WO2020138371A1 - 改変ｔｃｒ及びその製造方法 - Google Patents

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晋一郎 高柳
早紀 長谷川
健 福本
篤志 國里
慧 西川
新 金子
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キリンホールディングス株式会社
国立大学法人京都大学
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention is an invention relating to a modified TCR and a manufacturing method thereof.
  • T cells are one of the immune cells derived from hematopoietic stem cells.
  • T cells express the ⁇ chain (TCR ⁇ ) and ⁇ chain (TCR ⁇ ) of the T cell receptor (TCR) on the cell surface, and the TCR ⁇ and TCR ⁇ form a heterodimer.
  • TCR ⁇ and TCR ⁇ consists of a variable region and a constant region having sequence diversity, and a major histocompatibility complex (MHC)-peptide complex on a target cell is formed by an antigen recognition site formed by the variable region of a TCR ⁇ /TCR ⁇ heterodimer. Recognize specifically. Further, it is considered that the antigen recognition site of the TCR ⁇ /TCR ⁇ heterodimer recognizes whether the target cell is self or non-self, and is involved in the non-self recognition response (alloreaction) in the living body.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the TCR ⁇ /TCR ⁇ heterodimer forms a complex with the CD3 subunits (CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ and CD3 ⁇ ).
  • the TCR ⁇ /TCR ⁇ heterodimer itself is specialized in recognizing and binding to an antigen, and has no signal transduction ability by itself. Instead, the intracellular region of the CD3 subunit is phosphorylated and activated by various adapter molecules, co-receptors, or enzyme molecules that are triggered by antigen recognition through TCR to activate the antigen further downstream. A stimulatory signal is transmitted.
  • This TCR/CD3 complex signal not only functions as a survival signal or an elimination signal in the positive selection or the negative selection that immature T cells receive during the T cell differentiation process in the thymus, but also after maturation in the thymus, the It functions as an activation signal or a proliferation signal in T cells that have migrated to.
  • T-cells are roughly classified into helper T-cells and cytotoxic T-cells, and T-cell therapeutic methods utilizing the antitumor effect of cytotoxic T-cells have been developed.
  • CAR-T therapy for treating tumors, infectious diseases and the like by expressing a chimeric antigen receptor (CAR) on T cells has been put into practical use and has already been used as a cell drug. Approved in Europe and America. In the future, a treatment method using allogeneic T cells will be required in order to reduce the burden on patients due to T cell collection, improve the quality of T cells, and suppress the manufacturing cost.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • Non-Patent Documents 3, 4 and 5 a method of inducing differentiation of T cells from induced pluripotent stem (iPS) cells established from allogeneic T cells has been proposed as a means for producing a homogeneous and highly functional T cell preparation independent of donors. It has been proposed (Non-Patent Documents 3, 4 and 5).
  • Non-Patent Document 7 To efficiently induce T cell differentiation from non-T cell-derived iPS cells, the functional TCR locus is rearranged during differentiation, and the TCR/CD3 complex formed thereby is stimulated in vitro. It is considered important to promote proliferation and survival (Non-Patent Document 7).
  • the CD3 subunit is not retained on the cell membrane surface, so that the growth signal and survival signal via the TCR/CD3 complex are not included.
  • the CD3 agonist antibody which is used to amplify T cell preparations derived from donors ex vivo, does not work, and the efficient production and preparation of cell medicinal products containing allogeneic T cells. It will be a challenge in realization.
  • the TCR ⁇ /TCR ⁇ complex is expressed on the cell surface, and in addition, non-transgenic T cells In order not to cause a self-recognition response, it is desirable that the TCR ⁇ /TCR ⁇ complex does not recognize a non-self antigen such as a non-self HLA-peptide complex.
  • the present inventors designed TCR ⁇ and TCR ⁇ deletions in which the variable region and the constant region were deleted stepwise for each of TCR ⁇ and TCR ⁇ , and their deletions were designed. It was verified whether CD3 subunit expression was observed on the cell membrane surface by introducing the combination of the lost bodies into 293T cells in which the CD3 subunit was constitutively expressed and in Jurkat cells in which the endogenous TCR was knocked out.
  • the modified TCR containing the protein can retain the CD3 subunit in the cell membrane, and induces the activation of T cells by stimulating the CD3 molecule presented on the cell surface by the modified TCR. .. That is, by expressing the modified TCR in a T cell that has suppressed or eliminated the endogenous TCR expression, it is possible that a stimulus response via the TCR/CD3 complex is possible without inducing antigen responsiveness. Heading, completed the present invention.
  • a modified T cell receptor comprising a first polypeptide and a second polypeptide, comprising:
  • the first polypeptide is a polypeptide containing a constant region of human T cell receptor ⁇ (TCR ⁇ ) or a constant region fragment thereof and not containing a variable region of human TCR ⁇
  • the modified TCR wherein the second polypeptide is a polypeptide containing the constant region of human T cell receptor ⁇ (TCR ⁇ ) or a fragment of the constant region and not the variable region of human TCR ⁇ .
  • the modified TCR according to 1 above, wherein the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment is the polypeptide according to any one of (A1) to (A3) below.
  • A1 a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 11;
  • A2 a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 11;
  • A3 A polypeptide comprising an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 11 in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and/or added. 3.
  • the modified TCR according to 1 or 2 wherein the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment is the polypeptide according to any one of (B1) to (B3) below.
  • (B1) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 12 to 24;
  • B2 a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 12 to 24;
  • B3 A polypeptide comprising an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 12 to 24, in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and/or added.
  • the human TCR ⁇ constant region or the constant region fragment and the human TCR ⁇ constant region or the constant region fragment is the polypeptide according to any one of the following (a1) to (a8): The modified TCR according to any one.
  • a polypeptide in which the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; an amino acid having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 A polypeptide consisting of a sequence; or a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and/or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, wherein the constant of human TCR ⁇ is The region or the constant region fragment is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11; 90% or more sequence identity to the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11 A polypeptide comprising an amino acid sequence having a sex; or an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11 in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and/or added Is a polypeptide; (A2) A polypeptide in which the constant
  • the human TCR ⁇ constant region or the constant region fragment and the human TCR ⁇ constant region or the constant region fragment are the polypeptides according to any one of the following (b1) to (b7): The modified TCR according to any one.
  • (B1) a polypeptide in which the constant region of human TCR ⁇ or a constant region fragment thereof comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; an amino acid having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 A polypeptide consisting of a sequence; or a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and/or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, wherein the constant of human TCR ⁇ is
  • the region or the constant region fragment is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11; 90% or more sequence identity to the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11 A polypeptide comprising an amino acid sequence
  • the region or the constant region fragment is a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 3 and 10; 90% of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 3 and 10
  • a polypeptide in which the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:21; an amino acid having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ
  • the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment and the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment are the polypeptides according to any one of the following (c1) to (c5): The modified TCR according to any one.
  • (C1) A polypeptide comprising the constant region or the constant region fragment of human TCR ⁇ consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; an amino acid having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12
  • the region or the constant region fragment is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11; 90% or more sequence identity to the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11
  • C3 A polypeptide comprising the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:22; an amino acid having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:22.
  • the second polypeptide contains at least one selected from Helix3, CC loop, Helix4 F strand and FG loop in the constant region of human TCR ⁇ .
  • the first polypeptide comprises at least a part of the extracellular region in the constant region of human TCR ⁇ , a cell transmembrane region and an intracellular region, and the second polypeptide is an extracellular region in the constant region of human TCR ⁇ .
  • a modified TCR comprising a first polypeptide and a second polypeptide, comprising:
  • the first polypeptide is a polypeptide containing a constant region of human TCR ⁇ or a constant region fragment thereof and not containing a variable region of human TCR ⁇
  • the second polypeptide is a polypeptide containing a constant region of human TCR ⁇ or a constant region fragment thereof and not containing a variable region of human TCR ⁇
  • the proportion of CD3-positive cells in the pluripotent stem cells into which the modified TCR has been introduced, hematopoietic stem/progenitor cells, or T cells in which the endogenous TCR ⁇ gene and the endogenous TCR ⁇ gene have been knocked down or knocked out is 1% or more.
  • Modified TCR 11.
  • the ratio of CD3-positive cells in the pluripotent stem cells introduced with the modified TCR, hematopoietic stem/progenitor cells, or T cells knockdown or knocking out the endogenous TCR ⁇ gene and the endogenous TCR ⁇ gene, respectively, is The modified TCR according to any one of 1 to 10 above, which is at least twice as high as the ratio of CD3-positive cells in the corresponding cells that have not been introduced.
  • the modified TCR-introduced pluripotent stem cells or hematopoietic stem/progenitor cells show T cell differentiation ability equivalent to or higher than that of the corresponding cells introduced with the full-length TCR.
  • the modified TCR according to 1. 13.
  • the alloreactivity of non-T cell-derived pluripotent stem cells introduced with the modified TCR, hematopoietic stem/progenitor cells, or T cells knocking down or knocking out the endogenous TCR ⁇ gene and the endogenous TCR ⁇ gene is The modified TCR according to any one of 1 to 12 above, which is reduced as compared to the corresponding cell into which the TCR has been introduced. 14. The modified TCR according to any one of 1 to 13 above, which is capable of retaining a CD3 subunit on a cell membrane. 15. 15. The modified TCR according to the above 14, which is capable of transmitting a TCR/CD3 complex-related signal into a cell. 16. 16.
  • the modified TCR according to 18 above which is expressed in pluripotent stem cells or hematopoietic stem/progenitor cells to differentiate into T cells.
  • Pluripotent stem cells, hematopoietic stem/progenitor cells, or endogenous TCR ⁇ gene and endogenous TCR ⁇ gene are expressed in knockdown or knockout T cells to enable stimulatory response through the modified TCR/CD3 complex
  • the modified TCR according to any one. 22. A cell expressing the modified TCR according to any one of 1 to 21 above. 23. 23. The cell according to 22 above, wherein the cell expressing the modified TCR is a T cell. 24.
  • (A) a step of preparing cells; (B) an expression vector comprising a polynucleotide encoding a first polypeptide containing a human TCR ⁇ constant region or a constant region fragment thereof and not containing a human TCR ⁇ variable region, and a human TCR ⁇ constant region or the constant region Preparing an expression vector comprising a polynucleotide encoding a second polypeptide comprising the fragment and not comprising the variable region of human TCR ⁇ . (C) A step of transforming the cell prepared in step (a) with the expression vector prepared in step (b). 26.
  • a method for producing a cell that expresses a modified TCR, wherein the modified TCR contains a first polypeptide and a second polypeptide comprises the following steps (a') to (c').
  • A′ a step of preparing cells;
  • B′ a polynucleotide encoding a first polypeptide which contains a constant region of human TCR ⁇ or a constant region fragment thereof and does not contain a variable region of human TCR ⁇ , and a constant region of human TCR ⁇ or a constant region fragment thereof
  • C' A step of transforming the cell prepared in step (a') with the expression vector prepared in step (b').
  • a method for producing a T cell which comprises pluripotent stem cells, hematopoietic stem/progenitor cells, or T cells obtained by knocking down or knocking out an endogenous TCR ⁇ gene and an endogenous TCR ⁇ gene, respectively.
  • the method for producing a T cell which comprises the step of expressing the modified TCR according to 1., wherein the resulting T cell is a T cell capable of stimulating response via the modified TCR/CD3 complex.
  • Immune cell therapy comprising the steps of expressing the modified TCR according to any one of 1 to 21 above in pluripotent stem cells to differentiate into T cells, and administering the obtained T cells to a subject the method of. 32.
  • the modified TCR described in any one of 1 to 21 above is expressed in a T cell that is knocked down or knocked out of an endogenous TCR ⁇ gene and an endogenous TCR ⁇ gene, and the obtained T cell is administered to a subject.
  • a method of immune cell therapy comprising the steps of: 33. Immune cell therapy comprising a step of expressing the modified TCR according to any one of 1 to 21 in a hematopoietic stem/progenitor cell to differentiate into a T cell, and a step of administering the obtained T cell to a subject. the method of. 34.
  • a pluripotent stem cell T cell wherein the modified TCR according to any one of 1 to 21 above is expressed in a pluripotent stem cell and differentiated into a T cell, for use in immune cell therapy.
  • 36. The T cell, wherein the modified TCR according to any one of 1 to 21 above is expressed in a T cell in which an endogenous TCR ⁇ gene and an endogenous TCR ⁇ gene are knocked down or knocked out, respectively, for use in immune cell therapy. .. 37.
  • a hematopoietic stem/progenitor cell-derived T cell wherein the modified TCR according to any one of 1 to 21 above is expressed in a hematopoietic stem/progenitor cell and differentiated into a T cell for use in immune cell therapy. 38. Use of the modified TCR according to any one of 1 to 21 above for producing a composition for immune cell therapy. 39. Pluripotent stem cell-derived T cells obtained by expressing the modified TCR according to any one of 1 to 21 above in pluripotent stem cells and differentiating into T cells for producing a composition for immune cell therapy Use of. 40.
  • T cells Expressing the modified TCR according to any one of 1 to 21 above to a T cell in which an endogenous TCR ⁇ gene and an endogenous TCR ⁇ gene are knocked down or knocked out, respectively, for producing a composition for immune cell therapy.
  • 42. A nucleic acid encoding the modified TCR according to any one of 1 to 21 above.
  • 43. A vector comprising the nucleic acid according to 42.
  • a method for producing a pharmaceutical composition which comprises using the nucleic acid described in 42 above or the vector described in 43 above.
  • a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid according to 42 above or the vector according to 43 above.
  • the modified TCR of the present invention comprises a first polypeptide and a second polypeptide, the first polypeptide comprises the constant region of human TCR ⁇ or a constant region fragment thereof, and the second polypeptide is the constant region of human TCR ⁇ .
  • the CD3 subunit can be retained on the cell membrane by including the constant region fragment.
  • the modified TCR of the present invention has no antigen recognition ability because the first polypeptide and the second polypeptide do not contain the variable regions of TCR ⁇ and TCR ⁇ , respectively.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of full length and modified TCR sequences.
  • FIG. 2 is a diagram showing amino acid sequence information of ba1.
  • FIG. 3 is a diagram showing amino acid sequence information of ba2 to ba9.
  • FIG. 4 is a diagram showing amino acid sequence information of ba10 to ba18.
  • FIG. 5 is a diagram in which the expression of CD3E when various ba vectors and mock vectors were introduced into 293T cells in which CD3 was stably expressed was analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 6 is a diagram in which the expression level of CD3E when various ba vectors and mock vectors were introduced into 293T cells stably expressing CD3 was quantified by MFI.
  • FIG. 5 is a diagram in which the expression of CD3E when various ba vectors and mock vectors were introduced into 293T cells stably expressing CD3 was quantified by MFI.
  • FIG. 6 is a diagram in which the expression level of CD3E when various ba vectors and mock vectors were introduced into 293
  • FIG. 7 is a diagram in which the expression of CD3D when various ba vectors and mock vectors were introduced into 293T cells in which CD3 was stably expressed was analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 8 is a diagram in which the expression level of CD3D when various ba vectors and mock vectors were introduced into 293T cells in which CD3 was stably expressed was quantified by MFI.
  • FIG. 9 is a diagram in which the expression of CD3E when various ba vectors and mock vectors were introduced into Jurkat cells knocking out the endogenous TCR was analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 10 is a diagram in which the expression level of CD3E when various ba vectors and mock vectors were introduced into Jurkat cells knocking out the endogenous TCR was quantified by MFI.
  • FIG. 10 is a diagram in which the expression level of CD3E when various ba vectors and mock vectors were introduced into Jurkat cells knocking out the endogenous TCR was quantified by MFI.
  • FIG. 11 is a diagram in which the expression of CD3D when various ba vectors and mock vectors were introduced into Jurkat cells knocking out the endogenous TCR was analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 12 is a diagram in which the expression level of CD3D when various ba vectors and mock vectors were introduced into Jurkat cells knocking out the endogenous TCR was quantified by MFI.
  • FIG. 13 is a diagram in which changes in responsiveness to OKT3 antibody stimulation due to knockout of endogenous TCR were analyzed by flow cytometry using an increase in expression of activated T cell marker CD69 as an index.
  • FIG. 12 is a diagram in which the expression level of CD3D when various ba vectors and mock vectors were introduced into Jurkat cells knocking out the endogenous TCR was quantified by MFI.
  • FIG. 13 is a diagram in which changes in responsiveness to OKT3 antibody stimulation due to knockout of endogenous TCR were analyzed by flow cytometry using an increase in expression of activated T cell marker CD69
  • FIG. 14 is a diagram in which the expression of CD69 when various ba vectors and mock vectors were introduced into Jurkat cells knocking out the endogenous TCR and stimulated with OKT3 antibody was analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 15 is a diagram in which the expression level of CD69 when various ba vectors and mock vectors were introduced into Jurkat cells knocking out the endogenous TCR and stimulated with OKT3 antibody was quantified by MFI.
  • FIG. 16 shows a schematic diagram of the partial sequence on the N-terminal side of the amino acid sequence of the extracellular region of modified TCR ⁇ and the structure of the amino acid sequence.
  • FIG. 17 shows a schematic diagram of the partial sequence on the N-terminal side of the amino acid sequence of the extracellular region of modified TCR ⁇ and the structure of the amino acid sequence.
  • FIG. 19(A) shows the results of CD3 and CD45 expression analysis of FF-WJs524.
  • FIG. 19(B) is a diagram showing the results of expression analysis of CD8 ⁇ and CD8 ⁇ of FF-WJs524.
  • FIG. 20(A) is a diagram showing the results of culturing on DLL4 and Retronectin for 21 days.
  • FIG. 20(B) is a diagram showing the results of expression analysis of CD8 ⁇ and CD8 ⁇ .
  • the modified TCR of the present invention is a modified TCR comprising a first polypeptide and a second polypeptide, wherein the first polypeptide contains a constant region of human TCR ⁇ or a constant region fragment thereof, and a human TCR ⁇
  • the second polypeptide is a polypeptide that does not include a variable region
  • the second polypeptide is a polypeptide that includes a constant region of human TCR ⁇ or a constant region fragment thereof and does not include a variable region of human TCR ⁇ .
  • the TCR ⁇ locus is composed of variable region (V region), joining region (J region), and constant region (C region).
  • V region variable region
  • J region joining region
  • C region constant region
  • the TCR ⁇ locus is composed of a V region, a diversity region (D region), a J region and a C region.
  • D region diversity region
  • J region J region
  • C region C region
  • V region and J region in TCR ⁇ and the V region, D region and J region in TCR ⁇ are ligated in various combinations, and random insertion or deletion of bases occurs at each ligation part. Results in the formation of functional and highly diverse variable region exons.
  • variable region exon is linked to the C region exon by RNA splicing to form the full-length TCR gene mRNA.
  • TCR ⁇ chain polypeptide and the TCR ⁇ chain polypeptide translated as proteins form a heterodimer, and the TCR is displayed on the cell membrane surface.
  • Each of the TCR ⁇ chain polypeptide and the TCR ⁇ chain polypeptide has an extracellular region, a variable region and a constant region, a cell transmembrane region, and an intracellular region.
  • the constant region in the present invention refers to the C region sequence in a gene and the sequence excluding the variable region domain (non-variable region) in a polypeptide.
  • TCR ⁇ constant region gene TCR gene
  • TRBC1 gene and TRBC2 gene TCR ⁇ constant region gene
  • IMGT the international ImmunoGeneTics information system
  • TRBC1 gene and TRBC2 gene differ by only 5 amino acids in the amino acid sequence, and the C-terminus of TRBC2 has only 2 amino acids compared to TRBC1, and both of them. Has high sequence homology and no functional difference is known.
  • amino acid sequence of the constant region of human TCR ⁇ examples include the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:1.
  • the amino acid sequence of the constant region fragment of human TCR ⁇ may be any amino acid sequence as long as it is a partial sequence of the constant region of human TCR ⁇ .
  • amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 11 may be used.
  • One aspect of the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment of the present invention is the polypeptide described in any one of (A1) to (A3) below.
  • A1 a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 11;
  • A2 a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 11;
  • A3 A polypeptide comprising an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 11 in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and/or added.
  • amino acid sequence of the constant region of human TCR ⁇ examples include the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12.
  • the amino acid sequence of the constant region fragment of human TCR ⁇ in the present invention may be any amino acid sequence as long as it is a partial sequence of the constant region of human TCR ⁇ .
  • One embodiment of the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment includes the polypeptide described in any one of (B1) to (B3) below.
  • (B1) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 12 to 24;
  • B2 a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 12 to 24;
  • B3 A polypeptide comprising an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 12 to 24, in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and/or added.
  • the modified TCR of the present invention exerts the effect of the present invention
  • the length of the amino acid sequence of the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment thereof or the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment in the above-mentioned embodiment is changed. It may also include those in which a mutation by Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) derived from human TCR is introduced.
  • SNPs Single Nucleotide Polymorphisms
  • the modified TCR of the present invention as long as the effects of the present invention are exhibited, known modifications for the purpose of improving the function of the TCR (for example, MichaelS. Kuhns et al., Immunity. 26: 357-369, 2007, AswinNatarajan et al., Cell Reports.14: 2833-2845, 2016 or Schamel W. Wolfgang et al. Immunological Reviews. 291: 8-25, 2019)) are also included.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which 1 to several amino acids have been substituted, inserted, deleted and/or added in the target amino acid sequence is a site-directed mutagenesis method (Molecular Cloning, A Laboratory Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Current Protocols in in Molecular Biology, John Wiley & Sons. 1987-1997, Nucleic Acids Research. 10, 6487, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982,Gene64, , 34: 315, 1985, Nucleic Acids Research. 13: 4431 ,1985 or Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488 ,1985), etc., and, for example, the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 24. Site-specific mutations can be introduced into the DNA encoding the containing polypeptide.
  • the range of 1 to several amino acids in the substitution, insertion, deletion and/or addition of 1 to several amino acids in the amino acid sequence is not particularly limited. For example, if 100 amino acids in the amino acid sequence is taken as one unit, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 per unit, preferably 1, 2 It means about 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 and more preferably about 1, 2, 3, 4 or 5.
  • Amino acid deletion means deletion or deletion of an amino acid residue in the sequence
  • amino acid substitution means that an amino acid residue in the sequence is replaced by another amino acid residue
  • insertion of amino acid or The addition means that a new amino acid residue is added before or after the sequence so as to be inserted or added.
  • substitution of 1 to several amino acids include an aspect in which 1 to several amino acids are replaced with another chemically similar amino acid.
  • a case where a certain hydrophobic amino acid is substituted with another hydrophobic amino acid a case where a certain polar amino acid is substituted with another polar amino acid having the same charge, and the like can be mentioned.
  • Such chemically similar amino acids are known in the art for each amino acid.
  • non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, valine, glycine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine or methionine.
  • polar (neutral) amino acids include serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • basic amino acid having a positive charge examples include arginine, histidine, lysine and the like.
  • aspartic acid, glutamic acid, etc. are mentioned as an acidic amino acid with a negative charge.
  • the amino acid sequence of the target protein in which one to several amino acids are substituted, inserted, deleted and/or added has a certain degree of sequence identity with the amino acid sequence of the target protein.
  • the amino acid sequence of the target protein for example, 60% or more, preferably 65% or more, preferably 70% or more, preferably 75% or more, preferably 80% or more, preferably 85%.
  • the amino acid sequences having the sequence identity of 90% or more, more preferably 90% or more, and further preferably 95% or more are mentioned.
  • the constant region or the constant region fragment of the human TCR ⁇ and the constant region or the constant region fragment of the human TCR ⁇ are the following (a1) to (a8): Modified TCRs that are the described polypeptides are preferred.
  • a polypeptide in which the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; an amino acid having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 A polypeptide consisting of a sequence; or a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and/or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, wherein the constant of human TCR ⁇ is The region or the constant region fragment is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11; 90% or more sequence identity to the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11 A polypeptide comprising an amino acid sequence having a sex; or an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11 in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and/or added Is a polypeptide; (A2) A polypeptide in which the constant
  • the modified TCR that is the polypeptide described in any one of the following (b1) to (b7) is preferable.
  • B1 a polypeptide in which the constant region of human TCR ⁇ or a constant region fragment thereof comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; an amino acid having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 A polypeptide consisting of a sequence; or a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and/or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, wherein the constant of human TCR ⁇ is The region or the constant region fragment is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11; 90% or more sequence identity to the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11 A polypeptide comprising an amino acid sequence having a sex; or an
  • the region or the constant region fragment is a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 3 and 10; 90% of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 3 and 10
  • a polypeptide in which the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:21; an amino acid having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ
  • the modified TCR that is the polypeptide of any one of the following (c1) to (c5) is preferable.
  • C1 A polypeptide comprising the constant region or the constant region fragment of human TCR ⁇ consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; an amino acid having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 A polypeptide consisting of a sequence; or a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, inserted, deleted and/or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, wherein the constant of human TCR ⁇ is The region or the constant region fragment is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11; 90% or more sequence identity to the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11 A polypeptide comprising an amino acid sequence having a sex; or an amino acid sequence having a sex; or an amino acid sequence having a sex; or
  • C3 A polypeptide comprising the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:22; an amino acid having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:22.
  • the first polypeptide contains at least one selected from AB loop, C strand, DE loop and F strand in the constant region of human TCR ⁇ .
  • ABloop, Cstrand, DEloop and Fstrand are preferably included in this order, but may be included in a different order. ..
  • AB loop is, for example, a structure consisting of the 14th to 20th amino acid sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • C strand is, for example, a structure consisting of the 29th to 40th amino acid sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • DEloop is, for example, a structure consisting of the 52nd to 57th amino acid sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • F strand is, for example, a structure composed of the 67th to 81st amino acid sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • the second polypeptide contains at least one selected from Helix3, CC loop, Helix4 Fstrand and FGloop in the constant region of human TCR ⁇ .
  • Helix3, CCloop, Helix4Fstrand and FGloop are preferably included in this order, but may be included in a different order.
  • Helix3 is, for example, a structure consisting of the 20th to 26th amino acid sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • CC loop is, for example, a structure consisting of the 49th to 54th amino acid sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • Helix4F Strand is, for example, a structure consisting of the 88th to 93rd amino acid sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • FGloop is, for example, a structure composed of the 105th to 113th amino acid sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the first polypeptide comprises at least a part of the extracellular region in the constant region of human TCR ⁇ , the transmembrane region and the intracellular region
  • the second polypeptide is in the constant region of human TCR ⁇ . It preferably includes at least a part of the extracellular region, a cell transmembrane region and an intracellular region.
  • the extracellular region in the constant region of human TCR ⁇ is, for example, a region consisting of the amino acid sequences 1 to 117 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the cell transmembrane region in the constant region of human TCR ⁇ is, for example, a region consisting of the 118th to 139th amino acid sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • As an aspect including at least a part of the extracellular region in the constant region of human TCR ⁇ for example, at least the 82nd to 117th amino acids in the region consisting of the 1st to 117th amino acid sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • Preferred embodiments include the embodiment.
  • the intracellular region in the constant region of human TCR ⁇ is, for example, a region consisting of the 140th to 141st amino acid sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • the extracellular region in the constant region of human TCR ⁇ is, for example, a region consisting of the 1st to 146th amino acid sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the cell transmembrane region in the constant region of human TCR ⁇ is, for example, a region consisting of the 147th to 172nd amino acid sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • Preferred embodiments include the embodiment.
  • the intracellular region in the constant region of human TCR ⁇ is, for example, a region consisting of the 173rd to 179th amino acid sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the cysteine residues contained in each amino acid sequence form a disulfide bond, and the two chains are linked together.
  • the modified TCR of the present invention also has an additional cysteine residue in each of the first and second polypeptides so as to form a disulfide bond in the amino acid sequence of the constant region or the constant region fragment.
  • the first polypeptide and the second polypeptide may be further modified so that an additional disulfide bond is formed within the chain and/or between the chains, thereby improving the stability of the modified TCR. You can do it.
  • the modified TCR of the present invention can associate with the CD3 and CD3 ⁇ chains having three different mammalian chains ( ⁇ , ⁇ and ⁇ ) and retain the CD3 subunit on the cell membrane.
  • the CD3 subunit plays an important role in signal transduction from TCR into cells, and the modified TCR of the present invention transduces TCR/CD3 complex-related signals into cells via the CD3 subunit retained on the cell membrane. And activate T cells.
  • the proportion of CD3-positive cells in the pluripotent stem cells introduced with the modified TCR of the present invention, hematopoietic stem/progenitor cells, or T cells knocking down or knocking out the endogenous TCR ⁇ gene and the endogenous TCR ⁇ gene is 1% or more. It is preferably 3% or more, 5% or more, 10% or more or 15% or more, more preferably 20% or more, further preferably 40% or more, particularly preferably 60% or more, particularly preferably 75% or more, Most preferably, it is 80% or more.
  • the proportion of the CD3-positive cells is at least 1% or more, a sufficient stimulus response is obtained via the modified TCR/CD3 complex.
  • the proportion of CD3 positive cells can be evaluated by examining the proportion of CD3D positive cells or CD3E positive cells using flow cytometry, as described later in the examples.
  • the modified TCR of the present invention introduced pluripotent stem cells, hematopoietic stem/progenitor cells, or an endogenous TCR ⁇ gene and an endogenous TCR ⁇ gene.
  • the proportion of CD3-positive cells in the T cells that have been knocked down or knocked out is preferably 2 times or more, more preferably 5 times or more, and further preferably 10 times, the proportion of CD3 positive cells in the corresponding cells. As described above, particularly preferably 20 times or more.
  • the pluripotent stem cells or hematopoietic stem/progenitor cells introduced with the modified TCR of the present invention preferably show the same or higher T cell differentiation ability as the corresponding cells introduced with the full-length TCR (wild type TCR). ..
  • the T cell differentiation potential can be evaluated by the method described below for determining whether or not T cells maintain an undifferentiated state.
  • the antigen recognition site formed by the variable region of the TCR ⁇ /TCR ⁇ heterodimer is considered to recognize whether the target cell is self or non-self.
  • the modified TCR of the present invention does not contain the variable regions of TCR ⁇ and TCR ⁇ in the first polypeptide and the second polypeptide, respectively, and the antigen recognition ability is lost, and the alloreactivity is reduced or eliminated/deleted. To do.
  • the modified TCR of the present invention may include a signal peptide at the N-terminus.
  • the modified TCR of the present invention expresses pluripotent stem cells, hematopoietic stem/progenitor cells, or endogenous TCR ⁇ gene and endogenous TCR ⁇ gene in knockdown or knockout T cells; pluripotent stem cells or hematopoietic stem/ Differentiated into progenitor cells and differentiated into T cells; modified by expressing into pluripotent stem cells, hematopoietic stem/progenitor cells, or endogenous TCR ⁇ gene and endogenous TCR ⁇ gene in knockdown or knockout T cells, respectively It can be preferably used for applications such as preparation of T cells capable of stimulus response via TCR/CD3 complex.
  • the method of introducing modified TCR into cells is not particularly limited, and known methods can be appropriately used.
  • a method of introducing into the cell in the form of a polynucleotide encoding the modified TCR a method of introducing the modified TCR into the cell in the form of a protein, and the like can be mentioned.
  • (A) a step of preparing cells; (B) an expression vector comprising a polynucleotide encoding a first polypeptide containing a human TCR ⁇ constant region or a constant region fragment thereof and not containing a human TCR ⁇ variable region, and a human TCR ⁇ constant region or the constant region Preparing an expression vector comprising a polynucleotide encoding a second polypeptide comprising the fragment and not comprising the variable region of human TCR ⁇ . (C) A step of transforming the cell prepared in step (a) with the expression vector prepared in step (b).
  • (A′) a step of preparing cells; (B′) a polynucleotide encoding a first polypeptide which contains a constant region of human TCR ⁇ or a constant region fragment thereof and does not contain a variable region of human TCR ⁇ , and a constant region of human TCR ⁇ or a constant region fragment thereof And a step of preparing an expression vector containing a polynucleotide encoding a second polypeptide which does not include the variable region of human TCR ⁇ ; (C') A step of transforming the cell prepared in step (a') with the expression vector prepared in step (b').
  • the type of polynucleotide is not particularly limited and can be selected according to the method of gene introduction, and may be DNA or RNA.
  • polynucleotide encoding the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment examples include the polynucleotides described in (i) to (v) below.
  • V A polynucleotide encoding a
  • polynucleotide encoding the constant region of human TCR ⁇ or the constant region fragment examples include the polynucleotides described in (vi) to (x) below.
  • Examples of the base sequence that hybridizes under stringent conditions include, for example, a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method or a method using a polynucleotide containing a target base sequence as a probe.
  • Examples include base sequences of hybridizable polynucleotides obtained by the DNA microarray method and the like.
  • a salinization of 0.7 to 1.0 mol/L is performed.
  • Examples of the polynucleotide containing a base sequence that hybridizes under stringent conditions include DNAs having a certain degree of sequence identity with the base sequence of the polynucleotide having the base sequence of the gene to be used as a probe. For example, DNA having at least 60% or more homology with the target nucleotide sequence, preferably DNA having 80% or more homology, and more preferably DNA having 95% or more homology. Further, for example, if 100 bases in the base sequence is taken as one unit, 1 to several, preferably 1 to 40, preferably 1 to 35, units per unit of the base sequence of the gene of interest.
  • a DNA containing a base sequence having a substitution, insertion, deletion and/or addition of 10 bases, still more preferably 1, 2, 3, 4 or 5 bases can be mentioned.
  • the deletion of a base means that a base in the sequence has a deletion or disappearance
  • the substitution of a base means that a base in the sequence is replaced by another base
  • the insertion or addition of a base means It means that a new base has been added for insertion.
  • Gene polymorphisms are often found in the nucleotide sequences of genes that encode eukaryotic proteins.
  • the base sequence of the gene used in the present invention also includes the base sequence of the gene in which a small-scale mutation has occurred in the base sequence due to such polymorphism.
  • sequence identity means the identity between two sequences, which means that two sequences are aligned with each other and that two nucleotides or protein sequences which are compared have exactly the same nucleotide or the same amino acid. Refers to the existence of a position. Thus, if two proteins show 90% identity, this means that 90% of all amino acid residues contained in the proteins at the corresponding positions are exactly the same.
  • sequence identity in the present invention may be a numerical value calculated by using a sequence identity search program known to those skilled in the art, unless otherwise specified.
  • BLAST for example, J .Mol.Biol., 215, 403, and 1990
  • amino acid sequences such as numerical values calculated using default parameters, BLAST2 (for example, Nucleic Acids Res., 25, 3389, 1997, Genome Res ., 7, 649, 1997 or http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html) or the default parameter in Pairwise SequenceAlignment based on Needleman-Wunsch algorithm Examples include numerical values calculated using.
  • the default parameters are, for example, 5 when G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 when an amino acid sequence, 2 when -E (Cost to extend gap) is a base sequence, and an amino acid sequence.
  • And -Z final X dropoff value for gapped alignment in bits
  • blastn 25 in programs other than blastn (for example, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/htmL /blastcgihelp.html).
  • the gene can be introduced by appropriately using a method usually used in the art, and the method is not particularly limited.
  • the gene of the present invention can be introduced by incorporating it into a viral vector such as retrovirus, lentivirus or adenovirus and infecting the cells to be introduced.
  • a viral vector such as retrovirus, lentivirus or adenovirus
  • a non-viral vector such as a bacterial vector or an episomal vector
  • introducing into a cell to be introduced a transfection method, an electroporation method, a liposome method, a calcium phosphate coprecipitation method, a DEAE dextran method or a microinjection method It can be introduced by incorporating it.
  • the gene of the present invention into any genomic DNA site of a cell.
  • the gene can be freely introduced by using the technique or the transposon method.
  • the gene of the present invention can be expressed by introducing it into a cell using an artificial chromosome vector or the like.
  • each gene is under the control of an independent promoter. Can be inserted into the same vector or separate vectors. Further, each gene can be linked via an intervening sequence to form one expression cassette using a single promoter.
  • intervening sequence examples include, but are not limited to, an internal ribosomal entry site (IRES) sequence and a 2A peptide sequence (Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther., 2005, 5: 627: -638).
  • 2A peptide is a peptide sequence of about 20 amino acid residues derived from virus, and when multiple genes are linked by 2A peptide, the ribosome skip mechanism does not link the 2A peptide C-terminal glycine and proline during the translation process. , Each polypeptide is divided and expressed.
  • the modified TCR can be synthesized on the cell surface by synthesizing the modified TCR from the above-mentioned polynucleotide by a protein synthesis system and incorporating it into the cell.
  • the method of expressing is mentioned.
  • a method for introducing a protein into a target cell for example, a method using a protein introduction reagent, a method using a protein introduction domain (PTD) fusion protein, an electroporation method, a microinjection method, or Shimono K, et al., The methods described in Protein Sci. 18(10):2160-71, 2009. can be mentioned.
  • cells into which the modified TCR is introduced include pluripotent stem cells, hematopoietic stem/progenitor cells, T cells in which the endogenous TCR ⁇ gene and the endogenous TCR ⁇ gene are knocked down or knocked out, and the like.
  • the pluripotent stem cell is a stem cell having pluripotency capable of differentiating into many cells existing in the living body, and also having proliferative ability, and at least the T cell used in the present invention Any cell that is differentiated/induced is included.
  • the pluripotent stem cells are preferably of mammalian origin, more preferably of human origin.
  • the term “origin” means the origin of acquisition, and for example, a mammal-derived pluripotent stem cell means a pluripotent stem cell obtained from a mammal.
  • the pluripotent stem cells are not particularly limited, and examples thereof include embryonic stem (ES) cells, cloned embryo-derived embryonic stem (ntES) cells obtained by nuclear transfer, sperm stem cells (GS cells), embryonic germ cells. (EG cells), induced pluripotent stem (iPS) cells, cultured fibroblasts or cord blood-derived pluripotent stem cells, or bone marrow stem cell-derived pluripotent stem cells (Muse cells), and the like.
  • the preferred pluripotent stem cells are iPS cells, more preferably human iPS cells, from the viewpoint that they can be obtained without destroying the embryo, egg, etc. in the production process.
  • the pluripotent stem cell of the present invention is preferably a pluripotent stem cell that does not have an endogenous TCR ⁇ gene and an endogenous TCR ⁇ gene, more preferably a non-T cell-derived pluripotent stem cell or an endogenous TCR ⁇ gene and It is a pluripotent stem cell derived from a T cell in which an endogenous TCR ⁇ gene is knocked down or knocked out. Examples thereof include T cell-derived induced pluripotent stem cells (T-iPS cells) in which the endogenous TCR ⁇ gene and the endogenous TCR ⁇ gene are knocked down or knocked out.
  • T-iPS cells T cell-derived induced pluripotent stem cells
  • the method for producing iPS cells is known in the art, and can be produced by introducing a reprogramming factor into any somatic cell.
  • the reprogramming factor include Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Examples thereof include genes or gene products such as Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glis1. These reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • Examples of combinations of the reprogramming factors include WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, and WO No. 2009/057831, International Publication No. 2009/075119, International Publication No. 2009/079007, International Publication No. 2009/091659, International Publication No. 2009/101084, International Publication No. 2009/101407, International Publication No. 2009 /102983, International Publication No. 2009/114949, International Publication No. 2009/117439, International Publication No. 2009/126250, International Publication No. 2009/126251, International Publication No. 2009/126655, International Publication No. 2009/157593. No., International Publication No.
  • the somatic cells used to produce iPS cells are not particularly limited, and include, for example, fetal (pup) somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, mature healthy or diseased somatic cells, primary culture Examples include cells, passage cells, established cells, and the like.
  • somatic cells examples include (1) tissue stem cells (eg, somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells or dental pulp stem cells, (2) tissue progenitor cells such as hematopoietic progenitor cells, or ( 3) Blood cells (eg, peripheral blood cells, cord blood cells, etc.), myeloid cells, lymphocytes, epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (eg, skin cells), hair cells, hepatocytes, gastric mucosal cells , Differentiated cells such as enterocytes, spleen cells, pancreatic cells (eg, exocrine pancreatic cells), brain cells, lung cells, renal cells, adipocytes, and the like.
  • somatic cells somatic cells other than T cells (non-T cells) are preferable, but T cells may be used.
  • the T cell as the somatic cell is not particularly limited, but a T cell expressing CD3 and expressing at least one molecule of CD4 and CD8 is preferable.
  • T cells include helper T cells, cytotoxic T cells, regulatory T cells, naive T cells, stem cell memory T cells (TSCM), central memory T cells (TCM), effector memory T cells, or Examples include terminal effector T cells.
  • helper T cells cytotoxic T cells, regulatory T cells, naive T cells, stem cell memory T cells (TSCM), central memory T cells (TCM), effector memory T cells, or Examples include terminal effector T cells.
  • Helper T cells are CD4 positive cells, and are classified into Th1 cells, Th2 cells, Th17 cells, etc. according to the cytokines that are expressed (for example, described in J. Allergy Clin. Immunol., 135(3): 626-635, 2012. ).
  • Th1 cells include cells expressing IFN- ⁇ , IL-2, TNF- ⁇ and the like.
  • Th2 cells include cells expressing IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 and the like.
  • Th17 cells include cells expressing IL-17, IL-6 and the like.
  • Cytotoxic T cells are CD8-positive cells and, like helper T cells, are classified into Tc1 cells, Tc2 cells, etc. by the cytokines that are further expressed.
  • Tc1 cells include cells expressing IFN- ⁇ , IL-2, TNF- ⁇ and the like.
  • Tc2 cells include cells expressing IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 and the like.
  • regulatory T cells include CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) cells.
  • naive T cells examples include CD4(+)CD45RA(+)CD62L(+)CCR7(+) cells, CD8(+)CD45RA(+)CD62L(+)CCR7(+) cells, and CD4(+)CCR7( Preferred examples include +)CD45RA(+)CD95( ⁇ )CD45RO( ⁇ ) cells and CD8(+)CCR7(+)CD45RA(+)CD95( ⁇ )CD45RO( ⁇ ) cells.
  • stem cell memory T cells examples include CD4(+)CD45RA(+)CD62L(+)CCR7(+)CD95(+) cells, CD8(+)CD45RA(+)CD62L(+)CCR7(+)CD95(+) ) Cells, CD4(+)CCR7(+)CD45RA(+)CD95(+)CD45RO(+) cells or CD8(+)CCR7(+)CD45RA(+)CD95(+)CD45RO(+) cells and the like.
  • Central memory T cells include, for example, CD4(+)CD45RA(-)CD62L(+)CCR7(+)CD95(+) cells, CD8(+)CD45RA(-)CD62L(+)CCR7(+)CD95(+) ) Cells, CD4(+)CCR7(+)CD45RA(-)CD45RO(+) cells or CD8(+)CCR7(+)CD45RA(-)CD45RO(+) cells.
  • effector memory T cells include CD4(+)CCR7( ⁇ )CD45RA( ⁇ )CD45RO(+) cells and CD8(+)CCR7( ⁇ )CD45RA( ⁇ )CD45RO(+) cells.
  • terminal effector T cells include CD4(+)CD45RA(+)CD62L( ⁇ ) cells and CD8(+)CD45RA(+)CD62L( ⁇ ) cells.
  • the T cell as the somatic cell is preferably an undifferentiated T cell.
  • undifferentiated T cells include naive T cells, stem cell memory T cells, or central memory T cells in descending order of undifferentiation.
  • naive T cells or stem cell memory T cells are particularly preferable from the viewpoint of maintaining the undifferentiated state of the cells and improving the proliferative property or the biological sustainability.
  • the T cells as somatic cells are preferably T cells for immune cell therapy.
  • a method of determining whether or not T cells maintain an undifferentiated state a method of determining by detecting expression of an undifferentiated marker and/or non-detection of expression of a differentiated marker, and other various markers (gene or protein ) And the method of observing the morphological characteristics of cells.
  • CCR7 is used as an undifferentiated marker of peripheral blood (for example, described in Nature Reviews Immunology, 18: 363-373, 2018).
  • T cells When T cells are used as the somatic cells, T cells obtained by knocking down or knocking out the endogenous TCR ⁇ gene and the endogenous TCR ⁇ gene are preferable.
  • the endogenous TCR ⁇ gene and the endogenous TCR ⁇ gene are the TCR ⁇ gene and TCR ⁇ gene of the T cell targeted for knockdown or knockout, the TCR ⁇ gene and the TCR ⁇ gene derived from the T cell targeted for knockdown or knockout, and the target of knockdown or knockout target. It means a TCR ⁇ gene and a TCR ⁇ gene derived from a T cell of the same species as the T cell. Knocking down a gene means reducing the transcription level or inhibiting the translation of a specific gene. Knocking out a gene means disrupting the nucleotide sequence of a specific gene to inhibit gene expression.
  • a small interfering RNA (siRNA) for the gene is introduced into cells to suppress gene expression.
  • a known method such as a method (described in Non-Patent Document 1) can be used.
  • a gene editing technique such as TALEN or CRISPR/Cas9 is used to generate a frameshift in the gene region,
  • a known method such as a method of destroying the coding sequence of (Non-patent document 2) can be used.
  • the origin of collecting somatic cells is not particularly limited, but is preferably a mammal, more preferably a human.
  • the somatic cells that are the source of iPS cells are transfused from the viewpoint of easily matching the type of human leukocyte antigen (HLA) with the transfused patient. It is preferably isolated from the subject.
  • HLA human leukocyte antigen
  • Existing cell lines may be used as iPS cells.
  • 253G1 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0002), 201B7 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0063), 409B2 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0076), 454E2 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0077), HiPS-. RIKEN-1A strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0003), HiPS-RIKEN-2A strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0009), HiPS-RIKEN-12A strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0029) or Nips-B2 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0223) ) And the like.
  • Examples of cells into which the modified TCR of the present invention is introduced include hematopoietic stem/progenitor cells.
  • Hematopoietic stem/progenitor cells can be collected from bone marrow, cord blood, mobilized peripheral blood, or the like. These origins are derived from the patients themselves or healthy individuals such as related donors or unrelated donors.
  • examples of cells into which the modified TCR of the present invention is introduced also include T cells in which the endogenous TCR ⁇ gene and the endogenous TCR ⁇ gene are knocked down or knocked out.
  • T cell endogenous TCR ⁇ gene and endogenous TCR ⁇ gene, gene knockdown and gene knockout, and a method for producing a T cell in which the endogenous TCR ⁇ gene and the endogenous TCR ⁇ gene are knocked down or knocked down, respectively, Each is similar to the above.
  • the cell into which the modified TCR of the present invention is introduced may be a cell into which a chimeric antigen receptor (CAR) has been previously introduced.
  • CAR means a fusion protein containing an extracellular domain that binds to an antigen and an intracellular domain derived from a polypeptide different from the extracellular domain.
  • the CAR include, for example, an antigen recognition site of an antibody against a specific antigen [eg, light chain (L chain) of variable region and heavy chain (H chain) of variable region], for example, T cell receptor such as CD3.
  • a fusion protein bound to the intracellular domain of a costimulatory molecule such as CD28 or 4-1BB (for example, described in Japanese Patent Publication No. 2015-509716).
  • the CAR antigen recognition site can be selected according to the target antigen, and thereby T cells specific to the target antigen can be produced.
  • CAR can be obtained by cloning the antigen recognition site of the anti-CD19 antibody and binding it to the intracellular domain of the CD3 molecule (for example, Cancer Res., 66: 10995-11004). , Described in 2006).
  • the strength or duration of activation can be controlled by selecting the type or number of costimulatory molecules to be bound (for example, described in Mol.Ther., 17: 1453-1464, 2009). ..
  • CAR By introducing CAR, it becomes possible to give specificity to the antigen of interest to cells into which the modified TCR of the present invention has been introduced. Further, by introducing CAR, an antigen molecule can be directly recognized, and a high immune reaction can be caused even in a tumor in which the expression of HLA class I gene is reduced.
  • the method of differentiating T cells from the pluripotent stem cells into which the modified TCR has been introduced according to the present invention can be carried out using a known method. Specifically, for example, the method described in WO 2016/076415 as a method for producing CD8 positive cells and the method described in WO 2017/221975 as a method for producing CD4 CD8 both positive T cells can be mentioned.
  • the method for differentiating T cells from primary hematopoietic stem/progenitor cells can be performed by the same method as or different from the method for differentiating T cells from pluripotent stem cells described above (for example, Induction T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like1 in vitro; Blood, 105(4): 1431-1439, 2005).
  • Therapeutic agent pharmaceutical composition, method of immune cell therapy
  • the therapeutic agent may be used alone, or may be used in combination with other agents and therapeutic methods that can be used for treating cancer, autoimmune disease, heart disease and the like.
  • drugs and treatment methods include, but are not limited to, molecular targeted drugs, chemotherapy, radiofrequency ablation therapy, surgery therapy, hepatic artery (chemo)embolization therapy, radiation therapy, heavy particles. Examples include radiation therapy, radioisotope therapy, hepatic arterial infusion chemotherapy, peptide vaccine therapy or other immune cell therapy.
  • the therapeutic agent of the present invention and the above-mentioned other drug may be administered simultaneously or separately, and may be administered by the same administration route or different administration routes.
  • the above-mentioned therapeutic agents can also be in the form of a pharmaceutical composition or a composition for immune cell therapy, alone or in combination with other active ingredients.
  • Ingredients that can be contained in the pharmaceutical composition include, in addition to the therapeutic agent of the present invention and other active ingredients, pharmaceutically acceptable carriers, buffers, or stabilizers that are commonly used in the art depending on the administration form. Agents and the like can be mentioned.
  • Carriers include, but are not limited to, saline, phosphate buffered saline, glucose solution or buffered saline. Further, salts, sugars, sugar alcohols and the like can be used as additives.
  • the therapeutic agent and the pharmaceutical composition of the present invention are intended to be administered in liquid form due to the nature of the present invention, and therefore, it is necessary to have a form capable of maintaining the stability of the active ingredient.
  • the therapeutic agent and pharmaceutical composition of the present invention can be administered locally or systemically, and the administration form is not particularly limited, but can be, for example, intravenous administration. In addition, it may be administered by injection or infusion in or near the affected area.
  • the dose and frequency of administration of the therapeutic agent or pharmaceutical composition of the present invention vary depending on the weight, sex, age, severity of disease, etc. of the patient, and are not particularly limited.
  • a step of expressing the modified TCR of the present invention in non-T cell-derived pluripotent stem cells to differentiate into T cells and a step of administering the obtained cells to a subject
  • a method comprising: a T cell-derived pluripotent stem cell in which an endogenous TCR ⁇ gene and an endogenous TCR ⁇ gene are knocked down or knocked out, respectively, to express the modified TCR of the present invention and differentiate into T cells,
  • a method comprising a step of administering the obtained cells to a subject; a step of expressing the modified TCR of the present invention in hematopoietic stem/progenitor cells to differentiate into T cells, and a step of administering the obtained T cells to a subject
  • a method comprising: a step of expressing the modified TCR of the present invention in a T cell knockdown or knockout of an endogenous TCR ⁇ gene and an endogenous TCR ⁇ gene, and a step of administering the obtained cells to a subject
  • TCR ⁇ chain and full-length TCR ⁇ chain genes are TPS-derived iPS cell line TKT3v1-7 established by introducing Yamanaka factor into T cells (provided by The University of Tokyo, Nishimura et.al., Cell Stem Cell.12: 774- 786, 2013)).
  • the full length base sequence of TCR ⁇ and the full length base sequence of TCR ⁇ used in the examples are shown in SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 36, respectively.
  • the TCR expression vector is obtained by connecting the TCR ⁇ chain gene and the TCR ⁇ chain gene in this order with the SGSG linker-T2A peptide sequence to form a pEF1 ⁇ -IRES-hKO1 (humanized codon type Xavira orange) vector (hereinafter referred to as a mock vector). ), and was constructed by cloning using the In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech). This full-length TCR expression vector was designated as ba1 vector.
  • a modified TCR expression vector lacking the variable region deletion was constructed. Immediately below the sequences encoding the signal peptides of the TCR ⁇ and TCR ⁇ sequences, the constant region sequences of the respective TCR sequences were connected in-frame to form a variable region-deleted TCR gene. This was cloned into a mock vector in the same manner as the ba1 vector to construct an expression vector (ba2 vector).
  • a modified TCR expression vector was constructed in which the constant region sequences were deleted stepwise.
  • ABloop, Cstrand we extracted 4 regions of DE loop and F strand, and 4 regions of Helix3, CC loop, Helix4 F strand and FG loop in the TCR ⁇ constant region.
  • FIG. 1 A schematic diagram of the above full-length and modified TCR sequences is shown in FIG. 1, amino acid sequence information of ba1 (SEQ ID NO: 49) in FIG. 2, amino acid sequence information of ba2 to ba9 (SEQ ID NOs: 50 to 57) in FIG. 3, and ba10.
  • the amino acid sequence information (SEQ ID NOs:58 to 66) of to ba18 is shown in FIG.
  • the CD3 expression vector for expressing in 293T cells is known in the cDNA sequence information of each CD3 subunit (CD3E:NM_000733.3; CD3G:NM_0000723.2; CD3D:NM_000732.4; CD247(CD3Z):NM_19803.2).
  • CD3 subunit sequences and the EGFP gene were ligated with the GSG linker-T2A peptide sequence (CD3E-T2A-CD3G-T2A-CD3D-T2A-CD3Z-T2A-EGFP), and cloned into the pEF1 ⁇ expression vector.
  • 293T cells that stably express CD3.
  • 293T cells were obtained from DSMZ (#ACC635).
  • 293T medium Dulbecco's Modified Eagle Medium (Nacalai Tesque), 10% FBS (Access Cell Culture), 10 ⁇ g/mL gentamicin sulfate (Nacalai Tesque) was used] was used. Passaging was performed by washing 293T cells once with PBS (Nacalai Tesque) and then detaching the cells with Trypsin/EDTA solution (Sigma).
  • a CD3-EGFP stable expression strain was established by repeating purification of the EGFP-positive fraction with a cell sorter SH800 (SONY) and amplification culture.
  • PE/Cy7-labeled anti-human CD3E antibody (clone: UCHT1) (BioLegend) was added to the cells for staining CD3E, and APC-labeled anti-human CD3D antibody (clone: 7D6) (Invitrogen) was added to the cells for staining CD3D, It was allowed to stand at 4° C. for 30 minutes in the dark. After washing the cells with FACS buffer, DAPI (Dojindo Laboratories) was added to stain dead cells. FACS analysis was performed using Cell Sorter SH800.
  • CD3E The expression pattern of CD3E in the EGFP positive hKO1 positive DAPI negative fraction is shown in FIG. 5, and the numerical data by MFI (Mean Fluorescence Intensity) is shown in FIG. Expression of CD3E was observed in the full-length TCR(ba1)-introduced cells. Even when the modified TCRs of ba2 to ba18 were introduced, CD3E expression on the cell surface was confirmed, but the expression level was weak depending on the type of modified TCR.
  • Fig. 7 shows the CD3D expression pattern
  • Fig. 8 shows the numerical data obtained by MFI. Expression of CD3D was observed in the full-length TCR(ba1)-introduced cells. Similar to the case of CD3E, cell surface CD3D expression was confirmed by the introduction of modified TCRs of ba2 to ba18, but the level of expression was observed depending on the type of modified TCR.
  • ba2 ba3, ba7, ba8, ba9, ba10, ba17, and ba18 had the same ability to retain CD3E and CD3D as ba1.
  • Example 2 In Jurkat cells, the retention ability of the CD3 subunit molecule by the modified TCR was analyzed.
  • Jurkat cells (#ACC282) (DSMZ), which is a T cell line, was used.
  • DSMZ a T cell line
  • Jurkat medium containing RPMI1640 (Nacalai Tesque), 10% FBS (Access Cell Culture), 10 ⁇ g/mL gentamicin sulfate (Nacalai Tesque)] was used. Passaging was performed by collecting an appropriate amount of Jurkat cells and suspending them in fresh Jurkat medium.
  • Jurkat cells a cell line of the T cell lineage, have an endogenous TCR gene in which the TCR ⁇ and TCR ⁇ genes have already been rearranged. Therefore, when a modified TCR gene is introduced into a wild-type Jurkat cell (hereinafter, referred to as a WT strain), a chimeric TCR molecule may be formed between the modified TCR gene and the endogenous TCR gene, and the modified TCR has an ability to retain a CD3 subunit. It cannot be accurately determined. Therefore, in Jurkat cells, an attempt was made to double knock out the endogenous TCR ⁇ gene and TCR ⁇ gene by genome editing.
  • Target sequences (20 mers upstream of NGG) were extracted from publicly known literatures; TRAC: gagaatcaaaatcggtgaat (SEQ ID NO: 67) (described in Osborn et al., Mol Ther, 2017); TRBC (common to TRBC1 and TRBC2): aaaacacagcgctgcctgcgcctg. ) (Legut et. al., Blood.131(3): 311-322, described in 2018).
  • the Cas9/guide RNA complex for TRAC gene knockout was introduced into the WT strain. After amplification culture, cells were stained with APC-labeled anti-human TCR ⁇ / ⁇ antibody (clone: IP26) (BioLegend) and PE/Cy7-labeled anti-human CD3E antibody (clone: UCHT1) (BioLegend). The appearance of the CD3E negative fraction was observed. This fraction was purified by a cell sorter, amplified and cultured, and then introduced with Cas9/guide RNA complex for TRBC gene knockout.
  • APC-labeled anti-human TCR ⁇ / ⁇ antibody clone: IP26
  • PE/Cy7-labeled anti-human CD3E antibody clone: UCHT1
  • a vector expressing only the full-length TCR ⁇ chain was transiently introduced into the cells and stained with APC-labeled anti-human TCR ⁇ / ⁇ antibody and PE/Cy7-labeled anti-human CD3E antibody. The appearance of the CD3E negative fraction was observed. This fraction is considered to be a fraction in which TCR ⁇ gene knockout was successful, and was purified by a cell sorter and amplified and cultured.
  • a vector expressing only the full-length TCR ⁇ chain or a vector expressing only the full-length TCR ⁇ chain was transiently introduced into this cell and stained with an APC-labeled anti-human TCR ⁇ / ⁇ antibody and a PE/Cy7-labeled anti-human CD3E antibody.
  • a TCR-negative CD3E-negative fraction was present with a purity of about 99%.
  • dKO strain a double knockout strain of TCR ⁇ gene and TCR ⁇ gene was established (hereinafter referred to as dKO strain).
  • CD3E The expression pattern of CD3E in the DAPI negative fraction is shown in FIG. 9, and the numerical data by MFI is shown in FIG. Expression of CD3E was observed in the full-length TCR(ba1)-introduced cells. Even when the modified TCRs of ba2 to ba18 were introduced, CD3E expression on the cell surface was confirmed, but the expression level was weak depending on the type of modified TCR.
  • Fig. 11 shows the CD3D expression pattern
  • Fig. 12 shows the numerical data obtained by MFI. Expression of CD3D was observed in the full-length TCR(ba1)-introduced cells. Similar to the case of CD3E, cell surface CD3D expression was confirmed by the introduction of modified TCRs of ba2 to ba18, but the level of expression was observed depending on the type of modified TCR.
  • a modified TCR capable of efficiently retaining CD3 subunit expression on the cell surface can be screened by using a Jurkat cell dKO strain having the property as a T cell.
  • ba1 to ba18 it was found that the expression levels of CD3E and CD3D on the cell surface fluctuate depending on the deletion pattern of the TCR gene.
  • ba1 to ba18 it was found that, although not as high as ba1, for example, ba7, ba8, and ba9 also support cell surface expression of CD3E and CD3D at a relatively high level in Jurkat cells.
  • Example 3 The dKO strain of Jurkat cells was used to analyze the signal transduction ability by the modified TCR.
  • Example 1 In Example 1 and Example 2, it was shown that there is variation in the ability to support expression of the CD3 subunit on the cell surface for each designed modified TCR. Next, the signal transduction to T cells via the CD3 molecule displayed on the cell surface by the modified TCR was examined.
  • CD69 is a typical cell surface marker for activated T cells, whose expression is induced early in response to TCR/CD3 complex stimulation by T cells (Ziegler et al., Stem Cells. 12(5 ): 456-65, 1994). It is known that the expression of CD69 is also enhanced in Jurkat cells in response to stimulation by the CD3/CD28 antibody-bound beads (described in Tomkowicz et al., PLoS One, 2015). Therefore, if the CD3 expression is enhanced by CD3 stimulation when the CD3 molecule is retained on the cell surface by the modified TCR, it can be shown that the modified TCR is also functionally useful in T cell signaling.
  • the supernatant was removed, and the plate (hereinafter referred to as solidified OKT3 plate) washed twice with PBS was inoculated with the WT strain or dKO strain, and further cultured overnight at 37°C. Cells were harvested and washed with FACS buffer. Alexa Fluor 647-labeled anti-human CD69 antibody (clone: FN50) (BioLegend) was added to the cells, and the mixture was allowed to stand at 4° C. for 30 minutes in the dark. After washing the cells with FACS buffer, DAPI was added to stain dead cells. FACS analysis was carried out using a cell sorter SH800. Results are shown in FIG.
  • CD69 expression was observed in the full-length TCR(ba1)-introduced cells. Even when the modified TCRs of ba2 to ba18 were introduced, the CD69 expression on the cell surface was confirmed, but the level of expression was observed depending on the type of modified TCR.
  • the modified TCR not only acts to retain the CD3 molecule on the cell membrane surface but also transmits the TCR/CD3 complex signal into the cell by stimulating the CD3 molecule presented on the cell surface with an agonist antibody or the like. It became clear that there is also an effect.
  • Example 5 293T cells forcibly expressing CD3 were used to evaluate the cell surface localization of the CD3 protein by the modified TCR ⁇ and the modified TCR ⁇ .
  • the 293T cells that constitutively expressed the CD3 subunit had higher sensitivity than the Jurkat cells that knocked out the endogenous TCR. Therefore, in Example 5, analysis was carried out using 293T cells forcibly expressing CD3.
  • the partial sequences on the N-terminal side of the amino acid sequences of the extracellular regions of the modified TCR ⁇ and modified TCR ⁇ proteins are shown in FIGS. 16 and 17, respectively.
  • the amino acid sequences of the modified TCR ⁇ and the fragment are shown in Tables 2 and 8, and the amino acid sequences of the modified TCR ⁇ and the fragment are shown in Tables 3 and 9, respectively.
  • the amino acid sequences of TCR ⁇ and TCR ⁇ of ba2 to ba18 are selected from the modified TCR ⁇ and its fragments and the modified TCR ⁇ and its fragments shown in Tables 2 and 8 and Tables 3 and 9, respectively. Correspondence between the amino acid sequences of the modified TCR ⁇ and the fragments and the modified TCR ⁇ and the fragments shown in Tables 2 and 8 and Tables 3 and 9 and the amino acid sequences of TCR ⁇ and TCR ⁇ in ba2 to ba18 are shown in Table 4. . .
  • a plasmid vector expressing the designed modified TCR ⁇ and modified TCR ⁇ was constructed.
  • Kpn1 was added to each 5'end of ⁇ CR and ⁇ CR
  • Xho1 was added to each 3'end for amplification by PCR.
  • the amplified DNA was cloned by cleaving pcDNA3.1(+) Mammalian Expression vector (Thermo Fisher Scientific) with Kpn1 and Xho1.
  • ⁇ CR and ⁇ CR as templates, ⁇ 1-10 and ⁇ 1-12 were prepared by inverse PCR. Table 5 shows the primers used for inverse PCR.
  • the base sequences of the DNA encoding the modified TCR ⁇ are shown in Tables 6, 10 and 11, and the base sequences of the DNA encoding the modified TCR ⁇ are shown in Tables 7, 12 and 13, respectively.
  • the transfection marker pEF1 ⁇ -IRES-hKO1 was co-transfected into a CD3-EGFP stable expression strain using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Has been elected.
  • the empty pcDNA3.1(+) vector co-transfected with pEF1 ⁇ -IRES-hKO1 was used as control.
  • the cells collected after 2 days were washed with FACS buffer [containing PBS (Nacalai Tesque), 2% FBS (Access Cell Culture), 1 mM EDTA (Invitrogen)].
  • the modified TCR consisting of ⁇ 3 and each modified TCR ⁇ showed a CD3 recruiting activity of 1.12 to 6.63%.
  • the modified TCR consisting of ⁇ 4 and each modified TCR ⁇ showed a CD3 recruiting activity of 1.02 to 8.97%.
  • the modified TCR consisting of ⁇ 5 and each modified TCR ⁇ showed a CD3 recruiting activity of 0.99-8.97%.
  • the modified TCR consisting of ⁇ 6 and each modified TCR ⁇ showed 0.94-10.1% CD3 recruiting activity.
  • the modified TCR consisting of ⁇ 7 and each modified TCR ⁇ showed a CD3 recruiting activity of 3.58-30.1%. Among them, the combination with ⁇ 9-10 showed a sufficiently high CD3 recruiting activity of 20% or more.
  • the modified TCR consisting of ⁇ 8 and each modified TCR ⁇ showed a CD3 recruiting activity of 1.81-18.1%.
  • the modified TCR consisting of ⁇ 9 and each modified TCR ⁇ showed a CD3 recruiting activity of 5.28-69.2%. In particular, when combined with ⁇ 8-10, a sufficiently high CD3 recruiting activity of 20% or more was exhibited.
  • the modified TCR consisting of ⁇ 10 and each modified TCR ⁇ showed a CD3 recruiting activity of 9.23-85.1%. Among them, the combination with ⁇ 3-10 showed a sufficiently high CD3 recruiting activity of 20% or more.
  • the modified TCR consisting of ⁇ 11 and each modified TCR ⁇ showed a CD3 recruiting activity of 12.3-81.7%.
  • the combination with ⁇ 3-10 showed a sufficiently high CD3 recruiting activity of 20% or more.
  • the modified TCR consisting of ⁇ 12 and each modified TCR ⁇ showed CD3 recruiting activity of 11.5-80.6%.
  • the combination with ⁇ 3-10 showed a sufficiently high CD3 recruiting activity of 20% or more.
  • Retrovirus vectors of modified TCRs ba1, ba2, ba4 and ba9 were constructed. The insert was excised using EcoRI and NotI upstream of the IRES of the ba1, vector ba2, ba4 and ba9 vectors (pEF1 ⁇ -IRES-hKO1) constructed in Example 1, and pMY-IRES cleaved with EcoRI and NotI. -EGFP (hereinafter referred to as pMY-IG. Cell Biolabs, Inc) was subcloned.
  • ba1-pMY-IG, ba2-pMY-IG, ba4-pMY-IG, ba9-pMY-IG, and Empty-pMY-IG were used together with VSV-G vector (Takara Bio) in GP2-293.
  • the packaging cells (Takara Bio) were transfected with Lipofectamine 2000. Two days later, the cell supernatant containing the retrovirus was collected, and a concentrated retrovirus was prepared using Retro-X Concentrator (Takara Bio).
  • Example 7 The ability of the modified TCRs ba1 and ba2 to induce T cells from iPS cells was verified.
  • HPCs hematopoietic progenitor cells
  • iPS cell lines FF-WJs524, FF-WJs527) that have been confirmed to be cord blood-derived and not T-cell derived. did.
  • StemFit AK02N medium (Ajinomo) was used for feeder-free iPS cells.
  • the iPS cells were detached from the culture surface coated with iMatrix-511 by diluting [1 ⁇ TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific) by 1/2 with PBS, and 0.5 mol/l-EDTA solution (pH 8, Nacalai tesque) was added. Then, the cells were peeled off using a final concentration of 0.5 ⁇ TrypLE Select, 0.75 mM EDTA], and subcultured in a medium in which 10 ⁇ M Y-27632 was added to StemFit AK02N (37° C., 5% CO 2 ). The next day, the medium was replaced with StemFit AK02N. This operation was repeated once a week to maintain iPS cells.
  • HPCs were prepared by inducing differentiation of iPS cells by the Embryoid Body formation method.
  • the feeder-free iPS cells were detached with 0.5 ⁇ TrypLE Select, 0.75 mM EDTA, and then seeded at 2 ⁇ 3 ⁇ 10 5 cells/well in a 6-well plate (CORNING) subjected to ultra-low adhesion treatment.
  • StemPro34 (Thermo Fisher Scientific) medium (EB medium) was added with 50 ng/ml BMP-4 (Miltenyi Biotec), 50 ng/ml VEGF-165A (Wako), 50 ng/ml bFGF (Wako%) and cultured at 1 (5% a). O 2 ).
  • the cells thawed the previous day were seeded at 2-4 ⁇ 10 4 cells/well in a 48-well plate coated with Retronectin (100 ⁇ g/ml, Takara Bio). Then, a modified TCRba1, ba2 or empty retrovirus was added, and 50 ng/ml VEGF-165A, 50 ng/ml bFGF, 50 ng/ml SCF, 30 ng/ml TPO (Wako), 10 ng/ml FLT3L (Wako) were added. It was cultured in EB medium (Day-1).
  • the cells were re-dispersed on 48 well plates coated with DLL4 (5 ⁇ g/ml, R&D systems) and Retronectin (5 ⁇ g/ml, Takara Bio), 50 ng/ml SCF (Wako), 50 ng/ml IL-7 ( Wako), 50 ng/ml Flt3L (Wako), 100 ng/ml TPO (Wako), 30 ⁇ M SDF-1 ⁇ (Wako), 15 ⁇ M SB203580 (Tocris Bioscience), 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol (Wako15, Wako/50 ⁇ m).
  • the cells were cultured in alpha-MEM medium supplemented with FCS and 1% PSG (Day 0).
  • a plate coated with new DLL4 and Retronin was prepared and cells were scattered. The medium was replaced every 2 to 3 days. It culture
  • FIG. 19(A) The results of FF-WJs524 are shown in FIG. 19(A) as a representative example of the expression analysis results of CD3 and CD45.
  • FIG. 19(A) expression of CD3 was not observed in the Empty-introduced cells, whereas expression of CD3 was observed in the ba1 and ba2-introduced cells (ba1:99.8%, ba2:50). .4%). Expression of the CD45 leukocyte marker was observed in all of Empty, ba1 and ba2.
  • CD8 ⁇ (+)CD8 ⁇ (+) was induced into mature T cells.
  • cells containing the above CD3(+)CD45(+) T cells were seeded at 1 to 10 ⁇ 10 4 cells/well in a 48 well plate, and 500 ng/ml Anti-CD3 antibody OKT3 (eBioscience), 10 nM Dexamethasone (Dextate R). , Fuji Pharma), 10 ng/ml IL-7 (Wako), 50 ⁇ g/ml PAA, 15% FCS and 1% PSG were added to culture in alpha-MEM medium (Day 0).
  • the medium was replaced with 10 ng/ml IL-7 (Wako), 50 ⁇ g/ml PAA, 15% FCS and 1% PSG, and the cells were cultured (Day 3). After 7 days, the cells were counted by the trypan blue staining method (Day 10).
  • the Empty control was 0.38 times and 0.165 times (results of FF-WJs524 and FF-WJs527, respectively. The same applies to the following), whereas ba1 introduced cells. The values were 5.13 times and 2.21 times, and ba2 was 1.55 times and 4.25 times.
  • FIG. 19(B) The results of FF-WJs524 are shown in FIG. 19(B) as a representative example of the results of CD8 ⁇ and CD8 ⁇ expression analysis. Both ba1 and ba2 introduced cells expressed CD8 ⁇ and CD8 ⁇ (Ba1:100%, Ba2:99.5%).
  • ba2 which is a modified TCR consisting of TCR ⁇ /TCR ⁇ having no variable domain is also useful for inducing mature T cells from totipotent stem cells.
  • the modified TCR since the mature T cells could be induced by introducing ba1 and ba2 by the CD3 antibody OKT3, the modified TCR not only has the effect of retaining the CD3 molecule on the cell membrane surface, but also the CD3 molecule presented on the cell surface. It was shown that there is also an action of transmitting a TCR/CD3 complex signal into cells by stimulating with an agonist antibody or the like.
  • Example 8 The T cell inducing ability was evaluated using the modified TCR ba4 which is a part of the TCR ⁇ constant region domain and ba9 which is a modified TCR which is a part of the TCR ⁇ constant region domain. After gene transfection of ba4 and ba9 into HPCs of iPS cell line FF-WJs524, differentiation induction and analysis were performed by the same method as in Example 7. The results of culturing on DLL4 and Retronectin for 21 days are shown in FIG. 20(A).
  • a modified TCR lacking a part of the constant region domain is also useful for inducing differentiation of pluripotent stem cells or totipotent stem cells into mature T cells.
  • ba4 showed the lowest CD3 positive rate in the reanalysis result of Example 1 (Example 4), and showed the lowest level of CD3 positive rate in additional Example 2.
  • the modified TCR not only has the effect of retaining the CD3 molecule on the cell membrane surface, but also stimulates the CD3 molecule presented on the cell surface with an agonist antibody or the like to induce the TCR/CD3 complex signal into the cell. It became clear that it also has a transmitting effect.
  • TCR locus rearrangement occurs at an appropriate timing of the differentiation stage, and thereby TCR/CD3 formed It is considered important to stimulate the complex in vitro to promote proliferation and survival.
  • pluripotent stem cells in which the TCR gene locus is not rearranged are not expected to efficiently produce functional TCRs during differentiation, which causes a significant decrease in T cell production efficiency.
  • the antigenic specificity of the resulting TCR molecule is random, so that not only homogeneity as a cell preparation but also unpredictable alloreaction after transplantation into a patient may occur. There remains a problem in safety.
  • the modified TCR according to the present invention can retain the CD3 subunit in the cell membrane. Therefore, in the T cell differentiation from pluripotent stem cells, if the modified TCR is expressed in the original pluripotent stem cells or the progenitor cells in the process of differentiation, the signals necessary for T cell maturation and proliferation, etc. can be modified. Stimulation via the TCR/CD3 complex enables free transmission at any timing, and as a result, induction of differentiation into T cells is promoted. Similarly, it is possible to appropriately expand T cells by stimulating the modified TCR/CD3 complex even after differentiation into T cells.
  • the modified TCR according to the present invention since the modified TCR according to the present invention has lost the antigen recognition ability, it is considered that the possibility of causing an alloreaction after transplantation of a cell preparation is extremely low. Therefore, by using the modified TCR according to the present invention, it is possible to efficiently induce the differentiation of homogeneous T cells from pluripotent stem cells.
  • the size of the gene encoding the modified TCR according to the present invention is more compact than that of the full-length TCR gene, gene transfer via an expression vector or viral vector, an episomal vector or a transposon vector, or a genome editing technique is used. It is considered that it can be applied to any gene transfer format such as gene insertion into a desired genomic region, modification of the TCR locus itself, and further gene loading into an artificial chromosome vector.

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Abstract

本発明は、抗原応答性を惹起することなく、且つＣＤ３サブユニットを細胞膜に保持させ、機能させることが出来る、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供することを目的とする。本発明は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む改変ＴＣＲであって、第１のポリペプチドは、ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲαの可変領域を含まないポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲβの可変領域を含まないポリペプチドである、改変ＴＣＲに関する発明である。

Description

改変ＴＣＲ及びその製造方法
　本発明は、改変ＴＣＲ及びその製造方法に関する発明である。
　Ｔ細胞は造血幹細胞に由来する免疫細胞の一つである。Ｔ細胞は、細胞表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖（ＴＣＲα）及びβ鎖（ＴＣＲβ）を発現し、そのＴＣＲα及びＴＣＲβはヘテロダイマーを形成している。ＴＣＲα及びＴＣＲβは、それぞれ配列多様性のある可変領域及び定常領域からなり、ＴＣＲα／ＴＣＲβヘテロダイマーの可変領域により形成された抗原認識部位により標的細胞上のＭａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＨＣ）－ペプチド複合体を特異的に認識する。また、ＴＣＲα／ＴＣＲβヘテロダイマーの抗原認識部位は、標的細胞が自己又は非自己であるかも認識し、生体内における非自己認識応答（アロ反応）にも関与すると考えられている。
　また、ＴＣＲα／ＴＣＲβヘテロダイマーはＣＤ３サブユニット（ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ及びＣＤ３ζ）と複合体を形成する。ＴＣＲα／ＴＣＲβヘテロダイマー自体は、抗原を認識し、結合することに特化しており、それ自身にシグナル伝達能は無い。代わりに、ＴＣＲを介した抗原認識が引き金となって集合した様々なアダプター分子、補助レセプター又は酵素分子によってＣＤ３サブユニットの細胞内領域がリン酸化し、活性化することにより、更に下流へと抗原刺激のシグナルが伝達される。このＴＣＲ／ＣＤ３複合体シグナルは、胸腺でのＴ細胞分化過程において未成熟Ｔ細胞が受ける正の選択又は負の選択における生存シグナル又は排除シグナルとして機能するだけでなく、胸腺での成熟後、末梢に移行したＴ細胞においては活性化シグナル又は増殖シグナルとして機能する。
　Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞に大別され、細胞傷害性Ｔ細胞が有する抗腫瘍効果を利用したＴ細胞治療法が開発されている。自家Ｔ細胞を用いたＴ細胞治療法として、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴ細胞上に発現させ、腫瘍や感染症等を治療するＣＡＲ－Ｔ療法が実用化されており、既に細胞医薬品として欧米で承認を受けている。今後は、Ｔ細胞採取に伴う患者の負担を軽減すると共に、Ｔ細胞の品質を向上させ、製造コストを抑えるべく、他家Ｔ細胞を用いた治療方法が求められている。
　しかしながら、他家Ｔ細胞治療法の場合には、他家Ｔ細胞の持つ多様なＴＣＲα／ＴＣＲβヘテロダイマーが強力なアロ反応を引き起こすことで生じる組織傷害、すなわち移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症が問題となる。現在、この課題を解決すべく、ＴＣＲ遺伝子をノックダウン又はノックアウトするといった処理によってアロ反応を低減若しくは消失させる試みが為されている（非特許文献１及び２）。
　また近年では、ドナーに依存することなく、均質で高機能なＴ細胞製剤を作製する手段として、他家Ｔ細胞より樹立した人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞からＴ細胞を分化誘導する方法が提案されている（非特許文献３、４及び５）。
　更には、より汎用的に他家ｉＰＳ細胞由来のＴ細胞製剤を提供するために、ヒトのＭＨＣである、Ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）ハプロタイプをホモで有するドナーの血液細胞（非Ｔ細胞）から樹立したｉＰＳ細胞バンクを活用する方法も提唱されている（非特許文献６）。
　非Ｔ細胞由来ｉＰＳ細胞から効率的にＴ細胞を分化誘導するには、分化途上で機能的なＴＣＲ遺伝子座を再編成させ、それにより形成されたＴＣＲ／ＣＤ３複合体をｉｎ　ｖｉｔｒｏで刺激して増殖及び生存を促進することが重要であると考えられている（非特許文献７）。
Okamoto S. et al, Cancer Res. 69: 9003-9011, 2009 Qasim W. et al, Sci Transl Med. 9, 2017 Nishimura T. et al, Cell Stem Cell. 12: 114-226, 2013 Vizcardo R. et al, Cell Stem Cell. 12: 31-36, 2013 Themeli M. et al, Nat. Biotechnol. 31: 928-33, 2013 金子新、最新医学 69: 724-733, 2014 Minagawa et al., Cell Stem Cell. 23: 1-9, 2018
　しかしながら、ＴＣＲ遺伝子をノックダウン又はノックアウトすると、ＣＤ３サブユニットが細胞膜表面に保持されなくなるため、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した増殖シグナル及び生存シグナルが入らなくなる。このことは、例えばｅｘ　ｖｉｖｏにおいてドナー由来のＴ細胞製剤を増幅させるために使用されるＣＤ３アゴニスト抗体等が作用しなくなることを意味し、効率的な他家Ｔ細胞を含む細胞医薬品の生産及び製剤化における課題となる。
　前記課題において、所望のＴ細胞を適切な時期にＣＤ３シグナルにより増殖及び生存させるためには、ＴＣＲα／ＴＣＲβ複合体が細胞表面上に発現していることが望ましく、加えて他家Ｔ細胞による非自己認識応答を起こさないためには、該ＴＣＲα／ＴＣＲβ複合体が非自己ＨＬＡ－ペプチド複合体等の非自己抗原を認識しないことが望ましい。
　従って、本発明は、抗原応答性を惹起することなく、且つＣＤ３サブユニットを細胞膜に保持させ、ＣＤ３シグナル伝達を介在することが出来る、改変ＴＣＲを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、ＴＣＲα及びＴＣＲβのそれぞれについて、可変領域及び定常領域を段階的に欠失させたＴＣＲα欠失体及びＴＣＲβ欠失体を設計し、それらの欠失体の組み合わせを、ＣＤ３サブユニットを恒常発現させた２９３Ｔ細胞及び内在性ＴＣＲをノックアウトしたＪｕｒｋａｔ細胞に導入することで、細胞膜表面上にＣＤ３サブユニット発現が認められるかを検証した。
　その結果、ＴＣＲαの可変領域を含まず、且つＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片を含むポリペプチドと、ＴＣＲβの可変領域を含まず、且つＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片を含むポリペプチドとを含む改変ＴＣＲは、ＣＤ３サブユニットを細胞膜に保持することが出来、また該改変ＴＣＲによって細胞表面に提示されたＣＤ３分子を刺激することによりＴ細胞の活性化を誘導することが明らかとなった。すなわち、内在性のＴＣＲ発現を抑制又は消失させたＴ細胞に該改変ＴＣＲを発現させることで、抗原応答性を惹起することなく、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した刺激応答が可能であることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の発明を提供する。
１．第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
　第１のポリペプチドは、ヒトＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）の定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲαの可変領域を含まないポリペプチドであり、
　第２のポリペプチドは、ヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲβ）の定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲβの可変領域を含まないポリペプチドである、改変ＴＣＲ。
２．前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が以下（Ａ１）～（Ａ３）のいずれか１に記載のポリペプチドである前記１に記載の改変ＴＣＲ。
（Ａ１）配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ａ２）配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ａ３）配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
３．前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が以下（Ｂ１）～（Ｂ３）のいずれか１に記載のポリペプチドである前記１又は２に記載の改変ＴＣＲ。
（Ｂ１）配列番号１２～２４のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ２）配列番号１２～２４のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ３）配列番号１２～２４のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
４．前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片及び前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、以下の（ａ１）～（ａ８）のいずれか１に記載のポリペプチドである前記１～３のいずれか１に記載の改変ＴＣＲ。
（ａ１）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ａ２）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ａ３）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～３及び５～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～３及び５～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～３及び５～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ａ４）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１９で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１０又は１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１０又は１１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１０又は１１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ａ５）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ａ６）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ａ７）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ａ８）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
５．前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片及び前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、以下の（ｂ１）～（ｂ７）のいずれか１に記載のポリペプチドである前記１～４のいずれか１に記載の改変ＴＣＲ。
（ｂ１）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｂ２）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｂ３）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～３及び１０のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～３及び１０のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～３及び１０のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｂ４）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｂ５）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｂ６）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４及び７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４及び７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４及び７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｂ７）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
６．前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片及び前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、以下の（ｃ１）～（ｃ５）のいずれか１に記載のポリペプチドである前記１～５のいずれか１に記載の改変ＴＣＲ。
（ｃ１）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｃ２）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｃ３）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｃ４）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｃ５）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
７．前記第１のポリペプチドが、前記ヒトＴＣＲαの定常領域における、ＡＢ　ｌｏｏｐ、Ｃ　ｓｔｒａｎｄ、ＤＥ　ｌｏｏｐ及びＦ　ｓｔｒａｎｄから選ばれる少なくとも１を含む、前記１～６のいずれか１に記載の改変ＴＣＲ。
８．前記第２のポリペプチドが、前記ヒトＴＣＲβの定常領域におけるＨｅｌｉｘ３、ＣＣ　ｌｏｏｐ、Ｈｅｌｉｘ４　Ｆ　ｓｔｒａｎｄ及びＦＧ　ｌｏｏｐから選ばれる少なくとも１を含む、前記１～７のいずれか１に記載の改変ＴＣＲ。
９．前記第１のポリペプチドが前記ヒトＴＣＲαの定常領域における細胞外領域の少なくとも一部、細胞膜貫通領域及び細胞内領域を含み、且つ前記第２のポリペプチドが前記ヒトＴＣＲβの定常領域における細胞外領域の少なくとも一部、細胞膜貫通領域及び細胞内領域を含む、前記１～８のいずれか１に記載の改変ＴＣＲ。
１０．第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む改変ＴＣＲであって、
　第１のポリペプチドは、ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲαの可変領域を含まないポリペプチドであり、
　第２のポリペプチドは、ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲβの可変領域を含まないポリペプチドであり、
　前記改変ＴＣＲを導入された多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞におけるＣＤ３陽性細胞の割合が１％以上である、改変ＴＣＲ。
１１．前記改変ＴＣＲを導入された多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞におけるＣＤ３陽性細胞の割合が、前記改変ＴＣＲを導入されていない対応する細胞におけるＣＤ３陽性細胞の割合に対して２倍以上である、前記１～１０のいずれか１に記載の改変ＴＣＲ。
１２．前記改変ＴＣＲを導入された多能性幹細胞又は造血幹・前駆細胞が、全長ＴＣＲを導入された対応する細胞と比較して、同等以上のＴ細胞分化能を示す、前記１～１１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲ。
１３．前記改変ＴＣＲを導入された非Ｔ細胞由来の多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞のアロ反応性が、全長ＴＣＲを導入された対応する細胞と比較して、低減されている、前記１～１２のいずれか１に記載の改変ＴＣＲ。
１４．細胞膜上にＣＤ３サブユニットを保持可能である、前記１～１３のいずれか１に記載の改変ＴＣＲ。
１５．ＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを細胞内に伝達可能である、前記１４に記載の改変ＴＣＲ。
１６．前記細胞膜上に保持された前記ＣＤ３サブユニットを介してＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを細胞内に伝達可能である、前記１４又は１５に記載の改変ＴＣＲ。
１７．前記細胞膜上に保持された前記ＣＤ３サブユニットを介してＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを細胞内に伝達することにより、Ｔ細胞を活性化する、前記１６に記載の改変ＴＣＲ。
１８．多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に発現させるための前記１～１７のいずれか１に記載の改変ＴＣＲ。
１９．多能性幹細胞又は造血幹・前駆細胞に発現させて、Ｔ細胞に分化させるための前記１８に記載の改変ＴＣＲ。
２０．多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に発現させて、前記改変ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した刺激応答が可能なＴ細胞を作製するための前記１８に記載の改変ＴＣＲ。
２１．前記多能性幹細胞が、非Ｔ細胞由来の多能性幹細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞由来の多能性幹細胞である、前記１～２０のいずれか１に記載の改変ＴＣＲ。
２２．前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲを発現している細胞。
２３．前記改変ＴＣＲを発現している細胞がＴ細胞である、前記２２に記載の細胞。
２４．前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲを発現している細胞を含有する医薬組成物。
２５．改変ＴＣＲを発現する細胞の製造方法であって、該改変ＴＣＲは第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む製造方法。
（ａ）細胞を調製する工程；
（ｂ）ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲαの可変領域を含まない第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及びヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲβの可変領域を含まない第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、をそれぞれ調製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で調製した発現ベクターを用いて、工程（ａ）で調製した細胞を形質転換する工程。
２６．改変ＴＣＲを発現する細胞の製造方法であって、該改変ＴＣＲは第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、以下の工程（ａ’）～（ｃ’）を含む製造方法。
（ａ’）細胞を調製する工程；
（ｂ’）ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲαの可変領域を含まない第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲβの可変領域を含まない第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを調製する工程；
（ｃ’）工程（ｂ’）で調製した発現ベクターを用いて、工程（ａ’）で調製した細胞を形質転換する工程。
２７．工程（ａ）又は（ａ’）における細胞が、多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又はＴＣＲα及びＴＣＲβ遺伝子をノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞である、前記２５又は２６に記載の製造方法。
２８．前記改変ＴＣＲを発現する細胞が免疫細胞治療用Ｔ細胞である、前記２５～２７のいずれか１に記載の製造方法。
２９．Ｔ細胞を製造する方法であって、多能性幹細胞又は造血幹・前駆細胞に前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲを発現させて、Ｔ細胞に分化させる工程を含む、Ｔ細胞を製造する方法。
３０．Ｔ細胞を製造する方法であって、多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲを発現させる工程を含み、得られるＴ細胞が前記改変ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した刺激応答が可能なＴ細胞である、Ｔ細胞を製造する方法。
３１．多能性幹細胞に、前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲを発現させて、Ｔ細胞に分化させる工程と、得られたＴ細胞を対象に投与する工程とを含む、免疫細胞治療の方法。
３２．内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に、前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲを発現させて、得られたＴ細胞を対象に投与する工程を含む、免疫細胞治療の方法。
３３．造血幹・前駆細胞に、前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲを発現させて、Ｔ細胞に分化させる工程と、得られたＴ細胞を対象に投与する工程を含む、免疫細胞治療の方法。
３４．免疫細胞治療に使用するための、前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲ。
３５．免疫細胞治療に使用するための、前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲを多能性幹細胞に発現させ、Ｔ細胞に分化させた、多能性幹細胞Ｔ細胞。
３６．免疫細胞治療に使用するための、前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲを内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に発現させた、Ｔ細胞。
３７．免疫細胞治療に使用するための、前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲを造血幹・前駆細胞に発現させ、Ｔ細胞に分化させた、造血幹・前駆細胞由来のＴ細胞。
３８．免疫細胞治療用の組成物を製造するための、前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲの使用。
３９．免疫細胞治療用の組成物を製造するための、前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲを多能性幹細胞に発現させ、Ｔ細胞に分化させた、多能性幹細胞由来のＴ細胞の使用。
４０．免疫細胞治療用の組成物を製造するための、前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲを内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に発現させた、Ｔ細胞の使用。
４１．免疫細胞治療用の組成物を製造するための、前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲを造血幹・前駆細胞に発現させ、Ｔ細胞に分化させた、Ｔ細胞の使用。
４２．前記１～２１のいずれか１に記載の改変ＴＣＲをコードする核酸。
４３．前記４２に記載の核酸を含むベクター。
４４．前記４２に記載の核酸又は前記４３に記載のベクターを用いる、医薬組成物の製造方法。
４５．前記４２に記載の核酸又は前記４３に記載のベクターを含む医薬組成物。
　本発明の改変ＴＣＲは第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドがヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片を含み、第２のポリペプチドがヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片を含むことによりＣＤ３サブユニットを細胞膜に保持し得る。また、本発明の改変ＴＣＲは、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドがそれぞれＴＣＲα及びＴＣＲβの可変領域を含まないことにより、抗原認識能が消失している。本発明の改変ＴＣＲを、内在性のＴＣＲ発現を抑制又は消失させたＴ細胞に発現させることで、抗原応答性を惹起することなく、改変ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した刺激応答が可能なＴ細胞を作製出来る。
図１は、全長及び改変ＴＣＲ配列の模式図である。 図２は、ｂａ１のアミノ酸配列情報を示す図である。 図３は、ｂａ２～ｂａ９のアミノ酸配列情報を示す図である。 図４は、ｂａ１０～ｂａ１８のアミノ酸配列情報を示す図である。 図５は、ＣＤ３が安定発現した２９３Ｔ細胞に各種ｂａベクター及びｍｏｃｋベクターを導入したときのＣＤ３Ｅの発現をフローサイトメトリーにより解析した図である。 図６は、ＣＤ３が安定発現した２９３Ｔ細胞に各種ｂａベクター及びｍｏｃｋベクターを導入したときのＣＤ３Ｅの発現レベルをＭＦＩにより数値化した図である。 図７は、ＣＤ３が安定発現した２９３Ｔ細胞に各種ｂａベクター及びｍｏｃｋベクターを導入したときのＣＤ３Ｄの発現をフローサイトメトリーにより解析した図である。 図８は、ＣＤ３が安定発現した２９３Ｔ細胞に各種ｂａベクター及びｍｏｃｋベクターを導入したときのＣＤ３Ｄの発現レベルをＭＦＩにより数値化した図である。 図９は、内在性ＴＣＲをノックアウトしたＪｕｒｋａｔ細胞に各種ｂａベクター及びｍｏｃｋベクターを導入したときのＣＤ３Ｅの発現をフローサイトメトリーにより解析した図である。 図１０は、内在性ＴＣＲをノックアウトしたＪｕｒｋａｔ細胞に各種ｂａベクター及びｍｏｃｋベクターを導入したときのＣＤ３Ｅの発現レベルをＭＦＩにより数値化した図である。 図１１は、内在性ＴＣＲをノックアウトしたＪｕｒｋａｔ細胞に各種ｂａベクター及びｍｏｃｋベクターを導入したときのＣＤ３Ｄの発現をフローサイトメトリーにより解析した図である。 図１２は、内在性ＴＣＲをノックアウトしたＪｕｒｋａｔ細胞に各種ｂａベクター及びｍｏｃｋベクターを導入したときのＣＤ３Ｄの発現レベルをＭＦＩにより数値化した図である。 図１３は、内在性ＴＣＲのノックアウトによるＯＫＴ３抗体刺激に対する応答性の変化を、活性化Ｔ細胞マーカーであるＣＤ６９の発現上昇を指標にフローサイトメトリーにより解析した図である。 図１４は、内在性ＴＣＲをノックアウトしたＪｕｒｋａｔ細胞に各種ｂａベクター及びｍｏｃｋベクターを導入し、ＯＫＴ３抗体刺激をした時のＣＤ６９の発現をフローサイトメトリーにより解析した図である。 図１５は、内在性ＴＣＲをノックアウトしたＪｕｒｋａｔ細胞に各種ｂａベクター及びｍｏｃｋベクターを導入し、ＯＫＴ３抗体刺激をした時のＣＤ６９の発現レベルをＭＦＩにより数値化した図である。 図１６は、改変ＴＣＲαの細胞外領域のアミノ酸配列のうちＮ末側の一部配列及び該アミノ酸配列における構造の模式図を示す。Ｎ末に＊を付したアミノ酸配列は公知（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ＩＤ：３ＱＪＦ；https://www.rcsb.org/pdb/explore/remediatedSequence.do?structureId=3QJFに記載）のヒトＴＣＲαアミノ酸配列の一部を示す。 図１７は、改変ＴＣＲβの細胞外領域のアミノ酸配列のうちＮ末側の一部配列及び該アミノ酸配列における構造の模式図を示す。Ｎ末に＊を付したアミノ酸配列は公知（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ＩＤ：３ＱＪＦ；https://www.rcsb.org/pdb/explore/remediatedSequence.do?structureId=3QJFに記載）のヒトＴＣＲβアミノ酸配列の一部を示す。 図１８は、各種の改変ＴＣＲ発現ベクターを導入した細胞におけるＣＤ３陽性率の平均値（ｎ＝３）を示す。 図１９（Ａ）は、ＦＦ－ＷＪｓ５２４のＣＤ３及びＣＤ４５の発現解析の結果を示す図である。図１９（Ｂ）は、ＦＦ－ＷＪｓ５２４のＣＤ８β及びＣＤ８αの発現解析の結果を示す図である。 図２０（Ａ）は、ＤＬＬ４とＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ上で２１日間培養した結果を示す図である。図２０（Ｂ）は、ＣＤ８β及びＣＤ８αの発現解析結果を示す図である。
［改変ＴＣＲ］
　本発明の改変ＴＣＲは、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む改変ＴＣＲであって、第１のポリペプチドは、ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲαの可変領域を含まないポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲβの可変領域を含まないポリペプチドである、ことを特徴とする。
　ＴＣＲα遺伝子座は、ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ（Ｖ領域）、ｊｏｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ（Ｊ領域）及びｃｏｎｓｔａｎｔ　ｒｅｇｉｏｎ（Ｃ領域）により構成されている。一方で、ＴＣＲβ遺伝子座は、Ｖ領域、ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｒｅｇｉｏｎ（Ｄ領域）、Ｊ領域及びＣ領域により構成されている。ＴＣＲの遺伝子座はＴ細胞の分化過程においてゲノム上で再編成を受ける。
　ＴＣＲαにおいてはＶ領域及びＪ領域が、ＴＣＲβにおいてはＶ領域、Ｄ領域及びＪ領域が、それぞれ様々な組み合わせで連結されるのに加え、各連結部分においてランダムな塩基の挿入又は欠失が起こることによって、機能的かつ非常に多様性に富んだ可変部エキソンが形成される。
　更に遺伝子転写の過程で、ＲＮＡスプライシングにより可変部エキソンがＣ領域エキソンと連結されることで、完全長のＴＣＲ遺伝子のｍＲＮＡが形成される。続いて、タンパク質として翻訳されたＴＣＲα鎖ポリペプチド及びＴＣＲβ鎖ポリペプチドはヘテロダイマーを形成して、ＴＣＲは細胞膜表面に提示される。
　ＴＣＲα鎖ポリペプチド及びＴＣＲβ鎖ポリペプチドは、それぞれ細胞外領域である可変領域及び定常領域、細胞膜貫通領域並びに細胞内領域を有する。以下、本発明における定常領域とは、遺伝子においてはＣ領域配列を、ポリペプチドにおいては可変部ドメインを除く配列（非可変部領域）を、それぞれ示す。
　ＴＣＲαの定常領域遺伝子は１種類（ＴＲＡＣ遺伝子）であるのに対して、ＴＣＲβの定常領域の遺伝子は２種類（ＴＲＢＣ１遺伝子及びＴＲＢＣ２遺伝子）あることが知られている。ＴＣＲβ遺伝子座の再編成の際には、ＴＲＢＣ１又はＴＲＢＣ２のどちらかの遺伝子が選択される。ＩＭＧＴ（ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）より抽出した配列情報に基づくと、ＴＲＢＣ１遺伝子とＴＲＢＣ２遺伝子とはアミノ酸配列として５アミノ酸しか違わず、またＴＲＢＣ２のＣ末端がＴＲＢＣ１に比べて２アミノ酸しか多くなく、両者の配列相同性は高く、機能的な相違は知られていない。
　ヒトＴＣＲαの定常領域のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列等が挙げられる。
　また、ヒトＴＣＲαの定常領域断片のアミノ酸配列としては、ヒトＴＣＲαの定常領域の部分配列であればいかなるアミノ酸配列でもよいが、例えば、配列番号２～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列等が挙げられる。
　本発明におけるヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片の一態様としては、以下（Ａ１）～（Ａ３）のいずれか１に記載のポリペプチドが挙げられる。
（Ａ１）配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ａ２）配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ａ３）配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　ヒトＴＣＲβの定常領域のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１２で示されるアミノ酸配列等が挙げられる。
　本発明におけるヒトＴＣＲβの定常領域断片のアミノ酸配列としては、ヒトＴＣＲβの定常領域の部分配列であればいかなるアミノ酸配列でもよいが、例えば、配列番号１３～２４のいずれか１で示されるアミノ酸配列等が挙げられる。
　ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片の一態様としては、以下（Ｂ１）～（Ｂ３）のいずれか１に記載のポリペプチドが挙げられる。
（Ｂ１）配列番号１２～２４のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ２）配列番号１２～２４のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ３）配列番号１２～２４のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　本発明の改変ＴＣＲには、本発明の効果を奏する限り、上記態様におけるヒトＴＣＲαの定常領域若しくは該定常領域断片、又はヒトＴＣＲβの定常領域若しくは該定常領域断片のアミノ酸配列の長さを変化させてもよく、ヒトＴＣＲに由来するＳｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＳＮＰｓ）による変異が導入されたものも包含される。また、本発明の改変ＴＣＲには、本発明の効果を奏する限り、ＴＣＲの機能向上を目的とする公知の改変（例えば、Michael S. Kuhns et al., Immunity. 26: 357-369, 2007、Aswin Natarajan et al., Cell Reports.14: 2833-2845, 2016又はSchamel W. Wolfgang et al. Immunological Reviews. 291: 8-25, 2019に記載の改変）が更になされたものも包含される。
　目的とするアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. 1987-1997、Nucleic Acids Research. 10, 6487, 1982、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79, 6409, 1982、Gene, 34: 315, 1985、Nucleic Acids Research. 13: 4431 ,1985又はProc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488 ,1985に記載）等を用いて、例えば配列番号１～２４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡに、部位特異的変異を導入することが出来る。
　アミノ酸配列の１から数個のアミノ酸の置換、挿入、欠失及び／又は付加における１から数個の範囲は特に限定されないが、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数１００個を一単位とすれば、該一単位あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。
　アミノ酸の欠失とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、アミノ酸の置換は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、アミノ酸の挿入又は付加とは配列前後又は配列中に新たなアミノ酸残基が挿入又は付加するように付け加えられていることを意味する。
　１から数個のアミノ酸の置換の具体的な態様としては、例えば１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合等を挙げることが出来る。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。
　具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン又はメチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン又はシステイン等が挙げられる。陽電荷を持つ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン又はリジン等が挙げられる。また、負電荷を持つ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸又はグルタミン酸等が挙げられる。
　対象となるタンパク質が有するアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列としては、対象となるタンパク質が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、対象となるタンパク質が有するアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは６５％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明の改変ＴＣＲの一態様としては、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片及び前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、以下の（ａ１）～（ａ８）のいずれか１に記載のポリペプチドである改変ＴＣＲが好ましい。
（ａ１）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ａ２）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ａ３）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～３及び５～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～３及び５～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～３及び５～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ａ４）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１９で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１０又は１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１０又は１１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１０又は１１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ａ５）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ａ６）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ａ７）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ａ８）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
　更に、前記（ａ１）～（ａ８）のポリペプチドである改変ＴＣＲの中でも、以下の（ｂ１）～（ｂ７）のいずれか１に記載のポリペプチドである改変ＴＣＲが好ましい。
（ｂ１）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｂ２）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｂ３）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～３及び１０のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～３及び１０のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～３及び１０のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｂ４）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｂ５）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｂ６）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４及び７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４及び７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４及び７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｂ７）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
　更に、前記（ｂ１）～（ｂ７）のポリペプチドである改変ＴＣＲの中でも、以下の（ｃ１）～（ｃ５）のいずれか１に記載のポリペプチドである改変ＴＣＲが好ましい。
（ｃ１）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｃ２）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｃ３）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｃ４）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
（ｃ５）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
　本発明の改変ＴＣＲは、第１のポリペプチドが、ヒトＴＣＲαの定常領域における、ＡＢ　ｌｏｏｐ、Ｃ　ｓｔｒａｎｄ、ＤＥ　ｌｏｏｐ及びＦ　ｓｔｒａｎｄから選ばれる少なくとも１を含むことが好ましい。
　ヒトＴＣＲαの定常領域において、ＡＢ　ｌｏｏｐ、Ｃ　ｓｔｒａｎｄ、ＤＥ　ｌｏｏｐ及びＦ　ｓｔｒａｎｄはこの順で含まれることが好ましいが、順序が異なって含まれていてもよい。　
　ＡＢ　ｌｏｏｐは、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１４～２０番目のアミノ酸配列からなる構造である。Ｃ　ｓｔｒａｎｄは、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２９～４０番目のアミノ酸配列からなる構造である。ＤＥ　ｌｏｏｐは、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列の５２～５７番目のアミノ酸配列からなる構造である。Ｆ　ｓｔｒａｎｄは、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列の６７～８１番目のアミノ酸配列からなる構造である。
　本発明の改変ＴＣＲは、第２のポリペプチドが、ヒトＴＣＲβの定常領域におけるＨｅｌｉｘ３、ＣＣ　ｌｏｏｐ、Ｈｅｌｉｘ４　Ｆ　ｓｔｒａｎｄ及びＦＧ　ｌｏｏｐから選ばれる少なくとも１を含むことが好ましい。
　ヒトＴＣＲβの定常領域において、Ｈｅｌｉｘ３、ＣＣ　ｌｏｏｐ、Ｈｅｌｉｘ４　Ｆ　ｓｔｒａｎｄ及びＦＧ　ｌｏｏｐはこの順で含まれることが好ましいが、順序が異なって含まれていてもよい。
　Ｈｅｌｉｘ３は、例えば、配列番号１２で示されるアミノ酸配列の２０～２６番目のアミノ酸配列からなる構造である。ＣＣ　ｌｏｏｐは、例えば、配列番号１２で示されるアミノ酸配列の４９～５４番目のアミノ酸配列からなる構造である。Ｈｅｌｉｘ４　Ｆ　Ｓｔｒａｎｄは、例えば、配列番号１２で示されるアミノ酸配列の８８～９３番目のアミノ酸配列からなる構造である。ＦＧ　ｌｏｏｐは、例えば、配列番号１２で示されるアミノ酸配列の１０５～１１３番目のアミノ酸配列からなる構造である。
　本発明の改変ＴＣＲは、第１のポリペプチドがヒトＴＣＲαの定常領域における細胞外領域の少なくとも一部、細胞膜貫通領域及び細胞内領域を含み、且つ第２のポリペプチドがヒトＴＣＲβの定常領域における細胞外領域の少なくとも一部、細胞膜貫通領域及び細胞内領域を含むことが好ましい。
　ヒトＴＣＲαの定常領域における細胞外領域は、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１～１１７番目のアミノ酸配列からなる領域である。ヒトＴＣＲαの定常領域における細胞膜貫通領域は、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１１８～１３９番目のアミノ酸配列からなる領域である。ヒトＴＣＲαの定常領域における細胞外領域の少なくとも一部を含む態様としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１～１１７番目のアミノ酸配列からなる領域のうち少なくとも８２～１１７番目のアミノ酸を含む態様が好ましく挙げられる。ヒトＴＣＲαの定常領域における細胞内領域は、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１４０～１４１番目のアミノ酸配列からなる領域である。
　ヒトＴＣＲβの定常領域における細胞外領域は、例えば、配列番号１２で示されるアミノ酸配列の１～１４６番目のアミノ酸配列からなる領域である。ヒトＴＣＲβの定常領域における細胞膜貫通領域は、例えば、配列番号１２で示されるアミノ酸配列の１４７～１７２番目のアミノ酸配列からなる領域である。ヒトＴＣＲβの定常領域における細胞外領域の少なくとも一部を含む態様としては、例えば、配列番号１２で示されるアミノ酸配列の１～１４６番目のアミノ酸配列からなる領域のうち少なくとも１１４～１４６番目のアミノ酸を含む態様が好ましく挙げられる。ヒトＴＣＲβの定常領域における細胞内領域は、例えば、配列番号１２で示されるアミノ酸配列の１７３～１７９番目のアミノ酸配列からなる領域である。
　また、例えばＰｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ等の、公知のデータベースに開示されているヒトＴＣＲαの定常領域若しくは該定常領域断片のアミノ酸配列又はヒトＴＣＲβの定常領域若しくは該定常領域断片のアミノ酸配列（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ＩＤ：３ＱＪＦ；https://www.rcsb.org/pdb/explore/remediatedSequence.do?structureId=3QJFに記載）からなるポリペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。
　野生型のＴＣＲα又は野生型のＴＣＲβの定常領域は、それぞれのアミノ酸配列に含まれるシステイン残基がジスルフィド結合を形成し、２本の鎖間を結合する。本発明の改変ＴＣＲも同様に、定常領域又は該定常領域断片のアミノ酸配列にジスルフィド結合を形成するように、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの各々に追加のシステイン残基を有していてもよい。また、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、鎖内又は／及び鎖間に追加のジスルフィド結合が形成されるように更に改変されていてもよく、これにより改変ＴＣＲの安定性を向上することが出来る。
　上述の構造を有することにより、本発明の改変ＴＣＲは、哺乳動物の３つの異なる鎖（γ、δ及びε）を有するＣＤ３及びＣＤ３ζ鎖と会合し、細胞膜上にＣＤ３サブユニットを保持出来る。ＣＤ３サブユニットはＴＣＲから細胞内へのシグナル伝達において重要な役割を果たしており、本発明の改変ＴＣＲは細胞膜上に保持されたＣＤ３サブユニットを介してＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを細胞内に伝達し、Ｔ細胞を活性化する。
　本発明の改変ＴＣＲを導入された多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞におけるＣＤ３陽性細胞の割合は１％以上、３％以上、５％以上、１０％以上又は１５％以上であることが好ましく、より好ましくは２０％以上、更に好ましくは４０％以上、特に好ましくは６０％以上、とりわけ好ましくは７５％以上、最も好ましくは８０％以上である。前記ＣＤ３陽性細胞の割合が少なくとも１％以上であると、改変ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介して、十分な刺激応答が得られる。ＣＤ３陽性細胞の割合は、実施例において後述するように、フローサイトメトリーを用いてＣＤ３Ｄ陽性細胞又はＣＤ３Ｅ陽性細胞の割合を調べることにより評価出来る。
　改変ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介して、十分な刺激応答を得る観点から、本発明の改変ＴＣＲを導入された多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞におけるＣＤ３陽性細胞の割合は、対応する細胞におけるＣＤ３陽性細胞の割合に対して２倍以上であることが好ましく、より好ましくは５倍以上、更に好ましくは１０倍以上、特に好ましくは２０倍以上である。
　本発明の改変ＴＣＲを導入された多能性幹細胞又は造血幹・前駆細胞は、全長のＴＣＲ（野生型のＴＣＲ）を導入された対応する細胞と同等以上のＴ細胞分化能を示すことが好ましい。Ｔ細胞分化能は、後述するＴ細胞が未分化状態を維持しているか否かを判定する方法により評価出来る。
　ＴＣＲα／ＴＣＲβヘテロダイマーの可変領域により形成された抗原認識部位は、標的細胞が自己又は非自己であるかを認識すると考えられている。本発明の改変ＴＣＲは、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドに、それぞれＴＣＲα及びＴＣＲβの可変領域を含まず、抗原認識能が消失しており、アロ反応性が低減又は消失／欠失する。
　また、本発明の改変ＴＣＲはＮ末端にシグナルペプチドを含んでもよい。
　本発明の改変ＴＣＲは、多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に発現させる；多能性幹細胞又は造血幹・前駆細胞に発現させて、Ｔ細胞に分化させる；多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に発現させて、改変ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した刺激応答が可能なＴ細胞を作製する、等の用途に好ましく用いることが出来る。
［改変ＴＣＲを発現する細胞及びその製造方法］
　本発明において改変ＴＣＲを発現する細胞を製造するために、細胞に改変ＴＣＲを導入する方法としては特に制限はなく、公知の方法を適宜用いることが出来る。例えば、改変ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドの形態にて細胞に導入する方法又は改変ＴＣＲをタンパク質の形態にて細胞に導入する方法等が挙げられる。
　改変ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドの形態にて細胞に導入する製造方法の一態様としては、以下の工程（ａ）～（ｃ）、又は工程（ａ’）～（ｃ’）を含む方法が挙げられる。
（ａ）細胞を調製する工程；
（ｂ）ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲαの可変領域を含まない第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及びヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲβの可変領域を含まない第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、をそれぞれ調製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で調製した発現ベクターを用いて、工程（ａ）で調製した細胞を形質転換する工程。
（ａ’）細胞を調製する工程；
（ｂ’）ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲαの可変領域を含まない第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲβの可変領域を含まない第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを調製する工程；
（ｃ’）工程（ｂ’）で調製した発現ベクターを用いて、工程（ａ’）で調製した細胞を形質転換する工程。
　ポリヌクレオチドの種類は特に制限されず、遺伝子の導入方法に応じて選択することができ、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
　ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、以下（ｉ）～（ｖ）に記載のポリヌクレオチド等が挙げられる。
（ｉ）配列番号２５～３５のいずれか１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号２５～３５のいずれか１で示される塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号２５～３５のいずれか１で示される塩基配列又は該塩基配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｉｖ）配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、以下（ｖｉ）～（ｘ）に記載のポリヌクレオチド等が挙げられる。
（ｖｉ）配列番号３６～４８のいずれか１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｖｉｉ）配列番号３６～４８のいずれか１で示される塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｖｉｉｉ）配列番号３６～４８のいずれか１で示される塩基配列又は該配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｉｘ）配列番号１２～２４のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｘ）配列番号１２～２４のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、対象となる塩基配列を含むポリヌクレオチドをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法又はＤＮＡマイクロアレイ法等により得られるハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの塩基配列等が挙げられる。
　具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ配列、又は該ＤＮＡ配列を有するＰＣＲ産物若しくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルター若しくはスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション法（例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-1997又はDNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, 1995に記載）を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルター又はスライドガラスを洗浄することにより同定出来るＤＮＡの塩基配列等を挙げることが出来る。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、プローブとして使用する対象となる遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチドの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。例えば、対象となる塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。また、例えば、塩基配列における塩基数１００個を一単位とすれば、対象となる遺伝子の塩基配列において、該一単位あたり、１から数個、好ましくは１～４０個、好ましくは１～３５個、好ましくは１～３０個、好ましくは１～２５個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１５個、更に好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個、尚更に好ましくは１、２、３、４又は５個の塩基の置換、挿入、欠失及び／又は付加等を有する塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
　塩基の欠失とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、塩基の置換は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、塩基の挿入又は付加とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
　真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子の塩基配列に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子の塩基配列も該塩基配列に含有される。
　本発明において配列同一性とは、２つの配列間の同一性を意味し、２つの配列を互いに整列させ、比較した２つのヌクレオチド又はタンパク質配列において、正確に同一のヌクレオチド又は同一のアミノ酸が同一の位置に存在することを指す。従って、２つのタンパク質が９０％の同一性を示す場合には、これは、対応する位置にある前記タンパク質に含まれるすべてのアミノ酸残基のうち９０％が正確に同一であることを意味する。
　本発明における配列同一性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の配列同一性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ（例えば、J. Mol. Biol., 215, 403, 1990に記載）において、デフォルトのパラメータを用いて算出される数値等、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２（例えば、Nucleic Acids Res.,25, 3389, 1997、Genome Res., 7, 649, 1997又はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.htmlに記載）又はNeedleman-Wunsch algorithmを基にしたPairwise Sequence Alignment等において、デフォルトのパラメータを用いて算出される数値等が挙げられる。
　デフォルトのパラメータとしては、例えば、Ｇ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ　ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ　ｂｌａｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）が１５及び－Ｚ（ｆｉｎａｌ　Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５が挙げられる（例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/htmL/blastcgihelp.htmlに記載）。
　遺伝子の導入は、当分野において通常用いられる方法を適宜利用して行うことができ、該方法は特に限定されるものではない。例えば本発明の遺伝子をレトロウイルス、レンチウイルス又はアデノウイルス等のウイルスベクターに組み込んで、導入する細胞に感染させることで導入することが出来る。また、プラスミド、細菌ベクター又はエピソーマルベクター等の非ウイルスベクター等のベクターに組み込んで、導入する細胞にトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法又はマイクロインジェクション法等により組み込むことで導入することが出来る。
　また、本発明の遺伝子を細胞の任意のゲノムＤＮＡ部位に挿入することも可能であり、例えば、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）若しくはｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　ｓｈｏｒｔ　ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９等のゲノム編集技術又はトランスポゾン法等を使用して遺伝子を自在に導入することも出来る。更には、本発明の遺伝子を人工染色体ベクター等により細胞に導入することで発現させることも出来る。
　ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片をコードする遺伝子及びヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片をコードする遺伝子等の複数の遺伝子を導入する場合には、各遺伝子を独立したプロモーターの制御下に配置して、同一のベクター又はそれぞれ別個のベクターに挿入することが出来る。また、介在配列を介して各遺伝子を連結し、単一のプロモーターを用いる一つの発現カセットとすることも出来る。
　前記介在配列としては、限定されるものではないが、例えばＩｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）配列又は２Ａ　ｐｅｐｔｉｄｅ配列等が挙げられる（Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther., 2005, 5: 627-638に記載）。２Ａ　ｐｅｐｔｉｄｅは、ウイルス由来の２０アミノ酸残基前後のペプチド配列であり、複数の遺伝子を２Ａ　ｐｅｐｔｉｄｅで連結した場合、翻訳の過程においてｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｓｋｉｐ機構により２ＡペプチドＣ末端のグリシンとプロリンが連結されないことにより、各々のポリペプチドが分断されて発現する。
　改変ＴＣＲをタンパク質の形態にて細胞に導入する製造方法の一態様としては、上記のポリヌクレオチドからタンパク質合成系によって改変ＴＣＲを合成し、細胞に取り込ませることによっても、該細胞表面に改変ＴＣＲを発現させる方法が挙げられる。目的の細胞にタンパク質を導入する方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質を用いる方法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、又はShimono K, et al., Protein Sci. 18(10): 2160-71, 2009.に記載の方法等を挙げることが出来る。
［改変ＴＣＲを導入する細胞］
　改変ＴＣＲを導入する細胞としては、例えば、多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性ＴＣＲα遺伝子及び内在性ＴＣＲβ遺伝子をノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞等が挙げられる。
　本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せ持つ幹細胞であり、少なくとも本発明で使用されるＴ細胞に分化／誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞は哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
　本発明において由来とは取得の起源を意味しており、例えば、哺乳動物由来の多能性幹細胞とは、哺乳動物より取得された多能性幹細胞を意味する。
　多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞若しくは臍帯血由来の多能性幹細胞又は骨髄幹細胞由来の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）等が含まれる。本発明において、好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚又は卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点からｉＰＳ細胞であり、より好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。
　本発明の多能性幹細胞としては、好ましくは内在性ＴＣＲα遺伝子及び内在性ＴＣＲβ遺伝子を有さない多能性幹細胞であり、より好ましくは非Ｔ細胞由来の多能性幹細胞又は内在性ＴＣＲα遺伝子及び内在性ＴＣＲβ遺伝子をノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞由来の多能性幹細胞である。例えば、内在性ＴＣＲα遺伝子及び内在性ＴＣＲβ遺伝子をノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞由来の人工多能性幹細胞（Ｔ－ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。
　ｉＰＳ細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。初期化因子としては、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３又はＧｌｉｓ１等の遺伝子又は遺伝子産物が挙げられる。これらの初期化因子は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
　初期化因子の組み合わせとしては、国際公開第２００７／０６９６６６号、国際公開第２００８／１１８８２０号、国際公開第２００９／００７８５２号、国際公開第２００９／０３２１９４号、国際公開第２００９／０５８４１３号、国際公開第２００９／０５７８３１号、国際公開第２００９／０７５１１９号、国際公開第２００９／０７９００７号、国際公開第２００９／０９１６５９号、国際公開第２００９／１０１０８４号、国際公開第２００９／１０１４０７号、国際公開第２００９／１０２９８３号、国際公開第２００９／１１４９４９号、国際公開第２００９／１１７４３９号、国際公開第２００９／１２６２５０号、国際公開第２００９／１２６２５１号、国際公開第２００９／１２６６５５号、国際公開第２００９／１５７５９３号、国際公開第２０１０／００９０１５号、国際公開第２０１０／０３３９０６号、国際公開第２０１０／０３３９２０号、国際公開第２０１０／０４２８００号、国際公開第２０１０／０５０６２６号、国際公開第２０１０／０５６８３１号、国際公開第２０１０／０６８９５５号、国際公開第２０１０／０９８４１９号、国際公開第２０１０／１０２２６７号、国際公開第２０１０／１１１４０９号、国際公開第２０１０／１１１４２２号、国際公開第２０１０／１１５０５０号、国際公開第２０１０／１２４２９０号、国際公開第２０１０／１４７３９５号、国際公開第２０１０／１４７６１２号、Huangfu D, et al., Nat. Biotechnol., 26: 795-797, 2008、Shi Y, et al., Cell Stem Cell, 2: 525-528, 2008、Eminli S, et al., Stem Cells. 26: 2467-2474, 2008、Huangfu D, et al., Nat. Biotechnol. 26: 1269-1275, 2008、Shi Y, et al., Cell Stem Cell, 3, 568-574, 2008、Zhao Y, et al., Cell Stem Cell, 3: 475-479, 2008、Marson A, Cell Stem Cell, 3, 132-135, 2008、Feng B, et al., Nat. Cell Biol. 11:197-203, 2009、R.L. Judson et al., Nat. Biotechnol., 27: 459-461, 2009、Lyssiotis CA, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 106: 8912-8917, 2009、Kim JB, et al., Nature. 461:649-643, 2009、Ichida JK, et al., Cell Stem Cell. 5: 491-503, 2009、Heng JC, et al., Cell Stem Cell. 6:167-74, 2010、Han J, et al., Nature. 463: 1096-100, 2010、Mali P, et al., Stem Cells. 28: 713-720, 2010又はMaekawa M, et al., Nature. 474:225-9, 2011等に記載の組み合わせ等が挙げられる。
　ｉＰＳ細胞を製造するのに用いられる体細胞としては、特に制限されないが、例えば、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、成熟した健全な若しくは疾患性の体細胞、初代培養細胞、継代細胞又は株化細胞等が挙げられる。
　前記体細胞としては、例えば、（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞若しくは歯髄幹細胞等の組織幹細胞（例えば、体性幹細胞）、（２）造血前駆細胞等の組織前駆細胞、又は（３）血液細胞（例えば、末梢血細胞、臍帯血細胞等）、骨髄球、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（例えば、皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（例えば、膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞若しくは脂肪細胞等の分化した細胞等が挙げられる。前記体細胞としては、Ｔ細胞以外の体細胞（非Ｔ細胞）が好ましいが、Ｔ細胞を用いてもよい。
　前記体細胞としてのＴ細胞は、特に制限されないが、ＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８の少なくとも一方の分子を発現しているＴ細胞が好ましい。
　このようなＴ細胞としては、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞又はターミナルエフェクターＴ細胞等が挙げられる。
　ヘルパーＴ細胞はＣＤ４陽性細胞であり、更に発現するサイトカインによりＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞及びＴｈ１７細胞等に分類される（例えば、J Allergy Clin. Immunol., 135(3): 626-635, 2012に記載）。
　Ｔｈ１細胞としては、例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２又はＴＮＦ－α等を発現する細胞等が挙げられる。Ｔｈ２細胞としては、例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０又はＩＬ－１３等を発現する細胞等が挙げられる。Ｔｈ１７細胞としては、例えば、ＩＬ－１７又はＩＬ－６等を発現する細胞等が挙げられる。
　細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性細胞であり、ヘルパーＴ細胞同様に、更に発現するサイトカインによりＴｃ１細胞及びＴｃ２細胞等に分類される。
　Ｔｃ１細胞としては、例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２又はＴＮＦ－α等を発現する細胞等が挙げられる。Ｔｃ２細胞としては、例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０又はＩＬ－１３等を発現する細胞等が挙げられる。
　制御性Ｔ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）ＦｏｘＰ３（＋）細胞が好ましく挙げられる。
　ナイーブＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）細胞、ＣＤ８（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）細胞、ＣＤ４（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ９５（－）ＣＤ４５ＲＯ（－）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ９５（－）ＣＤ４５ＲＯ（－）細胞等が好ましく挙げられる。
　ステムセルメモリーＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ９５（＋）細胞、ＣＤ８（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ９５（＋）細胞、ＣＤ４（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ９５（＋）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ９５（＋）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞等が好ましく挙げられる。
　セントラルメモリーＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ９５（＋）細胞、ＣＤ８（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ９５（＋）細胞、ＣＤ４（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞等が好ましく挙げられる。
　エフェクターメモリーＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＣＲ７（－）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＣＲ７（－）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞等が好ましく挙げられる。
　ターミナルエフェクターＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（－）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（－）細胞等が好ましく挙げられる。
　前記体細胞としてのＴ細胞は、未分化Ｔ細胞であることが好ましい。未分化Ｔ細胞としては、例えば、未分化度の高い順に、ナイーブＴ細胞、ステムセルメモリーＴ細胞又はセントラルメモリーＴ細胞が挙げられる。これらの中でも、細胞の未分化状態を維持して増殖性又は生体持続性を向上する点から、ナイーブＴ細胞又はステムセルメモリーＴ細胞が特に好ましい。
　未分化性の高いＴ細胞は高い免疫細胞治療効果を示す。前記体細胞としてのＴ細胞は、免疫細胞治療用Ｔ細胞であることが好ましい。
　Ｔ細胞が未分化状態を維持しているか否かを判定する方法としては、未分化マーカーの発現の検出及び／若しくは分化マーカーの発現の不検出により判定する方法、その他の各種マーカー（遺伝子やタンパク質）の発現の検出により判定する方法又は細胞の形態学的特徴を観察する方法等が挙げられる。例えば、ＣＣＲ７は末梢血の未分化マーカーとして用いられている（例えば、Nature Reviews Immunology, 18: 363-373, 2018に記載）。
　前記体細胞としてＴ細胞を用いる場合には、内在性ＴＣＲα遺伝子及び内在性ＴＣＲβ遺伝子をノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞が好ましい。
　内在性ＴＣＲα遺伝子及び内在性ＴＣＲβ遺伝子とは、ノックダウン若しくはノックアウト対象のＴ細胞の有するＴＣＲα遺伝子及びＴＣＲβ遺伝子、ノックダウン若しくはノックアウト対象のＴ細胞由来のＴＣＲα遺伝子及びＴＣＲβ遺伝子、ノックダウン若しくはノックアウト対象のＴ細胞と同種のＴ細胞由来のＴＣＲα遺伝子及びＴＣＲβ遺伝子を意味する。遺伝子をノックダウンするとは、特定の遺伝子の転写量の減少又は翻訳を阻害することを意味する。遺伝子をノックアウトするとは、特定の遺伝子の塩基配列を破壊して、遺伝子発現を阻害することを意味する。
　本発明の内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックダウンしたＴ細胞の作製方法としては、当該遺伝子に対するｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞に導入して遺伝子発現を抑制する手法等（非特許文献１に記載）の公知の方法を用いることが出来る。内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞の作製方法としては、ＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のゲノム編集技術を用いて当該遺伝子領域にフレームシフトを生じさせ、遺伝子のコーディング配列を破壊する手法等（非特許文献２）の公知の方法を用いることが出来る。
　本発明において、体細胞を採取する由来は特に制限されないが、好ましくは哺乳動物である、より好ましくはヒトである。本発明のヒト由来のＴ細胞を輸血に使用する場合、輸血される患者とヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）の型を適合させ易いという観点から、ｉＰＳ細胞の元となる体細胞は、輸血される対象から単離されることが好ましい。
　ｉＰＳ細胞として既存の細胞株を用いてもよい。例えば、ヒトｉＰＳ細胞株として、２５３Ｇ１株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０００２）、２０１Ｂ７株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００６３）、４０９Ｂ２株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００７６）、４５４Ｅ２株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００７７）、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０００３）、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株（理研セルバンク　Ｎｏ．ＨＰＳ０００９）、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株（理研セルバンク　Ｎｏ．ＨＰＳ００２９）又はＮｉｐｓ－Ｂ２株（理研セルバンク　Ｎｏ．ＨＰＳ０２２３）等が挙げられる。
　本発明の改変ＴＣＲを導入する細胞としては、造血幹・前駆細胞が挙げられる。造血幹・前駆細胞は骨髄、臍帯血又は動員末梢血等から採取可能である。これらの由来は患者自身又は血縁ドナー若しくは非血縁ドナー等の健常人由来である。
　また、本発明の改変ＴＣＲを導入する細胞としては、内在性ＴＣＲα遺伝子及び内在性ＴＣＲβ遺伝子をノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞等も挙げられる。
　Ｔ細胞、内在性ＴＣＲα遺伝子及び内在性ＴＣＲβ遺伝子、遺伝子のノックダウン及び遺伝子のノックアウト、並びに内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックダウンしたＴ細胞の作製方法とは、それぞれ上述と同様である。
　本発明の改変ＴＣＲを導入する細胞としては、更に予めキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入された細胞であってもよい。ここで、ＣＡＲとは、抗原に結合する細胞外ドメイン及び前記細胞外ドメインとは異なるポリペプチドに由来する細胞内ドメインを含む融合タンパク質を意味する。ＣＡＲとしては、例えば、特定の抗原に対する抗体の抗原認識部位［例えば、可変領域の軽鎖（Ｌ鎖）及び可変領域の重鎖（Ｈ鎖）等］を、例えば、ＣＤ３等のＴ細胞受容体の細胞内ドメイン、及びＣＤ２８又は４－１ＢＢ等の共刺激分子の細胞内ドメインと結合させた融合タンパク質等が挙げられる（例えば、日本国特表２０１５－５０９７１６号公報に記載）。
　ＣＡＲの抗原認識部位は目的とする抗原に応じて選択でき、それにより目的の抗原に対して特異的なＴ細胞を作製することが可能である。例えば、ＣＤ１９を抗原とする場合、抗ＣＤ１９抗体の抗原認識部位をクローニングし、ＣＤ３分子の細胞内ドメインと結合させることにより、ＣＡＲとすることが出来る（例えば、Cancer Res., 66: 10995-11004, 2006に記載）。また、結合させる共刺激分子の種類又は数等を選択することにより、活性化の強さ又は持続時間等をコントロールすることが出来る（例えば、Mol Ther., 17: 1453-1464, 2009に記載）。
　ＣＡＲを導入することにより、本発明の改変ＴＣＲを導入した細胞に目的の抗原に対する特異性を付与することが可能となる。また、ＣＡＲを導入することにより、抗原分子を直接認識することができ、ＨＬＡクラスＩ遺伝子の発現が低下した腫瘍に対しても高い免疫反応を起こすことが可能である。
［改変ＴＣＲを導入した多能性幹細胞又は初代造血幹・前駆細胞からＴ細胞への分化］
　本発明における、改変ＴＣＲを導入した多能性幹細胞からＴ細胞を分化する方法は、公知の方法を用いて行うことが出来る。具体的には例えば、ＣＤ８陽性細胞の製造方法として国際公開第２０１６／０７６４１５号に記載の方法、ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞の製造方法として国際公開第２０１７／２２１９７５号に記載の方法が挙げられる。
　初代造血幹・前駆細胞からＴ細胞を分化する方法は、上述の多能性幹細胞からＴ細胞を分化する方法と同一又は類似の方法で行うことが出来る（例えば、Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro; Blood, 105(4): 1431-1439, 2005に記載）。
［治療剤、医薬組成物、免疫細胞治療の方法］
　本発明に係る改変ＴＣＲ、該改変ＴＣＲを発現する細胞、該改変ＴＣＲを構成する第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドをコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターはそれぞれ治療剤として用いることが出来る。該治療剤は、単独で使用してもよく、また、がん、自己免疫疾患又は心疾患等の治療に使用され得る他の薬剤及び治療方法と組み合わせて使用することが出来る。
　使用可能な他の薬剤及び治療方法としては、特に限定するものではないが、例えば、分子標的薬、化学療法、ラジオ波焼灼療法、手術療法、肝動脈(化学)塞栓療法、放射線療法、重粒子線療法、ラジオアイソトープ治療、肝動注化学療法、ペプチドワクチン療法又は他の免疫細胞療法等が挙げられる。本発明の治療剤と上記の他の薬剤とは、同時に投与しても、別個に投与してもよく、また同じ投与経路で投与しても、異なる投与経路で投与してもよい。
　上記の治療剤はまた、単独又は他の有効成分と組み合わせて、医薬組成物又は免疫細胞治療用の組成物の形態とすることも出来る。医薬組成物に含まれ得る成分としては、本発明の治療剤及び他の有効成分の他に、投与形態に応じて、当分野において通常配合される、製薬上許容される担体、緩衝剤又は安定化剤等が挙げられる。担体としては、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、グルコース液又は緩衝生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、塩類、糖類又は糖アルコール類等を添加剤として用いることも出来る。尚、本発明の治療剤及び医薬組成物は、本発明の性質上、液状で投与することが意図され、従って、有効成分の安定性を維持出来る形態とすることが必要である。
　本発明の治療剤及び医薬組成物は、局所投与又は全身投与することができ、また投与形態を特に限定するものではないが、例えば経静脈投与とすることが出来る。また、患部若しくは患部の近辺に注射又は注入により投与してもよい。本発明の治療剤又は医薬組成物の投与量及び投与頻度は、患者の体重、性別、年齢又は疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではない。
　本発明の免疫細胞治療の方法としては、非Ｔ細胞由来の多能性幹細胞に本発明の改変ＴＣＲを発現させて、Ｔ細胞に分化させる工程と、得られた細胞を対象に投与する工程とを含む方法；内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞由来の多能性幹細胞に、本発明の改変ＴＣＲを発現させて、Ｔ細胞に分化させる工程と、得られた細胞を対象に投与する工程を含む方法；造血幹・前駆細胞に、本発明の改変ＴＣＲを発現させて、Ｔ細胞に分化させる工程と、得られたＴ細胞を対象に投与する工程を含む方法；内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に、本発明の改変ＴＣＲを発現させる工程と、得られた細胞を対象に投与する工程を含む方法等が挙げられる。
　投与するＴ細胞は、得られたＴ細胞をそのまま投与してもよいし、上述の製剤化された医薬組成物の形態で投与してもよい。
　以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明の実施態様は本実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　２９３Ｔ細胞において、改変ＴＣＲによるＣＤ３サブユニット分子の保持能を解析した。
　まず、全長ＴＣＲ発現ベクターを構築した。全長ＴＣＲα鎖及び全長ＴＣＲβ鎖遺伝子は、Ｔ細胞に山中因子を導入して樹立されたＴ細胞由来ｉＰＳ細胞株ＴＫＴ３ｖ１－７（東京大学より供与、Nishimura et al., Cell Stem Cell.12: 774-786, 2013に記載）に由来するＴＣＲ遺伝子配列を使用した。実施例で用いたＴＣＲαの全長塩基配列を配列番号２５、ＴＣＲβの全長塩基配列を配列番号３６にそれぞれ示す。ＴｋＴ３ｖ１－７株より分化して得られたＴ細胞からＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　５’／３’Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、ＴＣＲα及びＴＣＲβ遺伝子の５’　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ及び３’　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡ産物のサンガーシーケンスにより、全長のｃＤＮＡ配列情報を得た。
　ＴＣＲ発現ベクターは、ＴＣＲβ鎖遺伝子及びＴＣＲα鎖遺伝子をこの順番でＳＧＳＧリンカー－Ｔ２Ａ　ｐｅｐｔｉｄｅ配列で連結したものを、ｐＥＦ１α－ＩＲＥＳ－ｈＫＯ１（ヒト化コドンタイプクサビラオレンジ）ベクター（以下、ｍｏｃｋベクターと表記）のＩＲＥＳの上流に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック）を用いてクローニングすることで構築した。この全長ＴＣＲ発現ベクターをｂａ１ベクターとした。
　次に、可変領域欠失を欠失した改変ＴＣＲ発現ベクターを構築した。ＴＣＲα及びＴＣＲβ配列のシグナルペプチドをコーディングする配列の直下に、それぞれのＴＣＲ配列の定常領域配列をｉｎ－ｆｒａｍｅで接続したものを可変領域欠失ＴＣＲ遺伝子とした。これをｂａ１ベクターと同様にｍｏｃｋベクターにクローニングし、発現ベクターを構築した（ｂａ２ベクター）。
　更に、ＴＣＲα及びＴＣＲβ配列の可変領域に加え、定常領域の配列を段階的に欠失した改変ＴＣＲ発現ベクターを構築した。公知文献（Kuhns et al., Immunity.26: 357-369, 2007; Natarajan et al., Cell Rep. 14: 2833-2845, 2016に記載）に基づき、ＴＣＲα定常領域においてはＡＢ　ｌｏｏｐ、Ｃ　ｓｔｒａｎｄ、ＤＥ　ｌｏｏｐ及びＦ　ｓｔｒａｎｄの４領域、ＴＣＲβ定常領域においてはＨｅｌｉｘ３、ＣＣ　ｌｏｏｐ、Ｈｅｌｉｘ４　Ｆ　ｓｔｒａｎｄ及びＦＧ　ｌｏｏｐの４領域を抽出した。ＴＣＲα及びＴＣＲβ配列のシグナルペプチドをコーディングする配列の直下に、各々のアミノ酸領域を消失させるように５´末端から段階的に塩基を欠失させた定常領域配列をｉｎ－ｆｒａｍｅで接続した複数パターンの改変ＴＣＲ配列を設計し、ｍｏｃｋベクターにクローニングし、発現ベクターを構築した（ｂａ３～ｂａ１８ベクター）。
　以上の全長及び改変ＴＣＲ配列の模式図を図１に、ｂａ１のアミノ酸配列情報（配列番号４９）を図２に、ｂａ２～ｂａ９のアミノ酸配列情報（配列番号５０～５７）を図３に、ｂａ１０～ｂａ１８のアミノ酸配列情報（配列番号５８～６６）を図４に示す。
　２９３Ｔ細胞に発現させるためのＣＤ３発現ベクターを公知の各ＣＤ３サブユニットのｃＤＮＡ配列情報（ＣＤ３Ｅ：ＮＭ＿０００７３３．３；ＣＤ３Ｇ：ＮＭ＿００００７３．２；ＣＤ３Ｄ：ＮＭ＿０００７３２．４；ＣＤ２４７（ＣＤ３Ｚ）：ＮＭ＿１９８０５３．２）に基づき構築した。これらのＣＤ３サブユニット配列とＥＧＦＰ遺伝子とを、ＧＳＧリンカー－Ｔ２Ａ　ｐｅｐｔｉｄｅ配列で連結したもの（ＣＤ３Ｅ－Ｔ２Ａ－ＣＤ３Ｇ－Ｔ２Ａ－ＣＤ３Ｄ－Ｔ２Ａ－ＣＤ３Ｚ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＰ）を、ｐＥＦ１α発現ベクターにクローニングした。
　ＣＤ３を安定発現する２９３Ｔ細胞を樹立した。２９３Ｔ細胞はＤＳＭＺより入手した（＃ＡＣＣ６３５）。２９３Ｔ細胞の維持培養には、２９３Ｔ培地［Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ナカライテスク）、１０％　ＦＢＳ（Ａｃｃｅｓｓ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン硫酸塩（ナカライテスク）を含む］を用いた。継代は、２９３Ｔ細胞をＰＢＳ（ナカライテスク）で１回洗浄した後、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）で細胞を剥離して行った。２９３Ｔ細胞にＣＤ３発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてトランスフェクション後、セルソーターＳＨ８００（ＳＯＮＹ）によるＥＧＦＰ陽性画分の純化と、増幅培養を繰り返すことで、ＣＤ３－ＥＧＦＰ安定発現株を樹立した。
　ＣＤ３－ＥＧＦＰ安定発現株に上述の各種ｂａベクターを導入することで、細胞表面上にＣＤ３Ｅ及びＣＤ３Ｄ分子が保持されるかどうかを検証した。各種ｂａベクター及びｍｏｃｋベクターをＣＤ３－ＥＧＦＰ安定発現株にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００を用いてトランスフェクション後、２日後に細胞を回収した。回収した細胞をＦＡＣＳバッファー［ＰＢＳ（ナカライテスク）、２％　ＦＢＳ（Ａｃｃｅｓｓ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む］で洗浄した。ＣＤ３Ｅの染色のためにＰＥ／Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ３Ｅ抗体（ｃｌｏｎｅ：ＵＣＨＴ１）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を、ＣＤ３Ｄの染色のためにＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ３Ｄ抗体（ｃｌｏｎｅ：７Ｄ６）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に添加し、暗所で４℃、３０分間静置した。ＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄後、ＤＡＰＩ（同仁化学研究所）を添加して死細胞を染色した。ＦＡＣＳ解析は、セルソーターＳＨ８００を用いて行った。
　ＥＧＦＰ陽性ｈＫＯ１陽性ＤＡＰＩ陰性画分におけるＣＤ３Ｅの発現パターンを図５に、ＭＦＩ（Ｍｅａｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）による数値化データを図６に示す。全長ＴＣＲ（ｂａ１）導入細胞においてＣＤ３Ｅの発現が認められた。ｂａ２～ｂａ１８の改変ＴＣＲを導入した場合においても、細胞表面のＣＤ３Ｅ発現が確認されたが、改変ＴＣＲの種類によって発現レベルには強弱が観察された。
　ＣＤ３Ｄの発現パターンを図７に、ＭＦＩによる数値化データを図８に示す。全長ＴＣＲ（ｂａ１）導入細胞においてＣＤ３Ｄの発現が認められた。ＣＤ３Ｅの場合と同様に、ｂａ２～ｂａ１８の改変ＴＣＲ導入によって、細胞表面のＣＤ３Ｄ発現が確認されたが、改変ＴＣＲの種類によって発現レベルには強弱が観察された。
　以上より、２９３Ｔ細胞における人工的なＴＣＲ／ＣＤ３再構成実験によって、細胞表面上にＣＤ３サブユニット発現を効率的に保持することが出来る改変ＴＣＲをスクリーニングすることが可能となった。
　ｂａ１～ｂａ１８の検証の結果、ＴＣＲ遺伝子の削除パターンによって、細胞表面上のＣＤ３Ｅ及びＣＤ３Ｄの発現レベルが変動することを明らかなった。具体的には、ｂａ２、ｂａ３、ｂａ７、ｂａ８、ｂａ９、ｂａ１０、ｂａ１７及びｂａ１８は、ｂａ１と同程度のＣＤ３Ｅ及びＣＤ３Ｄの保持能を有していた。
［実施例２］
　Ｊｕｒｋａｔ細胞において、改変ＴＣＲによるＣＤ３サブユニット分子の保持能を解析した。
　改変ＴＣＲによるＣＤ３サブユニット保持能をより生理的な条件下で解析するために、Ｔ細胞系列の細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞（＃ＡＣＣ２８２）（ＤＳＭＺ）を用いた。Ｊｕｒｋａｔ細胞の維持培養には、Ｊｕｒｋａｔ培地［ＲＰＭＩ１６４０（ナカライテスク）、１０％　ＦＢＳ（Ａｃｃｅｓｓ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン硫酸塩（ナカライテスク）を含む］を用いた。継代は、適量のＪｕｒｋａｔ細胞を分取し、新鮮なＪｕｒｋａｔ培地に懸濁することで行った。
　Ｔ細胞系列の細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞は、ＴＣＲα及びＴＣＲβ遺伝子が既に再構成された内在性のＴＣＲ遺伝子を有している。そのため、野生型Ｊｕｒｋａｔ細胞（以下、ＷＴ株と記載）に改変ＴＣＲ遺伝子を導入すると、内在性ＴＣＲ遺伝子との間でキメラＴＣＲ分子を形成する可能性があり、改変ＴＣＲによるＣＤ３サブユニット保持能を正確に判定することができない。そこで、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、内在性のＴＣＲα遺伝子及びＴＣＲβ遺伝子をゲノム編集にてダブルノックアウトすることを試みた。
　ＴＣＲα鎖定常領域をコードする遺伝子（ＴＲＡＣ遺伝子）及びＴＣＲβ鎖定常領域をコードする遺伝子（ＴＲＢＣ遺伝子）を標的としたゲノム編集を行い、フレームシフトによるノックアウトを行った。ゲノム編集には、Ａｌｔ－Ｒ　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９　Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＤＴ）を用いて、Ｃａｓ９タンパク質とｇｕｉｄｅ　ＲＮＡとの複合体を直接細胞内に導入する手法を用いた。ターゲット配列（ＮＧＧ上流２０ｍｅｒ）はそれぞれ公知文献より抽出した；ＴＲＡＣ：ｇａｇａａｔｃａａａａｔｃｇｇｔｇａａｔ（配列番号６７）（Osborn et al., Mol Ther, 2017に記載）；ＴＲＢＣ（ＴＲＢＣ１とＴＲＢＣ２共通）：ｃａａａｃａｃａｇｃｇａｃｃｔｃｇｇｇｔ（配列番号６８）（Legut et. al., Blood. 131(3): 311-322, 2018に記載）。
　仕様書に基づいてＣａｓ９／ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ複合体を形成させた後、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　（Ｌｏｎｚａ）及びＳＥ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ　４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　Ｘ　Ｋｉｔ　Ｌ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、エレクトロポレーションによるＪｕｒｋａｔ細胞へのＣａｓ９／ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ複合体導入を行った（導入プログラム：ＣＬ－１２０）。
　まず、ＷＴ株にＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトのためのＣａｓ９／ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ複合体導入を行った。増幅培養させた後、細胞をＡＰＣ標識抗ヒトＴＣＲα／β抗体（ｃｌｏｎｅ：ＩＰ２６）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＰＥ／Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ３Ｅ抗体（ｃｌｏｎｅ：ＵＣＨＴ１）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて染色したところ、ＴＣＲ陰性ＣＤ３Ｅ陰性画分の出現が認められた。この画分をセルソーターにて純化し、増幅培養させた後、続いてＴＲＢＣ遺伝子ノックアウトのためのＣａｓ９／ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ複合体導入を行った。増幅培養させた後、全長ＴＣＲα鎖のみを発現するベクターを細胞に一過性に導入し、ＡＰＣ標識抗ヒトＴＣＲα／β抗体及びＰＥ／Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ３Ｅ抗体を用いて染色したところ、ＴＣＲ陰性ＣＤ３Ｅ陰性画分の出現が認められた。この画分はＴＣＲβ遺伝子ノックアウトに成功した画分と考えられ、セルソーターにて純化し、増幅培養させた。
　最後にこの細胞に全長ＴＣＲα鎖のみを発現するベクター又は全長ＴＣＲβ鎖のみを発現するベクターを一過性に導入し、ＡＰＣ標識抗ヒトＴＣＲα／β抗体及びＰＥ／Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ３Ｅ抗体で染色したところ、いずれの場合にも９９％程度の純度でＴＣＲ陰性ＣＤ３Ｅ陰性画分が存在していた。以上より、ＴＣＲα遺伝子及びＴＣＲβ遺伝子のダブルノックアウト株を樹立した（以下、ｄＫＯ株と記載する）。
　ｄＫＯ株に各種ｂａベクターを導入することで、細胞表面上にＣＤ３Ｅ及びＣＤ３Ｄ分子が保持されるかどうかを検証した。各種ｂａベクター及びｍｏｃｋベクターを上記と同様のエレクトロポレーションにより導入後、２日後に細胞を回収した。回収した細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄した。ＣＤ３Ｅの染色のためにＰＥ／Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ３Ｅ抗体を、ＣＤ３Ｄの染色のためにＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ３Ｄ抗体を細胞に添加し、暗所で４℃、３０分間静置した。ＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄後、ＤＡＰＩを添加して死細胞を染色した。ＦＡＣＳ解析は、セルソーターＳＨ８００を用いて行った。
　ＤＡＰＩ陰性画分におけるＣＤ３Ｅの発現パターンを図９に、ＭＦＩによる数値化データを図１０に示す。全長ＴＣＲ（ｂａ１）導入細胞においてＣＤ３Ｅの発現が認められた。ｂａ２～ｂａ１８の改変ＴＣＲを導入した場合においても、細胞表面のＣＤ３Ｅ発現が確認されたが、改変ＴＣＲの種類によって発現レベルには強弱が観察された。
　ＣＤ３Ｄの発現パターンを図１１に、ＭＦＩによる数値化データを図１２に示す。全長ＴＣＲ（ｂａ１）導入細胞においてＣＤ３Ｄの発現が認められた。ＣＤ３Ｅの場合と同様に、ｂａ２～ｂａ１８の改変ＴＣＲ導入によって、細胞表面のＣＤ３Ｄ発現が確認されたが、改変ＴＣＲの種類によって発現レベルには強弱が観察された。
　以上より、Ｔ細胞としての性質を備えたＪｕｒｋａｔ細胞のｄＫＯ株を用いることで、細胞表面上にＣＤ３サブユニット発現を効率的に保持することの出来る改変ＴＣＲをスクリーニング出来ることを明らかにした。ｂａ１～ｂａ１８の検証の結果、ＴＣＲ遺伝子の削除パターンによって、細胞表面上のＣＤ３Ｅ及びＣＤ３Ｄの発現レベルが変動することがわかった。ｂａ１～ｂａ１８の検証の結果、ｂａ１には及ばないものの、例えばｂａ７、ｂａ８及びｂａ９では、Ｊｕｒｋａｔ細胞においても比較的高いレベルでＣＤ３Ｅ及びＣＤ３Ｄの細胞表面発現を支持することを見出した。
［実施例３］
　Ｊｕｒｋａｔ細胞のｄＫＯ株を用いて、改変ＴＣＲによるシグナル伝達能を解析した。
　実施例１及び実施例２において、設計した改変ＴＣＲごとに、細胞表面上のＣＤ３サブユニットの発現支持能にバリエーションがあることを示した。次に、改変ＴＣＲによって細胞表面上に提示されたＣＤ３分子を介した、Ｔ細胞へのシグナル伝達を検証した。
　ＣＤ６９は、Ｔ細胞がＴＣＲ／ＣＤ３複合体刺激に応答することで早期に発現が誘導される、活性化Ｔ細胞の代表的な細胞表面マーカーである（Ziegler et al., Stem Cells. 12(5): 456-65, 1994に記載）。Ｊｕｒｋａｔ細胞においても、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体結合ビーズによる刺激に応じて、ＣＤ６９の発現が亢進すること等が知られている（Tomkowicz et al., PLoS One, 2015に記載）。従って、改変ＴＣＲによってＣＤ３分子が細胞表面上に保持された時に、ＣＤ３刺激によってＣＤ６９発現が亢進すれば、改変ＴＣＲがＴ細胞シグナル伝達において機能的にも有用であることを示すことが出来る。
　Ｊｕｒｋａｔ細胞のＷＴ株及びｄＫＯ株を、抗ＣＤ３Ｅアゴニスト抗体であるＯＫＴ３で刺激することでＣＤ６９発現が亢進するかどうかを検証した。接着細胞用９６ウェルプレートに、ＰＢＳ（ナカライテスク）を用いて１０μｇ／ｍＬに希釈したＵｌｔｒａ－ＬＥＡＦ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＣＤ３　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｃｌｏｎｅ：ＯＫＴ３）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１００μＬずつ添加し、３７℃で一晩静置した。
　上清を除去し、ＰＢＳで２回洗浄したプレート（以下、固層化ＯＫＴ３プレートと記載）にＷＴ株又はｄＫＯ株を播種し、更に３７℃で一晩培養を行った。細胞を回収し、ＦＡＣＳバッファーで洗浄した。Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７標識抗ヒトＣＤ６９抗体（ｃｌｏｎｅ：ＦＮ５０）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を細胞に添加し、暗所で４℃、３０分間静置した。ＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄後、ＤＡＰＩを添加して死細胞を染色した。ＦＡＣＳ解析はセルソーターＳＨ８００を用いて行った。結果を図１３に示す。
　図１３に示すように、ＷＴ株においてはＯＫＴ３刺激によってＣＤ６９発現が上昇したのに対して、ｄＫＯ株ではＣＤ６９の発現亢進は認められなかった。従って、ＴＣＲダブルノックアウトによりＣＤ３発現を消失したｄＫＯ株では、ＣＤ３刺激への応答性も消失していることが示された。
　次に、ｄＫＯ株に改変ＴＣＲを導入することで、ＯＫＴ３刺激を介したＣＤ６９発現亢進が生じるかどうかを検証した。実施例２と同様に、ｄＫＯ株に各種ｂａベクター及びｍｏｃｋベクターをエレクトロポレーションにより導入後、翌日に細胞を回収し、固層化ＯＫＴ３プレートに播種した。翌日に細胞を回収し、上記と同様の手順にてＣＤ６９の発現解析を行った。ＤＡＰＩ陰性画分におけるＣＤ６９の発現パターンを図１４に、ＭＦＩによる数値化データを図１５に示す。
　図１４及び図１５に示すように、全長ＴＣＲ（ｂａ１）導入細胞においてＣＤ６９発現が認められた。ｂａ２～ｂａ１８の改変ＴＣＲを導入した場合においても、細胞表面のＣＤ６９発現が確認されたが、改変ＴＣＲの種類によって発現レベルには強弱が観察された。
　以上より、改変ＴＣＲは単に細胞膜表面上にＣＤ３分子を保持する作用のみならず、細胞表面に提示されたＣＤ３分子をアゴニスト抗体等で刺激することによってＴＣＲ／ＣＤ３複合体シグナルを細胞内に伝達する作用もあることが明らかになった。
［実施例４］
　実施例１で得たＣＤ３Ｅ蛋白のＦＡＣＳ解析結果につき、ＣＤ３－ＥＧＦＰ安定発現株におけるＣＤ１－１８によるＣＤ３Ｅ陽性率を再解析した。解析ソフトはＦｌｏｗＪｏを用いた。Ｎ＝２の平均値を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例５］
　ＣＤ３を強制発現した２９３Ｔ細胞を用いて、改変ＴＣＲα及び改変ＴＣＲβによるＣＤ３タンパク質の細胞表面の局在を評価した。ここで、実施例１及び実施例２の結果から、ＣＤ３サブユニットを恒常発現させた２９３Ｔ細胞（ＣＤ３強制発現２９３Ｔ細胞）は内在性ＴＣＲをノックアウトしたＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、感度が高かったことから、実施例５においては、ＣＤ３強制発現２９３Ｔ細胞を用いて解析した。
　まず、改変ＴＣＲα及びＴＣＲβの配列をデザインした。公知文献（Michael S. Kuhns et al., Immunity. 26: 357-369, 2007、Aswin Natarajan et al., Cell Reports.14: 2833-2845, 2016に記載）を参考に、ＣＤ３タンパクとの相互作用が報告されているＴＣＲα及びＴＣＲβのアミノ酸を確認した。
　また、ＴＣＲα及びＴＣＲβタンパク質の結晶構造を、オープンソースの分子グラフィックツールであるＰｙＭＯＬを用いて確認した。ＴＣＲα及びＴＣＲβのタンパク質の結晶構造は、公知の情報（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ＩＤ：３ＱＪＦ）を参照した。
　改変ＴＣＲα及び改変ＴＣＲβタンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列のうちＮ末側の一部配列を図１６及び図１７にそれぞれ示す。また、改変ＴＣＲα及び該断片のアミノ酸配列を表２及び表８に、改変ＴＣＲβ及び該断片のアミノ酸配列を表３及び表９にそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　尚、ｂａ２～ｂａ１８のＴＣＲα及びＴＣＲβのアミノ酸配列は、それぞれ表２及び表８並びに表３及び表９にそれぞれ示している改変ＴＣＲα及び該断片並びに改変ＴＣＲβ及び該断片から選択される。表２及び表８並びに表３及び表９に示される改変ＴＣＲα及び該断片並びに改変ＴＣＲβ及び該断片の各アミノ酸配列と、ｂａ２～ｂａ１８におけるＴＣＲα及びＴＣＲβの各アミノ酸配列との対応を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　デザインした改変ＴＣＲα及び改変ＴＣＲβを発現するプラスミドベクターを構築した。ｂａ２を鋳型として、ＰＣＲによってαＣＲとβＣＲの各５’末端にＫｐｎ１、各３’末端にＸｈｏ１を付加し増幅した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＫｐｎ１及びＸｈｏ１で開裂し、増幅したＤＮＡをクローニングした。次に、αＣＲとβＣＲを鋳型として、インバースＰＣＲによってα１～１０、β１～１２を作製した。インバースＰＣＲに使用したプライマーを表５に示す。ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、得られたｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡの配列解析によりＤＮＡ配列を確認した。改変ＴＣＲαをコードするＤＮＡの塩基配列を表６、１０及び１１に、改変ＴＣＲβをコードするＤＮＡの塩基配列を表７、１２及び１３にそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　ＣＤ３－ＥＧＦＰ安定発現株に改変ＴＣＲ発現ベクターを導入することで、細胞表面上にＣＤ３分子が保持されるかどうかを検証した。各種改変ＴＣＲαベクターと各種改変ＴＣＲβベクターとを組み合わせて、トランスフェクションマーカーであるｐＥＦ１α－ＩＲＥＳ－ｈＫＯ１（実施例１におけるｍｏｃｋベクター）をＣＤ３－ＥＧＦＰ安定発現株にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて共トランスフェクションした。
　Ｅｍｐｔｙ　ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターとｐＥＦ１α－ＩＲＥＳ－ｈＫＯ１とを共トランスフェクションしたものをｃｏｎｔｒｏｌとした。２日後に回収した細胞をＦＡＣＳバッファー［ＰＢＳ（ナカライテスク）、２％　ＦＢＳ（Ａｃｃｅｓｓ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む］で洗浄した。
　ＣＤ３の染色のためにＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体（ｃｌｏｎｅ：ＵＣＨＴ１）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を細胞に添加し、暗所で４℃、３０分間静置した。ＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄後、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅを添加して死細胞を染色した。ＦＡＣＳ解析は、ＢＤ　ＬＳＲ　Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて行った。ＥＧＦＰ（＋）ＫＯ（＋）細胞中のＣＤ３陽性率をＦｌｏｗＪｏ９で解析した。Ｎ＝３の平均値を図１８に示す。
　図１８に示す結果から、以下（１）～（１３）に記載の知見が得られた。
（１）βＣＲと各改変ＴＣＲαを組み合わせたすべての改変ＴＣＲは８０％以上の高いＣＤ３リクルート活性を示した。
（２）β１と各改変ＴＣＲαからなる改変ＴＣＲは７．４２－４３．１％のＣＤ３リクルート活性を示した。なかでも、αＣＲ及びα１の改変ＴＣＲαと組み合わせると２０％以上の十分に高いＣＤ３リクルート活性を示した。
（３）β２と各改変ＴＣＲαからなる改変ＴＣＲは１３．３－７１％のＣＤ３リクルート活性を示した。なかでも、α３以外の改変ＴＣＲαと組み合わせると２０％以上の十分に高いＣＤ３リクルート活性を示した。
（４）β３と各改変ＴＣＲαからなる改変ＴＣＲは１．１２－６．６３％のＣＤ３リクルート活性を示した。
（５）β４と各改変ＴＣＲαからなる改変ＴＣＲは１．０２－８．９７％のＣＤ３リクルート活性を示した。
（６）β５と各改変ＴＣＲαからなる改変ＴＣＲは０．９９－８．９７％のＣＤ３リクルート活性を示した。
（７）β６と各改変ＴＣＲαからなる改変ＴＣＲは０．９４－１０．１％のＣＤ３リクルート活性を示した。
（８）β７と各改変ＴＣＲαからなる改変ＴＣＲは３．５８－３０．１％のＣＤ３リクルート活性を示した。なかでも、α９－１０と組み合わせると２０％以上の十分に高いＣＤ３リクルート活性を示した。
（９）β８と各改変ＴＣＲαからなる改変ＴＣＲは１．８１－１８．１％のＣＤ３リクルート活性を示した。
（１０）β９と各改変ＴＣＲαからなる改変ＴＣＲは５．２８－６９．２％のＣＤ３リクルート活性を示した。なかでも、α８－１０と組み合わせると２０％以上の十分に高いＣＤ３リクルート活性を示した。
（１１）β１０と各改変ＴＣＲαからなる改変ＴＣＲは９．２３－８５．１％のＣＤ３リクルート活性を示した。なかでも、α３－１０と組み合わせると２０％以上の十分に高いＣＤ３リクルート活性を示した。
（１２）β１１と各改変ＴＣＲαからなる改変ＴＣＲは１２．３－８１．７％のＣＤ３リクルート活性を示した。なかでも、α３－１０と組み合わせると２０％以上の十分に高いＣＤ３リクルート活性を示した。
（１３）β１２と各改変ＴＣＲαからなる改変ＴＣＲは１１．５－８０．６％のＣＤ３リクルート活性を示した。なかでも、α３－１０と組み合わせると２０％以上の十分に高いＣＤ３リクルート活性を示した。
　以上の結果から、評価した各種改変ＴＣＲα及び各種改変ＴＣＲβの組み合わせの多くにより、ＣＤ３タンパクの細胞表面上へのリクルートが認められた。また、ＴＣＲ遺伝子を欠失させるパターンによって、細胞表面上のＣＤ３の発現レベルが変動することを明らかにした。
［実施例６］
　改変ＴＣＲであるｂａ１、ｂａ２、ｂａ４及びｂａ９のレトロウイルスベクターを構築した。実施例１で構築した、ｂａ１ベクター、ｂａ２ベクター、ｂａ４ベクター及びｂａ９ベクター（ｐＥＦ１α－ＩＲＥＳ－ｈＫＯ１）のＩＲＥＳの上流にあるＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩを用いてインサートを切り出し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで開裂したｐＭＹ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ　（以下、ｐＭＹ－ＩＧと記載する。Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ，　Ｉｎｃ）にサブクローニングした。レトロウイルスを作製するため、ｂａ１－ｐＭＹ－ＩＧ、ｂａ２－ｐＭＹ－ＩＧ、ｂａ４－ｐＭＹ－ＩＧ、ｂａ９－ｐＭＹ－ＩＧ及びＥｍｐｔｙ－ｐＭＹ－ＩＧそれぞれをＶＳＶ－Ｇベクター（タカラバイオ）と共にＧＰ２－２９３パッケージング細胞（タカラバイオ）へＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００を用いてトランスフェクションした。二日後、レトロウイルスを含む細胞上清を回収し、Ｒｅｔｒｏ－Ｘ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（タカラバイオ）を用いて濃縮レトロウイルスを作製した。
［実施例７］
　改変ＴＣＲであるｂａ１及びｂａ２によるｉＰＳ細胞からのＴ細胞誘導能を検証した。まず、臍帯血由来でありＴ細胞に由来しないことを確認しているｉＰＳ細胞株（ＦＦ－ＷＪｓ５２４、ＦＦ－ＷＪｓ５２７）から、ｂａ１及びｂａ２を遺伝子導入するための造血前駆細胞（ＨＰＣｓ）細胞を誘導した。ｉＰＳ細胞の維持は、フィーダーフリーｉＰＳ細胞はＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ培地（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）を用いた。
　ｉＭａｔｒｉｘ－５１１をコートした培養表面にｉＰＳ細胞を剥離剤［１×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳで１／２に希釈し、０．５ｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ　８、Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）を添加し、終濃度０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ、０．７５ｍＭ　ＥＤＴＡ］を用いて剥離し、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎに１０μＭ　Ｙ－２７６３２を加えた培地に継代、培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。翌日、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎで培地交換を行った。この操作を週に一度繰り返し、ｉＰＳ細胞を維持した。
　続いて、ｉＰＳ細胞をＥｍｂｒｙｏｉｄ　Ｂｏｄｙ形成法で分化誘導することにより、ＨＰＣｓを作製した。フィーダーフリーｉＰＳ細胞を０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ、０．７５ｍＭ　ＥＤＴＡで剥離した後、超低接着処理された６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（ＣＯＲＮＩＮＧ）に２～３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。
　１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）、１０μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加したＳｔｅｍｆｉｔ　ＡＫ０２Ｎ培地を用い、低酸素条件下（５％　Ｏ２）にて培養した（Ｄａｙ０）。翌日、１×Ｉｎｓｕｒｉｎ，Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２×ＰＳＧ、４５ｍＭ　モノチオグリセ口一ル（Ｗａｋｏ）及び５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ（Ｗａｋｏ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培地（ＥＢ培地）に５０ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ－４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－１６５Ａ（Ｗａｋｏ）、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ　（Ｗａｋｏ）を加えて培養した（Ｄａｙ１、５％　Ｏ２）。
　翌日、６μＭ　ＳＢ４３１５４２（Ｗａｋｏ）を添加して培養した（Ｄａｙ２、５％　Ｏ２）。２日後、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－１６５Ａ、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦを添加したＥＢ培地で培養した（Ｄａｙ４、５％　Ｏ２）。２日後、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－１６５Ａ、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、３０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ（Ｗａｋｏ）、１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＬＴ３Ｌ（Ｗａｋｏ）を添加したＥＢ培地で培養した（Ｄａｙ６）。２～３日毎に培地交換を行い、Ｄａｙ１３まで細胞を５％ＣＯ２下で培養した。細胞を回収し、Ｔｃプロテクターにて凍結した。
　得られたＨＰＣｓに改変ＴＣＲｂａ１及びｂａ２を遺伝子導入した後に、ＣＤ３（＋）ＣＤ４５（＋）Ｔ細胞に分化した。詳細には、レトロウイルスを導入するために、凍結したＨＰＣを解凍し、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－１６５Ａ、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、３０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ　（Ｗａｋｏ）、１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＬＴ３Ｌ（Ｗａｋｏ）を添加したＥＢ培地で培養した（Ｄａｙ－２）。
　翌日、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（１００μｇ／ｍｌ、タカラバイオ）をコートした４８ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに前日解凍した細胞を２～４×１０４細胞／ウェルで播種した。その後、改変ＴＣＲｂａ１、ｂａ２又はＥｍｐｔｙのレトロウイルスを添加し、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－１６５Ａ、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、３０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ（Ｗａｋｏ）、１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＬＴ３Ｌ（Ｗａｋｏ）を添加したＥＢ培地で培養した（Ｄａｙ－１）。
　翌日、ＤＬＬ４（５μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）とＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（５μｇ／ｍｌ、タカラバイオ）でコ一ティングした４８ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに細胞を撒き尚し、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ（Ｗａｋｏ）、５０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７（Ｗａｋｏ）、５０ｎｇ／ｍｌ　Ｆｌｔ３Ｌ（Ｗａｋｏ）、１００ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ（Ｗａｋｏ）、３０μＭ　ＳＤＦ－１α（Ｗａｋｏ）、１５μＭ　ＳＢ２０３５８０（Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、５５μＭ　２－メルカプトエタノール（Ｗａｋｏ）、５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、１５％　ＦＣＳ及び１％　ＰＳＧを添加したａｌｐｈａ－ＭＥＭ培地で培養した（Ｄａｙ０）。
　１週間ごとに新たなＤＬＬ４及びＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎをコートしたプレートを作製し、細胞を撒き尚した。２～３日毎に培地交換をおこなった。Ｄａｙ２１まで培養した。分化させた細胞（Ｄａｙ２１）はＣＤ３－ＢＶ５１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ４５－ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で共染色した。洗浄後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含むＦＡＣＳバッファーで再懸濁した。ＢＤ　ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて解析した。ＦｌｏｗＪｏ９でＰＩ（－）ＧＦＰ（＋）細胞集団中のＣＤ３及びＣＤ４５の陽性率を解析した。
　ＣＤ３及びＣＤ４５の発現解析結果の代表例としてＦＦ－ＷＪｓ５２４の結果を図１９（Ａ）に示す。図１９（Ａ）に示すように、Ｅｍｐｔｙ導入細胞ではＣＤ３の発現が認められなかったのに対し、ｂａ１及びｂａ２導入細胞はＣＤ３の発現が認められた（ｂａ１：９９．８％、ｂａ２：５０．４％）。Ｅｍｐｔｙ、ｂａ１及びｂａ２の全てにおいてＣＤ４５白血球マーカーの発現が認められた。
　続いて、ＣＤ８β（＋）ＣＤ８α（＋）を成熟Ｔ細胞へ誘導した。詳細には、上記ＣＤ３（＋）ＣＤ４５（＋）Ｔ細胞を含む細胞を４８ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１～１０ｘ１０４細胞／ウェルで播種し、５００ｎｇ／ｍｌ　Ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１０ｎＭ　Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（デキサートＲ、Ｆｕｊｉ　Ｐｈａｒｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７（Ｗａｋｏ）、５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、１５％　ＦＣＳ及び１％ＰＳＧを添加したａｌｐｈａ－ＭＥＭ培地で培養した（Ｄａｙ０）。３日後、１０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７（Ｗａｋｏ）、５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、１５％　ＦＣＳ及び１％　ＰＳＧに培地交換を行い、培養した（Ｄａｙ３）。７日後、細胞をトリパンブルー染色法により細胞を計数した（Ｄａｙ１０）。
　Ｄａｙ０からＤａｙ１０までの１０日間における細胞増殖は、Ｅｍｐｔｙコントロールが０．３８倍及び０．１６５倍（それぞれＦＦ－ＷＪｓ５２４及びＦＦ－ＷＪｓ５２７の結果。以下同様。）であったのに対しｂａ１導入細胞が５．１３倍及び２．２１倍、ｂａ２が１．５５倍及び４．２５倍となった。
　十分に細胞の得られた改変ＴＣＲ　ｂａ１及びｂａ２導入細胞のみ成熟Ｔ細胞マーカーであるＣＤ８β及びＣＤ８αの発現を解析した。具体的には、ＣＤ３－ＢＶ５１０、ＣＤ４５－ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ４－ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８ｂｅｔａ－ＰＥ－Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８α－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で共染色した。洗浄後、ヨウ化プロピジウムを含むＦＡＣＳバッファーで再懸濁した。ＢＤ　ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて解析した。ＦｌｏｗＪｏ９でＰＩ（－）ＧＦＰ（＋）ＣＤ３（＋）ＣＤ４５（＋）ＣＤ４（－）細胞集団中のＣＤ８β及びＣＤ８αの陽性率を解析した。
　ＣＤ８β及びＣＤ８αの発現解析結果の代表例としてＦＦ－ＷＪｓ５２４の結果を図１９（Ｂ）に示す。ｂａ１及びｂａ２導入細胞共にＣＤ８β及びＣＤ８αを発現した（Ｂａ１：１００％、Ｂａ２：９９．５％）。
　以上の結果から、ＴＣＲα／ＴＣＲβ全長からなるｂａ１同様、可変部ドメインを持たないＴＣＲα／ＴＣＲβからなる改変ＴＣＲであるｂａ２も全能性幹細胞からの成熟Ｔ細胞誘導に有用であることが示された。特に、ＣＤ３抗体ＯＫＴ３によりｂａ１及びｂａ２導入により成熟Ｔ細胞を誘導できたことから、改変ＴＣＲは単に細胞膜表面上にＣＤ３分子を保持する作用があるのみならず、細胞表面に提示されたＣＤ３分子をアゴニスト抗体等で刺激することによってＴＣＲ／ＣＤ３複合体シグナルを細胞内に伝達する作用もあることが示された。
［実施例８］
　ＴＣＲβ定常部ドメインの一部を切り取った改変ＴＣＲであるｂａ４及びＴＣＲα定常部ドメインの一部を切り取った改変ＴＣＲであるｂａ９を用い、Ｔ細胞誘導能を評価した。ｉＰＳ細胞株ＦＦ－ＷＪｓ５２４のＨＰＣｓにｂａ４及びｂａ９を遺伝子導入した後に、実施例７と同様の方法で分化誘導と解析を行なった。ＤＬＬ４及びＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ上で２１日間培養した結果を図２０（Ａ）に示す。
　図２０（Ａ）に示すように、Ｅｍｐｔｙ導入細胞ではＣＤ３の発現が認められなかったのに対し（０．９４％）、ｂａ４及びｂａ９導入細胞はＣＤ３の発現が認められた（ｂａ４：３８．３％、ｂａ９：９９．５％）。Ｅｍｐｔｙ、ｂａ４及びｂａ９の全てにおいてＣＤ４５白血球マーカーの発現が認められた。
　続いて、ＣＤ８β（＋）ＣＤ８α（＋）の成熟Ｔ細胞へ分化誘導した。
ＣＤ８β及びＣＤ８αの発現解析結果を図２０（Ｂ）に示す。図２０（Ｂ）に示すように、ｂａ４、ｂａ９導入細胞ともにＣＤ８βとＣＤ８αを発現した（ｂａ４：１００％、ｂａ２：９９．７％）。
　以上の結果から、ｂａ１及びｂａ２と同様に、定常部ドメインの一部を欠失した改変ＴＣＲも多能性幹細胞または全能性幹細胞からの成熟Ｔ細胞への分化誘導に有用であることが示された。また、ｂａ４は、実施例１の再解析結果（実施例４）でもっとも低いＣＤ３陽性率を示し、追加実施例２で最低レベルのＣＤ３陽性率を示した。しかし、本実施例において、ｂａ４により成熟Ｔ細胞を分化誘導できた。このことから、ＣＤ３をわずかでも細胞表面にリクルート出来る改変ＴＣＲであれば成熟Ｔ細胞の分化誘導に有用であることが示された。更に、本発明で示した改変ＴＣＲに限らず、ＴＣＲα及びＴＣＲβ定常ドメインに様々な改変を加えた改変ＴＣＲがＣＤ３リクルート活性を持つことが示唆された。
　以上より、改変ＴＣＲは単に細胞膜表面上にＣＤ３分子を保持する作用があるのみならず、細胞表面に提示されたＣＤ３分子をアゴニスト抗体等で刺激することによってＴＣＲ／ＣＤ３複合体シグナルを細胞内に伝達する作用もあることが明らかになった。
　多能性幹細胞や造血幹・前駆細胞から効率的にＴ細胞を分化誘導するには、分化段階の適切なタイミングで機能的なＴＣＲ遺伝子座の再編成が起こり、それにより形成されたＴＣＲ／ＣＤ３複合体をｉｎ　ｖｉｔｒｏで刺激して増殖、生存を促進することが重要であると考えられている。ところが、ＴＣＲ遺伝子座が再編成されていない多能性幹細胞では、分化途上で機能的なＴＣＲが効率的に生成されないと予想され、このことはＴ細胞の生産効率を著しく低下させる原因となる。仮にＴＣＲ遺伝子座が再編成されたとしても、生じたＴＣＲ分子の抗原特異性はランダムであることから、細胞製剤としての均質性だけでなく、患者への移植後に予測不能なアロ反応を生じうるという安全性に課題が残る。
　本発明に係る改変ＴＣＲは、ＣＤ３サブユニットを細胞膜に保持し得る。従って、多能性幹細胞からのＴ細胞分化において、改変ＴＣＲを元の多能性幹細胞または分化途上にある前駆細胞等に発現しておけば、Ｔ細胞成熟及び増殖等に必要なシグナルを、改変ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した刺激によって任意のタイミングで自在に伝達することが可能となり、結果的にＴ細胞への分化誘導が促進される。同様に、Ｔ細胞へ分化した後であっても、改変ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激することによって、適宜Ｔ細胞を増幅させることも可能である。また、本発明に係る改変ＴＣＲは抗原認識能が消失していることから、細胞製剤を移植後にアロ反応を生じる可能性は極めて低いと考えられる。従って、本発明に係る改変ＴＣＲを用いることで、多能性幹細胞から効率的に均質なＴ細胞を分化誘導出来る。
　また、本発明に係る改変ＴＣＲをコードする遺伝子のサイズは全長ＴＣＲ遺伝子と比較してコンパクトであるため、発現ベクター若しくはウイルスベクター、エピソーマルベクター又はトランスポゾンベクターを介した遺伝子導入、又はゲノム編集技術による所望のゲノム領域への遺伝子挿入やＴＣＲ遺伝子座自体の改変、更には人工染色体ベクターへの遺伝子搭載等、あらゆる遺伝子導入用のフォーマットに対応し得ると考えられる。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更及び変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。尚、本出願は、２０１８年１２月２６日付けで出願された日本特許出願（特願２０１８－２４２７３３）に基づいており、その全体が引用により援用される。

Claims (45)

  1. 　第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
    　第１のポリペプチドは、ヒトＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）の定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲαの可変領域を含まないポリペプチドであり、
    　第２のポリペプチドは、ヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲβ）の定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲβの可変領域を含まないポリペプチドである、改変ＴＣＲ。
  2. 　前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が以下（Ａ１）～（Ａ３）のいずれか１に記載のポリペプチドである請求項１に記載の改変ＴＣＲ。
    （Ａ１）配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    （Ａ２）配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    （Ａ３）配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  3. 　前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が以下（Ｂ１）～（Ｂ３）のいずれか１に記載のポリペプチドである請求項１又は２に記載の改変ＴＣＲ。
    （Ｂ１）配列番号１２～２４のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    （Ｂ２）配列番号１２～２４のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    （Ｂ３）配列番号１２～２４のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  4. 　前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片及び前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、以下の（ａ１）～（ａ８）のいずれか１に記載のポリペプチドである請求項１～３のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲ。
    （ａ１）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ａ２）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ａ３）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～３及び５～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～３及び５～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～３及び５～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ａ４）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１９で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１０又は１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１０又は１１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１０又は１１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ａ５）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ａ６）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ａ７）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ａ８）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
  5. 　前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片及び前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、以下の（ｂ１）～（ｂ７）のいずれか１に記載のポリペプチドである請求項１～４のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲ。
    （ｂ１）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ｂ２）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ｂ３）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～３及び１０のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～３及び１０のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～３及び１０のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ｂ４）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ｂ５）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ｂ６）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４及び７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４及び７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４及び７～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ｂ７）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号４及び６～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
  6. 　前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片及び前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、以下の（ｃ１）～（ｃ５）のいずれか１に記載のポリペプチドである請求項１～５のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲ。
    （ｃ１）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ｃ２）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ｃ３）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ｃ４）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２３で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである；
    （ｃ５）前記ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２４で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片が、配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号８～１１のいずれか１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
  7. 　前記第１のポリペプチドは、前記ヒトＴＣＲαの定常領域における、ＡＢ　ｌｏｏｐ、Ｃ　ｓｔｒａｎｄ、ＤＥ　ｌｏｏｐ及びＦ　ｓｔｒａｎｄから選ばれる少なくとも１を含む請求項１～６のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲ。
  8. 　前記第２のポリペプチドは、前記ヒトＴＣＲβの定常領域におけるＨｅｌｉｘ３、ＣＣ　ｌｏｏｐ、Ｈｅｌｉｘ４　Ｆ　ｓｔｒａｎｄ及びＦＧ　ｌｏｏｐから選ばれる少なくとも１を含む請求項１～７のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲ。
  9. 　前記第１のポリペプチドが前記ヒトＴＣＲαの定常領域における細胞外領域の少なくとも一部、細胞膜貫通領域及び細胞内領域を含み、かつ前記第２のポリペプチドが前記ヒトＴＣＲβの定常領域における細胞外領域の少なくとも一部、細胞膜貫通領域及び細胞内領域を含む請求項１～８のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲ。
  10. 　第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む改変ＴＣＲであって、
    　第１のポリペプチドは、ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲαの可変領域を含まないポリペプチドであり、
    　第２のポリペプチドは、ヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲβの可変領域を含まないポリペプチドであり、
    　前記改変ＴＣＲを導入された多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞におけるＣＤ３陽性細胞の割合が１％以上である、改変ＴＣＲ。
  11. 　前記改変ＴＣＲを導入された多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞におけるＣＤ３陽性細胞の割合が、前記改変ＴＣＲを導入されていない対応する細胞におけるＣＤ３陽性細胞の割合に対して２倍以上である請求項１～１０のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲ。
  12. 　前記改変ＴＣＲを導入された多能性幹細胞又は造血幹・前駆細胞が、全長ＴＣＲを導入された対応する細胞と比較して、同等以上のＴ細胞分化能を示す、請求項１～１１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲ。
  13. 　前記改変ＴＣＲを導入された非Ｔ細胞由来の多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞のアロ反応性が、全長ＴＣＲを導入された対応する細胞と比較して、低減されている、請求項１～１２のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲ。
  14. 　細胞膜上にＣＤ３サブユニットを保持可能である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲ。
  15. 　ＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを細胞内に伝達可能である、請求項１４に記載の改変ＴＣＲ。
  16. 　前記細胞膜上に保持された前記ＣＤ３サブユニットを介してＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを細胞内に伝達可能である、請求項１４又は１５に記載の改変ＴＣＲ。
  17. 　前記細胞膜上に保持された前記ＣＤ３サブユニットを介してＴＣＲ／ＣＤ３複合体関連シグナルを細胞内に伝達することにより、Ｔ細胞を活性化する、請求項１６に記載の改変ＴＣＲ。
  18. 　多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に発現させるための請求項１～１７のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲ。
  19. 　多能性幹細胞又は造血幹・前駆細胞に発現させて、Ｔ細胞に分化させるための請求項１８に記載の改変ＴＣＲ。
  20. 　多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に発現させて、前記改変ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した刺激応答が可能なＴ細胞を作製するための請求項１８に記載の改変ＴＣＲ。
  21. 　前記多能性幹細胞が、非Ｔ細胞由来の多能性幹細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞由来の多能性幹細胞である請求項１～２０のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲ。
  22. 　請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲを発現している細胞。
  23. 　前記改変ＴＣＲを発現している細胞がＴ細胞である請求項２２に記載の細胞。
  24. 　請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲを発現している細胞を含有する医薬組成物。
  25. 　改変ＴＣＲを発現する細胞の製造方法であって、該改変ＴＣＲは第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む製造方法。
    （ａ）細胞を調製する工程；
    （ｂ）ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲαの可変領域を含まない第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及びヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲβの可変領域を含まない第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、をそれぞれ調製する工程；
    （ｃ）工程（ｂ）で調製した発現ベクターを用いて、工程（ａ）で調製した細胞を形質転換する工程。
  26. 　改変ＴＣＲを発現する細胞の製造方法であって、該改変ＴＣＲは第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、以下の工程（ａ’）～（ｃ’）を含む製造方法。
    （ａ’）細胞を調製する工程；
    （ｂ’）ヒトＴＣＲαの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲαの可変領域を含まない第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びヒトＴＣＲβの定常領域又は該定常領域断片を含み、且つヒトＴＣＲβの可変領域を含まない第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを調製する工程；
    （ｃ’）工程（ｂ’）で調製した発現ベクターを用いて、工程（ａ’）で調製した細胞を形質転換する工程。
  27. 　工程（ａ）又は（ａ’）における細胞が、多能性幹細胞であるか、造血幹・前駆細胞又はＴＣＲα及びＴＣＲβ遺伝子をノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞である、請求項２５又は２６に記載の製造方法。
  28. 　前記改変ＴＣＲを発現する細胞が免疫細胞治療用Ｔ細胞である請求項２５～２７のいずれか１項に記載の製造方法。
  29. 　Ｔ細胞を製造する方法であって、多能性幹細胞又は造血幹・前駆細胞に請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲを発現させて、Ｔ細胞に分化させる工程を含む、Ｔ細胞を製造する方法。
  30. 　Ｔ細胞を製造する方法であって、多能性幹細胞、造血幹・前駆細胞又は内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲを発現させる工程を含み、得られるＴ細胞が前記改変ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した刺激応答が可能なＴ細胞である、Ｔ細胞を製造する方法。
  31. 　多能性幹細胞に請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲを発現させて、Ｔ細胞に分化させる工程と、得られたＴ細胞を対象に投与する工程とを含む、免疫細胞治療の方法。
  32. 　内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に、請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲを発現させて、得られたＴ細胞を対象に投与する工程を含む、免疫細胞治療の方法。
  33. 　造血幹・前駆細胞に、請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲを発現させて、Ｔ細胞に分化させる工程と、得られたＴ細胞を対象に投与する工程を含む、免疫細胞治療の方法。
  34. 　免疫細胞治療に使用するための、請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲ。
  35. 　免疫細胞治療に使用するための、請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲを多能性幹細胞に発現させ、Ｔ細胞に分化させた多能性幹細胞由来のＴ細胞。
  36. 　免疫細胞治療に使用するための、請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲを内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に発現させた、Ｔ細胞。
  37. 　免疫細胞治療に使用するための、請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲを造血幹・前駆細胞に発現させ、Ｔ細胞に分化させた造血幹・前駆細胞由来のＴ細胞。
  38. 　免疫細胞治療用の組成物を製造するための、請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲの使用。
  39. 　免疫細胞治療用の組成物を製造するための、請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲを多能性幹細胞に発現させ、Ｔ細胞に分化させた、多能性幹細胞由来のＴ細胞の使用。
  40. 免疫細胞治療用の組成物を製造するための、前記１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲを内在性のＴＣＲα遺伝子及び内在性のＴＣＲβ遺伝子をそれぞれノックダウン若しくはノックアウトしたＴ細胞に発現させた、Ｔ細胞の使用。
  41. 　免疫細胞治療用の組成物を製造するための、前記１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲを造血幹・前駆細胞に発現させ、Ｔ細胞に分化させた、Ｔ細胞の使用。
  42. 　請求項１～２１のいずれか１項に記載の改変ＴＣＲをコードする核酸。
  43. 　請求項４２に記載の核酸を含むベクター。
  44. 　請求項４２に記載の核酸又は請求項４３に記載のベクターを用いる、医薬組成物の製造方法。
  45. 　請求項４２に記載の核酸又は請求項４３に記載のベクターを含む医薬組成物。
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