ES2599412T3 - Disminución del nivel de lactato y aumento de la producción de polipéptidos regulando por disminución la expresión de la lactato deshidrogenasa y de la piruvato deshidrogenasa quinasa - Google Patents

Disminución del nivel de lactato y aumento de la producción de polipéptidos regulando por disminución la expresión de la lactato deshidrogenasa y de la piruvato deshidrogenasa quinasa Download PDF

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Abstract

Un método de reducción de la producción de lactato en células cultivadas, comprendiendo el método cultivar células que comprenden una primera secuencia de ácidos nucleicos heteróloga que codifica un ARN interferente pequeño (ARNip) específico para una lactato deshidrogenasa (LDH) y una segunda secuencia de ácidos nucleicos heteróloga que codifica un ARNip específico para una piruvato deshidrogenasa quinasa (PDHK), en el que la primera secuencia de ácidos nucleicos heteróloga está unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de ácidos nucleicos heteróloga está unida operativamente a un segundo promotor, en el que los ARNip silencian o regulan por disminución la transcripción génica de la LDH y la PDHK.

Description

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DESCRIPCION
Disminucion del nivel de lactato y aumento de la produccion de polipeptidos regulando por disminucion la expresion de la lactato deshidrogenasa y de la piruvato deshidrogenasa quinasa
Referencia cruzada con solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad a la solicitud de patente provisional de EE.UU. N.° 61/349.727 presentada el 28 de mayo de 2010.
Campo de la invencion
El campo de la presente invencion se refiere generalmente a metodos y composiciones para reducir la produccion de lactato y aumentar la produccion de polipeptidos en celulas cultivadas.
Antecedentes de la invencion
El mercado biofarmaceutico esta creciendo rapidamente y la industria esta proyectada para alcanzar 70 billones de dolares en el ano 2010. Vease Genetic Engineering in Livestock: New Applications and Interdisciplinary Perspectives (Engelhard et al., 2009) Springer Berlin Heidelberg. Dado el aumento en la demanda de protemas terapeuticas y el aumento de competidores en el reparto de mercados entre empresas, existe una necesidad de mejorar las tecnologfas para lograr mejor productividad en protemas terapeuticas. Hacia este objetivo se han explorado diferentes enfoques, tales como ingeniena de celulas huesped. Vease Kuystermans et al., Cytotechnology 53(1-3):3- 22 (2007); y O'Callaghan and James, Brief Funct. Genomic Proteomic 7(2):95-110 (2008). Se usan ampliamente celulas cultivadas, tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO), para producir protemas terapeuticas. Por ejemplo, se ha usado ampliamente cultivo en biorreactor de lotes alimentados de pH controlado para producir anticuerpos monoclonales recombinantes. Langheinrich y Nienow, Biotechnol. Bioeng. 66(3):171-9 (1999). El lactato es uno de los principales productos residuales acumulados durante los cultivos de lotes alimentados y se ha mostrado la inhibicion del crecimiento celular y la produccion de protemas. Vease Glacken et al., Biotechnol. Bioeng. 32:491-506 (1988); y Lao y Toth, Biotechnol. Prog. 13:688-691 (1997). Esto conduce a su vez a un aumento en la cantidad de alcali que se necesita anadir al medio de cultivo para controlar el pH. Dietl et al., J. Immunol. 184(3):1200-9 (2010); Langheinrich y Nienow, Biotechnol. Bioeng, 66(3):171-9 (1999). La elevada adicion de alcali al medio de cultivo celular para mantener el pH puede producir un aumento en la osmolalidad y este aumento puede conducir a la inhibicion del crecimiento celular y la disminucion de la productividad de anticuerpos. Cruz et al., Enzyme Microb. Technol. 27(1-2):43-52 (2000); Iran et al., Biotechnol. Bioeng. 66:238-246 (1999). Por lo tanto, se desea reducir el nivel de lactato para el desarrollo de polipeptido o un proceso de produccion de anticuerpos de tftulo mas alto.
Hay muchos factores que pueden influir en la produccion de lactato en cultivo celular, tales como controlar el nivel de piruvato. Vease Liu et al., J. Biol. Chem., 284(5):2811-22 (2009); y Samuvel et al., J. de Immunol. 182(4):2476-84 (2009). El piruvato es el sustrato para las enzimas piruvato deshidrogenasa (PDH) y lactato deshidrogenasa (LDH).
El complejo PDH es una unidad multi-enzimatica que consiste en tres enzimas catalfticas, E1, E2 y E3. Patel y Korotchkina, Exp. Mol. Med. 33(4):191-7 (2001). Este complejo cataliza la reaccion de conversion limitante de la velocidad en la conversion de piruvato a acetil-CoA, que es el punto de entrada del ciclo del acido tricarboxflico (TCA). La actividad de PDH esta regulada por las enzimas piruvato deshidrogenasa quinasas (PDHK(s)) y piruvato deshidrogenasa fosfatasas (PDHPs). Las PDHK fosforilan PDH para suprimir su actividad enzimatica, mientras que las PDHP desfosforilan y asf activan PDH. Veanse Patel y Korotchkina, Exp. Mol. Med. 33(4):191-7 (2001); Roche y Hiromasa, Cell Mol. Life Sci. 64(7-8):830-49 (2007); Holness and Sugden, Biochemical Society Transactions, 31:1143-1151 (2003). Hay cuatro isotipos de PDHK en celulas de mamffero (PDHK1, PDHK2, PDHK3 y PDHK4) con distribuciones espedficas de tejido. Veanse Harris et al., Adv. Enzyme Regul. 42:249-59 (2002); y Bowker-Kinley et al., Biochem. J. 329(1):191-6 (1998).
La LDH cataliza directamente la interconversion de piruvato y lactato con interconversion simultanea de NADH y NAD+. En celulas de mairnfero, las LDH existen bien como homo- o bien como heterotetrameros que consisten principalmente en subunidades A y B (o subunidades H y M, respectivamente) codificadas por genes LDHa y LDHb y algunas veces homotetrameros de la subunidad C codificada por genes LDHc. Vease Baumgart et al., J. Biol. Chem. 271(7):3846-55 (1996); Li et al., J. Biol. Chem. 258(11):7029-32 (1983); Skory C.D., Appl. Environ. Microbiol. 66(6):2343-8 (2000); y Read et al., Proteins 43(2):175-185 (2001). Por ejemplo, en celulas CHO, se ha mostrado que los isotipos de LDH son productos intermedios del tetramero A3B y A2B2. Jeong et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 289(5):1141-9 (2001). Estudios previos han mostrado que regular por disminucion LDHa en celulas CHO alterando el gen mediante recombinacion homologa (Chen et al., Biotechnol. Bioeng. 72(1):55-61 (2001)), tecnologfa antisentido (Jeong et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 289(5):1141-9 (2001)) o ARN interferente pequeno o corto (ARNip) (Kim y Lee, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74(1):152-9 (2007)) puede reducir el nivel de lactato, pero no logro una mejora apreciable en la productividad de protema. Por ejemplo, en el caso de ARNip espedfico de LDHa, aun cuando hubo una supuesta reduccion del 45-79 % en el nivel de lactato, no hubo mejora significativa en la
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productividad espedfica (Qp) y el tftulo de producto (anticuerpo), sugiriendo que la inactivacion de LDHa sola en celulas CHO no es suficiente para mejorar Qp y el rendimiento de producto eficazmente. As^ se necesitan metodos mas eficientes para reducir la produccion de lactato para lograr una mejor produccion terapeutica de polipeptidos.
El documento WO 02/04598 desvela anadir inhibidores qmmicos de piruvato quinasas a medios de cultivo celular para reducir la produccion de lactato.
Breve sumario de la invencion
La presente invencion proporciona metodos y composiciones para reducir la produccion de lactato y aumentar la produccion de polipeptidos en celulas cultivadas. Los inventores han descubierto que la regulacion por disminucion simultanea de una LDH y de las PDHK mediante los ARNip en celulas cultivadas que expresan polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) disminuyo el nivel de lactato, la velocidad de produccion de lactato y la osmolalidad y aumento la productividad espedfica de polipeptidos (por ejemplo, productividad espedfica) y la produccion de polipeptidos (por ejemplo, productividad). Ademas, estas celulas cultivadas con LDH y las PDHK reguladas por disminucion no presentaron impacto negativo sobre el crecimiento celular, viabilidades celulares y la calidad de los polipeptidos producidos.
En un aspecto, la invencion proporciona un metodo de reduccion de la produccion de lactato en celulas cultivadas, comprendiendo el metodo cultivar celulas que expresan a) un ARN interferente pequeno (ARNip) espedfico para una lactato deshidrogenasa (LDH) y b) un ARNip espedfico para una piruvato deshidrogenasa quinasa (PDHK).
En otro aspecto, la invencion proporciona celulas en cultivo que comprenden a) un ARNip espedfico para una LDH y un ARNip espedfico para una PDHK.
En algunas realizaciones, las celulas cultivadas expresan adicionalmente un ARNip espedfico para una segunda PDHK. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas expresan adicionalmente un ARNip espedfico para una tercera PDHK. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas expresan adicionalmente un ARNip espedfico para una cuarta PDHK.
En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo de reduccion de la produccion de lactato en celulas cultivadas, comprendiendo el metodo cultivar celulas que comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARN interferente pequeno (ARNip) espedfico para una lactato deshidrogenasa (LDH) y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una piruvato deshidrogenasa quinasa (PDHK), en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor.
En otro aspecto, la invencion proporciona celulas en cultivo que comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un primer ARNip espedfico para una LDH y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un segundo ARNip espedfico para una PDHK, en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor.
En algunas realizaciones, las celulas comprenden ademas una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una segunda PDHK y en las que la tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un tercer promotor. En algunas realizaciones, las celulas comprenden ademas una cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una tercera PDHK y en las que la cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un cuarto promotor. En algunas realizaciones, las celulas comprenden ademas una quinta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una quinta PDHK y en las que la quinta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un quinto promotor.
En algunas realizaciones, la LDH es LDHa, LDHb, o LDHc.
En algunas realizaciones, la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1, PDHK2, PDHK3 y PDHK4. En algunas realizaciones, la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1, PDHK2 y PDHK3. En algunas realizaciones, la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1 y PDHK2. En algunas realizaciones, la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1 y PDHK3. En algunas realizaciones, la PDHK se selecciona del grupo que consiste en pDhK2 y PDHK3.
En algunas realizaciones, el metodo de reduccion de la produccion de lactato en celulas cultivadas comprende cultivar celulas que comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una lactato deshidrogenasa (LDH) y una segunda, tercera y cuarta secuencias de acidos nucleicos heterologas que codifican tres ARNip diferentes espedficos para una primera, segunda y tercera PDHK, en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la
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segunda, tercera y cuarta secuencias de acidos nucleicos heterologas estan unidas operativamente a un segundo, tercero y cuarto promotores, respectivamente. En algunas realizaciones, la LDH es LDHa, en la que la primera PDHK es PDHK1, la segunda PDHK es PDHK2 y la tercera PDHK es PDHK3.
En algunas realizaciones, las celulas en cultivo comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un primer ARNip espedfico para una LDH y una segunda, tercera y cuarta secuencias de acidos nucleicos heterologas que codifican tres ARNip diferentes espedficos para una primera, segunda y tercera PDHK, en la que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en la que la segunda, tercera y cuarta secuencias de acidos nucleicos heterologas estan unidas operativamente a un segundo, tercero y cuarto promotores, respectivamente. En algunas realizaciones, la LDH es LDHa, en la que la primera PDHK es PDHK1, la segunda PDHK es PDHK2 y la tercera PDHK es PDHK3.
En algunas realizaciones, las celulas cultivadas producen un polipeptido heterologo. En algunas realizaciones, el polipeptido heterologo es un anticuerpo.
En algunas realizaciones, la velocidad de smtesis de lactato de las celulas cultivadas es inferior a la velocidad de consumo de lactato. En algunas realizaciones, la tasa promedio de produccion de lactato es inferior a un valor negativo de aproximadamente 0,02 mg/106 celulas/dfa.
En algunas realizaciones, las celulas cultivadas que contienen ARNip espedficos para la LDH y las PDHK tienen una osmolalidad inferior a aproximadamente 300 mOsm.
En algunos aspectos de la divulgacion, las celulas cultivadas tienen una productividad espedfica (Qp) de al menos aproximadamente el 75 % superior a las celulas cultivadas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que comprende una o mas PDHK y la LDH.
En algunas realizaciones, las celulas cultivadas tienen una productividad espedfica (Qp) de al menos aproximadamente el 75 % superior a las celulas cultivadas sin los ARNip espedficos para la LDH y las PDHK.
En algunos aspectos de la divulgacion, las celulas cultivadas tienen una productividad de polipeptidos (por ejemplo, productividad o tttulo de anticuerpos en g/l) superior de aproximadamente 10% a aproximadamente 800 % en comparacion con las celulas cultivadas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que comprende una o mas PDHK y la LDH. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas tienen una productividad de polipeptidos superior de aproximadamente 55 % en comparacion con las celulas cultivadas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que comprende una o mas PDHK y la LDH. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas tienen una productividad de polipeptidos superior de al menos aproximadamente 68 % en comparacion con las celulas cultivadas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que comprende una o mas PDHKy la LDH.
En algunas realizaciones, las celulas cultivadas tienen una productividad de polipeptidos superior de aproximadamente 10% a aproximadamente 800 % en comparacion con las celulas cultivadas sin los ARNip espedficos para una o mas PDHK y la LDH. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas tienen una productividad de polipeptidos superior de aproximadamente 55 % en comparacion con las celulas cultivadas sin los ARNip espedficos para una o mas PDHK y la LDH. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas tienen una productividad de polipeptidos superior de al menos aproximadamente 68 % en comparacion con las celulas cultivadas sin los ARNip espedficos para una o mas PDHK y la LDH.
En algunas realizaciones, las celulas cultivadas son celulas de mairnfero. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas son celulas no de marnffero.
En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo de silenciamiento o regulacion por disminucion de la transcripcion de LDH y PDHK en una celula cultivada que comprende: introducir en la celula un vector que comprende una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para la LDH y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para la PDHK, en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor, en la que los ARNip se expresan, silenciando o regulando asf por disminucion la transcripcion genica de la LDH y la PDHK.
En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo de produccion de una celula que presenta produccion de lactato reducida en cultivo, que comprende introducir en la celula un vector que comprende una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para la LDH y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para la PDHK, en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor.
En otro aspecto, la invencion proporciona un vector que comprende una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARN interferente pequeno (ARNip) espedfico para una lactato deshidrogenasa (LDH) y
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una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una piruvato deshidrogenasa quinasa (PDHK), en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra construccion de ARNip que se dirige a LDHa/PDHK1, 2, 3. ARNip que se dirigen a LDHa, PDHK1, PDHK2 y PDHK3 se clonaron en un unico vector de higromicina pSilencer 3.1. La secuencia de direccionamiento para LDHa estuvo bajo la regulacion del promotor U6 mientras que los ARNip para PDHK1, 2 y 3 estuvieron bajo la regulacion del promotor H1.
La Figura 2 muestra niveles de expresion relativa de ARNm de LDHa, PDHK1, 2 y 3 en 12 clones de ARNip seleccionados (como se muestra en color gris claro). Los niveles de expresion de LDHa y de las PDHK se normalizaron al gen de mantenimiento b-microglobulina. Se mostraron los niveles de expresion promedio de ARNm de 12 clones de control en color gris oscuro.
La Figura 3 muestra perfiles de lactato, velocidades promedio de produccion de lactato y valores de pH del dfa 14 en la evaluacion de matraz oscilante de lotes alimentados. Las concentraciones de lactato se midieron usando el analizador Nova en el dfa 3, 7, 10 y 14 durante una evaluacion de matraz oscilante de 14 dfas. 3A). Perfil de lactato de clones de control (gris oscuro) y de ARNip (gris claro); 3B). Velocidad promedio de produccion de lactato entre los dfas 3 y 14 (mg/106 celulas/dfa); y 3C). Valores de pH del dfa 14. Los experimentos en matraz oscilante de lotes alimentados se realizaron 3 veces y los datos mostrados son de 1 experimento.
La Figura 4 muestra los perfiles del tttulo, productividad espedfica (Qp) y crecimiento celular en la evaluacion en matraz oscilante de lotes alimentados. 4A). Tftulo del dfa 14 (productividad) en g/l; 4B). Productividad espedfica en pg/celula/dfa; y 4C). Medida del crecimiento celular por cifra de celulas viables integradas (IVCC) en 100 millones de celulas por dfa por litro. Los clones de control estan en gris oscuro y los clones de ARNip estan en gris claro.
La Figura 5 muestra el perfil de lactato, velocidad promedio de produccion de lactato y perfil de osmolalidad en evaluaciones en biorreactor de 2 l. 5A). Perfil de lactato; 5B). Velocidades promedio de produccion de lactato; y 5C). Perfil de osmolalidad.
La Figura 6 muestra el perfil de productividad de celulas cultivadas que contienen clones de ARNip, de control o parentales en la evaluacion en biorreactor de 2 l.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona metodos y composiciones para reducir la produccion de lactato y aumentar la produccion de polipeptidos en celulas cultivadas. Los inventores han descubierto que la regulacion por disminucion simultanea de una lDh y de las PDHK mediante ARNip por un proceso conocido como interferencia por ARN (iARN) en celulas cultivadas que expresan polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) disminuyo el nivel de lactato, la velocidad de produccion de lactato y la osmolalidad celular y aumento la productividad espedfica de polipeptidos (por ejemplo, productividad espedfica) y produccion de polipeptidos (por ejemplo, productividad). Ademas, estas celulas cultivadas con LDH y con las PDHK reguladas por disminucion no presentaron impacto negativo sobre el crecimiento celular, las viabilidades celulares y la calidad de polipeptidos producidos. Asf, sin desear cenirse a teona alguna, la disminucion de la conversion de piruvato-lactato por inactivacion de la expresion de una LDH y la promocion de piruvato en el ciclo del acido tricarboxflico (ciclo de TCA o de Krebs) por inactivacion de la expresion de una o mas PDHK puede crear un efecto sinergico en la reduccion de lactato y proporcionar celulas con mas energfa y productos intermedios metabolicos. Estos efectos pueden conducir a su vez al aumento de la produccion de polipeptidos (por ejemplo, anticuerpo) en celulas cultivadas.
Por consiguiente, en un aspecto de la invencion, se proporciona un metodo de reduccion de la produccion de lactato en celulas cultivadas, que comprende cultivar celulas que expresan a) un ARNip espedfico para una LDH y b) un ARNip espedfico para una PDHK.
En otro aspecto, se proporcionan celulas en cultivo que comprenden a) un ARNip espedfico para una LDH y un ARNip espedfico para una PDHK.
En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo de reduccion de la produccion de lactato en celulas cultivadas, que comprende cultivar celulas que comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una LDH y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una PDHK, en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor.
En otro aspecto mas, la invencion proporciona celulas en cultivo que comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un primer ARNip espedfico para una LDH y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un segundo ARNip espedfico para una PDHK, en el que la primera secuencia de
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acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor.
La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologfa molecular (incluyendo tecnicas recombinantes), microbiolog^a, biolog^a celular, bioqmmica e inmunolog^a, que estan dentro de la experiencia de la materia. Tales tecnicas se explican completamente en la bibliograffa, tales como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
Definiciones
Como se usa en el presente documento, el termino “celulas en cultivo” o “celulas cultivadas” se refiere a dos o mas celulas en una solucion (por ejemplo, un medio celular) que permite que las celulas experimenten una o mas divisiones celulares.
El termino “polinucleotido” o “acido nucleico”, como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a polfmeros de nucleotidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleotidos pueden ser desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos, nucleotidos o bases modificados y/o sus analogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polfmero por ADN o ARN polimerasa. Un polinucleotido puede comprender nucleotidos modificados tales como nucleotidos metilados y sus analogos. Si esta presente, la modificacion a la estructura del nucleotido puede conferirse antes o despues del ensamblaje del polfmero. La secuencia de nucleotidos puede interrumpirse por componentes de no nucleotido. Un polinucleotido puede modificarse adicionalmente despues de la polimerizacion, tal como por conjugacion con un componente de marca. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, “tapas”, sustitucion de uno o mas de los nucleotidos que existen de forma natural con un analogo, modificaciones de internucleotidos tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriesteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen restos laterales tales como, por ejemplo, protemas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, peptidos senal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, acidos nucleicos alfa-anomericos, etc.), ademas de formas sin modificar del (de los) polinucleotido(s). Ademas, cualquiera de los grupos hidroxilo generalmente presente en los azucares puede sustituirse, por ejemplo, con grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse por grupos protectores convencionales o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleotidos adicionales, o pueden conjugarse con soportes solidos. Los OH del extremo 5' y 3' pueden fosforilarse o sustituirse con aminas o restos de grupos de terminacion organicos de 1 a 20 atomos de carbono. Otros hidroxilos tambien pueden derivatizarse a grupos protectores convencionales. Los polinucleotidos tambien pueden contener formas analogas de azucares de ribosa o desoxirribosa que generalmente son conocidos en la tecnica que incluyen, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, analogos de azucares carbodclicos, azucares alfa- anomericos, azucares epimericos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azucares de piranosa, azucares de furanosa, sedoheptulosas, analogos adclicos y analogos de nucleosidos abasicos tales como metilrribosido. Uno o mas enlaces fosfodiester pueden sustituirse con grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, realizaciones en las que el fosfato esta sustituido con P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), (O)NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OR', cO o CH2 (“formacetal”), en las que cada R o R' es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o sin sustituir que opcionalmente contiene un enlace eter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleotido necesitan ser identicos. La descripcion precedente se aplica a todos los polinucleotidos citados en el presente documento, que incluyen ARN y AdN.
El termino “interferencia por ARN (iARN)” se refiere al proceso de silenciamiento genico transcripcional espedfico de secuencia (por ejemplo, silenciamiento genico post-transcripcional) mediado o iniciado por ARNip. Sin desear cenirse a teona alguna, durante la iARN, en la practica de los metodos de la invencion, el ARNip puede inducir la degradacion de ARNm diana con la posterior inhibicion espedfica de secuencia de la expresion genica de una LDH y una o mas PDHK.
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El termino “acido nucleico heterologo” o “polipeptido heterologo” se refiere a un acido nucleico o un polipeptido cuya secuencia no es identica a la de otro acido nucleico o polipeptido naturalmente encontrado en la misma celula huesped.
El termino “ARN interferente pequeno”, “ARN interferente corto” o “ARNip” se refiere a un duplex de ARN de nucleotidos, o, en algunos aspectos alternativos, una molecula de ARN individual que se dirige a un acido nucleico de interes, por ejemplo, una LDH o PDHK(s). Los ARNip comprenden una hebra de ARN sentido y una hebra de ARN antisentido complementaria hibridadas juntas por interacciones de apareamiento de bases de Watson-Crick convencionales. El ARNip puede tanto transfectarse directamente como producirse de otro modo en una celula cultivada.
En una variacion, la hebra de ARN sentido y la hebra de ARN antisentido complementaria se enlazan por un espaciador que conduce a la expresion de una estructura de tallo-bucle o de horquilla llamado ARN de horquilla pequena (ARNhp). La horquilla se escinde entonces por una endonucleasa (por ejemplo, Dicer) para generar un ARNip. En otra variacion, el ARNhp es un ARNhp bi-funcional que consiste en dos estructuras de tallo-bucle, con una estructura de tallo-bucle compuesta de secuencia completamente apareada que grna al duplex de ARN para la degradacion de ARNm mediante carga de RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN) dependiente de escision y con la segunda estructura de tallo-bucle compuesta de hebra de desapareamiento del ARNm mediante secuestro de ARNm mediante carga de RISC independiente de escision.
Como se usa en el presente documento, un ARNip “espedfico” para una LDH o PDHK se refiere a un ARNip que se dirige a un acido nucleico de interes (por ejemplo, una LDH o PDHK(s)) y que la secuencia de nucleotidos de la porcion de duplex del ARNip es complementaria a una secuencia de nucleotidos del gen elegido como diana (por ejemplo, una LdH o PDHK(s)).
Como se usa en el presente documento, “unidas(os) operativamente”, como se usa en el presente documento, se refiere a una relacion funcional entre dos o mas segmentos de acido nucleico (por ejemplo, ADN). Normalmente, se refiere a la relacion funcional de la secuencia reguladora de la transcripcion con una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor esta unido operativamente a una secuencia codificante, tal como un acido nucleico de la invencion, si estimula o modula la transcripcion de la secuencia codificante en una celula huesped apropiada u otro sistema de expresion. Generalmente, las secuencias reguladoras de la transcripcion del promotor que estan unidas operativamente a una secuencia transcrita estan ffsicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, estan actuando en cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de la transcripcion, tales como potenciadores, no necesitan estar ffsicamente contiguas o localizadas en estrecha proximidad a las secuencias codificantes cuya transcripcion potencian.
Como se usa en el presente documento, el termino “promotor” incluye todas las secuencias capaces de conducir la transcripcion de una secuencia codificante en una celula cultivada, por ejemplo, una celula de mairfffero. Asf, los promotores usados en las construcciones de la invencion incluyen elementos de control de la transcripcion que actuan en cis y secuencias reguladoras que participan en regular o modular el momento exacto y/o velocidad de transcripcion de un gen (por ejemplo, una LDH o PDHK(s)). Por ejemplo, un promotor puede ser un elemento de control de la transcripcion que actua en cis, que incluye un potenciador, un promotor, un terminador de la transcripcion, un origen de replicacion, una secuencia de integracion cromosomica, regiones no traducidas 5' y 3', o una secuencia intronica, que participan en la regulacion de la transcripcion. Estas secuencias que actuan en cis normalmente interaccionan con protemas u otras biomoleculas para llevar a cabo (encender/apagar, regular, modular, etc.) la transcripcion. Promotores “constitutivos” son aquellos que conducen la expresion continuamente en la mayona de las condiciones medioambientales y estados de desarrollo o diferenciacion celular. Los promotores “inducibles” o “regulables” dirigen la expresion del acido nucleico de la invencion bajo la influencia de condiciones medioambientales o condiciones de desarrollo. Ejemplos de condiciones medioambientales que pueden afectar la transcripcion por promotores inducibles incluyen condiciones anaerobias, temperatura elevada, seqrna, o la presencia de luz.
Como se usa en el presente documento, “vector” significa una construccion que es capaz de administrar y preferentemente expresar, uno o mas gen(es) o secuencia(s) de interes (por ejemplo, LDHa y PDHK(s)) en una celula huesped. Ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresion de ADN desnudo o ARN, vectores de plasmido, cosmido o fago, vectores de expresion de ADN o ARN asociados a agentes de condensacion cationicos, vectores de expresion de ADN o ARN encapsulados en liposomas y ciertas celulas eucariotas, tales como celulas productoras. Vectores adecuados son aquellos que son compatibles con la celula huesped empleada. Vectores adecuados pueden proceder, por ejemplo, de una bacteria, un virus (tal como bacteriofago T7 o un fago derivado de M-13), un cosmido, una levadura, o una planta. Protocolos para obtener y usar tales vectores son conocidos para aquellos en la materia (vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989).
Como se usa en el presente documento, la velocidad promedio de produccion de lactato se calcula como la velocidad de smtesis de lactato menos la velocidad de consumo de lactato en mg/celulas/dfa.
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Como se usa en el presente documento, “productividad espedfica” o “Qp” se refiere a la velocidad de produccion de protemas espedficas, por ejemplo, anticuerpo, en pg/celulaMa. La productividad espedfica se calcula como el tftulo de protema (pg/celula^a)/IVCC (calcular la cifra de celulas viables integrada; celula/dfa).
Los terminos “polipeptido” y “protema” se usan indistintamente en el presente documento para referirse a polfmeros de aminoacidos de cualquier longitud. El polfmero puede ser linear o ramificado, puede comprender aminoacidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoacidos. Los terminos tambien engloban un polfmero de aminoacido que ha sido modificado naturalmente o por intervencion; por ejemplo, formacion de enlaces disulfuro, glucosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion, o cualquier otra manipulacion o modificacion, tal como conjugacion con un componente de marca. Tambien estan incluidos dentro de la definicion, por ejemplo, polipeptidos que contienen uno o mas analogos de un aminoacido (incluyendo, por ejemplo, aminoacidos no naturales, etc.), ademas de otras modificaciones conocidas en la tecnica.
El termino “anticuerpo” se usa en el sentido mas amplio y cubre espedficamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespedficos (por ejemplo, anticuerpos biespedficos) y fragmentos de anticuerpos.
“Fragmentos de anticuerpos” comprenden una porcion de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la region de union al antfgeno o region variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; moleculas de anticuerpo monocatenario; diacuerpos; anticuerpos lineales; y anticuerpos multiespedficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
El termino “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos, excepto por posibles mutaciones que existen de forma natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente espedficos, estando dirigidos contra un sitio antigenico unico. Ademas, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopes), cada anticuerpo monoclonal esta dirigido contra un unico determinante sobre el antfgeno. El adjetivo “monoclonal” indica que el caracter del anticuerpo es que se obtiene de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos y no debe interpretarse como que requiera la produccion del anticuerpo por cualquier metodo particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a usarse segun la presente invencion pueden prepararse por el metodo de hibridoma descritos por primera vez por Kohler et al, Nature 256:495 (1975), o pueden prepararse por metodos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” tambien pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las tecnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen espedficamente anticuerpos “quimericos” (inmunoglobulinas) en los que una porcion de la cadena pesada y/o ligera es identica a u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos procedentes de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es identico a u homologo a secuencias correspondientes en anticuerpos procedentes de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, ademas de fragmentos de tales anticuerpos, mientras que presenten la actividad biologica deseada (la patente de EE.UU. N.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
El termino “region hipervariable”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a los restos de aminoacidos de un anticuerpo que son responsables de la union al antfgeno. La region hipervariable comprende restos de aminoacidos de una “region determinante de la complementariedad” o “CDR” (es decir, los residuos 24-34 (L1), 5056 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos residuos de un “bucle hipervariable” (es decir, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chotia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Residuos de la “region estructural” o de “FR” son aquellos residuos del dominio variable distintos de los “residuos de la region hipervariable” como se ha definido en el presente documento.
Formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos que contienen secuencia minima procedente de inmunoglobulina no humana. En general, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo de receptor) en las que los residuos de la region hipervariable del receptor estan sustituidos con “residuos de la region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo de donante) tal como raton, rata, conejo o humano no primate que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la region estructural (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana estan sustituidos con residuos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo del receptor o en el anticuerpo del donante. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente
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todos los bucles hipervariables se corresponden con aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado tambien comprendera opcionalmente al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles vease Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Como se usa en el presente documento, el termino “inmunoadhesina” designa moleculas similares a anticuerpo que combinan el “dominio de union” de una protema “adhesina” heterologa (por ejemplo, un receptor, ligando o enzima) con las funciones efectoras de un dominio constante de la inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusion de la secuencia de aminoacidos de la adhesina con la especificidad de union deseada que es distinta del sitio de reconocimiento y de union del antfgeno (sitio de combinacion del antfgeno) de un anticuerpo (es decir, es “heterologo”) y una secuencia del dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina procede preferentemente de las cadenas pesadas y1, y2 o y4 ya que las inmunoadhesinas que comprenden estas regiones pueden purificarse por cromatograffa en protema A (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)).
El termino “dominio de union al ligando”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier receptor de la superficie celular nativo o a cualquier region o derivado del mismo que retenga al menos una union a ligando cualitativa de un receptor nativo correspondiente. En una realizacion espedfica, el receptor es de un polipeptido de la superficie celular que tiene un dominio extracelular que es homologo a un miembro de la familia de supergenes de la inmunoglobulina. Otros receptores, que no son miembros de la familia de supergenes de la inmunoglobulina, pero estan sin embargo espedficamente cubiertos por esta definicion, son receptores para citocinas y en particular receptores con actividad de tirosina quinasas (tirosina quinasas de receptor), miembros de las superfamilias de la hematopoyetina y de receptores del factor de crecimiento nervioso y moleculas de adhesion a celulas, por ejemplo (E-, L- y P-) selectinas.
El termino “dominio de union al receptor” se usa para designar cualquier ligando nativo para un receptor, que incluye moleculas de adhesion a celulas, o cualquier region o derivado de tal ligando nativo que retiene al menos una capacidad de union al receptor cualitativa de un ligando nativo correspondiente. Esta definicion, entre otras, incluye espedficamente secuencias de union de ligandos para los receptores anteriormente mencionados.
Una “quimera anticuerpo-inmunoadhesina” comprende una molecula que combina al menos un dominio de union de un anticuerpo (como se define en el presente documento) con al menos una inmunoadhesina (como se define en la presente solicitud). Quimeras anticuerpo-inmunoadhesina a modo de ejemplo son las quimeras CD4-IgG biespedficas como se describen en Berg et al., PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991) y Chamow et al., J. Immunol. 153:4268 (1994).
El termino “osmolalidad” se refiere al numero de partmulas de soluto disueltas en 1 litro de solucion. Los solutos que pueden anadirse al medio de cultivo para aumentar la osmolalidad del mismo incluyen protemas, peptidos, aminoacidos, polfmeros no metabolizados, vitaminas, iones, sales (por ejemplo, sales de sodio o de potasio), azucares, metabolitos, acidos organicos, lfpidos, etc. Cuando se usa en el presente documento, la abreviatura “mOsm” significa “miliosmoles/litro de H2O”.
Como se usa en el presente documento, una “celula huesped” incluye una celula individual, celulas cultivadas, o celula en cultivo que puede ser o ha sido un receptor para vector(es) o ARNip(s) para la incorporacion de insertos de polinucleotido para producir polipeptido. Las celulas huesped incluyen progenie de una celula cultivada individual y la progenie puede no necesariamente ser completamente identica (en morfologfa o en complemento de ADN genomico) a la celula parental original debido a mutacion natural, accidental o deliberada.
Para su uso en el presente documento, a menos que se indique claramente de otro modo, el uso de los terminos “un”, “una” y similares se refiere a uno o mas.
Referencia a “aproximadamente” un valor o parametro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se refieren a ese valor o parametro por sf mismo. Por ejemplo, descripcion con referencia a “aproximadamente X” incluye la descripcion de “X”. Los intervalos numericos son inclusivos de los numeros que definen el intervalo.
Se entiende que en cualquier parte donde se describen realizaciones en el presente documento con el lenguaje “que comprende”, tambien se proporcionan realizaciones de otro modo analogas descritas en terminos de “que consiste en” y/o “que consiste esencialmente en”.
Donde los aspectos o realizaciones de la invencion se describen en terminos de un grupo de Markush u otra agrupacion de alternativas, la presente invencion engloba no solo el grupo entero enumerado en conjunto, sino cada miembro del grupo individualmente y todos los posibles subgrupos del grupo principal, pero tambien el grupo principal ausente de uno o mas de los miembros de grupo. La presente invencion tambien preve la exclusion explfcita de uno o mas de cualquiera de los miembros del grupo en la invencion reivindicada.
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Metodos de reduccion de la produccion de lactato
Los metodos en el presente documento implican cultivar celulas que expresan ARNip espedficos para una LDH y al menos una o mas PDHK para reducir la produccion de lactato mediante interferencia por aRn (iARN). En un aspecto, el metodo comprende cultivar celulas que expresan a) un ARNip espedfico para LDH y b) un ARNip espedfico para una PDHK.
En algunas realizaciones, las celulas cultivadas expresan adicionalmente un ARNip espedfico para una segunda PDHK. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas expresan adicionalmente un ARNip espedfico para una tercera PDHK. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas expresan adicionalmente un ARNip espedfico para una cuarta PDHK.
En otro aspecto, el metodo comprende una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una LDH y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una PDHK, en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor.
En otro aspecto, se proporciona un metodo de silenciamiento o regulacion por disminucion de la transcripcion de LDH y PDHK en una celula cultivada que comprende: introducir en la celula un vector que comprende una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para la LDH y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para la PDHK, en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor, en el que los ARNip se expresan, silenciando o regulando asf por disminucion la transcripcion genica de la LDH y la PDHK.
En algunas realizaciones, las celulas cultivadas comprenden ademas una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una segunda PDHK y en las que la tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un tercer promotor. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas comprenden ademas una cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una tercera PDHK y en las que la cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un cuarto promotor. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas comprenden ademas una quinta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una quinta PDHK y en las que la quinta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un quinto promotor.
En algunas realizaciones, la LDH es LDHa, LDHb o LDHc. En algunas realizaciones, la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1, PDHK2, PDHK3 y PDHK4. En algunas realizaciones, la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1, PDHK2 y PDHK3. En algunas realizaciones, la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK2, PDHK3 y PDHK4. En algunas realizaciones, la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1, PDHK3 y PDHK4. En algunas realizaciones, la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1 y PDHK2. En algunas realizaciones, la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1 y PDHK3. En algunas realizaciones, la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK2 y PDHK3. En algunas realizaciones, la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK2 y PDHK4. En algunas realizaciones, la PDHK se selecciona del grupo que consiste en pDhK3 y PDHK4.
En algunas realizaciones, el metodo comprende cultivar celulas que expresan a) un ARNip espedfico para LDHa y b) un ARNip espedfico para PDHK1, PDHK2 y PDHK3, respectivamente. En algunas realizaciones, el metodo comprende cultivar celulas que expresan a) un ARNip espedfico para LDHb y b) un ARNip espedfico para PDHK1, PDHK2 y PDHK3, respectivamente. En algunas realizaciones, el metodo comprende cultivar celulas que expresan a) un ARNip espedfico para LDHc y b) un ARNip espedfico para PDHK1, PDHK2 y PDHK3, respectivamente.
En algunas realizaciones, el metodo comprende cultivar celulas que expresan a) un ARNip espedfico para LDHa, LDHb o LDHc y b) un ARNip espedfico para dos PDHK, en las que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1, PDHK2, PDHK3 y PDHK4. Por ejemplo, el metodo comprende cultivar celulas que expresan a) un ARNip espedfico para LDHa y b) un ARNip espedfico para PDHK1 y PDHK2, respectivamente.
En algunas realizaciones, el nivel de expresion de ARNm para una LDH se reduce al menos aproximadamente el 75 % y el nivel de expresion de ARNm para una PDHK se reduce al menos aproximadamente el 25 % en celulas
cultivadas que expresan a) un ARNip espedfico para una LDH y b) un ARNip espedfico para una PDHK en
comparacion con celulas cultivadas sin los ARNip espedficos para una LDH y una PDHK. En algunas realizaciones, la LDH es LDHa, LDHb o LDHc y el nivel de expresion de ARNm para la LDH se reduce al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, la PDHK es PDHK1, PDHK2 o PDHK3 y el nivel de expresion de ARNm para la PDHK se reduce al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos
aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos
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aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 %.
En algunas realizaciones, en celulas cultivadas que expresan a) un ARNip espedfico para LDHa y b) un ARNip espedfico para PDHK1, PDHK2 y PDHK3, el nivel de expresion de ARNm para LDHa se reduce aproximadamente el 90 % y los niveles de expresion de ARNm para PDHK1, PDHK2 y PDHK3 se reducen aproximadamente el 32 %, 83 % y 70 %, respectivamente, en comparacion con celulas cultivadas sin los ARNip espedficos para la LDHa, PDHK1, PDHK2 y PDHK3.
En algunas realizaciones, el metodo comprende una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para LDHa, LDHb, o LDHc, una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK1, una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK2 y una cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK3, en las que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en las que la segunda, tercera y cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor.
En algunas realizaciones, el metodo comprende una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para LDHa, LDHb o LDHc, una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una PDHK y una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una PDHK, en las que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor, en las que la segunda y tercera secuencias de acidos nucleicos heterologas estan unidas operativamente a un segundo promotor y en las que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1, PDHK2, PDHK3 y PDHK4.
En algunas realizaciones, el nivel de expresion de ARNm para una LDH se reduce al menos aproximadamente el 75 % y el nivel de expresion de ARNm para una PDHK se reduce al menos aproximadamente el 25 % en celulas cultivadas que comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una lDh y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una PDHK en comparacion con celulas cultivadas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que comprende la LDH y una o mas PDHK, en las que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologo esta unida operativamente a un primer promotor y en las que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor. En algunas realizaciones, la LDH es LDHa, LDHb o LDHc y el nivel de expresion de ARNm para la LDH se reduce al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, la PDHK es PDHK1, PDHK2 o PDHK3 y el nivel de expresion de ARNm para la PDHK se reduce al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al

menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al

menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al

menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al
menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95 %.
En algunas realizaciones, en celulas cultivadas que comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para LDHa, una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK1, una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK2 y una cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK3, en las que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en las que la segunda, tercera y cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor, el nivel de expresion de ARNm para LDHa se reduce aproximadamente el 90 % y los niveles de expresion de ARNm para PDHKl, PDHK2 y PDHK3 se reducen aproximadamente el 32 %, 83 % y el 70 %, respectivamente, en comparacion con celulas cultivadas sin los ARNip espedficos para la LDHa, PDHK1, PDHK2 y PDHK3.
El ARNip usado en la invencion descrita en el presente documento puede obtenerse o prepararse a partir de una variedad de fuentes, por ejemplo, producirse in vitro, ex vivo o in vivo, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el ARNip puede contener de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 nucleotidos, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleotidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleotidos, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotidos, o de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleotidos. En algunas realizaciones, la longitud del ARNip es inferior a 30 nucleotidos. En algunas realizaciones, la longitud de los ARNip es superior a 30 nucleotidos. En algunas realizaciones, el ARNip puede ser 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9 o menos nucleotidos de longitud.
En algunas realizaciones, el ARNip puede generarse por smtesis qmmica, por transcripcion in vitro usando una polimerasa, o por una digestion con endorribonucleasa (por ejemplo, Dicer) de ARN bicatenario largo (ARNbc). En
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algunas realizaciones, el ARNip puede estar completamente, o en parte, comprendido por nucleotidos sinteticos, bases naturales o bases modificadas.
En algunas realizaciones, el ARNip puede expresarse intracelularmente. El ARNip puede codificarse por una secuencia de acidos nucleicos y la secuencia de acidos nucleicos tambien puede incluir uno o mas promotores. La secuencia de acidos nucleicos tambien puede incluir una senal de poliadenilacion. En algunas realizaciones, pueden producirse hebras codificantes y no codificantes del duplex de ARN a partir de dos promotores independientes e hibridarse con la celula cultivada. En algunas realizaciones, las hebras codificantes y no codificantes del duplex de ARN tambien pueden enlazarse por un espaciador de pares de bases (por ejemplo, un espaciador de pares de bases puede comprender un unico par de bases o multiples pares de bases) o un tallo-bucle para formar un ARNhp y expresarse por un unico promotor. En algunas realizaciones, el ARNhp puede ser un ARNhp bi-funcional. La horquilla puede escindirse por una endorribonucleasa (por ejemplo, Dicer) para generar moleculas de ARNip efectivas. El espaciador o tallo-bucle esta situado entre las hebras codificantes y no codificantes que forman el duplex. El tallo-bucle puede variar en longitud. En algunas realizaciones, el tallo-bucle tiene 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o mas nucleotidos de longitud. La estructura de horquilla tambien puede contener porciones de nucleotidos protuberantes 3' o 5'. En algunas realizaciones, el nucleotido protuberante es un nucleotido protuberante de 3' o 5' de 1, 2, 3, 4 o 5 nucleotidos de longitud. Las composiciones y metodos para la regulacion de genes mediada por ARN por ARNip, ARNhp o ARNhp bifuncional se describen, por ejemplo, en la solicitud de EE.UU. N.° 20090215860, Rutz and Scheffold, Arthritis Research & Therapy, 6(2):78-85 (2004) y Rao et al., Advanced Drug Delivery Reviews 61:746-759 (2009).
En algunas realizaciones, el ARNip usado en la presente invencion pueden tener homologfa perfecta con secuencias diana para producir respuestas espedficas de diana. En algunas realizaciones, el ARNip usado en la presente invencion tiene aproximadamente cualquiera del 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 92 %, 91 %, 90 %, 88 %, 86 %, 84 %, 82 %, 80 %, 78 %, 76 %, 74 %, 72 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o el 5 % de homologfa con secuencias diana. En una variacion, el ARNip usado en la presente invencion puede hibridarse bajo condiciones fisiologicas con una secuencia diana de acido nucleico, por ejemplo, puede hibridarse espedficamente con una secuencia diana en una celula, por ejemplo, in vivo. En otra variacion, el ARNip se dirige a mas de una secuencia diana, marcador diana o gen indicador.
El grado de identidad de secuencias (homologfa) necesario para el direccionamiento in vivo de un ARNip a un acido nucleico diana (por ejemplo, union espedfica de un ARNip a una secuencia diana en una celula bajo condiciones fisiologicas) puede probarse bajo condiciones de seleccion rutinarias, por ejemplo, en cultivo celular y similares.
En algunas realizaciones, la secuencia diana para PDHK1 es GCAGTTCCTGGACTTCGGA (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, la secuencia diana para PDHK2 es CATTCAGTACTTCTTGGAC (SEQ iD NO: 3). En algunas realizaciones, la secuencia diana para PdHk3 es TGTAGCTGATGTCGTGAAA (SEQ ID NO: 4).
La lactato deshidrogenasa (LDH) convierte el piruvato en lactato. El numero de accesos de polipeptidos y acidos nucleicos de LDH a modo de ejemplo (por ejemplo, LDHa, LDHb o LDHc) incluyen, pero no se limitan a, DQ912661 (LDHa en celulas CHO), BC067223 (LDHa humana), BC084698 (LDHa de rata), BC094428 (LDHa de raton), BC002362 (LDHb humana), NM_012595 (LDHb de rata), NM_008492 (LDHb de raton), BC090043 (LDHc humana), NM_017266 (LDHc de rata) y NM_013580 (LDHc de raton). Pueden usarse metodos convencionales conocidos por personas expertas en la materia para determinar si un polipeptido de LDH tiene actividad de LDH midiendo la capacidad del polipeptido para convertir la piruvato en lactato in vitro, en un extracto de celulas, o in vivo.
La piruvato deshidrogenasa quinasa (PDHK) inhibe la conversion de piruvato en acetil-CoA. El numero de accesos de polipeptidos y acidos nucleicos de PDHK1 a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, L42450 (humano), BC089783 (rata) y NM_172665 (raton). El numero de accesos de polipeptidos y acidos nucleicos de PDHK2 a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, NM_002611 (humano), NM_030872 (rata) y NM_133667 (raton). El numero de accesos de polipeptidos y acidos nucleicos de PDHK3 a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, L42452 (humano), BC169078 (rata) y NM_145630 (raton). El numero de accesos de polipeptidos y acidos nucleicos de PDHK4 a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, NM_002612 (humano), NM_053551 (rata) y NM_013743 (raton). Pueden usarse metodos convencionales conocidos por el experto en la materia para determinar si un polipeptido de PDHK tiene actividad de PDHK midiendo la capacidad del polipeptido para inhibir la conversion de piruvato en acetil-CoA in vitro, en un extracto de celulas, o in vivo.
Los promotores son muy conocidos en la tecnica. Cualquier promotor que funcione en la celula huesped puede usarse para la expresion de ARNip espedficos para una LDH y una o mas de PDHK en la celula huesped. Practicamente cualquier promotor capaz de conducir estos ARNip es adecuado para la presente invencion que incluyen, pero no se limitan a, U6, H1, CYC1, HIS3, GAL1, GAL4, GAL10, ADH1, PGK, PHO5 GAPDH, T7, CMV, SV40 y EF1a. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el metodo comprende una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para LDHa, una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK1, una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK2 y una cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK3, en las que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida
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operativamente a un primer promotor U6 y en las que la segunda, tercera y cuarta secuencias de acidos nucleicos heterologas estan unidas operativamente a un segundo promotor H1. En una variacion, la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip es espedfica para LDHb. En otra variacion, la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip es espedfica para LDHc.
En otro aspecto, se proporciona un metodo de produccion de una celula que presenta produccion de lactato reducida en cultivo, que comprende introducir en la celula un vector que comprende una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para la LDH y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para la PDHK, en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor.
La primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para la LDH y la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica el ARNip espedfico para la PDHK pueden insertarse en un vector mediante una variedad de procedimientos. Por ejemplo, las secuencias de ARNip de LDH y PDHK se enlazan a la posicion deseada en el vector tras la digestion del inserto y el vector con endonucleasas de restriccion apropiadas, tales como KasI, BamHI, HindIII o BhIII. En algunas realizaciones, un vector que contiene secuencias de ARNip espedficas para LDHa y PDHK1, PDHK2 y PDHK3 se construye insertando la secuencia de ARNip de LDHa en el sitio KasI del vector (por ejemplo, vector de higromicina pSilencer 3.1-H1) con una adicion de promotor U6 en su extremo 5' inmediato, insertando las secuencias de ARNip de PDHK1 y PDHK2 en sitios BamHI/HindIII y HindIII, respectivamente, e insertando la secuencia de ARNip de PDHK3 en BgIII con una adicion de promotor H1 en los extremos 5' inmediatos de PDHK1, PDHK2 y PDHK3. Celulas cultivadas que expresan la produccion de lactato reducida pueden entonces generarse transfectando los vectores que contienen ARNip de LDHa y PDHK1, PDHK2 y PDHK3.
Composiciones
Las celulas cultivadas producidas por los metodos descritos en el presente documento tambien se proporcionan en la presente invencion. Las composiciones de la presente invencion pueden ponerse en practica in vivo, ex vivo, o in vitro. En un aspecto, se proporcionan celulas en cultivo que expresan a) un ARNip espedfico para LDH y b) un ARNip espedfico para una PDHK. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas expresan adicionalmente un ARNip espedfico para una segunda PDHK. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas expresan adicionalmente un ARNip espedfico para una tercera PDHK. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas expresan adicionalmente un ARNip espedfico para una cuarta PDHK.
En algunas realizaciones, celulas en cultivo expresan a) un ARNip espedfico para LDHa y b) un ARNip espedfico para PDHK1, PDHK2 y PDHK3, respectivamente. En algunas realizaciones, celulas en cultivo expresan a) un ARNip espedfico para LDHb y b) un ARNip espedfico para PDHK1, PDHK2 y PDHK3, respectivamente. En algunas realizaciones, celulas en cultivo expresan a) un ARNip espedfico para LDHc y b) un ARNip espedfico para PDHK1, PDHK2 y PDHK3, respectivamente.
En algunas realizaciones, celulas en cultivo expresan a) un ARNip espedfico para LDHa y b) un ARNip espedfico para dos PDHK, en las que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1, PDHK2, PDHK3 y PdHk4. En algunas realizaciones, celulas en cultivo expresan a) un ARNip espedfico para LDHb y b) un ARNip espedfico para dos PDHK, en las que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1, PDHK2, PDHK3 y PDHK4. En algunas realizaciones, celulas en cultivo expresan a) un ARNip espedfico para LDHc y b) un ARNip espedfico para dos PDHK, en las que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en pDhKI, PDhK2, PDHK3 y PdHk4.
En otro aspecto, se proporcionan celulas en cultivo que comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una LDH y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una PDHK, en las que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en las que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor. En algunas realizaciones, las celulas comprenden ademas una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una segunda PDHK y en las que la tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un tercer promotor. En algunas realizaciones, las celulas comprenden ademas una cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una tercera PDHK y en las que la cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un cuarto promotor. En algunas realizaciones, las celulas comprenden ademas una quinta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una quinta PDHK y en las que la quinta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un quinto promotor.
En algunas realizaciones, celulas en cultivo comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para LDHa, una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHKl, una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK2 y una cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico
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para PDHK3, en las que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor (por ejemplo, U6) y en las que la segunda, tercera y cuarta secuencias de acidos nucleicos heterologas estan unidas operativamente a un segundo promotor (por ejemplo, H1). En una variacion, la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip es espedfica para LDHb. En otra variacion, la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip es espedfica para LDHb.
En algunas realizaciones, celulas en cultivo comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para LDHa, una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una PDHK, una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una PDHK, en las que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1, PDHK2, PDHK3 y PDHK4, en las que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor (por ejemplo, U6) y en las que la segunda y la tercera secuencias de acidos nucleicos heterologas estan unidas operativamente a un segundo promotor (por ejemplo, H1). En una variacion, la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip es espedfica para LDHb. En otra variacion, la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip es espedfica para LDHc.
En algunas realizaciones, el cultivo celular incluye al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 50, 75, 100, 200, 500, 750, 1.000, 5.000, 7,500, 10.000, 15.000 o mas celulas.
En otro aspecto, se desvelan celulas en cultivo que tienen una velocidad de la smtesis de lactato que es inferior a una velocidad de consumo de lactato. La divulgacion tambien se refiere a las celulas en cultivo que tienen una velocidad promedio de produccion de lactato inferior a un valor negativo de aproximadamente cualquiera de 0,2 mg/106 celulas/dfa, 0,1 mg/106 celulas/dfa, 0,08 mg/106 celulas/dfa, 0,06 mg/106 celulas/dfa, 0,04 mg/106 celulas/dfa 0,02 mg/106 celulas/dfa, 0,01 mg/106 celulas/dfa, 0,008 mg/106 celulas/dfa, 0,006 mg/106 celulas/dfa, 0,004 mg/106 celulas/dfa, o 0,002 mg/106 celulas/dfa.
En algunas realizaciones, celulas en cultivo comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para LDHa, una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK1, una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK2 y una cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK3, en las que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor (por ejemplo, U6), en las que la segunda, tercera y cuarta secuencias de acidos nucleicos heterologas estan unidas operativamente a un segundo promotor (por ejemplo, H1) y en las que las celulas en cultivo tienen una velocidad promedio de produccion de lactato de un valor negativo de aproximadamente 0,02 mg/106 celulas/dfa.
En otro aspecto, se desvelan celulas en cultivo que contienen ARNip espedfico para una LDH y PDHK(s) que tienen una osmolalidad reducida. En algunos aspectos de la divulgacion, celulas en cultivo que contienen ARNip espedfico para una LDH y PDHK(s) tienen una osmolalidad inferior a aproximadamente cualquiera de 500 mOsm, 450 mOsm, 400 mOsm 350 mOsm, 300 mOsm, 250 mOsm, 200 mOsm o 150 mOsm.
En algunas realizaciones, celulas en cultivo comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para LDHa, una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK1, una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK2 y una cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK3, en las que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor (por ejemplo, U6), en las que la segunda, tercera y cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor (por ejemplo, H1) y en las que las celulas en cultivo tienen una osmolalidad a aproximadamente 300 mOsm.
En otro aspecto, se desvelan celulas en cultivo que tienen una elevada productividad espedfica (Qp). En algunos aspectos de la divulgacion, las celulas cultivadas tienen una productividad espedfica superior de al menos aproximadamente 60 %, de al menos aproximadamente 65 %, de al menos aproximadamente 70 %, de al menos aproximadamente 75 %, de al menos aproximadamente 80 %, de al menos aproximadamente 85 %, de al menos aproximadamente 90 % o de al menos aproximadamente 95 % en comparacion con las celulas cultivadas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que comprende una o mas PDHK y la LDH. En algunos aspectos de la divulgacion, las celulas cultivadas tienen una productividad espedfica superior de aproximadamente 67 %, de aproximadamente 69%, de aproximadamente 71%, de aproximadamente 72%, de aproximadamente 73%, aproximadamente 74 %, de aproximadamente 75 %, de aproximadamente 76 %, de aproximadamente 77 %, de
aproximadamente 78 %, de aproximadamente 79 %, de aproximadamente 81 %, de aproximadamente 83 %, de
aproximadamente 85 %, de aproximadamente 87 %, de aproximadamente 89 %, de aproximadamente 91 %, de
aproximadamente 93 %, de aproximadamente 95 %, de aproximadamente 97 % o de aproximadamente 99 % en
comparacion con las celulas cultivadas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que comprende una o mas PDHK y la LDH.
En algunas realizaciones, las celulas en cultivo comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para LDHa, una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un
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ARNip espedfico para PDHK1, una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK2 y una cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK3, en las que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor (por ejemplo, U6), en las que la segunda, tercera y cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor (por ejemplo, H1) y en las que las celulas en cultivo tienen una productividad espedfica de aproximadamente el 75 % superior.
En otro aspecto, se proporcionan las celulas cultivadas producidas por el metodo en el presente documento con una elevada productividad de polipeptidos (por ejemplo, productividad o tftulo de anticuerpos en g/l). En algunas realizaciones, las celulas cultivadas tienen una productividad de polipeptidos superior de aproximadamente 10 % a aproximadamente 800 % en comparacion con las celulas cultivadas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que comprende una o mas PDHKy la LDH. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas tienen una productividad de polipeptidos superior de aproximadamente 10%, de aproximadamente 15%, de aproximadamente 20%, de

aproximadamente 25 %, de aproximadamente 30 %, de aproximadamente 35 %, de aproximadamente 40 %, de

aproximadamente 45 %, de aproximadamente 50 %, de aproximadamente 55 %, de aproximadamente 58 %, de

aproximadamente 60%, de aproximadamente 65%, de aproximadamente 70%, de aproximadamente 71 %, de
aproximadamente 75 % , de aproximadamente 80 %, de aproximadamente 85 %, de aproximadamente 90 %, de aproximadamente 95 %, de aproximadamente 100 %, de aproximadamente 125 %, de aproximadamente 150 %, de aproximadamente 200 %, de aproximadamente 250 %, de aproximadamente 300 %, de aproximadamente 350 %, de aproximadamente 400 %, de aproximadamente 450 %, de aproximadamente 500, de aproximadamente 550 %, de aproximadamente 600 %, de aproximadamente 650 %, de aproximadamente 700 %, de aproximadamente 750 % o de aproximadamente 800 % en comparacion con las celulas cultivadas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que comprende una o mas PDHK y la LDH. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas tienen una productividad de polipeptidos superior de al menos aproximadamente 55 %, de al menos aproximadamente 60 %, de al menos aproximadamente 65 %, de al menos aproximadamente 68 %, de al menos aproximadamente 70 %, de al menos aproximadamente 80 %, de al menos aproximadamente 85 % o de al menos aproximadamente 90 % en comparacion con las celulas cultivadas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que comprende una o mas PDHKy la LDH.
En algunas realizaciones, celulas en cultivo comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para LDHa, una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK1, una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK2 y una cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para PDHK3, en las que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor (por ejemplo, U6), en la que la segunda, tercera y cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor (por ejemplo, H1) y en las que las celulas cultivadas tienen una productividad de anticuerpos (por ejemplo, en g/l) de al menos aproximadamente el 68 % superior a las celulas cultivadas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que comprende la PDHK1, PDHK2, PDHK3 y LDHa.
En algunas realizaciones, las celulas cultivadas tienen una productividad de polipeptidos superior de aproximadamente 10% a aproximadamente 800 % en comparacion con las celulas cultivadas sin los ARNip espedficos para una o mas PDHK y la LDH (en algunas realizaciones, un anticuerpo). En algunas realizaciones, las celulas cultivadas tienen una productividad de polipeptidos superior de aproximadamente 10%, de aproximadamente 15%, de aproximadamente 20%, de aproximadamente 25%, de aproximadamente 30%, de

aproximadamente 35 %, de aproximadamente 40 %, de aproximadamente 45 %, de aproximadamente 50 %, de

aproximadamente 55 %, de aproximadamente 60 %, de aproximadamente 65 %, de aproximadamente 70 %, de

aproximadamente 75 %, de aproximadamente 80 %, de aproximadamente 85 %, de aproximadamente 90 %, de
aproximadamente 95 %, de aproximadamente 100 %, de aproximadamente 125 %, de aproximadamente 150 %, de aproximadamente 200 %, de aproximadamente 250 %, de aproximadamente 300 %, de aproximadamente 350 %, de aproximadamente 400 %, de aproximadamente 450 %, de aproximadamente 500 %, de aproximadamente 550 %, de aproximadamente 600 %, de aproximadamente 650 %, de aproximadamente 700 %, de aproximadamente 750 % o de aproximadamente 800 % en comparacion con las celulas cultivadas sin los ARNip espedficos para una o mas PDHK y la LDH. En algunas realizaciones, las celulas cultivadas tienen una productividad de polipeptidos superior de al menos aproximadamente 65 %, de al menos aproximadamente 68 %, de al menos aproximadamente 70 %, de al menos aproximadamente 80 %, de al menos aproximadamente 85 % o de al menos aproximadamente 90 % en comparacion con las celulas cultivadas sin los ARNip espedficos para una o mas PDHK y la LDH. En algunas realizaciones, los anticuerpos tienen una productividad superior de al menos aproximadamente 68 % en comparacion con las celulas cultivadas sin los ARNip espedficos para una o mas PDHK y la LDH.
En otro aspecto, se proporciona un vector que comprende una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una LDH y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una PDHK, en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor.
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En algunas realizaciones, el vector contiene un acido nucleico bajo el control de una secuencia de control de la expresion. Como se usa en el presente documento, una “secuencia de control de la expresion” significa una secuencia de acidos nucleicos que dirige la transcripcion de un acido nucleico de interes. Una secuencia de control de la expresion puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. Un “promotor inducible” es un promotor que es activo bajo regulacion ambiental o de desarrollo. La secuencia de control de la expresion esta unida operativamente al segmento de acido nucleico que va a transcribirse.
En algunas realizaciones, el vector tambien incluye una secuencia de terminacion. Las regiones de control de terminacion tambien pueden proceder diversos genes nativos para la celula huesped. En algunas realizaciones, la secuencia de terminacion y la secuencia promotora proceden de la misma fuente. En otra realizacion, la secuencia de terminacion es endogena a la celula huesped. Opcionalmente, puede incluirse un sitio de terminacion. Para la expresion eficaz de los polipeptidos, el ADN que codifica el polipeptido se une operativamente mediante codones de iniciacion a regiones de control de la expresion seleccionadas de forma que la expresion produzca la formacion del ARN mensajero apropiado.
En algunas realizaciones, el vector contiene un marcador selectivo. El termino “marcador selectivo” se refiere a un acido nucleico capaz de la expresion en una celula huesped que permite la facilidad de seleccion de aquellas celulas huesped que contienen un acido nucleico o vector introducido. Ejemplos de marcadores de seleccion incluyen, pero no se limitan a, acidos nucleicos de resistencia a antibioticos (por ejemplo, kanamicina, ampicilina, carbenicilina, gentamicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina, o cloranfenicol) y/o acidos nucleicos que confieren una ventaja metabolica, tal como una ventaja nutricional sobre la celula huesped. En algunas realizaciones, el marcador selectivo es el acido nucleico de higromicina.
Polipeptidos
El polipeptido o protema que va a producirse usando los metodos y celulas cultivadas descritos en el presente documento incluye, pero no se limita a, anticuerpo o inmunoadhesina. Las tecnicas para generar tales moleculas se tratan a continuacion.
Anticuerpos
Los anticuerpos dentro del alcance de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a: anticuerpos anti-CD20 tales como anti-CD20 quimerico “C2B8” como en la patente de EE.UU. N.° 5.736.137 (RITUXAN®); anticuerpos anti- VEGF, que incluyen anticuerpos anti-VEGF humanizados y/o madurados por afinidad tales como el anticuerpo anti- VEGF humanizado huA4.6.1 AVASTIN® (Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), publicacion internacional N.° WO 96/30046 y documento WO 98/45331, publicado el 15 de octubre de 1998) y V3LA; anticuerpo anti-MUC16; anticuerpos anti-CD4 tales como el anticuerpo cM-7412 (Choy et al. Arthritis Rheum. 39(1):52-56 (1996)) y el anticuerpo Ibalizumab (TNX355); anticuerpos anti-MET tales como el anticuerpo anti-C-Met 5D5 de un brazo; anticuerpos anti-HER2 Trastuzumab (HERCEPTIN®) (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), la patente de EE.UU. N.° 5.725.856) y 2C4 humanizado (documento WO01/00245, Adams et al.), una variante quimerica o humanizada del anticuerpo 2H7 como en la patente de EE.UU. N.° 5.721.108B1, o Tositumomab (BEXXAR®); anticuerpos anti-IL-8 (St John et al., Chest, 103:932 (1993) y la publicacion internacional N.° WO 95/23865); anticuerpos anti-antfgeno de celulas madres de prostata (PSCA) (documento WO01/40309); anticuerpos anti-CD40, que incluyen S2C6 y variantes humanizadas de los mismos (documento WO00/75348); anticuerpos anti- CD1 (patente de EE.UU. N.° 5.622.700, documento WO 98/23761, Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991) y Horamant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)); anti-CD18 (patente de EE.UU. N.° 5.622.700, concedida el 22 de abril de 1997, o como en el documento WO 97/26912, publicado el 31 de julio de 1997); anticuerpos anti-IgE (incluyendo E25, E26 y E27; patente de EE.UU. N.° 5.714.338, concedida el 3 de febrero de 1998 o la patente de EE.UU. N.° 5.091.313, concedida el 25 de febrero de 1992, documento WO 93/04173 publicado el 4 de marzo de 1993, o la solicitud internacional No. PCT/US98/13410 presentada el 30 de junio de 1998, la patente de EE.UU. N.° 5.714.338, Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993) y la publicacion internacional N.° WO 95/19181); anticuerpos anti-receptor de Apo-2 (documento WO 98/51793 publicado el 16 de noviembre de 1998); anticuerpos anti-TNF-a, que incluyen cA2 (REMICADE®), CDP571 y MAK-195 (veanse la patente de EE.UU. N.° 5.672.347 concedida el 30 de septiembre de 1997, Lorenz et al. J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996) y Dhainaut et al. Crit. Care Med. 23(9):1461-1469 (1995)); anticuerpos anti-factor tisular (Tf) (patente europea N.° 0 420 937 B1 concedida el 9 de noviembre de 1994); anticuerpos anti-integrina a4p7 humana (documento WO 98/06248 publicado el 19 de febrero de 1998); anticuerpos anti-receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) (por ejemplo, anticuerpo 225 quimerizado o humanizado como en el documento WO 96/40210 publicado el 19 de diciembre de 1996); anticuerpos anti-CD3 tales como OKT3 (patente de EE.UU. N.° 4.515.893 concedida el 7 de mayo de 1985); anticuerpos anti-CD25 o anti-Tac tales como CHI-621 (SIMULECT® y ZENAPAX® (vease la patente de EE.UU. N.° 5.693.762 concedida el 2 de diciembre de 1997); anticuerpos anti-CD52 tales como CAMPATH-1H (Riechmann et al. Nature 332:323-337 (1988)); anticuerpos anti-receptor de Fc tales como el anticuerpo M22 dirigido contra Fcy RI como en Graziano et al. J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995); anticuerpos anti-antfgeno carcinoembrionario (CEA) tales como hMN-1 4 (Sharkey et al. Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995); anticuerpos dirigidos contra celulas epiteliales de mama que incluyen huBrE-3, hu-Mc 3 y CHL6 (Ceriani et al. Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); y Richman et al. Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)); anticuerpos que se unen a celulas de
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carcinoma de colon tales como C242 (Litton et al. Eur J Immunol. 26(1): 1-9 (1996)); anticuerpos anti-CD38, por ejemplo A 13/5 (Ellis et al. J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); anticuerpos anti-CD33 tales como Hu M195 (Jurcic et al. Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995) y cMa-676 o CDP771; anticuerpos anti-CD22 tales como LL2 o LymphoCide (Juweid et al. Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995)); anticuerpos anti-EpCAM tales como 17- 1A (PANOREX®); anticuerpos anti-GpIIb/IIIa tales como abciximab o c7E3 Fab (rEoPRO®); anticuerpos anti-RSV tales como MEDI-493 (SyNaGIS®); anticuerpos anti-CMV tales como PROTOVIR®; anticuerpos anti-VIH tales como PRO542; anticuerpos anti-hepatitis tales como el anticuerpo anti-Hep B OSTAVIR®; anticuerpos anti-CA 125, tales como OvaRex; anticuerpo anti-epttope de GD3 idiotfpico BEC2; anticuerpos anti-avp3, que incluyen VITAXIN®; anticuerpo anti-carcinoma de celulas renales humano tal como ch-G250; ING-1; anticuerpo anti-17-1A humano (3622W94); anticuerpo anti-tumor colorrectal humano (A33); anticuerpo anti-melanoma humano R24 dirigido contra gangliosido GD3; anticuerpos anti-carcinoma de celulas escamosas humano (SF-25); y anti-antigeno leucocitario humano (HLA) tales como Smart ID10 y el anticuerpo anti-HLA DR Oncolym (Lym-1).
Aparte de los anticuerpos espedficamente identificados anteriormente, el medico habitual puede generar anticuerpos dirigidos contra un antigeno de interes, por ejemplo, usando las tecnicas descritas a continuacion.
(i) Seleccion y preparacion de antigenos
El anticuerpo en el presente documento se dirige contra un antigeno de interes. Preferentemente, el antigeno es un polipeptido biologicamente importante y la administracion del anticuerpo a un mairnfero que padece una enfermedad o trastorno puede producir un beneficio terapeutico en ese mamffero. Sin embargo, tambien se contemplan anticuerpos dirigidos contra antfgenos no de polipeptido (tales como antfgenos de glicolfpido asociados a tumor; vease la patente de EE.UU. N.° 5.091.178). Si el antfgeno es un polipeptido, puede ser una molecula transmembranaria (por ejemplo, receptor) o ligando tal como un factor de crecimiento. Antfgenos a modo de ejemplo incluyen aquellas protemas descritas en la seccion (3) mas adelante. Dianas moleculares a modo de ejemplo para anticuerpos englobados por la presente invencion incluyen protemas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22 y CD34; miembros de la familia de receptores de ErbB tales como el receptor EGFR, HER2, HER3 o HER4; moleculas de adhesion a celulas tales como LFA-1, Mac1, p1 50,95, VLA-4, IcAm-1, VCAM e integrina av/p3 que incluyen tanto subunidades a como p de las mismas (por ejemplo, anticuerpos anti-CD11a, anti-CD18 o anti-CD11b); factores de crecimiento tales como VEGF; IgE; antfgenos de grupo sangumeo; receptor de flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4; protema C, o cualquiera de los otros antfgenos mencionados en el presente documento.
Pueden usarse antfgenos solubles o fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados con otras moleculas, como inmunogenos para generar anticuerpos. Para moleculas transmembranarias, tales como receptores, los fragmentos de estos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) pueden usarse como inmunogen. Alternativamente, las celulas que expresan la molecula transmembranaria pueden usarse como inmunogen. Tales celulas pueden proceder de una fuente natural (por ejemplo, lmeas de celulas cancerosas) o pueden ser celulas que han sido transformadas por tecnicas recombinantes para expresar la molecula transmembranaria.
Otros antfgenos y formas de los mismos utiles para preparar anticuerpos seran evidentes para aquellos en la materia.
(ii) Anticuerpos policlonales
Los anticuerpos policlonales se producen preferentemente en animales por multiples inyecciones subcutaneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antfgeno relevante y un adyuvante. Puede ser util conjugar el antfgeno con una protema que es inmunogenica en las especies a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albumina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, ester de maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugacion por restos de cistema), N-hidroxisuccinimida (por restos de lisina), glutaraldehfdo, anhfdrido succmico, SOCh, o R1 N=C=NR en la que R y R1 son grupos alquilo diferentes.
Los animales se inmunizan contra el antfgeno, conjugados inmunogenicos o derivados combinando, por ejemplo, 100 |jg o 5 |jg de la protema o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volumenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solucion por via intradermica en multiples sitios. Un mes despues, los animales se refuerzan con 1/5 a {fraccion (1/10)} de la cantidad original de antfgeno o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyeccion subcutanea en multiples sitios. Siete a 14 dfas despues, los animales se sangran y el suero se ensaya para tttulo de anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta la meseta del tftulo. Preferentemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antfgeno, pero conjugado con una protema diferente y/o mediante un reactivo de reticulacion diferente. Tambien pueden prepararse conjugados en cultivo celular recombinante como fusiones de protemas. Por tanto, agentes agregantes tales como alumbre se usan adecuadamente para potenciar la respuesta inmunitaria.
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(iii) Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando el metodo de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o resto no proteinaceo mediante metodos de ADN recombinante (patente de EE.UU. N.° 4.816.567).
En el metodo de hibridoma, un raton u otro animal huesped apropiado tal como un hamster o mono macaco se inmuniza como se ha descrito anteriormente para provocar que los linfocitos produzcan o puedan producir anticuerpos que se uniran espedficamente a la protema usada para la inmunizacion. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos se fusionan luego con celulas de mieloma usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pag. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Las celulas de hibridoma asf preparadas se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las celulas de mieloma sin fusionar parentales. Por ejemplo, si las celulas de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina-guanina- fosforribosil-transferasa (HGPRt o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluira hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que previenen el crecimiento de celulas deficientes en HGPRT.
Celulas de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan produccion de alto nivel estable de anticuerpo por las celulas productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. De entre estas, lmeas de celulas de mieloma preferidas son lmeas de mieloma murino tales como las procedentes de tumores de raton MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif., EE.UU. y celulas SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la Coleccion americana de cultivos tipo, Rockville, Md. EE.UU. Las lmeas de celulas de mieloma humano y heteromieloma de raton-humano tambien se han descrito para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pag. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
El medio de cultivo en el que las celulas de hibridoma estan cultivandose se ensaya para la produccion de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el anffgeno. Preferentemente, la especificidad de union de los anticuerpos monoclonales producidos por celulas de hibridoma se determina por inmunoprecipitacion o por un ensayo de union in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA).
Despues de identificarse las celulas de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse por procedimientos de dilucion limitante y cultivarse mediante metodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pag. 59-103 (Academic Press, 1986)). Medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Ademas, las celulas de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores asdticos en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido asdtico o suero por procedimientos de purificacion de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, protema A-Sepharose, cromatograffa de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis, o cromatograffa de afinidad. Preferentemente, se usa el procedimiento de cromatograffa de afinidad por protema A usando un gradiente de pH descrito en el presente documento.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invencion se afsla y se secuencia facilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleotidos que pueden unirse espedficamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las celulas de hibridoma sirven de fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresion que entonces se transfectan en celulas huesped tales como celulas de E. coli, celulas COS de simio, celulas de ovario hamster chino (CHO) o celulas de mieloma que no producen de otra forma protema de inmunoglobulina para obtener la smtesis de anticuerpos monoclonales en las celulas huesped recombinantes.
El ADN tambien puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por dominios constantes de las cadenas pesadas y ligeras humanas en lugar de las secuencias murinas homologas (patente de EE.UU. N.° 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipeptido no de inmunoglobulina.
Normalmente, tales polipeptidos no de inmunoglobulina estan sustituidos con los dominios constantes de un anticuerpo, o estan sustituidos con los dominios variables de un sitio de combinacion de anffgeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimerico que comprende un sitio de combinacion de anffgeno que tiene especificidad por un anffgeno y otro sitio de combinacion de anffgeno que tiene especificidad por un anffgeno diferente.
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Pueden aislarse anticuerpos monoclonales de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando las tecnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554(1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581.597(1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la produccion de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de nM) por barajado de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), ademas de infeccion combinatoria y recombinacion in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Por tanto, estas tecnicas son alternativas viables a las tecnicas de hibridomas de anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.
(iv) Anticuerpos humanizados y humanos
Un anticuerpo humanizado tiene uno o mas restos de aminoacidos introducidos en el de una fuente que es no humana. Estos restos de aminoacidos no humanos se denominan frecuentemente en lo sucesivo restos “importados”, que se toman normalmente de un dominio variable “importado”. La humanizacion puede realizarse esencialmente siguiendo el metodo de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1968); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1998)) sustituyendo CdR de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quimericos (patente de EE.UU. N.° 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de CDR y posiblemente algunos restos de FR estan sustituidos por restos de sitios analogos en anticuerpos de roedor.
La eleccion de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que van a usarse en la produccion de anticuerpos humanizados puede ser importante para reducir la antigenicidad. Segun el llamado metodo “de mejor ajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba contra la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humano conocido. La secuencia humana que esta mas proxima a la del roedor se acepta entonces como la FR humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al. (1993)). Otro metodo usa una region estructural particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma region estructural puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).
Es adicionalmente importante que los anticuerpos se humanicen con retencion de alta afinidad por el antfgeno y otras propiedades biologicas favorables. Para lograr este objetivo, segun un metodo preferido, anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de analisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina estan comunmente disponibles y son familiares para aquellos expertos en la materia. Estan disponibles programas informaticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspeccion de estas visualizaciones permite el analisis de la probable funcion de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el analisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antfgeno. De esta forma, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias del receptor y de importacion de manera que se logre la caractenstica de anticuerpo deseada, tal como aumento de la afinidad por el (los) antfgeno(s) diana. En general, los residuos de CDR estan directamente y principalmente sustancialmente implicados en influir la union a antfgeno.
Alternativamente, ahora es posible producir animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que tras la inmunizacion pueden producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulina endogena. Por ejemplo, se ha descrito que la delecion homocigotica del gen de la region de union de la cadena pesada del anticuerpo (Jh) en ratones quimericos y mutantes en la lmea germinal produce la inhibicion completa de la produccion de anticuerpo endogeno. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de la lmea germinal en tales ratones mutantes en la lmea germinal producira la produccion de anticuerpos humanos tras la exposicion a antfgeno. Veanse, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. uSa, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al. year in Immuno., 7:33 (1993); y Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). Los anticuerpos humanos tambien pueden proceder de bibliotecas de expresion en fago (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)).
(v) Fragmentos de anticuerpos
Se han desarrollado diversas tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtuvieron por digestion proteolftica de anticuerpos intactos (vease, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden ahora ser directamente producidos por celulas huesped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas de fagos de anticuerpos tratadas
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anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse qmmicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Segun otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de cultivo de celulas huesped recombinantes. Tambien puede aislarse un fragmento Fv monocatenario (scFv). Vease el documento WO 93/16185. Otras tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos seran evidentes para el medico experto.
(vi) Anticuerpos multiespedficos
Los anticuerpos multiespedficos tienen especificidades de union por al menos dos antigenos diferentes. Mientras que tales moleculas normalmente solo se uniran a dos antigenos (es decir, anticuerpos biespedficos, BsAbs), los anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespedficos estan englobados por esta expresion cuando se usa en el presente documento.
Se conocen en la tecnica metodos de produccion de anticuerpos biespedficos. La produccion tradicional de anticuerpos biespedficos de longitud completa se basa en la co-expresion de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina en los que las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Milstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Debido al surtido aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de 10 moleculas de anticuerpos diferentes, de las que solo una tiene la estructura biespedfica correcta. La purificacion de la molecula correcta, que se hace normalmente por etapas de cromatograffa de afinidad, es bastante embarazosa y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se desvelan en el documento WO 93/08829 y en Traunecker et al., eMbO J., 10:3655-3659 (1991).
Segun otro enfoque descrito en el documento WO96/27011, la superficie de separacion entre un par de moleculas de anticuerpos puede manipularse para maximizar el porcentaje de heterodfmeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La superficie de separacion preferida comprende al menos una parte del dominio Ch3 de un dominio constante de anticuerpo. En este metodo, una o mas cadenas laterales de aminoacidos pequenos de la superficie de separacion de la primera molecula de anticuerpo estan sustituidas con cadenas laterales mas grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano). Las “cavidades” de compensacion de tamano identico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) se crean sobre la superficie de separacion de la segunda molecula de anticuerpo sustituyendo las cadenas laterales de aminoacidos grandes por mas pequenas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodfmero con respecto a otros productos finales no deseados tales como homodfmeros.
Los anticuerpos biespedficos incluyen anticuerpos reticulados o “heteroconjugados”. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para elegir como diana celulas del sistema inmunitario para celulas no deseadas (patente de EE.UU. n° 4.676.980) y para el tratamiento de infeccion por el VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/00373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden producirse usando cualquier metodo de reticulacion conveniente. Agentes de reticulacion adecuados son muy conocidos en la tecnica y se desvelan en la patente de EE.UU. n° 4.676.980, junto con varias tecnicas de reticulacion.
Las tecnicas para generar anticuerpos biespedficos a partir de fragmentos de anticuerpos tambien se han descrito en la bibliograffa. Por ejemplo, los anticuerpos biespedficos pueden prepararse usando enlace qmmico. Brennan et al., Science 229:81 (1985), describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se escinden proteolfticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito de sodio para estabilizar ditioles vecinos y prevenir la formacion de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte entonces en el Fab'-tiol mediante reduccion con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro Fab'-TNB derivado para formar el anticuerpo biespedfico. Los anticuerpos biespedficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilizacion selectiva de enzimas.
El reciente progreso ha facilitado la recuperacion directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que pueden acoplarse qmmicamente para formar anticuerpos biespedficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992), describen la produccion de una molecula de anticuerpo biespedfico completamente humanizado F(ab')2. Cada fragmento Fab' se secreto por separado de E. coli y se sometio a acoplamiento qmmico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespedfico. Por tanto, el anticuerpo biespedfico formado podfa unirse a celulas que expresan en exceso el receptor ErbB2 y linfocitos T humanos normales, ademas de desencadenar la actividad lttica de linfocitos citotoxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano.
Tambien se han descrito diversas tecnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpos biespedficos directamente a partir de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, los anticuerpos biespedficos se han producido usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Los peptidos de cremalleras de leucina de las protemas Fos y Jun se ligaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusion de genes. Los homodfmeros de anticuerpos se redujeron en la region de bisagra para formar monomeros y entonces se reoxidaron para formar los heterodfmeros de anticuerpos. Este metodo tambien puede utilizarse para la produccion de homodfmeros de anticuerpos. La tecnologfa de “diacuerpos” descrita por Hollinger et al., Proc. Natl.
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Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), ha proporcionado un mecanismo alternativo para producir fragmentos de anticuerpos biespedficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (Vl) por un conector que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios Vh y Vl de un fragmento estan obligados a aparearse con los dominios Vl y Vh complementarios de otro fragmento, formandose asf dos sitios de union a antigeno. Tambien se ha notificado otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpos biespedficos mediante el uso de dfmeros Fv (sFv). Vease, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994). Alternativamente, los anticuerpos pueden ser “anticuerpos lineales” como se describen en Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos de Fd en tandem (Vh -Ch1- Vh y Vl) que forman un par de regiones de union al antfgeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespedficos o monoespedficos.
Se contemplan anticuerpos con mas de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespedficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
Inmunoadhesinas
El diseno mas simple y mas directo de inmunoadhesinas combina el (los) dominio(s) de union de la adhesina (por ejemplo, el dominio extracelular (ECD) de un receptor) con las regiones bisagra y Fc de una cadena pesada de la inmunoglobulina. Generalmente, cuando se preparan las inmunoadhesinas de la presente invencion, el acido nucleico que codifica el dominio de union de la adhesina se fusionara con el extremo C con el acido nucleico que codifica el extremo N de una secuencia del dominio constante de inmunoglobulina; sin embargo, tambien son posibles fusiones del extremo N.
Normalmente, en tales fusiones el polipeptido quimerico codificado retendra la bisagra al menos funcionalmente activa, dominios Ch2 y Ch3 de de la region constante de una cadena pesada de la inmunoglobulina. Tambien se hacen fusiones al extremo C de la porcion Fc de un dominio constante, o extremo N inmediatamente a la Ch1 de la cadena pesada o la region correspondiente de la cadena ligera. El sitio preciso en el que se hace la fusion no es cntico; sitios particulares son muy conocidos y pueden seleccionarse con el fin de optimizar la actividad biologica, secrecion, o caractensticas de union de la inmunoadhesina.
En algunas realizaciones, la secuencia de adhesina esta fusionada con el extremo N del dominio Fc de inmunoglobulina G1 (Ig G1). Es posible fusionar la region constante de la cadena pesada entera con la secuencia de adhesina. Sin embargo, preferentemente, una secuencia que empieza en la region bisagra justo en la direccion 5' del sitio de escision por paparna que define Fc de IgG qmmicamente (es decir, resto 216, tomando el primer resto de la region constante de la cadena pesada para que sea 114), o sitios analogos de otras inmunoglobulinas, se usa en la fusion. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la adhesina esta fusionada con (a) la region bisagra y o Ch2 y Ch3 o (b) Ch1, bisagra, dominios Ch2 y Ch3, de una cadena pesada de IgG.
Para inmunoadhesinas biespedficas, las inmunoadhesinas se ensamblan como multfmeros y particularmente como heterodfmeros o heterotetrameros. Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas tendran estructuras unitarias conocidas. Una unidad estructural de cuatro cadenas basica es la forma en la que existen IgG, IgD e IgE. Una unidad de cuatro cadenas se repite en las inmunoglobulinas de peso molecular mas alto; IgM generalmente existe como un pentamero de cuatro unidades basicas mantenidas juntas por enlaces disulfuro. La globulina IgA y ocasionalmente la globulina IgG, tambien pueden existir en forma multfmera en el suero. En el caso de multfmero, cada una de las cuatro unidades puede ser igual o diferente.
Diversas inmunoadhesinas ensambladas a modo de ejemplo dentro del alcance en el presente documento se representan esquematicamente a continuacion:
(a) ACl-ACl;
(b) ACh-(ACh, ACl-ACh, ACl-VhCh, o VlCl-ACh);
(c) ACl-ACh-(ACl-ACh, ACl-VhCh, VlCl-ACh, o VlCl-VhCh)
(d) ACl-VhCh -(ACh, o ACl-VhCh, o VlCl-ACh);
(e) VlCl- ACh -(ACl-Vh Ch, o VlCl-ACh); y
(f) (A-YMVlCl-VhCh)2,
en lasque cada A representa secuencias de aminoacidos de adhesina identicas o diferentes;
Vl es un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vh es un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Cl es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Ch es un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina;
n es un numero entero superior a 1;
Y designa el resto de un agente de reticulacion covalente.
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Por brevedad, las estructuras anteriores solo muestran caractensticas clave; no indican dominios de union (J) u otros de las inmunoglobulinas, ni se muestran enlaces disulfuro. Sin embargo, si tales dominios se requieren para la actividad de union, deben construirse para estar presentes en las localizaciones habituales que ocupan en las moleculas de inmunoglobulina.
Alternativamente, las secuencias de adhesina pueden insertarse entre secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera de la inmunoglobulina, de forma que se obtenga una inmunoglobulina que comprende una cadena pesada quimerica. En esta realizacion, las secuencias de adhesina estan fusionadas al extremo 3' de una cadena pesada de la inmunoglobulina en cada brazo de una inmunoglobulina, tanto entre la bisagra y el dominio Ch2, como entre los dominios Ch2 y Ch3. Se ha informado de construcciones similares por Hoogenboom, et al., Mol. Immunol. 28:10271037 (1991).
Aunque la presencia de una cadena ligera de la inmunoglobulina no es requerida en las inmunoadhesinas de la presente invencion, una cadena ligera de la inmunoglobulina podna estar presente tanto covalentemente asociada a un polipeptido de fusion de adhesina-cadena pesada de la inmunoglobulina, como directamente fusionada con la adhesina. En el primer caso, el ADN que codifica una cadena ligera de la inmunoglobulina normalmente se co- expresa con el ADN que codifica la protema de fusion adhesina-cadena pesada de la inmunoglobulina. Tras la secrecion, la cadena pesada y la cadena ligera tubridas se asociaran covalentemente para proporcionar una estructura similar a inmunoglobulina que comprende dos pares de cadena pesada-cadena ligera de la inmunoglobulina unidas por disulfuro. Metodos adecuados para la preparacion de tales estructuras se desvelan, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N.° 4.816.567, concedida el 28 de marzo de 1989.
Las inmunoadhesinas se construyen lo mas convenientemente fusionando la secuencia de ADNc que codifica la porcion de adhesina en marco con una secuencia de ADNc de inmunoglobulina. Sin embargo, tambien puede usarse fusion con fragmentos de inmunoglobulina genomicos (vease, por ejemplo, Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990); y Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)). El ultimo tipo de fusion requiere la presencia de secuencias reguladoras de Ig para la expresion. Los ADNc que codifican regiones constantes de la cadena pesada de IgG pueden aislarse basandose en las secuencias publicadas de bibliotecas de ADNc procedentes de bazo o de linfocitos de sangre periferica, por tecnicas de hibridacion o por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Los ADNc que codifican la “adhesina” y las partes de inmunoglobulina de la inmunoadhesina se insertan en tandem en un vector plasmfdico que dirige la eficiente expresion en las celulas huesped elegidas.
Expresion de polipeptidos
El polipeptido (por ejemplo, anticuerpo) que va a producirse usando el metodo descrito en el presente documento se produce generalmente usando tecnicas recombinantes.
Celulas huesped adecuadas para clonar o expresar los ARNip en los vectores en el presente documento son las celulas procariotas, de levadura, o eucariotas superiores. Procariotas adecuados para este fin incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescens y Shigella, ademas de bacilos tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, 41P de B. licheniformis desvelado en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes.
Ademas de microbios procariotas, microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levadura son huespedes de clonacion o expresion adecuados para vectores que codifican polipeptidos. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadero comun, es el mas comunmente usado de entre los microorganismos huesped eucariotas inferiores. Sin embargo, varios otros generos, especies y cepas estan comunmente disponibles y son utiles en el presente documento, tales como Schizosaccharomyces pombe; huespedes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (aTcC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, huespedes de Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.
Celulas cultivadas adecuadas para la expresion del polipeptido glucosilado proceden de organismos multicelulares. Los ejemplos de celulas de invertebrados incluyen celulas vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y variantes y celulas huesped de insecto permisivas correspondientes de huespedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Una variedad de cepas virales para transfeccion esta publicamente disponible, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV y tales virus pueden usarse como virus en el presente documento segun la presente invencion, particularmente para la transfeccion de celulas de Spodoptera frugiperda. Tambien puede utilizarse cultivos de celulas de planta de algodon, trigo, patata, soja, petunia, tomate y tabaco como huespedes.
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Sin embargo, el mayor interes ha sido en celulas de vertebrados y la propagacion de celulas de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Ejemplos de lmeas celulares de mairnfero utiles incluyen, pero no se limitan a, celulas CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); celulas de rinon de embrion humano (celulas 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspension, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); celulas de rinon de bebes de hamster (BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chino/DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); celulas de Sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); celulas de rinon de mono (CV1 AtCC CCL 70); celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); celulas de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); celulas de rinon canino (MDCK, ATCC CcL 34); celulas de Idgado de rata bufalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL 75); celulas de Idgado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de raton (mMt 060562, ATcC CCL51); celulas TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); celulas MRC 5; celulas FS4; y celulas de hepatoma humano (Hep G2).
Las celulas huesped se transforman con los vectores de expresion o de clonacion anteriormente descritos para la produccion de polipeptidos y se cultivan en medio nutriente convencional modificado segun sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
Las celulas huesped usadas para producir el polipeptido usado en los metodos de la presente invencion pueden cultivarse en una variedad de medios. Para cultivar las celulas huesped son adecuados medios de cultivo comercialmente disponibles tales como F10 de Ham (Sigma), medio esencial mmimo ((MEM), (Sigma)), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), (Sigma)) o medio de Eagle modificado por Dulbecco GIBCO®: Mezcla nutriente F-12 (Invitrogen). Ademas, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem, 102:255 (1980), patentes de EE.UU. n° 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/00195; o la patente de EE.UU. N.° Re. 30.985 puede usarse como medios de cultivo para las celulas huesped. Tambien pueden usarse otros medios de crecimiento definidos o sinteticos y el medio apropiado para cultivar un tipo espedfico de celulas huesped es conocido por un experto en la materia de la biologfa molecular y celular. Cualquiera de estos medios puede complementarse segun se necesite con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidermico), sales (tales como cloruro sodico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tal como HEPES), nucleotidos (tales como adenosina y timidina), antibioticos (tales como el farmaco GENTAMYCIN™, higromicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorganicos normalmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energfa equivalente. Tambien puede incluirse cualquier otro complemente necesario a concentraciones apropiadas que senan conocidas para aquellos expertos en la materia. Las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH y similares son aquellas previamente usadas con la celula huesped seleccionada para expresion y seran evidentes para el experto general.
Pueden usarse condiciones de cultivo celular estandar para cultivar las celulas. Las celulas se cultivan y mantienen a una temperatura apropiada, mezcla de gases y pH (tal como a aproximadamente 20 °C a aproximadamente 37 °C, a aproximadamente el 6 % a aproximadamente el 84 % de CO2 y a un pH entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9). En algunas realizaciones, las celulas se cultivan en un medio de celulas apropiado a 37 °C durante las primeras 48 horas y se desplaza a 33 °C durante los 12 dfas siguientes. Pueden realizarse reacciones bajo condiciones aerobias o anoxicas basandose en los requisitos de las celulas huesped. En algunas realizaciones, las celulas se cultivan usando cualquier modo de fermentacion conocido, que incluye, pero no se limita a, procesos discontinuos, de lotes alimentados, o continuos.
Si se usan tecnicas recombinantes, el polipeptido puede producirse intracelularmente, en el espacio periplasmico, o directamente secretarse en el medio. Si el polipeptido se produce intracelularmente, como una primera etapa, el residuo particulado, tanto celulas huesped como celulas lisadas (por ejemplo, resultantes de la homogeneizacion), se eliminan, por ejemplo, por centrifugacion o ultrafiltracion. Si el polipeptido es secretado en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresion se concentran primero usando un filtro de concentracion de protemas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltracion Amicon o Millipore Pellicon.
Kits
La presente invencion tambien proporciona kits que comprenden composiciones e instrucciones para su uso que comprenden la descripcion de los metodos de la invencion. Los kits pueden comprender celulas cultivadas, ARNip, secuencias diana, agentes de transfeccion, instrucciones para los metodos de la presente invencion, o cualquier combinacion de los mismos.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar, la invencion.
Ejemplos
Se entiende que los ejemplos y realizaciones en el presente documento se describen para fines ilustrativos solo y que diversas modificaciones o cambios en luz de los mismos se sugeriran a personas expertas en la materia y deben incluirse dentro del espmtu y alcance de la presente solicitud.
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Ejemplo 1: La inactivacion de PDHK1, PDHK2, PDHK3 y LDHa reduce la produccion de lactato y aumenta el tftulo/productividad de anticuerpos
Materiales y metodos
Construccion del vector que se dirige a LDHa/PDHK1, 2, 3
Se selecciono la secuencia de direccionamiento para LDHa como se describe previamente por Kim y Lee et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74(1):152-159 (2007) y la secuencia de ARNip de LDHa es CTCGATTCCGTTATCTGAT (SEQ ID NO: 1). Para disenar la secuencia dirigida a ARNip para la pDhK, se clonaron secuencias de ADNc parciales para CHO PDHK1, 2 y 3 por reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa de (RT-PCR) con cebadores localizados en las regiones altamente conservadas de las PDHK. Se usaron secuencias parcialmente clonadas para el diseno de la secuencia de ARNip segun el metodo descrito por Elbashier et al. (Methods 26:199213 (2002)).
Secuencia de direccionamiento de PDHK1 (ARNip): GCAGTTCCTGGACTTCGGA (SEQ ID NO: 2)
Secuencia de direccionamiento de PDHK2 (ARNip) : CATTCAGTACTTCTTGGAC (SEQ ID NO: 3)
Secuencia de direccionamiento de PDHK3 (ARNip): TGTAGCTGATGTCGTGAAA (SEQ ID NO: 4)
Se construyo la construccion individual que contiene secuencias de direccionamiento para LDHa y las PDHK usando el vector de higromicina pSilencer 3.1-H1 (Cat. N.° AM5766, Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX). Se inserto ARNip de LDHa en el sitio KasI de pSilencer 3.1, con una adicion del promotor U6 de pSilencer 2.1 en su extremo 5' inmediato. Se insertaron secuencias de ARNip para ARNip de PDHK1 y 2 en los sitios BamHI/HindIII y HindIII, respectivamente. Se introdujo un sitio BgIII al lado 3' del ARNip de PDHK2 y se uso para la insercion de ARNip de PDHK3. Para el control negativo, se utilizo el vector pSilencer 3.1 que contiene una secuencia de ARNip reordenada.
Cultivo celular
Se cultivaron celulas CHO deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) en un medio basado en DMEM/F12 patentado en recipientes de matraz oscilante a 37 °C y 5 % de CO2. Las celulas se sometieron a pases cada tres a cuatro dfas.
Desarrollo de la linea celular de ARNip estable (clon de ARNip)
Se transfecto una lrnea celular CHO resistente a metotrexato (MTX) 25 nM y que expresaba un anticuerpo monoclonal recombinante usando Lipofectamine 2000 CD (Cat. N.° 12566-014, Invitrogen, Carlsbad, CA) segun la recomendacion del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las celulas transfectadas se centrifugaron y se sembraron en medio selectivo (libre de glicina, hipoxantina y timidina) basado en DMEM/F-12 que contema MTX 25 nM y 400 ug/ml de higromicina (Cat N.° 10687010, Invitrogen, Carlsbad, CA). Se sembraron celulas resuspensas en placas de 96 pocillos para generar clones individuales. Se obtuvieron clones de transfeccion de plasmido de ARNip que conteman secuencias de direccionamiento para los genes de LDHa y de las PDHK, mientras que los clones de control se obtuvieron por transfeccion de plasmido de control (Cat N.° AM5766, Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX) que contema una secuencia reordenada disenada por fabricacion sin homologfa apreciable por genes conocidos.
Analisis de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR o Taqman)
Se aislaron ARN total de clones individuales usando el kit RNeasy 96 (Cat N.° 74181, Qiagen) y se trataron con digestion por DNasa (Cat N.° 79254, set de DNasa libre de RNasa, Qiagen) para eliminar el ADN residual posiblemente presente en muestras de ARN aisladas. Se realizo Taqman usando mezcla maestra universal de qRT- PCR segun las instrucciones del fabricante (Cat N.° 4309169, Applied Biosystems) y los niveles de expresion de las PDHK y LDHa se normalizaron al gen de mantenimiento p-microglobulina.
Los cebadores y las secuencias de las sondas usadas para el analisis Taqman fueron del siguiente modo:
cebador directo de PDHK1: GCCCATCTCATCGAAAACA (SEQ ID NO: 5) cebador inverso de PDHK1: AGCCATCTTTAATGACTTCGACTAC (SEQ ID NO: 6) sonda de PDHK1: TCGCAGTTTGGATTTATGCTTCCAATG (SEQ ID NO: 7) cebador directo de PDHK2: GATCTGTCCATCAAAATGAGTGA (SEQ ID NO: 8) cebador inverso de PDHK2: TGTGGAGTACATGTAGCTGAAGAG (SEQ ID NO: 9) sonda de PDHK2: CTCTCAATCTTCCTCAAGGGGACACC (SEQ ID NO: 10) cebador directo de PDHK3: CAGCCTGGAGCCTACAAGA (SEQ ID NO: 11) cebador inverso de PDHK3: GGCATACAGTCGAGAAATTGG (SEQ ID NO: 12)
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sonda de PDHK3: AAGCCATAACCAAATCCAGCCAAGG (SEQ ID NO: 13)
cebador directo de LDHa: GCCGAGAGCATAATGAAGAA (SEQ ID NO: 14)
cebador inverso de LDHa: CCATAGAGACCCTTAATCATGGTA (SEQ ID NO: 15)
sonda de LDHa: CTTAGGCGGGTGCATCCCATTT (SEQ ID NO: 16)
cebador directo de p-microglobulina: TCCTCTCAGTGGTCT GCT tGg (SEQ ID NO: 17)
cebador inverso de p-microglobulina: TGGCGTGTGTAGACTTGCACTT (SEQ ID NO: 18)
sonda de p-microglobulina: TGCCATCCAGCGTCCCCCA (SEQ ID NO: 19)
Evaluacion de clones en matraz oscilante de lotes alimentados
Se sembraron doce clones de ARNip y doce clones de control en el medio de produccion patentado con un pH de 7,15 empleando un proceso de cultivo de lotes alimentados de 14 dias con una alimentacion en bolo en el dia 3 y un desplazamiento de la temperatura de 37 °C a 33 °C en el dia 2. La viabilidad celular y las cifras de celulas viables se monitorizaron por exclusion con colorante azul de tripano usando Vicell (Beckman Coulter). Las concentraciones de lactato se midieron en el dia 3, 7, 10 y 14 usando un analizador Nova Bioprofile (Nova biomedical). La velocidad promedio de produccion de lactato espedfica de celula, qs se calcula como la pendiente del grafico del numero de celulas total integrado y el lactato acumulado producido, [St So], basado en la ecuacion de equilibrio de masa de lactato formulada con respecto al volumen de cultivo completo:
t
S,-So =<ls\Xdt
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en la que St es la cantidad total de lactato en el volumen de cultivo (mg) en el tiempo t, So es la cantidad total de lactato en el volumen de cultivo (mg) en el tiempo t=0, X es el numero total de celulas en el volumen de cultivo en cualquier momento dado t y qs es la velocidad de produccion de lactato espedfica en mg/celula/dia. Como la ecuacion anterior se escribe para el intervalo de tiempo entre t=0 y t=t, qs es la velocidad promedio de produccion de lactato durante este intervalo de tiempo. Por la convencion usada en este trabajo, si se produce mas lactato del que es consumido por la celula, entonces el valor de qs es positivo.
Operacion de lotes alimentados en biorreactor
Se realizaron experimentos en biorreactor en biorreactores de tanque con agitacion de 2 l (Applikon, Foster City, CA) operados a 1,5 l de volumen de trabajo. Despues de una alimentacion de nutriente concentrado a las 72 horas despues de la inoculacion, se anadio glucosa segun se necesitara durante los cultivos de lotes alimentados de 14 dias. El oxigeno disuelto y la agitacion se mantuvieron en los cultivos de biorreactor a los puntos de consigna de 30 % de saturacion de aire y 275 rpm, respectivamente. Se controlo el pH del cultivo a 7,0 mediante la adicion de gas CO2 o Na2CO3 1 M. La temperatura del cultivo se mantuvo a 37 °C durante las primeras 48 horas y se desplazo a 33 °C a partir de aqm. El control del proceso en cada biorreactor se logro usando una unidad de control digital de B. Braun Biotech (Allentown, PA).
Analisis de muestras
Se determino el trtulo de anticuerpos usando cromatografia de afinidad por protema A convencional con deteccion de UV. Vease Fahrner et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:121-128 (1999). Se analizaron muestras de cultivo para la concentracion y viabilidad de celulas viables por el contador de celulas ViCell AS (Beckman Coulter, Fullerton, CA), pH y lactato por el bioanalizador Bioperfil 400 (Nova Biomedical, Waltham, MA) y osmolalidad por un osmometro de multiples muestras (Advanced Instruments, Norwood, MA).
Analisis estadistico
Se llevo a cabo la prueba de de la t de Student bilateral usando el software JMP.
Resultados
Construccion de un vector de ARNip que se dirige a las PDHK y a LDHa
Hay cuatro genes PDHK informados por Harris et al. (Adv. Enzyme Regul. 42:249-59 (2002) en celulas de mamifero. Para evaluar si los cuatro genes PDHK estan presentes en celulas CHO, se disenaron cuatro conjuntos de cebadores de RT-PCR basados en las regiones conservadas entre secuencias de PDHK humana y de raton. Los resultados de PCR revelaron que aun cuando los cuatro ARNm de PDHK pueden detectarse en celulas CHO, el nivel de ARNm de PDHK4 es minimo y mucho mas bajo que de los otros 3 PDHK en celulas CHO deficientes en DHFR (deficiente en dihidrofolato reductasa). Por lo tanto, solo la expresion de genes PDHK1,2 y 3 se inactivo junto con el gen LDHa. Para LDHa y cada PDHK, se disenaron tres secuencias de ARNip y se probaron en celulas CHO para elegir la secuencia de ARNip que presentaba la mejor regulacion por disminucion del gen diana. Se selecciono la mejor secuencia de ARNip para LDHa basandose en los hallazgos por Kim y Lee. Appl. Microbiol. Biotechnol.
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74(1):152-9 (2007). Se construyeron la secuencia de ARNip para LDHa y PDHK en un unico vector en el que el ARNip para LDHa estaba bajo el control del promotor U6, mientras que los ARNip para cada PDHK fueron conducidos por promotores H1 (Figura 1).
Generacion de clones estables con expresion reducida de PDHK1, 2, 3 y LDHa
La construccion de ARNip de las PDHK y LDHa se transfecto en celulas CHO que expresaban un anticuerpo monoclonal para conseguir clones individuales llamados clones de ARNip. Se ensayaron clones de ARNip individuales para la expresion de ARNm de cuatro genes, PDHK1, 2, 3 y LDHa, usando analisis Taqman. Se identificaron doce clones de ARNip que presentaron la expresion mas reducida de los cuatro genes anteriores (Figura 2) para analisis adicional. El vector de control que contema la secuencia reordenada tambien se transfecto en las mismas celulas que expresan anticuerpo que para conseguir clones individuales llamados clones de control. Se eligieron aleatoriamente doce clones de control como control y tambien se analizaron sus niveles de expresion de ARNm de genes LDHa y PDHK1, 2 y 3 por Taqman. En promedio, los niveles de expresion de ARNm para LDHa, PDHK1, 2 y 3 en los doce clones de ARNip seleccionados se redujeron el 90%, 32%, 83% y el 70%, respectivamente, en comparacion con los clones de control (Figura 2).
Evaluacion en matraz oscilante de lotes alimentados de clones de ARNip y de control
(a) Niveles de lactato reducidos y pH superiores en medios de cultivo observados en clones de ARNip
Para evaluar el efecto de la regulacion por disminucion mediada por ARNip de LDHa y PDHK sobre la produccion de lactato, se evaluaron 12 clones de ARNip y 12 de control en recipientes de matraz oscilante en el medio patentado de los presentes inventores empleando un proceso de lotes alimentados de 14 dfas y de desplazamiento de la temperatura. El experimento se ha repetido durante tres veces y se observaron resultados similares. Los resultados de un conjunto de experimento se muestran como representativos en las figuras. Los resultados mostraron que, en comparacion con los clones de control, los clones de ARNip tuvieron niveles de lactato reducidos (Figura 3) en general. En el dfa 14, los clones de ARNip mostraron un 91 % menos de lactato en promedio que los clones de control (p<0,0001) (Figura 3A). De acuerdo con el nivel de lactato mas bajo en los clones de ARNip con respecto al periodo de produccion de 14 dfas, la velocidad promedio de produccion de lactato para los clones de ARNip fue un valor negativo de 0,02 mg/106 celulas/dfa, sugiriendo que la velocidad de la smtesis de lactato es inferior a la velocidad de consumo. A diferencia, la velocidad promedio de produccion de lactato fue de 0,01 mg/106 celulas/dfa para los clones de control, que indica que la velocidad global de la smtesis de lactato es superior a la velocidad de consumo. Esta diferencia en la velocidad de produccion de lactato entre clones de ARNip y de control fue estadfsticamente significativa (p<0,002) (Figura 3B). Como el nivel de lactato en los medios afecta al pH, en el dfa 14, el pH promedio para los clones de control disminuyo a 6,54, mientras que el pH promedio para los clones de ARNip fue 7,04 (Figura 3C). El pH promedio mas bajo observado esta de acuerdo con el nivel promedio mas alto de lactato para los clones de control.
b) Elevado titulo de anticuerpos y productividad especifica (Op) observada en clones de ARNip
Para investigar si la inactivacion de la expresion genica de PDHK y LDHa afecta la produccion de anticuerpos, se recogieron muestras de experimentos en matraz oscilante de lotes alimentados en el dfa 3, 7, 10 y 14 para medir los tftulos de anticuerpos por cromatograffa de protema A. Los datos mostraron que, en promedio, los clones de ARNip produjeron un 68 % mas de anticuerpo que los clones de control (Figura 4A, p<0,022) y la productividad espedfica de celulas promedio (Qp) medida en pg/celula-d para los clones de ARNip fue el 75 % superior a aquella para los clones de control (Figura 4B, p<0,006). Para evaluar el crecimiento celular, se recogieron muestras de matraces oscilantes en el dfa 3, 7, 10 y 14 para medir las cifras de celulas viables y las viabilidades para calcular la cifra de celulas viables integradas (IVCC). A diferencia de los tftulos de anticuerpos y Qps, no se observaron diferencias del crecimiento celular apreciables entre los dos grupos (Figura 4C). Los atributos de calidad del producto de anticuerpo que incluyen perfil de glicanos, variantes de carga y porcentaje de agregacion fueron comparables entre los clones de ARNip y de control.
Evaluacion de cultivos de lotes alimentados en biorreactor de clones de control de ARNip
Como el cultivo en biorreactor de lotes alimentados de pH controlado es el modelo de reduccion de escala estandar para la fabricacion a gran escala, se investigo adicionalmente el rendimiento de algunos clones de ARNip y de control en biorreactores de 2 l. Dada la limitacion en la disponibilidad de biorreactores y la complejidad experimental, no se ejecutaron 12 clones de ARNip y 12 de control por duplicado debido a impracticabilidad. Se seleccionaron dos clones de ARNip representativos y dos clones de control representativos cuyos perfiles metabolicos representaron mejor el rendimiento promedio para cada grupo para minimizar el sesgo de seleccion, junto con la lrnea parental usada para las transfecciones de plasmido de ARNip y de control durante la evaluacion en biorreactores de 2 l. Se recogieron muestras de cultivo celular diariamente (excepto en los dfas 6 y 13) para lactato, glucosa, osmolalidad y analisis de tftulos. Los niveles de lactato para los clones de ARNip siguieron generalmente planos, mientras que los niveles de lactato para clones de control y parentales continuaron aumentaron durante el periodo de produccion de 14 dfas. En el dfa 14, los dos clones de ARNip tuvieron un 86 % de nivel de lactato mas bajo en promedio en medios
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que los clones de control o el clon parental (Figura 5A) y tuvieron velocidad de produccion de lactato espedfica mas baja que los clones de control y la lmea parental (Figura 5B). Similarmente, las osmolaridades para los clones de ARNip permanecieron a aproximadamente 300 mOsm, mientras que las osmolaridades para los clones de control o el clon parental continuaron aumentando durante el periodo de produccion de l4 dfas. En el dfa 14, las osmolaridades promedio para 2 clones de ARNip fueron un 60 % mas bajas que aquellas de clones de control y parental (Figura 5C). Y, lo que es mas importante, en el dfa 14, los clones de ARNip produjeron en promedio el 125% mas de anticuerpo que los clones de control (Figura 6). Como se observa en la evaluacion de matraces oscilantes de lotes alimentados, los clones de ARNip y de control tienen viabilidades y crecimiento celular comparables en biorreactores de 2 l.
Discusion
El estudio previo demostro que regular por disminucion la expresion del gen LDHa solo fue capaz de reducir la produccion de lactato. Kim y Lee, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74(1):152-9 (2007). Sin embargo, en su estudio, a pesar del 45-79 % de reduccion en el nivel de lactato, no hubo mejora significativa en Qp y tftulo de producto, sugiriendo que la inactivacion de LDHa sola en celulas CHO no es suficiente para mejorar Qp y el rendimiento de producto eficientemente. Ademas, el regular simultaneamente por disminucion PDHK1, 2 y 3 en celulas CHO nunca fue suficiente para reducir el nivel de lactato ni para aumentar la productividad de anticuerpos. Como la unica forma de las celulas de generar lactato es mediante la reduccion de piruvato y el piruvato no solo puede convertirse en lactato por LDH, sino tambien convertirse en acetil-CoA por PDH entrando en el ciclo de TCA para ser oxidado, la reduccion de la produccion de lactato por inactivacion de la expresion de LDHa y la promocion de piruvato en el ciclo de TCA por inactivacion de PDHK puede sinergizar para reducir el nivel de lactato y para proporcionar celulas con mas energfa y posiblemente productos intermedios metabolicos que conducen a elevada produccion de anticuerpos.
Se redujo sustancialmente la expresion de LDHa, PDHK2 y PDHK3 y la expresion de PDHK1 se redujo moderadamente en todos los clones probados. Es probable la reduccion moderada en la expresion de PDHKl debido a secuencia de direccionamiento de ARNip no optima ya que se observo reduccion moderada con tres secuencias de ARNip de PDHK1 probadas. Se observaron las variaciones en la produccion de lactato y la produccion de anticuerpos en clones de control y de ARNip ya que cada clon tuvo diferentes niveles de expresion de LDHa y PDHK. Sin embargo, en el dfa 14, el nivel promedio de lactato en el grupo de ARNip fue mas bajo que en el grupo de control que condujo al pH promedio mas bajo para clones de control que en los clones de ARNip en el cultivo de matraces oscilantes de lotes alimentados. Y, lo que es mas importante, ademas de velocidad de produccion de lactato espedfica mas bajo, el tftulo promedio y Qp para los clones de ARNip aumento el 68 % y el 75 %, respectivamente, en comparacion con aquellos de clones de control sin diferencias perceptibles en el crecimiento celular y la calidad de producto entre los clones de ARNip y de control. De forma interesante, para los tftulos del dfa 14 frente a los niveles de lactato del dfa 14, hubo una buena relacion inversa entre tftulos y niveles de lactato entre los clones de control, pero no entre los clones de ARNip. Las diferencias observadas en los tftulos y niveles de lactato entre los clones de control puede ser probablemente que el clon parental es heterogeneo en la productividad de anticuerpos y el metabolismo celular aun cuando la lmea celular se derivo de un unico clon. Se evaluaron un total de 12 clones de control para tener en cuenta la variacion clonal. Los datos indican que la inactivacion de LDHa y PDHK reduce simultaneamente el nivel de lactato y mejora la produccion de anticuerpos en celulas CHO. Por lo tanto, para el desarrollo de procesos de produccion de anticuerpos robustos y productivos, la regulacion por disminucion simultanea de tanto LDHa como PDHK proporciona un enfoque eficiente.
Se investigo ademas el rendimiento de 2 clones de control y 2 de ARNip en biorreactores de 2 l con duplicados. Se seleccionaron aquellos 4 clones para representar mejor la productividad promedio en cada grupo basandose en evaluaciones de matraces oscilantes de lotes alimentados. Similar a las observaciones del experimento en matraz oscilante, los clones de ARNip tuvieron niveles de lactato mas bajos y tftulos mas altos que los clones de control en la evaluacion en biorreactor de 2 l. Dado que el pH esta controlado en los biorreactores de 2 l de lotes alimentados, los cultivos de control presentaron osmolalidad mas elevada que los cultivos de ARNip ya que se necesitaron niveles de lactato mas altos en clones de control mas adicion de alcali para mantener el pH de consigna.
En resumen, los datos de las evaluaciones en matraz oscilante de 2 l y en biorreactor de 2 l demostraron que la inactivacion simultanea de LDHa, PDHK1, 2 y 3 en celulas CHO es eficaz en reducir el nivel de lactato y en aumentar el tftulo de anticuerpos sin afectar el crecimiento celular y la calidad del producto.

Claims (43)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de reduccion de la produccion de lactato en celulas cultivadas, comprendiendo el metodo cultivar celulas que comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARN interferente pequeno (ARNip) espedfico para una lactato deshidrogenasa (LDH) y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una piruvato deshidrogenasa quinasa (PDHK), en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor, en el que los ARNip silencian o regulan por disminucion la transcripcion genica de la LDH y la PDHK.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la LDH es LDHa.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las celulas cultivadas comprenden ademas una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una segunda PDHK y en el que la tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un tercer promotor.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que las celulas cultivadas comprenden ademas una cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una tercera PDHK y en el que la cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un cuarto promotor.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que las celulas cultivadas comprenden ademas una quinta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una quinta PDHK y en el que la quinta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un quinto promotor.
  6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 y 5, en el que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1, PDHK2, PDHK3 y PDHK4.
  7. 7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4, en el que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1, PDHK2 y PDHK3.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 1 o 3, en el que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1 y PDHK2.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 1 o 3, en el que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1 y PDHK3.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 1 o 3, en el que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK2 y PDHK3.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 4, en el que la LDH es LDHa, en el que la primera PDHK es PDHK1, en el que la segunda PDHK es PDHK2 y en el que la tercera PDHK es PDHK3.
  12. 12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 y 5, en el que las celulas cultivadas producen un polipeptido heterologo.
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 12, en el que el polipeptido heterologo es un anticuerpo.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 4, en el que una velocidad promedio de produccion de lactato de las celulas cultivadas es inferior a un valor negativo de 0,02 mg/106 celulas/dfa.
  15. 15. El metodo de la reivindicacion 4, en el que las celulas cultivadas tienen una productividad espedfica superior de al menos 75 % en comparacion con las celulas cultivadas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para las PDHK y la LDH.
  16. 16. El metodo de la reivindicacion 4, en el que las celulas cultivadas tienen una osmolalidad inferior a 300 mOsm.
  17. 17. El metodo de la reivindicacion 4, en el que las celulas cultivadas tienen una productividad de polipeptidos superior de al menos 68 % en comparacion con las celulas cultivadas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que comprende que codifica un ARNip espedfico para las PDHKy la LDH.
  18. 18. El metodo de la reivindicacion 12 o 13, en el que las celulas cultivadas son celulas de mairnfero.
  19. 19. Un metodo de silenciamiento o regulacion por disminucion de la transcripcion de lactato deshidrogenasa (LDH) y piruvato deshidrogenasa quinasa (PDHK) en una celula cultivada que comprende:
    5
    10
    15
    20
    25
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    55
    60
    65
    introducir en la celula un vector que comprende una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARN interferente pequeno (ARNip) espedfico para la LDH y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para la PDHK, en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor, en el que los ARNip se expresan, silenciando o regulando asf por disminucion la transcripcion genica de la LDH y la PDHK.
  20. 20. Un metodo de produccion de una celula que presenta produccion de lactato reducida en cultivo, que comprende introducir en la celula un vector que comprende una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARN interferente pequeno (ARNip) espedfico para la LDH y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para la PDHK, en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor, en el que los ARNip se expresan, silenciando o regulando asf por disminucion la transcripcion genica de la LDH y la PDHK.
  21. 21. Celulas en cultivo que comprenden una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un primer ARN interferente pequeno (ARNip) espedfico para una lactato deshidrogenasa (LDH) y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un segundo ARNip espedfico para una piruvato deshidrogenasa quinasa (PDHK), en las que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en las que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor, en las que los ARNip silencian o regulan por disminucion la transcripcion genica de la LDH y la PDHK.
  22. 22. Las celulas de la reivindicacion 21, en las que las celulas comprenden ademas una tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una segunda PDHK y en las que la tercera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un tercer promotor.
  23. 23. Las celulas de la reivindicacion 22, en las que las celulas comprenden ademas una cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una tercera PDHK y en las que la cuarta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un cuarto promotor.
  24. 24. Las celulas de la reivindicacion 23, en las que las celulas comprenden ademas una quinta secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una quinta PDHK y en las que la quinta secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un quinto promotor.
  25. 25. Las celulas de una cualquiera de las reivindicaciones 21, 22, 23 y 24, en las que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1, PDHK2, PDHK3 y PDHK4.
  26. 26. Las celulas de una cualquiera de las reivindicaciones 21, 22 y 23 en las que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1, PDHK2 y PDHK3.
  27. 27. Las celulas de la reivindicacion 21 o 22, en las que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1 y PDHK2.
  28. 28. Las celulas de la reivindicacion 21 o 22, en las que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK1 y PDHK3.
  29. 29. Las celulas de la reivindicacion 21 o 22, en las que la PDHK se selecciona del grupo que consiste en PDHK2 y PDHK3.
  30. 30. Las celulas de la reivindicacion 23, en las que la LDH es LDHa, en las que la primera PDHK es PDHK1, en las que la segunda PDHK es PDHK2 y en las que la tercera PDHK es PDHK3.
  31. 31. Las celulas de la reivindicacion 21, en las que las celulas producen un polipeptido heterologo.
  32. 32. Las celulas de la reivindicacion 31, en las que el polipeptido heterologo es un anticuerpo.
  33. 33. Las celulas de la reivindicacion 23, en las que las celulas tienen una velocidad promedio de produccion de lactato inferior a un valor negativo de 0,02 mg/106 celulas/dfa.
  34. 34. Las celulas de la reivindicacion 23, en las que las celulas tienen una productividad espedfica superior de al menos 75 % en comparacion con las celulas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que comprende la LDH y las PDHK.
  35. 35. Las celulas de la reivindicacion 23, en las que las celulas tienen una osmolalidad inferior a 300 mOsm.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
  36. 36. Las celulas de la reivindicacion 23, en las que las celulas tienen una productividad de polipeptidos superior de al menos 68 % en comparacion con las celulas sin la secuencia de acidos nucleicos heterologa que comprende la LDH y las PDHK.
  37. 37. Las celulas de la reivindicacion 31 o 32, en las que las celulas son celulas de mairnfero.
  38. 38. Un vector que comprende una primera secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARN interferente pequeno (ARNip) espedfico para una lactato deshidrogenasa (LDH) y una segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa que codifica un ARNip espedfico para una piruvato deshidrogenasa quinasa (PDHK), en el que la primera secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un primer promotor y en el que la segunda secuencia de acidos nucleicos heterologa esta unida operativamente a un segundo promotor.
  39. 39. Un metodo de reduccion de la produccion de lactato en celulas cultivadas, comprendiendo el metodo cultivar celulas que expresan a) un ARN interferente pequeno (ARNip) espedfico para una lactato deshidrogenasa (LDH) y b) un ARNip espedfico para una piruvato deshidrogenasa quinasa (PDHK), en el que los ARNip se expresan, silenciando o regulando asf por disminucion la transcripcion genica de la LDH y la PDHK.
  40. 40. El metodo de la reivindicacion 39, en el que las celulas cultivadas expresan adicionalmente un ARNip espedfico para una segunda PDHK.
  41. 41. El metodo de la reivindicacion 40, en el que las celulas cultivadas expresan adicionalmente un ARNip espedfico para una tercera PDHK.
  42. 42. El metodo de la reivindicacion 40, en el que las celulas cultivadas expresan adicionalmente un ARNip espedfico para una cuarta PDHK.
  43. 43. El metodo de la reivindicacion 41, en el que las celulas cultivadas tienen una productividad de polipeptidos superior de al menos 68 % en comparacion con las celulas cultivadas sin los ARNip espedficos para la lDh y las PDHK.
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