ES2912455T3 - Péptidos de FVIII para la inducción de tolerancia inmunitaria e inmunodiagnóstico - Google Patents
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Abstract
Péptido que consiste en la secuencia: (R1)x-P-(R2)y, en la que P es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 5 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 5 aminoácidos; y cada uno de x e y es independientemente cero o uno.
Description
DESCRIPCIÓN
Péptidos de FVIII para la inducción de tolerancia inmunitaria e inmunodiagnóstico
Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional estadounidense con número de serie 61/407.402, presentada el 27 de octubre 2010, la solicitud de patente provisional estadounidense con número de serie 61/467.894, presentada el 25 de marzo de 2011 y la solicitud de patente provisional estadounidense con número de serie 61/502.476, presentada el 29 de junio de 2011.
Declaración sobre los derechos de invenciones realizadas bajo investigación o desarrollo patrocinado federalmente
No aplicable
Referencia a una “lista de secuencias”, una tabla, o un apéndice de listado de programas informáticos presentado en un disco compacto
No aplicable
Antecedentes de la invención
El factor VIII (FVIII) es una proteína encontrada en el plasma sanguíneo que actúa como cofactor en la cascada de reacciones que conduce a la coagulación sanguínea. La hemofilia A se produce por una reducción o deficiencia de la proteína FVIII funcional y es uno de los trastornos hemorrágicos más frecuentes que afecta a aproximadamente 1 de cada 5000-10000 hombres. Los síntomas clínicos en la hemofilia son frecuentes hemorragias en músculos y articulaciones, y los traumatismos pueden conducir incluso a situaciones potencialmente mortales. Actualmente, los tratamientos eficaces para la hemofilia incluyen reemplazar la proteína FVIII que falta usando aplicación intravenosa de productos de FVIII derivados de plasma o recombinantes. Tales preparaciones se administran generalmente o bien en respuesta a un episodio hemorrágico (terapia bajo demanda) o bien a intervalos frecuentes y regulares para prevenir la hemorragia no controlada (profilaxis). Desafortunadamente, la aparición de anticuerpos neutralizantes anti-FVIII (inhibidores de FVIII) es una complicación importante durante la terapia de reemplazo con productos de FVIII. Aproximadamente, el 25 % de los pacientes que reciben tratamiento desarrollan esta inmunidad a la proteína FVIII haciendo, por tanto, que el control adicional de las hemorragias sea muy difícil.
La causa de esta respuesta inmunitaria a la proteína FVIII no se ha elucidado completamente, pero los aspectos específicos del sistema inmunitario de un paciente pueden afectar a su respuesta a la terapia. Normalmente, el sistema inmunitario desarrolla una tolerancia a determinados antígenos, por ejemplo, “autoantígenos”. Esta característica es importante porque, de otro modo, si un autoantígeno se reconoce como xenoantígeno, se produce enfermedad autoinmunitaria. Los pacientes con hemofilia A, en particular, tienen un defecto genético en su gen de FVIII, que hace que el sistema inmunitario no reconozca la proteína FVIII administrada como “autoantígeno”. Por tanto, cuando se administra proteína FVIII durante la terapia de reemplazo del factor de coagulación, el sistema inmunitario del paciente reconoce la proteína FVIII como xenoantígeno o una proteína propia alterada y desarrolla por consiguiente anticuerpos anti-FVIII.
Los inhibidores de FVIII, es decir, anticuerpos anti-FVIII los producen células plasmáticas derivadas de células B específicas de FVIII. Las células B necesitan la ayuda de células T CD4+ activadas para proliferar y diferenciarse en células plasmáticas que producen anticuerpos anti-FVIII. Por ejemplo, la proteína FVIII es reconocida por los linfocitos B y T de diferentes maneras. La inducción de anticuerpos anti-FVIII es dependiente de células T cooperadoras. Las células B reconocen epítopos completos de las proteínas mediante su receptor del linfocito B específico. Por otro lado, las células T reconocen proteínas en forma de péptidos procesados complejados con una molécula de CMH de clase II presentada sobre la superficie de una célula presentadora de antígenos. Cada clon de células T CD4+ reconoce únicamente un complejo de péptido-CMH específico. Para presentar los péptidos a las células T, las moléculas de CMH de clase II tienen un surco de unión abierto que permite que péptidos de diversas longitudes se ajusten y se presenten sobre la superficie de una célula. Además, la proteína de CMH de clase II contiene cuatro cavidades de unión que difieren para los diversos haplotipos (Jones et al., Nature Rev. Immunol. 6:271-282 (2006)). Únicamente aminoácidos específicos se ajustan en estas cavidades de unión, y el tamaño mínimo de los péptidos que se unen es de nueve aminoácidos. De manera notable, diferentes haplotipos de CMH de clase II pueden presentar diferentes péptidos. Por tanto, es probable que el haplotipo de CMH de clase II de un paciente influya en el riesgo de desarrollar anticuerpos anti-FVIII. De hecho, varios estudios han demostrado que hay una correlación entre el haplotipo de CMH de clase II humano HLA-DRB1*1501 y un aumento del riesgo de aparición de anticuerpos anti-FVIII (Pavlova et al., J. Thromb. Haemost. 7:2006-2015 (2009); Oldenburg et al., Thromb. Haemost. 77:238-242 (1997); Hay et al., Thromb. Haemost. 77:234-237 (1997)).
Se han explorado determinados enfoques para abordar los desafíos asociados con el tratamiento de la hemofilia
mediante la administración de proteína FVIII. Por ejemplo, el documento WO 03/087161 divulga proteínas FVIII modificadas, en las que las características inmunitarias de la proteína FVIII se modifican reduciendo o eliminando el número de epítopos de células T potenciales presentes en la proteína. Se identificaron varias regiones que incluyen epítopos de células T a lo largo de la proteína FVIII, incluyendo, por ejemplo, FVIII 2030-2044 . Según la divulgación, la eliminación de tales regiones pudo usarse para proporcionar proteína FVIII funcional que no indujo producción de anticuerpos anti-FVIII. El documento WO 09/071886 también divulga regiones específicas de la proteína FVIII que se predijo que dan lugar a péptidos de unión a HLA-DR2 que están implicados en la respuesta inmunitaria de un paciente, tales como, por ejemplo, FVIII 475-495 , FVIII 542-562 , FVIII 1785-1805 y FVIII 2158-2178 . Los péptidos se identificaron para su posible uso en la inducción de tolerancia inmunitaria en un paciente.
Aunque ha habido avances en la identificación de regiones de la proteína FVIII implicadas en la respuesta inmunitaria, existe todavía la necesidad de identificar otras regiones de la proteína FVIII que puedan usarse para desarrollar otros péptidos terapéuticos y metodologías que puedan, por ejemplo, usarse para tratar pacientes que tienen hemofilia A.
Breve sumario de la invención
La presente invención se basa en la identificación de regiones de la proteína FVIII relacionadas con la respuesta inmunitaria frente a moléculas de FVIII. Más específicamente, puede usarse un péptido de FVIII que incluye la región de la proteína FVIII para inducir tolerancia a FVIII humano en pacientes con, por ejemplo, hemofilia A. Además, los péptidos de FVIII pueden usarse con fines de inmunodiagnóstico para monitorizar pacientes con hemofilia A durante la terapia de reemplazo y durante la terapia de inducción de tolerancia inmunitaria.
La invención es tal como se define por las reivindicaciones adjuntas.
Se divulga en el presente documento un método para inducir una tolerancia inmunitaria a FVIII en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método una etapa de: administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en: (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que: P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 10, 68, 344, y 740; R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; y cada uno de x e y es independientemente cero o uno.
En los métodos proporcionados anteriormente, P puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 10.
En los métodos proporcionados anteriormente, P puede ser una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 10.
En los métodos proporcionados anteriormente, P puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 68.
En los métodos proporcionados anteriormente, P puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 68.
En los métodos proporcionados anteriormente, P puede ser una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 68.
En los métodos proporcionados anteriormente, P puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 344. En los métodos proporcionados anteriormente, P puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 344. En los métodos proporcionados anteriormente, P puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 344. En los métodos proporcionados anteriormente, P puede ser una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 344.
En los métodos proporcionados anteriormente, P puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 740. En los métodos proporcionados anteriormente, P puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 740. En los métodos proporcionados anteriormente, P puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 %
de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 740. En los métodos proporcionados anteriormente, P puede ser una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 740.
En los métodos proporcionados anteriormente, x e y pueden ser ambos cero.
En los métodos proporcionados anteriormente, x puede ser uno e y puede ser cero.
En los métodos proporcionados anteriormente, x puede ser cero e y puede ser uno.
En los métodos proporcionados anteriormente, x e y pueden ser ambos cero.
En los métodos proporcionados anteriormente, el péptido puede consistir en desde 9 hasta 100 aminoácidos.
En los métodos proporcionados anteriormente, el péptido puede consistir en desde 9 hasta 50 aminoácidos.
En los métodos proporcionados anteriormente, el péptido puede consistir en desde 9 hasta 25 aminoácidos.
En los métodos proporcionados anteriormente, la administración de la composición farmacéutica puede prevenir el desarrollo de anticuerpos anti-FVIII en el sujeto.
En los métodos proporcionados anteriormente, la administración de la composición farmacéutica puede reducir una cantidad de anticuerpos anti-FVIII presentes en el sujeto.
En un aspecto, la presente invención proporciona un péptido tal como se define en las reivindicaciones 1-2.
En una realización de los péptidos proporcionados anteriormente, x e y son ambos cero.
En una realización de los péptidos proporcionados anteriormente, x es uno e y es cero.
En una realización de los péptidos proporcionados anteriormente, x es cero e y es uno.
En una realización de los péptidos proporcionados anteriormente, x e y son ambos cero.
En un aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un péptido tal como se describe en el presente documento.
En una realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición se formula para administración farmacéutica.
En una realización de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición comprende además un segundo polipéptido, consistiendo el segundo polipéptido en la secuencia de aminoácidos: (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que: P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 10, 68, 159, 250, 477, 568, 659 y 740; R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; y cada uno de x e y es independientemente cero o uno. En un aspecto, la presente invención proporciona un método de preparación de un péptido tal como se define en la reivindicación 13.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar una célula T específica de péptido de FVIII tal como se define en la reivindicación 8.
En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el multímero de CMH de clase II es un tetrámero de CMH de clase II.
En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el péptido o multímero de CMH de clase II comprende además un resto detectable.
En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el método comprende además aislar al menos una célula T CD4 + que es específica para el péptido.
En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la célula T CD4 + se aísla usando citometría de flujo. También se divulga en el presente documento una proteína de fusión que comprende un péptido de FVIII tal como se
proporciona en el presente documento y un segundo péptido.
En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, el segundo péptido es un péptido indicador.
En los métodos proporcionados anteriormente, la proteína de fusión puede estar codificada por un ácido nucleico. En los métodos proporcionados anteriormente, el péptido de FVIII puede estar unido químicamente al segundo péptido.
En un aspecto, los péptidos de FVIII proporcionados en el presente documento se usan para inducir tolerancia inmunitaria hacia FVIII humano para la prevención del desarrollo de inhibidores de FVIII.
En un aspecto, los péptidos de FVIII proporcionados en el presente documento se usan para inducir tolerancia hacia FVIII humano para el tratamiento de pacientes con inhibidores de FVIII establecidos.
En un aspecto, los péptidos de FVIII proporcionados en el presente documento se usan para generar reactivos adecuados para tinción directa de células T específicas de FVIII (por ejemplo, multímeros de CMH de clase II o tetrámeros de CMH de clase II) en la monitorización inmunitaria de pacientes durante la terapia de reemplazo o durante la terapia de inducción de tolerancia inmunitaria.
En un aspecto, los péptidos de FVIII proporcionados en el presente documento se usan para identificar células T específicas de antígeno. En una realización, estos reactivos pueden usarse para rastrear células T específicas de FVIII en entornos in vitro y ex vivo. En otra realización, estos reactivos pueden usarse para aislar y caracterizar adicionalmente células T específicas de FVIII. En una realización, puede usarse clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o PCR unicelular para estos fines.
En un aspecto, los péptidos de FVIII proporcionados en el presente documento se usan para monitorización inmunitaria de células T específicas de FVIII durante la terapia de inducción de tolerancia inmunitaria.
En un aspecto, los péptidos de FVIII proporcionados en el presente documento se usan para monitorización inmunitaria de células T específicas de FVIII durante el tratamiento con FVIII.
En un aspecto, los péptidos de FVIII proporcionados en el presente documento se usan para inmunodiagnóstico de células T específicas de FVIII durante el desarrollo clínico de nuevos moduladores inmunitarios para la prevención de inhibidores de FVIII.
Breve descripción de los dibujos
No aplicable.
Descripción detallada de la invención
La invención es tal como se define por las reivindicaciones adjuntas.
I. Introducción
La presente invención se refiere a péptidos de factor VIII (FVIII) que pueden usarse para inducir tolerancia a proteína FVIII en, por ejemplo, pacientes con hemofilia A. Además, los péptidos pueden usarse para fines de inmunodiagnóstico para monitorizar células T específicas de FVIII en pacientes con hemofilia A durante la terapia de reemplazo y durante la terapia de inducción de tolerancia inmunitaria.
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que varias regiones de FVIII, específicamente FVIII102-122, FVIII246-266 y FVIII1401-1424, están implicadas en la respuesta inmunitaria montada frente a la proteína FVIII durante la terapia de reemplazo de factor VIII o conectadas con hemofilia adquirida. Las secuencias de aminoácidos de las regiones identificadas son TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID NO: 740), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID NO: 68) y QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), respectivamente. Se cree que la presente invención proporciona, por primera vez, la identificación de estas regiones de proteína FVIII y su relación con la respuesta inmunitaria a la proteína FVIII.
Los péptidos de la presente invención incluyen péptidos que tienen al menos una porción de las regiones FVIII102-122, FVIII246-266 y FVIII1401-1424 que se compleja con una molécula de CMH de clase II para producir un epítopo de células T capaz de ser reconocido por células T implicadas en la respuesta inmunitaria de un paciente. En algunas realizaciones, los péptidos incluyen al menos nueve aminoácidos contiguos que corresponden a nueve aminoácidos contiguos de FVIII102-122, FVIII246-266 o FVIII1401-1424. Tal como se describe adicionalmente a continuación, los péptidos proporcionados en el presente documento también incluyen péptidos más largos de nueve aminoácidos de longitud así como variantes de las secuencias de FVIII102-122, FVIII246-266 y FVIII1401-1424. Una identificación de este tipo de los
péptidos de la presente invención puede tener implicaciones en la mejora y el avance de estrategias terapéuticas diseñadas para tratar enfermedades relacionadas con la coagulación sanguínea, tales como hemofilia A.
II. Definiciones
El término “proteína factor VIII” o “proteína FVIII” se refiere a cualquier molécula de FVIII que tiene al menos una porción del dominio B intacta, y que presenta actividad biológica que está asociada con proteína FVIII humana nativa. La molécula de FVIII puede ser FVIII de longitud completa. La molécula de FVIII también puede ser una variante modificada de manera conservativa de FVIII nativo. La proteína FVIII puede derivarse de plasma humano o producirse mediante técnicas de ingeniería genética. Puede encontrarse caracterización adicional de la proteína FVIII, por ejemplo, en los párrafos [0042]-[0055] en el documento US 2010/0168018.
El término “péptido de factor VIII” o “péptido de FVIII” se refiere a los péptidos descritos en el presente documento que incluyen una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región de la proteína FVIII que se ha descubierto que es importante en una respuesta inmunitaria frente a FVIII. Un péptido de FVIII incluye al menos nueve aminoácidos que se complejan con una proteína de CMH de clase II para la presentación a células T implicadas en la respuesta inmunitaria. Pueden estar presentes aminoácidos adicionales en cualquier extremo del núcleo de al menos nueve aminoácidos del péptido. En algunas realizaciones, un péptido de FVIII puede incluir una secuencia idéntica a la región particular de proteína FVIII humana nativa. En otras realizaciones, un péptido de FVIII puede ser una variante modificada de manera conservativa de una región de la proteína FVIII. Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, un péptido de FVIII puede caracterizarse por un determinado porcentaje de identidad, por ejemplo, el 85 % idéntico, en relación con la secuencia de una región de proteína FVIII humana nativa.
El término “aminoácido” se refiere a aminoácidos no naturales y que se producen de manera natural, incluyendo análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido que funcionan de manera similar a los aminoácidos que se producen de manera natural. Los aminoácidos que se producen de manera natural incluyen los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, ycarboxiglutamato y O-fosfoserina. Los aminoácidos que se producen de manera natural pueden incluir, por ejemplo, aminoácidos D y L. Los aminoácidos usados en el presente documento también pueden incluir aminoácidos no naturales. Análogos de aminoácido se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido que se produce de manera natural, es decir, cualquier carbono que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina o metilsulfonio de metionina. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos de péptidos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido que se produce de manera natural. Miméticos de aminoácido se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido que se produce de manera natural. Puede hacerse referencia a los aminoácidos en el presente documento o bien por sus símbolos de tres letras frecuentemente conocidos o bien por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de nomenclatura bioquímica de la IUPAC-IUB. Del mismo modo, puede hacerse referencia a los nucleótidos por sus códigos de una única letra frecuentemente aceptados.
“Variantes modificadas de manera conservativa” se aplica a tanto secuencias de aminoácido como a secuencias de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, variantes modificadas de manera conservativa se refiere a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier péptido dado. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Por tanto, en cada posición en la que una alanina se especifica por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son “variaciones silenciosas”, que son una especie de variaciones modificadas de manera conservativa. Cada secuencia de ácido nucleico en el presente documento que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Una persona de experiencia ordinaria en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es habitualmente el único codón para metionina, y TGG, que es habitualmente el único codón para triptófano) puede modificarse para dar una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita con respecto al producto de expresión, pero no con respecto a las secuencias de sonda reales.
En cuanto a las secuencias de aminoácidos, una persona de experiencia ordinaria en la técnica reconocerá que sustituciones, deleciones o adiciones individuales en una secuencia de ácido nucleico o péptido que altera, añade o deleciona un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una “variante modificada de manera conservativa” en donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien en la técnica. Tales variantes modificadas de manera conservativa son además de y no excluyen variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos de la invención.
Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) alanina
(A), glicina (G); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) arginina (R), lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); 6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W); 7) serina (S), treonina (T); y 8) cisteína (C), metionina (M). Véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984).
Los términos “ idéntico” o porcentaje de “ identidad”, en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o péptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son iguales (es decir, aproximadamente el 60 % de identidad, preferiblemente el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, de identidad o superior a lo largo de una región especificada, cuando se comparan y alinean para máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación o región designada) tal como se mide usando algoritmos de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con parámetros por defecto descritos a continuación, o por alineación manual e inspección visual.
Por “cantidad o dosis terapéuticamente eficaz” o “cantidad o dosis suficiente” en el presente documento quiere decirse una dosis que produce los efectos para los que se administra. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento, y podrá determinarla el experto en la técnica usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Augsburger & Hoag, Pharmaceutical Dosage Forms (vol. 1-3, 3a ed. 2008); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (3a ed., 2008); Pickar, Dosage Calculations (8a ed., 2007); y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 2a ed., 2005, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
III. Péptidos de FVIII
La presente invención se refiere a péptidos de FVIII que corresponden a regiones de la proteína FVIII implicadas en una respuesta inmunitaria frente a FVIII. En un aspecto, la presente invención proporciona un péptido tal como se define en la reivindicación 1.
En una realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos.
Generalmente, los péptidos de FVIII pueden incluir cualquier secuencia de aminoácidos presente en la región identificada de FVIII 102-122 , FVIII 246-266 o FVIII 1401-1424 , o una variante modificada que puede, por ejemplo, conservar una función similar o idéntica a FVIII 102-122 , FVIII 246-266 o FVIII 1401-1424 . En particular, los péptidos de Fv III incluyen una secuencia de aminoácidos que incluye un epítopo de células T. Los péptidos de FVIII incluyen una secuencia de al menos nueve aminoácidos que puede oscilar en porcentaje de identidad en relación con la secuencia de aminoácidos AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID NO: 68); QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344); o TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID NO: 740). Por ejemplo, un péptido de FVIII puede tener nueve aminoácidos que son idénticos o al menos el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 % o el 85 % por ciento idénticos a cualquiera de nueve aminoácidos consecutivos de FVIII 102-122 , FVIII 246-266 o FVIII 1401-1424 .
En otro grupo de realizaciones, los péptidos de FVIII pueden tener secuencias de aminoácidos mayores de nueve aminoácidos, en los que las secuencias de aminoácidos incluyen una región que puede ser idéntica o al menos el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos consecutivos de FVIII 102-122 , FVIII 246-266 o FVIII 1401-1424 . Una persona de experiencia ordinaria en la técnica apreciará que pueden usarse técnicas de mutagénesis conocidas, tales como sustitución de alanina para identificar variantes modificadas que conservan la función de la región de FVIII 102-122 , FVIII 246-266 o FVIII 1401-1424 .
Además, los péptidos de FVIII pueden incluir otras secuencias de aminoácidos adicionales en cualquier extremo de la secuencia principal de los péptidos de FVIII comentados anteriormente. Las secuencias adicionales se designan (R 1 ) x y (R 2 ) y . En determinadas realizaciones, R 1 y R 2 pueden oscilar entre 1 y aproximadamente 80 aminoácidos de longitud. Alternativamente, R 1 y R 2 pueden oscilar entre 1 y aproximadamente 40 aminoácidos de longitud. En determinadas realizaciones, cada uno de los subíndices x e y son independientemente cero o uno. En algunas realizaciones, tanto x como y pueden ser cero. En otras realizaciones, x puede ser uno e y puede ser cero. En aún otras realizaciones más, x puede ser cero e y puede ser uno. En otra realización, tanto x como y son uno. Pueden añadirse aminoácidos adicionales en cualquier extremo por una variedad de motivos, incluyendo aumento de la estabilidad de los péptidos, mejora en la unión a moléculas de CMH de clase II y/o células T, así como otros aspectos que apreciará una persona de experiencia ordinaria en la técnica.
También se describe en el presente documento un polipéptido que tiene la secuencia (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una región de factor VIII identificada en la tabla 1, R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, y R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, en la que cada uno de x e y son independientemente cero o uno. Alternativamente, R 1 y R 2 pueden oscilar entre 1 y aproximadamente 40 aminoácidos de longitud. P puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una región de factor VIII identificada en la tabla 1. P puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 %
de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una región de factor VIII identificada en la tabla 1. X e y pueden ser cero, o x puede ser uno e y puede ser cero, o x puede ser cero e y puede ser uno, o tanto x como y pueden ser uno. El péptido de FVIII puede consistir en desde 9 hasta 150 aminoácidos, o desde 9 hasta 100 aminoácidos, o desde 9 hasta 50 aminoácidos, o desde 9 hasta 25 aminoácidos.
Tabla 1. Regiones de FVIII que incluyen epítopos de células T
Tal como se describió anteriormente, los péptidos de FVIII de la presente invención pueden incluir cualquier secuencia de aminoácidos presente en la región identificada de FVIII 1401-1424 o una variante modificada que puede, por ejemplo, conservar una función similar o idéntica a FVIII 1401-1424 . En determinadas realizaciones, los péptidos pueden cubrir el dominio B completo de proteína FVIII humana. La presente invención también puede incluir otros péptidos de FVIII que incluyen un péptido que tiene una secuencia de al menos nueve aminoácidos que puede oscilar en porcentaje de identidad en relación con una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (FVIII 474-494 ; SEQ ID NO: 159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (FVIII 540-560 ; SEQ ID NO: 250), EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (FVIII 1785-1805 ; SEQ ID NO: 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (FVIII 2025-2045 ; SEQ ID NO: 568), NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (FVIII 2160-2180 ; SEQ ID NO: 659), TVVITLKNMASHPVSLHA (FVIII 102-119 ; SEQ ID NO: 10), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (FVIII 246-266 ; SEQ ID NO: 68) y TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (FVIII 102-122 ; SEQ ID NO: 740).
Por ejemplo, los péptidos de FVIII que tienen nueve aminoácidos que son idénticos o al menos el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 % o el 85 % por ciento idénticos a cualquiera de nueve aminoácidos consecutivos de FVIII 474-494 , FVIII 540-560 , FVIII 1785-1805 , FVIII 2025-2045 , FVIII 2160-2180 , FVIII 102-119 , FVIII 246-266 o FVIII 102-122 . En otro grupo de realizaciones, los péptidos de FVIII pueden tener secuencias de aminoácidos mayores de nueve aminoácidos, en los que las secuencias de aminoácidos pueden ser idénticas o al menos el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % por ciento idénticas a cualquiera de nueve aminoácidos consecutivos de FVIII 474-494 , FVIII 540-560 , FVIII 1785-1805 , FVIII 2025-2045 , FVIII 2160-2180 , FVIII 102-119 , FVIII 246-266 o FVIII 102-122 . Una persona de experiencia ordinaria en la técnica apreciará que pueden usarse técnicas de mutagénesis conocidas, tales como sustitución de alanina para identificar variantes modificadas que conservan la función de las regiones de FVIII 474-494 , FVIII 540-560 , FVIII 1785-1805 , FVIII 2025-2045 , FVIII 2160-2180 , FVIII 102-119 , FVIII 246-266 o FVIII 102-122 . Los péptidos de FVIII divulgados en el presente documento pueden producirse usando métodos descritos anteriormente con respecto a los péptidos de FVIII relacionados con FVIII 1401-1424 .
A. Péptidos de factor v ii i102-119
En una realización, la presente invención usa un polipéptido que tiene la secuencia (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 102-119 que tiene la secuencia: TVVITLKNMASHPVSLHA (SEQ ID NO: 10), R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, y R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, en la que cada uno de x e y son independientemente cero o uno.
En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 102-119 que tiene la secuencia: TVVITLKNMASHPVSLHA (SEQ ID NO: 10). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 a 55 (SEQ ID NO: 10). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 a 55. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 a 55. En algunas realizaciones, tanto x como y pueden ser cero. En otras realizaciones, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras realizaciones, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra realización más, tanto x como y pueden ser uno.
En una realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 80 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos
que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 30 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos. En aún otra realización más, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,
51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos.
En determinadas realizaciones, R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 40 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En una realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 150 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta
100 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 25 aminoácidos. En aún otras realizaciones más, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,
32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 5 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93,
94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Tabla 2. Péptidos de FVIII102-119 a modo de ejemplo
B. Péptidos de factor VIII 246-266
La invención proporciona un péptido tal como se define en las reivindicaciones 1-2.
En una realización, la presente invención usa un polipéptido que tiene la secuencia (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 246-266 que tiene la secuencia: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID NO: 68), R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, y R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, en la que cada uno de x e y son independientemente cero o uno.
En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 246-266 que tiene la secuencia: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID NO: 68). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 246-266 que tiene la secuencia: AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID NO: 68). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 56 a 146. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 56 a 146. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 56 a 146. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 56 a 146. En algunas realizaciones, tanto x como y pueden ser cero. En otras realizaciones, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras realizaciones, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra realización más, tanto x como y pueden ser uno.
En una realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 80 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 30 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos. En aún otra realización más, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos.
En una realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 150 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 100 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 25 aminoácidos. En aún otras realizaciones más, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54,
55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Tabla 3. Péptidos de FVIII246-266 a modo de ejemplo
C. Péptidos de factor VIII 474-494
En una realización, la presente invención usa un polipéptido que tiene la secuencia (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 474-494 que tiene la secuencia: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (SEQ ID NO: 159), R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, y R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, en la que cada uno de x e y son independientemente cero o uno.
En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 474-494 que tiene la secuencia: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (SEQ ID NO: 159). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 474-494 que tiene la secuencia: GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (SEQ ID NO: 159). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 147 a 237. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 147 a 237. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 147 a 237. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 147 a 237. En algunas realizaciones, tanto x como y pueden ser cero. En otras realizaciones, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras realizaciones, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra realización más, tanto x como y pueden ser uno.
En determinadas realizaciones, R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 40 aminoácidos, y R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En una realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 150 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 100 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 25 aminoácidos. En aún otras realizaciones más, el péptido
de FVIII consiste en desde 9 hasta 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Tabla 4. Péptidos de FVIII474-494 a modo de ejemplo
D. Péptidos de factor VIII 540-560
En una realización, la presente invención usa un polipéptido que tiene la secuencia (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 540-560 que tiene la secuencia: PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID NO: 250), R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, y R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, en la que cada uno de x e y son independientemente cero o uno.
En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 540-560 que tiene la secuencia: PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID NO: 250). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 540-560 que tiene la secuencia: PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID NO: 250). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 238 a 328. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 238 a 328. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 238 a 328. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 238 a 328. En algunas realizaciones, tanto x como y pueden ser cero. En otras realizaciones, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras realizaciones, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra realización más, tanto x como y pueden ser uno.
En una realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 80 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos
que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 30 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos. En aún otra realización más, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos.
En una realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 150 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 100 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 25 aminoácidos. En aún otras realizaciones más, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Tabla 5. Péptidos de FVIII540-560 a modo de ejemplo
E. Péptidos de factor v ii i1401-1424
En una realización, la presente invención usa un polipéptido que tiene la secuencia (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 1401-1424 que tiene la secuencia: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, y R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, en la que cada uno de x e y son independientemente cero o uno.
En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una
secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII1401-1424 que tiene la secuencia: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII1401-1424 que tiene la secuencia: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 329 a 464. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 329 a 464. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 329 a 464. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 329 a 464. En algunas realizaciones, tanto x como y pueden ser cero. En otras realizaciones, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras realizaciones, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra realización más, tanto x como y pueden ser uno.
En una realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 80 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 30 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos. En aún otra realización más, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos.
En una realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 150 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 100 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 25 aminoácidos. En aún otras realizaciones más, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Tabla 6. Péptidos de FVIII1401-1424 a modo de ejemplo
F. Péptidos de factor VIII 1785-1805
En una realización, la presente invención usa un polipéptido que tiene la secuencia (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 1785-1805 que tiene la secuencia: EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (SEQ ID NO: 477), R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, y R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, en la que cada uno de x e y son independientemente cero o uno. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor V iii1785-1805 que tiene la secuencia: EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (SEQ ID NO: 477).
En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 1785-1805 que tiene la secuencia:
EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (SEQ ID NO: 477). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 465 a 555. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 465 a 555. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 465 a 555. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 465 a 555. En algunas realizaciones, tanto x como y pueden ser cero. En otras realizaciones, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras realizaciones, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra realización más, tanto x como y pueden ser uno.
En una realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 80 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 30 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos. En aún otra realización más, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos.
En una realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 150 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 100 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 25 aminoácidos. En aún otras realizaciones más, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Tabla 7. Péptidos de FVIII1785-1805 a modo de ejemplo
G. Péptidos de factor VIII 2025-2045
En una realización, la presente invención usa un polipéptido que tiene la secuencia (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 2025-2045 que tiene la secuencia: LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (SEQ ID NO: 568), R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, y R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, en la que cada uno de x e y son independientemente cero o uno.
En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 2025-2045 que tiene la secuencia: LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (SEQ ID NO: 568). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 2025-2045 que tiene la secuencia: LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (SEQ ID NO: 568). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 556 a 646. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 556 a 646. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 556 a 646. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 556 a 646. En algunas realizaciones, tanto x como y pueden ser cero. En otras realizaciones, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras realizaciones, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra realización más, tanto x como y pueden ser uno.
En una realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 80 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 30 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos. En aún otra realización más, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos.
En una realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 150 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 100 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 25 aminoácidos. En aún otras realizaciones más, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Tabla 8. Péptidos de FVIII 2025-2045 a modo de ejemplo
H. Péptidos de factor VIII 2160-2180
En una realización, la presente invención usa un polipéptido que tiene la secuencia (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 2160-2180 que tiene la secuencia: NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (SEQ ID NO: 659), R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, y R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, en la que cada uno de x e y son independientemente cero o uno.
En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 2160-2180 que tiene la secuencia: NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (SEQ ID NO: 659). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 2160-2180 que tiene la secuencia: NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (SEQ ID NO: 659). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 647 a 737. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 647 a 737. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 647 a 737. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 647 a 737. En algunas realizaciones, tanto x como y pueden ser cero. En otras realizaciones, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras realizaciones, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra realización más, tanto x como y pueden ser uno.
En una realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 80 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 30 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos. En aún otra realización más, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos.
En una realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 150 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 100 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 25 aminoácidos. En aún otras realizaciones más, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Tabla 9. Péptidos de FVIII2160-2180 a modo de ejemplo
I. Péptidos de factor VIII 102-122
En una realización, la presente invención usa un polipéptido que tiene la secuencia (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 102-122 que tiene la secuencia: TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID NO: 740), R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, y R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, en la que cada uno de x e y son independientemente cero o uno.
En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 102-122 que tiene la secuencia: TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID NO: 740). En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII 102-122 que tiene la secuencia: TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID NO: 740).
En el contexto de la presente invención, los péptidos de FVIII 102-122 también incluyen péptidos de FVIII 102-119 . Por consiguiente, en una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 a 55 y 738 a 773. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 a 55 y 738 a 773. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 a 55 y 738 a 773. En una realización, P es una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 a 55 y 738 a 773. En algunas realizaciones, tanto x como y pueden ser cero. En otras realizaciones, x puede ser uno e y puede ser cero. En otras realizaciones, x puede ser cero e y puede ser uno. En aún otra realización más, tanto x como y pueden ser uno.
En una realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 80 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 30 aminoácidos. En otra
realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos. En aún otra realización más, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos.
En una realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 150 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 100 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 25 aminoácidos. En aún otras realizaciones más, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Tabla 10. Péptidos de FVIII102-122 a modo de ejemplo
IV. Métodos de producción de péptidos de FVIII
En otro aspecto, la presente invención se refiere además a métodos para producir péptidos de FVIII. En algunas realizaciones, los péptidos de FVIII de la presente invención pueden producirse usando técnicas de síntesis en fase sólida (por ejemplo, Fmoc o f-Boc) o líquida generalmente conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, Chan & White, Eds., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Oxford University Press, 2000); Benoiton,
Chemistry of Peptide Synthesis (CRC Press, 2005); Howl, Peptide Synthesis and Applications (Humana Press, 2010).
En una realización, la presente invención usa un método de preparación de un péptido de FVIII, comprendiendo el método: a) sintetizar un péptido usando técnicas de síntesis en fase sólida o fase líquida, teniendo el péptido de FVIII la secuencia: (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 68, 344 y 740, R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; y cada uno de x e y es independientemente cero o uno. En una realización, R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 40 aminoácidos, y R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En determinadas realizaciones, los péptidos pueden cubrir todo el dominio B de la proteína FVIII humana.
En una realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 80 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 30 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos. En aún otra realización más, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos.
En otras realizaciones, los péptidos pueden producirse usando técnicas recombinantes. En una realización, la presente invención usa un método de preparación de un péptido de FVIII, comprendiendo el método las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células que comprende un vector que codifica un péptido de FVIII, teniendo el péptido de FVIII la secuencia: (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 68, 344 y 740, R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; y cada uno de x e y es independientemente cero o uno. En una realización, R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 40 aminoácidos, y R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En determinadas realizaciones, los péptidos pueden cubrir el dominio B completo de la proteína FVIII humana.
En una realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 80 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 30 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos. En aún otra realización más, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos.
La invención proporciona un método tal como se define en la reivindicación 13.
En una realización, la presente invención usa un método para producir un péptido de FVIII, comprendiendo el método las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células que comprende un polinucleótido que codifica un péptido de FVIII, teniendo el péptido la secuencia: (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 y 740, R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; y cada uno de x e y son independientemente cero o uno; y b) expresar el péptido en el cultivo de células.
En una realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta
80 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 30 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos. En otra realización, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos. En aún otra realización más, R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 4 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos.
En una realización de los métodos para producir péptidos de FVIII, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 150 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 100 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 25 aminoácidos. En aún otras realizaciones más, el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,
43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 6 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115,
120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Los péptidos de FVIII de la presente invención pueden producirse mediante expresión en un sistema de huésped procariota o eucariota adecuado. Los ejemplos de células eucariotas incluyen, sin limitación, células de mamífero, tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep y HepG2; células de insecto, por ejemplo células SF9, células SF21, células S2 y células High Five; y células de levadura, por ejemplo células de Saccharomyces o Schizosaccharomyces.
En una realización, los péptidos de FVIII pueden expresarse en células bacterianas, células de levadura, células de insecto, células aviares, células de mamífero, y similares. En algunas realizaciones, los péptidos pueden expresarse en una línea celular humana, una línea celular de hámster o una línea celular murina. En una realización particular, la línea celular es una línea celular CHO, BHK o HEK.
Puede usarse una amplia variedad de vectores para la expresión de los péptidos de FVIII y pueden seleccionarse de vectores de expresión procariotas y eucariotas. Los vectores incluirán una secuencia de nucleótidos necesaria para la expresión de al menos uno de los péptidos de FVIII divulgados en el presente documento. Los ejemplos de vectores para expresión procariota incluyen plásmidos tales como pRSET, pET, pBAD, etc., en los que los promotores usados en vectores de expresión procariota incluyen lac, trc, trp, recA, araBAD, etc. Los ejemplos de vectores para expresión eucariota incluyen: (i) para expresión en levadura, vectores tales como pAO, pPIC, pYES, pMET, usando promotores tales como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc.; (ii) para expresión en células de insecto, vectores tales como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., usando promotores tales como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc., y (iii) para la expresión en células de mamífero, vectores tales como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., y vectores derivados de sistemas virales tales como virus vaccinia, virus adenoasociados, virus del herpes, retrovirus, etc., usando promotores tales como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV y p-actina.
En algunas realizaciones de la presente invención, las secuencias de ácido nucleico para producir los péptidos de
FVIII incluyen además otras secuencias adecuadas para una expresión controlada de una proteína tal como secuencias de promotor, potenciadores, cajas TATA, sitios de iniciación de la transcripción, poliligadores, sitios de restricción, secuencias de poli-A, secuencias de procesamiento de proteínas, marcadores de selección, y similares que conoce generalmente una persona de experiencia ordinaria en la técnica.
Los medios de cultivo usados para las células que producen péptidos de FVIII pueden basarse en un medio basal adecuado bien conocido en la técnica, por ejemplo, DMEM, F12 de Ham, medio 199, McCoy o RPMI. El medio basal puede incluir varios componentes, incluyendo aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas y fuentes de hidratos de carbono. Cada componente puede estar presente en una cantidad que soporta el cultivo de una célula, siendo tales cantidades generalmente conocidas por un experto en la técnica. El medio puede incluir sustancias auxiliares, tales como sustancias tampón, por ejemplo, bicarbonato de sodio, antioxidantes, estabilizadores para contrarrestar la tensión mecánica o inhibidores de proteasas. Si es necesario, puede añadirse un tensioactivo no iónico tal como copolímeros y/o mezclas de polietilenglicoles y polipropilenglicoles.
En algunas realizaciones, el medio de cultivo está libre de proteína añadida de manera exógena. “Libre de proteína” y términos relacionados se refiere a una proteína que es de una fuente exógena a o distinta de las células en el cultivo, que secretan de manera natural proteínas durante el crecimiento. En otra realización, el medio de cultivo está libre de polipéptidos. En otra realización, el medio de cultivo está libre de suero. En otra realización el medio de cultivo está libre de proteína animal. En otra realización el medio de cultivo está libre de componentes animales. En otra realización, el medio de cultivo contiene proteína, por ejemplo, proteína animal de suero tal como suero fetal bovino.
En otra realización, el cultivo tiene proteínas recombinantes añadidas de manera exógena. En otra realización, las proteínas son de un animal libre de patógenos certificado.
Se conocen en la técnica métodos de preparación de medios de cultivo libres de proteínas animales y químicamente definidos, por ejemplo en los documentos US 2008/0009040 y US 2007/0212770. En una realización, el medio de cultivo usado en los métodos descritos en el presente documento está libre de proteínas animales o es un medio libre de oligopéptidos. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo puede estar definido químicamente. El término “definido químicamente” tal como se usa en el presente documento significará que el medio no comprende ningún complemento no definido, tal como, por ejemplo, extractos de componentes animales, órganos, glándulas, plantas o levadura. Por consiguiente, cada componente de un medio químicamente definido está definido con precisión.
En determinadas realizaciones, los métodos de la presente invención pueden incluir el uso de un sistema de cultivo celular que funciona en, por ejemplo, modo discontinuo, modo semicontinuo, modo de alimentación discontinua o modo continuo. Un cultivo discontinuo puede ser un cultivo celular a gran escala en el que se cultiva un inóculo celular hasta una densidad máxima en un tanque o fermentador, y se recoge y procesa como un lote. Un cultivo de alimentación discontinua puede ser un cultivo discontinuo al que se le suministran nutrientes nuevos (por ejemplo, sustratos que limitan el crecimiento) o aditivos (por ejemplo, precursores de productos). Un cultivo continuo puede ser un cultivo en suspensión al que se le suministran de manera continua nutrientes mediante el flujo de entrada de medio nuevo, en el que el volumen de cultivo es habitualmente constante. De manera similar, fermentación continua puede referirse a un proceso en el que células o microorganismos se mantienen en cultivo en la fase de crecimiento exponencial mediante la adición continua de medio nuevo que está exactamente equilibrada por la eliminación de suspensión celular del biorreactor. Además, puede usarse un sistema de reactor de tanque agitado para cultivos en suspensión, perfusión, quimiostáticos y/o de microportador. Generalmente, el sistema de reactor de tanque agitado puede hacerse funcionar como cualquier reactor de tanque agitado convencional con cualquier tipo de agitador tal como un agitador Rushton, de hidroala, de paleta inclinada o marino.
En determinadas realizaciones, los métodos de cultivo celular de la invención pueden incluir el uso de un microportador. En algunas realizaciones, los cultivos celulares de las realizaciones pueden realizarse en biorreactores grandes en condiciones adecuadas para proporcionar áreas de superficie de cultivo específicas de alto volumen para lograr altas densidades de células y expresión de proteínas. Un medio para proporcionar tales condiciones de crecimiento es usar microportadores para cultivo celular en biorreactores de tanque agitado. El concepto de crecimiento celular sobre microportadores lo describió por primera vez van Wezel (van Wezel, A.L., Nature 216:64-5 (1967)) y permite la unión de células sobre la superficie de partículas sólidas pequeñas suspendidas en el medio de crecimiento. Estos métodos proporcionan altas razones de superficie con respecto a volumen y, por tanto, permiten una utilización de nutrientes eficaz. Además, para la expresión de proteínas secretadas en líneas celulares eucariotas, la razón de superficie con respecto a volumen aumentada permite mayores niveles de secreción y, por tanto, mayores rendimientos de proteína en el sobrenadante del cultivo. Finalmente, estos métodos permiten un aumento a escala fácil de los cultivos de expresión eucariota.
Las células que expresan péptidos de FVIII pueden unirse a un microportador esférico o poroso durante el crecimiento del cultivo celular. El microportador puede ser un microportador seleccionado del grupo de microportadores basados en dextrano, colágeno, plástico, gelatina y celulosa y otros. También es posible hacer crecer las células para dar una biomasa sobre microportadores esféricos y subcultivar las células cuando han alcanzado la biomasa de fermentador final y antes de la producción de la proteína expresada sobre un microportador poroso o viceversa. Los microportadores esféricos adecuados pueden incluir microportadores de superficie lisa, tales como Cytodex™ 1, Cytodex™ 2 y Cytodex™ 3 (GE Healthcare) y microportadores macroporosos tales como Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1 y Cytoline™ 2 (GE Healthcare).
Una persona de experiencia ordinaria en la técnica apreciará que los péptidos de FVIII producidos mediante los métodos sintéticos y/o recombinantes descritos anteriormente pueden incluir aminoácidos naturales y/o no naturales, incluyendo análogos de aminoácido y/o miméticos de aminoácido.
V. Composiciones de péptidos de factor FVIII para inducir tolerancia inmunitaria
La presente invención proporciona una composición tal como se define en las reivindicaciones 4-5.
Los péptidos de FVIII divulgados en el presente documento pueden incluirse en una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede comprender un péptido de factor VIII246'266, péptido de factor VIII1401'1424 o péptido de factor VIII102'122, tal como se describe en el presente documento.
La composición farmacéutica puede comprender un péptido de factor VIN246-266 tal como se describe en el presente documento. La composición farmacéutica puede comprender además un péptido de FVIII474-494, péptido de FVIII540-560, péptido de FVIII1785-1805, péptido de FVIII2025-2045, péptido de FVIII2160-2180, péptido de FVIII102-119, péptido de FVIII1401-1424, péptido de FVIII102-122 o segundo péptido de FVIII246-266, tal como se describe en el presente documento.
La composición farmacéutica puede comprender un péptido de factor VIII1401-1424 tal como se describe en el presente
documento. La composición farmacéutica puede comprender además un péptido de FVIII 474-494 , péptido de FVIII 540-560 , péptido de FVIII 1785-1805 , péptido de FVIII 2025-2045 , péptido de FVIII 2160-2180 , péptido de FVIII 102-119 , péptido de FVIII 246-266 , péptido de FVIII 102-122 o segundo péptido de FVIII 1401-1424 , tal como se describe en el presente documento.
La composición farmacéutica puede comprender un péptido de factor VIII 102-122 tal como se describe en el presente documento. La composición farmacéutica puede comprender además un péptido de FVIII 474-494 , péptido de FVIII 540-560 , péptido de FVIII 1785-1805 , péptido de FVIII 2025-2045 , péptido de FVIII 2160-2180 , péptido de FVIII 102-119 , péptido de FVIII 246-266 , péptido de FVIII 1401-1424 o segundo péptido de FVIII 102-122 , tal como se describe en el presente documento.
La presente invención proporciona una composición tal como se define en las reivindicaciones 4-5.
En una realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2,
3, 4 ó 5 aminoácidos.
En una realización específica, la composición farmacéutica comprende además un segundo polipéptido, teniendo el segundo polipéptido la secuencia: (R 1 ) x -P-(R 2 ) y , en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el
85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 y 740, R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; y cada uno de x e y es independientemente cero o uno. En una realización, R 1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 40 aminoácidos, y R 2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 40 aminoácidos.
En una realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta
80 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 30 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos. En otra realización, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos. En aún otra realización más, R 1 y R 2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos.
En una realización, el segundo péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 150 aminoácidos. En otra realización, el segundo péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 100 aminoácidos. En otra realización, el segundo péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 50 aminoácidos. En otra realización, el segundo péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta
25 aminoácidos. En aún otras realizaciones más, el segundo péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120,
125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
A. Administración
Para administrar las composiciones a un humano o animal de prueba, en un aspecto, las composiciones pueden incluir uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Las frases “farmacéuticamente” o “farmacológicamente” aceptables se refiere a entidades moleculares y composiciones que son estables, inhiben la degradación de proteínas o péptidos tal como agregación y productos de escisión, y además no producen reacciones alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran usando vías bien conocidas en la técnica, tal como se describe a continuación. “Portadores farmacéuticamente aceptables” incluyen todos y cada uno de disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción útiles y similares.
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por vía oral, por vía tópica, por vía transdérmica, por vía parenteral, mediante pulverizador de inhalación, por vía vaginal, por vía rectal o mediante inyección intracraneal. El término parenteral tal como se usa en el presente documento incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intracisternal, o técnicas de infusión. También se contempla la administración mediante inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar y o implantación quirúrgica en un sitio particular. Generalmente, las composiciones están esencialmente libres de pirógenos, así como otras impurezas que podrían ser perjudiciales para el receptor.
Las dosificaciones y frecuencia de administración dependerán de diversos factores apreciados generalmente por los expertos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la gravedad de la hemofilia de un paciente y/o si la tolerancia inmunitaria se induce más eficazmente usando dosis mayores o menores. Las dosis diarias típicas pueden oscilar entre aproximadamente 0,01 y 100 mg/kg. Las dosis en el intervalo de 0,07-700 mg de péptido de FVNI a la semana pueden ser eficaces y se toleran bien, aunque incluso dosis semanales superiores pueden ser apropiadas y/o tolerarse bien. El factor determinante principal en la definición de la dosis apropiada es la cantidad de un péptido de FVIII particular necesaria para que sea terapéuticamente eficaz en un contexto particular. Pueden requerirse administraciones repetidas con el fin de lograr una tolerancia inmunitaria duradera más prolongada. Pueden llevarse a cabo administraciones individuales o múltiples de las composiciones seleccionando el médico encargado el patrón y los niveles de dosis.
En un aspecto, las composiciones de la invención pueden administrarse mediante un bolo. Como otro ejemplo, un péptido de FVIII puede administrarse como una sola dosis. Las personas de experiencia ordinaria en la técnica optimizarán fácilmente regímenes de administración y dosificaciones eficaces tal determinados conforme a la buena práctica médica y en función del estado clínico del paciente individual. La frecuencia de dosificación depende de la vía de administración. La composición farmacéutica óptima la determina un experto en la técnica dependiendo de la vía de administración y dosificación deseada. Véase por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Remington the Science and Practice of Pharmacy), 21a ed. (2005, Lippincott Williams & Wilkins). Tales composiciones influyen en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de aclaramiento in vivo de los agentes administrados. Dependiendo de la vía de administración, se calcula una dosis adecuada según el peso corporal, el área de superficie corporal o el tamaño del órgano. Pueden determinarse dosificaciones apropiadas a través del uso de ensayos establecidos para determinar las dosificaciones a nivel sanguíneo conjuntamente con datos de respuesta a la dosis apropiados. El régimen de dosificación final lo determina el médico encargado, considerando diversos factores que modifican la acción de fármacos, por ejemplo la actividad específica del fármaco, la gravedad del daño y la respuesta del paciente, la edad, el estado, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos.
En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden un péptido de FVIII divulgadas en el presente documento se liofilizan antes de su administración. La liofilización se lleva a cabo usando técnicas comunes en la técnica y deben optimizarse para la composición que está desarrollándose, tal como se describe, por ejemplo, en Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) y Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996). Los métodos de preparación de composiciones farmacéuticas pueden incluir una o más de las siguientes etapas: añadir un agente estabilizante a la mezcla antes de la liofilización, añadir al menos un agente seleccionado de un agente de carga, un agente regulador de la osmolaridad y un tensioactivo a la mezcla antes de la liofilización. Una formulación liofilizada está comprendida, en un aspecto, al menos por uno o más de un tampón, un agente de carga y un estabilizador. En este aspecto, la utilidad de un tensioactivo se evalúa y se selecciona en casos en donde la agregación durante la etapa de liofilización o durante la reconstitución se convierte en un problema. Se incluye un agente de tamponamiento apropiado para mantener la formulación dentro de zonas estables de pH durante la liofilización.
La práctica de reconstitución convencional para material liofilizado es añadir de nuevo un volumen de agua pura o agua estéril para inyección (WFI) (normalmente equivalente al volumen retirado durante la liofilización), aunque algunas veces se usan disoluciones diluidas de agentes antibacterianos en la producción de productos farmacéuticos para administración parenteral. Por consiguiente, se proporcionan métodos para la preparación de composiciones de péptidos de FVIII reconstituidas que comprenden la etapa de añadir un diluyente a composiciones de péptidos de FVIII liofilizadas.
En algunas realizaciones, el material liofilizado puede reconstituirse como una disolución acuosa. Una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua estéril para inyección, agua con conservantes para uso de múltiples dosis, o agua con cantidades apropiadas de tensioactivos (por ejemplo, una suspensión acuosa que contiene el compuesto activo en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas). En diversos aspectos, tales excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo y sin limitación, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga; agentes humectantes o de dispersión son un fosfátido que se produce de manera natural, por ejemplo y sin limitación, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo y sin limitación, poli(estearato de oxietileno), o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo y sin limitación, heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo y sin limitación, monooleato de polietilensorbitano. En diversos aspectos, las suspensiones acuosas también contienen uno o más conservantes, por ejemplo y sin limitación, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo.
VI. Métodos de tratamiento
También se divulgan en el presente documento métodos de tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad asociada con la proteína FVIII, tal como hemofilia A o hemofilia adquirida. Tales métodos pueden incluir la
administración de al menos uno de los péptidos de FVIII divulgados en el presente documento. En particular, las composiciones farmacéuticas que incluyen al menos uno de los péptidos de FVIII pueden administrarse para inducir tolerancia inmunitaria a la proteína FVIII en un paciente.
Los métodos para inducir una tolerancia inmunitaria a FVIII pueden incluir impedir el desarrollo de inhibidor de FVIII tras la administración de FVIII. El término “ impedir” se refiere a no permitir una respuesta inmunitaria sustancialmente detectable a FVIII. Por ejemplo, un paciente antes de la administración de la proteína FVIII puede no tener ningún anticuerpo anti-FVIII detectable. Sin embargo, tras la terapia de administración con proteína FVIII, el nivel de anticuerpos anti-FVIII detectables puede aumentar si no se administra un péptido de FVIII para inducir tolerancia inmunitaria. La administración de los péptidos de FVIII divulgados en el presente documento puede inducir tolerancia inmunitaria, tratando de ese modo a un paciente que tiene hemofilia.
Los métodos para inducir una tolerancia inmunitaria a la proteína FVIII pueden incluir tratar pacientes que ya tienen inhibidores de FVIII establecidos. En estos métodos, la administración del péptido de FVIII puede reducir o eliminar la presencia de anticuerpos anti-FVIII. El término “reducir” significa una reducción parcial en una respuesta inmunitaria a proteína FVIII. En determinadas realizaciones, la reducción de la respuesta inmunitaria puede incluir una reducción del 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 % o el 90 % en la respuesta inmunitaria en comparación con el nivel de la respuesta inmunitaria en un paciente antes de la administración del péptido de FVIII. Por ejemplo, el porcentaje de reducción puede analizarse midiendo la cantidad de anticuerpos anti-FVIII presentes en la sangre antes y después de la administración del péptido de FVIII, usando métodos convencionales para determinar la cantidad de anticuerpos frente a FVIII presentes. En otras realizaciones, la reducción de la respuesta inmunitaria puede incluir medir niveles reducidos de células T CD4+ específicas para FVIII o células B específicas para FVIII que secretan anticuerpos frente a FVIII, o una combinación de los tres, las células T, células B y los anticuerpos anti-FVIII. Pueden aislarse células inmunitarias, tales como células T y B específicas para FVIII usando métodos generalmente conocidos en la técnica.
En un aspecto, la presente divulgación incluye un método de inducción de tolerancia inmunitaria a FVIII en un sujeto, comprendiendo el método una etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un péptido de FVIII tal como se describe en el presente documento. El péptido de FVIII puede ser un péptido de factor VIII246-266, péptido de factor VIII1401'1424 o péptido de factor VIII102'122, tal como se describe en el presente documento.
El método puede comprender una etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un péptido de factor VIII246-266 tal como se describe en el presente documento. La composición farmacéutica puede comprender además un péptido de FVIII474-494, péptido de FVIII540’ 560, péptido de FVIII1785-1805, péptido de FVIII2025-2045, péptido de FVIII2160-2180, péptido de FVIII102-119, péptido de FVIII1401-1424, péptido de FVIII102-122 o un segundo péptido de FVIII246-266, tal como se describe en el presente documento.
El método puede comprender una etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un péptido de factor v III1401-1424 tal como se describe en el presente documento. La composición farmacéutica puede comprender además un péptido de FVIII474-494, péptido de FVIII540-560, péptido de FVIII1785-1805, péptido de FVIII2025-2045, péptido de FVIII2160-2180, péptido de FVIII102-119, péptido de FVIII246-266, péptido de FVIII102-122 o un segundo péptido de Fv III1401-1424, tal como se describe en el presente documento.
El método puede comprender una etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un péptido de factor VIII102-122 tal como se describe en el presente documento. La composición farmacéutica puede comprender además un péptido de FVIII474-494, péptido de FVIII540-560, péptido de FVIII1785-1805, péptido de FVIII2025-2045, péptido de FVIII2160-2180, péptido de FVIII102-119, péptido de FVIII246-266, péptido de f v III1401-1424 o un segundo péptido de FVIII102-122, tal como se describe en el presente documento.
También se divulga en el presente documento un método para inducir una tolerancia inmunitaria a una proteína FVIII, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un péptido que tiene la secuencia: (R1)x-P-(R2)y, en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 68, 344 y 740, R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; y cada uno de x e y es independientemente cero o uno; induciendo de ese modo una tolerancia inmunitaria a proteína FVIII en el sujeto. R1 puede ser una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 40 aminoácidos, y R2 puede ser una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 40 aminoácidos.
R1 y R2 pueden ser por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 80 aminoácidos. R1 y R2 pueden ser por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos. R1 y R2 pueden ser por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos. R1 y R2 pueden ser por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos. R1 y R2 pueden ser por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos. R1 y R2 pueden ser por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten
en desde 1 hasta 30 aminoácidos. R1 y R2 pueden ser por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos. R1 y R2 pueden ser por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos. R1 y R2 pueden ser por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos. R1 y R2 pueden ser por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,
54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos.
El péptido de FVIII puede consistir en desde 9 hasta 150 aminoácidos, o el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta
100 aminoácidos, o el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 50 aminoácidos, o el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 25 aminoácidos, o el péptido de FVIII consiste en desde 9 hasta 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 1 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,
82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145,
150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
Los métodos de inducción de tolerancia inmunitaria pueden incluir además terapias de combinación en las que pueden administrarse varios péptidos para inducir tolerancia inmunitaria.
El método de inducción de tolerancia inmunitaria puede comprender además administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segundo péptido que tiene la secuencia: (R1)x-P-(R2)y, en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 y 740,
R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; y cada uno de x e y es independientemente cero o uno; induciendo de ese modo una tolerancia inmunitaria a proteína FVIII en el sujeto. R1 puede ser una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 40 aminoácidos, y R2 puede ser una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 40 aminoácidos. El segundo péptido puede consistir en desde 9 hasta 80 aminoácidos.
Cualquier aminoácido adicional en el segundo péptido pueden ser aminoácidos naturales.
El segundo péptido puede consistir en desde 9 hasta 40 aminoácidos de longitud.
Específicamente , el segundo péptido puede consistir en desde 9 hasta 80 aminoácidos de longitud y cualquier aminoácido adicional en el segundo péptido son aminoácidos naturales.
R1 y R2 pueden ser por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 80 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 30 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,
37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,
68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos.
El segundo péptido de FVIII puede consistir en desde 9 hasta 150 aminoácidos, o desde 9 hasta 100 aminoácidos, o desde 9 hasta 50 aminoácidos, o desde 9 hasta 25 aminoácidos, o desde 9 hasta 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,
50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,
81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140,
145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 ó 180 aminoácidos.
En un método específico para inducir una tolerancia inmunitaria, en la que la composición farmacéutica administrada comprende un péptido en el que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 68, 344 ó 740, la composición puede comprender además un segundo polipéptido, teniendo el segundo polipéptido la secuencia: (R1)x-P-(R2)y, en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 10, 68, 159, 250, 344, 477,
568, 659 y 740, R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; y cada uno de x e y es independientemente cero o uno.
R1 y R2 pueden ser por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 80 aminoácidos, o desde 1 hasta 70 aminoácidos, o desde 1 hasta 60 aminoácidos, o desde 1 hasta 50 aminoácidos, o desde 1 hasta 40 aminoácidos, o desde 1 hasta 30 aminoácidos, o desde 1 hasta 20 aminoácidos, o desde 1 hasta
10 aminoácidos, o desde 1 hasta 5 aminoácidos, o desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,
49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u
80 aminoácidos.
También se divulga en el presente documento el uso de un péptido de FVIII tal como se describe en el presente documento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una respuesta inmunitaria generada contra la terapia de reemplazo de FVIII. El péptido de FVIII puede ser un péptido de FVIII1401-1424. También se divulga en el presente documento un péptido de FVIII tal como se describe en el presente documento para la fabricación de un medicamento para la prevención de una respuesta inmunitaria generada contra la terapia de reemplazo de FVIII. El péptido de FVIII puede ser un péptido de FVIII1401-1424.
También se divulga en el presente documento un péptido de FVIII para su uso como medicamento. Específicamente, la divulgación abarca un polipéptido que tiene la secuencia (R1)x-P-(R2)y, en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII1401-1424 que tiene la secuencia: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, en la que cada uno de x e y son independientemente cero o uno para su uso como medicamento.
También se divulga en el presente documento un péptido de FVIII para el tratamiento de una respuesta inmunitaria generada contra la terapia de reemplazo de FVIII. Específicamente, la divulgación abarca un polipéptido que tiene la secuencia (R1)x-P-(R2)y, en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII1401'1424 que tiene la secuencia: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, en la que cada uno de x e y son independientemente cero o uno para el tratamiento de una respuesta inmunitaria generada contra la terapia de reemplazo de FVIII.
También se divulga en el presente documento un péptido de FVIII para la prevención de una respuesta inmunitaria generada contra la terapia de reemplazo de FVIII. Específicamente, la divulgación abarca un polipéptido que tiene la secuencia (R1)x-P-(R2)y, en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de un péptido de factor VIII1401’1424 que tiene la secuencia: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, y R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos, en la que cada uno de x e y son independientemente cero o uno para la prevención de una respuesta inmunitaria generada contra la terapia de reemplazo de FVIII.
VII. Inmunodiagnóstico
También se divulga en el presente documento un método para monitorizar la terapia de reemplazo de FVIII o terapia de inducción de tolerancia inmunitaria a FVIII en un sujeto que lo necesita identificando la presencia o el nivel de un anticuerpo inhibidor de FVIII o célula T CD4+ que es específica para FVIII en una muestra biológica tomada del sujeto.
El método puede comprender un método para monitorizar la terapia de reemplazo de FVIII en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método: poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un péptido de FVIII246-266, péptido de FVIII1401-1424 o péptido de FVIII102-122, tal como se describe en el presente documento; y detectar un complejo formado entre el péptido de FVIII y un anticuerpo inhibidor de FVIII presente en la muestra. El método puede comprender determinar el nivel de anticuerpo inhibidor de FVIII en la muestra. El método puede comprender determinar el nivel de un anticuerpo inhibidor de FVIII en al menos dos muestras tomadas del sujeto a diferentes tiempos, y comparar los niveles de anticuerpo inhibidor de FVIII entre las dos muestras, en el que un aumento en el nivel de anticuerpo a lo largo del tiempo es indicativo de la formación de una respuesta inmunitaria frente a FVIII administrado al sujeto durante el transcurso de la terapia de reemplazo de FVIII.
El método puede comprender un método para monitorizar la terapia de inducción de tolerancia inmunitaria a FVIII en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método: poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un péptido de FVIII246-266, péptido de FVIII1401-1424 o péptido de FVIII102-122, tal como se describe en el presente documento;
y detectar un complejo formado entre el péptido de FVIII y un anticuerpo inhibidor de FVIII presente en la muestra. El método puede comprender determinar el nivel de anticuerpo inhibidor de FVIII en la muestra. El método puede comprender determinar el nivel de un anticuerpo inhibidor de FVIII en al menos dos muestras tomadas del sujeto a diferentes tiempos, y comparar los niveles de anticuerpo inhibidor de FVIII entre las dos muestras, en el que una disminución en el nivel de anticuerpo a lo largo del tiempo es indicativa de la formación de tolerancia inmunitaria a proteína FVIII en el sujeto.
El método puede comprender un método para monitorizar la terapia de reemplazo de FVIII en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método: poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un péptido de FVIlI246-266, péptido de FVIII1401-1424 o péptido de FVIII102-122, tal como se describe en el presente documento; y detectar un complejo formado entre el péptido de FVIII y una célula T CD4+ específica para FVIII presente en la muestra. El método puede comprender determinar el nivel de célula T CD4+ específica para FVIII en la muestra. El método puede comprender determinar el nivel de una célula T CD4+ específica para FVIII en al menos dos muestras tomadas del sujeto a diferentes tiempos, y comparar los niveles de célula T CD4+ específica para FVIII entre las dos muestras, en el que un aumento en el nivel de anticuerpo a lo largo del tiempo es indicativo de la formación de una respuesta inmunitaria frente a FVIII administrado al sujeto durante el transcurso de la terapia de reemplazo de FVIII. El péptido de FVIII puede complejarse con un multímero de CMH de clase II.
El método puede comprender un método para monitorizar la terapia de inducción de tolerancia inmunitaria a FVIII en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método: poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un péptido de FVIII246-266, péptido de FVIII1401-1424 o péptido de FVIII102-122, tal como se describe en el presente documento; y detectar un complejo formado entre el péptido de FVIII y una célula T CD4+ específica para FVIII presente en la muestra. El método puede comprender determinar el nivel de célula T CD4+ específica para FVIII en la muestra. El método puede comprender determinar el nivel de una célula T CD4+ específica para FVIII en al menos dos muestras tomadas del sujeto a diferentes tiempos, y comparar los niveles de célula T CD4+ específica para FVIII entre las dos muestras, en el que una disminución en el nivel de anticuerpo a lo largo del tiempo es indicativa de la formación de tolerancia inmunitaria a proteína FVIII en el sujeto. El péptido de FVIII puede complejarse con un multímero de CMH de clase II.
Tal como apreciará una persona de experiencia ordinaria en la técnica, puede usarse monitorización inmunitaria, por ejemplo, para facilitar el tratamiento de pacientes con hemofilia. Por ejemplo, puede usarse monitorización inmunitaria para identificar si la administración de los péptidos y/o composiciones de la presente invención está impidiendo o reduciendo una respuesta inmunitaria a un producto de FVIII. Pueden optimizarse las cantidades de dosificación y/o intervalos de dosificación mediante monitorización inmunitaria. En algunas realizaciones, las dosificaciones de administración pueden adaptarse específicamente basándose en los resultados de la monitorización inmunitaria de la prevención o reducción de anticuerpos anti-FVIII. Además, los intervalos de dosificación así como las cantidades de dosificación pueden determinarse para un paciente o grupo de pacientes particulares.
A. Métodos de identificación de células T específicas de FVIII
La invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones 8-12.
En determinadas realizaciones, los péptidos de FVIII divulgados en el presente documento pueden usarse para generar reactivos adecuados para tinción directa de células T específicas de FVIII. Por ejemplo, los multímeros de CMH de clase II que presentan los péptidos de FVIII de la presente invención pueden incluir una variedad de formas, tales como un tetrámero de CMH de clase II. Estas moléculas de CMH de clase II pueden modificarse adicionalmente para incluir un agente de diagnóstico. Alternativamente, los péptidos de FVIII que se complejan con los multímeros de CMH de clase II pueden incluir un agente de diagnóstico. Los agentes de diagnóstico (es decir, un resto detectable) usados en la presente invención pueden incluir los conocidos generalmente en la técnica para monitorización inmunitaria. Por ejemplo, pueden identificarse y/o aislarse células T específicas de FVIII basándose en la detección de un agente de diagnóstico asociado con un péptido de FVIII descrito en el presente documento presentado por un tetrámero de CMH de clase II. Los agentes de diagnósticos adecuados pueden incluir un agente fluorescente, un agente quimioluminiscente, un agente radiactivo, un agente de contraste, y similares. Los agentes de fluorescencia adecuados incluyen los normalmente usados en citometría de flujo y pueden incluir pero no se limitan a isotiocianato de fluoresceína, R-ficoeritrina, rojo Texas, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7, y derivados de los mismos.
En determinadas realizaciones, el péptido de FVIII puede usarse para reestimular células T específicas de FVIII CD4+ in vitro. En estas realizaciones, la reestimulación de las células T podría monitorizarse mediante la detección de proliferación, secreción de citocinas o quimiocinas, o la regulación por incremento o disminución de determinados marcadores de activación que conocen los expertos en la técnica.
En algunas realizaciones, la detección del agente de diagnóstico puede usarse para identificar y/o aislar células T específicas para los péptidos de FVIII divulgados en el presente documento. Por ejemplo, los reactivos anteriores (por ejemplo, péptido, tetrámero de CMH de clase II y agente de diagnóstico) pueden usarse para rastrear células T específicas de FVIII in vitro o ex vivo. En determinadas realizaciones, las células T pueden aislarse y caracterizarse adicionalmente usando diversas técnicas conocidas generalmente en la técnica, tales como citometría de flujo, por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), y/o PCR, por ejemplo, PCR unicelular.
Para llevar a cabo análisis de monitorización inmunitaria, las células T que se unen al complejo de péptido de FVIII-multímero de CMH de clase II incluyen células T CD4+ y pueden aislarse de un paciente usando una variedad de métodos conocidos generalmente en la técnica. Por ejemplo, pueden aislarse y purificarse células T procedentes de la sangre, los órganos u otro tejido de un paciente. El aislamiento y la identificación de las células T específicas de
FVIII pueden usarse para una variedad de aplicaciones de inmunodiagnóstico. En determinadas realizaciones, los péptidos de FVIII o reactivos asociados pueden usarse para la monitorización inmunitaria de células T específicas de FVIII durante el desarrollo clínico de un nuevo producto de FVIII. En otras realizaciones, los péptidos de FVIII pueden usarse para la monitorización inmunitaria de células T específicas de FVIII durante la terapia de inducción de tolerancia inmunitaria. En aún otras realizaciones más, los péptidos de FVIII pueden usarse para la monitorización inmunitaria de células T específicas de FVIII durante el tratamiento con FVIII.
VIII. Kits
También se divulgan en el presente documento kits para facilitar y/o estandarizar el uso de composiciones proporcionadas por la presente invención, así como para facilitar los métodos de la presente invención. Los materiales y reactivos para llevar a cabo estos diversos métodos pueden proporcionarse en kits para facilitar la ejecución de los métodos. Tal como se usa en el presente documento, el término “kit” se usa en referencia a una combinación de artículos que facilitan un procedimiento, ensayo, análisis o manipulación.
Los kits pueden contener reactivos químicos (por ejemplo, péptidos de FVIII o polinucleótidos que codifican péptidos de FVIII) así como otros componentes. Además, los kits pueden incluir también, por ejemplo pero no se limitan a, un aparato y reactivos para la recogida y/o purificación de muestras, un aparato y reactivos para la recogida y/o purificación de productos, reactivos para transformación de células bacterianas, reactivos para transfección de células eucariotas, células huésped previamente transformadas o transfectadas, tubos, soportes, bandejas, rejillas, platos, placas de muestras, instrucciones para el usuario del kit, disoluciones, tampones u otros reactivos químicos, muestras adecuadas para usarse para la estandarización, normalización y/o muestras de control. Los kits también pueden envasarse para su almacenamiento conveniente y envío seguro, por ejemplo, en una caja que tiene una tapa.
Los kits pueden proporcionar un péptido de FVIII de la invención, un vector de polinucleótido (por ejemplo, un plásmido) que codifica un péptido de FVIII de la invención, cepas de células bacterianas para la propagación del vector, y reactivos para la purificación de proteínas de fusión expresadas. Alternativamente, un kit puede proporcionar los reactivos necesarios para realizar la mutagénesis de un péptido de FVIII con el fin de generar una variante modificada de manera conservativa del péptido de FVIII.
Un kit puede contener una o más composiciones de la invención, por ejemplo, una o una pluralidad de péptidos de FVIII o uno o una pluralidad de polinucleótidos que codifican los péptidos de FVIII. Alternativamente, un kit puede contener reactivos (por ejemplo, péptido, tetrámero de CMH de clase II y agente de diagnóstico) para llevar a cabo la monitorización inmunitaria de un paciente.
Un kit también puede contener una o una pluralidad de moléculas de ácido nucleico recombinante, que codifican los péptidos de FVIII, que pueden ser iguales o diferentes, y pueden incluir además, por ejemplo, un segundo polinucleótido operativamente unido que contiene o que codifica un sitio de reconocimiento de endonucleasas de restricción o un sitio de reconocimiento de recombinasas, o cualquier polipéptido de interés. Además, el kit puede contener instrucciones para el uso de los componentes del kit, particularmente las composiciones de la invención que están contenidas en el kit.
IX. Realizaciones específicas
También se divulga en el presente documento un péptido de FVIII que consiste en una secuencia consecutiva de nueve aminoácidos que es al menos el 85 % idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en la siguiente secuencia de aminoácidos: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), y el péptido tiene la fórmula: (R1)x-péptido-(R2)y, en la que R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; y cada uno de los subíndices x e y son independientemente cero o uno.
R1 y R2 pueden ser por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 80 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 70 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 60 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 50 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 40 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 30 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 20 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 10 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 5 aminoácidos, o R1 y R2 son por separado o ambos secuencias de aminoácidos que consisten en desde 1 hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, o 80 aminoácidos.
En los pé p tid os d e sc rito s an te rio rm e n te , x e y pueden s e r am b os cero.
En los péptidos descritos anteriormente, x puede ser uno e y puede ser cero.
En los péptidos descritos anteriormente, x puede ser cero e y puede ser uno.
En los péptidos descritos anteriormente, x e y pueden ser ambos uno.
En los péptidos descritos anteriormente, la secuencia consecutiva de nueve aminoácidos puede ser idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344). También se divulga en el presente documento una composición farmacéutica que comprende un péptido de FVIII que consiste en una secuencia consecutiva de nueve aminoácidos que es al menos el 85 % idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en la siguiente secuencia de aminoácidos: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), y el péptido tiene la fórmula: (R1)x-péptido-(R2)y, en la que R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; y cada uno de los subíndices x e y son independientemente cero o uno.
En las composiciones descritas anteriormente, x e y pueden ser ambos cero.
En las composiciones descritas anteriormente, x puede ser uno e y puede ser cero.
En las composiciones descritas anteriormente, x puede ser cero e y puede ser uno.
En las composiciones descritas anteriormente, x e y pueden ser ambos uno.
En las composiciones descritas anteriormente, la composición puede comprender además al menos un péptido que consiste en una secuencia consecutiva de nueve aminoácidos que es al menos el 85 % idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en una secuencia de aminoácidos independientemente seleccionada del grupo que consiste en GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (SEQ ID NO: 159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID NO: 250), EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (SEQ ID NO: 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (SEQ ID NO: 568), NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (SEQ ID NO: 659), TVVITLKNMASHPVSLHA (SEQ ID NO: 10), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID NO: 68) y TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID NO: 740), en las que el al menos un péptido tiene un máximo de 80 aminoácidos de longitud y en las que cualquier aminoácido adicional en el al menos un péptido son aminoácidos naturales.
También se divulga en el presente documento un método para inducir una tolerancia inmunitaria a FVIII en un sujeto, comprendiendo el método una etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un péptido de FVIII que consiste en una secuencia consecutiva de nueve aminoácidos que es al menos el 85 % idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en la siguiente secuencia de aminoácidos: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), y el péptido tiene la fórmula: (R1)x-péptido-(R2)y, en la que R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; cada uno de los subíndices x e y son independientemente cero o uno; e induciendo de ese modo una tolerancia inmunitaria a proteína FVIII en el sujeto.
Específicamente, la composición farmacéutica puede comprender además al menos un péptido que consiste en una secuencia consecutiva de nueve aminoácidos que es al menos el 85 % idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en una secuencia de aminoácidos independientemente seleccionada del grupo que consiste en GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI (SEQ ID NO: 159), PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID NO: 250), EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY (SEQ ID NO: 477), LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (SEQ ID NO: 568), NPPIIARYIRLHPTHYSIRST (SEQ ID NO: 659), TVVITLKNMASHPVSLHA (SEQ ID NO: 10), AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID NO: 68) y TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID NO: 740), en las que el al menos un péptido tiene un máximo de 80 aminoácidos de longitud y en las que cualquier aminoácido adicional en el al menos un péptido son aminoácidos naturales.
En los métodos descritos anteriormente, la administración de la composición farmacéutica puede prevenir el desarrollo de anticuerpos anti-FVIII en el sujeto.
En los métodos descritos anteriormente, la administración de la composición farmacéutica puede reducir una cantidad anticuerpos anti-FVIII presentes en el sujeto.
En los métodos descritos anteriormente, x e y pueden ser ambos cero.
En los métodos descritos anteriormente, x puede ser uno e y puede ser cero.
En los m é tod os d e sc rito s an te rio rm e n te , x puede s e r ce ro e y puede s e r uno.
En los métodos descritos anteriormente, x e y pueden ser ambos uno.
También se divulga en el presente documento un método de preparación de un péptido de FVIII, comprendiendo el método las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células que comprende un vector que codifica un péptido de FVIII que consiste en una secuencia consecutiva de nueve aminoácidos que es al menos el 85 % idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en la siguiente secuencia de aminoácidos: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), y el péptido tiene la fórmula: (R1)x-péptido-(R2)y en la que R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; cada uno de los subíndices x e y son independientemente cero o uno; y b) expresar el péptido en el cultivo de células. En los métodos descritos anteriormente, x e y pueden ser ambos cero.
En los métodos descritos anteriormente, x puede ser uno e y puede ser cero.
En los métodos descritos anteriormente, x puede ser cero e y puede ser uno.
En los métodos descritos anteriormente, x e y pueden ser ambos uno.
También se divulga en el presente documento un método de preparación de un péptido de FVIII, comprendiendo el método: a) sintetizar un péptido usando técnicas de síntesis en fase sólida o fase líquida, consistiendo el péptido en una secuencia consecutiva de nueve aminoácidos que es al menos el 85 % idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en la siguiente secuencia de aminoácidos: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), y el péptido tiene la fórmula: (R1)x-péptido-(R2)y en la que R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; y cada uno de los subíndices x e y son independientemente cero o uno.
En los métodos descritos anteriormente, x e y pueden ser ambos cero.
En los métodos descritos anteriormente, x puede ser uno e y puede ser cero.
En los métodos descritos anteriormente, x puede ser cero e y puede ser uno.
En los métodos descritos anteriormente, x e y pueden ser ambos uno.
También se divulga en el presente documento un método de identificación de células T específicas de péptido de FVIII, comprendiendo el método: a) combinar una pluralidad de células T CD4+ con un péptido de FVIII complejado con un multímero de CMH de clase II, consistiendo el péptido de FVIII en una secuencia consecutiva de nueve aminoácidos que es al menos el 85 % idéntica a nueve aminoácidos consecutivos en la siguiente secuencia de aminoácidos: QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO: 344), y el péptido tiene la fórmula: (R1)x-péptido-(R2)y, en la que R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; cada uno de los subíndices x e y son independientemente cero o uno; y b) identificar al menos uno de los miembros de la pluralidad de células T CD4+ que es específica para el péptido complejado con el multímero de CMH de clase II.
En los métodos descritos anteriormente, el multímero de CMH de clase II puede ser un tetrámero de CMH de clase II. En los métodos descritos anteriormente, el péptido o multímero de CMH de clase II puede comprender además un agente de diagnóstico.
En los métodos descritos anteriormente, el agente de diagnóstico puede identificar el al menos un miembro de la pluralidad de células T CD4+ que es específica para el péptido.
En los métodos descritos anteriormente, el método puede comprender además aislar el al menos un miembro de la pluralidad de células T CD4+ que es específica para el péptido basándose en la detección del agente de diagnóstico. En los métodos descritos anteriormente, el al menos un miembro de la pluralidad de células T CD4+ puede aislarse con citometría de flujo.
En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, x e y son ambos cero.
En los métodos descritos anteriormente, x puede ser uno e y puede ser cero.
En los métodos descritos anteriormente, x puede ser cero e y puede ser uno.
En los m é tod os d e sc rito s a n te rio rm en te , x e y pueden s e r am b os uno.
La presente invención se ilustrará ahora adicionalmente en los siguientes ejemplos, sin limitarse a los mismos.
X. Ejemplos
Ejemplo 1
Para imitar mejor la molécula de CMH de clase II humana para identificar péptidos de FVIII, se desarrolló un modelo de ratón para hemofilia A con una molécula de CMH de clase II quimérica que portaba un sitio de unión específico de HLA-DRB1*1501 humano. Este ratón se sometió a retrocruzamiento con un ratón que portaba una desactivación completa de todos los genes de CMH de clase II murinos (Reipert et al., J. Thromb. Haemost. 7 Suppl. 1:92-97 (2009)). En este nuevo modelo de ratón transgénico, todas las respuestas de células T CD4+ están dirigidas por la molécula de CMH de clase II humana. Se usó este modelo de ratón para identificar péptidos de FVIII presentados por HLA-DRB1*1501 que dirigen respuestas inmunitarias anti-FVIII en estos ratones.
Materiales y métodos
FVIII: Se produjo FVIII humano recombinante (rFVIII) como producto a granel sin albúmina (Baxter Neuchatel) y producto de FVIII clínico formulado con sacarosa (Advate, Baxter, Westlake Village, CA).
Ratones HLA-DRB15 E17 hemofílicos: Ratones HLA-DRB1*1501+/_ E17'/_ tal como se describe en Reipert et al., J. Thromb. Haemost. 7 Supl. 1:92-97 (2009). Los ratones eran todos machos y con edades de 8 a 12 semanas al comienzo del experimento.
Inmunización con FVIII recombinante humano: Los ratones HLA-DRB1*1501+/_ E17'/_ recibieron entre 4 y 8 dosis intravenosas o subcutáneas de 0,2 |ig o 1 |ig de rFVIII humano a intervalos semanales. Se diluyó rFVIII en el tampón de formulación original o solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía calcio y magnesio (DPBS; Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EE.UU.).
Preparación de células: Se obtuvieron bazos de 3 a 7 días tras la última inmunización con rFVIII. Se trituraron células de bazo y se hicieron pasar a través de un tamiz de células de 70 |im (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Se recogieron células individuales en medio de cultivo: medio RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA) complementado con suero fetal bovino preseleccionado al 10 % (FCS; Hyclone, Logan, UT), L-glutamina 2 mM, penicilina/estreptomicina 100 U/ml (ambos de Gibco) y mercaptoetanol 5x10-5 M (Sigma-Aldrich). Se lisaron los eritrocitos usando tampón hipotónico (pH 7,2) compuesto por cloruro de amonio 0,15 M, bicarbonato de potasio 10 mM (ambos de Merck, Darmstadt, Alemania) y ácido etilen-diaminatetraacético 0,1 mM (Sigma-Aldrich). Se lavaron las células y se contaron usando un contador Coulter Z1.
Generación de hibridomas de células T para identificar péptidos de FVIII
Reestimulación in vitro de células de bazo con rFVIII humano: Se reestimularon células de bazo en presencia de 20 |ig/ml de FVIII humano en medio de cultivo a una concentración de 1,5x106 células/ml durante 3 ó 10 días. El medio de cultivo para los cultivos de 10 días se renovó tras 6 días.
Fusión de células T de ratón con células BW: Los cultivos de células de bazo reestimuladas in vitro y las células BW (a-P) se lavaron dos veces con medio de cultivo sin suero y luego se combinaron a una razón de 1:3 a 1:10 (células T:células BW). La línea de células BW se derivó de un linfoma de células T AKR/J de ratón. Estas células no tenían receptores de células T en su superficie (a-P-) y, por tanto, cualquier receptor de células T tras la fusión con células de bazo de ratón se deriva de la pareja de fusión. Tras una tercera etapa de lavado, se retiró el sobrenadante. Se lograron las condiciones de fusión mediante la adición de 1 ml de polietilenglicol (PEG; HybiMax al 50 %, Sigma-Aldrich) en el plazo de 45 segundos. Tras otros 45 segundos de incubación, se añadieron posteriormente 50 ml de medio sin suero para prevenir el efecto tóxico de PEG. Se centrifugaron las células a 1300 rpm durante 5 minutos sin rotura para formar un sedimento muy firme. Se desechó el sobrenadante y se añadieron 50 ml de medio sin suero nuevo muy lentamente con el objetivo de no alterar el sedimento. Se invirtió el tubo lentamente hasta que las células se resuspendieron y centrifugaron como anteriormente. Esto se realizó dos veces para eliminar el PEG restante. La última etapa de lavado se realizó con medio de cultivo. Entonces se diluyeron las células y se cultivaron en placas de 96 pocillos. Se cambió el medio de cultivo por medio de selección (complemento de medio HAT, Sigma Aldrich) tras 48 horas y se seleccionaron clones en crecimiento. Se mantuvo el medio de selección durante 2 semanas, después de eso se cambió de nuevo el medio posteriormente a medio de cultivo normal.
Especificidad de péptido de hibridomas de células T específicos de FVIII: Se sometieron a prueba hibridomas de células T para determinar su especificidad de antígeno. Para este fin, se cocultivaron 1x105 células con células presentadoras de antígenos. Se usaron o bien 5x104 células Mgar (que expresan HLA-DRB1*1501) o bien 1x105 células de bazo completas derivadas de ratones HLA-DRB1*1501 - E17 sin tratamiento previo. Se incubaron las células con 10 |ig/ml de rFVIII humano o con 1 |ig/ml de conjuntos péptido/péptido durante 24 horas a 37 °C, 5 % de CO2. Se recogieron los sobrenadantes y se midió la liberación de IL-2 al sobrenadante de cultivo usando un ELISA de
IL-2 (BioLegend, San Diego, CA) o Bio-Plex de IL-2 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) según el protocolo de los fabricantes. Una liberación de IL-2 > 20 pg/ml en presencia pero no en ausencia de FVIII (o péptidos) se consideró positiva, o alternativamente un aumento de 10 veces en la liberación de IL-2 en presencia de FVIII en comparación con la ausencia de FVIII se consideró positiva.
Subclonación de hibridomas de células T: Para garantizar que cada clon representa sólo un tipo de hibridoma de células T, se subclonaron todos los clones. Se diluyeron clones de hibridoma a una dilución limitante de 0,3 células/pocillo y se cocultivaron con 200 células alimentadoras/pocillo. Se produjeron células alimentadoras mediante tratamiento con mitomicina C de las células de pareja de fusión, células BW. Se trataron 2x108 células BW con 0,1 mg de mitomicina C de Streptomyces caespitosus (Sigma Aldrich) durante 10 minutos a temperatura ambiente y 25 minutos a 37 °C, 5 % de CO2 en el incubador. Se seleccionaron cinco subclones en crecimiento por clon y se sometieron a prueba para determinar su especificidad de FVIII.
Conjuntos de péptidos de FVIII usados para especificar las especificidades de hibridomas de células T: Se produjeron conjuntos de péptidos de FVIII usando el método de síntesis SPOT tal como se describe por Ay et al. (Biopolimers 88:64-75 (2007)). En resumen, se sintetizaron péptidos de 15 meros sobre dos membranas de celulosa idénticas. Se cortaron las membranas en tiras verticales y horizontales. Se liberaron los péptidos de las tiras de membrana y se usaron como conjuntos de péptidos en pruebas de especificidad tal como se describió anteriormente. Se disolvieron los péptidos en DMSO (Hybrimax, Sigma Aldrich) y se diluyeron adicionalmente con PBS.
Resultados
Se produjeron 181 clones de hibridoma específicos de FVIII. Se cribaron estos clones frente a una biblioteca de péptidos que abarcaba el FVIII humano completo. Se usaron péptidos de 15 meros con una desviación de tres aminoácidos. Usando este enfoque, se identificaron seis regiones de FVIII diferentes que contenían péptidos unidos a HLA-DRB1*1501. Se encontraron dos dominios peptídicos dentro del dominio A1, dos péptidos dentro del dominio A2, uno dentro del dominio B, dos dentro del dominio A3 y un dominio peptídico dentro del dominio C1 de FVIII humano. El péptido de FVIII1401'1424 no se había descrito anteriormente (tabla 11). Los péptidos FVIII474'494, FVIII545'559, FVIII1788' 1802 y FVIII2161-2175 se identificaron ya en el documento WO 09/071886, que usó programas de predicción por ordenador seguido por tecnología de hibridomas de células T. El péptido FVIII2030-2044 se divulgó en el documento WO 03/087161. El péptido FVIII2161-2180 ya se publicó por Jacquemin et al., Blood 101(4):1351-8 (2003).
Tabla 11. Regiones de FVIII que incluyen epítopos de células T
Ċ
Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos en el presente documento son sólo para fines ilustrativos.
Claims (13)
1. Péptido que consiste en la secuencia:
(R1)x-P-(R2)y,
en la que P es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68;
R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 5 aminoácidos;
R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 5 aminoácidos; y cada uno de x e y es independientemente cero o uno.
2. Péptido según la reivindicación 1, en el que x e y son ambos cero, o en el que x es uno e y es cero, o en el que x es cero e y es uno, o en el que x e y son ambos uno.
3. Composición que comprende un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
4. Composición según la reivindicación 3, en la que la composición se formula para administración farmacéutica.
5. Composición según la reivindicación 3 ó 4, en la que la composición comprende además un segundo polipéptido, consistiendo el segundo polipéptido en la secuencia de aminoácidos:
(R1)x-P-(R2)y,
en la que:
P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a una secuencia de al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 10, 68, 159, 250, 477, 568, 659 y 740;
R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos;
R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; y cada uno de x e y es independientemente cero o uno.
6. Péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, para su uso en un método para inducir una tolerancia inmunitaria a FVIII en un sujeto que lo necesita.
7. Péptido para su uso según la reivindicación 6, en el que el uso comprende además:
uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un segundo péptido que tiene la secuencia de aminoácidos:
(R1)x-P-(R2)y,
en la que P es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con respecto a al menos nueve aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 10, 68, 159, 250, 344, 477, 568, 659 y 740;
R1 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos;
R2 es una secuencia de aminoácidos que consiste en desde 1 hasta 80 aminoácidos; y
cada uno de x e y es independientemente cero o uno.
8. Método para identificar células T específicas de péptido de FVIII, comprendiendo el método:
a) combinar una pluralidad de células T CD4+ aisladas o de hibridoma con un péptido complejado con un multímero de CMH de clase II, en el que el péptido es un péptido de FVIII según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2; y
b) identificar al menos uno de los miembros de la pluralidad de células T CD4+ que es específica para el péptido complejado con el multímero de CMH de clase II.
9. Método según la reivindicación 8, en el que el multímero de CMH de clase II es un tetrámero de CMH de clase II.
10. Método según la reivindicación 8 ó 9, en el que el péptido o multímero de CMH de clase II comprende además un resto detectable.
11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende además aislar la al menos una célula T CD4+ que es específica para el péptido.
12. Método según la reivindicación 11, en el que la célula T CD4+ se aísla usando citometría de flujo.
13. Método para preparar un péptido, comprendiendo el método las etapas de:
a) proporcionar un cultivo de células que comprende un polinucleótido que codifica un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2; y
b) expresar el péptido en el cultivo de células.
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