CN103298482A

CN103298482A - 用于免疫耐受性诱导和免疫诊断的fviii肽

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Publication number: CN103298482A
Application number: CN2011800631179A
Authority: CN
Inventors: 卡塔琳娜·诺拉·施泰尼茨; 保拉·玛利亚·威廉明娜范黑尔登; 比吉特·玛利亚·赖佩特; 汉斯-彼得·施瓦茨; 哈特穆特·埃利希
Original assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2031-10-27
Also published as: KR102040867B1; AU2016202155B2; KR20130128404A; AU2016202155A1; EP3260132B1; NZ703514A; NZ609474A; US8969524B2; CA2815239A1; EP2632479A1; DK2632479T3; JP6122780B2; SG189914A1; JP2017095463A; ES2912455T3; CA2815239C; PT2632479T; SG10201600656WA; KR20190126189A; US9512198B2

Abstract

本发明涉及可用于在患有例如甲型血友病的患者中减少针对FVIII的免疫反应或诱导对人类FVIII的耐受性的肽。此外，所述肽可出于免疫诊断目的而用于检测FVIII特异性CD4⁺T细胞，以便在替补疗法期间并且在免疫耐受诱导疗法期间监测患有甲型血友病的患者。

Description

用于免疫耐受性诱导和免疫诊断的FVIII肽

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年10月27日提交的美国临时专利申请序号61/407,402、2011年3月25日提交的美国临时专利申请序号61/467,894以及2011年6月29日提交的美国临时专利申请序号61/502,476号的优先权，所述临时专利申请的公开内容是以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的。

关于在联邦赞助的研究或开发下作出的对发明的权利的声明

不适用

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不适用

发明背景

因子VIII(FVIII)为一种在血浆中发现的在引起血液凝固的级联反应中充当辅因子的蛋白质。甲型血友病由功能性FVIII蛋白的减少或缺乏造成并且为影响每5000至10000个男性中约1人的最常见的出血病症之一。血友病的临床症状为频繁的肌肉和关节出血，且外伤甚至会引起危及生命的状况。目前，血友病的有效治疗包括使用重组或由血浆得到的FVIII产品的静脉内施加替补缺少的FVIII蛋白。所述制剂一般响应于出血事件施用(按需疗法(on-demand therapy))或按频繁、定期的时间间隔施用以防止不受控制的出血(预防)。不幸的是，中和抗FVIII抗体(FVIII抑制剂)的出现为在使用FVIII产品的替补疗法期间的主要并发症。约25%接受治疗的患者对FVIII蛋白发展此免疫性，由此使得进一步控制出血极其困难。

尚未完全阐明针对FVIII蛋白的这种免疫反应的原因，但患者免疫系统的特异性会影响其对于疗法的反应。通常，免疫系统对某些抗原(例如“自体”抗原)发展耐受性。此特征至关重要，因为否则的话，如果自体抗原被识别为外来抗原，那么导致自体免疫疾病。具体来说，甲型血友病患者在其FVIII基因中具有遗传缺陷，这导致免疫系统不将所施用的FVIII蛋白识别为“自体”抗原。因此，当在凝血因子替补疗法期间施用FVIII蛋白时，患者的免疫系统将FVIII蛋白识别为外来抗原或改变的自体蛋白并且因此发展抗FVIII抗体。

FVIII抑制剂(即抗FVIII抗体)由来源于FVIII特异性B细胞的浆细胞产生。B细胞需要活化CD4⁺T细胞的帮助以增殖并分化成产生抗FVIII抗体的浆细胞。例如，FVIII蛋白由B淋巴细胞和T淋巴细胞以不同方式识别。抗FVIII抗体的诱导为T辅助细胞依赖型。B细胞经由其特异性B细胞受体识别整个蛋白表位。另一方面，T细胞识别呈与抗原呈现细胞表面上所呈现的MHC II类分子复合的加工的肽形式的蛋白质。各CD4⁺T细胞克隆仅识别一种特异性肽-MHC复合物。为将肽呈现给T细胞，MHC II类分子具有开放的结合槽(binding groove)，其允许各种长度的肽适配装入并呈现在细胞表面上。此外，MHC II类蛋白含有四个结合袋(binding pocket)，不同单倍体的结合袋不同(Jones等,Nature Rev.Immunol.6:271-282(2006))。仅特异性氨基酸被适配装入这些结合袋中，并且结合肽的最小尺寸为九个氨基酸。值得注意的是，不同MHC II类单倍体可以呈现不同肽。因此，患者的MHCII类单倍体可能影响发展抗FVIII抗体的危险性。实际上，数项研究已经显示人类MHC II类单倍体HLA-DRB1*1501与抗FVIII抗体发展的危险性增大存在相关性(Pavlova等,J.Thromb.Haemost.7:2006-2015(2009)；Oldenburg等,Thromb.Haemost.77:238-242(1997)；Hay等,Thromb.Haemost.77:234-237(1997))。

已经探索某些方法来解决与通过施用FVIII蛋白来治疗血友病有关的挑战。例如，WO 03/087161公开了修饰的FVIII蛋白，其中所述FVIII蛋白的免疫特征通过减少或移除所述蛋白质上存在的潜在T细胞表位的数目来改变。鉴定沿着FVIII蛋白的包括T细胞表位的许多区域，包括例如FVIII^2030-2044。根据本公开，移除所述区域可用以提供不诱导抗FVIII抗体产生的功能性FVIII蛋白。WO 09/071886还公开了预计会产生患者免疫反应中所涉及的HLA-DR2结合肽的FVIII蛋白特定区域，如FVIII^475-495、FVIII^542-562、FVIII^1785-1805以及FVIII^2158-2178。鉴定可能用以在患者中诱导免疫耐受性的肽。

虽然在鉴定免疫反应中所涉及的FVIII蛋白的区域方面已有进展，但仍需要鉴定FVIII蛋白的可用于发展其它治疗性肽和方法的其它区域，所述方法可以例如用以治疗甲型血友病患者。

发明概述

本发明是基于鉴定FVIII蛋白的与针对FVIII分子的免疫反应相关的区域。更确切地讲，包含FVIII蛋白的所述区域的FVIII肽可用于在患有例如甲型血友病的患者中诱导对人类FVIII的耐受性。此外，所述FVIII肽可用于免疫诊断目的，以便在替补疗法期间并且在免疫耐受性诱导疗法期间监测患有甲型血友病的患者。

在一方面中，本发明提供一种在有需要的受试者中诱导对FVIII的免疫耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用治疗有效量的具有由(R¹)_x-P-(R²)_y组成的氨基酸序列的肽，其中：P为与选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:344以及SEQ IDNO:740的序列的至少九个连续氨基酸具有至少85%同一性的氨基酸序列；R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:10的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:10的至少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:68的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:68的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:68的至少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的至少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，x和y都为0。

在上文所提供方法的一个实施方案中，x为1且y为0。

在上文所提供方法的一个实施方案中，x为0且y为1。

在上文所提供方法的一个实施方案中，x和y都为0。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述肽由9至100个氨基酸组成。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述肽由9至50个氨基酸组成。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述肽由9至25个氨基酸组成。

在上文所提供方法的一个实施方案中，施用药物组合物可防止在受试者中发展抗FVIII抗体。

在上文所提供方法的一个实施方案中，施用药物组合物可减少在受试者中存在的抗FVIII抗体的量。

在一方面中，本发明提供一种由氨基酸序列(R¹)_x-P-(R²)_y组成的肽，其中：P为与选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:568、SEQ ID NO:659以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列；R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:10的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:10的至少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:68的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:68的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:68的至少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的至少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，x和y都为0。

在上文所提供肽的一个实施方案中，x为1且y为0。

在上文所提供肽的一个实施方案中，x为0且y为1。

在上文所提供肽的一个实施方案中，x和y都为0。

在上文所提供肽的一个实施方案中，所述肽由9至100个氨基酸组成。

在上文所提供肽的一个实施方案中，所述肽由9至50个氨基酸组成。

在上文所提供肽的一个实施方案中，所述肽由9至25个氨基酸组成。

在一方面中，本发明提供一种包含如本文所述的肽的组合物。

在上文所提供的组合物的一个实施方案中，所述组合物被配制成用于药物施用。

在上文所提供的组合物的一个实施方案中，所述组合物进一步包含第二多肽，所述第二多肽由氨基酸序列(R¹)_x-P-(R²)_y组成，其中：P为与选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:159、SEQ IDNO:250、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:568、SEQ ID NO:659以及SEQID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列；R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1。

在一方面中，本发明提供一种制造FVIII肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含编码根据权利要求24至41中任一项所述的FVIII肽的多核苷酸的细胞培养物；和b)在所述细胞培养物中表达所述肽。

在一方面中，本发明提供一种鉴定FVIII肽特异性T细胞的方法，所述方法包括：a)使多种CD4+T细胞与同MHC II类多聚体复合的肽进行组合，其中所述肽为根据权利要求24至41中任一项所述的FVIII肽；和b)鉴定对与MHC II类多聚体复合的肽具有特异性的所述多种CD4+T细胞中的至少一员。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述MHC II类多聚体为MHC II类四聚体。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述肽或MHC II类多聚体进一步包含可检测部分。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括分离对所述肽具有特异性的至少一种CD4+T细胞。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述CD4+T细胞是使用流动式细胞测量术进行分离。

在一方面中，本发明提供一种融合蛋白，其包含如本文中所提供的FVIII肽和第二肽。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述第二肽为报导体肽。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述融合蛋白由核酸编码。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述FVIII肽被化学连接至所述第二肽。

在一方面中，本文中所提供的FVIII肽用以诱导针对人类FVIII的免疫耐受性以便防止FVIII抑制剂发展。

在一方面中，本文中所提供的FVIII肽用以诱导针对人类FVIII的免疫耐受性以便治疗具有确定的FVIII抑制剂的患者。

在一方面中，本文中所提供的FVIII肽用以产生适于在替补疗法期间或在免疫耐受性诱导疗法期间在免疫监测患者时使FVIII特异性T细胞直接染色的试剂(例如MHC II类多聚体或MHC II类四聚体)。

在一方面中，本文中所提供的FVIII肽用以鉴定抗原特异性T细胞。在一个实施方案中，这些试剂可用于在体外和离体环境中追踪FVIII特异性T细胞。在另一实施方案中，这些试剂可用于分离和进一步表征FVIII特异性T细胞。在一个实施方案中，荧光活化细胞分选(fluorescent activated cell sorting；FACS)或单细胞PCR可用于这些目的。

在一方面中，本文中所提供的FVIII肽用于在免疫耐受性诱导疗法期间免疫监测FVIII特异性T细胞。

在一方面中，本文中所提供的FVIII肽用于在FVIII治疗期间免疫监测FVIII特异性T细胞。

在一方面中，本文中所提供的FVIII肽用于在临床开发用于防止FVIII抑制剂产生的新型免疫调节剂期间免疫诊断FVIII特异性T细胞。

附图简述

不适用。

发明详述

I.引言

本发明涉及因子VIII(FVIII)肽，其可用于在例如患有甲型血友病的患者中诱导对FVIII蛋白的耐受性。此外，所述肽可用于免疫诊断目的，以便在替补疗法期间并且在免疫耐受性诱导疗法期间在患有甲型血友病的患者中监测FVIII特异性T细胞。

本发明部分基于以下发现：FVIII的数个区域(确切地讲有FVIII^102-122、FVIII^246-266以及FVIII^1401-1424)涉及在因子VIII替补疗法期间针对FVIII蛋白产生的免疫反应中或与后天性血友病相关联。所鉴定的区域的氨基酸序列分别为TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQID NO:740)、AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO:68)以及QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)。相信本发明提供这些FVIII蛋白区和它们与对FVIII蛋白的免疫反应的关系的第一次鉴定。

本发明的肽包括具有区域FVIII^102-122、FVIII^246-266以及FVIII^1401-1424的至少一部分的肽，所述肽与MHC II类分子复合而产生能够由患者免疫反应中所涉及的T细胞识别的T细胞表位。在一些实施方案中，所述肽包括至少九个邻接氨基酸，所述至少九个邻接氨基酸与FVIII^102-122、FVIII^246-266或FVIII^1401-1424中的九个邻接氨基酸相对应。如下文进一步描述，本文中所提供的肽还包括长度上长于九个氨基酸的肽和FVIII^102-122、FVIII^246-266以及FVIII^1401-1424序列的变异体。本发明肽的这种鉴定可牵涉在改进和推进被设计以治疗与血液凝固相关的疾病(如甲型血友病)的治疗性策略方面。

II.定义

术语“因子VIII蛋白”或“FVIII蛋白”是指具有完整B域的至少一部分并且展现出与天然人类FVIII蛋白有关的生物活性的任何FVIII分子。FVIII分子可以为全长FVIII。FVIII分子还可以为天然FVIII的经过保守修饰的变异体。FVIII蛋白可来源于人类血浆或通过重组工程改造技术产生。FVIII蛋白的其它表征可例如见于US2010/0168018的段落[0042]-[0055]，所述文献是以引用的方式并入本文中。

术语“因子VIII肽”或“FVIII肽”是指本文所述的肽，其包含对应于被发现在针对FVIII的免疫反应中至关重要的FVIII蛋白的区域的氨基酸序列。FVIII肽包含至少九个氨基酸，所述至少九个氨基酸与MHC II类蛋白复合以便呈现给免疫反应中所涉及的T细胞。其它氨基酸可以存在于所述肽的至少九个氨基酸核心的任一端。在一些实施方案中，FVIII肽可以包含与天然人类FVIII蛋白的特定区域一致的序列。在其它实施方案中，FVIII肽可以为FVIII蛋白的区域的经过保守修饰的变异体。如本文中进一步描述，FVIII肽的特征可以为相对于天然人类FVIII蛋白的区域的序列的某种同一性百分比(例如85%一致)。

术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和非天然氨基酸，包括以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸包括由遗传密码编码的氨基酸以及后来修饰的氨基酸，例如羟基脯氨酸、y-羧基谷氨酸以及O-磷酸丝氨酸。天然存在的氨基酸可以包括例如D-氨基酸和L-氨基酸。本文中所用的氨基酸还可以包括非天然氨基酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基以及R基键接的任何碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸甲基锍。所述类似物具有经过修饰的R基(例如正亮氨酸)或经过修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构、但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。氨基酸在本文中可以用其通常已知的三字母符号或用由IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的一字母符号提及。同样，核苷酸可以用其通常认可的单字母代码提及。

“经过保守修饰的变异体”适用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定核酸序列，经过保守修饰的变异体是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的核酸，或当核酸并不编码氨基酸序列时，是指基本上一致的序列。由于遗传密码的简并，大量功能上相同的核酸编码任何给定的肽。例如，密码子GCA、GCC、GCG以及GCU皆编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置上，密码子可以变成所描述的相应密码子中的任一个，而不改变所编码的多肽。所述核酸变异为“沉默变异”，其为一种经过保守修饰的变异。本文中编码多肽的每个核酸序列还说明每种可能的核酸沉默变异。本领域的普通技术人员将认识到核酸中的各密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG以外)可被修饰以获得功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各沉默变异在相对于表达产物而非相对于实际探测序列所述的各序列中为隐含的。

关于氨基酸序列，本领域的普通技术人员将认识到改变、添加或删除编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对于核酸或肽序列的个别取代、删除或添加为“经过保守修饰的变异”，其中变化使得氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。提供功能上类似的氨基酸的保守性取代表格在本领域中是熟知的。所述经过保守修饰的变异体为除了本发明的多态变异体、种间同系物以及等位基因以外的变异体并且并不排除本发明的多态变异体、种间同系物以及等位基因。

以下八组各含有可以为彼此的保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。参见例如Creighton,Proteins(1984)。

在两个或两个以上核酸或肽序列的背景中，术语“一致”或“同一性”百分比是指如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法与如下所述的预设参数或通过人工比对和目视检查所测量，两个或两个以上序列或子序列相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当比较和比对与比较窗或指定区相比的最大对应性时，相比于指定区有约60%同一性，优选为65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性)。

“治疗有效量或剂量”或“足够量或剂量”在本文中意指在施用时产生效应的剂量。精确剂量将取决于治疗目的并且可以由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如Augsburger & Hoag,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,第3版,2008)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(第3版,2008)；Pickar,Dosage Calculations(第8版,2007)；以及Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第21版,2005,Gennaro编,Lippincott,Williams & Wilkins)。

III.FVIII肽

本发明涉及与FVIII蛋白的在针对FVIII的免疫反应中涉及的区域对应的FVIII肽。在一方面中，本发明提供一种FVIII肽，其由九个氨基酸的连续序列组成，所述序列与以下氨基酸序列之一中的九个连续氨基酸至少85%一致：AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ IDNO:68)；QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)；或TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO:740)，其中所述肽由9至180个氨基酸组成。

在一个特定实施方案中，所述FVIII肽具有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:344以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列；R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1。在一个实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列，且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180个氨基酸组成。

一般来说，本发明的FVIII肽可以包括FVIII^102-122、FVIII^246-266或FVIII^1401-1424、或经过修饰的变异体的鉴定区中所存在的任何氨基酸序列，所述变异体可以例如具有与FVIII^102-122、FVIII^246-266或FVIII^1401-1424相似或相同的保留功能。具体来说，本发明的FVIII肽包含含有T细胞表位的氨基酸序列。所述FVIII肽包括相对于氨基酸序列AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO:68)、QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)、或TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO:740)的氨基酸序列，同一性百分比可在一定范围内变化的至少九个氨基酸的序列。例如，FVIII肽可以具有与FVIII^102-122、FVIII^246-266或FVIII^1401-1424中任意九个连续氨基酸一致或至少50%、60%、70%、80%或85%(百分比)一致的九个氨基酸。

在另一组实施方案中，FVIII肽可以具有多于九个氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括可以与FVIII^102-122、FVIII^246-266或FVIII^1401-1424中的连续氨基酸序列一致或至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(百分比)一致的区域。本领域的普通技术人员应了解已知诱变技术(如丙氨酸取代)可以用以鉴定保留FVIII^102-122、FVIII^246-266或FVIII^1401-1424区的功能的经过修饰的变异体。

另外，FVIII肽可以在上文所论述的FVIII肽核心序列的任一端进一步包括其它氨基酸序列。其它序列指示为(R¹)_x和(R²)_y。在某些实施方案中，R¹和R²的长度范围可介于1至约80个氨基酸。或者，R¹和R²的长度范围可介于1至约40个氨基酸。在某些实施方案中，下标x和y各独立地为0或1。在一些实施方案中，x与y可以均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与y均为1。由于以下各种原因可以在任一端添加其它氨基酸，所述原因包括增加肽稳定性、改善与MHC II类分子和/或T细胞的结合以及本领域的普通技术人员所将了解的其它方面。

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多肽，其中P为与表1中所鉴定的因子VIII区的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立地为0或1。或者，R¹和R²的长度范围可介于1至约40个氨基酸。在一个实施方案中，P为与表1中所鉴定的因子VIII区的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在另一实施方案中，P为与表1中所鉴定的因子VIII区的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。在一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至25个氨基酸组成。

表1.FVIII的包括T细胞表位的区域

包括T细胞表位的区域	氨基酸序列
		FVIII^102-119	TVVITLKNMASHPVSLHA(SEQ ID NO:10)
FVIII^246-266	AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO:68)
		FVIII^474-494	GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ ID NO:159)
FVIII^540-560	PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ ID NO:250)
		FVIII^1401-1424	QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)
FVIII^1785-1805	EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID NO:477)
		FVIII^2025-2045	LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ ID NO:568)
FVIII^2160-2180	NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ ID NO:659)
		FVIII^102-122	TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO:740)

如上所述，本发明的FVIII肽可以包括FVIII^1401-1424、或经修饰的变异体的鉴定区中所存在的任何氨基酸序列，所述变异体可以例如具有与FVIII^1401-1424相似或一致的保留功能。在某些实施方案中，所述肽可涵盖人类FVIII蛋白的整个B域。本发明还可以包括其它FVIII肽，所述肽包括具有至少九个氨基酸的序列的肽，所述序列相对于以下氨基酸序列中的任一个的同一性百分比可在一定范围内变化：GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(FVIII^474-494；SEQ ID NO:159)、PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(FVIII^540-560；SEQ ID NO:250)、EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(FVIII^1785-1805；SEQ ID NO:477)、LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(FVIII^2025-2045；SEQ ID NO:568)、NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(FVIII^2160-2180；SEQ ID NO:659)、TVVITLKNMASHPVSLHA(FVIII^102-119；SEQ ID NO:10)、AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(FVIII^246-266；SEQ ID NO:68)以及TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(FVIII^102-122；SEQ ID NO:740)。

例如，FVIII肽具有与FVIII^474-494、FVIII^540-560、FVIII^1785-1805、FVIII^2025-2045、FVIII^2160-2180、FVIII^102-119、FVIII^246-266或FVIII^102-122中任意九个连续氨基酸一致或至少50%、60%、70%、80%或85%(百分比)一致的九个氨基酸。在另一组实施方案中，FVIII肽可以具有多于九个氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列可以与FVIII^474-494、FVIII^540-560、FVIII^1785-1805、FVIII^2025-2045、FVIII^2160-2180、FVIII^102-119、FVIII^246-266或FVIII^102-122中任意九个连续氨基酸一致或至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(百分比)一致。本领域的普通技术人员应了解，已知诱变技术(如丙氨酸取代)可以用以鉴定保留FVIII^474-494、FVIII^540-560、FVIII^1785-1805、FVIII^2025-2045、FVIII^2160-2180、FVIII^102-119、FVIII^246-266或FVIII^102-122区域的功能的经过修饰的变异体。此处所公开的FVIII肽可以使用以上关于与FVIII^1401-1424有关的FVIII肽所述的方法制得。

A.因子VIII^102-119肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多肽，其中P为与具有序列：TVVITLKNMASHPVSLHA(SEQ ID NO:10)的因子VIII^102-119肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，并且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列：TVVITLKNMASHPVSLHA(SEQ ID NO:10)的因子VIII^102-119肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQID NO:1至SEQ ID NO:55(SEQ ID NO:10)的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:1至SEQID NO:55的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。

在某些实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列，且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。在一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180个氨基酸组成。

表2.示例性FVIII^102-119肽

肽	序列	SEQ ID NO:
			FVIII^102-119-1	TVVITLKNM	1
FVIII^102-119-2	TVVITLKNMA	2
			FVIII^102-119-3	TVVITLKNMAS	3
FVIII^102-119-4	TVVITLKNMASH	4
			FVIII^102-119-5	TVVITLKNMASHP	5
FVIII^102-119-6	TVVITLKNMASHPV	6
			FVIII^102-119-7	TVVITLKNMASHPVS	7
FVIII^102-119-8	TVVITLKNMASHPVSL	8
			FVIII^102-119-9	TVVITLKNMASHPVSLH	9
FVIII^102-119-10	TVVITLKNMASHPVSLHA	10
			FVIII^102-119-11	VVITLKNMA	11
FVIII^102-119-12	VVITLKNMAS	12
			FVIII^102-119-13	VVITLKNMASH	13
FVIII^102-119-14	VVITLKNMASHP	14

FVIII^102-119-15	VVITLKNMASHPV	15
			FVIII^102-119-16	VVITLKNMASHPVS	16
FVIII^102-119-17	VVITLKNMASHPVSL	17
			FVIII^102-119-18	VVITLKNMASHPVSLH	18
FVIII^102-119-19	VVITLKNMASHPVSLHA	19
			FVIII^102-119-20	VITLKNMAS	20
FVIII^102-119-21	VITLKNMASH	21
			FVIII^102-119-22	VITLKNMASHP	22
FVIII^102-119-23	VITLKNMASHPV	23
			FVIII^102-119-24	VITLKNMASHPVS	24
FVIII^102-119-25	VITLKNMASHPVSL	25
			FVIII^102-119-26	VITLKNMASHPVSLH	26
FVIII^102-119-27	VITLKNMASHPVSLHA	27
			FVIII^102-119-28	ITLKNMASH	28
FVIII^102-119-29	ITLKNMASHP	29
			FVIII^102-119-30	ITLKNMASHPV	30
FVIII^102-119-31	ITLKNMASHPVS	31
			FVIII^102-119-32	ITLKNMASHPVSL	32
FVIII^102-119-33	ITLKNMASHPVSLH	33
			FVIII^102-119-34	ITLKNMASHPVSLHA	34
FVIII^102-119-35	TLKNMASHP	35
			FVIII^102-119-36	TLKNMASHPV	36
FVIII^102-119-37	TLKNMASHPVS	37
			FVIII^102-119-38	TLKNMASHPVSL	38
FVIII^102-119-39	TLKNMASHPVSLH	39
			FVIII^102-119-40	TLKNMASHPVSLHA	40
FVIII^102-119-41	LKNMASHPV	41
			FVIII^102-119-42	LKNMASHPVS	42
FVIII^102-119-43	LKNMASHPVSL	43
			FVIII^102-119-44	LKNMASHPVSLH	44
FVIII^102-119-45	LKNMASHPVSLHA	45
			FVIII^102-119-46	KNMASHPVS	46
FVIII^102-119-47	KNMASHPVSL	47
			FVIII^102-119-48	KNMASHPVSLH	48
FVIII^102-119-49	KNMASHPVSLHA	49
			FVIII^102-119-50	NMASHPVSL	50
FVIII^102-119-51	NMASHPVSLH	51
			FVIII^102-119-52	NMASHPVSLHA	52
FVIII^102-119-53	MASHPVSLH	53
			FVIII^102-119-54	MASHPVSLHA	54
FVIII^102-119-55	ASHPVSLHA	55

B.因子VIII^246-266肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多肽，其中P为与具有序列：AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ IDNO:68)的因子VIII^246-266肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列：AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO:68)的因子VIII^246-266肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与具有序列：AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO:68)的因子VIII^246-266肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQID NO:56至SEQ ID NO:146的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:146的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:146的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:56至SEQ IDNO:146的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。

表3.示例性FVIII^246-266肽

肽	序列	SEQ ID NO:
			FVIII^246-266-1	AWPKMHTVN	56
FVIII^246-266-2	AWPKMHTVNG	57
			FVIII^246-266-3	AWPKMHTVNGY	58
FVIII^246-266-4	AWPKMHTVNGYV	59
			FVIII^246-266-5	AWPKMHTVNGYVN	60
FVIII^246-266-6	AWPKMHTVNGYVNR	61
			FVIII^246-266-7	AWPKMHTVNGYVNRS	62
FVIII^246-266-8	AWPKMHTVNGYVNRSL	63
			FVIII^246-266-9	AWPKMHTVNGYVNRSLP	64
FVIII^246-266-10	AWPKMHTVNGYVNRSLPG	65
			FVIII^246-266-11	AWPKMHTVNGYVNRSLPGL	66
FVIII^246-266-12	AWPKMHTVNGYVNRSLPGLI	67

FVIII^246-266-13	AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG	68
			FVIII^246-266-14	WPKMHTVNG	69
FVIII^246-266-15	WPKMHTVNGY	70
			FVIII^246-266-16	WPKMHTVNGYV	71
FVIII^246-266-17	WPKMHTVNGYVN	72
			FVIII^246-266-18	WPKMHTVNGYVNR	73
FVIII^246-266-19	WPKMHTVNGYVNRS	74
			FVIII^246-266-20	WPKMHTVNGYVNRSL	75
FVIII^246-266-21	WPKMHTVNGYVNRSLP	76
			FVIII^246-266-22	WPKMHTVNGYVNRSLPG	77
FVIII^246-266-23	WPKMHTVNGYVNRSLPGL	78
			FVIII^246-266-24	WPKMHTVNGYVNRSLPGLI	79
FVIII^246-266-25	WPKMHTVNGYVNRSLPGLIG	80
			FVIII^246-266-26	PKMHTVNGY	81
FVIII^246-266-27	PKMHTVNGYV	82
			FVIII^246-266-28	PKMHTVNGYVN	83
FVIII^246-266-29	PKMHTVNGYVNR	84
			FVIII^246-266-30	PKMHTVNGYVNRS	85
FVIII^246-266-31	PKMHTVNGYVNRSL	86
			FVIII^246-266-32	PKMHTVNGYVNRSLP	87
FVIII^246-266-33	PKMHTVNGYVNRSLPG	88
			FVIII^246-266-34	PKMHTVNGYVNRSLPGL	89
FVIII^246-266-35	PKMHTVNGYVNRSLPGLI	90
			FVIII^246-266-36	PKMHTVNGYVNRSLPGLIG	91
FVIII^246-266-37	KMHTVNGYV	92
			FVIII^246-266-38	KMHTVNGYVN	93
FVIII^246-266-39	KMHTVNGYVNR	94
			FVIII^246-266-40	KMHTVNGYVNRS	95
FVIII^246-266-41	KMHTVNGYVNRSL	96
			FVIII^246-266-42	KMHTVNGYVNRSLP	97
FVIII^246-266-43	KMHTVNGYVNRSLPG	98
			FVIII^246-266-44	KMHTVNGYVNRSLPGL	99
FVIII^246-266-45	KMHTVNGYVNRSLPGLI	100
			FVIII^246-266-46	KMHTVNGYVNRSLPGLIG	101
FVIII^246-266-47	MHTVNGYVN	102
			FVIII^246-266-48	MHTVNGYVNR	103
FVIII^246-266-49	MHTVNGYVNRS	104
			FVIII^246-266-50	MHTVNGYVNRSL	105
FVIII^246-266-51	MHTVNGYVNRSLP	106
			FVIII^246-266-52	MHTVNGYVNRSLPG	107
FVIII^246-266-53	MHTVNGYVNRSLPGL	108
			FVIII^246-266-54	MHTVNGYVNRSLPGLI	109
FVIII^246-266-55	MHTVNGYVNRSLPGLIG	110
			FVIII^246-266-56	HTVNGYVNR	111
FVIII^246-266-57	HTVNGYVNRS	112
			FVIII^246-266-58	HTVNGYVNRSL	113
FVIII^246-266-59	HTVNGYVNRSLP	114
			FVIII^246-266-60	HTVNGYVNRSLPG	115

FVIII^246-266-61	HTVNGYVNRSLPGL	116
			FVIII^246-266-62	HTVNGYVNRSLPGLI	117
FVIII^246-266-63	HTVNGYVNRSLPGLIG	118
			FVIII^246-266-64	TVNGYVNRS	119
FVIII^246-266-65	TVNGYVNRSL	120
			FVIII^246-266-66	TVNGYVNRSLP	121
FVIII^246-266-67	TVNGYVNRSLPG	122
			FVIII^246-266-68	TVNGYVNRSLPGL	123
FVIII^246-266-69	TVNGYVNRSLPGLI	124
			FVIII^246-266-70	TVNGYVNRSLPGLIG	125
FVIII^246-266-71	VNGYVNRSL	126
			FVIII^246-266-72	VNGYVNRSLP	127
FVIII^246-266-73	VNGYVNRSLPG	128
			FVIII^246-266-74	VNGYVNRSLPGL	129
FVIII^246-266-75	VNGYVNRSLPGLI	130
			FVIII^246-266-76	VNGYVNRSLPGLIG	131
FVIII^246-266-77	NGYVNRSLP	132
			FVIII^246-266-78	NGYVNRSLPG	133
FVIII^246-266-79	NGYVNRSLPGL	134
			FVIII^246-266-80	NGYVNRSLPGLI	135
FVIII^246-266-81	NGYVNRSLPGLIG	136
			FVIII^246-266-82	GYVNRSLPG	137
FVIII^246-266-83	GYVNRSLPGL	138
			FVIII^246-266-84	GYVNRSLPGLI	139
FVIII^246-266-85	GYVNRSLPGLIG	140
			FVIII^246-266-86	YVNRSLPGL	141
FVIII^246-266-87	YVNRSLPGLI	142
			FVIII^246-266-88	YVNRSLPGLIG	143
FVIII^246-266-89	VNRSLPGLI	144
			FVIII^246-266-90	VNRSLPGLIG	145
FVIII^246-266-91	NRSLPGLIG	146

C.因子VIII^474-494肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多肽，其中P为与具有序列：GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ IDNO:159)的因子VIII^474-494肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列：GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ ID NO:159)的因子VIII^474-494肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与具有序列：GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQID NO:159)的因子VIII^474-494肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ IDNO:147至SEQ ID NO:237的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:147至SEQ ID NO:237的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:147至SEQ ID NO:237的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:147至SEQ IDNO:237的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。

表4.示例性FVIII^474-494肽

肽	序列	SEQ ID NO:
			FVIII^474-494-1	GEVGDTLLI	147

FVIII^474-494-2	GEVGDTLLII	148
			FVIII^474-494-3	GEVGDTLLIIF	149
FVIII^474-494-4	GEVGDTLLIIFK	150
			FVIII^474-494-5	GEVGDTLLIIFKN	151
FVIII^474-494-6	GEVGDTLLIIFKNQ	152
			FVIII^474-494-7	GEVGDTLLIIFKNQA	153
FVIII^474-494-8	GEVGDTLLIIFKNQAS	154
			FVIII^474-494-9	GEVGDTLLIIFKNQASR	155
FVIII^474-494-10	GEVGDTLLIIFKNQASRP	156
			FVIII^474-494-11	GEVGDTLLIIFKNQASRPY	157
FVIII^474-494-12	GEVGDTLLIIFKNQASRPYN	158
			FVIII^474-494-13	GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI	159
FVIII^474-494-14	EVGDTLLII	160
			FVIII^474-494-15	EVGDTLLIIF	161
FVIII^474-494-16	EVGDTLLIIFK	162
			FVIII^474-494-17	EVGDTLLIIFKN	163
FVIII^474-494-18	EVGDTLLIIFKNQ	164
			FVIII^474-494-19	EVGDTLLIIFKNQA	165
FVIII^474-494-20	EVGDTLLIIFKNQAS	166
			FVIII^474-494-21	EVGDTLLIIFKNQASR	167
FVIII^474-494-22	EVGDTLLIIFKNQASRP	168
			FVIII^474-494-23	EVGDTLLIIFKNQASRPY	169
FVIII^474-494-24	EVGDTLLIIFKNQASRPYN	170
			FVIII^474-494-25	EVGDTLLIIFKNQASRPYNI	171
FVIII^474-494-26	VGDTLLIIF	172
			FVIII^474-494-27	VGDTLLIIFK	173
FVIII^474-494-28	VGDTLLIIFKN	174
			FVIII^474-494-29	VGDTLLIIFKNQ	175
FVIII^474-494-30	VGDTLLIIFKNQA	176
			FVIII^474-494-31	VGDTLLIIFKNQAS	177
FVIII^474-494-32	VGDTLLIIFKNQASR	178
			FVIII^474-494-33	VGDTLLIIFKNQASRP	179
FVIII^474-494-34	VGDTLLIIFKNQASRPY	180
			FVIII^474-494-35	VGDTLLIIFKNQASRPYN	181
FVIII^474-494-36	VGDTLLIIFKNQASRPYNI	182
			FVIII^474-494-37	GDTLLIIFK	183
FVIII^474-494-38	GDTLLIIFKN	184
			FVIII^474-494-39	GDTLLIIFKNQ	185
FVIII^474-494-40	GDTLLIIFKNQA	186
			FVIII^474-494-41	GDTLLIIFKNQAS	187
FVIII^474-494-42	GDTLLIIFKNQASR	188
			FVIII^474-494-43	GDTLLIIFKNQASRP	189
FVIII^474-494-44	GDTLLIIFKNQASRPY	190
			FVIII^474-494-45	GDTLLIIFKNQASRPYN	191
FVIII^474-494-46	GDTLLIIFKNQASRPYNI	192
			FVIII^474-494-47	DTLLIIFKN	193
FVIII^474-494-48	DTLLIIFKNQ	194
			FVIII^474-494-49	DTLLIIFKNQA	195

FVIII^474-494-50	DTLLIIFKNQAS	196
			FVIII^474-494-51	DTLLIIFKNQASR	197
FVIII^474-494-52	DTLLIIFKNQASRP	198
			FVIII^474-494-53	DTLLIIFKNQASRPY	199
FVIII^474-494-54	DTLLIIFKNQASRPYN	200
			FVIII^474-494-55	DTLLIIFKNQASRPYNI	201
FVIII^474-494-56	TLLIIFKNQ	202
			FVIII^474-494-57	TLLIIFKNQA	203
FVIII^474-494-58	TLLIIFKNQAS	204
			FVIII^474-494-59	TLLIIFKNQASR	205
FVIII^474-494-60	TLLIIFKNQASRP	206
			FVIII^474-494-61	TLLIIFKNQASRPY	207
FVIII^474-494-62	TLLIIFKNQASRPYN	208
			FVIII^474-494-63	TLLIIFKNQASRPYNI	209
FVIII^474-494-64	LLIIFKNQA	210
			FVIII^474-494-65	LLIIFKNQAS	211
FVIII^474-494-66	LLIIFKNQASR	212
			FVIII^474-494-67	LLIIFKNQASRP	213
FVIII^474-494-68	LLIIFKNQASRPY	214
			FVIII^474-494-69	LLIIFKNQASRPYN	215
FVIII^474-494-70	LLIIFKNQASRPYNI	216
			FVIII^474-494-71	LIIFKNQAS	217
FVIII^474-494-72	LIIFKNQASR	218
			FVIII^474-494-73	LIIFKNQASRP	219
FVIII^474-494-74	LIIFKNQASRPY	220
			FVIII^474-494-75	LIIFKNQASRPYN	221
FVIII^474-494-76	LIIFKNQASRPYNI	222
			FVIII^474-494-77	IIFKNQASR	223
FVIII^474-494-78	IIFKNQASRP	224
			FVIII^474-494-79	IIFKNQASRPY	225
FVIII^474-494-80	IIFKNQASRPYN	226
			FVIII^474-494-81	IIFKNQASRPYNI	227
FVIII^474-494-82	IFKNQASRP	228
			FVIII^474-494-83	IFKNQASRPY	229
FVIII^474-494-84	IFKNQASRPYN	230
			FVIII^474-494-85	IFKNQASRPYNI	231
FVIII^474-494-86	FKNQASRPY	232
			FVIII^474-494-87	FKNQASRPYN	233
FVIII^474-494-88	FKNQASRPYNI	234
			FVIII^474-494-89	KNQASRPYN	235
FVIII^474-494-90	KNQASRPYNI	236
			FVIII^474-494-91	NQASRPYNI	237

D.因子VIII^540-560肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多肽，其中P为与具有序列：PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ IDNO:250)的因子VIII^540-560肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列：PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ ID NO:250)的因子VIII^540-560肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与具有序列：PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ ID NO:250)的因子VIII^540-560肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQID NO:238至SEQ ID NO:328的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:238至SEQ ID NO:328的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:238至SEQ ID NO:328的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:238至SEQ IDNO:328的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。

表5.示例性FVIII^540-560肽

肽	序列	SEQ ID NO:
			FVIII^540-560-1	PTKSDPRCL	238
FVIII^540-560-2	PTKSDPRCLT	239
			FVIII^540-560-3	PTKSDPRCLTR	240
FVIII^540-560-4	PTKSDPRCLTRY	241
			FVIII^540-560-5	PTKSDPRCLTRYY	242
FVIII^540-560-6	PTKSDPRCLTRYYS	243
			FVIII^540-560-7	PTKSDPRCLTRYYSS	244
FVIII^540-560-8	PTKSDPRCLTRYYSSF	245
			FVIII^540-560-9	PTKSDPRCLTRYYSSFV	246
FVIII^540-560-10	PTKSDPRCLTRYYSSFVN	247

FVIII^540-560-11	PTKSDPRCLTRYYSSFVNM	248
			FVIII^540-560-12	PTKSDPRCLTRYYSSFVNME	249
FVIII^540-560-13	PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER	250
			FVIII^540-560-14	TKSDPRCLT	251
FVIII^540-560-15	TKSDPRCLTR	252
			FVIII^540-560-16	TKSDPRCLTRY	253
FVIII^540-560-17	TKSDPRCLTRYY	254
			FVIII^540-560-18	TKSDPRCLTRYYS	255
FVIII^540-560-19	TKSDPRCLTRYYSS	256
			FVIII^540-560-20	TKSDPRCLTRYYSSF	257
FVIII^540-560-21	TKSDPRCLTRYYSSFV	258
			FVIII^540-560-22	TKSDPRCLTRYYSSFVN	259
FVIII^540-560-23	TKSDPRCLTRYYSSFVNM	260
			FVIII^540-560-24	TKSDPRCLTRYYSSFVNME	261
FVIII^540-560-25	TKSDPRCLTRYYSSFVNMER	262
			FVIII^540-560-26	KSDPRCLTR	263
FVIII^540-560-27	KSDPRCLTRY	264
			FVIII^540-560-28	KSDPRCLTRYY	265
FVIII^540-560-29	KSDPRCLTRYYS	266
			FVIII^540-560-30	KSDPRCLTRYYSS	267
FVIII^540-560-31	KSDPRCLTRYYSSF	268
			FVIII^540-560-32	KSDPRCLTRYYSSFV	269
FVIII^540-560-33	KSDPRCLTRYYSSFVN	270
			FVIII^540-560-34	KSDPRCLTRYYSSFVNM	271
FVIII^540-560-35	KSDPRCLTRYYSSFVNME	272
			FVIII^540-560-36	KSDPRCLTRYYSSFVNMER	273
FVIII^540-560-37	SDPRCLTRY	274
			FVIII^540-560-38	SDPRCLTRYY	275
FVIII^540-560-39	SDPRCLTRYYS	276
			FVIII^540-560-40	SDPRCLTRYYSS	277
FVIII^540-560-41	SDPRCLTRYYSSF	278
			FVIII^540-560-42	SDPRCLTRYYSSFV	279
FVIII^540-560-43	SDPRCLTRYYSSFVN	280
			FVIII^540-560-44	SDPRCLTRYYSSFVNM	281
FVIII^540-560-45	SDPRCLTRYYSSFVNME	282
			FVIII^540-560-46	SDPRCLTRYYSSFVNMER	283
FVIII^540-560-47	DPRCLTRYY	284
			FVIII^540-560-48	DPRCLTRYYS	285
FVIII^540-560-49	DPRCLTRYYSS	286
			FVIII^540-560-50	DPRCLTRYYSSF	287
FVIII^540-560-51	DPRCLTRYYSSFV	288
			FVIII^540-560-52	DPRCLTRYYSSFVN	289
FVIII^540-560-53	DPRCLTRYYSSFVNM	290
			FVIII^540-560-54	DPRCLTRYYSSFVNME	291
FVIII^540-560-55	DPRCLTRYYSSFVNMER	292
			FVIII^540-560-56	PRCLTRYYS	293
FVIII^540-560-57	PRCLTRYYSS	294
			FVIII^540-5⁶⁰-58	PRCLTRYYSSF	295

FVIII^540-560-59	PRCLTRYYSSFV	296
			FVIII^540-560-60	PRCLTRYYSSFVN	297
FVIII^540-560-61	PRCLTRYYSSFVNM	298
			FVIII^540-560-62	PRCLTRYYSSFVNME	299
FVIII^540-560-63	PRCLTRYYSSFVNMER	300
			FVIII^540-560-64	RCLTRYYSS	301
FVIII^540-560-65	RCLTRYYSSF	302
			FVIII^540-560-66	RCLTRYYSSFV	303
FVIII^540-560-67	RCLTRYYSSFVN	304
			FVIII^540-560-68	RCLTRYYSSFVNM	305
FVIII^540-560-69	RCLTRYYSSFVNME	306
			FVIII^540-560-70	RCLTRYYSSFVNMER	307
FVIII^540-560-71	CLTRYYSSF	308
			FVIII^540-560-72	CLTRYYSSFV	309
FVIII^540-560-73	CLTRYYSSFVN	310
			FVIII^540-560-74	CLTRYYSSFVNM	311
FVIII^540-560-75	CLTRYYSSFVNME	312
			FVIII^540-560-76	CLTRYYSSFVNMER	313
FVIII^540-560-77	LTRYYSSFV	314
			FVIII^540-560-78	LTRYYSSFVN	315
FVIII^540-560-79	LTRYYSSFVNM	316
			FVIII^540-560-80	LTRYYSSFVNME	317
FVIII^540-560-81	LTRYYSSFVNMER	318
			FVIII^540-560-82	TRYYSSFVN	319
FVIII^540-560-83	TRYYSSFVNM	320
			FVIII^540-560-84	TRYYSSFVNME	321
FVIII^540-560-85	TRYYSSFVNMER	322
			FVIII^540-560-86	RYYSSFVNM	323
FVIII^540-560-87	RYYSSFVNME	324
			FVIII^540-560-88	RYYSSFVNMER	325
FVIII^540-560-89	YYSSFVNME	326
			FVIII^540-560-90	YYSSFVNMER	327
FVIII^540-560-91	YSSFVNMER	328

E.因子VIII^1401-1424肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多肽，其中P为与具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ IDNO:344)的因子VIII^1401-1424肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)的因子VIII^1401-1424肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)的因子VIII^1401-1424肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:329至SEQ ID NO:464的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:329至SEQ ID NO:464的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:329至SEQ IDNO:464的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:329至SEQ ID NO:464的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。

表6.示例性FVIII^1401-1424肽

肽	序列	SEQ ID NO:
			FVIII^1401-1424-1	QANRSPLPI	329
FVIII^1401-1424-2	QANRSPLPIA	330
			FVIII^1401-1424-3	QANRSPLPIAK	331
FVIII^1401-1424-4	QANRSPLPIAKV	332
			FVIII^1401-1424-5	QANRSPLPIAKVS	333
FVIII^1401-1424-6	QANRSPLPIAKVSS	334
			FVIII^1401-1424-7	QANRSPLPIAKVSSF	335
FVIII^1401-1424-8	QANRSPLPIAKVSSFP	336
			FVIII^1401-1424-9	QANRSPLPIAKVSSFPS	337
FVIII^1401-1424-10	QANRSPLPIAKVSSFPSI	338
			FVIII^1401-1424-11	QANRSPLPIAKVSSFPSIR	339
FVIII^1401-1424-12	QANRSPLPIAKVSSFPSIRP	340
			FVIII^1401-1424-13	QANRSPLPIAKVSSFPSIRPI	341
FVIII^1401-1424-14	QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIY	342
			FVIII^1401-1424-15	QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYL	343
FVIII^1401-1424-16	QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT	344
			FVIII^1401-1424-17	ANRSPLPIA	345

FVIII^1401-1424-18	ANRSPLPIAK	346
			FVIII^1401-1424-19	ANRSPLPIAKV	347
FVIII^1401-1424-20	ANRSPLPIAKVS	348
			FVIII^1401-1424-21	ANRSPLPIAKVSS	349
FVIII^1401-1424-22	ANRSPLPIAKVSSF	350
			FVIII^1401-1424-23	ANRSPLPIAKVSSFP	351
FVIII^1401-1424-24	ANRSPLPIAKVSSFPS	352
			FVIII^1401-1424-25	ANRSPLPIAKVSSFPSI	353
FVIII^1401-1424-26	ANRSPLPIAKVSSFPSIR	354
			FVIII^1401-1424-27	ANRSPLPIAKVSSFPSIRP	355
FVIII^1401-1424-28	ANRSPLPIAKVSSFPSIRPI	356
			FVIII^1401-1424-29	ANRSPLPIAKVSSFPSIRPIY	357
FVIII^1401-1424-30	ANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYL	358
			FVIII^1401-1424-31	ANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT	359
FVIII^1401-1424-32	NRSPLPIAK	360
			FVIII^1401-1424-33	NRSPLPIAKV	361
FVIII^1401-1424-34	NRSPLPIAKVS	362
			FVIII^1401-1424-35	NRSPLPIAKVSS	363
FVIII^1401-1424-36	NRSPLPIAKVSSF	364
			FVIII^1401-1424-37	NRSPLPIAKVSSFP	365
FVIII^1401-1424-38	NRSPLPIAKVSSFPS	366
			FVIII^1401-1424-39	NRSPLPIAKVSSFPSI	367
FVIII^1401-1424-40	NRSPLPIAKVSSFPSIR	368
			FVIII^1401-1424-41	NRSPLPIAKVSSFPSIRP	369
FVIII^1401-1424-42	NRSPLPIAKVSSFPSIRPI	370
			FVIII^1401-1424-43	NRSPLPIAKVSSFPSIRPIY	371
FVIII^1401-1424-44	NRSPLPIAKVSSFPSIRPIYL	372
			FVIII^1401-1424-45	NRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT	373
FVIII^1401-1424-46	RSPLPIAKV	374
			FVIII^1401-1424-47	RSPLPIAKVS	375
FVIII^1401-1424-48	RSPLPIAKVSS	376
			FVIII^1401-1424-49	RSPLPIAKVSSF	377
FVIII^1401-1424-50	RSPLPIAKVSSFP	378
			FVIII^1401-1424-51	RSPLPIAKVSSFPS	379
FVIII^1401-1424-52	RSPLPIAKVSSFPSI	380
			FVIII^1401-1424-53	RSPLPIAKVSSFPSIR	381
FVIII^1401-1424-54	RSPLPIAKVSSFPSIRP	382
			FVIII^1401-1424-55	RSPLPIAKVSSFPSIRPI	383
FVIII^1401-1424-56	RSPLPIAKVSSFPSIRPIY	384
			FVIII^1401-1424-57	RSPLPIAKVSSFPSIRPIYL	385
FVIII^1401-1424-58	RSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT	386
			FVIII^1401-1424-59	SPLPIAKVS	387
FVIII^1401-1424-60	SPLPIAKVSS	388
			FVIII^1401-1424-61	SPLPIAKVSSF	389
FVIII^1401-1424-62	SPLPIAKVSSFP	390
			FVIII^1401-1424-63	SPLPIAKVSSFPS	391
FVIII^1401-1424-64	SPLPIAKVSSFPSI	392
			FVIII^1401-1424-65	SPLPIAKVSSFPSIR	393

FVIII^1401-1424-66	SPLPIAKVSSFPSIRP	394
			FVIII^1401-1424-67	SPLPIAKVSSFPSIRPI	395
FVIII^1401-1424-68	SPLPIAKVSSFPSIRPIY	396
			FVIII^1401-1424-69	SPLPIAKVSSFPSIRPIYL	397
FVIII^1401-1424-70	SPLPIAKVSSFPSIRPIYLT	398
			FVIII^1401-1424-71	PLPIAKVSS	399
FVIII^1401-1424-72	PLPIAKVSSF	400
			FVIII^1401-1424-73	PLPIAKVSSFP	401
FVIII^1401-1424-74	PLPIAKVSSFPS	402
			FVIII^1401-1424-75	PLPIAKVSSFPSI	403
FVIII^1401-1424-76	PLPIAKVSSFPSIR	404
			FVIII^1401-1424-77	PLPIAKVSSFPSIRP	405
FVIII^1401-1424-78	PLPIAKVSSFPSIRPI	406
			FVIII^1401-1424-79	PLPIAKVSSFPSIRPIY	407
FVIII^1401-1424-80	PLPIAKVSSFPSIRPIYL	408
			FVIII^1401-1424-81	PLPIAKVSSFPSIRPIYLT	409
FVIII^1401-1424-82	LPIAKVSSF	410
			FVIII^1401-1424-83	LPIAKVSSFP	411
FVIII^1401-1424-84	LPIAKVSSFPS	412
			FVIII^1401-1424-85	LPIAKVSSFPSI	413
FVIII^1401-1424-86	LPIAKVSSFPSIR	414
			FVIII^1401-1424-87	LPIAKVSSFPSIRP	415
FVIII^1401-1424-88	LPIAKVSSFPSIRPI	416
			FVIII^1401-1424-89	LPIAKVSSFPSIRPIY	417
FVIII^1401-1424-90	LPIAKVSSFPSIRPIYL	418
			FVIII^1401-1424-91	LPIAKVSSFPSIRPIYLT	419
FVIII^1401-1424-92	PIAKVSSFP	420
			FVIII^1401-1424-93	PIAKVSSFPS	421
FVIII^1401-1424-94	PIAKVSSFPSI	422
			FVIII^1401-1424-95	PIAKVSSFPSIR	423
FVIII^1401-1424-96	PIAKVSSFPSIRP	424
			FVIII^1401-1424-97	PIAKVSSFPSIRPI	425
FVIII^1401-1424-98	PIAKVSSFPSIRPIY	426
			FVIII^1401-1424-99	PIAKVSSFPSIRPIYL	427
FVIII^1401-1424-100	PIAKVSSFPSIRPIYLT	428
			FVIII^1401-1424-101	IAKVSSFPS	429
FVIII^1401-1424-102	IAKVSSFPSI	430
			FVIII^1401-1424-103	IAKVSSFPSIR	431
FVIII^1401-1424-104	IAKVSSFPSIRP	432
			FVIII^1401-1424-105	IAKVSSFPSIRPI	433
FVIII^1401-1424-106	IAKVSSFPSIRPIY	434
			FVIII^1401-1424-107	IAKVSSFPSIRPIYL	435
FVIII^1401-1424-108	IAKVSSFPSIRPIYLT	436
			FVIII^1401-1424-109	AKVSSFPSI	437
FVIII^1401-1424-110	AKVSSFPSIR	438
			FVIII^1401-1424-111	AKVSSFPSIRP	439
FVIII^1401-1424-112	AKVSSFPSIRPI	440
			FVIII^1401-1424-113	AKVSSFPSIRPIY	441

FVIII^1401-1424-114	AKVSSFPSIRPIYL	442
			FVIII^1401-1424-115	AKVSSFPSIRPIYLT	443
FVIII^1401-1424-116	KVSSFPSIR	444
			FVIII^1401-1424-117	KVSSFPSIRP	445
FVIII^1401-1424-118	KVSSFPSIRPI	446
			FVIII^1401-1424-119	KVSSFPSIRPIY	447
FVIII^1401-1424-120	KVSSFPSIRPIYL	448
			FVIII^1401-1424-121	KVSSFPSIRPIYLT	449
FVIII^1401-1424-122	VSSFPSIRP	450
			FVIII^1401-1424-123	VSSFPSIRPI	451
FVIII^1401-1424-124	VSSFPSIRPIY	452
			FVIII^1401-1424-125	VSSFPSIRPIYL	453
FVIII^1401-1424-126	VSSFPSIRPIYLT	454
			FVIII^1401-1424-127	SSFPSIRPI	455
FVIII^1401-1424-128	SSFPSIRPIY	456
			FVIII^1401-1424-129	SSFPSIRPIYL	457
FVIII^1401-1424-130	SSFPSIRPIYLT	458
			FVIII^1401-1424-131	SFPSIRPIY	459
FVIII^1401-1424-132	SFPSIRPIYL	460
			FVIII^1401-1424-133	SFPSIRPIYLT	461
FVIII^1401-1424-134	FPSIRPIYL	462
			FVIII^1401-1424-135	FPSIRPIYLT	463
FVIII^1401-1424-136	PSIRPIYLT	464

F.因子VIII^1785-1805肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多肽，其中P为与具有序列：EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ IDNO:477)的因子VIII^1785-1805肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立地为0或1。在一个实施方案中，P为与具有序列：EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID NO:477)的因子VIII^1785-1805肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，P为与具有序列：EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID NO:477)的因子VIII^1785-1805肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:465至SEQ ID NO:555的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:465至SEQ ID NO:555的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:465至SEQ IDNO:555的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:465至SEQ ID NO:555的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。

表7.示例性FVIII^1785-1805肽

肽	序列	SEQ ID NO:
			FVIII^1785-1805-1	EVEDNIMVT	465
FVIII^1785-1805-2	EVEDNIMVTF	466
			FVIII^1785-1805-3	EVEDNIMVTFR	467
FVIII^1785-1805-4	EVEDNIMVTFRN	468
			FVIII^1785-1805-5	EVEDNIMVTFRNQ	469
FVIII^1785-1805-6	EVEDNIMVTFRNQA	470
			FVIII^1785-1805-7	EVEDNIMVTFRNQAS	471
FVIII^1785-1805-8	EVEDNIMVTFRNQASR	472
			FVIII^1785-1805-9	EVEDNIMVTFRNQASRP	473
FVIII^1785-1805-10	EVEDNIMVTFRNQASRPY	474
			FVIII^1785-1805-11	EVEDNIMVTFRNQASRPYS	475
FVIII^1785-1805-12	EVEDNIMVTFRNQASRPYSF	476
			FVIII^1785-1805-13	EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY	477
FVIII^1785-1805-14	VEDNIMVTF	478
			FVIII^1785-1805-15	VEDNIMVTFR	479
FVIII^1785-1805-16	VEDNIMVTFRN	480
			FVIII^1785-1805-17	VEDNIMVTFRNQ	481
FVIII^1785-1805-18	VEDNIMVTFRNQA	482
			FVIII^1785-1805-19	VEDNIMVTFRNQAS	483
FVIII^1785-1805-20	VEDNIMVTFRNQASR	484
			FVIII^1785-1805-21	VEDNIMVTFRNQASRP	485
FVIII^1785-1805-22	VEDNIMVTFRNQASRPY	486
			FVIII^1785-1805-23	VEDNIMVTFRNQASRPYS	487
FVIII^1785-1805-24	VEDNIMVTFRNQASRPYSF	488
			FVIII^1785-1805-25	VEDNIMVTFRNQASRPYSFY	489
FVIII^1785-1805-26	EDNIMVTFR	490
			FVIII^1785-1805-27	EDNIMVTFRN	491
FVIII^1785-1805-28	EDNIMVTFRNQ	492
			FVIII^1785-1805-29	EDNIMVTFRNQA	493
FVIII^1785-1805-30	EDNIMVTFRNQAS	494
			FVIII^1785-1805-31	EDNIMVTFRNQASR	495

FVIII^1785-1805-32	EDNIMVTFRNQASRP	496
			FVIII^1785-1805-33	EDNIMVTFRNQASRPY	497
FVIII^1785-1805-34	EDNIMVTFRNQASRPYS	498
			FVIII^1785-1805-35	EDNIMVTFRNQASRPYSF	499
FVIII^1785-1805-36	EDNIMVTFRNQASRPYSFY	500
			FVIII^1785-1805-37	DNIMVTFRN	501
FVIII^1785-1805-38	DNIMVTFRNQ	502
			FVIII^1785-1805-39	DNIMVTFRNQA	503
FVIII^1785-1805-40	DNIMVTFRNQAS	504
			FVIII^1785-1805-41	DNIMVTFRNQASR	505
FVIII^1785-1805-42	DNIMVTFRNQASRP	506
			FVIII^1785-1805-43	DNIMVTFRNQASRPY	507
FVIII^1785-1805-44	DNIMVTFRNQASRPYS	508
			FVIII^1785-1805-45	DNIMVTFRNQASRPYSF	509
FVIII^1785-1805-46	DNIMVTFRNQASRPYSFY	510
			FVIII^1785-1805-47	NIMVTFRNQ	511
FVIII^1785-1805-48	NIMVTFRNQA	512
			FVIII^1785-1805-49	NIMVTFRNQAS	513
FVIII^1785-1805-50	NIMVTFRNQASR	514
			FVIII^1785-1805-51	NIMVTFRNQASRP	515
FVIII^1785-1805-52	NIMVTFRNQASRPY	516
			FVIII^1785-1805-53	NIMVTFRNQASRPYS	517
FVIII^1785-1805-54	NIMVTFRNQASRPYSF	518
			FVIII^1785-1805-55	NIMVTFRNQASRPYSFY	519
FVIII^1785-1805-56	IMVTFRNQA	520
			FVIII^1785-1805-57	IMVTFRNQAS	521
FVIII^1785-1805-58	IMVTFRNQASR	522
			FVIII^1785-1805-59	IMVTFRNQASRP	523
FVIII^1785-1805-60	IMVTFRNQASRPY	524
			FVIII^1785-1805-61	IMVTFRNQASRPYS	525
FVIII^1785-1805-62	IMVTFRNQASRPYSF	526
			FVIII^1785-1805-63	IMVTFRNQASRPYSFY	527
FVIII^1785-1805-64	MVTFRNQAS	528
			FVIII^1785-1805-65	MVTFRNQASR	529
FVIII^1785-1805-66	MVTFRNQASRP	530
			FVIII^1785-1805-67	MVTFRNQASRPY	531
FVIII^1785-1805-68	MVTFRNQASRPYS	532
			FVIII^1785-1805-69	MVTFRNQASRPYSF	533
FVIII^1785-1805-70	MVTFRNQASRPYSFY	534
			FVIII^1785-1805-71	VTFRNQASR	535
FVIII^1785-1805-72	VTFRNQASRP	536
			FVIII^1785-1805-73	VTFRNQASRPY	537
FVIII^1785-1805-74	VTFRNQASRPYS	538
			FVIII^1785-1805-75	VTFRNQASRPYSF	539
FVIII^1785-1805-76	VTFRNQASRPYSFY	540
			FVIII^1785-1805-77	TFRNQASRP	541
FVIII^1785-1805-78	TFRNQASRPY	542
			FVIII^1785-1805-79	TFRNQASRPYS	543

FVIII^1785-1805-80	TFRNQASRPYSF	544
			FVIII^1785-1805-81	TFRNQASRPYSFY	545
FVIII^1785-1805-82	FRNQASRPY	546
			FVIII^1785-1805-83	FRNQASRPYS	547
FVIII^1785-1805-84	FRNQASRPYSF	548
			FVIII^1785-1805-85	FRNQASRPYSFY	549
FVIII^1785-1805-86	RNQASRPYS	550
			FVIII^1785-1805-87	RNQASRPYSF	551
FVIII^1785-1805-88	RNQASRPYSFY	552
			FVIII^1785-1805-89	NQASRPYSF	553
FVIII^1785-1805-90	NQASRPYSFY	554
			FVIII^1785-1805-91	QASRPYSFY	555

G.因子VIII^2025-2045肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多肽，其中P为与具有序列：LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ IDNO:568)的因子VIII^2025-2045肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列：LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ ID NO:568)的因子VIII^2025-2045肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与具有序列：LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ ID NO:568)的因子VIII^2025-2045肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:556至SEQ ID NO:646的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:556至SEQ IDNO:646的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:556至SEQ ID NO:646的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:556至SEQ ID NO:646的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。

表8.示例性FVIII^2025-2045肽

肽	序列	SEQ ID NO:
			FVIII^2025-2045-1	LHAGMSTLF	556
FVIII^2025-2045-2	LHAGMSTLFL	557
			FVIII^2025-2045-3	LHAGMSTLFLV	558
FVIII^2025-2045-4	LHAGMSTLFLVY	559
			FVIII^2025-2045-5	LHAGMSTLFLVYS	560
FVIII^2025-2045-6	LHAGMSTLFLVYSN	561
			FVIII^2025-2045-7	LHAGMSTLFLVYSNK	562
FVIII^2025-2045-8	LHAGMSTLFLVYSNKC	563
			FVIII^2025-2045-9	LHAGMSTLFLVYSNKCQ	564
FVIII^2025-2045-10	LHAGMSTLFLVYSNKCQT	565
			FVIII^2025-2045-11	LHAGMSTLFLVYSNKCQTP	566
FVIII^2025-2045-12	LHAGMSTLFLVYSNKCQTPL	567
			FVIII^2025-2045-13	LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG	568
FVIII^2025-2045-14	HAGMSTLFL	569
			FVIII^2025-2045-15	HAGMSTLFLV	570
FVIII^2025-2045-16	HAGMSTLFLVY	571
			FVIII^2025-2045-17	HAGMSTLFLVYS	572
FVIII^2025-2045-18	HAGMSTLFLVYSN	573
			FVIII^2025-2045-19	HAGMSTLFLVYSNK	574
FVIII^2025-2045-20	HAGMSTLFLVYSNKC	575
			FVIII^2025-2045-21	HAGMSTLFLVYSNKCQ	576
FVIII^2025-2045-22	HAGMSTLFLVYSNKCQT	577
			FVIII^2025-2045-23	HAGMSTLFLVYSNKCQTP	578
FVIII^2025-2045-24	HAGMSTLFLVYSNKCQTPL	579
			FVIII^2025-2045-25	HAGMSTLFLVYSNKCQTPLG	580
FVIII^2025-2045-26	AGMSTLFLV	581
			FVIII^2025-2045-27	AGMSTLFLVY	582
FVIII^2025-2045-28	AGMSTLFLVYS	583
			FVIII^2025-2045-29	AGMSTLFLVYSN	584
FVIII^2025-2045-30	AGMSTLFLVYSNK	585
			FVIII^2025-2045-31	AGMSTLFLVYSNKC	586
FVIII^2025-2045-32	AGMSTLFLVYSNKCQ	587
			FVIII^2025-2045-33	AGMSTLFLVYSNKCQT	588
FVIII^2025-2045-34	AGMSTLFLVYSNKCQTP	589
			FVIII^2025-2045-35	AGMSTLFLVYSNKCQTPL	590
FVIII^2025-2045-36	AGMSTLFLVYSNKCQTPLG	591
			FVIII^2025-2045-37	GMSTLFLVY	592
FVIII^2025-2045-38	GMSTLFLVYS	593
			FVIII^2025-2045-39	GMSTLFLVYSN	594
FVIII^2025-2045-40	GMSTLFLVYSNK	595
			FVIII^2025-2045-41	GMSTLFLVYSNKC	596
FVIII^2025-2045-42	GMSTLFLVYSNKCQ	597

FVIII^2025-2045-43	GMSTLFLVYSNKCQT	598
			FVIII^2025-2045-44	GMSTLFLVYSNKCQTP	599
FVIII^2025-2045-45	GMSTLFLVYSNKCQTPL	600
			FVIII^2025-2045-46	GMSTLFLVYSNKCQTPLG	601
FVIII^2025-2045-47	MSTLFLVYS	602
			FVIII^2025-2045-48	MSTLFLVYSN	603
FVIII^2025-2045-49	MSTLFLVYSNK	604
			FVIII^2025-2045-50	MSTLFLVYSNKC	605
FVIII^2025-2045-51	MSTLFLVYSNKCQ	606
			FVIII^2025-2045-52	MSTLFLVYSNKCQT	607
FVIII^2025-2045-53	MSTLFLVYSNKCQTP	608
			FVIII^2025-2045-54	MSTLFLVYSNKCQTPL	609
FVIII^2025-2045-55	MSTLFLVYSNKCQTPLG	610
			FVIII^2025-2045-56	STLFLVYSN	611
FVIII^2025-2045-57	STLFLVYSNK	612
			FVIII^2025-2045-58	STLFLVYSNKC	613
FVIII^2025-2045-59	STLFLVYSNKCQ	614
			FVIII^2025-2045-60	STLFLVYSNKCQT	615
FVIII^2025-2045-61	STLFLVYSNKCQTP	616
			FVIII^2025-2045-62	STLFLVYSNKCQTPL	617
FVIII^2025-2045-63	STLFLVYSNKCQTPLG	618
			FVIII^2025-2045-64	TLFLVYSNK	619
FVIII^2025-2045-65	TLFLVYSNKC	620
			FVIII^2025-2045-66	TLFLVYSNKCQ	621
FVIII^2025-2045-67	TLFLVYSNKCQT	622
			FVIII^2025-2045-68	TLFLVYSNKCQTP	623
FVIII^2025-2045-69	TLFLVYSNKCQTPL	624
			FVIII^2025-2045-70	TLFLVYSNKCQTPLG	625
FVIII^2025-2045-71	LFLVYSNKC	626
			FVIII^2025-2045-72	LFLVYSNKCQ	627
FVIII^2025-2045-73	LFLVYSNKCQT	628
			FVIII^2025-2045-74	LFLVYSNKCQTP	629
FVIII^2025-2045-75	LFLVYSNKCQTPL	630
			FVIII^2025-2045-76	LFLVYSNKCQTPLG	631
FVIII^2025-2045-77	FLVYSNKCQ	632
			FVIII^2025-2045-78	FLVYSNKCQT	633
FVIII^2025-2045-79	FLVYSNKCQTP	634
			FVIII^2025-2045-80	FLVYSNKCQTPL	635
FVIII^2025-2045-81	FLVYSNKCQTPLG	636
			FVIII^2025-2045-82	LVYSNKCQT	637
FVIII^2025-2045-83	LVYSNKCQTP	638
			FVIII^2025-2045-84	LVYSNKCQTPL	639
FVIII^2025-2045-85	LVYSNKCQTPLG	640
			FVIII^2025-2045-86	VYSNKCQTP	641
FVIII^2025-2045-87	VYSNKCQTPL	642
			FVIII^2025-2045-88	VYSNKCQTPLG	643
FVIII^2025-2045-89	YSNKCQTPL	644
			FVIII^2025-2045-90	YSNKCQTPLG	645

FVIII^2025-2045-91

SNKCQTPLG

646

H.因子VIII^2160-2180肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多肽，其中P为与具有序列：NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ IDNO:659)的因子VIII^2160-2180肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列：NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ ID NO:659)的因子VIII^2160-2180肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与具有序列：NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ IDNO:659)的因子VIII^2160-2180肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ IDNO:647至SEQ ID NO:737的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:647至SEQ ID NO:737的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:647至SEQ ID NO:737的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:647至SEQ IDNO:737的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。

表9.示例性FVIII^2160-2180肽

肽	序列	SEQ ID NO:
			FVIII^2160-2180-1	NPPIIARYI	647
FVIII^2160-2180-2	NPPIIARYIR	648
			FVIII^2160-2180-3	NPPIIARYIRL	649
FVIII^2160-2180-4	NPPIIARYIRLH	650

FVIII^2160-2180-5	NPPIIARYIRLHP	651
			FVIII^2160-2180-6	NPPIIARYIRLHPT	652
FVIII^2160-2180-7	NPPIIARYIRLHPTH	653
			FVIII^2160-2180-8	NPPIIARYIRLHPTHY	654
FVIII^2160-2180-9	NPPIIARYIRLHPTHYS	655
			FVIII^2160-2180-10	NPPIIARYIRLHPTHYSI	656
FVIII^2160-2180-11	NPPIIARYIRLHPTHYSIR	657
			FVIII^2160-2180-12	NPPIIARYIRLHPTHYSIRS	658
FVIII^2160-2180-13	NPPIIARYIRLHPTHYSIRST	659
			FVIII^2160-2180-14	PPIIARYIR	660
FVIII^2160-2180-15	PPIIARYIRL	661
			FVIII^2160-2180-16	PPIIARYIRLH	662
FVIII^2160-2180-17	PPIIARYIRLHP	663
			FVIII^2160-2180-18	PPIIARYIRLHPT	664
FVIII^2160-2180-19	PPIIARYIRLHPTH	665
			FVIII^2160-2180-20	PPIIARYIRLHPTHY	666
FVIII^2160-2180-21	PPIIARYIRLHPTHYS	667
			FVIII^2160-2180-22	PPIIARYIRLHPTHYSI	668
FVIII^2160-2180-23	PPIIARYIRLHPTHYSIR	669
			FVIII^2160-2180-24	PPIIARYIRLHPTHYSIRS	670
FVIII^2160-2180-25	PPIIARYIRLHPTHYSIRST	671
			FVIII^2160-2180-26	PIIARYIRL	672
FVIII^2160-2180-27	PIIARYIRLH	673
			FVIII^2160-2180-28	PIIARYIRLHP	674
FVIII^2160-2180-29	PIIARYIRLHPT	675
			FVIII^2160-2180-30	PIIARYIRLHPTH	676
FVIII^2160-2180-31	PIIARYIRLHPTHY	677
			FVIII^2160-2180-32	PIIARYIRLHPTHYS	678
FVIII^2160-2180-33	PIIARYIRLHPTHYSI	679
			FVIII^2160-2180-34	PIIARYIRLHPTHYSIR	680
FVIII^2160-2180-35	PIIARYIRLHPTHYSIRS	681
			FVIII^2160-2180-36	PIIARYIRLHPTHYSIRST	682
FVIII^2160-2180-37	IIARYIRLH	683
			FVIII^2160-2180-38	IIARYIRLHP	684
FVIII^2160-2180-39	IIARYIRLHPT	685
			FVIII^2160-2180-40	IIARYIRLHPTH	686
FVIII^2160-2180-41	IIARYIRLHPTHY	687
			FVIII^2160-2180-42	IIARYIRLHPTHYS	688
FVIII^2160-2180-43	IIARYIRLHPTHYSI	689
			FVIII^2160-2180-44	IIARYIRLHPTHYSIR	690
FVIII^2160-2180-45	IIARYIRLHPTHYSIRS	691
			FVIII^2160-2180-46	IIARYIRLHPTHYSIRST	692
FVIII^2160-2180-47	IARYIRLHP	693
			FVIII^2160-2180-48	IARYIRLHPT	694
FVIII^2160-2180-49	IARYIRLHPTH	695
			FVIII^2160-2180-50	IARYIRLHPTHY	696
FVIII^2160-2180-51	IARYIRLHPTHYS	697
			FVIII^2160-2180-52	IARYIRLHPTHYSI	698

FVIII^2160-2180-53	IARYIRLHPTHYSIR	699
			FVIII^2160-2180-54	IARYIRLHPTHYSIRS	700
FVIII^2160-2180-55	IARYIRLHPTHYSIRST	701
			FVIII^2160-2180-56	ARYIRLHPT	702
FVIII^2160-2180-57	ARYIRLHPTH	703
			FVIII^2160-2180-58	ARYIRLHPTHY	704
FVIII^2160-2180-59	ARYIRLHPTHYS	705
			FVIII^2160-2180-60	ARYIRLHPTHYSI	706
FVIII^2160-2180-61	ARYIRLHPTHYSIR	707
			FVIII^2160-2180-62	ARYIRLHPTHYSIRS	708
FVIII^2160-2180-63	ARYIRLHPTHYSIRST	709
			FVIII^2160-2180-64	RYIRLHPTH	710
FVIII^2160-2180-65	RYIRLHPTHY	711
			FVIII^2160-2180-66	RYIRLHPTHYS	712
FVIII^2160-2180-67	RYIRLHPTHYSI	713
			FVIII^2160-2180-68	RYIRLHPTHYSIR	714
FVIII^2160-2180-69	RYIRLHPTHYSIRS	715
			FVIII^2160-2180-70	RYIRLHPTHYSIRST	716
FVIII^2160-2180-71	YIRLHPTHY	717
			FVIII^2160-2180-72	YIRLHPTHYS	718
FVIII^2160-2180-73	YIRLHPTHYSI	719
			FVIII^2160-2180-74	YIRLHPTHYSIR	720
FVIII^2160-2180-75	YIRLHPTHYSIRS	721
			FVIII^2160-2180-76	YIRLHPTHYSIRST	722
FVIII^2160-2180-77	IRLHPTHYS	723
			FVIII^2160-2180-78	IRLHPTHYSI	724
FVIII^2160-2180-79	IRLHPTHYSIR	725
			FVIII^2160-2180-80	IRLHPTHYSIRS	726
FVIII^2160-2180-81	IRLHPTHYSIRST	727
			FVIII^2160-2180-82	RLHPTHYSI	728
FVIII^2160-2180-83	RLHPTHYSIR	729
			FVIII^2160-2180-84	RLHPTHYSIRS	730
FVIII^2160-2180-85	RLHPTHYSIRST	731
			FVIII^2160-2180-86	LHPTHYSIR	732
FVIII^2160-2180-87	LHPTHYSIRS	733
			FVIII^2160-2180-88	LHPTHYSIRST	734
FVIII^2160-2180-89	HPTHYSIRS	735
			FVIII^2160-2180-90	HPTHYSIRST	736
FVIII^2160-2180-91	PTHYSIRST	737

I.因子VIII^102-122肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多肽，其中P为与具有序列：TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ IDNO:740)的因子VIII^102-122肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列：TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO:740)的因子VIII^102-122肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与具有序列：TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO:740)的因子VIII^102-122肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

在本发明的背景中，FVIII^102-122肽还包括FVIII^102-119肽。因此，在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:55以及SEQID NO:738至SEQ ID NO:773的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:55以及SEQ ID NO:738至SEQ ID NO:773的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:55以及SEQ ID NO:738至SEQ ID NO:773的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:1至SEQID NO:55以及SEQ ID NO:738至SEQ ID NO:773的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。

表10.示例性FVIII^102-122肽

肽	序列	SEQ ID NO:
			FVIII^102-122-738	TVVITLKNMASHPVSLHAV	738
FVIII^102-122-739	TVVITLKNMASHPVSLHAVG	739
			FVIII^102-122-740	TVVITLKNMASHPVSLHAVGV	740
FVIII^102-122-741	VVITLKNMASHPVSLHAV	741
			FVIII^102-122-742	VVITLKNMASHPVSLHAVG	742
FVIII^102-122-743	VVITLKNMASHPVSLHAVGV	743

FVIII^102-122-744	VITLKNMASHPVSLHAV	744
			FVIII^102-122-745	VITLKNMASHPVSLHAVG	745
FVIII^102-122-746	VITLKNMASHPVSLHAVGV	746
			FVIII^102-122-747	ITLKNMASHPVSLHAV	747
FVIII^102-122-748	ITLKNMASHPVSLHAVG	748
			FVIII^102-122-749	ITLKNMASHPVSLHAVGV	749
FVIII^102-122-750	TLKNMASHPVSLHAV	750
			FVIII^102-122-751	TLKNMASHPVSLHAVG	751
FVIII^102-122-752	TLKNMASHPVSLHAVGV	752
			FVIII^102-122-753	LKNMASHPVSLHAV	753
FVIII^102-122-754	LKNMASHPVSLHAVG	754
			FVIII^102-122-755	LKNMASHPVSLHAVGV	755
FVIII^102-122-756	KNMASHPVSLHAV	756
			FVIII^102-122-757	KNMASHPVSLHAVG	757
FVIII^102-122-758	KNMASHPVSLHAVGV	758
			FVIII^102-122-759	NMASHPVSLHAV	759
FVIII^102-122-760	NMASHPVSLHAVG	760
			FVIII^102-122-761	NMASHPVSLHAVGV	761
FVIII^102-122-762	MASHPVSLHAV	762
			FVIII^102-122-763	MASHPVSLHAVG	763
FVIII^102-122-764	MASHPVSLHAVGV	764
			FVIII^102-122-765	ASHPVSLHAV	765
FVIII^102-122-766	ASHPVSLHAVG	766
			FVIII^102-122-767	ASHPVSLHAVGV	767
FVIII^102-122-768	SHPVSLHAV	768
			FVIII^102-122-769	SHPVSLHAVG	769
FVIII^102-122-770	SHPVSLHAVGV	770
			FVIII^102-122-771	HPVSLHAVG	771
FVIII^102-122-772	HPVSLHAVGV	772
			FVIII^102-122-773	PVSLHAVGV	773

IV.制造FVIII肽的方法

在另一方面中，本发明进一步涉及制造FVIII肽的方法。在一些实施方案中，本发明的FVIII肽可以使用本领域中通常已知的固相(例如Fmoc或t-Boc)或液相合成技术来制造。参见例如Chan & White编,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach(OxfordUniversity Press,2000)；Benoiton,Chemistry of Peptide Synthesis(CRCPress,2005)；Howl,Peptide Synthesis and Applications(Humana Press,2010)。

在一个实施方案中，本发明包括一种制造FVIII肽的方法，所述方法包括：a)使用固相或液相合成技术合成肽，所述FVIII肽具有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:344以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1。在一个实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列，并且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述肽可涵盖人类FVIII蛋白的整个B域。

在其它实施方案中，所述肽可以使用重组技术来制造。在一个实施方案中，本发明包括一种制造FVIII肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含编码FVIII肽的载体的细胞培养物，所述FVIII肽具有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:344以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1。在一个实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列，并且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述肽可以涵盖人类FVIII蛋白的整个B域。

在一个实施方案中，本发明提供一种制造FVIII肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含编码FVIII肽的多核苷酸的细胞培养物，所述肽具有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:250、SEQ IDNO:344、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:568、SEQ ID NO:659以及SEQID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1；和b)在所述细胞培养物中表达所述肽。

在制造FVIII肽的方法的一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180个氨基酸组成。

本发明的FVIII肽可以通过在合适的原核或真核宿主系统中表达来产生。真核细胞的实例包括(但不限于)哺乳动物细胞，如CHO、COS、HEK293、BHK、SK-Hep以及HepG2；昆虫细胞，例如SF9细胞、SF21细胞、S2细胞以及High Five细胞；以及酵母细胞，例如酵母属(Saccharomyces)细胞或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)细胞。在一个实施方案中，FVIII肽可以在细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、禽类细胞、哺乳动物细胞以及其类似细胞中表达。在一些实施方案中，肽可在人类细胞系、仓鼠细胞系或鼠类细胞系中表达。在一个特定实施方案中，细胞系为CHO、BHK或HEK细胞系。

广泛多种载体可以用于表达FVIII肽且可以选自真核和原核表达载体。所述载体将包括表达至少一种本文中所公开的FVIII肽所必需的核苷酸序列。原核表达载体的实例包括质粒，如pRSET、pET、pBAD等，其中原核表达载体中所用的启动子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。真核表达载体的实例包括：(i)对于在酵母中表达，如pAO、pPIC、pYES、pMET的载体，使用如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等的启动子；(ii)对于在昆虫细胞中表达，如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等的载体，使用如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等的启动子，并且(iii)对于在哺乳动物细胞中表达，如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等的载体和来源于病毒系统(如牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、反转录病毒等)的载体，使用如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV以及β-肌动蛋白的启动子。

在本发明的一些实施方案中，用于产生FVIII肽的核酸序列进一步包括适用于受控蛋白质表达的其它序列，如启动子序列、增强子、TATA盒、转录起始位点、多接头、限制性位点、聚A序列、蛋白质加工序列、选择标记以及其类似序列，其通常为本领域的普通技术人员所已知。

对产生FVIII肽的细胞所用的培养基可以基于本领域中熟知的合适基础培养基，例如DMEM、汉姆氏F12(Ham's F12)、培养基199(Medium199)、McCoy或RPMI。基础培养基可以包括许多成分，包括氨基酸、维生素、有机盐和无机盐、以及碳水化合物来源。各成分可以按支持细胞培养的量存在，所述量通常为本领域技术人员已知。培养基可以包括辅助物质，如缓冲物质(例如碳酸氢钠)、抗氧化剂、抵消机械应力的稳定剂、或蛋白酶抑制剂。必要时，可以添加非离子表面活性剂，如聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物和/或混合物。

在一些实施方案中，培养基不含外源添加的蛋白质。“不含蛋白质”和相关术语是指来自由培养物中的细胞外源性或除培养物中的细胞以外的来源的蛋白质，其中所述细胞在生长期间天然排出蛋白质。在另一实施方案中，培养基不含多肽。在另一实施方案中，培养基不含血清。在另一实施方案中，培养基不含动物蛋白。在另一实施方案中，培养基不含动物组分。在另一实施方案中，培养基含有蛋白质，例如来自血清(如胎牛血清)的动物蛋白。在另一实施方案中，培养物具有外源添加的重组蛋白。在另一实施方案中，蛋白质来自经过证实无病原体的动物。

制备不含动物蛋白且化学成分确定的培养基的方法为本领域中已知，例如在US 2008/0009040和US 2007/0212770中，所述文献皆并入本文中以用于所有目的。在一个实施方案中，本文所述的方法中所用的培养基为不含动物蛋白或不含寡肽的培养基。在某些实施方案中，培养基可为化学成分确定的培养基。如本文所用的术语“化学成分确定”应意指培养基不包含任何不确定的补充物，如例如动物组分、器官、腺体、植物或酵母的提取物。因此，化学成分确定的培养基的各组分为精确确定的。

在某些实施方案中，本发明的方法可以包括使用例如以分批方式、半分批方式、补料分批方式或连续方式操作的细胞培养系统。分批培养可为大规模细胞培养，其中细胞接种物在槽或发酵罐中培养至最大密度，且以分批形式收集和处理。补料分批培养可为供给新鲜营养物(例如生长限制性底物)或添加剂(例如产物前体)的分批培养。连续培养可为通过流入新鲜培养基连续供给营养物的悬浮培养，其中培养物体积一般为恒定的。类似地，连续发酵可指通过连续添加新鲜培养基(其通过从生物反应器移除细胞悬浮液而恰好平衡)而使细胞或微生物在培养物中维持在指数生长期的过程。此外，搅拌槽反应器系统可用于悬浮培养、灌流培养、恒化培养(chemostatic culture)和/或微载体培养。通常，搅拌槽反应器系统可如同具有任何类型的搅拌器(如Rushton型、水翼型、斜叶桨型或船用型(marine))的任何常规搅拌槽反应器般操作。

在某些实施方案中，本发明的细胞培养法可以包括使用微载体。在一些实施方案中，实施方案的细胞培养可以在适于提供高体积-比培养表面积的条件下于大型生物反应器中进行以获得高细胞密度和蛋白质表达。一种提供所述生长条件的手段为在搅拌槽生物反应器中使用微载体进行细胞培养。细胞在微载体上生长的概念首先由vanWezel(van Wezel,A.L.,Nature 216:64-5(1967))描述并且允许细胞附着于悬浮于生长培养基中的小固体颗粒表面上。这些方法提供高表面与体积比并且因此允许有效的营养物利用。此外，对于在真核细胞系中表达分泌蛋白，表面与体积比增大允许较高程度的分泌并且因此在培养物上清液中的蛋白质产率较高。最后，这些方法允许真核表达培养容易地按比例扩大。

表达FVIII肽的细胞可以在细胞培养生长期间结合至球形或多孔微载体。微载体可为选自基于葡聚糖、胶原蛋白、塑料、明胶和纤维素以及其它的微载体的组的微载体。还可能使细胞在球形微载体上生长至某一生物量并且当它们已达到最终发酵罐生物量时且在多孔微载体上产生表达蛋白之前继代培养细胞，或反之亦然。合适的球形微载体可以包括光滑表面微载体，如Cytodex^TM1、Cytodex^TM2以及Cytodex^TM3(GE Healthcare)；和大孔微载体，如Cytopore^TM1、Cytopore^TM2、Cytoline^TM1以及Cytoline^TM2(GE Healthcare)。

本领域的普通技术人员应了解，通过上述合成和/或重组方法产生的FVIII肽可包括天然和/或非天然氨基酸，包括氨基酸类似物和/或氨基酸模拟物。

V.用于诱导免疫耐受性的因子FVIII肽组合物

在另一方面中，本文中所公开的FVIII肽可以包括于药物组合物中。在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含如本文所述的因子VIII^246-266肽、因子VIII^1401-1424肽或因子VIII^102-122肽。

在一个实施方案中，所述药物组合物包含如本文所述的因子VIII^246-266肽。在另一实施方案中，所述药物组合物进一步包含如本文所述的FVIII^474-494肽、FVIII^540-560肽、FVIII^1785-1805肽、FVIII^2025-2045肽、FVIII^2160-2180肽、FVIII^102-119肽、FVIII^1401-1424肽、FVIII^102-122肽或第二FVIII^246-266肽。

在另一实施方案中，所述药物组合物包含如本文所述的因子VIII^1401-1424肽。在另一实施方案中，所述药物组合物进一步包含如本文所述的FVIII^474-494肽、FVIII^540-560肽、FVIII^1785-1805肽、FVIII^2025-2045肽、FVIII^2160-2180肽、FVIII^102-119肽、FVIII^246-266肽、FVIII^102-122肽或第二FVIII^1401-1424肽。

在另一实施方案中，所述药物组合物包含如本文所述的因子VIII^102-122肽。在另一实施方案中，所述药物组合物进一步包含如本文所述的FVIII^474-494肽、FVIII^540-560肽、FVIII^1785-1805肽、FVIII^2025-2045肽、FVIII^2160-2180肽、FVIII^102-119肽、FVIII^246-266肽、FVIII^1401-1424肽或第二FVIII^102-122肽。

在一个特定实施方案中，本发明提供一种包含肽的药物组合物，所述肽具有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:344以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1。在一个实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列，并且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个特定实施方案中，所述药物组合物进一步包含第二多肽，所述第二多肽具有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:250、SEQ IDNO:344、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:568、SEQ ID NO:659以及SEQID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1。在一个实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列，并且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，第二FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一实施方案中，第二FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中，第二FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，第二FVIII肽由9至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，第二FVIII肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180个氨基酸组成。

A.施用

为向人类或测试动物施用组合物，在一方面中，所述组合物可以包含一种或多种药学上可接受的载体。短语“药学上”或“药理学上”可接受是指当使用如下所述的本领域中熟知的途径施用时，稳定、抑制蛋白质或肽降解(如聚集和裂解产物)并且另外不产生过敏性或其它不良反应的分子实体和组合物。“药学上可接受的载体”包括任何和所有临床上有用的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂以及其类似物。

药物组合物可以经口、局部、经皮、胃肠外、通过吸入喷雾、经阴道、直肠或通过颅内注射施用。如本文所用的术语胃肠外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、脑池内注射或输注技术。还涵盖通过静脉内、皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射和或手术植入特定部位而进行的施用。通常，组合物基本上不含热原质以及可能对接受者有害的其它杂质。

施用的剂量和频率将取决于本领域技术人员通常所了解的各种因素，包括例如患者血友病的严重程度和/或使用较大或较小剂量是否更有效地诱导免疫耐受性。典型每日剂量可在约0.01mg/kg至100mg/kg范围内。每周0.07-700mg FVIII肽范围内的剂量可能为有效且被完全耐受的，不过甚至更高的每周剂量可能为适当且/或被完全耐受的。在规定适当剂量中的主要决定因素为在特定情形下在治疗上有效所必需的特定FVIII肽的量。为获得较长持续时间的免疫耐受性，可能需要重复施用。可以使用由治疗医师所选的剂量水平和模式进行组合物的单次或多次使用。

在一方面中，本发明的组合物可以通过团注(bolus)施用。作为另一实例，FVIII肽可以作为一次剂量施用。本领域的普通技术人员将容易地如由良好医疗操作和个别患者临床情况所确定使有效剂量和施用方案最优化。给药频率取决于施用途径。最优药物组合物由本领域技术人员根据施用途径和所需剂量而确定。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Remington the Science andPractice of Pharmacy),第21版.(2005,Lippincott Williams & Wilkins)，其公开内容据此以引用的方式并入本文中。所述组合物影响所施用药剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除率。取决于施用途径，根据体重、体表面积或器官大小计算合适剂量。适当剂量可以通过使用测定血液水平剂量的已确立的测定连同适当的剂量-反应数据来确定。最终给药方案由主治医师考虑改变药物作用的各种因素来确定，所述因素例如药物比活性、患者的损伤严重程度和反应性、患者年龄、病状、体重、性别以及饮食、任何感染的严重程度、施用时间以及其它临床因素。

在一些实施方案中，包含本文中所公开的FVIII肽的组合物在施用之前冻干。冻干是使用本领域中常见的技术来进行且应如例如Tang等,Pharm Res.21:191-200,(2004)和Chang等,Pharm Res.13:243-9(1996)中所述最优化而用于所开发的组合物。制备药物组合物的方法可以包括以下步骤中的一个或多个：在冻干之前将稳定剂添加至混合物中；在冻干之前添加至少一种选自增积剂、渗透压(osmolarity)调节剂以及表面活性剂的试剂至混合物中。在一方面中，冻干制剂至少包含缓冲剂、增积剂以及稳定剂中的一种或多种。在此方面中，在冻干步骤期间或在复原期间聚集成为问题的情况下评估并选择表面活性剂的应用。包含适当缓冲剂以使制剂在冻干期间维持在稳定pH带内。

冻干材料的标准复原实践是添加回一定体积的纯水或无菌注射用水(WFI)(通常等于在冻干期间所移除的体积)，但是在用于胃肠外施用的药物的制造中有时使用抗细菌剂的稀溶液。因此，提供制备复原FVIII肽组合物的方法，其包括添加稀释剂至冻干FVIII肽组合物中的步骤。

在一些实施方案中，冻干材料可以复原为水溶液。多种水性载体，例如无菌注射用水、供多剂量使用的含防腐剂的水、或含适当量的表面活性剂的水(例如含有与适于制造水性混悬液的赋形剂混合的活性化合物的水性混悬液)。在各种方面中，所述赋形剂为悬浮剂，例如(但不限于)羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、褐藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、黄蓍胶以及阿拉伯胶；分散或湿润剂为天然存在的磷脂，例如(但不限于)卵磷脂；或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如(但不限于)聚氧乙烯硬脂酸酯；或环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物，例如(但不限于)十七乙烯氧基十六醇(heptadecaethyl-eneoxycetanol)；或环氧乙烷与从脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；或环氧乙烷与从脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物，例如(但不限于)聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。在各种方面中，水性悬浮液还含有一种或多种防腐剂，例如(但不限于)对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。

VI.治疗方法

本发明进一步涉及治疗患有与FVIII蛋白有关的疾病(如甲型血友病或后天性血友病)的患者的方法。所述方法可以包括施用至少一种本文中所公开的FVIII肽。具体来说，可以施用包含至少一种FVIII肽的药物组合物以在患者中诱导对FVIII蛋白的免疫耐受性。

在一些实施方案中，诱导对FVIII的免疫耐受性的方法可以包括在施用FVIII之后防止FVIII抑制剂发展。术语“防止”是指不允许大致可检测的针对FVIII的免疫反应。例如，患者在施用FVIII蛋白之前可能不具有任何可检测的抗FVIII抗体。然而，在FVIII蛋白的施用疗法之后，如果未施用FVIII肽来诱导免疫耐受性，那么可检测的抗FVIII抗体的含量会增加。施用本文中所公开的FVIII肽可以诱导免疫耐受性，从而治疗患有血友病的患者。

在其它实施方案中，诱导对FVIII蛋白的免疫耐受性的方法可以包括治疗已经具有确定的FVIII抑制剂的患者。在这些实施方案中，施用FVIII肽可以减少或消除抗FVIII抗体的存在。术语“减少”意指针对FVIII蛋白的免疫反应部分减少。在某些实施方案中，减少免疫反应可以包括与患者在施用FVIII肽之前的免疫反应程度相比免疫反应减少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。例如，减少百分比可以通过使用测定FVIII抗体存在量的标准方法来测量在施用FVIII肽之前和之后血液中所存在的抗FVIII抗体的量来分析。在其它实施方案中，免疫反应减少可以包括测量对FVIII有特异性的CD4⁺T细胞，或分泌FVIII抗体的FVIII特异性B细胞，或T细胞、B细胞以及抗FVIII抗体所有三者的组合的减少程度。可以使用本领域中通常已知的方法分离免疫细胞，如对FVIII有特异性的T细胞和B细胞。

在一方面中，本发明包括一种在受试者中诱导对FVIII的免疫耐受性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含如本文所述的FVIII肽的药物组合物的步骤。在一个特定实施方案中，所述FVIII肽为如本文所述的因子VIII^246-266肽、因子VIII^1401-1424肽或因子VIII^102-122肽。

在一个实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含如本文所述的因子VIII^246-266肽的药物组合物的步骤。在另一实施方案中，所述药物组合物进一步包含如本文所述的FVIII^474-494肽、FVIII^540-560肽、FVIII^1785-1805肽、FVIII^2025-2045肽、FVIII^2160-2180肽、FVIII^102-119肽、FVIII^1401-1424肽、FVIII^102-122肽或第二FVIII^246-266肽。

在另一实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含如本文所述的因子VIII^1401-1424肽的药物组合物的步骤。在另一实施方案中，所述药物组合物进一步包含如本文所述的FVIII^474-494肽、FVIII^540-560肽、FVIII^1785-1805肽、FVIII^2025-2045肽、FVIII^2160-2180肽、FVIII^102-119肽、FVIII^246-266肽、FVIII^102-122肽或第二FVIII^1401-1424肽。

在另一实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含如本文所述的因子VIII^102-122肽的药物组合物的步骤。在另一实施方案中，所述药物组合物进一步包含如本文所述的FVIII^474-494肽、FVIII^540-560肽、FVIII^1785-1805肽、FVIII^2025-2045肽、FVIII^2160-2180肽、FVIII^102-119肽、FVIII^246-266肽、FVIII^1401-1424肽或第二FVIII^102-122肽。

在一个实施方案中，本发明提供一种诱导对FVIII蛋白的免疫耐受性的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含肽的药物组合物，所述肽具有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:344以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列；R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1；从而在所述受试者中诱导对FVIII蛋白的免疫耐受性。在某些实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列，并且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。

诱导免疫耐受性的方法可以进一步包括组合疗法，其中可以施用数种肽来诱导免疫耐受性。在一个实施方案中，诱导免疫耐受性的方法进一步包括施用治疗有效量的至少具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的第二肽，其中P为与选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:568、SEQ ID NO:659以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列；R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1；从而在受试者中诱导对FVIII蛋白的免疫耐受性。在某些实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列，并且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，所述第二肽由9至80个氨基酸组成。在另一特定实施方案中，所述第二肽中的任何其它氨基酸为天然氨基酸。在另一特定实施方案中，所述第二肽由9至40个氨基酸长度组成。在一个特定实施方案中，所述第二肽由9至80个氨基酸长度组成，并且所述第二肽中的任何其它氨基酸为天然氨基酸。

在一个实施方案中，第二FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180个氨基酸组成。

在诱导免疫耐受性的方法的一个特定实施方案中，其中所施用的药物组合物包含肽，其中P为与SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:344或SEQID NO:740的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，所述组合物进一步包含第二多肽，所述第二多肽具有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:568、SEQ ID NO:659以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列；R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1。

在一方面中，本发明提供如本文所述的FVIII肽的用途，其用于制造用以处理针对FVIII替补疗法产生的免疫反应的药物。在一个特定实施方案中，所述FVIII肽为FVIII^1401-1424肽。在相关方面中，本发明提供如本文所述的FVIII肽的用途，其用于制造用以防止针对FVIII替补疗法产生的免疫反应的药物。在一个特定实施方案中，所述FVIII肽为FVIII^1401-1424肽。

在一方面中，本发明提供一种用作药剂的FVIII肽。在一个特定实施方案中，本发明提供一种用作药剂的具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多肽，其中P为与具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ IDNO:344)的因子VIII^1401-1424肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，并且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立地为0或1。

在一方面中，本发明提供一种用于处理针对FVIII替补疗法产生的免疫反应的FVIII肽。在一个特定实施方案中，本发明提供一种用于处理针对FVIII替补疗法产生的免疫反应的具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多肽，其中P为与具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ IDNO:344)的因子VIII^1401-1424肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，并且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立地为0或1。

在一方面中，本发明提供一种用于防止针对FVIII替补疗法产生的免疫反应的FVIII肽。在一个特定实施方案中，本发明提供一种用于防止针对FVIII替补疗法产生的免疫反应的具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多肽，其中P为与具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ IDNO:344)的因子VIII^1401-1424肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，并且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立地为0或1。

VII.免疫诊断

在一方面中，本发明提供一种在有需要的受试者中监测FVIII替补疗法或FVIII免疫耐受性诱导疗法的方法，其是通过在从所述受试者获取的生物样品中鉴定对FVIII有特异性的FVIII抑制抗体或CD4+T细胞的存在或含量来达成。

在一个实施方案中，所述方法包括一种在有需要的受试者中监测FVIII替补疗法的方法，所述方法包括：使所述受试者的生物样品与如本文所述的FVIII^246-266肽、FVIII^1401-1424肽或FVIII^102-122肽接触；和检测在所述FVIII肽与所述样品中所存在的FVIII抑制抗体之间形成的复合物。在一个实施方案中，所述方法包括测定所述样品中FVIII抑制抗体的含量。在另一实施方案中，所述方法包括测定在不同时间从所述受试者获取的至少两个样品中FVIII抑制抗体的含量，并且比较所述两个样品之间FVIII抑制抗体的含量，其中抗体含量随时间增加表明针对向所述受试者施用的FVIII的免疫反应在FVIII替补疗法过程中形成。

在另一实施方案中，所述方法包括一种在有需要的受试者中监测FVIII免疫耐受性诱导疗法的方法，所述方法包括：使所述受试者的生物样品与如本文所述的FVIII^246-266肽、FVIII^1401-1424肽或FVIII^102-122肽接触；和检测在所述FVIII肽与所述样品中所存在的FVIII抑制抗体之间形成的复合物。在一个实施方案中，所述方法包括测定所述样品中FVIII抑制抗体的含量。在另一实施方案中，所述方法包括测定在不同时间从所述受试者获取的至少两个样品中FVIII抑制抗体的含量，并且比较所述两个样品之间FVIII抑制抗体的含量，其中抗体含量随时间减少表明针对FVIII蛋白的免疫耐受性在所述受试者中形成。

在一个实施方案中，所述方法包括一种在有需要的受试者中监测FVIII替补疗法的方法，所述方法包括：使所述受试者的生物样品与如本文所述的FVIII^246-266肽、FVIII^1401-1424肽或FVIII^102-122肽接触；和检测在所述FVIII肽与所述样品中所存在的对FVIII有特异性的CD4+T细胞之间形成的复合物。在一个实施方案中，所述方法包括测定所述样品中对FVIII有特异性的CD4+T细胞的含量。在另一实施方案中，所述方法包括测定在不同时间从所述受试者获取的至少两个样品中对FVIII有特异性的CD4+T细胞的含量，并且比较所述两个样品之间对FVIII有特异性的CD4+T细胞的含量，其中抗体含量随时间增加表明针对向所述受试者施用的FVIII的免疫反应在FVIII替补疗法过程中形成。在一个特定实施方案中，所述FVIII肽与MHC II类多聚体复合。

在另一实施方案中，所述方法包括一种在有需要的受试者中监测FVIII免疫耐受性诱导疗法的方法，所述方法包括：使所述受试者的生物样品与如本文所述的FVIII^246-266肽、FVIII^1401-1424肽或FVIII^102-122肽接触；和检测在所述FVIII肽与所述样品中所存在的对FVIII有特异性的CD4+T细胞之间形成的复合物。在一个实施方案中，所述方法包括测定所述样品中对FVIII有特异性的CD4+T细胞的含量。在另一实施方案中，所述方法包括测定在不同时间从所述受试者获取的至少两个样品中对FVIII有特异性的CD4+T细胞的含量，并且比较所述两个样品之间对FVIII有特异性的CD4+T细胞的含量，其中抗体含量随时间减少表明针对FVIII蛋白的免疫耐受性在所述受试者中形成。在一个特定实施方案中，所述FVIII肽与MHC II类多聚体复合。

如本领域的普通技术人员所了解，免疫监测可以例如用以推进患有血友病的患者的治疗。例如，免疫监测可以用于鉴定施用本发明的肽和/或组合物是否防止或减少针对FVIII产物的免疫反应。剂量和/或剂量间隔可以通过免疫监测来最优化。在一些实施方案中，施用剂量可以特别基于防止或减少抗FVIII抗体的免疫监测结果来定制。另外，可以确定特定患者或患者群体的给药间隔以及剂量。

A.鉴定FVIII特异性T细胞的方法

在另一方面中，本发明包括鉴定抗原特异性T细胞，更确切地讲为对FVIII蛋白和本文所述的FVIII肽有特异性的T细胞的方法。所述方法可以例如用于患者的免疫诊断，如免疫监测。在一个实施方案中，本发明包括一种鉴定FVIII肽特异性T细胞的方法，所述方法包括a)使多种CD4⁺T细胞与同MHC II类多聚体复合的FVIII肽组合，所述FVIII肽具有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID NO:68、SEQID NO:344以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列；R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1；和b)鉴定对与MHC II类多聚体复合的肽有特异性的所述多种CD4⁺T细胞中的至少一员。在一些实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列，并且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本文中所公开的FVIII肽可以用于产生适于使FVIII特异性T细胞直接染色的试剂。例如，呈现本发明的FVIII肽的MHC II类多聚体可以包括多种形式，如MHC II类四聚体。这些MHC II类分子可以经过进一步修饰而包含诊断剂。或者，与MHCII类多聚体复合的FVIII肽可以包含诊断剂。本发明所用的诊断剂(即可检测部分)可以包括免疫监测领域中通常已知的诊断剂。例如，可以基于检测与本文所述的由MHC II类四聚体呈现的FVIII肽缔合的诊断剂来鉴定和/或分离FVIII特异性T细胞。合适诊断剂可以包括荧光剂、化学发光剂、放射性试剂、造影剂以及其类似试剂。合适荧光剂包括典型用于流动式细胞测量术的荧光剂并且可以包括(但不限于)异硫氰酸荧光素、R-藻红素、得克萨斯红(Texas Red)、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7以及其衍生物。

在某些实施方案中，FVIII肽可以用于体外再刺激CD4⁺FVIII特异性T细胞。在这些实施方案中，再刺激T细胞可以通过检测增殖、细胞因子或趋化因子的分泌或本领域技术人员已知的某些活化标记的上调或下调来监测。

在一些实施方案中，诊断剂检测可以用于鉴定和/或分离对本文中所公开的FVIII肽有特异性的T细胞。例如，上述试剂(例如肽、MHC II类四聚体以及诊断剂)可以用于体外或离体追踪FVIII特异性T细胞。在某些实施方案中，可使用本领域中通常已知的各种技术进一步分离和表征T细胞，所述技术如流动式细胞测量术，例如荧光活化细胞分选(FACS)；和/或PCR，例如单细胞PCR。

为进行免疫监测分析，结合FVIII肽-MHC II类多聚体复合物的T细胞包括CD4⁺T细胞，并且可以使用本领域中通常已知的多种方法从患者分离。例如，T细胞可从患者血液、器官或其它组织分离和纯化。FVIII特异性T细胞的分离和鉴定可以用于多种免疫诊断应用。在某些实施方案中，FVIII肽或相关试剂可以在新FVIII产品的临床开发期间用于免疫监测FVIII特异性T细胞。在其它实施方案中，FVIII肽可以在免疫耐受性诱导疗法期间用于免疫监测FVIII特异性T细胞。在其它实施方案中，FVIII肽可以在FVIII治疗期间用于免疫监测FVIII特异性T细胞。

VIII.本发明的试剂盒

本发明还提供推进和/或标准化由本发明提供的组合物的使用以及推进本发明的方法的试剂盒。可以在试剂盒中提供用于进行这些不同方法的材料和试剂以推行方法的执行。如本文中所用，术语“试剂盒”用以指推进方法、测定、分析或操纵的物品组合。

试剂盒可以含有化学试剂(例如FVIII肽或编码FVIII肽的多核苷酸)以及其它组分。另外，本发明的试剂盒还可以包括例如(但不限于)用于样品收集和/或纯化的设备和试剂、用于产物收集和/或纯化的设备和试剂、用于细菌细胞转化的试剂、用于真核细胞转染的试剂、预先转化或转染的宿主细胞、样品管、固持器、塔盘、支架、器皿、平板、试剂盒使用者的说明书、溶液、缓冲剂或其它化学试剂，适用于标准化、正规化的样品和/或对照样品。本发明的试剂盒还可以封装于例如具有盖子的盒子中以便方便储存和安全运送。

在一些实施方案中，例如，本发明的试剂盒可以提供本发明的FVIII肽、编码本发明的FVIII肽的多核苷酸载体(例如质粒)、适于繁殖载体的细菌细胞菌株以及用于纯化所表达的融合蛋白的试剂。或者，本发明的试剂盒可以提供为进行FVIII肽诱变所需的试剂，以便产生FVIII肽的经过保守修饰的变异体。

试剂盒可以含有一种或多种本发明的组合物，例如一种或多种FVIII肽或一种或多种编码FVIII肽的多核苷酸。或者，试剂盒可以含有用于进行患者的免疫监测的试剂(例如肽、MHC II类四聚体以及诊断剂)。

本发明的试剂盒还可以含有一种或多种编码FVIII肽的重组核酸分子，所述分子可以为相同或不同的，并且可以进一步包含(例如)操作性连接的含有或编码限制性核酸内切酶识别位点或重组酶识别位点、或任何所感兴趣多肽的第二多核苷酸。另外，试剂盒可以含有使用试剂盒组分(尤其试剂盒中所含有的本发明的组合物)的说明书。

IX.特定实施方案

在一个实施方案中，本发明提供一种FVIII肽，其由与以下氨基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)中的九个连续氨基酸至少85%一致的九个氨基酸的连续序列组成，并且所述肽具有式：(R1)x-肽-(R2)y，其中R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且下标x和y各独立地为0或1。

在上述肽的一个特定实施方案中，x和y都为0。

在上述肽的一个特定实施方案中，x为1且y为0。

在上述肽的一个特定实施方案中，x为0且y为1。

在上述肽的一个特定实施方案中，x和y都为1。

在上述肽的一个特定实施方案中，九个氨基酸的连续序列与氨基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)中的九个连续氨基酸一致。

在一个实施方案中，本发明提供一种包含FVIII肽的药物组合物，所述FVIII肽由与以下氨基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)中的九个连续氨基酸至少85%一致的九个氨基酸的连续序列组成，并且所述肽具有式：(R1)x-肽-(R2)y，其中R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；且下标x和y各独立地为0或1。

在上述组合物的一个特定实施方案中，x和y都为0。

在上述组合物的一个特定实施方案中，x为1且y为0。

在上述组合物的一个特定实施方案中，x为0且y为1。

在上述组合物的一个特定实施方案中，x和y都为1。

在上述组合物的一个特定实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种肽，所述肽由与独立地选自由以下组成的组的氨基酸序列中的九个连续氨基酸至少85%一致的九个氨基酸的连续序列组成：GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ ID NO:159)、PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ ID NO:250)、EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID NO:477)、LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ ID NO:568)、NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ ID NO:659)、TVVITLKNMASHPVSLHA(SEQ ID NO:10)、AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO:68)以及TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO:740)，其中所述至少一种肽长度为最大80个氨基酸并且其中所述至少一种肽中的任何其它氨基酸为天然氨基酸。

在一个实施方案中，本发明提供一种在受试者中诱导对FVIII的免疫耐受性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含FVIII肽的药物组合物的步骤，所述FVIII肽由与以下氨基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)中的九个连续氨基酸至少85%一致的九个氨基酸的连续序列组成，并且所述肽具有式：(R1)x-肽-(R2)y，其中R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；下标x和y各独立地为0或1；并且从而在所述受试者中诱导对FVIII蛋白的免疫耐受性。

在上述方法的一个特定实施方案中，所述药物组合物进一步包含至少一种肽，所述肽由与独立地选自由以下组成的组的氨基酸序列中的九个连续氨基酸至少85%一致的九个氨基酸的连续序列组成：GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ ID NO:159)、PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ ID NO:250)、EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID NO:477)、LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ ID NO:568)、NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ ID NO:659)、TVVITLKNMASHPVSLHA(SEQ ID NO:10)、AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO:68)以及TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO:740)，其中所述至少一种肽长度为最大80个氨基酸并且其中所述至少一种肽中的任何其它氨基酸为天然氨基酸。

在上述方法的一个特定实施方案中，施用药物组合物防止在受试者中发展抗FVIII抗体。

在上述方法的一个特定实施方案中，施用药物组合物减少受试者中存在的抗FVIII抗体的量。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为1且y为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为0且y为1。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为1。

在一个实施方案中，本发明提供一种制造FVIII肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含编码FVIII肽的载体的细胞培养物，所述FVIII肽由与以下氨基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)中的九个连续氨基酸至少85%一致的九个氨基酸的连续序列组成，并且所述肽具有式：(R1)x-肽-(R2)y，其中R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；下标x和y各独立地为0或1；和b)在所述细胞培养物中表达所述肽。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为1且y为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为0且y为1。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为1。

在一个实施方案中，本发明提供一种制造FVIII肽的方法，所述方法包括：a)使用固相或液相合成技术合成肽，所述肽由与以下氨基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)中的九个连续氨基酸至少85%一致的九个氨基酸的连续序列组成，并且所述肽具有式：(R1)x-肽-(R2)y，其中R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；下标x和y各独立地为0或1。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为1且y为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为0且y为1。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为1。

在一个实施方案中，本发明提供一种鉴定FVIII肽特异性T细胞的方法，所述方法包括：a)使多种CD4+T细胞与同MHC II类多聚体复合的FVIII肽组合，所述FVIII肽由与以下氨基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)中的九个连续氨基酸至少85%一致的九个氨基酸的连续序列组成，并且所述肽具有式：(R1)x-肽-(R2)y，其中R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；下标x和y各独立地为0或1；和b)鉴定对与MHC II类多聚体复合的肽有特异性的所述多种CD4+T细胞中的至少一员。

在上述方法的一个特定实施方案中，所述MHC II类多聚体为MHC II类四聚体。

在上述方法的一个特定实施方案中，所述肽或MHC II类多聚体进一步包含诊断剂。

在上述方法的一个特定实施方案中，所述诊断剂鉴定对肽有特异性的所述多种CD4+T细胞的至少一员。

在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法进一步包括基于所述诊断剂的检测分离对所述肽有特异性的所述多种CD4+T细胞的至少一员。

在上述方法的一个特定实施方案中，所述多种CD4+T细胞的至少一员是使用流动式细胞测量术分离。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为1且y为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为0且y为1。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为1。

现将在以下实施例中进一步说明本发明，但本发明不受限于这些实施例。

X.实施例

实施例1

为了更好地模拟人类MHC II类分子以鉴定FVIII肽，开发具有携带人类HLA-DRB1*1501特异性结合位点的嵌合MHC II类分子的甲型血友病的小鼠模型。这种小鼠与完全剔除所有鼠类MHC II类基因的小鼠回交(Reipert等,J.Thromb.Haemost.7增刊1:92-97(2009))。在这种新转基因小鼠模型中，所有CD4⁺T细胞反应都由人类MHC II类分子驱动。此小鼠模型用以鉴定由HLA-DRB1*1501呈现的在这些小鼠中驱动抗FVIII免疫反应的FVIII肽。

材料和方法

FVIII：制得重组人类FVIII(rFVIII)，其呈无白蛋白散装产品(Baxter Neuchatel)和临床蔗糖配制的FVIII产品(Advate,Baxter,Westlake Village,CA)形式。

血友病HLA-DRB15E17小鼠：如Reipert等,J.Thromb.Haemost.7增刊1:92-97(2009)中所述的HLA-DRB1*1501^+/-E17^-/-小鼠。小鼠全部为雄性且在实验开始时为8至12周大。

用人类重组FVIII免疫：HLA-DRB1*1501^+/-E17^-/-小鼠以每周间隔接受4至8次之间的0.2μg或1μg人类rFVIII的静脉内或皮下剂量。将rFVIII稀释于原始制剂缓冲液或杜尔贝科磷酸盐缓冲生理盐水(含有钙和镁)(DPBS，Sigma Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)中。

细胞制备：在使用rFVIII最后一次免疫后3至7天取得脾脏。切碎脾细胞并且使其通过70μm细胞过滤器(Becton Dickinson,FranklinLakes,NJ)。将单一细胞收集于以下培养基中：补充有10%预选胎牛血清(FCS；Hyclone,Logan,UT)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素/链霉素(两者均来自Gibco)以及5×10^-5M巯基乙醇(Sigma-Aldrich)的RPMI 1640培养基(Gibco,Invitrogen,Life Technologies,Carlsbad,CA)。使用主要由0.15M氯化铵、10mM碳酸氢钾(两者均来自Merck,Darmstadt,Germany)以及0.1mM乙二胺四乙酸(Sigma-Aldrich)组成的低渗缓冲液(pH7.2)溶解红血球。洗涤细胞并且使用库尔特计数器Z1计数。

产生T细胞杂交瘤以鉴定FVIII肽

用人类rFVIII体外再刺激脾细胞：在20μg/mL人类FVIII存在下以1.5×10⁶个细胞/毫升的浓度于培养基中再刺激脾细胞3或10天。在6天后更新用于10天培养的培养基。

小鼠T细胞与BW细胞的融合：用无血清培养基洗涤体外再刺激的脾细胞培养物和BW细胞(α-β-)两次，并且随后以1:3至1:10(T细胞:BW细胞)的比率组合。BW细胞系来源于小鼠AKR/J T细胞淋巴瘤。这些细胞在其表面(α-β-)上不具有T细胞受体且因此在与小鼠脾细胞融合后的任何T细胞受体来源于融合搭配物。在第三个洗涤步骤后，移除上清液。通过在45秒内添加1ml聚乙二醇(PEG；50%HybiMax,Sigma-Aldrich)来达成融合条件。再培育45秒后，接着添加50ml无血清培养基以防止PEG的毒性效应。在1300rpm下不间断地离心细胞5分钟以形成非常结实的沉淀。弃去上清液并且非常缓慢地添加50ml新的无血清培养基，旨在不使沉淀移位。缓慢颠倒试管直至细胞再悬浮并且如前所述离心。进行此操作两次以移除剩余PEG。用培养基进行最后的洗涤步骤。接着稀释细胞并且在96孔板中培养。在48小时后将培养基更换为选择培养基(HAT培养基补充物，Sigma Aldrich)且选择生长克隆。保留选择培养基2周，其后接着将培养基更换回正常培养基。

FVIII特异性T细胞杂交瘤的肽特异性：测试T细胞杂交瘤的抗原特异性。为此目的，使1×10⁵个细胞与抗原呈现细胞共培养。使用5×10⁴个Mgar细胞(表达HLA-DRB1*1501)或1×10⁵个来源于未处理的HLA-DRB1*1501-E17小鼠的完整脾细胞。在37°C、5%CO₂下用10μg/mL人类rFVIII或1μg/mL肽/肽池培育细胞24小时。收集上清液且根据制造商方案使用IL-2ELISA(BioLegend,San Diego,CA)或IL-2Bio-Plex(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)测量释放于培养上清液中的IL-2。在FVIII(或肽)存在(而非不存在)下IL-2释放量≥20pg/ml视为阳性，或者在FVIII存在下，与不存在FVIII相比IL-2释放量增加10倍视为阳性。

T细胞杂交瘤的亚克隆：为确保各克隆仅表示一种类型的T细胞，亚克隆所有杂交瘤克隆。将杂交瘤克隆稀释成0.3个细胞/孔的限制稀释度并且与每孔200个喂养细胞共培养。喂养细胞是通过以丝裂霉素C处理融合搭配物细胞BW细胞来产生。在室温下用0.1mg来自头状链霉菌(Streptomyces caespitosus)的丝裂霉素C(Sigma Aldrich)处理2×10⁸个BW细胞10分钟且在37°C、5%CO₂下于培育箱中培育25分钟。每个克隆选择五个生长亚克隆且测试其FVIII特异性。

用以确定T细胞杂交瘤特异性的FVIII肽池：如Ay等(Biopolymers 88:64-75(2007))所述，使用SPOT合成法产生FVIII肽池。简单地说，在两个相同的纤维素膜上合成15聚体肽。将膜切割为垂直和水平条带。肽从膜条带释放并且在如上所述的特异性测试中用作肽池。将肽溶解于DMSO(Hybrimax,Sigma Aldrich)中且用PBS进一步稀释。

结果

产生181种FVIII特异性杂交瘤克隆。针对覆盖整个人类FVIII的肽库筛选这些克隆。使用偏移三个氨基酸的15聚体肽。使用此方法鉴定含有与HLA-DRB1*1501结合的肽的六个不同FVIII区。发现人类FVIII的两个肽域在A1域内、两个肽在A2域内、一个在B域内、两个在A3域内且一个肽域在C1域内。先前并未描述FVIII肽^1401-1424(表11)。已经在WO 09/071886中使用计算机预测程序继之以T细胞杂交瘤技术鉴定肽FVIII^474-494、FVIII^545-559、FVIII^1788-1802以及FVIII^2161-2175。肽FVIII^2030-2044公开于WO 03/087161中。肽FVIII^2161-2180已由Jacquemin等,Blood 101(4):1351-8(2003)公开。

表11.FVIII的包括T细胞表位的区域

应了解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的并且根据其产生的各种修改或变化可为本领域技术人员所想到且欲包括于本申请的精神和权限以及随附权利要求的范围内。本文所引用的所有公开、专利以及专利申请据此以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的。

Claims

1.一种在有需要的受试者中诱导对FVIII的免疫耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：

向所述受试者施用治疗有效量的具有由下式组成的氨基酸序列的肽：

(R¹)_x-P-(R²)_y，

其中：

P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸具有至少85%同一性的氨基酸序列；

R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；

R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且

x和y各自独立地为0或1。

2.如权利要求1所述的方法，其中P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的方法，其中P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的方法，其中P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的方法，其中P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中x和y都为0。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中x为1且y为0。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中x为0且y为1。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中x和y都为1。

10.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述肽由9至100个氨基酸组成。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述肽由9至50个氨基酸组成。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述肽由9至25个氨基酸组成。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：

向所述受试者施用治疗有效量的具有由下式组成的氨基酸序列的第二肽：

(R¹)_x-P-(R²)_y，

其中：

P为与选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:159、SEQID NO:250、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:568、SEQID NO:659以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸具有至少85%同一性的氨基酸序列；

R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；

R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且

x和y各自独立地为0或1。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中施用所述药物组合物防止在所述受试者中发展抗FVIII抗体。

15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中施用所述药物组合物减少所述受试者中所存在的抗FVIII抗体的量。

16.一种肽，其由以下氨基酸序列组成：

(R¹)_x-P-(R²)_y，

其中：

R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；

R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且

x和y各自独立地为0或1。

17.如权利要求16所述的肽，其中P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

18.如权利要求16所述的肽，其中P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

19.如权利要求16所述的肽，其中P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

20.如权利要求16所述的肽，其中P为与SEQ ID NO:344的至少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

21.根据权利要求16至20中任一项所述的肽，其中x和y都为0。

22.根据权利要求16至20中任一项所述的肽，其中x为1且y为0。

23.根据权利要求16至20中任一项所述的肽，其中x为0且y为1。

24.根据权利要求16至20中任一项所述的肽，其中x和y都为1。

25.根据权利要求16至20中任一项所述的肽，其中所述肽由9至100个氨基酸组成。

26.如权利要求25所述的肽，其中所述肽由9至50个氨基酸组成。

27.如权利要求25所述的肽，其中所述肽由9至25个氨基酸组成。

28.一种组合物，其包含根据权利要求16至27中任一项所述的肽。

29.如权利要求28所述的组合物，其中所述组合物被配制成用于药物施用。

30.如权利要求28或29所述的组合物，其中所述组合物进一步包含第二多肽，所述第二多肽由以下氨基酸序列组成：

(R¹)_x-P-(R²)_y，

其中：

R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；

R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且

x和y各自独立地为0或1。

31.一种制造FVIII肽的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含编码根据权利要求16至27中任一项所述的FVIII肽的多核苷酸的细胞培养物；和

b)在所述细胞培养物中表达所述肽。

32.一种鉴定FVIII肽特异性T细胞的方法，所述方法包括：

a)使多种CD4⁺T细胞与同MHC II类多聚体复合的肽进行组合，其中所述肽为根据权利要求16至27中任一项所述的FVIII肽；和

b)鉴定对与MHC II类多聚体复合的肽有特异性的所述多种CD4⁺T细胞中的至少一员。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述MHC II类多聚体为MHC II类四聚体。

34.如权利要求32或33所述的方法，其中所述肽或MHC II类多聚体进一步包含可检测部分。

35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其进一步包括分离所述至少一种对所述肽有特异性的CD4⁺T细胞。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述CD4⁺T细胞是使用流动式细胞测量术分离。

37.一种融合蛋白，其包含：

根据权利要求16至27中任一项所述的因子VIII肽；和

第二肽。

38.如权利要求37所述的融合蛋白，其中所述第二肽为报导体肽。

39.如权利要求37或38所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白由核酸编码。

40.如权利要求37或38所述的融合蛋白，其中所述FVIII肽被化学连接至所述第二肽。