KR102222864B1 - 면역 관용 유도 및 면역진단을 위한 ｆｖｉｉｉ 펩타이드 - Google Patents

면역 관용 유도 및 면역진단을 위한 ｆｖｉｉｉ 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 예를 들어 A형 혈우병 환자에서 FVIII에 대한 면역 반응을 감소시키거나 또는 인간 FVIII에 대한 관용을 유도하기 위하여 사용될 수 있는 펩타이드에 관한 것이다. 더 나아가, 펩타이드는 FVIII-특이적 CD4+ T 세포를 검출하기 위한 면역진단적 목적을 위하여 사용되어 대체 치료 동안 및 면역 관용 유도 치료 동안 A형 혈우병 환자를 모니터링할 수 있다.

Description

면역 관용 유도 및 면역진단을 위한 ＦＶＩＩＩ 펩타이드{FVIII PEPTIDES FOR IMMUNE TOLERANCE INDUCTION AND IMMUNODIAGNOSTICS}
관련출원과의 상호참조
본 출원은 2010년 10월 27일 출원된 미국 가특허 출원 제61/407,402호, 2011년 3월 25일 출원된 미국 가특허 출원 제61/467,894호 및 2011년 6월 29일 출원된 미국 가특허 출원 제61/502,476호의 우선권을 주장하며, 이들 기초 출원은 본 명세서에 그들의 전문이 모든 목적을 위하여 참조로서 포함된다.
연방정부 지원된 연구 또는 개발하에 만들어진 발명에 대한 권리로서의 언급
해당 없음.
"서열목록", 표 또는 컴팩트 디스크 상에서 제출된 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 대한 언급
해당 없음.
인자 VIII(FVIII)는 혈액 응고를 야기하는 반응의 캐스케이드에서 보조인자로서 작용하는 혈장에서 발견되는 단백질이다. A형 혈우병은 기능성 FVIII 단백질의 감소 또는 결핍에 의해 야기되며, 5000명 내지 10000명의 사람 중에서 약 1명에게 영향을 미치는 가장 흔한 출혈 장애이다. 혈우병의 임상적 증상은 빈번한 근육 및 관절 출혈이며, 외상은 심지어 생명을 위협하는 상황에 이를 수 있다. 현재 혈우병에 대한 효과적인 치료는 재조합 또는 혈장 유래 FVIII 생성물의 정맥내 적용을 사용하여 결여된 FVIII 단백질을 대체하는 것을 포함한다. 이러한 제제는 일반적으로 출혈 에피소드(온-디맨드(on-demand) 치료)에 반응하거나 또는 빈번하게, 정기적 간격으로 투여되어 제어되지 않은 출혈을 방지한다(예방). 불행하게도, 중화 항-FVIII 항체의 출현은 FVIII 생성물에 의한 대체 치료 동안의 주된 합병증이다. 치료를 받는 대략 25%의 환자는 FVIII 단백질에 대해 이런 면역이 발생하였고, 따라서 출혈의 제어를 매우 어렵게 만든다.
FVIII 단백질에 대한 이 면역 반응의 원인은 완전히 밝혀지지 않았지만, 환자의 면역 시스템의 상세한 특성은 치료에 대한 그들의 반응에 영향을 미칠 수 있다. 보통, 면역 시스템은 특정 항원, 예를 들어 "자기"항원에 대한 관용(tolerance)을 만든다. 이 특징은 중요한데, 자기 항원이 외래 항원으로서 인식된다면, 다르게는 자가면역질병을 초래하기 때문이다. 특히 A형 혈우병 환자는 그들의 FVIII 유전자에서 유전적 결함을 가지는데, 이는 면역계가 "자기" 항원으로서 투여된 FVIII 단백질을 인식하지 못하는 것에 대한 원인이 된다. 따라서, FVIII 단백질이 응고 인자 대체 치료 동안 투여될 때, 환자의 면역계는 외래 항원으로서 또는 변경된 자기 단백질로서 FVIII 단백질을 인식하며, 따라서 항-FVIII 항체를 발생시킨다.
FVIII 억제제, 즉, 항-FVIII 항체는 FVIII 특이적 B 세포로부터 유래된 혈장 세포에 의해 생성된다. B 세포는 활성화된 CD4+ T-세포를 증식시키고, 혈장 세포를 생성하는 항-FVIII 항체로 분화시키는데 도움을 필요로 한다. 예를 들어, FVIII 단백질은 상이한 방법으로 B 및 T 림프구에 의해 인식된다. 항-FVIII 항체의 유도는 T 헬퍼 세포 의존적이다. B 세포는 그것의 특이적 B 세포 수용체를 통해 전체 단백질 에피토프를 인식한다. 다른 한편으로, T 세포는 항원 존재 세포의 표면상에 존재하는 MHC 클래스 II 분자와 복합체화된 처리된 펩타이드의 형태로 단백질을 인식한다. 각각의 CD4+ T-세포는 단지 하나의 특이적 펩타이드-MHC 복합체를 인식한다. T-세포에 펩타이드를 제공하기 위하여, MHC 클래스 II 분자는 다양한 길이의 펩타이드가 세포 표면에 맞도록 하며, 세포 표면상에 제공되는 개방 결합 그루브를 가진다. 게다가, MHC 클래스 II 단백질은 다양한 단상형(haplotype)과 상이한 4개의 결합 포켓을 함유한다(Jones et al., Nature Rev. Immunol. 6:271-282 (2006)). 특이적 아미노산만이 이들 결합 포켓에 꼭 들어맞으며, 결합 펩타이드의 최소 크기는 9개의 아미노산이다. 특히, 상이한 MHC 클래스 II 단상형은 상이한 펩타이드가 존재할 수 있다. 따라서, 환자의 MHC 클래스 II 단상형은 항-FVIII 항체의 발생 위험에 영향을 미칠 가능성이 있다. 게다가, 몇몇 연구는 항-FVIII 항체 발생의 증가된 위험과 인간 MHC 클래스 II 단상형 HLA-DRB1*1501의 상호관련이 있다는 것을 나타내었다(Pavlova et al., J. Thromb. Haemost. 7:2006-2015 (2009); Oldenburg et al., Thromb. Haemost. 77:238-242 (1997); Hay et al., Thromb. Haemost. 77:234-237 (1997)).
특정 접근은 FVIII 단백질의 투여에 의해 혈우병을 처리하는 것과 관련된 시험감염을 처리하기 위하여 탐구되었다. 예를 들어, WO 03/087161은 변형된 FVIII 단백질을 개시하는데, 여기서 FVIII 단백질의 면역 특징은 단백질 상에 존재하는 잠재적인 T-세포 에피토프의 수를 감소시키거나 또는 제거함으로써 변형된다. FVIII 단백질을 따라 T-세포 에피토프를 포함하는 다수의 영역은 예를 들어 FVIII2030-2044를 포함하여 확인되었다. 개시내용에 따라, 이러한 영역의 제거는 항-FVIII 항체의 생성을 유도하지 않는 기능성 FVIII 단백질을 제공하기 위하여 사용될 수 있었다. 또한 WO 09/071886은, 예를 들어 FVIII475-495, FVIII542-562, FVIII1785-1805 및 FVIII2158-2178과 같이 환자의 면역 반응에 수반된 HLA-DR2 결합 펩타이드를 생기게 하는 것으로 예측되는 FVIII 단백질의 특이적 영역을 개시한다. 펩타이드는 환자에서 면역 관용(immune tolerance)을 유도하는 것에 가능한 용도에 대해 확인되었다.
면역 반응에 수반된 FVIII 단백질의 영역을 확인하는 것에서 진보가 있었지만, 예를 들어 A형 혈우병 환자를 치료하는데 사용될 수 있는 다른 치료적 펩타이드 및 방법을 개발하기 위하여 사용될 수 있는 FVIII 단백질의 다른 영역을 확인할 필요는 여전히 존재한다.
본 발명은 FVIII 분자에 대한 면역 반응에 관련된 FVIII 단백질 영역의 확인에 기반한다. 더 구체적으로는, FVIII 단백질의 영역을 포함하는 FVIII 펩타이드는, 예를 들어 A형 혈우병 환자에서 인간 FVIII에 대해 관용을 유도하기 위하여 사용될 수 있다. 더 나아가, FVIII 펩타이드는 대체치료 동안 및 면역 관용 유도치료 동안 A형 혈우병 환자를 모니터링하기 위한 면역진단적 목적을 위하여 사용될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 치료가 필요한 피험체에서 FVIII에 대해 면역 관용을 유도하는 방법을 제공하며, 해당 방법은 (R1)x-P-(R2)y로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 치료적 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 식 중, P는 서열번호 10, 68, 344 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이며; R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 10의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 10의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 68의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 68의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 68의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, x는 0이고 y는 1이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 피험체에서 항-FVIII 항체의 발생을 방지한다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 피험체에서 존재하는 항-FVIII 항체의 양을 감소시킨다.
한 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 (R1)x-P-(R2)y로 이루어진 펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이며; R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 10의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 10의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 68의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 68의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 68의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 344의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, P는 서열번호 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 동일한 아미노산 서열이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, x는 0이고, y는 1이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다.
상기 제공된 펩타이드의 한 실시형태에서, 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다.
한 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 제공된 조성물의 한 실시형태에서, 조성물은 약제학적 투여를 위해 조제된다.
상기 제공된 조성물의 한 실시형태에서, 조성물은 제2 폴리펩타이드를 추가로 포함하되, 제2 폴리펩타이드는 아미노산 서열 (R1)x-P-(R2)y로 이루어지고, 상기 식 중, P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이며; R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
한 양태에서, 본 발명은 FVIII 펩타이드의 제조방법을 제공하며, 해당 방법은: a) 제24항 내지 제41항 중 어느 한 항의 FVIII 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포의 배양물을 제공하는 단계; 및 b) 세포 배양물에서 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 FVIII 펩타이드-특이적 T 세포를 확인하기 위한 방법을 제공하며, 해당 방법은: a) MHC 클래스 II 멀티머(multimer)와 복합체화된 펩타이드와 다수의 CD4+ T 세포를 조합하는 단계; 및 b) MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된 펩타이드에 특이적인 다수의 CD4+ T 세포의 구성원 중 적어도 하나를 확인하는 단계를 포함하되, 해당 펩타이드는 제24항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 FVIII 펩타이드이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, MHC 클래스 II 멀티머는 MHC 클래스 II 테트라머이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 펩타이드 또는 MHC 클래스 II 멀티머는 검출가능한 모이어티(moiety)를 추가로 포함한다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 해당 방법은 펩타이드에 특이적인 적어도 하나의 CD4+ T 세포를 분리시키는 단계를 추가로 포함한다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, CD4+ T 세포는 유세포 분석기를 사용하여 분리된다.
한 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 바와 같은 FVIII 펩타이드 및 제2 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 제2 펩타이드는 리포터 펩타이드(reporter peptide)이다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, 융합 단백질은 핵산에 의해 암호화된다.
상기 제공된 방법의 한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 제2 펩타이드에 화학적으로 연결된다.
한 양태에서, 본 명세서에 제공된 FVIII 펩타이드는 FVIII 억제제 발생의 방지를 위한 인간 FVIII에 대해 면역 관용을 유도하기 위하여 사용된다.
한 양태에서, 본 명세서에 제공된 FVIII 펩타이드는 확립된 FVIII 억제제로 환자의 치료를 위해 인간에 대해 FVIII에 대한 관용을 유도하기 위하여 사용된다.
한 양태에서, 본 명세서에 제공된 FVIII 펩타이드는 대체 치료 동안 또는 면역 관용 유도 치료 동안 환자의 면역 모니터링에서 FVIII 특이적 T 세포(예를 들어 MHC 클래스 II 멀티머 또는 MHC 클래스 II 테트라머)의 직접적 염색에 적합한 시약을 만들기 위해 사용된다.
한 양태에서, 본 명세서에 제공된 FVIII 펩타이드는 항원 특이적 T 세포를 확인하기 위하여 사용된다. 한 실시형태에서, 이들 시약은 시험관내 및 생체밖 세팅에서 FVIII 특이적 T 세포를 추적하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 이들 시약은 FVIII 특이적 T 세포를 분리하고 추가로 특성규명(characterize)하기 위하여 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 형광 활성 세포 분류(fluorescent activated cell sorting, FACS) 또는 단일 세포 PCR이 이들 목적을 위해 사용될 수 있다.
한 양태에서, 본 명세서에 제공된 FVIII 펩타이드는 면역 관용 유도 치료 동안 FVIII 특이적 T 세포의 면역 모니터링을 위해 사용된다.
한 양태에서, 본 명세서에 제공된 FVIII 펩타이드는 FVIII 처리 동안 FVIII 특이적 T 세포의 면역 모니터링을 위하여 사용된다.
한 양태에서, 본 명세서에 제공된 FVIII 펩타이드는 FVIII 억제제 방지를 위한 새로운 면역 조절제의 임상적 개발 동안 FVIII 특이적 T 세포의 면역진단을 위하여 사용된다.
I. 도입
본 발명은, 예를 들어 A형 혈우병 환자에서 FVIII 단백질에 대한 관용을 유도하기 위해 사용될 수 있는 인자 VIII(FVIII) 펩타이드에 관한 것이다. 더 나아가, 펩타이드는 대체 치료 동안 및 면역 관용 유도 치료 동안 A형 혈우병 환자에서 FVIII-특이적 T 세포를 모니터링하기 위한 면역진단적 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 FVIII, 구체적으로는 FVIII102-122, FVIII246-266 및 FVIII1401-1424의 몇몇 영역이 인자 VIII 대체 치료 동안 FVIII 단백질에 대해 시작된 면역 반응에 수반되거나 또는 획득된 혈우병과 관련된다는 발견에 부분적으로 기반한다. 확인된 영역의 아미노산 서열은 각각 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68) 및 QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)이다. 본 발명은 이들 FVIII 단백질 영역 및 FVIII 단백질에 대한 면역 반응에 대한 그것의 관계의 첫 번째 확인을 제공한다.
본 발명의 펩타이드는 환자의 면역 반응에 수반된 T 세포에 의해 인식될 수 있는 T 세포 에피토프를 생성하기 위하여 MHC 클래스 II 분자와 복합체화된 영역 FVIII102-122, FVIII246-266 및 FVIII1401-1424의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드는 FVIII102-122, FVIII246-266 또는 FVIII1401-1424에서 9개의 연속적 아미노산에 대응하는 적어도 9개의 연속적 아미노산을 포함한다. 이하에 추가로 기재되는 바와 같이, 본 명세서에 제공된 펩타이드는 또한 길이로 9개 이상의 아미노산의 펩타이드뿐만 아니라 FVIII102-122, FVIII246-266 및 FVIII1401-1424 서열의 변이체를 포함한다. 본 발명의 펩타이드의 이러한 확인은 A형 혈우병과 같은 혈액 응고와 관련된 질병을 치료하기 위하여 설계된 치료적 전략을 개선시키고 진전시키는 것에서 영향을 가질 수 있다.
II. 정의
용어 "인자 VIII 단백질" 또는 "FVIII 단백질"은 B 도메인의 적어도 일부를 갖고, 천연 인간 FVIII 단백질과 관련된 생물학적 활성을 나타내는 임의의 FVIII 분자를 지칭한다. FVIII 분자는 전장 FVIII일 수 있다. FVIII 분자는 또한 천연 FVIII의 상보적으로 변형된 변이체일 수 있다. FVIII 단백질은 인간 혈장으로부터 유래될 수 있거나 또는 재조합 유전자조작 기법에 의해 생성될 수 있다. FVIII 단백질의 추가적인 특징은, 예를 들어 본 명세서에 참조로서 포함되는 미국 특허 제2010/0168018호의 단락 [0042]-[0055]에서 찾을 수 있다.
용어 "인자 VIII 펩타이드" 또는 "FVIII 펩타이드"는 FVIII에 대한 면역 반응에서 중요한 것으로 발견된 FVIII 단백질의 영역에 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 본 명세서에 기재된 펩타이드를 지칭한다. FVIII 펩타이드는 면역 반응에 수반된 T 세포의 제시를 위해 MHC 클래스 II 단백질과 복합체화되는 적어도 9개의 아미노산을 포함한다. 추가적인 아미노산은 펩타이드의 적어도 9개의 아미노산 코어의 양 말단 중 하나에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 천연 인간 FVIII 단백질의 특정 영역과 동일한 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 FVIII 단백질의 상보적으로 변형된 변이체일 수 있다. 본 명세서에 추가로 기재되는 바와 같이, FVIII 펩타이드는 천연 인간 FVIII 단백질 영역의 서열에 대해, 예를 들어 85% 동일한 특정 백분율 동일성에 의해 특성규명될 수 있다.
용어 "아미노산"은 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 포함하는 자연적으로 발생하는 및 비-천연의 아미노산을 지칭한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 유전자 코드뿐만 아니라 이후에 변형되는 아미노산에 의해 암호화되는 것, 예를 들어 하이드록시프롤린, y-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린을 포함한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은, 예를 들어 D- 및 L-아미노산을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 아미노산은 또한 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산 유사체는 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 염기의 화학적 구조, 즉, 수소, 카복실기, 아미노기 및 R 기, 예를 들어 호모세린, 놀류신, 메티오닌, 설폭사이드 또는 메티오닌 메틸 설포늄에 결합되는 임의의 탄소를 갖는 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 놀류신) 또는 변형된 펩타이드 백본을 가지지만, 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 염기의 화학적 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적 화학적 구조와 상이한 구조를 가지지만, 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 지칭한다. 아미노산은 그것의 보통 알려진 3글자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 추천되는 1-글자 기호에 의해 본 명세서에서 지칭될 수 있다. 마찬가지로 뉴클레오타이드는 그것의 보통 받아들여지는 1-글자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
"상보적으로 변형된 변이체"는 아미노산과 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열에 대해, 상보적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 해당 핵산, 또는 핵산이 본질적으로 동일한 서열에 대해 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우를 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴 때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 주어진 펩타이드를 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 구체화되는 모든 위치에서, 코돈은 암호화된 폴리펩타이드를 변경하지 않고 기재된 대응하는 코돈 중 어떤 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변형은 "침묵 변형"인데, 이는 상보적으로 변형된 변형의 한 종류이다. 또한 폴리펩타이드를 암호화하는 본 명세서의 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변형을 기재한다. 당업자라면 핵산에서 각 코돈(보통 단지 메티오닌에 대한 코돈인 AUG 및 보통 단지 트립토판에 대한 코돈인 TGG를 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 수득할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 각 침묵 변형은 발현 생성물에 대해 각각 기재된 서열에 내포되지만, 실제 프로브 서열에 대해서는 아니다.
아미노산 서열에 대해, 당업자라면 암호화된 서열 내 아미노산의 단일 아미노산 또는 적은 백분율을 변경하고, 첨가하거나 또는 결실시키는 핵산 또는 펩타이드 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 첨가는, 변경이 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산의 차환을 초래하는 경우, "상보적으로 변형된 변이체"라는 것을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 상보적 치환 표는 당업계에 잘 공지되어 있다. 이러한 상보적으로 변형된 변이체가 추가되며, 다형성 변이체, 종간 상동성 및 본 발명의 대립유전자를 제외하지 않는다.
다음의 8개 그룹은 각각 서로 상보적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글라이신(G); 2) 아스팔트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 알기닌(R), 리신(K); 5) 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M). 예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins (1984)]을 참조한다.
2 이상의 핵산 또는 펩타이드 서열의 내용에서 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은 이하에 기재되는 디폴트 변수에 의한 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 또는 조작 정렬 및 시각적 검사에 의해 측정된 바와 같이 동일하거나 또는 동일한(즉, 비교창 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 대응도로 비교되고 정렬될 때 특정된 영역에 걸쳐 약 60% 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 구체화된 백분율을 갖는 2 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다.
본 명세서에서 "치료적 유효량 또는 치료적 용량" 또는 "충분량 또는 충분한 용량"은 투여되는 효과를 생성하는 용량을 의미한다. 정확한 용량은 치료 목적에 의존할 것이며, 공지된 기법을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, 문헌[Augsburger & Hoag, Pharmaceutical Dosage Forms(vols. 1-3, 3rd Ed. 2008); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(3rd Ed., 2008); Pickar, Dosage Calculations (8th Ed., 2007); 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., 2005, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins] 참조).
III. FVIII 펩타이드
본 발명은 FVIII에 대한 면역 반응에 수반된 FVIII 단백질의 영역에 대응하는 FVIII 펩타이드에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 다음의 아미노산 서열중 하나에서 9개의 연속적 아미노산과 적어도 85% 동일한 9개의 아미노산의 연속적 서열로 이루어진 FVIII 펩타이드를 제공하되: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68); QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344); 또는 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740), 해당 펩타이드는 9 내지 180개의 아미노산으로 이루어진다.
구체적 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 서열 (R1)x-P-(R2)y를 가지며, 상기 식 중, P는 서열번호 68, 344 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 한 실시형태에서, R1은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
일반적으로, 본 발명의 FVIII 펩타이드는 FVIII102-122, FVIII246-266 또는 FVIII1401-1424의 확인된 영역에 존재하는 임의의 아미노산 서열 또는, 예를 들어 FVIII102-122, FVIII246-266 또는 FVIII1401-1424와 유사하거나 도는 동일한 보유 기능을 가질 수 있는 변형된 변이체를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 FVIII 펩타이드는 T 세포 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. FVIII 펩타이드는 아미노산 서열 AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68); QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344); 또는 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740)에 대해 동일성 백분율의 범위에 있을 수 있는 적어도 9개의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, FVIII 펩타이드는 FVIII102-122, FVIII246-266 또는 FVIII1401-1424에서 9개의 연속적 아미노산 중 어떤 것과 동일하거나 또는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 85% 동일한 백분율의 9개의 아미노산을 가질 수 있다.
실시형태의 다른 그룹에서, FVIII 펩타이드는 9개 아미노산 초과의 아미노산 서열을 가질 수 있는데, 여기서 아미노산 서열은 FVIII102-122, FVIII246-266 또는 FVIII1401-1424의 연속적 아미노산의 서열과 동일하거나 또는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 백분율일 수 있는 영역을 포함한다. 당업자라면 알라닌 치환과 같은 공지된 돌연변이유발 기법이 FVIII102-122, FVIII246-266 또는 FVIII1401-1424 영역의 기능을 보유하는 변형된 변이체를 확인하기 위하여 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
추가로, FVIII 펩타이드는 상기 논의한 FVIII 펩타이드의 코어 서열의 말단 중 하나 상에서 추가적인 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 추가적인 서열은 지정된 (R1)x 및 (R2)y이다. 특정 실시형태에서, R1 및 R2는 길이로 1 내지 약 80개의 아미노산의 범위에 있을 수 있다. 대안적으로, R1 및 R2는 길이로 1 내지 약 40개의 아미노산의 범위에 있을 수 있다. 특정 실시형태에서, 각각의 아래첨자 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1이다. 양 말단 중 하나 상에서 추가적인 아미노산은 펩타이드의 증가된 안정성, MHC 클래스 II 분자 및/또는 T 세포에 대한 개선된 결합뿐만 아니라 당업자에 의해 인식될 다른 양태를 포함하는 다양한 이유로 첨가될 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 (R1)x-P-(R2)y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 표 1에서 확인되는 인자 VIII 영역의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 대안적으로, R1 및 R2는 길이로 1 내지 40개의 아미노산의 범위에 있을 수 있다. 한 실시형태에서, P는 표 1에서 확인된 인자 VIII 영역의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, P는 표 1에서 확인된 인자 VIII 영역의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다. 한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다.
Figure 112019110853260-pat00001
상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 FVIII 펩타이드는 FVIII1401-1424의 확인된 영역에 존재하는 임의의 아미노산 서열 또는 예를 들어 FVIII1401-1424와 유사하거나 또는 동일한 보유 기능을 가질 수 있는 변형된 변이체를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 펩타이드는 인간 FVIII 단백질의 전체 B-도메인을 다룰 수 있다. 본 발명은 또한 다음의 아미노산 서열 중 어떤 하나에 대해 동일성 백분율의 범위에 있을 수 있는 적어도 9개의 아미노산의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 다른 FVIII 펩타이드를 포함할 수 있다: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(FVIII474-494; 서열번호 159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(FVIII540-560; 서열번호 250), EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(FVIII1785-1805; 서열번호 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (FVIII2025-2045; 서열번호 568), NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (FVIII2160-2180; 서열번호 659), TVVITLKNMASHPVSLHA(FVIII102-119; 서열번호 10), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (FVIII246-266; 서열번호 68) 및 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(FVIII102-122; 서열번호 740).
예를 들어, FVIII 펩타이드는 FVIII474-494, FVIII540-560, FVIII1785-1805, FVIII2025-2045, FVIII2160-2180, FVIII102-119, FVIII246-266 또는 FVIII102-122 내 9개의 연속적 아미노산 중 어떤 것과 동일하거나 또는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 85% 동일한 9개의 아미노산을 가진다. 실시형태의 다른 그룹에서, FVIII 펩타이드는 9개 아미노산 초과의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 여기서 아미노산 서열은 FVIII474-494, FVIII540-560, FVIII1785-1805, FVIII2025-2045, FVIII2160-2180, FVIII102-119, FVIII246-266 또는 FVIII102-122 내 9개의 연속적 아미노산 중 어떤 것과 동일하거나 또는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99 동일할 수 있다. 당업자라면 알라닌 치환과 같은 공지된 돌연변이유발기법이 FVIII474-494, FVIII540-560, FVIII1785-1805, FVIII2025-2045, FVIII2160-2180, FVIII102-119, FVIII246-266 또는 FVIII102-122 영역의 기능을 보유하는 변형된 변이체를 확인하기 위하여 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 명세서에 개시된 FVIII 펩타이드는 FVIII1401-1424에 관한 FVIII 펩타이드에 대해 상기 기재한 방법을 사용하여 만들어질 수 있다.
A. 인자 VIII 102-119 펩타이드
한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R1)x-P-(R2)y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열 TVVITLKNMASHPVSLHA(서열번호 10)을 갖는 인자 VIII102-119 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
한 실시형태에서, P는 서열 TVVITLKNMASHPVSLHA(서열번호 10)을 갖는 인자 VIII102-119 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 1 내지 55(서열번호 10)로부터 선택된 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 1 내지 55로부터 선택된 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 1 내지 55로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80 개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
특정 실시형태에서, R1은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, R2는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산을 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
Figure 112019110853260-pat00002
Figure 112019110853260-pat00003
B. 인자 VIII 246-266 펩타이드
한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R1)x-P-(R2)y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68)을 갖는 인자 VIII246-266 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
한 실시형태에서, P는 서열: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68)을 갖는 인자 VIII246-266 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68)를 갖는 인자 VIII246-266 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 56 내지 146으로부터 선택되는 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 56 내지 146으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 56 내지 146으로부터 선택되는 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 56 내지 146으로부터 선택되는 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
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Figure 112019110853260-pat00005
Figure 112019110853260-pat00006
C. 인자 VIII 474-494 펩타이드
한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R1)x-P-(R2)y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(서열번호 159)을 갖는 인자 VIII474-494 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
한 실시형태에서, P는 서열: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(서열번호 159)를 갖는 인자 VIII474-494 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(서열번호 159)를 갖는 인자 VIII474-494 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 147 내지 237로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 147 내지 237로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 147 내지 237로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 147 내지 237로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.
특정 실시형태에서, R1은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
Figure 112019110853260-pat00007
Figure 112019110853260-pat00008
Figure 112019110853260-pat00009
D. 인자 VIII 540-560 펩타이드
한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R1)x-P-(R2)y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 P는 서열: PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(서열번호 250)을 갖는 인자 VIII540-560 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, 각각의 x 및 y는 0 또는 1이다.
한 실시형태에서, P는 서열: PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(서열번호 250)을 갖는 인자 VIII540-560 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열: PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(서열번호 250)을 갖는 인자 VIII540-560 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 238 내지 328로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 238 내지 328로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 238 내지 328로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 238 내지 328로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
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Figure 112019110853260-pat00011
E. 인자 VIII 1401-1424 펩타이드
한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R1)x-P-(R2)y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)을 갖는 인자 VIII1401-1424 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
한 실시형태에서, P는 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)을 갖는 인자 VIII1401-1424 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)을 갖는 인자 VIII1401-1424 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 329 내지 464로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 329 내지 464로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 329 내지 464로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 329 내지 464로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
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F. 인자 VIII 1785-1805 펩타이드
한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R1)x-P-(R2)y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(서열번호 477)을 갖는 인자 VIII1785-1805 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 한 실시형태에서, P는 서열: EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(서열번호 477)을 갖는 인자 VIII1785-1805 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, P는 서열: EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(서열번호 477)을 갖는 인자 VIII1785-1805 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 465 내지 555로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 465 내지 555로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 465 내지 555로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 465 내지 555로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
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G. 인자 VIII 2025-2045 펩타이드
한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R1)x-P-(R2)y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(서열번호 568)를 갖는 인자 VIII2025-2045 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
한 실시형태에서, P는 서열: LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(서열번호 568)를 갖는 인자 VIII2025-2045 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열: LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(서열번호 568)을 갖는 인자 VIII2025-2045 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 556 내지 646으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 556 내지 646으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 556 내지 646으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 556 내지 646으로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
Figure 112019110853260-pat00019
Figure 112019110853260-pat00020
H. 인자 VIII 2160-2180 펩타이드
한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R1)x-P-(R2)y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(서열번호 659)를 갖는 인자 VIII2160-2180 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이며, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
한 실시형태에서, P는 서열: NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(서열번호 659)을 갖는 인자 VIII2160-2180 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열: NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(서열번호 659)를 갖는 인자 VIII2160-2180 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 647 내지 737로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 647 내지 737로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 647 내지 737로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 647 내지 737로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
Figure 112019110853260-pat00021
Figure 112019110853260-pat00022
Figure 112019110853260-pat00023
I. 인자 VIII 102-122 펩타이드
한 실시형태에서, 본 발명은 서열 (R1)x-P-(R2)y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740)을 갖는 인자 VIII102-122 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
한 실시형태에서, P는 서열: TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740)를 갖는 인자 VIII102-122 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열: TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740)를 갖는 인자 VIII102-122 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
본 발명의 내용에서, FVIII102-122 펩타이드는 또한 FVIII102-119 펩타이드를 포함한다. 따라서, 한 실시형태에서, P는 서열번호 1 내지 55 및 738 내지 773으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 가지는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 1 내지 55 및 738 내지 773으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 가지는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 1 내지 55 및 738 내지 773으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 가지는 아미노산 서열이다. 한 실시형태에서, P는 서열번호 1 내지 55 및 738 내지 773으로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 1일 수 있고, y는 0일 수 있다. 다른 실시형태에서, x는 0일 수 있고, y는 1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1일 수 있다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
Figure 112019110853260-pat00024
IV. FVIII 펩타이드의 생성방법
다른 양태에서, 본 발명은 추가로 FVIII 펩타이드의 생성 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 FVIII 펩타이드는 당업계에 일반적으로 공지된 고체상(예를 들어, Fmoc 또는 t-Boc) 또는 액체상 합성 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chan & White, Eds., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Oxford University Press, 2000); Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis (CRC Press, 2005); Howl, Peptide Synthesis and Applications (Humana Press, 2010)]을 참조한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 a) 고체상 또는 액체상 합성 기법을 사용하여 펩타이드를 합성하는 단계를 포함하는 FVIII 펩타이드의 제조 방법을 포함하며, FVIII 펩타이드는 서열: (R1)x-P-(R2)y를 가지되, 상기 식 중, P는 서열번호 68, 344 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 한 실시형태에서, R1은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, R2는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 특정 실시형태에서, 펩타이드는 인간 FVIII 단백질의 전체 B-도메인을 다룰 수 있다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
다른 실시형태에서, 펩타이드는 재조합 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 하기의 a) FVIII 펩타이드를 암호화하는 벡터를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계를 포함하는 FVIII 펩타이드의 제조 방법을 포함하며, FVIII 펩타이드는 서열: (R1)x-P-(R2)y를 가지되, 상기 식 중, P는 서열번호 68, 344 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 한 실시형태에서, R1은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, R2는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 특정 실시형태에서, 펩타이드는 인간 FVIII 단백질의 전체 B-도메인을 다룰 수 있다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, 본 발명은 a) FVIII 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포의 배양물을 제공하는 단계, 및 b) 세포 배양물에서 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 FVIII 펩타이드의 제조방법을 제공하되, 펩타이드는 서열: (R1)x-P-(R2)y를 가지되, 상기 식 중, P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이며, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
FVIII 펩타이드의 생성을 위한 방법의 한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
본 발명의 FVIII 펩타이드는 적합한 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에서 발현에 의해 생성될 수 있다. 진핵 세포의 예는, 제한 없이, 포유류 세포, 예컨대 CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep 및 HepG2; 곤충 세포, 예를 들어 SF9 세포, SF21 세포, S2 세포 및 하이 파이브(High Five) 세포; 및 효모 세포, 예를 들어 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 세포를 포함한다. 한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 포유류 세포 등에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드는 인간 세포주, 햄스터 세포주 또는 뮤린 세포주에서 발현될 수 있다. 하나의 특정 실시형태에서, 세포주는 CHO, BHK 또는 HEK 세포주이다.
매우 다양한 벡터가 FVIII 펩타이드의 발현을 위해 사용될 수 있고, 진핵 및 원핵 발현 벡터로부터 선택될 수 있다. 벡터는 본 명세서에 개시된 FVIII 펩타이드 중 적어도 하나의 발현에 필요한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 것이다. 원핵세포 발현에 대한 벡터의 예는 pRSET, pET, pBAD 등과 같은 플라스미드를 포함하되, 원핵세포 발현 벡터에 사용된 프로모터는 lac, trc, trp, recA, araBAD 등을 포함한다. 진핵세포 발현을 위한 벡터의 예는 (i) 효모에서 발현에 대해, AOX1, GAP, GAL1, AUG1 등과 같은 프로모터를 사용하는 pAO, pPIC, pYES, pMET와 같은 벡터; (ii) 곤충 세포에서 발현에 대해, PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh 등과 같은 프로모터를 사용하여 pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC와 같은 벡터, 및 (iii) 포유류 세포에서 발현에 대해, CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV 및 β-액틴과 같은 프로모터를 사용하는, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV 등과 같은 벡터, 및 백시니아 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 포진 바이러스, 레트로바이러스 등과 같은 바이러스 시스템으로부터 유래된 벡터를 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, FVIII 펩타이드를 생성하기 위한 핵산 서열은 단백질의 제어된 발현에 적합한 다른 서열, 예컨대 프로모터 서열, 인핸서, TATA 박스, 전사 개시 부위, 폴리링커, 제한부위, 폴리-A-서열, 단백질 처리 서열, 선택 마커 등을 추가로 포함하며, 이들은 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다.
FVIII 펩타이드를 생성하는 세포에 대해 사용되는 배양 배지는 당업계에 잘 공지된 적합한 기본 배지, 예를 들어, DMEM, 함스 F12(Ham's F12), 배지 199(Medium 199), 맥코이(McCoy) 또는 RPMI에 기반할 수 있다. 기본 배지는 아미노산, 비타민, 유기 및 무기염 및 탄수화물 공급원을 포함하는 다수의 성분을 포함할 수 있다. 각 성분은 세포 배양을 지탱하는 양으로 존재할 수 있으며, 이러한 양은 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 배지는 완충 물질, 예를 들어 탄산수소나트륨, 항산화제, 기계적 응력에 대응하는 안정제 또는 프로테아제 억제제와 같은 보조 물질을 포함할 수 있다. 필요하다면, 비-이온성 계면활성제, 예컨대 공중합체 및/또는 폴리에틸렌 글라이콜과 폴리프로필렌 글라이콜의 혼합물이 첨가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 배양 배지는 외인성으로 첨가된 단백질이 없다. "단백질이 없는" 및 관련된 용어는 성장하는 동안 단백질이 자연적으로 없어지는 배양물 내 세포에 대해 또는 배양물 내 세포 이외의 외인성 공급원으로부터 유래된 단백질을 지칭한다. 다른 실시형태에서, 배양배지는 폴리펩타이드가 없다. 다른 실시형태에서, 배양 배지는 혈청이 없다. 다른 실시형태에서 배양 배지는 동물 단백질이 없다. 다른 실시형태에서 배양 배지는 동물 성분이 없다. 다른 실시형태에서,배양 배지는 단백질, 예를 들어, 우태아혈청과 같은 혈청으로부터의 동물 단백질을 함유한다. 다른 실시형태에서, 배양물은 외인성으로 첨가된 재조합 단백질을 가진다. 다른 실시형태에서, 단백질은 증명된 병원체가 없는 동물로부터 유래된다.
동물 단백질이 없고, 화학적으로 한정된 배양 배지의 제조방법은 당업계, 예를 들어 미국 특허 2008/0009040호 및 미국 특허 2007/0212770호에서 공지되며, 이는 둘 다 모든 목적을 위해 본 명세서에 포함된다. 한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 사용되는 배양 배지는 단백질이 없거나 또는 올리고펩타이드가 없는 배지이다. 특정 실시형태에서, 배양배지는 화학적으로 한정될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "화학적으로 한정된"은, 배지가 예를 들어 동물 성분, 기관, 선, 식물 또는 효모와 같은 임의의 한정되지 않은 보충물을 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 화학적으로 한정된 배지의 각 성분은 정확하게 정해진다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 예를 들어 배치(batch)-방식, 반-배치 방식, 유가식 배치 방식 또는 연속적 방식으로 작동되는 세포-배양 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 배치 배양물은 세포 접종물이 탱크 또는 발효기에서 최대 밀도로 배양되고, 배치로서 채취되며 처리되는 대규모 세포 배양물일 수 있다. 유가식 배치 배양물은 신선한 영양분(예를 들어 성장-제한 물질) 또는 첨가물(예를 들어 생성물에 대한 전구체) 중 하나와 함께 공급된 배치 배양물일 수 있다. 유가식-배치 배양물은 신선한 영양분(예를 들어, 성장-제한 물질) 또는 첨가물(예를 들어, 생성물에 대한 전구체) 중 하나와 함께 공급된 배치 배양물일 수 있다. 연속적 배양물은 신선한 배지의 유입에 의해 영양분과 함께 연속적으로 공급된 현탁 배양물일 수 있되, 배양물 용적은 보통 일정하다. 유사하게, 연속적 발효는 세포 또는 미생물 유기체가 생물반응기로부터 세포 현탁액의 제거에 의해 정확하게 균형 잡히는 신선한 배지의 연속적 첨가에 의한 기하급수적 성장단계로 배양물에서 유지되는 과정을 지칭한다. 더 나아가, 교반-탱크 반응기 시스템은 현탁액, 관류, 물질환경조절장치(chemostatic) 및/또는 마이크로담체 배양물에 대해 사용될 수 있다. 일반적으로, 교반-탱크 반응기 시스템은 러쉬튼(Rushton), 수중날개(hydrofoil), 경사 블레이트 또는 마린(marine)과 같은 교반기 중 어떤 형태와 함께 임의의 통상적인 교반-탱크 반응기로서 작동될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 세포 배양 방법은 마이크로담체의 사용을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 실시형태의 고용적-특이적 배양물 표면적을 제공하기에 적합한 조건 하에서 거대 생물반응기 내에서 수행되어 세포-배양물은 높은 세포 밀도 및 단백질 발현을 달성할 수 있다. 이러한 성장 조건을 제공하기 위한 한 수단은 교반 탱크 생물반응기 내 세포 배양물에 대해 마이크로담체를 사용하는 것이다. 마이크로담체 상에서 세포성장의 개념은 반 베즐(van Wezel)(van Wezel, A.L., Nature 216:64-5 (1967))에 의해 처음으로 기재되었으며, 이는 성장 배지에서 현탁된 작은 고체 입자의 표면 상에 세포를 부착시킨다. 이 방법은 고표면-대-용적 비를 제공하며, 따라서 영영분 이용을 효율적으로 하게 한다. 더 나아게, 진핵 세포주에서 분비된 단백질의 발현에 대해, 증가된 표면-대-용적비는 더 높은 분비 수준을 허용하고, 따라서 배양물의 상청액에서 더 높은 단백질 수율을 허용한다. 최종적으로, 이들 방법은 진핵 세포 발현 배양물을 용이하게 정률증가시킨다.
FVIII 펩타이드를 발현시키는 세포는 세포 배양물 성장 동안 구형 또는 다공성 마이크로담체에 결합될 수 있다. 마이크로담체는 덱스트란, 콜라겐, 플라스틱, 젤라틴 및 셀룰로스 및 기타에 기반한 마이크로담체의 군으로부터 선택된 마이크로담체일 수 있다. 또한 그것들이 최종 발효기 바이오매스에 도달되었을 때 및 다공성 마이크로담체 상에서 발현된 단백질의 생성 전 또는 그 반대로 구형 마이크로담체 및 계대배양(subculture) 상의 바이오매스에 대해 세포를 성장시키는 것이 가능하다. 적합한 구형 마이크로담체는 Cytodex(상표명) 1, Cytodex(상표명) 2 및 Cytodex(상표명) 3(GE Healthcare)와 같은 평활 표면 마이크로담체 및 Cytopore(상표명) 1, Cytopore(상표명) 2, Cytoline(상표명) 1 및 Cytoline(상표명) 2(GE Healthcare)와 같은 거대다공성 마이크로담체를 포함할 수 있다.
당업자라면 상기 기재한 합성 및/또는 재조합 방법에 의해 생성된 FVIII 펩타이드가 천연 및/또는 비-천연 아미노산, 예를 들어 아미노산 유사체 및/또는 아미노산 모방체를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
V. 면역 관용을 유도하기 위한 인자 FVIII 펩타이드 조성물
다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 FVIII 펩타이드는 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII246-266 펩타이드, 인자 VIII1401-1424 펩타이드 또는 인자 VIII102-122 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII246-266을 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII474-494 펩타이드, FVIII540-560 펩타이드, FVIII1785-1805 펩타이드, FVIII2025-2045 펩타이드, FVIII2160-2180 펩타이드, FVIII102-119 펩타이드, FVIII1401-1424 펩타이드, FVIII102-122 펩타이드 또는 제2 FVIII246-266 펩타이드를 추가로 포함한다.
[다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII1401-1424 펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII474-494 펩타이드, FVIII540-560 펩타이드, FVIII1785-1805 펩타이드, FVIII2025-2045 펩타이드, FVIII2160-2180 펩타이드, FVIII102-119 펩타이드, FVIII246-266 펩타이드, FVIII102-122 펩타이드 또는 제2 FVIII1401-1424 펩타이드를 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII102-122 펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII474-494 펩타이드, FVIII540-560 펩타이드, FVIII1785-1805 펩타이드, FVIII2025-2045 펩타이드, FVIII2160-2180 펩타이드, FVIII102-119 펩타이드, FVIII246-266 펩타이드, FVIII1401-1424 펩타이드 또는 제2 FVIII102-122 펩타이드를 추가로 포함한다.
구체적 실시형태에서, 본 발명은 서열: (R1)x-P-(R2)y를 갖는 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하되, 상기 식 중, P는 서열번호 68, 344 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 한 실시형태에서, R1은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
구체적 실시형태에서, 약제학적 조성물은 제2 폴리펩타이드를 추가로 포함하되, 제2 폴리펩타이드는 서열: (R1)x-P-(R2)y를 가지며, 상기 식 중, P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 한 실시형태에서, R1은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, R2는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, 제2 FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 제2 FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 제2 FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 제2 FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 제2 FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
A. 투여
인간 또는 시험 동물에 대해 조성물을 투여하기 위하여, 한 양태에서, 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 어구 "약제학적으로" 또는 "약리학적으로"는 안정하고, 응집 및 절단 생성물과 같이 단백질 또는 펩타이드 분해를 억제하며, 추가로 이하에 기재하는 바와 같이 잘-공지된 당업계의 경로를 사용하여 투여될 때 알레르기 또는 다른 부작용을 생성하지 않는 허용가능한 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. "약제학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 및 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡착 지연제 등을 포함한다.
약제학적 조성물은 경구로, 국소적으로, 경피적으로, 비경구로, 흡입 스프레이, 질, 직장으로 또는 두개내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 낭내 주사 또는 인퓨전 기법을 포함한다. 정맥내, 피내, 근육내, 유방내, 복강내, 척추강내, 안구후부, 폐내 주사 또는 특정 자리에 수술적 이식에 의한 투여가 마찬가지로 고려된다. 일반적으로, 조성물은 본질적으로 파이로젠(pyrogen)뿐만 아니라 수용인에게 해로울 수 있는 다른 불순물이 없다.
투약량 및 투여빈도는, 예를 들어 환자 혈우병의 중증도 및/또는 면역 관용이 더 많은 또는 더 적은 용량을 사용하여 효과적으로 유도되는지 여부를 포함하여 당업자에 의해 일반적으로 인식되는 다양한 인자에 의존할 것이다. 전형적인 1일 용량은 약 0.01 내지 100㎎/㎏의 범위에 있을 수 있다. 더 높은 매주의 용량이 적절할 수 있고/있거나 잘 관용될 수 있지만, 1주당 0.07 내지 700㎎ FVIII 펩타이드 범위의 용량이 효과적일 수 있고, 잘 관용될 수 있다. 적절한 용량을 정하는 것에서 인자를 결정하는 원칙은 특정 내용에서 치료적으로 효과적으로 되는데 필요한 특정 FVIII 펩타이드의 양이다. 더 긴 지속적 면역 관용을 달성하기 위하여 반복된 투여가 필요할 수 있다. 조성물의 1회 또는 다회 투여는 치료하는 의사에 의해 선택된 용량 수준 및 패턴에 의해 수행될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 조성물은 볼루스에 의해 투여될 수 있다. 다른 예로서, FVIII 펩타이드는 1회 용량으로서 투여될 수 있다. 당업자라면 양호한 의학적 실행 및 개개의 환자의 임상적 상태에 의해 결정되는 유효 투약량 및 투여 섭생을 용이하게 최적화할 것이다. 투약 빈도는 투여 경로에 의존한다. 최적의 약제학적 조성물은 투여 경로 및 원하는 투약량에 의존하여 당업자에 의해 결정된다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Remington the Science and Practice of Pharmacy), 21st Ed. (2005, Lippincott Williams & Wilkins)]을 참조하며, 이것의 개시는 본 명세서에 참조로서 포함된다. 이러한 조성물은 투여되는 작용제(agent)의 생리적 상태, 안정성, 생체내 방출률 및 생체내 클리어런스(clearance)률에 영향을 미친다. 투여경로에 의존하여, 적합한 용량은 체중, 체표면적 또는 기관 크기에 따라 계산된다. 적합한 투약량은 적절한 용량-반응 데이터와 함께 혈액 수준 투약량을 결정하기 위한 확립된 분석의 사용을 통해 확인될 수 있다. 최종 투약량 섭생은 약물의 작용을 변형시키는 다양한 인자, 예를 들어 약물의 특이적 활성, 손상의 중등도 및 환자의 반응, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이요법, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간 및 다른 임상적 인자를 고려하여 담당의사에 의해 결정된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 FVIII 펩타이드를 포함하는 조성물은 투여 전 동결건조된다. 동결건조는 당업계에서 흔한 기법을 사용하여 수행되며, 예를 들어 문헌[Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) 및 Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)]에 기재된 바와 같이 개발된 조성물에 대해 최적화되어야 한다. 약제학적 조성물의 제조 방법은 다음의 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 동결건조 전 혼합물에 안정화제를 첨가하는 단계, 동결건조 전 혼합물에 증량제(bulking agent), 삼투 조절제 및 계면활성제로부터 선택된 적어도 하나의 작용제를 첨가하는 단계. 한 양태에서, 동결건조된 조제물은 하나 이상의 완충제, 증량제 및 안정제이다. 이 양태에서, 동결건조 단계 동안 또는 재구성 동안 응집이 문제가 되는 경우 계면활성제의 이용성은 평가되고 선택된다. 적절한 완충제가 포함되어 동결건조 동안 pH의 안정한 구역 내에서 조제물을 유지한다.
항박테리아제의 희석 용액이 때때로 비경구 투여를 위한 약제의 생성에서 사용되지만, 동결건조 물질에 대한 표준 재구성 실행은 순수(pure water) 또는 멸균 주사용 수(water for injection, WFI)의 용적을 다시 첨가하는 것이다(전형적으로 동결건조 동안 제거된 용적과 동일). 따라서, 동결건조된 FVIII 펩타이드 조성물에 희석물을 첨가하는 단계를 포함하는, 재구성된 FVIII 펩타이드 조성물의 제조를 위한 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 동결건조된 물질은 수용액으로서 재구성될 수 있다. 다수의 수성 담체, 예를 들어 멸균 주사용 수, 다회 투약 사용을 위해 보존제가 있는 물, 또는 적절한 양의 계면활성제가 있는 물(예를 들어, 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 화합물을 함유하는 수성 현탁액). 다양한 양태에서, 이러한 부형제는 현탁제, 예를 들어 제한 없이, 카복시메틸셀룰로스나트륨, 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트래거캔스 검 및 아카시아 검이며; 분산제 또는 습윤제는 자연적으로-발생하는 포스파타이드, 예를 들어 및 제한 없이, 레시틴, 또는 알킬렌 산화물과 지방산의 축합 생성물, 예를 들어 및 제한 없이, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물, 예를 들어 및 제한 없이, 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 지방산과 헥시톨로부터 유래된 부분적 에스터와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레이트, 또는 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분적 에스터와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어 및 제한 없이, 폴리에틸렌 솔비탄 모노올레이트이다. 다양한 양태에서, 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들어 및 제한 없이, 에틸 또는 n-프로필, p-하이드록시벤조에이트를 함유한다.
VI. 치료 방법
본 발명은 추가로 A형 혈우병 또는 후천성 혈우병과 같은 FVIII 단백질과 연관된 질병을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 본 명세서에 개시된 FVIII 펩타이드 중 적어도 하나의 투여를 포함할 수 있다. 특히, FVIII 펩타이드 중 적어도 하나를 포함하는 약제학적 조성물은 환자에서 FVIII 단백질에 대한 면역 관용을 유도하기 위하여 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, FVIII에 대해 면역 관용을 유도하기 위한 방법은 FVIII의 투여 후 FVIII 억제제 발생을 방지하는 단계를 포함할 수 있다. 용어 "방지하는"는 FVIII에 대해 실질적으로 검출가능한 면역 반응이 허용되지 않는 것을 지칭한다. 예를 들어, FVIII 단백질의 투여 전 환자는 임의의 검출가능한 항-FVIII 항체를 가질 수 있다. 그러나, FVIII 단백질로 치료 후, FVIII 펩타이드가 투여되어 면역 관용을 유도하지 않는다면, 검출가능한 항-FVIII 항체의 수준은 증가될 수 있다. 본 명세서에 개시된 FVIII 펩타이드의 투여는 면역 관용을 유도할 수 있고, 이에 의해 혈우병이 있는 환자를 치료할 수 있다.
다른 실시형태에서, FVIII 단백질에 대해 면역 관용을 유도하기 위한 방법은 확립된 FVIII 억제제를 이미 갖는 환자를 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 실시형태에서, FVIII 펩타이드의 투여는 항-FVIII 항체의 존재를 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 용어 "감소한다"는 FVIII 단백질에 대한 면역 반응의 부분적 감소를 의미한다. 특정 실시형태에서, 면역 반응을 감소시키는 것은 FVIII 펩타이드의 투여 전 환자에서 면역반응 수준과 비교하여 면역 반응의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 환원%는 존재하는 FVIII 항체의 양을 결정하기 위한 표준 방법을 사용하여 FVIII 펩타이드의 투여 전 및 투여 후 혈액 내 존재하는 항-FVIII 항체의 양을 측정함으로써 분석될 수 있다. 다른 실시형태에서, 면역 반응의 감소는 FVIII 항체 또는 모두 3가지, 즉, T 세포, B 세포 및 항-FVIII 항체의 조합을 분비하는 FVIII에 특이적인 CD4+ T 세포 또는 FVIII 특이적 B 세포의 감소된 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 면역 세포, 예컨대 FVIII에 대해 특이적인 T 세포 및 B 세포는 당업계에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 분리될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 피험체에서 FVIII에 대한 면역 관용을 유도하는 방법을 포함하되, 해당 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 구체적 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII246-266 펩타이드, 인자 VIII1401-1424 펩타이드, 또는 인자 VIII102-122 펩타이드이다.
한 실시형태에서, 해당 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII246-266 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII474-494 펩타이드, FVIII540-560 펩타이드, FVIII1785-1805 펩타이드, FVIII2025-2045 펩타이드, FVIII2160-2180 펩타이드, FVIII102-119 펩타이드, FVIII1401-1424 펩타이드, FVIII102-122 펩타이드, 또는 제2 FVIII246-266 펩타이드를 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 해당 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII1401-1424 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII474-494 펩타이드, FVIII540-560 펩타이드, FVIII1785-1805 펩타이드, FVIII2025-2045 펩타이드, FVIII2160-2180 펩타이드, FVIII102-119 펩타이드, FVIII246-266 펩타이드, FVIII102-122 펩타이드, 또는 제2 FVIII1401-1424 펩타이드를 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인자 VIII102-122 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII474-494 펩타이드, FVIII540-560 펩타이드, FVIII1785-1805 펩타이드, FVIII2025-2045 펩타이드, FVIII2160-2180 펩타이드, FVIII102-119 펩타이드, FVIII246-266 펩타이드, FVIII1401-1424 펩타이드, 또는 제2 FVIII102-122 펩타이드를 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 FVIII 단백질에 대해 면역 관용을 유도하기 위한 방법을 제공하되, 해당 방법은 서열: (R1)x-P-(R2)y를 갖는 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에게 투여하는 단계; 이에 의해 피험체에서 FVIII 단백질에 대한 면역 관용을 유도하는 단계를 포함하고, 상기 식 중, P는 서열번호 68, 344 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 특정 실시형태에서, R1은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
면역 관용을 유도하는 방법은 몇몇 펩타이드가 투여되어 면역 관용을 유도할 수 있는 조합 치료를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 면역 관용을 유도하는 방법은 서열: (R1)x-P-(R2)y를 갖는 적어도 제2 펩타이드의 치료적 유효량을 추가로 포함하고, 이에 의해 피험체에서 FVIII 단백질에 대해 면역 관용을 유도하되, 상기 식 중, P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 특정 실시형태에서, R1은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, R2는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 특정 실시형태에서, 제2 펩타이드는 9 내지 80개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 특정 실시형태에서, 제2 펩타이드 내 임의의 추가적인 아미노산은 천연 아미노산이다. 다른 특정 실시형태에서, 제2 펩타이드는 길이로 9 내지 40개의 아미노산으로 이루어진다. 구체적 실시형태에서, 제2 펩타이드는 길이로 9 내지 80개의 아미노산으로 이루어지고, 제2 펩타이드 내 임의의 추가적인 아미노산은 천연 아미노산이다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 실시형태에서, 제2 FVIII 펩타이드는 9 내지 150개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 100개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 50개의 아미노산으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 9 내지 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 아미노산으로 이루어진다.
면역 관용을 유도하기 위한 방법의 구체적 실시형태에서, 투여된 약제학적 조성물은 펩타이드를 포함하며, P는 서열번호 68, 344 또는 740의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, 조성물은 제2 폴리펩타이드를 추가로 포함하며, 제2 폴리펩타이드는 서열: (R1)x-P-(R2)y를 가지고, 상기 식 중, P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이며, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
한 양태에서, 본 발명은 FVIII 대체 치료에 대해 만들어진 면역반응의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII 펩타이드의 용도를 제공한다. 구체적 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 FVIII1401-1424 펩타이드이다. 관련된 양태에서, 본 발명은 FVIII 대체 치료에 대해 만들어진 면역반응의 방지를 위한 의약의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII 펩타이드의 용도를 제공한다. 구체적 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 FVIII1401-1424 펩타이드이다.
한 양태에서, 본 발명은 의약으로서 용도를 위한 FVIII 펩타이드를 제공한다. 구체적 실시형태에서, 본 발명은 의약으로서 용도를 위한 서열 (R1)x-P-(R2)y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)을 갖는 인자 VIII1401-1424 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
한 양태에서, 본 발명은 FVIII 대체 치료에 대해 만들어진 면역 반응의 치료를 위한 FVIII 펩타이드를 제공한다. 구체적 실시형태에서, 본 발명은 FVIII 대체 치료에 대해 만들어진 면역 반응의 치료를 위한 서열 (R1)x-P-(R2)y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)을 갖는 인자 VIII1401-1424 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
한 양태에서, 본 발명은 FVIII 대체 치료에 대해 만들어진 면역 반응의 방지를 위한 FVIII 펩타이드를 제공한다. 구체적 실시형태에서, 본 발명은 FVIII 대체 치료에 대해 만들어진 면역 반응의 방지를 위한 서열 (R1)x-P-(R2)y를 갖는 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 식 중, P는 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)을 갖는 인자 VIII1401-1424 펩타이드의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고, 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
VII. 면역진단
한 양태에서, 본 발명은 피험체로부터 취한 생물학적 샘플 내 FVIII에 대해 특이적인 FVIII 억제 항체 또는 CD4+ T 세포의 존재 또는 수준을 확인함으로써 치료가 필요한 피험체에서 FVIII 대체 치료 또는 FVIII 면역 관용 유도 치료를 모니터링하기 위한 방법을 제공한다.
한 실시형태에서, 해당 방법은 치료가 필요한 피험체에서 FVIII 대체 치료를 모니터링하기 위한 방법을 포함하되, 해당 방법은 피험체로부터의 생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII246-266 펩타이드, FVIII1401-1424 펩타이드 또는 FVIII102-122 펩타이드와 접촉시키는 단계; 및 샘플 내 존재하는 FVIII 펩타이드와 FVIII 억제 항체 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 해당 방법은 샘플 내 FVIII 억제 항체의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 해당 방법은 상이한 시간에 피험체로부터 취한 적어도 2개의 샘플 내 FVIII 억제 항체의 수준을 결정하는 단계 및 2개의 샘플 사이에 FVIII 억제 항체의 수준을 비교하는 단계를 포함하되, 시간에 따른 항체 수준의 증가는 FVIII 대체 치료의 과정 동안 피험체에게 투여된 FVIII에 대한 면역 반응의 형성을 표시한다.
다른 실시형태에서, 해당 방법은 치료가 필요한 피험체에서 FVIII 면역 관용 유도 치료를 모니터링하기 위한 방법을 포함하되, 해당 방법은 피험체로부터의 생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII246-266 펩타이드, FVIII1401-1424 펩타이드 또는 FVIII102-122 펩타이드와 접촉시키는 단계; 및 샘플 내 존재하는 FVIII 펩타이드와 FVIII 억제 항체 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 해당 방법은 샘플 내 FVIII 억제 항체의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 해당 방법은 상이한 시간에 피험체로부터 취한 적어도 2개의 샘플 내 FVIII 억제 항체의 수준을 결정하는 단계 및 2개의 샘플 사이에 FVIII 억제 항체의 수준을 비교하는 단계를 포함하되, 시간에 따른 항체 수준의 감소는 피험체에서 FVIII 단백질에 대한 면역 관용의 형성을 표시한다.
한 실시형태에서, 해당 방법은 치료가 필요한 피험체에서 FVIII 대체 치료를 모니터링하기 위한 방법을 포함하되, 해당 방법은 본 피험체로부터의 생물학적 샘플을 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII246-266 펩타이드, FVIII1401-1424 펩타이드 또는 FVIII102-122 펩타이드와 접촉시키는 단계; 및 FVIII 펩타이드와 샘플 내 존재하는 FVIII에 특이적인 CD4+ T 세포 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 해당 방법은 샘플 내 FVIII에 대해 특이적인 CD4+ T 세포의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 해당 방법은 상이한 시간에 피험체로부터 취한 적어도 2개의 샘플 내 FVIII에 대해 특이적인 CD4+ T 세포의 수준을 결정하는 단계, 및 2개의 샘플 사이의 FVIII에 대해 특이적인 CD4+ T 세포의 수준을 비교하는 단계를 포함하되, 시간에 따른 항체 수준의 증가는 FVIII 대체 치료 과정 동안 피험체에게 투여된 FVIII에 대한 면역 반응의 형성을 표시한다. 구체적 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된다.
다른 실시형태에서, 해당 방법은 치료가 필요한 피험체에서 FVIII 면역 관용 유도 치료를 모니터링하기 위한 방법을 포함하되, 해당 방법은 피험체로부터의 생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 바와 같은 FVIII246-266 펩타이드, FVIII1401-1424 펩타이드 또는 FVIII102-122 펩타이드와 접촉시키는 단계; 및 FVIII 펩타이드와 샘플 내 존재하는 FVIII에 특이적인 CD4+ T 세포 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 해당 방법은 샘플 내 FVIII에 대해 특이적인 CD4+ T 세포의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 해당 방법은 상이한 시간에 피험체로부터 취한 적어도 2개의 샘플 내 FVIII에 대해 특이적인 CD4+ T 세포의 수준을 결정하는 단계, 및 2개의 샘플 사이의 FVIII에 대해 특이적인 CD4+ T 세포의 수준을 비교하는 단계를 포함하되, 시간에 따른 항체 수준의 감소는 피험체에서 FVIII 단백질에 대한 면역 관용의 형성을 표시한다. 구체적 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된다.
당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 면역 모니터링은, 예를 들어 혈우병이 있는 환자의 치료를 가능하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역 모니터링은 본 발명의 펩타이드 및/또는 조성물의 투여가 FVIII 생성물에 대한 면역 반응을 방지하거나 또는 감소시키는지 여부를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 투약량 및/또는 투약 간격은 면역 모니터링에 의해 최적화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여 투약량은 항-FVIII 항체의 방지 또는 감소의 면역 모니터링으로부터의 결과에 구체적으로 기반하여 맞춰질 수 있다. 추가로, 투약 간격뿐만 아니라 투약량은 특정 환자 또는 환자 그룹에 대해 결정될 수 있다.
A. FVIII-특이적 T 세포의 확인 방법
다른 양태에서, 본 발명은 항원-특이적 T 세포, 더 구체적으로는 본 명세서에 기재된 FVIII 단백질 및 FVIII 펩타이드에 특이적인 T 세포의 확인 방법을 포함한다. 이러한 방법은, 예를 들어 환자의 면역 모니터링과 같은 면역진단을 위해 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 FVIII 펩타이드-특이적 T 세포를 확인하는 방법을 포함하되, 해당 방법은 a) MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된 FVIII 펩타이드와 다수의 CD4+ T 세포를 조합하는 단계, 및 b) MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된 펩타이드에 대해 특이적인 다수의 CD4+ T 세포의 구성원 중 적어도 하나를 확인하는 단계를 포함하되, FVIII 펩타이드는 서열: (R1)x-P-(R2)y를 가지며, 상기 식 중, P는 서열번호 68, 344 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다. 일부 실시형태에서, R1은 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며, R2는 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 FVIII 펩타이드는 FVIII 특이적 T 세포의 직접 염색에 적합한 시약을 만들기 위하야 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 FVIII 펩타이드가 존재하는 MHC 클래스 II 멀티머는 다양한 형태, 예컨대 MHC 클래스 II 테트라머를 포함할 수 있다. 이들 MHC 클래스 II 분자는 진단제를 포함하기 위하여 추가로 변형될 수 있다. 대안적으로, MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된 FVIII 펩타이드는 진단제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 진단제(즉, 검출가능한 모이어티)는 면역 모니터링을 위해 당업계에 일반적으로 공지된 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, FVIII-특이적 T 세포는 MHC 클래스 II 테트라머에 의해 제공되는 본 명세서에 기재된 FVIII 펩타이드와 연관된 진단제의 검출에 기반하여 확인되고/되거나 분리될 수 있다. 적합한 진단제는 형광제, 화학발광제, 방사성활성제, 조영제 등을 포함할 수 있다. 적합한 형광제는 유세포 분석기에서 전형적으로 사용된 것을 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, R-피코에리트린, 텍사스 레드(Texas Red), Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 및 이들의 유도체를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 시험관내 CD4+ FVIII-특이적 T 세포를 재자극하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 실시형태에서, T 세포의 재자극은 증식의 검출, 사이토카인 또는 케모카인의 분리 또는 당업자에게 공지된 특정 활성 마커의 상향- 또는 하향-조절에 의해 모니터링될 수 있다.
일부 실시형태에서, 진단제는 본 명세서에 개시된 FVIII 펩타이드에 특이적인 T 세포를 확인하고/하거나 분리하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 시약(예를 들어, 펩타이드, MHC 클래스 II 테트라머 및 진단제)는 시험관내 또는 생체밖에서 FVIII-특이적 T 세포를 추적하기 위하여 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 당업계에 일반적으로 공지된 다양한 기법, 예컨대 유세포 분석기, 예를 들어 형광 활성 세포 분류(FACS) 및/또는 PCR, 예를 들어 단일 세포 PCR을 사용하여 추가로 분리되고 특성규명될 수 있다.
면역 모니터링 분석을 수행하기 위하여, FVIII 펩타이드-MHC 클래스 II 멀티머 복합체와 결합하는 T 세포는 CD4+ T 세포를 포함하고, 당업계에 일반적으로 공지된 다양한 방법을 사용하여 환자로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 환자의 혈액, 기관 또는 다른 조직으로부터 분리되고 정제될 수 있다. FVIII 특이적 T 세포의 분리 및 정제는 다양한 면역진단적 용도를 위하여 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, FVIII 펩타이드 또는 연관된 시약은 새로운 FVIII 생성물의 임상적 개발 동안 FVIII-특이적 T 세포의 면역 모니터링을 위하여 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 면역 관용 유도 치료 동안 FVIII-특이적 T 세포의 면역 모니터링을 위하여 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 펩타이드는 FVIII 처리 동안 FVIII-특이적 T 세포의 면역 모니터링을 위하여 사용될 수 있다.
VIII. 본 발명의 키트
본 발명은 또한 본 발명에 의해 제공되는 조성물의 사용을 용이하게 하고/하거나 표준화할 뿐만 아니라 본 발명의 방법을 가능하게 하기 위한 키트를 제공한다. 이들 다양한 방법을 수행하기 위한 물질 및 시약은 본 방법의 실행을 가능하게 하기 위한 키트 내에서 제공될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "키트"는 처리, 검사, 분석 또는 조작을 가능하게 하는 물품의 조합에 대해 사용될 수 있다.
키트는 화학적 시약(예를 들어, FVIII 펩타이드 또는 FVIII 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)뿐만 아니라 다른 성분을 함유할 수 있다. 추가로, 본 발명의 키트는 또한, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 샘플 수집 및/또는 정제, 생성물 수집 및/또는 정제를 위한 장치 및 시약, 박테리아 세포 형질전환을 위한 시약, 진핵세포 트랜스펙션을 위한 시약, 이전에 형질전환되거나 또는 트랜스펙션된 숙주 세포, 샘플 튜브, 홀더, 트레이, 랙(rack), 디쉬, 플레이트, 키트 사용자에 대한 설명서, 용액, 완충제 또는 다른 화학적 시약, 표준화, 정상화를 위하 사용되는 적합한 샘플 및/또는 제어 샘플을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 편리한 저장 및 안정한 선적을 위하여, 예를 들어 리드(lid)를 갖는 박스 내에 포장될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어 본 발명의 키트는 본 발명의 FVIII 펩타이드, 본 발명의 FVIII 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 벡터(예를 들어, 플라스미드), 벡터를 전파하는데 적합한 박테리아 세포 균주 및 발현된 융합 단백질의 정제를 위한 시약을 제공할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 키트는 FVIII 펩타이드의 보존적으로 변형된 변이체를 만들기 위하여 FVIII 펩타이드의 돌연변이유발을 수행하는데 필요한 시약을 제공할 수 있다.
키트는 본 발명의 하나 이상의 조성물, 예를 들어 하나 또는 다수의 FVIII 펩타이드 또는 FVIII 펩타이드를 암호화하는 하나 또는 다수의 폴리뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 대안적으로, 키트는 환자의 면역 모니터링을 수행하기 위한 시약(예를 들어, 펩타이드, MHC 클래스 II 테트라머 및 진단제)을 함유할 수 있다.
본 발명의 키트는 하나 또는 다수의 재조합 핵산 분자를 함유할 수 있는데, 이는 FVIII 펩타이드를 암호화하며, 동일 또는 상이할 수 있고, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 또는 재조합효소 인식 부위 또는 관심의 임의의 폴리뉴클레오타이드를 함유하거나 또는 암호화하는 작동가능하게 연결된 제2 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 키트는 키트의 구성성분, 특히 키트 내 함유된 본 발명의 조성물을 사용하기 위한 설명서를 함유할 수 있다.
IX. 특이적 실시형태
한 실시형태에서, 본 발명은 다음의 아미노산 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)에서 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85% 동일한 9개 아미노산의 연속적 서열로 이루어진 FVIII 펩타이드를 제공하며, 해당 펩타이드는 식 (R1)x-펩타이드-(R2)y를 가지고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 아래첨자 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
한 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 70개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 60개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에서, R1 및 R2는 개별적으로 또는 둘 다 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다.
상기 기재된 펩타이드의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.
상기 기재된 펩타이드의 구체적 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다.
상기 기재된 펩타이드의 구체적 실시형태에서, x는 0이고, y는 1이다.
상기 기재된 펩타이드의 구체적 실시형태에서, x 및 y는 둘 다 1이다.
상기 기재된 펩타이드의 구체적 실시형태에서, 9개의 아미노산의 연속적 서열은 아미노산 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344) 내 9개의 연속적 아미노산과 동일하다.
한 실시형태에서, 본 발명은 다음의 아미노산 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344) 에서 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85% 동일한 9개의 아미노산의 연속적 서열로 이루어진 FVIII 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 해당 펩타이드는 식 (R1)x-펩타이드-(R2)y를 가지고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 아래첨자 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
상기 기재된 조성물의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.
상기 기재된 조성물의 구체적 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다.
상기 기재된 조성물의 구체적 실시형태에서, x는 0이고, y는 1이다.
상기 기재된 조성물의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1이다.
상기 기재된 조성물의 구체적 실시형태에서, 조성물은 GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(서열번호 159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(서열번호 250), EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(서열번호 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(서열번호 568), NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(서열번호 659), TVVITLKNMASHPVSLHA(서열번호 10), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68) 및 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열에서 9개의 연속적 아미노산과 적어도 85% 동일한 9개의 아미노산 서열의 연속적 서열로 이루어진 적어도 하나의 펩타이드를 추가로 포함하되, 적어도 하나의 펩타이드는 길이로 최대 80개의 아미노산이고, 적어도 하나의 펩타이드에서 임의의 추가적인 아미노산은 천연 아미노산이다.
한 실시형태에서, 본 발명은 피험체에서 FVIII에 대해 면역 관용을 유도하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 다음의 아미노산 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)에서 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85% 동일한 9개의 아미노산의 연속적 서열로 이루어진 FVIII 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 피험체에게 투여하고, 이에 의해 피험체에서 FVIII 단백질에 대해 면역 관용을 유도하는 단계를 포함하며, 해당 펩타이드는 식 (R1)x-펩타이드-(R2)y를 가지고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 아래첨자 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, 약제학적 조성물은 GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(서열번호 159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(서열번호 250), EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(서열번호 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(서열번호 568), NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(서열번호 659), TVVITLKNMASHPVSLHA(서열번호 10), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(서열번호 68) 및 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(서열번호 740)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열에서 9개의 연속적 아미노산에 대해 적어도 85%인 9개의 아미노산의 연속적 서열로 이루어진 적어도 하나의 펩타이드를 추가로 포함하되, 적어도 하나의 펩타이드는 길이로 최대 80개의 아미노산이고, 적어도 하나의 펩타이드 내 임의의 추가적인 아미노산은 천연 아미노산이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 피험체에서 항-FVIII 항체의 발생을 방지한다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, 약제학적 조성물의 투여는 피험체에서 존재하는 항-FVIII 항체의 양을 감소시킨다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 0이고, y는 1이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1이다.
한 실시형태에서, 본 발명은 FVIII 펩타이드의 제조방법을 제공하되, 해당 방법은 a) 다음의 아미노산 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)에서 9개의 연속적 아미노산과 적어도 85% 동일한 9개의 아미노산의 연속적 서열로 이루어진 FVIII 펩타이드를 암호화하는 벡터를 포함하는 세포의 배양물을 제공하는 단계, 및 b) 세포 배양물에서 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하되, 해당 펩타이드는 식 (R1)x-펩타이드-(R2)y를 가지고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 아래첨자 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 0이고, y는 1이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1이다.
한 실시형태에서, 본 발명은 a) 고체상 또는 액체상 합성 기법을 사용하여 펩타이드를 합성하는 단계를 포함하는 FVIII 펩타이드의 제조방법을 제공하되, 펩타이드는 다음의 아미노산 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)에서 9개의 연속적 아미노산과 적어도 85% 동일한 9개의 아미노산의 연속적 서열로 이루어지고, 펩타이드는 식 (R1)x-펩타이드-(R2)y를 가지고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 아래첨자 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 0이고, y는 1이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1이다.
한 실시형태에서, 본 발명은 FVIII 펩타이드-특이적 T 세포를 확인하는 방법을 제공하며, 해당 방법은 a) MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된 FVIII 펩타이드와 다수의 CD4+ T 세포를 조합하는 단계, 및 b) MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된 펩타이드에 특이적인 다수의 CD4+ T 세포의 구성원 중 적어도 하나를 확인하는 단계를 포함하되, FVIII 펩타이드는 다음의 아미노산 서열: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(서열번호 344)에서 9개의 연속적 아미노산과 적어도 85% 동일한 9개의 아미노산의 연속적 서열로 이루어지고, 펩타이드는 식 (R1)x-펩타이드-(R2)y를 가지고, R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며; R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고; 각각의 아래첨자 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, MHC 클래스 II 멀티머는 MHC 클래스 II 테트라머이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, 펩타이드 또는 MHC 클래스 II 멀티머는 진단제를 추가로 포함한다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, 진단제는 펩타이드에 특이적인 다수의 CD4+ T 세포의 적어도 하나의 구성원을 확인한다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, 해당 방법은 진단제의 검출에 기반하여 펩타이드에 특이적인 다수의 CD4+ T 세포의 적어도 하나의 구성원을 분리시키는 단계를 추가로 포함한다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, 다수의 CD4+ T 세포의 적어도 하나의 구성원은 유세포 분석기에 의해 분리된다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 0이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 1이고, y는 0이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x는 0이고, y는 1이다.
상기 기재한 방법의 구체적 실시형태에서, x와 y는 둘 다 1이다.
본 발명은 이제 다음의 실시예에서 추가로 예시될 것이며, 이것으로 제한되지 않는다.
X. 실시예
실시예 1
FVIII 펩타이드를 확인하기 위한 인간 MHC 클래스 II 분자를 더 양호하게 모방하기 위하여, 인간 HLA-DRB1*1501 특이적 결합 부위를 운반하는 키메라 MHC 클래스 II 분자로 A형 혈우병에 대한 마우스 모델을 개발하였다. 이 마우스를 모든 뮤린 MHC 클래스 II 유전자의 완전한 녹아웃을 운반하는 마우스에 대해 역교배시켰다(Reipert et al., J. Thromb. Haemost. 7 Suppl. 1:92-97 (2009)). 이 새로운 유전자이식 마우스 모델에서, 모든 CD4+ T 세포 반응은 인간 MHC 클래스 II 분자에 의해 구동된다. 이들 마우스에서 항-FVIII 면역 반응을 구동하는 HLA-DRB1*1501에 의해 제시된 FVIII 펩타이드를 확인하기 위하여 이 마우스 모델을 사용하였다.
물질 및 방법
FVIII: 재조합 인간 FVIII(rFVIII)을 무알부민 벌크 생성물(Baxter Neuchatel) 및 임상적 수크로스 조제된 FVIII 생성물(캘리포니아주 웨스트레이크 빌리지에 소재한 Advate, Baxter)로서 생성하였다.
혈우병에 걸린 HLA-DRB15 E17 마우스: 문헌[Reipert et al., J. Thromb. Haemost. 7 Suppl. 1:92-97 (2009)]에 기재된 바와 같은 HLA-DRB1*1501+/- E17-/- 마우스. 마우스는 모두 수컷이었고 실험의 시작시 8 내지 12주령이었다.
인간 재조합 FVIII에 의한 면역화: HLA-DRB1*1501+/- E17-/- 마우스는 1주일 간격으로 0.2 ㎍ 또는 1 ㎍ 인간 rFVIII의 정맥내 또는 피하 용량을 4 내지 8회 받았다. 본래의 조제 완충제 또는 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS; 미국 미주리주 세인트루이스에 소재한 Sigma Aldrich) 중에서 rFVIII를 희석시켰다.
세포 프레파라트: rFVIII로 최종 면역화 후 3 내지 7일에 비장을 얻었다. 비장 세포를 민싱(mince)하였고, 70 ㎛ 세포 스트레이터(strainer)(뉴저지주 플랭클린 레이크에 소재한 Becton Dickinson)를 통과시켰다. 배양 배지 중에 단일 세포를 수집하였고: RPMI 1640 배지(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Gibco, Invitrogen, Life Technologies)를 10% 사전선택한 우태아혈청(FCS; 유타주 로간에 소재한 Hyclone), 2 mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신(둘 다 Gibco) 및 5x10-5 M 머캅토에탄올(Sigma-Aldrich)로 보충하였다. 적혈구를 0.15 M 염화암모늄, 10 mM 중탄산칼륨(둘 다 독일 다름슈타트에 소재한 Merck제) 및 0.1 mM 에틸렌-다이아민테트라아세트산(Sigma-Aldrich)으로 구성된 저장성 완충제(pH 7.2)를 사용하여 용해시켰다. 세포를 세척하였고, Coulter Counter Z1을 사용하여 계측하였다.
FVIII 펩타이드의 확인을 위한 T-세포 하이브리도마의 생성
인간 rFVIII에 의한 비장세포의 시험관내 재자극: 3 또는 10일 동안 1.5×106개 세포/㎖의 농도에서 배양배지 내 20㎍/㎖ 인간 FVIII의 존재에서 비장 세포를 재자극하였다. 10일 동안 배양 배지를 배양시키고, 6일 후 새로 교체하였다.
BW 세포와 마우스 T 세포의 융합: 시험관내 재자극 비장 세포 배양물 및 BW 세포(α-β-)를 무혈청 배양 배지로 2회 세척한 다음, 1:3 내지 1:10(T 세포:BW 세포)의 비로 조합하였다. BW 세포주는 마우스 AKR/J T 세포 림프종으로부터 유래되었다. 이들 세포는 그것의 표면(α-β-) 상에 T 세포 수용체가 없었고, 따라서 마우스 비장세포와 융합 후 임의의 T 세포 수용체는 융합 상대로부터 유래된다. 제3 세척 단계 후, 상청액을 제거하였다. 융합 조건은 45초 내 1㎖ 폴리에틸렌글라이콜(PEG; 50% HybiMax, Sigma-Aldrich)의 첨가에 의해 달성하였다. 인큐베이션의 다른 45초 후, 후속하여 50㎖ 무혈청 배지를 첨가하여 PEG의 독성 효과를 방지하였다. 5분 동안 1300 rpm에서 세포를 원심분리시켜 파손 없이 매우 단단한 펠렛을 형성하였다. 상청액을 버렸고, 펠렛의 위치를 바꾸지 않기 위한 목적으로 50㎖ 새로은 무혈청 배지를 매우 서서히 첨가하였다. 세포가 재현탁되고 앞에서와 같이 원심분리될 때까지 튜브를 서서히 뒤집었다. 이를 2회 행하여 남아있는 PEG를 제거하였다. 배양배지로 최종 세척 단계를 행하였다. 배양 배지에 대해 최종 세척 단계를 행하였다. 그 다음에 세포를 희석시키고 96웰 플레이트에서 배양시켰다. 48시간 후 선택 배지에 대해 배양 배지를 변화시켰고(HAT 배지 보충물, Sigma Aldrich), 성장 클론을 선택하였다. 선택 배지를 2주 동안 유지시켰고, 그 후에 후속하여 배지를 정상 배양배지로 되돌렸다.
FVIII-특이적 T 세포 하이브리도마의 펩타이드 특이성: T 세포 하이브리도마를 그것의 항원 특이성에 대해 시험하였다. 이 목적을 위해, 1×105개 세포를 항원 존재 세포와 공동 배양시켰다. 본 발명자들은 5×104개의 가르(Mgar) 세포(HLA-DRB1*1501를 발현시킴) 또는 천연 HLA-DRB1*1501 - E17 마우스로부터 유래된 1×105개 전체 비장 세포 중 하나를 사용하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 10㎍/㎖ 인간 rFVIII 또는 1㎍/㎖ 펩타이드/펩타이드 풀과 함께 인큐베이션시켰다. 상청액을 수집하였고, 제조업자의 프로토콜에 따라 IL-2 ELISA(캘리포니아주 샌디에고에 소재한 BioLegend) 또는 IL-2 Bio-Plex(캘리포니아주 허큘레스에 소재한 Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 배양 상청액 내로 IL-2 방출을 측정하였다. IL-2 방출은 FVIII(또는 펩타이드)의 존재에서 ≥ 20 pg/ml 이지만, FVIII(또는 펩타이드)의 부재하에 양성으로 고려되었고, 또는 대안적으로 FVIII의 부재와 비교하여 FVIII의 존재에서 IL-2 방출의 10배 증가는 양성으로 고려되었다.
T 세포 하이브리도마의 서브클로닝: 각 클론이 T 세포 중 단지 하나를 나타내는 것을 보장하기 위하여, 하이브리도마 모든 클론을 서브클로닝시켰다. 하이브리도마 클론을 0.3 세포/웰의 제한 희석으로 희석시켰고, 200개의 피더(feeder) 세포/웰과 공동-배양시켰다. 융합 상대 세포, BW 세포의 미토마이신 C 처리에 의해 피더 세포를 생성하였다. 2×108개 BW 세포를 인큐베이터 내 5% CO2에서 실온에서 10분 동안 및 37℃에서 25분 동안 스트렙토마이세스 카이스피토수스(Streptomyces caespitosus)(Sigma Aldrich)로부터 0.1㎎ 미토마이신으로 처리하였다. 클론 당 5개의 성장 서브클론을 선택하였고, 그것의 FVIII 특이성에 대해 시험하였다.
T 세포 하이브리도마의 특이성을 확인하기 위하여 사용한 FVIII 펩타이드 풀: 문헌[Ay et al. (Biopolymers 88:64-75 (2007))]에 기재된 바와 같은 SPOT 합성 방법을 사용하여 FVIII 펩타이드 풀을 생성하였다. 간략하게, 15량체(mer) 펩타이드를 2개의 동일한 셀룰로스 막 상에서 합성하였다. 막을 수직 및 수평 스트라이프로 절단하였다. 펩타이드를 막 스트라이프로부터 방출시켰고, 상기 기재한 바와 같은 특이성 시험에서 펩타이드 풀로서 사용하였다. 펩타이드를 DMSO(Hybrimax, Sigma Aldrich) 중에서 용해시켰고, PBS로 추가로 희석시켰다.
결과
181 FVIII 특이적 클론을 생성하였다. 이들 클론을 전체 인간 FVIII에 걸쳐 펩타이드 라이브러리에 대해 스크리닝하였다. 3개의 아미노산에 의해 15량체 펩타이드 오프셋을 사용하였다. 이 접근을 사용하여, HLA-DRB1*1501에 결합된 펩타이드를 함유한 6개의 상이한 FVIII 영역을 확인하였다. 본 발명자는 인간 FVIII의 A1 도메인 내 2개의 펩타이드, A2 도메인 내 2개의 펩타이드, B 도메인 내 1개, A3 도메인 내 2개 및 C1 도메인 내 1개의 펩타이드 도메인을 발견하였다. FVIII 펩타이드1401-1424는 앞서 기재하지 않았다(표 11). 펩타이드 FVIII474-494, FVIII545-559, FVIII1788-1802 및 FVIII2161-2175는 컴퓨터 예측 프로그램 다음에 T 세포 혼성 기법을 사용한 WO 09/071886에서 이미 확인하였다. 펩타이드 FVIII2030-2044는 WO 03/087161에서 개시되었다. 펩타이드 FVIII2161-2180은 문헌[Jacquemin et al., Blood 101(4):1351-8 (2003)]에 의해 이미 공개되었다.
T-세포 에피토프를 포함하는 FVIII의 영역
T 세포 에피토프를 포함하는 영역 아미노산 서열 개시내용
FVIII102-122 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV
(서열번호 740)		 WO 2003/087161에 개시된 FVIII107-121
WO/2009/095646에 개시된 FVIII100-118
FVIII246-266 AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG
(서열번호 68)		 WO/2009/095646에 개시된 FVIII253-268
FVIII474-494 GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI
(서열번호 159)		 WO 2009/071886에 개시된 FVIII475-495
WO/2009/095646에 개시된 FVIII477-495
FVIII540-560 PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER
(서열번호 250)		 WO 2009/071886에 개시된 FVIII 542-562
WO/2009/095646에 개시된 FVIII545-569
FVIII1401-1424 QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT
(서열번호 344)		 본 발명의 펩타이드
FVIII1785-1805 EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY
(서열번호 477)		 WO 2009/071886에 개시된 FVIII 1785-1805
WO/2009/095646에 개시된 FVIII1787-1805
FVIII2025-2045 LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG
(서열번호 568)		 WO 2003/087161에 개시된 FVIII 2030-2044
FVIII2160-2180 NPPIIARYIRLHPTHYSIRST
(서열번호 659)		 WO 2009/071886에 개시된 FVIII 2158-2178 및
FVIII 2161-2180 Jacquemin et al., 상기 참조
WO 2003/087161에 개시된 FVIII 2164-2183
WO/2009/095646에 개시된 FVIII 2164-2188
본 명세서에 기재된 실시예 및 실시형태는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 이것에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 시사될 것이고, 본 출원의 정신 및 이해의 범위 및 첨부되는 특허청구범위의 범주 내에 포함될 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 모든 목적을 위하여 그들의 전문이 참조로서 본 명세서에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> BAXTER INTERNATIONAL INC. BAXTER HEALTHCARE S.A. <120> FVIII PEPTIDES FOR IMMUNE TOLERANCE INDUCTION AND IMMUNODIAGNOSTICS <130> 008073-5030-US <140> PCT/US11/58165 <141> 2011-10-27 <150> 61/502,476 <151> 2011-06-29 <150> 61/467,894 <151> 2011-03-25 <150> 61/407,402 <151> 2010-10-27 <160> 773 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro 1 5 10 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 1 5 10 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Thr Val Val 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<400> 668 Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1 5 10 15 Ile <210> 669 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 669 Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1 5 10 15 Ile Arg <210> 670 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 670 Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1 5 10 15 Ile Arg Ser <210> 671 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 671 Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1 5 10 15 Ile Arg Ser Thr 20 <210> 672 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 672 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu 1 5 <210> 673 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 673 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His 1 5 10 <210> 674 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 674 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 1 5 10 <210> 675 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 675 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr 1 5 10 <210> 676 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 676 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His 1 5 10 <210> 677 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 677 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr 1 5 10 <210> 678 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 678 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1 5 10 15 <210> 679 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 679 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile 1 5 10 15 <210> 680 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 680 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile 1 5 10 15 Arg <210> 681 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 681 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile 1 5 10 15 Arg Ser <210> 682 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 682 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile 1 5 10 15 Arg Ser Thr <210> 683 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 683 Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His 1 5 <210> 684 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 684 Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 1 5 10 <210> 685 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 685 Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr 1 5 10 <210> 686 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 686 Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His 1 5 10 <210> 687 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 687 Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr 1 5 10 <210> 688 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 688 Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1 5 10 <210> 689 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 689 Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile 1 5 10 15 <210> 690 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 690 Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg 1 5 10 15 <210> 691 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 691 Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg 1 5 10 15 Ser <210> 692 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 692 Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg 1 5 10 15 Ser Thr <210> 693 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 693 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 1 5 <210> 694 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 694 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr 1 5 10 <210> 695 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 695 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His 1 5 10 <210> 696 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 696 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr 1 5 10 <210> 697 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 697 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1 5 10 <210> 698 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 698 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile 1 5 10 <210> 699 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 699 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg 1 5 10 15 <210> 700 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 700 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser 1 5 10 15 <210> 701 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 701 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser 1 5 10 15 Thr <210> 702 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 702 Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr 1 5 <210> 703 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 703 Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His 1 5 10 <210> 704 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 704 Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr 1 5 10 <210> 705 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 705 Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1 5 10 <210> 706 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 706 Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile 1 5 10 <210> 707 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 707 Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg 1 5 10 <210> 708 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 708 Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser 1 5 10 15 <210> 709 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 709 Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr 1 5 10 15 <210> 710 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 710 Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His 1 5 <210> 711 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 711 Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr 1 5 10 <210> 712 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 712 Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1 5 10 <210> 713 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 713 Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile 1 5 10 <210> 714 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 714 Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg 1 5 10 <210> 715 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 715 Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser 1 5 10 <210> 716 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 716 Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr 1 5 10 15 <210> 717 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 717 Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr 1 5 <210> 718 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 718 Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1 5 10 <210> 719 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 719 Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile 1 5 10 <210> 720 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 720 Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg 1 5 10 <210> 721 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 721 Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser 1 5 10 <210> 722 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 722 Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr 1 5 10 <210> 723 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 723 Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1 5 <210> 724 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 724 Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile 1 5 10 <210> 725 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 725 Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg 1 5 10 <210> 726 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 726 Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser 1 5 10 <210> 727 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 727 Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr 1 5 10 <210> 728 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 728 Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile 1 5 <210> 729 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 729 Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg 1 5 10 <210> 730 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 730 Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser 1 5 10 <210> 731 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 731 Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr 1 5 10 <210> 732 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 732 Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg 1 5 <210> 733 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 733 Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser 1 5 10 <210> 734 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 734 Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr 1 5 10 <210> 735 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 735 His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser 1 5 <210> 736 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 736 His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr 1 5 10 <210> 737 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 737 Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr 1 5 <210> 738 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 738 Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu 1 5 10 15 His Ala Val <210> 739 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 739 Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu 1 5 10 15 His Ala Val Gly 20 <210> 740 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 740 Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu 1 5 10 15 His Ala Val Gly Val 20 <210> 741 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 741 Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His 1 5 10 15 Ala Val <210> 742 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 742 Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His 1 5 10 15 Ala Val Gly <210> 743 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 743 Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His 1 5 10 15 Ala Val Gly Val 20 <210> 744 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 744 Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala 1 5 10 15 Val <210> 745 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 745 Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala 1 5 10 15 Val Gly <210> 746 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 746 Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala 1 5 10 15 Val Gly Val <210> 747 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 747 Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val 1 5 10 15 <210> 748 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 748 Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val 1 5 10 15 Gly <210> 749 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 749 Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val 1 5 10 15 Gly Val <210> 750 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 750 Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val 1 5 10 15 <210> 751 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 751 Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly 1 5 10 15 <210> 752 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 752 Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly 1 5 10 15 Val <210> 753 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 753 Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val 1 5 10 <210> 754 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 754 Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly 1 5 10 15 <210> 755 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 755 Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val 1 5 10 15 <210> 756 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 756 Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val 1 5 10 <210> 757 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 757 Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly 1 5 10 <210> 758 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 758 Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val 1 5 10 15 <210> 759 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 759 Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val 1 5 10 <210> 760 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 760 Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly 1 5 10 <210> 761 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 761 Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val 1 5 10 <210> 762 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 762 Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val 1 5 10 <210> 763 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 763 Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly 1 5 10 <210> 764 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 764 Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val 1 5 10 <210> 765 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 765 Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val 1 5 10 <210> 766 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 766 Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly 1 5 10 <210> 767 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 767 Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val 1 5 10 <210> 768 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 768 Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val 1 5 <210> 769 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 769 Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly 1 5 10 <210> 770 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 770 Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val 1 5 10 <210> 771 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 771 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly 1 5 <210> 772 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 772 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val 1 5 10 <210> 773 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 773 Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val 1 5

Claims (21)

  1. 서열 (R1)x-P-(R2)y를 갖되,
    상기 식 중,
    P는 서열번호 68의 서열과 동일한 아미노산 서열이고;
    R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며;
    R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고;
    각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1인,
    펩타이드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, x 및 y가 모두 0이거나, x는 1이고 y는 0이거나, x는 0이고 y는 1이거나, 또는 x 및 y 모두 1인 펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 21 내지 100개의 아미노산으로 이루어지거나, 21 내지 50개의 아미노산으로 이루어지거나, 또는 21 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드.
  6. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는, 혈우병 환자에서 FVIII에 대해 면역 관용을 유도하기 위한 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 제약학적 투여를 위해 제제화된, 혈우병 환자에서 FVIII에 대해 면역 관용을 유도하기 위한 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    아미노산 서열 (R1)x-P-(R2)y로 이루어지되,
    상기 식 중,
    P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 85% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열이고;
    R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며;
    R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고;
    각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1인
    제2 폴리펩타이드를 더 포함하는 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    아미노산 서열 (R1)x-P-(R2)y로 이루어지되,
    상기 식 중,
    P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 85% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열이고;
    R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며;
    R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고;
    각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1인
    제2 폴리펩타이드를 더 포함하는 조성물.
  10. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII에 대한 면역 관용을 필요로 하는 환자에서 FVIII에 대한 면역 관용을 유도하는 방법에 사용하기 위한 펩타이드.
  11. 아미노산 서열 (R1)x-P-(R2)y를 갖되,
    상기 식 중,
    P는 서열번호 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 및 740으로부터 선택된 서열의 적어도 9개의 연속적 아미노산의 서열에 대해 85% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열이고;
    R1은 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이며;
    R2는 1 내지 80개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이고;
    각각의 x 및 y는 독립적으로 0 또는 1인
    제2 펩타이드의 치료적 유효량의 사용을 더 포함하는 제10항에 따른 용도를 위한 펩타이드.
  12. FVIII 펩타이드-특이적 T 세포를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) MHC 클래스 II 멀티머(multimer)와 복합체화된 펩타이드와 다수의 분리된 또는 하이브리도마 CD4+ T 세포를 조합하는 단계, 및
    b) 상기 MHC 클래스 II 멀티머와 복합체화된 상기 펩타이드에 특이적인 다수의 CD4+ T 세포의 구성원 중 적어도 하나를 확인하는 단계를 포함하되,
    상기 펩타이드는 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 FVIII 펩타이드인 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 MHC 클래스 II 멀티머는 MHC 클래스 II 테트라머인 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 MHC 클래스 II 멀티머는 검출가능한 모이어티를 더 포함하는 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 펩타이드에 특이적인 상기 적어도 하나의 CD4+ T 세포를 분리시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 CD4+ T 세포는 유세포 분석기를 사용하여 분리되는 것인 방법.
  17. 융합 단백질로서,
    제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 FVIII 펩타이드; 및
    제2 펩타이드를 포함하는 것인 융합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제2 펩타이드는 리포터 펩타이드(reporter peptide)인 것인 융합 단백질.
  19. 제17항에 있어서, 상기 융합 단백질은 핵산에 의해 암호화된 것인 융합 단백질.
  20. 제17항에 있어서, 상기 FVIII 펩타이드는 상기 제2 펩타이드에 화학적으로 연결된 것인 융합 단백질.
  21. FVIII 펩타이드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 FVIII 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포의 배양물을 제공하는 단계; 및
    b) 상기 세포 배양물 내 펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
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