ES2255027T3 - Antagonistas de factores de crecimiento de celulas endotheliales vasculares. - Google Patents
Antagonistas de factores de crecimiento de celulas endotheliales vasculares.Info
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Abstract
Uso de un antagonista del hVEGF en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la degeneración macular asociada a la edad en un paciente humano, en donde el antagonista del hVEGF comprende la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de un hVEGFr. 2 Uso acorde con la reivindicación 1, en donde el hVEGFr es el receptor flt o el receptor flk-1 (también denominado como KDR). 3. Uso acorde con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde los dominios transmembrana y citoplásmico del hVEGFr están suprimidos. 4. Uso acorde con cualquier reivindicación 1 precedente, en donde el antagonista del hVEGF es una proteína de fusión que comprende además un polímero o polipéptido que no es del hVEGFr. 5. Uso acorde con la reivindicación 4, en donde el polipéptido que no es del hVEGFr es una inmunoglobulina. 6. Uso acorde con la reivindicación 5, en donde el dominio extracelular del hVEGFr se sustituye con el dominio Fv de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina. 7. Uso acorde con la reivindicación 6, en donde el dominio Fv procede de una cadena pesada de inmunoglobulina. 8. Uso acorde con la reivindicación 7, en donde el extremo C-terminal del dominio extracelular del receptor está unido covalentemente al extremo amino-terminal del CH1, bisagra, CH2 de la cadena pesada. 9. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el hVEGFr está conjugado a un polímero no proteico. 10. Uso acorde con la reivindicación 9, en donde el polímero no proteico es polietilenglicol.
Description
Antagonistas de factores de crecimiento de
células endoteliales vasculares.
La presente invención se refiere a procedimientos
de uso de los antagonistas del VEGF con propósitos terapéuticos.
Los dos principales componentes celulares de la
vasculatura son las células endoteliales y las células del músculo
liso. Las células endoteliales forman el recubrimiento de la
superficie interna de todos los vasos sanguíneos, y constituyen una
interfaz no trombogénica entre la sangre y el tejido. Además, las
células endoteliales son un componente importante para el desarrollo
de nuevos capilares y vasos sanguíneos. Por tanto, las células
endoteliales proliferan durante la angiogénesis, o
neovascularización, asociada con el crecimiento tumoral y la
metástasis, y con una variedad de enfermedades o trastornos no
neoplásicos.
Según se informa, varios polipéptidos, que
ocurren de forma natural, inducen la proliferación de las células
endoteliales. Entre esos polipéptidos se hallan los factores de
crecimiento de fibroblastos básico y ácido (FGF), Burgess y Maciag,
Annual Rev. Biochem., 58:575 (1989), el factor de crecimiento
celular derivado de plaquetas (PD-ECGF), Ishikawa,
et al., Nature, 338:557 (1989), y el factor de
endotelial vascular (VEGF), Leung, et al., Science,
246:1306 (1989); Ferrara y Henzel, Biochem. Biophys. Res.
Commun., 161:851 (1989); Tischer, et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 165:1198 (1989); Ferrara, et al.,
Patente PCT con nº de publicación WO 90/13649 (publicada el 15 de
noviembre de 1990).
El VEGF se identificó primero en medio
condicionado por células foliculares o foliculoestrelladas de la
pituitaria bovina. Los análisis bioquímicos indican que el VEGF
bovino es una proteína dimérica con una masa molecular aparente de
aproximadamente 45.000 daltones, y con una especificidad mitogénica
aparente por las células endoteliales vasculares. El ADN que
codificaba el VEGF bovino se aisló examinando una biblioteca de cADN
preparada a partir de tales células, usando oligonucleótidos basados
en la secuencia de aminoácidos amino-terminal de la
proteína como sondas de hibridación.
El VEGF humano se obtuvo examinando primero una
biblioteca de cADN preparada a partir de células humanas, usando el
cADN del VEGF bovino como una sonda de hibridación. Un cADN
identificado de ese modo codifica una proteína de
165-aminoácidos que tiene más del 95% de homología
con el VEGF bovino, proteína que es conocida como VEGF humano
(hVEGF). La actividad mitogénica del VEGF humano se confirmó
expresando el cADN del VEGF humano en células huésped de mamífero.
El medio condicionado por las células tratadas con el cADN del VEGF
humano promovió la proliferación de las células endoteliales
capilares, mientras que las células control no lo hicieron. Leung,
et al., Science, 246:1306 (1989).
Se identificaron varios cADN en bibliotecas de
cADN humanas que codifican isoformas de 121-, 189-, y
206-aminoácidos del hVEGF (denominadas también de
forma conjunta como proteínas relacionadas con el hVEGF). La
proteína de 121 aminoácidos difiere del hVEGF a causa de la
supresión de los 44 aminoácidos entre los residuos 116 y 159 del
hVEGF. La proteína de 189 aminoácidos difiere del hVEGF a causa de
la inserción de 24 aminoácidos en el residuo 116 del hVEGF, y
aparentemente es idéntica al factor de permeabilidad vascular
(hVPF). La proteína de 206 aminoácidos difiere del hVEGF a causa de
una inserción de 44 aminoácidos en el residuo 116 del hVEGF. Houck,
et al., Mol. Endocrin., 5:1806 (1991); Ferrara et
al., J. Cell Biochem., 47:221 (1991); Ferrara et
al., Endocrine Reviews, 13:18 (1992); Keck, et
al., Science, 246:1309 (1989); Connolly, et al.,
J. Biol. Chem., 264:20017 (1989); Keck, et al.,
Patente EPO Nº de publicación 0.370.989 (publicada el 30 de mayo de
1990).
El VEGF no sólo estimula la proliferación de las
células endoteliales vasculares, sino que también induce la
permeabilidad vascular y la angiogénesis. La angiogénesis, que
implica la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de
endotelio preexistente, es un componente importante de una variedad
de enfermedades y trastornos, incluyendo la degeneración macular
relacionada con la edad.
Una revisión por D'Amore en Investigative
Ophthalmology & Visual Science,
35(12):3974-3979 (1994) discute los posibles
mecanismos de neovascularización retinal y coroidal.
Un resumen de Smith et al. en
Investigative Ophthalmology & Visual Science,
36(4):5871 (15 de marzo de 1995) descubre que el VEGF
antisentido reduce la neovascularización retinal.
La presente invención proporciona el uso de un
antagonista del hVEGF que comprende el dominio extracelular de un
receptor de hVEGF en la preparación de un medicamento para el
tratamiento de la AMD. El antagonista inhibe la actividad
mitogénica, angiogénica, u otra actividad biológica del hVEGF, y,
por tanto, es útil para el tratamiento de la AMD, la cual se
caracteriza por una neovascularización excesiva no deseable.
Los antagonistas del VEGF podrían estar
conjugados con un grupo citotóxico.
Si se desea, el antagonista del VEGF se
coadministra, bien simultánea o secuencialmente, con uno o más
antagonistas del VEGF o sustancias
anti-angiogénicas.
La Figura 1 muestra el efecto de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2), o de un
anticuerpo anti-factor de crecimiento de hepatocitos
(anti-HGF) irrelevante, sobre la unión de los
anticuerpos monoclonales anti-hVEGF al hVEGF.
La Figura 2 muestra el efecto de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2), o de un
anticuerpo anti-factor de crecimiento de hepatocitos
(anti-HGF) irrelevante, sobre la actividad biológica
del hVEGF en cultivos de células endoteliales capilares (ACE) del
córtex adrenal bovino.
La Figura 3 muestra el efecto de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1, B2.6.2 o A2.6.1)
sobre la unión del hVEGF a células ACE bovinas.
La Figura 4 muestra el efecto del tratamiento con
anticuerpo monoclonales anti-hVEGF A4.6.1 sobre la
velocidad de crecimiento del crecimiento de los tumores de NEG55 en
ratones.
La Figura 5 muestra el efecto del tratamiento con
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el
tamaño de los tumores de NEG55 en ratones después de cinco semanas
de tratamiento.
La Figura 6 muestra el efecto del tratamiento con
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 (VEGF Ab)
sobre el crecimiento de tumores de
SK-LMS-1 en ratones.
La Figura 7 muestra el efecto del tratamiento con
diferentes dosis de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF
A4.6.1 (VEGF Ab) sobre el crecimiento de tumores de A673 en
ratones.
La Figura 8 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 (VEGF Ab) sobre el
crecimiento y supervivencia de células de glioblastoma NEG55 (G55)
en cultivo.
La Figura 9 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento y
supervivencia de células de rabdomiosarcoma A673 en cultivo.
La Figura 10 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre la quimiotaxis de
las células endoteliales humanas inducida por el fluido sinovial
humano.
El término "hVEGF" tal como se usa en ésta,
se refiere al factor de crecimiento de células endoteliales
vasculares humano de 165 aminoácidos, y a los factores de
crecimiento de células endoteliales vasculares relacionados de 121,
189, y 206-aminoácidos, tal como describieron
Leung, et al., Science, 246:1306 (1989), y Houck,
et al., Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), junto con las
formas alélicas y procesadas que ocurren de forma natural de estos
factores de crecimiento.
La presente invención se refiere a antagonistas
del hVEGF que son capaces de inhibir una o más de las actividades
biológicas del hVEGF, por ejemplo, su actividad mitogénica o
angiogénica. Los antagonistas del hVEGF actúan interfiriendo con la
unión del hVEGF a un receptor celular, incapacitando o matando las
células que han sido activadas por el hVEGF, o interfiriendo con la
activación de la célula endotelial vascular después de la unión del
hVEGF a un receptor celular. Por tanto, dentro del ámbito de la
invención se halla incluido el receptor del hVEGF, y los fragmentos
y variantes de la secuencia de aminoácidos del mismo, tal como se
definen en las reivindicaciones, los cuales son capaces de unir el
hVEGF.
El término "receptor del hVEGF" o
"hVEGFr", tal como se usa en ésta, se refiere a un receptor
celular para el hVEGF, ordinariamente un receptor de la superficie
celular hallado sobre células endoteliales vasculares, así como a
variantes del mismo que retienen la capacidad de unirse al hVEGF.
Los receptores del hVEGF y las variantes del mismo que son
antagonistas del hVEGF estarán en forma aislada, en vez de estar
integrados en una membrana celular o fijados sobre una superficie
celular, como pudiera ser el caso en la naturaleza. Un ejemplo de
receptor del hVEGF es la quinasa de tirosina parecida a fms
(flt), un receptor transmembrana en la familia de quinasas de
tirosina. De Vries et al., Science, 255:989 (1992);
Shibuya et al., Oncogene, 5:519 (1990). El receptor
flt comprende un dominio extracelular, un dominio
transmembrana, y un dominio intracelular con actividad quinasa de
tirosina. El dominio extracelular está implicado en la unión del
hVEGF, mientras que el dominio intracelular está implicado en la
transducción de la señal.
Otro ejemplo de un receptor del hVEGF es el
receptor flk-1 (también denominado como KDR).
Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9026
(1991); Terman et al., Oncogene, 6:1677 (1991);
Terman, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.,
187:1579 (1992).
La unión del hVEGF al receptor flt resulta
en la formación de al menos dos complejos de peso molecular elevado,
que tiene un peso molecular aparente de 205.000 y 300.000 daltones.
Se cree que el complejo de 300.000 daltones es un dímero que
comprende dos moléculas de receptor unidas a una única molécula de
hVEGF.
Las variantes del hVEGFr que contienen el dominio
extracelular se hallan incluidas en el ámbito de ésta. Los ejemplos
representativos incluyen las formas truncadas de un receptor, en la
cuales los dominios transmembrana y citoplásmico se suprimen del
receptor, y las fusiones de proteínas en las que polímeros que no
son del hVEGFr o polipéptidos se conjugan al hVEGFr, o,
preferiblemente, formas truncadas del mismo. Un ejemplo de tal
polipéptido que no es un hVEGF es una inmunoglobulina. En ese caso,
por ejemplo, el dominio extracelular del hVEGFr es sustituido por el
dominio Fv de una cadena ligera o (preferiblemente) pesada de
inmunoglobulina, con el extremo C-terminal del
dominio extracelular del receptor unido covalentemente al término
amino del CH1, bisagra, CH2 u otro fragmento de la cadena pesada.
Tales variantes se preparan de la misma forma que los
inmunoadhesones conocidos. Ver, por ejemplo, Gascoigne, et
al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84:2936 (1987); Capon, et
al., Nature, 337:525 (1989); Aruffo, et al.,
Cell, 61:1303 (1990); Ashkenazi, et al., Proc.
Nat. Acad. Sci., 88:10535 (1991); Bennett, et al., J.
Biol. Chem., 266:23060 (1991). En otras realizaciones, el hVEGFr
está conjugado con un polímero no proteico tal como el
polietilenglicol (PEG) (ver, por ejemplo, Davis, et al.,
Patente estadounidense nº 4.179.337; Goodson, et al.,
BioTechnology, 8:343-346 (1990); Abuchowski,
et al., J. Biol. Chem., 252:3578 (1977); Abuchowski,
et al., J. Biol. Chem., 252:3582 (1977)) o
carbohidratos (ver, por ejemplo, Marshall, et al., Arch.
Biochem. Biophys., 167:77 (1975)). Esto sirve para alargar la
vida media biológica del hVEGFr y reduce la posibilidad de que el
receptor sea inmunogénico en el mamífero al cual se administra. El
hVEGFr se usa sustancialmente de la misma forma que los anticuerpos
contra el hVEGF, tomando en consideración la afinidad del
antagonista y su valencia para el hVEGF.
El dominio extracelular del receptor del hVEGF,
bien por sí mismo o fusionado a un polipéptido de inmunoglobulina u
otro polipéptido portador, es especialmente útil como un antagonista
del hVEGF, gracias a su capacidad para secuestrar el hVEGF que está
presente en un huésped pero que no está unido a los hVEGFr sobre la
superficie de una célula.
El término "recombinante", usando en
referencia al hVEGF, receptor del hVEGF, anticuerpos monoclonales, u
otras proteínas, se refiere a proteínas que se producen mediante la
expresión de ADN recombinante en una célula huésped. La célula
huésped podría ser procariota (por ejemplo, una célula bacteriana
tal como E. coli) o eucariota (por ejemplo, una levadura o
una células de mamífero).
En algunas realizaciones es deseable proporcionar
un grupo citotóxico conjugado con un hVEGFr. En estas realizaciones,
la citotoxina sirve para incapacitar o matar células que están
expresando o uniendo el hVEGF. El conjugado es dirigido hacia la
célula por el dominio que es capaz de unirse al hVEGF.
Típicamente, la citotoxina es una citotoxina
proteica, por ejemplo, la toxina de la difteria, ricina, o la toxina
de Pseudomonas, aunque en el caso de ciertas clases de
inmunoglobulinas, el dominio Fc del anticuerpo monoclonal podría
servir por sí mismo para proporcionar una citotoxina (por ejemplo,
en el caso de los anticuerpos IgG2, los cuales son capaces de fijar
el complemento y participar en la citotoxicidad celular dependiente
de anticuerpo (ADCC)). Sin embargo, no es necesario que la
citotoxina sea proteica, y podría incluir agentes quimioterapéuticos
usados hasta la fecha, por ejemplo, en el tratamiento de
tumores.
Cuando la función directora es proporcionada por
el hVEGFr, la porción citotóxica está sustituida sobre cualquier
dominio del receptor que no participe en la unión del hVEGF;
preferiblemente, la porción se sustituye en lugar de o sobre los
dominios transmembrana y/o citoplásmico. El sitio óptimo de
sustitución se determinará mediante experimentación rutinaria, y se
halla dentro de la formación ordinaria.
Los conjugados que son fusión de proteínas se
construyen fácilmente en cultivos de células recombinantes
expresando un gen que codifica el conjugado. Alternativamente, los
conjugados se construyen entrecruzando de forma covalente el grupo
citotóxico con una cadena lateral de residuo aminoácido o carboxilo
C-terminal del anticuerpo, usando procedimientos
conocidos per se, tales como el intercambio de disulfuro, o
el anclaje a través de un enlace tioéster usando, por ejemplo,
iminotiotato y
metil-4-mercaptobutirimadato.
Los hVEGFr que son antagonistas del hVEGF se
conjugan también con sustancias que podrían no clasificarse
fácilmente como citotoxinas por sus propios méritos, pero que
aumentan la actividad de las composiciones en ésta. Por ejemplo, los
hVEGFr capaces de unirse al hVEGF se fusionan con polipéptidos
heterólogos, tales como secuencias virales, con receptores
celulares, con citoquinas tales como el TNF, interferones, o
interleuquinas, con polipéptidos que tienen actividad
pro-coagulante, y con otros polipéptidos biológica o
inmunológicamente activos. Tales fusiones se realizan fácilmente
mediante procedimientos recombinantes. Típicamente, tales
polipéptidos que no son de inmunoglobulina sustituyen el dominio
transmembrana y/o intracelular de un hVEGFr.
Los dominios unidores del hVEGF en el hVEGFr se
determinan mediante procedimientos conocidos en la técnica,
incluyendo los estudios con rayos X, los análisis de mutaciones, y
los estudios de unión al anticuerpo. Las estrategias de mutaciones
incluyen las técnicas de mutagénesis de saturación aleatoria
acoplada con la selección de mutantes de escape, y la mutagénesis
por inserción. Cunningham, et al., Science
244:1081-1085 (1989). Este procedimiento implica la
identificación de regiones que contienen cadenas laterales de
aminoácidos cargadas. Los residuos cargados en cada región
identificada (es decir, Arg, Asp, His, Lys y Glu) son remplazados
(una región por molécula mutante) con Ala, y se ensaya la unión al
receptor de los ligandos obtenidos, para verificar la importancia de
la región concreta en la unión al receptor. Un potente procedimiento
adicional para la localización de los dominios de unión al receptor
es a través del uso de anticuerpos anti-hVEGF
neutralizantes. Kim et al., Growth Factors 7:53
(1992). Habitualmente se usa una combinación de éstos y similares
procedimientos para localizar los dominios implicados en la unión al
receptor.
Los fragmentos y las variantes de la secuencia de
aminoácidos del hVEGF se preparan fácilmente mediante procedimientos
conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a un sitio
del ADN que codifica el factor nativo. El ADN mutado se inserta en
un vector de expresión apropiado, y a continuación se transfectan
las células huéspedes con el vector recombinante. Las células
huéspedes recombinantes se cultivan en medios de cultivo
apropiados, y el fragmento deseado o la variante de la secuencia de
aminoácidos expresados en las células huéspedes se recuperan
entonces del cultivo de células recombinantes mediante
procedimientos cromatográficos u otros procedimientos de
purificación.
Alternativamente, los fragmentos y variantes de
aminoácidos del hVEGF se preparan in vitro, por ejemplo,
mediante proteolisis del hVEGF nativo, o mediante síntesis usando
procedimientos estándares de síntesis de péptidos en fase sólida,
tal como se describe en Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85:2149
(1963)), aunque podrían usarse otras síntesis químicas equivalentes
conocidas en la técnica. La síntesis en fase sólida se inicia a
partir del extremo C-terminal del péptido, acoplando
un \alpha-aminoácido protegido a una resina
apropiada. Los aminoácidos se acoplan a la cadena peptídica usando
técnicas bien conocidas en el campo para la formación de enlaces
peptídicos.
Para las aplicaciones terapéuticas, los
antagonistas de la invención podrían administrarse a un mamífero,
preferiblemente a un humano, en una forma de dosificación
farmacéuticamente aceptable, incluyendo aquéllas que podrían
administrarse a un humano intravenosamente como un bolo o mediante
infusión continua a lo largo de un período de tiempo, mediante rutas
intramusculares, subcutáneas, intraarticulares, intrasinoviales,
intratecales, orales, tópicas, o de inhalación. Los antagonistas
también se administran convenientemente mediante rutas
intralesionales o perilesionales, para ejercer efectos terapéuticos
locales así como sistémicos.
Tales formas de dosificación abarcan los
portadores farmacéuticamente aceptables que son inherentemente no
tóxicos y no terapéuticos. Los ejemplos de tales portadores incluyen
los intercambiadores de iones, la alúmina, el estearato de aluminio,
la lecitina, las proteínas del suero, tales como la albúmina de
suero humana, las sustancias tamponantes tales como los fosfatos,
glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas parciales de
glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales, o
electrólitos tales como el sulfato de protamina, el fosfato de
hidrógeno disódico, fosfato de hidrógeno potasio, el cloruro sódico,
las sales de zinc, el sílica coloidal, el trisilicato de magnesio,
la polivinilpirrolidona, sustancias basadas en la celulosa, y
polietilenglicol. Los portadores para formas tópicas o basadas en
gel del antagonista incluyen los polisacáridos, tales como la
carboximetilcelulosa de sodio o la metilcelulosa, la
polivinilpirrolidona, los poliacrilatos, los polímeros del bloque
polioxietilén-polioxipropilén, el polietilenglicol,
y los alcoholes de ceras de madera. En todas las administraciones se
usan convenientemente formas de almacenamiento convencionales. Tales
formas incluyen, por ejemplo, las microcápsulas, las nanocápsulas,
los liposomas, los parches, las formas para inhalación, los
aerosoles nasales, y las tabletas sublinguales, y las preparaciones
de liberación continua. El antagonista típicamente se formulará en
tales vehículos en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml
hasta 100 mg/ml.
Los ejemplos apropiados de preparaciones de
liberación continua incluyen las matrices semipermeables de
polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista,
matrices que se hallan en forma de artículos moldeados, por ejemplo,
películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación
continua incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el
poli(2-hidroxietil-metacrilato)
tal como describen Langer et al., J. Biomed. Mater.
Res. 15:167 (1981) y Langer, Chem. Tech.
12:98-105 (1982), o los poli(vinilalcohol),
poliláctidos (patente estadounidense nº 3.773.919), los copolímeros
de ácido L-glutámico y
gamma-etil-L-glutamato
(Sidman et al., Biolpolymers 22:547 (1983), el
etilen-vinil-acetato no degradable
(Langer et al., ver más arriba), los copolímeros degradables
de ácido láctico-ácido glicólico tales como el Lupron Depot^{TM}
(microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido
láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y el ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que los polímeros tales como el
etilen-vinil acetato y el ácido láctico-ácido
glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100
días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de
tiempo más breves. Cuando los antagonistas polipeptídicos
encapsulados permanecen en el cuerpo durante un período prolongado,
podrían desnaturalizarse o agregarse a resultas de la humedad a
37ºC, resultando en la pérdida de actividad biológica y en posibles
cambios en su inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias
racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo
implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de
agregación es la formación de enlaces S-S
intermoleculares a través del intercambio tiodisulfuro, la
estabilización podrían conseguirse modificando los residuos
sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando
el contenido en humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando
composiciones de matriz de polímero específicas.
Las composiciones de liberación continua de
antagonista del hVEGF incluyen también los hVEGFr antagonistas
atrapados liposomalmente. Los liposomas que contienen los
antagonistas se preparan mediante procedimientos conocidos en la
técnica, tales como los descritos por Epstein et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); la
patente estadounidense nº 4.485.045; la patente estadounidense nº
4.544.545. Ordinariamente los liposomas son del tipo unilamelar
pequeño (aproximadamente 200-800 angstroms), en los
cuales el contenido en lípido es superior a aproximadamente el 30
mol. % de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la
óptima terapia HRG. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado
se describen en la patente estadounidense nº 5.013.556.
Otro uso comprende la incorporación de un
antagonista del hVEGF en artículos moldeados. Tales artículos pueden
usarse para modular el crecimiento de las células endoteliales y la
angiogénesis.
Para la prevención y tratamiento de la
enfermedad, la dosis apropiada del antagonista dependerá del tipo de
enfermedad a tratarse, tal como se definió más arriba, la gravedad
del curso de la enfermedad, de si los anticuerpos se administran con
propósito preventivo o terapéutico, de la terapia previa, del
historial clínico del paciente, y de la respuesta al antagonista, y
del criterio del médico responsable. El antagonista se administra
convenientemente al paciente de una vez o a lo largo de una serie de
tratamientos.
La degeneración macular asociada a la edad (AMD)
es una causa principal de pérdida visual grave en la población
anciana. La forma exudativa de la AMD se caracteriza por la
neovascularización coroidal y el desprendimiento del epitelio
retinal pigmentado. Puesto que la neovascularización coroidal está
asociada con un empeoramiento dramático en la prognosis, se espera
que los antagonistas del VEGF de la presente invención sean
especialmente útiles para reducir la gravedad de la ADM.
Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad,
aproximadamente de 1 \mug/kg a 15 mg/kg de antagonistas es una
dosis candidata inicial para su administración a un paciente, sea,
por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o
mediante infusión continua. Una dosis diaria típica podría oscilar
entre desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg o más,
dependiendo de los factores mencionados más arriba. Para
administraciones repetidas a los largo de varios días o más,
dependiendo de la condición, se repite el tratamiento hasta que
ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. No
obstante, podrían ser útiles otros regímenes de dosificación. El
progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas
y ensayos convencionales.
De acuerdo con otra realización de la invención,
la efectividad del antagonista para prevenir o tratar la enfermedad
podría mejorarse administrando el antagonista en serie o en
combinación con otro agentes que es efectivo para esos propósitos,
tal como el factor de necrosis del tumor (TNF), un anticuerpo capaz
de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor de
crecimiento de fibroblastos ácido o básico (FGF) o del factor de
crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o
neutralizar las actividades coagulantes del factor de tejido, de la
proteína C, o de la proteína S (ver Esmon, et al.,
Publicación de Patente PCT nº WO 91/01.753, publicada el 21 de
febrero de 1991), un anticuerpo capaz de unirse al receptor HER2
(ver Hudziak et al., Publicación de Patente PCT nº WO
89/06.692, publicada el 27 de julio de 1989), o uno o más agentes
terapéuticos convencionales, tales como, por ejemplo, los agentes
alquilantes, los antagonistas del ácido fólico, antimetabolitos del
metabolismo de los ácidos nucleicos, antibióticos, análogos de la
pirimidina, el 5-fluorouracilo, el cisplatino, los
nucleósidos de purina, la aminas, los aminoácidos, los triazol
nucleósidos, o los corticoesteroides. Tales otros agentes podrían
estar presentes en la composición que se está administrando, o
podrían administrarse separadamente.
Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo a modo de
ilustración, y no se pretende que limiten la invención en modo
alguno.
(Antecedente)
Para obtener hVEGF conjugado con hemocianina de
lapa con forma de agujero de cerradura (KLH) para la inmunización,
se mezcló hVEGF recombinante (165 aminoácidos), Leung, et
al., Science 246:1306 (1989), con KLH en una proporción
de 4:1 en presencia de 0,05% de glutaraldehído, y se incubó la
mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas, con agitación suave.
A continuación se dializó la mezcla frente a solución salina
tamponada con fosfato (PBS) a 4ºC, durante la noche.
Se inmunizaron ratones BALB/C cuatro veces cada
dos semanas mediante inyecciones intraperitoneales de 5 mg de KLH, y
se inmunizaron secundariamente (boosted) con la misma dosis
de hVEGF conjugado con KLH cuatro días antes de la fusión
celular.
Se fusionaron células del bazo, procedentes de
ratones inmunizados, con células de mieloma P3X63Ag8U.1, Yelton,
et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1 (1978),
usando polietilenglicol (PEG) al 35%, tal como se ha descrito.
Yarmush, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 77:2899
(1980). Los hibridomas se seleccionaron en medio HAT.
Los sobrenadantes procedentes de cultivos
celulares de hibridomas se examinaron en busca de producción de
anticuerpo anti-hVEGF mediante un ensayo ELISA
usando placas de microvaloración recubiertas con hVEGF. El
anticuerpo que estaba unido al hVEGF en cada uno de los pocillos se
determinó usando inmunoglobulina IgG anti-ratón de
cabra conjugada con fosfatasa alcalina, y el sustrato cromogénico
p-nitrofenilfosfato. Harlow y Lane, Antibodies:
A Laboratory Manual, p. 597 (Cold Spring Harbor Laboratory,
1988). Las células de hibridoma identificadas de este modo como
productoras de anticuerpos anti-hVEGF se subclonaron
mediante dilución limitante, y se escogieron dos de esos clones,
denominados A4.6.1 y B2.6.2, para ulteriores estudios.
(Antecedente)
Las especificidades de unión de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF producidos por los
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron mediante ELISA. Los
anticuerpos monoclonales se añadieron a los pocillos de placas de
microvaloración que se habían recubierto previamente con hVEGF, FGF,
HGF o factor de crecimiento epidérmico (EGF). El anticuerpo unido se
detectó con inmunoglobulinas IgG de cabra anti-ratón
conjugadas con peroxidasa. Los resultados de esos ensayos
confirmaron que los anticuerpos monoclonales producidos por los
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen al hVEGF, pero no detectablemente
a ésos otros factores de crecimiento proteicos.
Se usó un ELISA de unión competitiva para
determinar si los anticuerpos monoclonales producidos por los
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen al mismo o diferentes epítopos
(sitios) en el hVEGF. Kim, et al., Infect. Immun.
57:944 (1989). Se añadieron anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF sin marcar (A4.6.1 o B2.6.2), o
anticuerpo anti-HGF irrelevante (isotipo IgG1) a los
pocillos de las placas de microvaloración que previamente se habían
recubierto con hVEGF. Los anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF biotinilados (BIO-A4.6.1
o BIO-B2.6.2) se añadieron a continuación. La
proporción de anticuerpo biotinilado respecto anticuerpo sin marcar
fue de 1:1000. La unión de los anticuerpos biotinilados se visualizó
mediante la adición de avidina conjugada con peroxidasa, seguida
por o-fenilenediamina dihidrocloruro y peróxido de
hidrógeno. El color de la reacción, indicando la cantidad de
anticuerpo biotinilado unido, se determinó midiendo la densidad
óptica (O.D) a una longitud de onda de 495 nm.
Tal como se muestra en la Figura 1, en cada caso,
la unión del anticuerpo anti-hVEGF biotinilado fue
inhibida por el correspondiente anticuerpo sin marcar, pero no por
los otros anticuerpos anti-hVEGF no marcados o por
el anticuerpo anti-HGF. Estos resultados indican que
los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y
B2.6.2 se unen a diferentes epítopos del hVEGF.
Los isotipos de los anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y
B2.6.2 se determinaron mediante ELISA. Se añadieron muestras de
medio de cultivo (sobrenadante), en los cuales estaban creciendo
cada uno de los hibridomas, a los pocillos de placas de
microvaloración que se habían recubierto previamente con hVEGF. Los
anticuerpos monoclonales anti-hVEGF capturados se
incubaron con diferentes inmunoglobulinas de cabra
anti-ratón, conjugadas con fosfatasa alcalina, y
específicas para diferentes isotipos, y la unión de los anticuerpos
conjugados a los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF
se determinó mediante la adición de
p-nitrofenilfosfato. El color de la reacción se
midió a 405 nm con un lector de placas de ELISA.
Mediante ése procedimiento, se determinó que el
isotipo de los anticuerpos monoclonales producidos por ambos
hibridomas, A4.6.1 y B2.6.2, era el IgG1.
Las afinidades por el hVEGF de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF producidos por los
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron mediante un ensayo de
unión competitiva. Se añadió una concentración predeterminada
subóptima de anticuerpo monoclonal a muestras que contenían
20.000-40.000 c.p.m. de
^{125}I-hVEGF (1-2 ng) y varias
cantidades conocidas de hVEGF sin marcar (1-1000
ng). Después de 1 hora a temperatura ambiente, se añadieron 100
\mul de antisuero de cabra anti Ig de ratón
(Pel-Freez, Rogers, AR, EE.UU.), y las mezclas se
incubaron otra hora a temperatura ambiente. Los complejos de
anticuerpo y proteína unida (complejos immunes) se precipitaron
mediante la adición de 500 \mul de polietilenglicol al 6% (PEG,
peso molecular: 8000), a 40ºC, seguida por la centrifugación a
2000xg, durante 20 minutos, a 4ºC. La cantidad de
^{125}I-hVEGF unido al anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF en cada muestra se determinó contando el
material precipitado en un contador gamma.
Las constantes de afinidad se calcularon a partir
de los datos mediante análisis Scatchard. Se calculó que la afinidad
del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por
el hibridoma A4.6.1 era de 1,2 x 10^{9} litros/mol. Se calculó que
la afinidad del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF
producido por el hibridoma B2.6.2 era de 2,5 x 10^{9}
litros/mol.
Se sembraron células endoteliales capilares (ACE)
del córtex adrenal bovino, Ferrara, et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. 84:5773 (1987), a una densidad de 10^{4} células/ml
en placas de 12 multipocillos, y se añadieron 2,5 ng/ml de hVEGF a
cada pocillo en presencia o ausencia de varias concentraciones de
los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos
por los hibridomas A4.6.1 o B2.6.2, o un anticuerpo monoclonal
anti-HGF irrelevante. Después de cultivarlas durante
5 días, las células en cada pocillo se contaron en un contador
Coulter. Como control, se cultivaron células ACE en ausencia de
hVEGF añadido.
Tal como se muestra en la Figura 2, ambos
anticuerpos monoclonales anti-hVEGF inhibieron la
capacidad del hVEGF añadido para apoyar el crecimiento o
supervivencia de las células ACE bovinas. El anticuerpo monoclonal
producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió completamente la actividad
mitogénica del hVEGF (más de aproximadamente el 90% de inhibición),
mientras que el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma
B2.6.2 inhibió sólo parcialmente la actividad mitogénica del
hVEGF.
Se sembraron células ACE bovina a una densidad de
2,5 x 10^{4} células/0,5 ml/pocillo en placas de microvaloración
de 24 pocillos, en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que
contenía un 10% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, y 1 n/ml de
factor de crecimiento de fibroblastos básico. Después de cultivarlas
durante la noche, se lavaron las células una vez en tampón unidor
(iguales volúmenes de DMEM y medio F21 más HEPES 25 mM y 1% de
albúmina de suero bovino) a 4ºC.
Se preincubaron 12.000 c.p.m. de
^{125}I-hVEGF (aprox. 5 x 10^{4} c.p.m./ng/ml)
durante 30 minutos con 5 \mug del anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF producido por los hibridomas A4.6.1,
B2.6.2, o A2.6.1 (250 \mul de volumen total), y a continuación se
añadieron las mezclas a las células ACE bovinas en las placas de
microvaloración. Después de incubar las células durante 3 horas a
4ºC, se lavaron las células 3 veces con tampón unidor a 4ºC, se
solubilizaron mediante la adición de 0,5 ml de NaOH 0,2 N, y se
contaron en un contador gamma.
Tal como se muestra en la Figura 3 (superior),
los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos
por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 inhibieron la unión del hVEGF a
las células ACE bovinas. Por contra, el anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF producido por el hibridoma A2.6.1 no
tenía un efecto evidente sobre la unión del hVEGF a las células ACE
bovinas. De forma consistente con los resultados obtenidos en el
ensayo de proliferación descrito más arriba, el anticuerpo
monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió la unión del
hVEGF con mayor alcance que el anticuerpo monoclonal producido por
el hibridoma B2.6.2.
Tal como se muestra en la Figura 3 (inferior), el
anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió
completamente la unión del hVEGF a las células ACE bovinas en un
proporción molar de 1:250 del hVEGF respecto el anticuerpo.
Para determinar si el anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1
reacciona con las formas de 121 y 189 aminoácidos del hVEGF, se
ensayó la capacidad del anticuerpo para inmunoprecipitar esos
polipéptidos.
Se transfectaron células 293 humanas con vectores
que comprendían la secuencia codificante de nucleótidos de los
polipéptidos de 121 y 189 aminoácidos del hVEGF, tal como se
describió. Leung, et al., Science 246:1306 (1989). Dos
días después de la transfección, se transfirieron las células a
medio que carecía de cisteína y metionina. Se incubaron las células
30 minutos en cada medio, a continuación se añadieron al medio 100
\muCi/ml de cada una de ^{35}S-metionina y
^{35}S-cisteína, y se incubaron las células otras
dos horas. El marcaje se capturó transfiriendo las células a medio
carente de suero e incubándolas durante tres horas. Se recolectaron
los medios de cultivos de las células, y las células se lisaron
incubándolas durante 30 minutos en tampón de lisis (NaCl 150 mM, 1%
de NP40, 0,5% de deoxicolato, 0,1% de sodio dodecil sulfato (SDS),
Tris 50 mM, pH 8,0). Los restos celulares se retiraron de los
lisados mediante centrifugación a 200 xg durante 30 minutos.
Se incubaron 500 \mul de las muestras de medios
de cultivo de las células y lisados de las células con 2 \mul del
anticuerpo del hibridoma A4.6.1 (2,4 mg/ml) durante 1 hora, a 4ºC, y
a continuación se incubaron con 5 \mul de inmunoglobulina IgG
anti-ratón de conejo durante 1 hora, a 4ºC. Los
complejos inmunes de hVEGF marcado con ^{35}S y anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF se precipitaron con proteína
A-Sepharose (Pharmacia), entonces se sometieron a
electroforesis el gel de poliacrilamida-SDS al 12%
en condiciones reductoras. Se expuso el gel a una película de rayos
X para el análisis mediante autorradiografía de las proteínas
marcadas radiactivamente e inmunoprecipitadas.
Los resultados de ese análisis indicaron que el
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el
hibridoma A4.6.1 reaccionaba de forma cruzada con ambas, las formas
de 121 y 189 aminoácidos del hVEGF.
Las secuencias de nucleótidos y codificante de
aminoácido del receptor flt del hVEGF se descubren en Shibuya
et al., Oncogene 5:519-524 (1990). La
secuencia codificante del dominio extracelular del receptor
flt del hVEGF se fusionó a la secuencia codificante de la
cadena pesada de la IgG1 humana en un proceso de dos pasos.
Se usó la mutagénesis dirigida a un sitio para
introducir un sitio de restricción BstBI en ADN que codificaba el
flt en un sitio 5' respecto el codón para el aminoácido 759
del flt, y para convertir el único sitio de restricción
BstEII en el plásmido pBSSK-FC, Bennet et
al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067
(1991), en un sitio BstBI. El plásmido modificado se digirió con con
EcoRI y BsTBI, y el gran fragmento de ADN de plásmido resultante se
ligó junto con un fragmento EcoRI-BstBI del ADN del
flt que codificaba el dominio extracelular (aminoácidos
1-758) del receptor flt del hVEGF.
La construcción resultante se digirió con ClaI y
NotI para generar un fragmento de aproximadamente 3,3 kb, el cual se
insertó a continuación en el sitio de clonación múltiple del vector
de expresión en mamíferos pHEBO2 (Leung et al., Neuron
8:1045 (1992)) mediante ligación. Los extremos del fragmento de 3,3
kb se modificaron, por ejemplo, mediante la adición de conectores,
para obtener la inserción del fragmento en el vector en la
orientación correcta para su expresión.
Se transfectaron células huésped de mamíferos
(por ejemplo, las células CEN4 (Leung et al., ver más
arriba)) con el plásmido pHEBO2, que contenía el inserto del
flt, mediante electroporación. Las células transfectadas se
cultivaron en medio que contenía aproximadamente un 10% de suero
fetal bovino, glutamina 2 mM, y antibióticos, y a aproximadamente el
75% de confluencia se transfirieron a medio carente de suero. El
medio se condicionó durante 3-4 días antes de
recogerlo, y la proteína de fusión flt-IgG se purifico a
partir del medio condicionado mediante cromatografía sobre una
matriz de proteína A-Sepharose, esencialmente tal
como se describe en Bennett et al., J. Biol. Chem.
266:23060-23067 (1991).
(Antecedente)
Se ensayó mediante ELISA la producción de hVEGF
en varias líneas celulares tumorales creciendo en cultivo. Se halló
que las líneas celulares tumorales de ovario, pulmón, colon,
gástricas, de mama y de cerebro producían hVEGF. Tres líneas
celulares que producen el hVEGF, la NEG 55 (línea celular de glioma
humano, obtenida del Dr. M. Westphal, Departamento de Neurocirugía,
University Hospital Eppendor, Hamburgo, Alemania, también denominada
G55), la A-673 (línea celular de rabdomiosarcoma
humano, obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC),
Rockville, Maryland, EE.UU., 28052, como línea celular con nº de CRL
1598), y la SK-LMS-1 (línea celular
de leiomiosarcoma, obtenida de la ATCC como la línea celular número
HTB 88), se usaron para estudios adicionales.
Se inyectaron subcutáneamente de seis a diez
ratones inmunodeprimidos (nude) (Charles River Laboratory,
Wilmington, Massachusetts, EE.UU.) con 1-5 x
10^{6} células tumorales en 100-200 \mul de PBS.
En diversos instantes, una vez se había establecido el crecimiento
tumor, se inyectaron los ratones intraperitonealmente, una o dos
veces por semana, con varias dosis de anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF A4.6.1, un anticuerpo monoclonal
anti-gp120 irrelevante (5B6), o PBS. El tamaño del
tumor se midió cada semana, y a la conclusión del estudio los
tumores se extrajeron y pesaron.
El efecto de varias cantidades del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento de
los tumores de NEG 55 en ratones se muestra en las Figuras 4 y 5. La
Figura 4 muestra que los ratones tratados con 25 \mug ó 100 \mug
de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1,
empezando una semana después de la inoculación de células NEG 55,
tenían una tasa de crecimiento del tumor sustancialmente reducida en
comparación con los ratones tratados, bien con el anticuerpo
irrelevante o con PBS. La Figura 5 muestra que cinco semanas después
de la inoculación de las células NEG 55, el tamaño de los tumores en
los ratones tratados con el anticuerpo anti-hVEGF
A4.6.1 eran aproximadamente del 50% (en el caso de los ratones
tratados con dosis de 25 \mug del anticuerpo) al 85% (en el caso
de los ratones tratados con dosis de 100 \mug del anticuerpo)
menores que el tamaño de los tumores en ratones tratados con el
anticuerpo irrelevante o con PBS.
El efecto del tratamiento con el anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento de
los tumores de SK-LMS-1 en ratones
se muestra en la Figura 6. Cinco semanas después de la inoculación
de la células SK-LMS-1, el tamaño
promedio de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo
anti-hVEGF A4.6.1 era aproximadamente un 75%
inferior respecto los tamaños de los tumores en ratones tratados con
anticuerpo irrelevante o PBS.
El efecto del tratamiento con anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento de
tumores de A673 en ratones se muestra en la Figura 7. Cuatro semanas
después de la inoculación de las células A673, el tamaño promedio de
los tumores en ratones tratados con el anticuerpo
anti-hVEGF A4.6.1 era aproximadamente del 60% (en el
caso de los ratones tratados con dosis de 10 \mug del anticuerpo)
a más del 90% (en el caso de los ratones tratados con dosis de
50-400 \mug del anticuerpo) inferiores al tamaño
de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo irrelevante o
PBS.
(Antecedente)
Las células de glioblastoma humano NEG55 o las
células de rabdomiosarcoma A673 se sembraron a una densidad de 7 x
10^{3} células/ml en placas multipocillos (12 pocillos/placa), en
medio F12/DMEM que contenían un 10% de suero fetal bovino, glutamina
2 mM, 7y antibióticos. A continuación se añadió el anticuerpo
anti-hVEGF A4.6.1 a los cultivos celulares hasta
una concentración final de 0-20,0 \mug de
anticuerpo/ml. Transcurridos cinco días, las células que crecían en
los pocillos se disociaron mediante exposición a tripsina, y se
contaron en un contador Coulter.
Las Figuras 8 y 9 muestran los resultados de esos
estudios. Como es evidente, el anticuerpo anti-hVEGF
A4.6.1 no tuvo ningún efecto significativo sobre el crecimiento de
las células NEG55 y A673 en cultivo. Estos resultados indican que el
anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 no es citotóxico, y
sugieren con fuerza que los efectos antitumorales del anticuerpo
observados se deben a su inhibición de la neovascularización mediada
por el VEGF.
(Antecedente)
La quimiotaxis de las células endoteliales, y de
otras células, incluyendo los monocitos y linfocitos, juega un papel
importante en la patogénesis de la artritis reumatoide. La migración
y proliferación de las células endoteliales acompañan la
angiogénesis que ocurre en el sinovio reumatoide. El tejido
vascularizado (pannus) invade y destruye el cartílago
articular.
Para determinar si los antagonistas del hVEGF
interfieren con este proceso, ensayamos el efecto del anticuerpo
anti-hVEGF A4.6.1 sobre la quimiotaxis de células
endoteliales estimuladas, mediante fluido sinovial procedente de
pacientes que tienen la artritis reumatoide. Como control, ensayamos
el efecto del anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 sobre la
quimiotaxis de células endoteliales estimuladas mediante fluido
sinovial procedente de paciente que tienen osteoartritis (la
angiogénesis que ocurre en la artritis reumatoide no ocurre en la
osteoartritis).
La quimiotaxis de las células endoteliales se
ensayó usando cámaras de Boyden modificadas de acuerdo con
procedimientos establecidos. Thompson et al., Cancer
Res. 51:2670 (1991); Phillips et al., Proc. Exp. Biol.
Med. 197:458 (1991). Aproximadamente 10^{4} células
endoteliales de la vena umbilical humana se dejaron adherir a
filtros recubiertos de gelatina (tamaño de poro de 0,8 micrones), en
microcámaras multipocillos de 48 pocillos, en medio de cultivo que
contenía un 0,1% de suero fetal bovino. Transcurridas
aproximadamente dos horas, se invirtieron las cámaras y se añadieron
a los pocillos muestras de ensayo (fluido sinovial de artritis
reumatoide, fluido sinovial de osteoartritis, FGF básico (bFGF)
(hasta una concentración final de 1 \mug/ml), o PBS) y anticuerpo
anti-hVEGF A4.6.1 (hasta una concentración final de
10 \mug/ml). Después de dos a cuatro horas, se tiñeron y contaron
las células que habían migrado.
La Figura 10 muestra los resultados promedio de
esos estudios. Los valores mostrados en la columna marcada "Fluido
Sinovial", y los mostrados al final de la página para los
controles, son el número promedio de células endoteliales que
migraron en presencia de fluido sinovial, bFGF, o PBS solo. Los
valores en la columna marcada "Fluido Sinovial + mAB VEGF" son
el número promedio de células endoteliales que migraron en presencia
de fluido sinovial más anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1
añadido. Los valores en la columna marcada "% de Supresión"
indican el porcentaje de reducción en la migración de células
endoteliales, inducida por el fluido sinovial, que resulta de la
adición del anticuerpo anti-hVEGF. Tal como se
indica, el anticuerpo anti-hVEGF inhibió
significativamente la capacidad del fluido sinovial de la artritis
reumatoide (53,40 porcentaje promedio de inhibición), pero no la del
fluido sinovial de la osteoartritis (13,64 porcentaje promedio de
inhibición), para inducir la migración de células endoteliales.
Claims (10)
1. Uso de un antagonista del hVEGF en la
preparación de un medicamento para el tratamiento de la degeneración
macular asociada a la edad en un paciente humano, en donde el
antagonista del hVEGF comprende la secuencia de aminoácidos del
dominio extracelular de un hVEGFr.
2. Uso acorde con la reivindicación 1, en donde
el hVEGFr es el receptor flt o el receptor flk-1
(también denominado como KDR).
3. Uso acorde con la reivindicación 1 o
reivindicación 2, en donde los dominios transmembrana y citoplásmico
del hVEGFr están suprimidos.
4. Uso acorde con cualquier reivindicación 1
precedente, en donde el antagonista del hVEGF es una proteína de
fusión que comprende además un polímero o polipéptido que no es del
hVEGFr.
5. Uso acorde con la reivindicación 4, en donde
el polipéptido que no es del hVEGFr es una inmunoglobulina.
6. Uso acorde con la reivindicación 5, en donde
el dominio extracelular del hVEGFr se sustituye con el dominio Fv de
una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina.
7. Uso acorde con la reivindicación 6, en donde
el dominio Fv procede de una cadena pesada de inmunoglobulina.
8. Uso acorde con la reivindicación 7, en donde
el extremo C-terminal del dominio extracelular del
receptor está unido covalentemente al extremo
amino-terminal del C_{H}1, bisagra, C_{H}2 de
la cadena pesada.
9. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en
donde el hVEGFr está conjugado a un polímero no proteico.
10. Uso acorde con la reivindicación 9, en donde
el polímero no proteico es polietilenglicol.
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