2、BGC-823实验组FcγRⅠ-T细胞表面的FasL的表达量分别提高了约20％、10％、10％、15％，sgc7901、HCT116、MKN-45、Caco-2、BGC-823细胞表面Fas的表达量分别提高了约30％、10％、6％、5％，提示FcγRⅠ嵌合受体T细胞可能是通过Fas/FasL途径发挥肿瘤杀伤过程。

实施例14PD-L1高表达细胞株的鉴定

流式细胞术法检测几个肿瘤细胞株表面PD-L1的表达情况，流式抗体选用PEMouse anti human PD-L1，肿瘤细胞株为HCC827、H1299、H460和A549。这四种细胞均为人肺癌细胞。检测结果如图17所示。结果显示，HCC827、H1299、H460表面PD-L1的表达均处于较高水平，但A549表面PD-L1的表达量很低，因此本发明将A549作为阴性对照细胞。

实施例15FcγRⅠ嵌合受体T细胞联合pembrolizumab的ADCC效应检测

ADCC效应检测方法参照实施例9，靶细胞为HCC827，结果如图所示。A图反映了不同抗体浓度对ADCC效应的影响，由图18可知，当抗体浓度为0.01μg/ml时，效应细胞对肿瘤细胞的杀伤能力最强。B图反映了不同E/T比例对ADCC效应的影响，由图可知，当E/T为10:1时，细胞裂解率最大，ADCC效应最强。综上，本发明确定了ADCC效应的最佳条件为抗体浓度为0.1μg/ml，E/T为10:1。在上述最佳条件下，检测HCC827、H1299、A549的ADCC效应，结果如C图所示，由图可知，同等条件下，与对照组相比，FcγRⅠ嵌合受体T细胞可介导更强的ADCC效应。

实施例16FcγRⅠ嵌合受体T细胞联合pembrolizumab肿瘤杀伤相关细胞因子的ELISA检测结果

ELISA法检测HCC827、H1299、H460和A549与效应细胞FcγRⅠ嵌合受体T细胞共孵育24h后的细胞上清中hIL-2、hIFN-γ和hTNF-α的表达水平，检测结果如图19所示。图A、图B、图C分别为hIL-2、hIFN-γ和hTNF-α的ELISA检测结果。结果显示，与对照组相比，pCAR-FcγRⅠ组的hIL-2、hIFN-γ和hTNF-α的表达量均有显著提高，提示FcγRⅠ嵌合受体T细胞可联合pembrolizumab引发肿瘤杀伤细胞因子的释放，进一步发挥肿瘤杀伤作用。

实施例17FcγRⅠ嵌合受体T细胞与PD-L1高表达肿瘤细胞和pembrolizumab共孵育后CD107a的流式检测结果

实验过程参考实施例12，靶细胞选择HCC827、H1299、H460和A549，检测结果如图20所示，由图可知，较对照组，HCC827、H1299实验组FcγRⅠ-T细胞表面CD107a的表达量分别提高了约10％、15％，说明pembrolizumab可以诱导FcγRⅠ-T细胞脱颗粒为具有杀伤功能的T细胞。

实施例18FcγRⅠ嵌合受体T细胞表面FasL以及PD-L1高表达肿瘤细胞表面Fas的流式检测结果

FcγRⅠ嵌合受体T细胞与HCC827、H1299、H460、A549和pembrolizumab共孵育24h后，流式检测肿瘤细胞表面的Fas和T细胞表面的FasL。检测结果如图21所示，由图可知，较对照组，HCC827、H1299、H460实验组FcγRⅠ-T细胞表面的FasL的表达量分别提高了约23％、37％、30％，HCC827、H1299和H460细胞表面Fas的表达量分别提高了约12％、15％和8％，提示FcγRⅠ嵌合受体T细胞可能是通过Fas/FasL途径发挥肿瘤杀伤过程。

实施例19Her-2高表达细胞株的鉴定

流式细胞术法检测几个肿瘤细胞株表面Her-2的表达情况，流式抗体选用PEMouse anti-human PD-L1，肿瘤细胞株为SK-BR-3、SK-OV-3、NCI-N87和MDA-MB-231。其中SK-BR-3、SK-OV-3和MDA-MB-231为人乳腺癌细胞，NCI-N87为人胃癌细胞。检测结果如图22所示。结果显示，SK-BR-3、SK-OV-3、NCI-N87表面Her-2的表达均处于较高水平，但MDA-MB-231表面Her-2的表达量很低，因此本发明将MDA-MB-231作为阴性对照细胞。

实施例20FcγRⅠ嵌合受体T细胞联合曲妥珠单抗的ADCC效应检测

ADCC效应检测方法参照实施例9，靶细胞为SK-BR-3，结果如图所示。A图反映了不同抗体浓度对ADCC效应的影响，由图可知，当抗体浓度为0.01μg/ml时，效应细胞对肿瘤细胞的杀伤能力最强。B图反映了不同E/T比例对ADCC效应的影响，由图23可知，当E/T为10:1时，细胞裂解率最大，ADCC效应最强。综上，本发明确定了ADCC效应的最佳条件为抗体浓度为0.01μg/ml，E/T为10:1。在上述最佳条件下，检测SK-BR-3、SK-OV-3、MDA-MB-231的ADCC效应，结果如C图所示，由图可知，同等条件下，与对照组相比，FcγRⅠ嵌合受体T细胞可介导更强的ADCC效应。

实施例21FcγRⅠ嵌合受体T细胞联合曲妥珠单抗肿瘤杀伤相关细胞因子的ELISA检测结果

ELISA法检测SK-BR-3、SK-OV-3、NCI-N87、MDA-MB-231与效应细胞FcγRⅠ嵌合受体T细胞共孵育24h后的细胞上清中hIL-2、hIFN-γ和hTNF-α的表达水平，检测结果如图24所示。图A、图B、图C分别为hIL-2、hIFN-γ和hTNF-α的ELISA检测结果。结果显示，与对照组相比，pCAR-FcγRⅠ组的hIL-2、hIFN-γ和hTNF-α的表达量均有显著提高，提示FcγRⅠ嵌合受体T细胞可联合曲妥珠单抗引发肿瘤杀伤细胞因子的释放，进一步发挥肿瘤杀伤作用。

实施例22FcγRⅠ嵌合受体T细胞与Her-2高表达肿瘤细胞和曲妥珠单抗共孵育后CD107a的流式检测结果

实验过程参考实施例12，靶细胞选择SK-BR-3、SK-OV-3、NCI-N87、MDA-MB-231，检测结果如图25所示，由图可知，较对照组，SK-BR-3、SK-OV-3实验组FcγRⅠ-T细胞表面CD107a的表达量分别提高了约10％、15％，说明曲妥珠单抗可以诱导FcγRⅠ-T细胞脱颗粒为具有杀伤功能的T细胞。

实施例23FcγRⅠ嵌合受体T细胞表面FasL以及Her-2高表达肿瘤细胞表面Fas的流式检测结果

FcγRⅠ嵌合受体T细胞与SK-BR-3、SK-OV-3、NCI-N87、MDA-MB-231和pembrolizumab共孵育24h后，流式检测肿瘤细胞表面的Fas和T细胞表面的FasL。检测结果如图26所示，由图可知，较对照组，SK-BR-3、SK-OV-3、NCI-N87实验组FcγRⅠ-T细胞表面的FasL的表达量分别提高了约39％、24％、22％，SK-BR-3、SK-OV-3、NCI-N87细胞表面Fas的表达量分别提高了约30％、25％和35％，提示FcγRⅠ嵌合受体T细胞可能是通过Fas/FasL途径发挥肿瘤杀伤过程。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京融捷康生物科技有限公司

<120> 药物组合物

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 277

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gln Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val

1 5 10 15

Ser Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His

20 25 30

Leu Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr

35 40 45

Gln Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp

50 55 60

Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro

65 70 75 80

Ile Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser

85 90 95

Arg Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp

100 105 110

Lys Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala

115 120 125

Phe Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn

130 135 140

Ile Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg

145 150 155 160

Tyr Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala

165 170 175

Pro Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu

180 185 190

Val Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu

195 200 205

Gln Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg

210 215 220

Asn Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser

225 230 235 240

Gly Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys

245 250 255

Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr

260 265 270

Pro Val Trp Phe His

275

<210> 2

<211> 45

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 3

<211> 68

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60

Ala Tyr Arg Ser

65

<210> 4

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly

1 5 10 15

<210> 7

<211> 559

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln

1 5 10 15

Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser

20 25 30

Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu

35 40 45

Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln

50 55 60

Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser

65 70 75 80

Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile

85 90 95

Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg

100 105 110

Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys

115 120 125

Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe

130 135 140

Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile

145 150 155 160

Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr

165 170 175

Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro

180 185 190

Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val

195 200 205

Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln

210 215 220

Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn

225 230 235 240

Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly

245 250 255

Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg

260 265 270

Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro

275 280 285

Val Trp Phe His Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

290 295 300

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg

305 310 315 320

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

325 330 335

Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

340 345 350

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg

355 360 365

Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

370 375 380

Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

385 390 395 400

Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

405 410 415

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

420 425 430

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

435 440 445

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450 455 460

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

465 470 475 480

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

485 490 495

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

545 550 555

Claims (6)

1.一种药物组合物，其包括表达FcγRⅠ嵌合受体的T细胞以及至少一种带有IgG Fc段的抗体；

所述FcγRⅠ嵌合受体包含A）FcγRⅠ胞外区，B）CD8α铰链区，C）CD28跨膜域和D）4-1BB以及CD3ζ的胞内信号传导区；

所述T细胞是人类T细胞；

所述FcγRⅠ胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述FcγRⅠ嵌合受体还包括信号肽区，所述信号肽区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述抗体选自：派姆单抗（Pembrolizumab）、曲妥珠单抗（Trastuzumab)以及尼妥珠单抗（Nimotuzumab)中的一种。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述T细胞来源于所述组合物施用对象自身T细胞。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，

所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述CD28跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗体用于治疗病毒或异常细胞。

5.根据权利要求4所述的组合物，所述异常细胞包括肿瘤细胞。

6.根据权利要求1~5任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括免疫细胞治疗药物、化学药物、促进粘膜免疫吸收或粘膜粘附的物质、免疫调节剂、药物可接受的盐或赋形剂中的一种或多种。

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