EA027735B1 - Слитый белок cd24 для лечения ревматоидного артрита - Google Patents

Abstract

Белок CD24 для лечения ревматоидного артрита, состоящий из зрелого CD24 человека, слитого с Fc частью иммуноглобулина (Ig) человека, в котором последовательность зрелого белка CD24 человека состоит из SEQ ID NO: 1, где белок CD24 не содержит аланина или валина непосредственно в С-терминальном положении по отношению к SEQ ID NO: 1.

Description

Изобретение относится к слитому белку СЭ24 для лечения ревматоидного артрита.

Предшествующий уровень техники

Этот раздел содержит информацию, которая необязательно является уровнем техники, и краткое описание настоящего изобретения, которое не является раскрытием его в полном объеме или всех его признаков.

СЭ24 известен как устойчивый к нагреванию антиген [1]. Он экспрессируется как гликозилфосфатидил-инозитол (ГФИ)-якорная молекула [2] и имеет широкое распространение в различных клеточных путях [3]. Благодаря тенденции СЭ24 экспрессироваться на незрелых клетках он используется также как часть маркеров стволовых клеток и для дифференцировки лимфоцитов. Первой функцией, связанной с СЭ24. является костимулирующая активность (совместная) для антигенспецифического ответа Т-клеток [4-6]. Изучение ίη νίνο показало, что как костимулятор для активации Т-клеток в лимфоидных органах, СЭ24 избыточен, но он становится необходимым в отсутствие СЭ28 [7, 8]. Это не будет происходить в случае локальных органов-мишеней, которые не так богаты костимулятором. В соответствии с этим понятием авторы изобретения показали, что мыши с целевой мутацией СЭ24 полностью устойчивы к индуцированию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) [9, 10].

Полиморфизмы СО24 человека связаны с риском и развитием серьезных аутоиммунных заболеваний [11 -15], включающих множественный склероз и ревматоидный артрит (РА). В случаях множественного склероза авторы изобретения сообщали, что растворимый СО24, состоящий из внеклеточной части СЭ24 мыши и 1§О1 Ре человека, улучшает клинический симптом экспериментальных аутоиммунных заболеваний, модель рассеянного склероза на мышах [9]. Более поздние исследования показали, что СЭ24 взаимодействует и подавляет ответ хозяина на характерные участки молекулы, связанные с опасностью (ΌΑΜΡ) [16].

РА поражает 0,5-1% населения. Хотя в настоящее время существует ряд облегчающих заболевание антиревматических лекарств (ΌΜΑΚΌ), но даже золотой стандарт биологических ΌΜΑΡΌ, лекарственные средства, нацеленные на фактор некроза опухоли-альфа, приводят к 50% улучшению в соответствии с Критериями Улучшения Американского Колледжа Ревматологии (АКР50) менее чем у 50% пациентов, получающих такое лечение [17]. Не существует лечения для РА. Таким образом, необходимо тестировать дополнительные варианты терапии для РА. Предполагается, что РА является аутоиммунным заболеванием суставов, хотя причины заболевания остаются в значительной степени неясными. Ряд исследований вовлекают Т-клетки в патогенез ревматоидного артрита [18]. Недавно было показано, что перенос антител может вызвать развитие воспаления суставов у мышей [19-21]. Патология повреждений напоминает ревматоидный артрит человека.

Одной из наиболее интересных концепций, установленных в ходе исследований с пассивным переносом РА с помощью антител, является то, что могут наблюдаться тканеспецифичные аутоиммунные заболевания, даже если антитела специфичны для белков, которые экспрессируются везде [19-21]. Это замечание важно, поскольку оно предполагает, что, несмотря на общий патогенез, аутоиммунные заболевания различных органов/тканей могут требовать различного лечения. В поддержку этого замечания, интерферон бета, который широко используется для лечения рассеянного склероза, показывает слабый эффект при лечении РА [22].

Модели на животных, относящиеся к РА человека, играют важную роль для улучшения развития терапии с ΌΜΑΚΌ. Например, индуцированный коллагеном артрит у мышей и крыс был критичен для развития лекарственных средств для РА [23]. Недавно было показано, что адаптивный перенос антиколлагеновых антител вызывает сильное РА-подобное поражение у мышей [19]. Так как содержание антител повышено у РА пациентов перед началом заболевания [24, 25], пассивный перенос коллагенспецифических антител является соответствующей моделью для РА у людей.

Так как патогенез РА включает ответ хозяина на ΌΑΜΡ [26, 27] и так как молекула СЭ24 негативно регулирует ответ хозяина на ΌΑΜΡ [16], авторы изобретения исследовали возможность применения растворимого ΟΌ24 для лечения РА. Модель пассивного переноса для РА была выбрана из-за отношения к болезням человека, а также простоты постановки эксперимента.

- 1 027735

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении предложен белок СГО24 для лечения ревматоидного артрита, состоящий из зрелого СГО24 человека, слитого с Ре частью иммуноглобулина (1д) человека, в котором последовательность зрелого белка СГО24 человека состоит из δΕΟ ГО N0: 1, где белок СГО24 не содержит аланина или валина непосредственно в С-терминальном положении по отношению к δΕΟ ГО N0: 1. Белок СГО24 содержит часть иммуноглобулина (1д) человека, слитую с Ν-концом или С-концом зрелого СГО24. Часть 1д представляет собой Рс часть белка 1д человека, при этом 1§ выбран из группы, состоящей из 1дС1, 1дС2. 1дС3, 1§03 или 1§Л. Рс часть также содержит шарнирную область и СН3 и СН4 домены 1§М человека.

Белок СГО24 может быть растворимым и может быть гликозилирован. Белок СГО24 может быть продуцирован с применением эукариотической системы экспрессии белка. Система экспрессии может включать вектор, содержащийся в клеточной линии СНО (линия клеток яичника китайского хомячка), или дефектный по репликации ретровирусный вектор. Дефектный по репликации ретровирусный вектор может быть стабильно интегрирован в геном эукариотической клетки.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 Аминокислотный состав гибридного белка, СГО24 1дС1 Рс (δΕΟ ГО N0: 5). Подчеркнутые 26 аминокислот являются сигнальным пептидом СГО24 (δΕΟ ГО N0: 4). Взятая в рамку, выделенная жирным шрифтом, часть последовательности представляет собой зрелый белок СГО24, используемый в гибридном белке (5>Е0 ГО N0: 1). Последняя аминокислота (А или V), которая обычно присутствует в зрелом белке СГО24, была убрана из конструкции для того, чтобы избежать иммуногенности. Не подчеркнутые, не выделенные жирным шрифтом буквы являются последовательностью 1дС1 Рс, включая шарнирную область и домены СН1 и СН2 (δΕΟ ГО N0: 6).

Фиг. 2. Способ очистки и процессирования СГО24 1дС1 Рс, экспрессированного в клеточных линиях млекопитающих.

Фиг. 3. Варьирования аминокислотной последовательности между зрелыми белками СГО24 из мыши (8Е0 ГО N0: 3) и человека (δΕΟ ГО N0: 2). Жирным шрифтом выделены потенциальные сайты гликозилирования, сайты ^гликозилирования выделены красным.

Фиг. 4. Терапевтический эффект СГО241д для РА. Самцов мышей линии ВАЬВ/с в возрасте 8-10 недель иммунизировали внутривенно в количестве 2 мг/мышь индуцирующей артрит смесью антител Аг1пЮМаЬ (МОЬюргобисК δΐ Раи1, М№). Через 2 суток мышам инъецировали внутрибрюшинно 90 мкг ЛПС (ΤΡδ-липополисахарид), растворенного в ФСБ (фосфатно-солевом буфере). Развитие болезни наблюдали ежедневно по следующей системе оценки. 0 - нет реакции, норма; 1 - слабое, но отчетливое покраснение и опухание лодыжки/запястья или несомненное покраснение и опухание, ограниченное отдельными пальцами, независимо от количества пораженных пальцев; 2 - среднее или сильное покраснение и опухание лодыжки/запястья; 3 - покраснение и опухание всей лапы; 4 - максимально воспаленная конечность, включая пальцы, с участием многих суставов. Приведенные данные являются комбинированной оценкой четырех конечностей (среднее значение ± ошибка среднего). * Р<0,05, ** Р<0,01, *** р<0,001. Разница между двумя группами является также значимой на основании теста Фишера ΡΕδΌ (или безопасный ΐ-тест по Фишеру).

Фиг. 5. АтШпПп компартментный моделирующий анализ фармакокинетики СГО24 1дС1. Белые кружки представляют среднее значение из 3 мышей, а линия графика является предсказанной фармакокинетической кривой: А - внутривенная инъекция 1 мг СГО24 1дС1; Б - подкожная инъекция 1 мг СГО24 1дС1; В - сравнение общих количеств антител в крови с помощью измерения площади под кривой (ППК), периода полувыведения и максимальной концентрации в крови. Заметим, что полностью ПИК и К_макс для подкожной инъекции составляет около 80% от внутривенной инъекции, хотя разница не является статистически значимой.

Фиг. 6. Взаимодействие СГО24^щ1ес С (10) различается между РАМР и ΌΑΜΡ: А - на ответ хозяина на РАМР не влияет взаимодействие СГО24^щ1ес С (10); Б - СГО24^щ1ес С (10) взаимодействие подавляет ответ хозяина на ΌΑΜΡ, возможно, через СГО24^щ1ес С/10-ассоциированный δΗΡ-1.

Фиг. 7. Единичная инъекция СГО24 Рс снижает клинические показатели АИАК (артрит, индуцированный антителами к коллагену): а - схема экспериментов. Мыши ВАЬВ/с (возраст 8 недель) получали моноклональные антитела на 1 сутки в сочетании либо с носителем, либо с гибридными белками. Мышам инъецировали ЛПС на 3 сутки и наблюдали ежедневно в течение 3 недель. Б. СГО24 Рс снижает клинические показатели АИАК. Гибридные белки (1 мг/мышь) или носители инъецировали один раз на 1 сутки. Клинические показатели определяли двойным слепым методом. * Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001. Влияние СГО24 воспроизводили в шести независимых экспериментах, в которые было включено в общем 52 мыши в группе ФСБ и 54 мыши в группе СГО24 Рс.

Фиг. 8. СГО24 Рс снижает уровни воспалительных цитокинов в суставе и АИАК. АИАК инициируют и лечат как показано на схеме фиг. 7а. Воспалительные цитокины измеряли с помощью набора гранул с антителами от ВО Ρΐιαηηίη^η: а - репрезентативный профиль СКАФ; б - общее значение сниженных цитокинов (среднее значение ± ошибка среднего), измеренное в гомогенате сустава.

- 2 027735

Фиг. 9. СЭ24 Рс снижает воспаление и разрушение хряща в суставе. На 7 сутки переднюю и заднюю лапы отделяли как от обработанных СЭ24 Рс, так и от контрольных мышей, фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 24 ч с последующей декальцификацией 5% муравьиной кислотой. Лапы затем заливали в парафин и продольный срез окрашивали гематоксилин-эозином и Сафранином О (§1§таА1бпсН).

Фиг. 10. Терапевтический эффект СЭ24 Рс, введенного на 5 сутки индуцирования АИАК. Индуцированные АИАК мыши были случайным образом разделены на две группы, получающие либо носитель (ФСБ), либо СЭ24 Рс. Мышей оценивали двойным слепым методом. Показан репрезентативный из трех независимых экспериментов.

Фиг 11. Низкие дозы СЭ24 Рс предупреждают развитие АИАК: а - схема экспериментов; б - клиническая оценка артрита, оценка двойным слепым способом.

Фиг. 12. §1§1есд (иммуноглобулин-подобный лектин, связывающий сиаловую кислоту) необходим для терапевтического эффекта СЭ24 Рс, \УТ (дикий тип) (а) и §1§1есд-/- мыши (б) получали либо контроль с носителем, либо СЭ24 Рс в сочетании с коктейлем анти-коллагеновых моноклональных антител. Клинические показатели определяли ежедневно двойным слепым методом.

Подробное описание изобретения

Изобретатели обнаружили, что растворимая форма СЭ24 высокоэффективна при лечении ревматоидного артрита.

1. Определения.

Терминология, используемая здесь, предназначена для описания только конкретных воплощений и не ограничивается ими. При использовании в описании и формуле изобретения формы единственного числа включают также множественное число, если в контексте не указано явно на другое. Для перечисления числовых интервалов, указанных здесь, каждый промежуточный номер между ними ожидается с той же степенью точности. Например, для интервала 6-9, числа 7 и 8 предполагаются в дополнение к 6 и 9, а для интервала 6,0-7,0 явно предполагаются числа 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4; 6,5; 6,6; 6,7; 6,8; 6,9 и 7,0.

Пептид или полипептид является связанной последовательностью аминокислот и может быть естественной, синтетической или сочетанием естественной и синтетической.

По существу идентичны может означать, что первая и вторая аминокислотные последовательности по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% перекрывают область из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 или 300 аминокислот.

Лечение или лечить по отношению к защите животного от заболевания означает предупреждение, подавление, прекращение или полное устранение заболевания. Предупреждение заболевания включает введение композиции по настоящему изобретению животному до начала заболевания. Подавление заболевания включает введение композиции по настоящему изобретению животному после индуцирования заболевания, но до его клинического проявления. Подавление заболевания включает введение композиции по настоящему изобретению животному после клинического проявления заболевания.

Вариант может означать пептид или полипептид, который отличается по аминокислотной последовательности путем вставки, удаления или консервативной замены аминокислот, но сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность. Показательные примеры биологической активности включают способность связывать толл-подобный рецептор и быть связанным специфическим антителом. Вариант может также означать белок с аминокислотной последовательностью, которая по существу идентична контрольному белку с аминокислотной последовательностью, которая сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность. Консервативное замещение аминокислоты, т.е. замещение аминокислоты другой аминокислотой с аналогичными свойствами (например, гидрофильностью, степенью и распределением заряженных участков), обычно считают незначительным изменением. Эти незначительные изменения могут быть идентифицированы, в частности, учитыванием индекса гидрофобности аминокислот, как известно специалистам. Ку4е е4 а1., 1. Мо1. Βίο1. 157:105-132 (1982). Индекс гидрофобности аминокислоты основан на рассмотрении ее гидрофобности и заряда. Специалистам известно, что аминокислоты, имеющие похожие индексы гидрофобности, могут быть замещены и при этом сохранять функцию белка. В одном аспекте аминокислоты, имеющие индексы гидрофобности ±2, являются замещенными. Гидрофильность аминокислот может также быть использована для выявления замещений, которые приведут к получению белков, сохраняющих биологическую функцию. Рассмотрение гидрофильности аминокислот в контексте пептида позволяет вычислить наибольшую локальную среднюю гидрофильность этого пептида, полезный критерий, который, как было показано, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью. Патент США № 4554101 включен в описание полностью путем ссылки. Замещение аминокислот, имеющих похожие значения гидрофильности, может привести к пептидам, сохраняющим биологическую активность, например иммуногенность, как известно специалистам. Замещения могут быть произведены аминокислотами, имеющими значения гидрофильности, находящиеся в пределах ±2 друг от друга. Как на индекс гидрофобности, так и на индекс гидрофильности влияет, в частности,

- 3 027735 боковая цепь этой аминокислоты. В соответствии с этим наблюдением аминокислотные замещения, которые совместимы с биологической функцией, как известно, зависят от относительного подобия аминокислот и, в частности, боковых цепей этих аминокислот, как показывают гидрофобность, гидрофильность, заряд, размер и другие свойства.

2. СЭ24.

В данном описании приведен белок СЭ24. состоящий из аминокислотной последовательности зрелого белка СГО24 человека, слитого с Рс частью иммуноглобулина (1д) человека, в котором последовательность зрелого белка СГО24 человека состоит из δΕΤΤΤΟΤδδΝδδρδΤδΝδΟΕΑΡΝΡΤΝΑΤΤΚ (8ЕЦ ГО N0: 1), где белок СГО24 не содержит аланина или валина непосредственно в С-терминальном положении по отношению к §ЕЦ ГО N0: 1. СГО24 может быть растворим. Несмотря на существенные изменения последовательности в аминокислотной последовательности зрелого СГО24 человека, она является функционально эквивалентной во взаимодействии с участками молекулам, связанными с опасностью (ΌΑΜΡ). Поскольку ответ хозяина на ΌΑΜΡ считается важным для патогенеза ΡΑ, СГО24 мыши и человека могут быть функционально эквивалентными при лечении РА. Как результат консервативности последовательности СГО24 человека, прежде всего в С-конце и в частоте сайтов гликозилирования, значительные изменения в зрелых СГО24 белках могут быть допущены при применении СГО24 для лечения РА, особенно если эти изменения не влияют на консервативные остатки на С-конце или не влияют на сайты гликозилирования СГО24 человека.

А. Слияние.

Белок СГО24 слит по своему Ν- или С-концу с частью белка 1дО человека. Эта часть представляет собой Рс часть белка 1дО. Рс часть содержит шарнирную область и СН2 и СН3 домены белка 1дО.

Белок 1д выбран из группы, состоящей из 1§С1, 1§02, 1§03, 1§04, 1§М, или 1дА человека. Белок 1д может также быть 1дМ, а Рс часть содержит шарнирную область и СН3 и СН4 домены 1дМ. Способы получения гибридных белков и очистка гибридных белков хорошо известны специалистам.

Б. Продуцирование.

СГО24 может быть сильно гликозилирован и может участвовать в функциях СЭ24, таких как костимулирование и взаимодействие с участками молекулами, связанной с опасностью. СГО24 может быть получен с применением эукариотической системы экспрессии. Система экспрессии может повлечь за собой экспрессию из вектора в клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО). Система может также быть вирусным вектором, таким как ретровирусный вектор, дефектным по репликации, который может быть использован для инфицирования эукариотических клеток. СГО24 также был получен из стабильной линии клеток, которые экспрессируют СГО24 из вектора или части вектора, которая была интегрирована в клеточный геном. Стабильная клеточная линия может экспрессировать СГО24 из интегрированного ретровирусного вектора, дефектного по репликации. Система экспрессии может быть ΟΡΕχ™.

3. Способ лечения.

СГО24 может быть применен для лечения ревматоидного артрита. СГО24 может быть введен субъекту при необходимости. Субъект может быть млекопитающим, таким как человек.

A. Комбинированная терапия СГО24.

СГО24 может быть комбинирован с другим лекарственным средством, таким как лекарства, модифицирующие течение заболевания (ЛМТЗ). Препарат может быть нестероидным противовоспалительным препаратом (НПВП), который может быть производным пропионовой кислоты, производным уксусной кислоты, производным еноловой кислоты, производным фенаминовой кислоты или селективным ингибитором Сох2. Лекарственное средство может также быть кортикостероидом или метотрексатом. Лекарственное средство может быть биологическим, которое может быть антагонистом ФНО-α (фактор некроза опухоли), таким как анти-ФНО-α антителом или гибридным белком, который связывается с ФНО-α (ЕиЪге1), анти-СЭ20 моноклональным антителом, антагонистом костимуляторной молекулы СЭ80 или СЭ86, таким как моноклональное антитело или гибридный белок (СТЕА41д), который связывается с двумя молекулами, или антагонистом для рецептора либо ГО-1, либо ГО-6. СГО24 и другой препарат могут быть введены вместе или последовательно.

Б. Фармацевтическая композиция.

СГО24 может содержаться в фармацевтической композиции, которая может включать растворитель, который может сохранять СГО24 стабильным в течение длительного периода. Растворитель может быть ФСБ, который может сохранять СГО24 стабильным в течение по меньшей мере 36 месяцев при -20°С (от -15 до примерно -25°С). Растворитель может быть способен содержать СГО24 в комбинации с другим лекарственным средством.

B. Дозировка.

Доза для применения для человека может в конечном счете быть определена через клинические испытания для определения дозы с приемлемой токсичностью и клинической эффективностью. Начальная клиническая доза для человека может быть определена через изучение фармакокинетики и токсичности у грызунов и нечеловекообразных приматов. Доза СГО24 может быть от 0,01 до 1000 мг/кг и может быть от

- 4 027735 до 500 мг/кг, в зависимости от серьезности заболевания, подлежащего лечению и способа введения.

Г. Введение.

Способ введения фармацевтической композиции может быть парентеральным. Парентеральное введение включает, но не ограничено, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное подкожное, внутримышечное, подоболочечное, внутрисуставное и непосредственную инъекцию в пораженный сустав. Для ветеринарного применения агент может быть введен как соответствующая приемлемая формулировка в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринар может легко определить режим дозирования и способ введения, который является наиболее подходящим для конкретного животного. Фармацевтическая композиция может быть введена пациенту, являющемуся человеком, кошкой, собакой, большим животным, или птице.

СО24 может быть введен одновременно или метрономически с другим лечением. Термин одновременный или одновременно, используемый здесь, означает, что СО24 и другое лечение вводятся в течение 48 ч, предпочтительно 24 ч, более предпочтительно 12 ч, еще более предпочтительно 6 ч и наиболее предпочтительно 3 ч или менее, друг от друга. Термин метрономически, используемый здесь, означает введение агента во время, отличное от другого лечения и с определенной частотой относительно повторного введения.

СО24 может быть введен в любой момент перед другим лечением, включая приблизительно 120, 118, 116, 114, 112, 110, 108, 106, 104, 102, 100, 98, 96, 94, 92, 90, 88, 86, 84, 82, 80, 78, 76, 74, 72, 70, 68, 66, 64, 62, 60, 58, 56, 54, 52, 50, 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1 ч, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 и 1 мин.

СО24 может быть введен в любой момент перед вторым лечением С.П24. включая приблизительно 120, 118, 116, 114, 112, 110, 108, 106, 104, 102, 100, 98, 96, 94, 92, 90, 88, 86, 84, 82, 80, 78, 76, 74, 72, 70, 68, 66, 64, 62, 60, 58, 56, 54, 52, 50, 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1 ч, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 и 1 мин.

С.П24 может быть введен в любой момент перед другим лечением, включая приблизительно 1 мин, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 мин., 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118 и 120 ч.

СЭ24 может быть введен в любой момент после предварительного лечения СО24, включая приблизительно 120, 118, 116, 114, 112, 110, 108, 106, 104, 102, 100, 98, 96, 94, 92, 90, 88, 86, 84, 82, 80, 78, 76, 74, 72, 70, 68, 66, 64, 62, 60, 58, 56, 54, 52, 50, 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1 ч, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 и 1 мин.

Следующие примеры приведены здесь для иллюстрации способов по настоящему изобретению и никоим образом не ограничивают применение указанных способов.

Пример 1.

Растворимые белки СЭ24.

Внеклеточный домен СО24 был слит с 1дО1 Ре. Аминокислотный состав СЭ24 гибридного белка приведен на фиг. 1. Затем создали ретровирусный вектор, дефектный по репликации, который направляет экспрессию гибридного белка СЭ241§. ОРЕх™ (сокращение для продукта генной экспрессии) система предлагает несколько важных преимуществ, наиболее важным из которых является образование в среднем >1000 вставок/клетку, но только с 1 копией/вставку. Более того, так как ретровирус предпочтительно вставляется в транскрипционно активный локус, ОРЕх™ дает в результате высокий уровень экспрессии целевого белка. Были получены стабильные клеточные линии, которые продуцируют высокий выход СО241§. В дополнение были получены 45 г продукта ОЬР стадии и ~100 г продуктов сОМР стадии. Способы, использованные для дальнейшей переработки среды, собранной из биореактора, резюмированы на технологической схеме ниже (фиг. 2).

Осветление выхода.

Культуральную среду из биореактора осветляют с применением Сипо 60М02 Махпп/ег глубинных фильтров с последующим фильтрованием через МППроге ОрПсар фильтр с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат собирают в стерильные мешки для сбора образцов. Отбирают пробы для определения выхода с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

Очистка на белке А.

Осветленную среду пропускают через колонку со смолой с белком А (ОЕ НеаИПсате МаЬ8е1ес!) в концентрации, не превышающей 16 г/л смолы (по ИФА), и при времени контакта 4 мин. Колонку промывают уравновешивающим буфером (50 мМ Трис + 0,15 М ЫаС1, рН 7,5), затем 10 мМ натрий цитрат/лимонная кислота рН 6,0 в течение 5 сук. Связанный СЭ241§ элюируют с колонки с применением 10 мМ цитрат натрия/лимонная кислота, рН 3,5.

Инактивация вируса.

Фракцию элюата с белка А немедленно доводят до рН 3,0 добавлением 2 М соляной кислоты и выдерживают при этом рН в течение 30 мин при температуре окружающей среды. Затем ее доводят до рН 5,0 добавлением 1 М Трис основного и фильтруют для осветления с применением 0,65 нм стекловоло- 5 027735 конного фильтра (§аг1огш8 8атЮрите СР2) и 0,2 нм (§атЮтш8 Запорите 2) в стерильный мешок для отбора проб.

Хроматография на §Р-Сефарозе.

Вирусно-инактивированный материал наносят на колонку с §Р-§ерйаго8е (СЕ НеаЙНсаге) в концентрации, не превышающей 25 г/л смолы (но основании А280 нм, составляющей 1,22 = 1 мг/мл) и линейной скорости потока 250 см/ч. Колонку промывают уравновешивающим буфером (10 мМ цитрата натрия/лимонная кислота рН 5,0) и связанный СО241§ элюируют с колонки с применением 10 мМ цитрата натрия/лимонная кислота + №С1. рН 5,0. Вытекающий раствор собирают в стерильный мешок для сбора.

Хроматография на Ми81аид О.

Элюат после §Р-§ерйаго8е доводят до рН 7.5 добавлением 1 М Трис основания и разводят водой для инъекций для понижения проводимости. Разбавленный материал наносят на фильтр Ми81аи§ С (Ра11) в концентрации, не превышающей 0,5 г/л смолы (на основании А280, составляющего 1,22 = 1 мг/мл), и при скорости потока 5 объемов колонки/мин. Фильтр промывают уравновешивающим буфером (10 мМ Трис рН 7,5), и СЭ24-Рс находится в протоке и его собирают в стерильный мешок для отбора.

Фильтрация вируса.

Проток после Ми81аи§ С затем фильтруют при постоянном давлении 30 фунтов/кв.дюйм (206842,8 Па) через 0,2 мМ фильтр и МИйроте ЧРР вирусный фильтр (номинальный размер пор 20 нм) и собирают в стерильные мешки для отбора.

Концентрирование и конечная формулировка.

Продукт концентрируют и диафильтрируют, применяя мембрану для ультрафильтрации 10 кДа (МИйроте Ргер/§са1е) в 10 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорида натрия при рН 7,2 приблизительно при 10 мг/мл конечной концентрации, как определено по поглощению при 280 нм. Из общего объема, находящегося в боксе биобезопасности, отбирают аналитические образцы. Проводят маркирование и отправляют образцы на контроль качества, в то время как аликвоты общего объема хранят при 2-8°С до разрешения выпуска.

Изучение вирусной очистки.

Оценку очистки от вируса проводили в Сатб1иа1 НеаНЪ, N6 по образцам, подготовленным в СНМ. Квалифицированные ученые из Са1а Вю1есй провели стадии хроматографии и фильтрации на Сатб1иа1 НеаНН УНа1 УаПбайои предприятии с помощью персонала Сатбша1 НеаНН. Процедура уменьшения масштаба была разработана из 200 л масштабного процесса. Для этого исследования были выбраны два вируса. Первым был Хеио1торю титше Ьеикет1а вирус (ХМиЬу), который является оболочечным РНК вирусом размером 80-130 нм из семейства вирусов РейоСпбае. Вторым был свиной Рагуоуииз (РРУ), который является безоболочечным ДНК вирусом размером 18-26 нм. Он считается грубым вирусом и ожидалось, что для него будет показано гораздо более низкое снижение вируса с помощью указанного протокола очистки, чем для ХМиЬу.

Пример 2.

Применение СИ24РС для лечения РА.

Этот пример демонстрирует, что СЭ24 может быть применен для лечения РА. Так как антиколлагеновые антитела присутствуют у пациентов с РА до начала заболевания и так как антиколлагеновые антитела способны индуцировать РА-подобную патологию у мышей, установленная модель пассивного переноса РА была использована для проверки эффективности растворимого СЭ24. Гибридный белок был растворен в ФСБ носителе при 10 мг/мл. Как показано на фиг. 4, комбинация четырех антиколлагеновых антител вызвала тяжелые клинические симптомы на всех конечностях, имеющие пиковые значения на 7 сутки в обоих группах как с носителем, так и обработанных СИ24Рс. Заболевания характеризовались краснотой и опуханием всей лапы во всех суставах. Некоторые суставы максимально воспалены и затронуты пальцы и множественные суставы. Таким образом, растворимый белок не влияет на начало заболеваний. Удивительно, но группа, обработанная СИ24Рс, показала гораздо более быстрое восстановление. Снижения клинических показателей весьма значительны, начиная с 9 суток и продолжая в течение всего периода наблюдения 24 суток. Таким образом, СИ24Рс обеспечивает эффективное лечение РА. Интересно, так как эффект наблюдается после пика заболевания, то по-видимому, блокирование СЭ24 влияет на процесс хронического заболевания после инициирования воспаления.

Пример 3.

Фармакокинетика СЭ24.

мг СЭ24 1дС1 инъецировали интактным С57ВБ/6 мышам и собирали образцы крови в различные временные точки (5 мин, 1, 4, 24, 48 ч, 7, 14 и 21 сутки) по 3 мыши на каждую временную точку. Сыворотку развели 1:100 и определили уровни СЭ24 1д, используя сэндвич ИФА, применяя очищенные антитела к СЭ24 человека (3.3 мкг/мл) в качестве первых антител, и конъюгированные с пероксидазой антитела козы против 1дС Рс человека (5 мкг/мл) как детектирующие антитела. Как показано на фиг. 5А, кривая распада СЭ24 1д выявила типичный двухфазовый распад белка. Первая фаза биораспределения имеет срок полувывода 12,4 ч. Вторая фаза следует модели первоочередного вывода из центрального компартмента. Время полувывода для второй фазы составляет 9,54 суток, что подобно времени полувывода для антител ίη у1уо. Эти данные позволяют предположить, что гибридный белок очень стабилен в кровенос- 6 027735 ном русле. В другом исследовании, в котором гибридный белок инъецировали подкожно, наблюдали почти идентичное время полувывода 9,52 суток (фиг. 5Б). Более того, так как это заняло приблизительно 48 ч для достижения пиковых уровней ί'.'Ό24 1д в крови, а общее количество гибридного белка, как было измерено с помощью ЛИС (площади под кривой), было существенно то же при любом пути инъецирования. Таким образом, с терапевтической точки зрения, разные пути введения инъекции не должны влиять на терапевтический эффект лекарственного средства. Это наблюдение значительно упрощает разработку экспериментов для изучения токсичности на приматах и клинические испытания.

Пример 4.

ί'.’Ό24 для лечения РА.

В течение десятилетий считалось, что РА является преимущественно аутоиммунным заболеванием, опосредованным Т-клетками. В последние два десятилетия снова пересматривают возможную роль антител и В-лимфоцитов в патогенезе РА. Таким образом, в дополнение к ревматоидным факторам, источник аутореактивных антител найден у пациентов с РА, хотя это не было окончательно отнесено к человеку. Однако несколько линий данных показали, что на мышиных моделях антитела, специфичные либо для общих, либо для тканеспецифичных антигенов, достаточны для того, чтобы вызвать симптомы РА. Например, обнаружено, что антитела из Κ/ΒχΝ ТСК трансгенных мышей полностью способны переносить РА-подобные заболевания к новому хозяину. Эта модель теперь называется АИАК - артрит, индуцированный антителами к коллагену (СА1А).

Г енетический анализ модели АИАК указал на критическую роль комплемента. Хотя существуют и другие возможности, эти требования предполагают возможное включение повреждение ткани, опосредованное антителами, в патогенез РА. Связь между повреждением ткани и воспалением является давним наблюдением в иммунологии. Почти два десятилетия назад Матцингер (Ма1/тдсг) предложил то, что обычно называют теорией опасности. По существу, предполагалось, что иммунная система включается, когда организм хозяина находится в опасности. Хотя природа опасности была не очень точно определена в то время, было установлено, что некроз связан с высвобождением внутриклеточных компонентов, таких как НМОВ1 и белки теплового шока, которые были названы ΌΑΜΡ, за участки молекулы, связанные с опасностью. Обнаружили, что ΌΑΜΡ усиливают продуцирование воспалительных цитокинов и аутоиммунные заболевания. В моделях на животных найдено, что ингибиторы НМОВ 1 и Η8Ρ90 усиливают РА. Участие ΌΑΜΡ усилило перспективность того, что негативная регуляция ответа хозяина на ΌΑΜΡ может быть изучена для терапии РА.

Взаимодействие СО24-81д1ес 10 в ответе хозяина на повреждение ткани.

Применив индуцированный ацетаминофеном некроз печени и обеспечив воспаление, авторы наблюдали, что через взаимодействие с 81д1ес О, ΟΌ24 дает сильную негативную регуляцию ответа хозяина на повреждение ткани. ΟΌ24 является ГФИ-якорной молекулой, которая широко экспрессируется в гематопоэтических клетках и стволовых клетках других тканей. Генетический анализ ряда аутоиммунных заболеваний у человека, включая множественный склероз, системную волчанку, РА и артрит гигантских клеток, показал существенную связь между полиморфизмом ΟΌ24 и риском аутоиммунных заболеваний. 8щ1ес О является членом семейства Ι-лектинов, выделенным по их способности распознавать структуры, содержащие сиаловые кислоты. 8щ1ес О распознает структуры, содержащие сиаловые кислоты, на ΟΌ24 и негативно регулирует продуцирование воспалительных цитокинов дендритными клетками [16]. С точки зрения своей способности взаимодействовать с ΟΌ24 8щ1ес 10 мыши и 8щ1ес О человека функционально эквивалентны. Однако неясно, существует ли точная корреляция между мышиным и человеческим гомологами. Хотя механизм остается полностью изученным, вполне вероятно, что связанный с 8щ1ес О 8ΗΡ1 может быть вовлечен в негативную регуляцию. Эти данные, опубликованные недавно в журнале 8с1еисе, приводят к новой модели, в которой взаимодействие СО24-81д1ес О/10 может играть критическую роль в разграничении молекул, связанных с патогеном (РАМР) и ΌΑΜΡ (фиг. 6). По меньшей мере два перекрывающихся механизма могут объяснять функцию ΟΌ24. Во-первых, путем связывания с рядом ΌΑΜΡ ΟΌ24 может быль ловушкой для воспалительных стимулов для предотвращения их взаимодействия с ТЬК или ΚΑ6Ε. Это мнение поддерживается наблюдениями, которые показывают, что СО24 ассоциирован с некоторыми молекулами ΌΑΜΡ, включая Η8Ρ70, 90, ΗΜОΒ1 и нуклеолин. Вовторых, возможно после ассоциации с ΌΑΜΡ ΟΌ24 может стимулировать передачу сигнала с помощью 8щ1ес О. Оба механизма могут действовать совместно, так как мыши с направленной мутацией по любому из генов показывали более сильный воспалительный ответ. На самом деле ОС (дендритные клетки), полученные из костного мозга, взятого либо от ΟΌ24-/-, либо от 8щ1ес О-/- мышей, продуцировали гораздо больше воспалительных цитокинов, чем при стимуляции любым из ΗΜОΒ1, Η8Ρ70 или Η8Ρ90. Напротив, не было найдено никакого эффекта при их ответе на РАМР, такой как ЛПС и Ρο1ν1:ί'.'. Эти данные не только обеспечили механизм для врожденного иммунитета для распознавания патогена от повреждения ткани, но также предполагают, что ΟΌ24 и 8щ1ес О могут быть потенциальными терапевтическими мишенями для лечения заболеваний, связанных с повреждением тканей.

- 7 027735

Терапевтический эффект СЭ24 на артрит, индуцированный антителами к коллагену.

Возможность стимулирования этого пути для лечения РА была изучена, учитывая возможную роль врожденного иммунитета к повреждению ткани в патогенезе РА и роль СЭ24^щ1ес 0/10 пути в негативном регулировании такого ответа.

Патогенез практически всех аутоиммунных заболеваний включает индуцирование иммунного ответа на аутоантиген и аутоиммунное разрушение. Фокус был сделан на аутоиммунной фазе разрушения на основании новой функции взаимодействия СЭ24Ащ1ес 0. Таким образом, для предварительного анализа модель артрита, индуцированного антителами к коллагену, была принята для оценки потенциального терапевтического эффекта. Как показано на фиг 7а, АИАК индуцировали у мышей ВАЬВ/с в возрасте 8 недель посредством внутривенной инъекции коктейля 4 антиколлагеновых моноклональных антител (ΜΌ Вюзаепсез, δΐ. Раи1, ΜΝ) при концентрации 2 мг/мышь на 1 сутки и внутрибрюшинной инъекции 100 мкг/мышь ΤΡδ (ΜΌ Вюзшепсе) на 3 сутки. Мыши были обработаны на 1 сутки либо 1 мг СЭ24Рс. либо равным объемом 1-кратного ФСБ носителя в качестве негативного контроля. Как показано на фиг. 7б, по сравнению с контролем с носителем, СЭ24Рс обеспечивает высокозначимый терапевтический эффект. Для понимания механизма, по которому СО24Рс снижает артрит в данной модели, измеряли цитокины из гомогенизированных суставов мышей, обработанных СО24Рс или ФСБ контролем, и измерен супернатант из 200 мкг гомогената ткани с помощью набора гранул с антителами к цитокинам. Типичный пример показан на фиг. 8а, в то время как сводные данные показаны на фиг. 8б. Эти данные показывают, что систематически вводимый СЭ24 снижает уровни многих воспалительных цитокинов, включая ΤΝΕ-α, 1Ь-6, МСР-1 (ССЬ2) и ΙΌ-Ιβ.

Эффект СЭ24 Рс подтверждается гистологическим анализом синовиальных суставов АИАК мышей, как показано на фиг. 9. На 7 сутки после индуцирования артрита гематоксилин-эозиновое окрашивание показало, что синовиальная оболочка сустава в группе с ФСБ сильно инфильтрирована воспалительными клетками, включающими нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты (фиг. 9а). Это было намного меньше у мышей, обработанных СЭ24 Рс. В дополнение, сильные повреждения суставов были выявлены по потере окрашивания сафранином О красным у обработанных ФСБ мышей (фиг. 9в), но не у обработанной СЭ24Рс группы (фиг. 9г).

Чтобы определить, будет ли у мышей СЭ24Рс иметь терапевтическое влияние на текущий РА, лечение начинали либо на 5, либо на 7 сутки после индуцирования РА. Как показано на фиг. 10, существенное снижение РА показателей наблюдали уже через 2 суток после обработки СЭ24РС. Терапевтический эффект сохранялся в течение оставшегося периода наблюдения даже без дополнительной обработки. Эти данные далее усилили терапевтический потенциал СЭ24Рс для текущих заболеваний. Для определения терапевтических дозировок СЭ24Рс для человека, для СЭ24Рс был определен титр в широком интервале дозировок. Как показано на фиг. 11, уже 2 мкг/мышь было достаточным для получения статистически значимого терапевтического эффекта.

δ^д1есд-зависимый терапевтический эффект СЭ24 Рс.

Чтобы определить, будет ли СЭ24 Рс защищать мышей путем взаимодействия с δ^дIес О, авторы изобретения определили, зависит ли терапевтический эффект от гена δίβ^β. Так как δ^д1есд-зависимые мыши были получены с помощью Εδ клеток из С57ВЬ/6 мышей, использовали \7Т С57ВЬ/6 мышей в качестве контроля. Как показано на фиг. 12а, так как известно, что В6 мыши менее подвержены АИАК, то общие показатели заболевания ниже, чем наблюдали для мышей ВАЬВ/с. Тем не менее, уже одна инъекция СЭ24 Рс, по существу, уничтожила клинические признаки у мышей дикого типа. Важно отметить, что даже если заболевание менее сильное у δ^д1есд-дефицитных мышей, СЭ24РС не имеет терапевтического эффекта. Таким образом, терапевтический эффект СЭ24РС строго зависит от гена δίβ^β.

Взятые вместе, приведенные данные показывают высокую терапевтическую эффективность СЭ24 Рс для АИАК. Учитывая обширные данные по безопасности, стабильности и успешное производство СЭ24Рс, - все указывает на большой потенциал указанного гибридного белка как терапевтического средства для РА.

Пример 5.

Токсичность.

Обширные исследования токсичности на грызунах и нечеловекообразных приматах не показали связанной с лекарственным средством токсичности при дозах от 12,5 до 125 мг/кг у мышей и нечеловекообразных приматов.

- 8 027735

Цитированные источники

1. Зрппдег, Т., С. баИге, 0.8. ЗесЬег, апс! С. ΜίΙείθΐη. 1978. Мопос1опа1 хеподепею апйЬосИез Ю типпе сеН зийасе апРдепз: 1бепРПсаРоп οί ηονθΙ 1еикосу1е с1И1егепйа1юп апРдепз. Еиг б 1ттипо18:539-551.

2. ΡίθπΌδ, Μ., Р. Мациер б. ВагЬер 8. МагсЬеПо, I. Мапез, С. Оеуаих, М. Вагаб, В. Нутап, апс1 <3. Воидоп. 1987. Ενϊάθηοθ Фа1 типпе Ьета1оро1еРс сеН зиЬзе! тагкег Л Ιό ϊδ аПасЬеб № а д1усозу1-рЬозрЬаРбу1|Поз11о1 тетЬгапе апсЬог. Еиг б 1ттипо117:1781-1785.

3. Воидоп, Θ., Ь-А. АКегтап, К. ϋβηηϊδ, Х.б. Оио, апб С. Κΐηηοη. 1991. ТЬе типпе ЬеаРзФЫе апрдеп: а бМегепРаРоп апрдеп ехргеззеб ϊη ЬоФ Фе Ьета1о1утрЬо1б апб пеига! сеН Нпеадез. Еиг б 1ттипо1 21:1397-1402.

4. Ρϊυ, Υ., апб С.А.б. бапемау. 1992. СеНз 1Ьа1 ргезеп! ЬоФ зресйю Ндапб апб Фе созРти1а1огу ас1м1у аге Фе тоз! βίίϊοϊβηί тбисег οί с1опа1 ехрапзюп οί погта!

Οϋ4 Т сеНз. Ргос Ыа« Асаб 8οϊ ΙΙ3Α 89:3845-3849.

5. Ьи, Υ., В. бопез, А. АгиИо, К.М. ЗиШуап, Р.8. Р|пз1еу, апб С.А. бапе\л/ау, бг.

1992. НеаРз1аЫе апрдеп ΐδ а созРти1а1огу то1еси1е 1ог 0ϋ4 Т сеН дгомФ. б Ехр Меб 175:437-445.

6. Ρϊυ, Υ., В. бопез, УУ. Вгабу, С.А. бапемау, бг., Р.8. Ртз1еу, апб Р.8. ип!еу. 1992. Со- зРти1аРоп οί типпе С04 Т сеН дгоу/Ф: соорегаРоп ЬеРл/ееп В7 апб Ьеа1з1аЫе апрдеп [риЬНзЬеб еггаФт арреагз ϊη Еиг б 1ттипо11993 Маг;23(3):780].

Еиг б 1ттипо1 22:2855-2859.

7. Ρϊυ, Υ., В.Н. УУепдег, М. гЬао, апс! Р.б. №е1зеп. 1997. ϋϊδϋηοί созРти1а1огу то1еси1ез аге геди1геб !ог Фе ФбисРоп οί еЯесФг апб тетогу су1о1охгс Т 1утрЬосу1ез. б Ехр Меб 185:251-262.

8. УУи, Υ., О. ΖΜου, Р. гЬепд, апб Υ. Ыи. 1998. СО28 -|'пберепбеп1 тбисРоп οί Т Ье1рег сеНз апб 1ттипод1оЬиНп с1азз змФЬез гедикез созРти1аРоп Ьу 1Ье ЬеаР з1аЫе апрдеп. б Ехр Меб 187:1151 -1156.

9. Вар Х.Р., б.О. Ρϊυ, X. Ρϊυ, Υ. Оио, К. Сох, б. УУеп, Р. гЬепд, апб Υ. Ыи. 2000. ТЬе ЬеаРзФЫе апрдеп беФтгипез раФодет'ску οί зеИ-геасруе Т сеНз ϊη ехрептепФ! аикяттипе епсерЬа1отуеНРз. б СНп Ιηνβδί 105:1227-1232.

10. Вар Х.Р., О. и, Ω. гЬои, Н. гЬапд, Р.8. бозЫ, X. ИЬепд, Υ. Ыи, Υ. УУапд, апб Р. ИЬепд. 2004. СО24 Соп1го1з Ехрапзюп апб Регз1з1епсе οί АиФгеасРуе Т СеНз ϊη Фе Сеп1га1 №гуоиз 8узФт биппд ЕхрептепФ! Аиф1ттипе ЕпсерЬа1отуеПРз. б Ехр Меб 200:447-458.

11. ОФедир ϋ., А. 8аепг, Р. Сатапо, Р. В1агдиег, М. ОоюоесЬеа, б. ВЫгМагРпег, б. О1азкоада, б. А. Етрагапга, апб А. ίορεζ бе Минаю. 2006. СО24 ν/ν ϊδ ап аПе1е аззос|‘а1еб \λ/ϊΦ Фе пзк οί беуе1ор|'пд ти1Рр1е зс1егоз13 ϊη Фе 8рап1зЬ рориФРоп. МиИ 8с1ег 12:511-514.

12. Виеба, В., б.А. М1гапба-РН1оу, б. МагРп, апб М.А. Оопга1е2-Оау. 2008.

Аззос1аРоп οί СО24 депе ро!утогрЬ1зтз ννϊΦ зизсерРЬПКу 1о Ьюрзу-ргоуеп д1ап1 сеН аПепйз. б. ВЬеитаЮ!. 35:850-854.

- 9 027735

13. 8апсйег, Е., А.К. АЬе1зоп, ΰ.Μ. ЗаЬю, М.А. Сопга1е2-6ау, Ν. Ог1едо-Сеп1епо, ΰ. Лтепег- А1опзо, Е. бе Ватоп, ΰ. ЗапсЬег-Вотап, М.А. Ι_ορβζ-Νβνοί, I. Сиппагззоп, Е. 8уепипдззоп, 6. δΐιιιίθΙί, 1_. Тгиебззоп, А. ΰοηδβη, М.Р. Θοηζ^βζЕзспЬапо, Т. ММе, М.Е. А1агсоп-В|дие1те, апс! ϋ. Магйп. 2007. Аззос!айоп οί а Οϋ24 депе ро1утогр1йзт ννΐίίι зизсерЦЬОНу Ю зузГетю 1ириз егуйзетайэзиз. АбЬпйз ВЬеит. 56:3080-3086.

14. Мапд, Ь., δ. Ι_ϊη, К. ВаттоЬап, Ζ. Ι_ίιι, ΰ. Ьи, В.-Н. Ьи, Ν. ΘυϊηίΙιβΓ, О. ΖΓιοιι, Т. Мапд, X. грепд, Ο.ΰ. В1гт1пдЬат, В.Н. Βονΐη, 1_.А. НегЬеП, Υ. Ми, ϋ.ΰ. 1_упп, О. Сооке, Ο.Υ. Υυ, Р. гпепд, апс! Υ. Ыи. 2007. А б1-пис1еойбе бе1ейоп ίη СО24 соп1егз рго1есйоп адатз! аиЮ1ттипе сНзеазез. Р1оз бепейсз 3:е49.

15. гЬои, О., К. ВаттоКап, 8.Ι_ϊη, Ν. ВоЫпзоп, О. и, X. Ыи, Х.Р. Вак Ι_. Υΐη, В. ЗсагЬеггу, Р. Ои, Μ. Υου, К. Оиап, Р. гЬепд, апс! Υ. 1_>и. 2003. Οϋ24 Ϊ5 а депейс тосНйег Тог пзк апс1 ргодгеззюп οί ти1йр1е зс1егоз13. Ргосеебтдз οί ϊΙίθ Ыайопа! Асабету οί δοϊβηοβδ οί 1Ре 1)пИеб 81а1ез οί Атепса 100:15041 -15046.

16. СКеп, 6.Υ., ΰ. Тапд, Р. гЬепд, апб Υ. Ыи. 2009. СО24 апс! 8|д1ес-10 8е1есйуе1у Вергезз Ъззие Оатаде-1пбисеб 1ттипе Везропзез. δοΐεηοβ 323:1722-1725.

17. \Мепз, А., В. Уепзоп, СЭ. Соггег, М.Р. О1ик1, апб В. Роп1аго1о. Ме1а-апа1уз15 οί Ию е№сасу апб за1е1у οί абаНтитаЬ, е1апегсер{, апб 1п1Нх1таЬ ίοΓ 1Ке 1геа1теп1 οί гЬеитакйб абЬпйз. РОагтасоЙзегару 30:339-353.

18. Рапау», С.8., 6.8.1_апсОЬигу, апб Θ.Η. К|пдз1еу. 1992. ТИе 1трог1апсе οί ίίιβ Т се11 ΐη ойайпд апб та1П1а1П1пд 1Ье сЬгопю зупоуШз οί гИеитайлб абЬпйз. АбЬпйз Впеит 35:729-735.

19. Вапба, Ν.Κ., ύ.Μ. ТИигтап, ϋ. Кгаиз, А. Мооб, М.С. СаггоН, М.Р. Агепб, апб ν.Μ. Но1егз. 2006. АИетайуе сотр1етеп1 райжау асйуайоп Ϊ5 еззепйа! Тог тНаттайоп апб ϊοΐηί без1гисйоп ϊη йпе раззме 1гапз1ег тобе1 οί соНадеп-тбисеб абОпйз. ΰ 1ттипо1177:1904-1912.

20. Когдапохл/, А.8., Η. Л, 8. Мапд1а1аю, V. ОисЬа1е11е, В. Ре1апба, Т. Магйп, С. ОедоП, Н. К|ки1ап1, К. Ва^емзку, Л1_. РаздиаН, С. Ββηοΐδί, апб ϋ. МаНйз. 1999. Ргот зуз1ет1с Т се11 зеИ -геас1м1у ίο огдап-зресйю аийЛттипе б1зеазе νΐβ 1ттипод1оЬийпз. 1ттипЛу 10:451-461.

21. МассюЫ, М., О. гебег-Ыи, Н. Ниапд, С. ЕЬе1, Р. СегЬег, Л Негдиеих, Р. МагсЬа!, V. ОисЬа1е11е, С. ОедоП, М. уап Ведептобе!, С. Ββηοΐδί, апб ϋ. МаНпз. 2002. АгйзпЮдепю топос1опа1 апйЬоб1ез Нот Κ/ΒχΝ ггисе. ΰ Ехр Меб 195:10711077.

22. уап НоИеп, ϋ., К. Рауе1ка, Л Уепсоузку, Н. 81аЫ, В. Вогтап, М. Сепоуезе,

А.Л Κΐνΐίζ, ΰ. А1уаго, 0.1\!ик|, ϋ.Ε. Ригз1, О. Неггего-ВеаитоШ, ИВ. Мс1ппез, Р. Миз1к1с, апб Р.Р. Так. 2005. А тиШсепИе, гапбопйзеб, боиЫе ЬНпб, р1асеЬо соп1го11еб рИазе II з1ибу οί зиЬси1апеоиз 1п1ебегоп Ье1а- 1а ϊη ίίιβ 1геа1теп1 οί райетз ννίίΐΊ асйуе гЬеитаййб агйзпйз. Апп ВИеит ϋΐδ 64:64-69.

- 10 02ΊΊ35

23. УПсек, б., апс1 М. Ре1бтапп. 2004. Н1з1опса1 Γθνίθνν: Су1ок1пез аз ЙюгареиЙсз апс11агде1з οί йпегареийсз. Тгепбз ίη рйагтасо1од1са1 зс^епсез 25:201-209.

24. Вап1араа-РаМду1з1, 5., В.А. бе бопд, Е. ВегдНп, О. НаНтапз, С. \Л/абе11, Н. 31еп1ипб, и. διιηάϊη, апб \ΛΖ.ΰ. уап Уепгооц. 2003. АпйЬосПез адатз! сусНс сЦги1Нпа1еб рерйбе апс11дА гйеита{О1б1ас1ог ргесНсГ ΐήθ 6θνθΙοριτιθηί οί гЬеитаЮ1б абйпйз. АгЙ1ПЙз ВЬеит 48:2741 -2749.

25. уап Уепгооу, \А/.Ц., апс! О.б. Ргицп. 2000. СЧгиШпайоп: а зтаН сЬапде Тог а ρΓοΐθίη ννίίΚ дгеа1 сопзедиепсез Тог гПеитаклб аЛЬпЙз. АгЙмйз гезеагсЬ 2:249251.

26. Лапд, М., апб Р.5. Р(зе1зку. 2007. МесЬап1зтз οί Р|зеазе: 1Ье го!е οί ЫдЬтоЬЛЦу дгоир ρΐΌΐθϊη 1 ϊη 1Ье ра1Ьодепез!3 οί 1ПЙаттаЮгу абЬпйз. №№ге с11П1са! ргасйсе 3:52-58.

27. уап Вецпит, б. В., \Л/.А. Виигтап, апс1 АЛЛ/. Θπίίΐοθη. 2008. Сопуегдепсе апб атрНйсайоп οί ΙοΙΙ-Пке гесерЮг (Т1Н) апс! гесерЮг 1ог абуапсеб д1усайоп епб ргос1ис1з (ΒΑΘΕ) 51дпаНпд раИпмауз У1а Ь|дЬ тоЬНку дгоир ΒΙ (ΗΜΘΒ1). Апдюдепез13 11:91 -99.

28. ЗапсЬег, Е., В. Регпапбег-Оийеггег, М.А. Оопга1ег-Оау, А. Ва1за, А. Оагс:а, Вобпдиег, Р. Разсиа1-5а1себо, М.Р. Оопга1е2-ЕзспЬапо, апб б. Магйп. 2008. 1пуезйдайпд ίήθ го1е οί СР24 депе ро1утогрЫзтз ίη гЬеитакПб абЬпйз. Апп ВЬеит ΡΪ5 67:1197-1198.

29. Кау, В., Р.М. Воз1еп, апб В.К. НитрЬпез. 1991. СР24, а 51дпа1 йапзбисег тоби!айпд В сеН асйуайоп гезропзез, Ϊ3 а νθιγ зЬоб рерйбе ννϊίΡι а д1усозу! рЬозрЬайбуНпозйо! тетЬгапе апсЬог. б 1ттипо1147:1412-1416.

30. Кау, В., Р. Таке!, апб В.К. НитрЬпез. 1990. Ехргеззюп с!оп1пд οί а οϋΝΑ епсобтд ΜΙ/69-6ΙΙ6 ЬеаТз1аЫе апйдепз. б 1ттипо1145:1952-1959.

31. Мо1ап, Е., X. гЬепд, X. 5и, Υ. Ыи, М. КуагавкЬеНа, М. Ргеказ, апб Ρ.Θ. Мапд. 2009. Апа1уз13 οί ВесотЫпап! СР24 01усапз Ьу МАЮ1-ТОР-МЗ Веуеа1з Ргеуа1епсе οί З1а1у1-Т АпЙдеп. Атепсап ригпа1 οί Ьютебюа1 зс1епсез 1:1-11.

32. Ни, У. 1994. ТЬе созйти!а1огу раЙпл/ау 1ог Т сеИ гезропзе. ВО 1_апбез, Аизйп.

Claims (7)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Белок ΟΌ24 для лечения ревматоидного артрита, состоящий из зрелого ΟΌ24 человека, слитого с Ес частью иммуноглобулина (1д) человека, в котором последовательность зрелого белка ΟΌ24 человека состоит из 8Ε^ ГО ΝΟ: 1, где белок ΟΌ24 не содержит аланина или валина непосредственно в Стерминальном положении по отношению к 8Ε^ ГО ΝΟ: 1.
2. 2. Белок ΟΌ24 по п.1, в котором Ес часть содержит (а) шарнирную область и СН2 и СН3 домены белка 1д человека, при этом 1д выбран из группы, состоящей из 1§О1, 1§О2, 1§О3, 1§О4 и 1дА; или (Ь) шарнирную область и СН3 и СН4 домены 1дМ.
3. 3. Белок ΟΌ24 по п.1, который получен с применением эукариотической системы экспрессии белка.
4. 4. Белок ΟΌ24 по п.1, отличающийся тем, что белок ΟΌ24 гликозилирован.
5. 5. Белок ΟΌ24 по п.2, где 1д представляет собой 1§О1.
6. 6. Белок ΟΌ24 по п.5, где последовательность Ес части состоит из 8Ε^ ГО ΝΟ: 6.
7. 7. Белок ΟΌ24 по любому из пп.1-6, где Ес часть слита с С-концом зрелого человеческого белка