JP6050226B2 - Ldh及びpdhk発現を下方制御することによる乳酸レベルの低下及びポリペプチド生産の増加 - Google Patents
Ldh及びpdhk発現を下方制御することによる乳酸レベルの低下及びポリペプチド生産の増加 Download PDFInfo
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- C12N2320/00—Applications; Uses
Description
本出願は、2010年5月28日に出願された米国仮出願第61/349,727号の優先権を主張するものであり、その内容を出典明記によりその全体を本明細書中に援用する。
この発明の分野は一般的に、培養細胞における乳酸生産を低下させ、ポリペプチド生産を増加させる方法及び組成物に関する。
本発明は、培養細胞において乳酸生産を低下させポリペプチド生産を増加させるための方法及び組成物を提供する。発明者は、ポリペプチド(例えば抗体)を発現する培養細胞における、RNA干渉(RNAi)として知られるプロセスによるsiRNAによるLDH及びPDHKの同時下方制御が、乳酸レベル、乳酸生産速度、及び細胞オスモル濃度を低下させ、比ポリペプチド生産性(例えば比生産性)及びポリペプチド生産(例えば生産性)を増加させることを発見した。更に、下方制御されたLDH及びPDHKを有するこれらの培養細胞は、細胞増殖、細胞生存率、及び生産されるポリペプチドの質にネガティブな影響を示さなかった。従って、理論に縛られることなく、LDHの発現のノックダウンよるピルビン酸-乳酸変換の低下、及び一又は複数のPDHKの発現のノックダウンによるトリカルボン酸サイクル(TCA又はクレブスサイクル)へのピルビン酸の促進は、乳酸の低下及び細胞へのより多くのエネルギーと代謝中間体の提供において相乗効果をもたらしうる。これらの効果は次いで、培養細胞におけるポリペプチド(例えば抗体)の増加を導きうる。
ここで使用される場合、「培養物中における細胞」又は「培養細胞」なる用語は、細胞に一又は複数の細胞分裂を生じさせる溶液(例えば、細胞培地)中における2以上の細胞を示す。
ここにおける方法は、RNA干渉(RNAi)により乳酸生産を低減させるために、LDH及び少なくとも一又は複数のPDHKに特異的なsiRNAを発現する細胞を培養することを含む。別の態様では、方法は、a)LDHに特異的なsiRNA及びb)PDHKに特異的なsiRNAを発現する細胞を培養することを含む。
ここに記載されている方法によって生産される培養細胞も、本発明において提供される。本発明の組成物は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロで実践されうる。一態様では、提供されるのは、a)LDHに特異的なsiRNA及びb)PDHKに特異的なsiRNAを発現する培養物中における細胞である。幾つかの実施態様では、培養細胞は、第二PDHKに特異的なsiRNAを更に発現する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、第三PDHKに特異的なsiRNAを更に発現する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、第四PDHKに特異的なsiRNAを更に発現する。
ここに記載されている方法及び培養細胞を使用して生産されるポリペプチド又はタンパク質は、限定するものではないが、抗体又はイムノアドヘシンを含む。このような分子を生成するための技術は以下で検討する。
本発明の範囲である抗体は、限定するものではないが:抗CD20抗体、例えば米国特許第5,736,137号に記載の抗CD20「C2B8」(RITUXAN(登録商標));抗VEGF抗体、ヒト化及び/又は親和性成熟抗VEGF抗体を含み、例えばヒト化抗VEGF抗体huA4.6.1 AVASTIN(登録商標)(Kim等, Growth Factors, 7:53-64 (1992),WO96/30046、及びWO98/45331、1998年10月15日公開)及びV3LA;抗MUC16抗体;抗CD4抗体、例えばcM-7412抗体(Choy等Arthritis Rheum.39(1):52-56 (1996))及びイバリズマブ(TNX355)抗体;抗MET抗体、例えばワンアームド5D5抗C-Met抗体;抗HER2抗体トラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標))(Carter等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:4285-4289 (1992), U.S. Pat.No. 5,725,856)及びヒト化2C4(WO01/00245, Adams等)、米国特許第5,721,108B1号に記載の2H7抗体のキメラ又はヒト化変異体、又はトシツモマブ(BEXXAR(登録商標));抗IL-8抗体(St John等, Chest, 103:932 (1993), and International Publication No. WO 95/23865);抗前立腺幹細胞抗原(PSCA)抗体(WO01/40309);抗CD40抗体、S2C6及びそのヒト化変異体(WO00/75348)を含む;抗CD1抗体(米国特許第5,622,700号、WO98/23761, Steppe等, Transplant Intl. 4:3-7 (1991), and Hourmant等, Transplantation 58:377-380 (1994));抗CD18 (1997年4月22日発行の米国特許第5,622,700号、又は1997年7月31日公開のWO97/26912);抗IgE抗体 (E25、E26及びE27を含む; 1998、2月3日発行の米国特許第5,714,338号、又は1992年2月25日発行の米国特許第5,091,313号、1993年3月4日公開のWO93/04173、又は1998年6月30日出願のPCT/US98/13410、米国特許第5,714,338号, Presta等, J. Immunol.151:2623-2632 (1993),及び国際公開WO95/19181);抗Apo-2受容体抗体 (1998年11月19日公開のWO 98/51793);抗TNF-α抗体、cA2(REMICADE(登録商標))、CDP571及びMAK-195を含む(1997年9月30日発行の米国特許第5,672,347号, Lorenz等J. Immunol.156(4):1646-1653(1996), and Dhainaut等Crit.Care Med.23(9):1461-1469 (1995)を参照);抗組織因子(TF)抗体 (1994年11月9日特許付与のEP0420937B1);抗ヒトα4β7インテグリン抗体 (1998年2月19日公開のWO98/06248);抗上皮増殖因子受容体(EGFR)抗体 (例えば、キメラ又はヒト化225抗体、1996年12月19日公開のWO96/40210);抗CD3抗体、例えばOKT3(1985年5月7日発行の米国特許第4,515,893号);抗CD25又は抗Tac抗体、例えばCHI−621(SIMULECT(登録商標)及びZENAPAX(登録商標)(1997年12月2日発行の米国特許第5,693,762号を参照);抗CD52抗体、例えばCAMPATH-1H(Riechmann等Nature 332:323-337 (1988));抗Fc受容体抗体、例えばFcy RIに対するM22抗体、Graziano等J. Immunol.155(10):4996-5002 (1995);抗癌胎児抗原(CEA)抗体、例えばhMN-1 4(Sharkey等Cancer Res.55(23Suppl):5935s-5945s (1995);乳房上皮細胞に対する抗体、huBrE-3、hu-Mc 3及びCHL6を含む(Ceriani等Cancer Res.55(23):5852s-5856s (1995); and Richman等Cancer Res.55(23 Supp):5916s-5920s (1995));結腸がん細胞に結合する抗体、例えばC242(Litton等Eur J Immunol.26(1):1-9 (1996));抗CD38抗体、例えばAT 13/5(Ellis等J. Immunol.155(2):925-937 (1995));抗CD33抗体、例えばHu M195(Jurcic等Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)及びCMA-676又はCDP771;抗CD22抗体、例えばLL2又はLymphoCide(Juweid等Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995));抗EpCAM抗体、例えば17-1A(PANOREX(登録商標));抗GpIIb/IIIa抗体、例えばアブシキシマブ又はc7E3 Fab(REOPRO(登録商標));抗RSV抗体、例えばMEDI-493(SYNAGIS(登録商標));抗CMV抗体、例えばPROTOVIR(登録商標);抗HIV抗体、例えばPRO542;抗肝炎抗体、例えば抗Hep B抗体OSTAVIR(登録商標);抗CA 125抗体、例えばOvaRex;抗イディオタイプGD3エピトープ抗体BEC2;抗αvβ3抗体、VITAXIN(登録商標)を含む;抗ヒト腎細胞がん抗体、例えばch-G250;ING-1;抗ヒト17-1A抗体(3622W94);抗ヒト直腸結腸腫瘍抗体(A33);GD3ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体R24;抗ヒト扁平上皮がん(SF−25);及び抗ヒト白血球抗原(HLA)抗体、例えばSmart ID10及び抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)を含む。
ここでの抗体は、興味ある抗原に対して指図される。好ましくは、抗原は、生物学上重要なポリペプチドであり、哺乳動物の治療の利益に帰着することができる疾病や疾患に苦しむ哺乳動物の抗体の管理者である。しかしながら、非ポリペプチド抗原(腫瘍関連糖脂質抗原のような;米国特許5,091,178参照)に対して方向性をもった抗体も熟考される。抗原がポリペプチドである場合、それは成長因子のような膜貫通型分子(例えば受容体)、あるいは配位子かもしれない。典型的な抗原は、下のセクション(iii)に記述されたタンパク質を含んでいる。本発明によって包含された抗体への典型的な分子ターゲットは、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22及びCD34のようなCDタンパク質;EGFR、HER2、HER3あるいはHER4受容体のようなErbB受容体ファミリーのメンバー;LFA-1のような細胞付着分子、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM及びそこにαかβいずれかのサブユニット(例えば抗CD11a、抗CD18あるいは抗CD11b抗体)を含むαv/β3インテグリン;VEGFのような成長因子;IgE;血液型抗原;flk2/flt3受容体;肥満(OB)受容体;mpl受容体;CTLA-4;プロテインC,あるいはここに言及された以外の抗原のいずれか、を含む。
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに、抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基によるコンジュゲート)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、又はRとR1が異なったアルキル基であるR1N=C=NRによりコンジュゲートさせることが有用である。
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術に記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には供給源が非ヒトである一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、ヒト抗体の該当する配列を齧歯類CDRs又はCDR配列で置換することによりWinterと共同研究者の方法(Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536(1988))に本質的に従って実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかのCDR残基及び場合によってはいくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) and Brennan等, Science, 229:81 (1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')2断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。単鎖Fv断片(scFv)も単離することができる。抗体断片の生産のための他の技術は当業者には明らかであろう。
多重特異性抗体は少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。このような分子は通常2つの抗原にのみ結合するが(すなわち二重特異性抗体、BsAb)、更なる特異性を有する抗体、例えば三重特異性抗体が、ここで使用される場合この発現に包含される。
最も単純で最も簡単であるイムノアドヘシン設計では、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域とFc領域を持つ付着因子(例えば、受容体の細胞外ドメイン(ECD))の結合ドメインを組み合わせる。通常、本発明の免疫付着因子を準備する時、付着因子の結合ドメインをコードする核酸は、免疫グロブリン定数ドメイン配列のN-末端をコードする核酸にC-末端的に融合されるであろう。しかしながら、さらにN-末端融合は可能である。
(a) ACL - ACL;
(b) ACH - (ACH, ACL - ACH, ACL - VHCH, 又はVLCL - ACH);
(c) ACL - ACH - (ACL - ACH, ACL - VHCH, VLCL - ACH, 又はVLCL - VHCH)
(d) ACL - VHCH - (ACH, 又はACL - VHCH, 又はVLCL - ACH);
(e) VLCL - ACH - (ACL - VHCH, 又は VLCL - ACH); そして
(f) (A-Y)n - (VLCL-VHCH)2,
そこで各Aは同一か異なる付着因子アミノ酸配列を表わす;
VLは免疫グロブリン軽鎖変数ドメインであり;
VHは免疫グロブリン重鎖変数ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定数ドメインであり;
CHは免疫グロブリン重鎖定数ドメインであり;
nは1を越える整数であり;
Yは、共有結合の架橋剤の残渣と定める。
手短に述べると、先の構造は重要な特徴のみを単に示す。すなわち、それらは連結する(J)あるいは免疫グロブリンの他のドメインを示さず、また、ジスルフィド結合も示さない。しかしながら、そのようなドメインが結合活性を必要とする場合、それらは、それらが免疫グロブリン分子の中で占める、通常の位置の中に存在するように構築されるものとする。
ここに記載されている方法を使用して生成されるポリペプチド(例えば抗体)は一般的に組換え技術を使用して生成される。
本発明はまた、組成物、及び発明の方法の説明を含んでなる使用の指示を含んでなるキットを提供する。キットは、培養細胞、siRNA、標的配列、トランスフェクト剤、本発明の方法の指示、又はその何れかの組合せを含みうる。
ここに記載されている実施例及び実施態様は、説明のみを目的とし、それらの考慮の下、様々な修飾又は変更が当業者に示唆され、この出願の精神及び範囲内に含まれる。
材料及び方法
LDHa/PDHK1、2、3を標的にするベクターの構築
PDHK2標的(siRNA)配列:CATTCAGTACTTCTTGGAC (配列番号:3)
PDHK3標的(siRNA)配列:TGTAGCTGATGTCGTGAAA (配列番号:4)
ジヒドロ葉酸還元酵素を欠くCHO細胞を、37oC及び5%CO2で、振とうフラスコにおいて、専有のDMEM/F12ベース培地において培養した。細胞を3又は4日毎に継代した。
25nMのメトトレキサート(MTX)に耐性であり、組換えモノクローナル抗体を発現するCHO細胞株を、製造者の推奨(Invitrogen, Carlsbad, CA)に従い、Lipofectamine 2000 CD (Cat#12566-014, Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用してトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を遠心分離し、25nMのMTX及び400ug/mlのハイグロマイシン(Cat # 10687010, Invitrogen, Carlsbad, CA)を含有するDMEM/F-12ベース選択(グリシン-、ヒポキサンチン-及びチミジン-を含まない)培地に播種した。再懸濁細胞を96-ウェルプレートにプレーティングし、個々のクローンを生成させた。SiRNAクローンは、LDHa及びPDHKの標的配列を有するsiRNAプラスミドトランスフェクションに由来し、mockクローンは、既知の遺伝子に大きな相同性を持たない、製造者によって設計されたスクランブル配列を有するmockプラスミド (Cat# AM5766, Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX)トランスフェクションに由来した。
個々のクローンからの全RNAを、RNeasy 96キット(Cat#74181, Qiagen)を使用して単離し、DNase digestion(Cat#79254, RNase free DNase set, Qiagen)で処理し、単離されたRNAサンプル中におそらく存在する残留DNAを除去した。Taqmanを製造者の指示に従い(Cat# 4309169, Applied Biosystems)、universal qRT-PCR master mixを使用して実施し、PDHK及びLDHの発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子-ミクログロブリンに正規化した。
PDHK1順方向プライマー:GCCCATCTCATCGAAAACA (配列番号:5)
PDHK1逆方向プライマー:AGCCATCTTTAATGACTTCGACTAC (配列番号:6)
PDHK1プローブ:TCGCAGTTTGGATTTATGCTTCCAATG (配列番号:7)
PDHK2順方向プライマー:GATCTGTCCATCAAAATGAGTGA (配列番号:8)
PDHK2逆方向プライマー:TGTGGAGTACATGTAGCTGAAGAG (配列番号:9)
PDHK2プローブ:CTCTCAATCTTCCTCAAGGGGACACC (配列番号:10)
PDHK3順方向プライマー:CAGCCTGGAGCCTACAAGA (配列番号:11)
PDHK3逆方向プライマー:GGCATACAGTCGAGAAATTGG (配列番号:12)
PDHK3プローブ:AAGCCATAACCAAATCCAGCCAAGG (配列番号:13)
LDHa順方向プライマー:GCCGAGAGCATAATGAAGAA (配列番号:14)
LDHa逆方向プライマー:CCATAGAGACCCTTAATCATGGTA (配列番号:15)
LDHaプローブ:CTTAGGCGGGTGCATCCCATTT (配列番号:16)
β-ミクログロブリン順方向プライマー:TCCTCTCAGTGGTCT GCT TGG(配列番号:17)
β-ミクログロブリン逆方向プライマー:TGGCGTGTGTAGACTTGCACTT(配列番号:18)
β-ミクログロブリンプローブ:TGCCATCCAGCGTCCCCCA (配列番号:19)
12のsiRNAクローン及び12のmockクローンを、3日目に与えられる一ボーラス、及び2日目の37℃から33℃への温度シフト有する14日流加培養プロセスを用い、pH7.15の専有生産培地に播種した。細胞生存率及び生細胞数を、Vicell (Beckman Coulter)を使用して、トリパンブルー色素排除によりモニタした。乳酸濃度を、Nova Bioprofile分析計(Nova biomedical)を使用して、3、7、10及び14日目に測定した。平均細胞比乳酸生産速度、qSを統合全細胞数のグラフの傾きとして算出し、生産される累積乳酸、[St−So]は、乳酸質量平衡等式に基づき、全培養体積に対して定式化した:
ここで、Stは時間tでの培養体積(mg)における乳酸の全量であり、S0はt=0での培養体積(mg)における乳酸の全量であり、Xは任意の時間tでの培養体積における細胞の全数であり、qSはmg/細胞/日における比乳酸生産速度である。上式はt=0及びt=t間の時間間隔について記述されているため、qSはこの時間間隔にわたる平均乳酸生産速度である。この作業において使用される慣習により、細胞に消費されるより多くの乳酸が生産されると、qSの値は正である。
バイオリアクター実験を、1.5Lの作動体積で操作される2Lの攪拌層バイオリアクター(Applikon, Foster City, CA)において実施した。播種後72時間での濃縮栄養分の供給の後、14日の流加の間、グルコースを必要に応じて加えた。溶存酸素及び攪拌を、それぞれ空気飽和の30%及び275rpmの設定値に、バイオリアクター培養物中において維持した。培養pHをCO2ガス又は1MのNa2CO3の添加により7.0に制御した。培養温度を、最初の48時間、37℃に維持し、その後、33℃にシフトさせた。各バイオリアクターにおけるプロセスコントロールを、B. Braun Biotech (Allentown, PA)からのDigital Control Unitを使用して得た。
抗体力価を、UV検出により、一般的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使用して決定した。Fahrner等, Biotechnol.Appl.Biochem.30:121-128 (1999)を参照。培養サンプルを、Vi-Cell ASセルカウンター(Beckman Coulter, Fullerton, CA)により生細胞濃度及び生存率について、Bioprofile 400バイオアナライザー(Nova Biomedical, Waltham, MA)によりpH及び乳酸について、multi-sample osmometer(Advanced Instruments, Norwood, MA)によりオスモル濃度について分析した。
両側スチューデントのt検定を、JMPソフトウェアを使用して実施した。
PDHK及びLDHaを標的にするsiRNAベクターの構築
哺乳類細胞では、Harris等 (Adv. Enzyme Regul. 42:249-59 (2002)に報告されている4つのPDHK遺伝子がある。全ての4つのPDHK遺伝子がCHO細胞に存在するか評価するために、4組のRT-PCRプライマーを、ヒト及びマウスPDHK配列間の保存領域に基づいて設計した。PCRの結果は、全ての4つのPDHK mRNAがCHO細胞において検出できることを示したが、PDHK4のmRNAレベルは最小限であり、DHFR欠如(ジヒドロ葉酸還元酵素欠如)CHO細胞における他の3つのPDHKよりずっと低かった。このように、PDHK1、2、及び3遺伝子の発現のみが、LDHa遺伝子によりノックダウンされた。LDHa及び各PDHKについて、3つのsiRNA配列を設計し、CHO細胞において試験し、標的遺伝子のベストの下方制御を呈するsiRNA配列を選択した。LDHaについてのベストなsiRNA配列を、Kim and Lee. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74(1):152-9 (2007)による発見に基づいて選択した。LDHa及びPDHKのためのsiRNA配列を、単一ベクターにおいて構築し、ここで、LDHaのためのsiRNAはU6プロモーターの制御下であり、各PDHKのsiRNAは、H1プロモーターにより駆動された(図1)。
PDHK及びLDHaを標的にするsiRNAコンストラクトを、モノクローナル抗体を発現するCHO細胞にトランスフェクトし、siRNAクローンと呼ばれる個々のクローンを得た。個々のsiRNAクローンを、4つの遺伝子、PDHK1、2、3及びLDHaのmRNA発現について、Taqman分析を使用してアッセイした。上記4つの遺伝子の最も低減された発現を呈する12のsiRNAクローンを、更なる分析のために同定した(図2)。スクランブル配列を有するmockベクターをまた、同じ抗体発現ベクターにトランスフェクトし、mockクローンと呼ばれる個々のクローンを得た。12のmockクローンをコントロールとしてランダムに選び、それらのLDHa及びPDHK1、2、及び3遺伝子のmRNA発現レベルをまた、Taqmanにより分析した。平均で、選択した12のsiRNAクローンにおけるLDHa、PDHK1、2、クローン3のmRNA発現レベルは、mockクローンと比較して90%、32%、83%、及び70%それぞれ低減された(図2)。
(a)siRNAクローンにおいて観察される培養培地における低下乳酸レベル及び高pH
乳酸生産に対する、LDHa及びPDHKのsiRNA媒介下方制御の効果を評価するために、12のsiRNA及び12のmockクローンを、14日、流加、及び温度シフトプロセスを使用し、我々の専有培地において、振とうフラスコ容器において評価した。実験は3回繰り返し、類似な結果が観察された。1セットの実験からの結果を、図に代表として示す。結果は、mockクローンと比較して、siRNAクローンが一般的に低減された乳酸レベルを有することを示した(図3)。14日目までに、siRNAクローンは、mockクローンより平均で91%少ない乳酸を示した(p<0.0001)(図3A)。14日の生産期間にわたるsiRNAクローンにおける低乳酸レベルと一致して、siRNAクローンの平均乳酸生産速度はネガティブ0.02mg/106細胞/日であり、乳酸合成速度が消費速度より低いことを示唆する。対照的に、平均乳酸生産速度はmockクローンでは0.01mg/106細胞/日であり、全体の乳酸合成速度が消費速度より高いことを示す。siRNA及びmockクローン間の乳酸生産速度におけるこの差は、統計的に有意である(p<0.002)(図3B)。培地における乳酸レベルはpHにするため、14日目までに、mockクローンの平均pHは6.54に落ちたが、siRNAクローンの平均pHは7.04だった(図3C)。観察された低平均pHは、mockクローンの高平均乳酸レベルと一致する。
PDHK及びLDHaのノックダウン遺伝子発現が抗体生産に影響するか調査するために、サンプルを3、7、10及び14日目の流加振とうフラスコ実験から収集し、プロテインAクロマトグラフィーによって抗体力価を測定した。データは、平均で、siRNAクローンがmockクローンより68%多い抗体を生産し(図4A,p<0.022)、siRNAクローンについてpg/細胞-日において測定された平均の細胞-比生産性(Qp)は、mockクローンより75%高い(図4B,p<0.006)ことを示した。細胞増殖を評価するために、振とうフラスコサンプルを3、7、10、及び14日目に収集し、生細胞数及び生存率を測定し、統合生細胞数(IVCC)を算出した。抗体力価及びQpと対照的に、大きな細胞増殖差異は、2つのグループ間に観察されなかった(図4C)。グリカンプロファイル、荷電変異体及び凝集のパーセンテージを含む抗体産物の質特性は、siRNA及びmockクローン間で同等だった。
pHコントロールされた流加バイオリアクター培養は大規模製造に対する標準的な縮小モデルであるため、2Lバイオリアクターにおいて幾つかのsiRNA及びmockクローンの性能を更に調査した。バイオリアクターアベイラビリティ及び実験の複雑性における制限により、二つ組における12のsiRNA及び12mockクローンは実行不可能性によりランしなかった。選択バイアスを最小化するために、代謝プロファイルが各グループの平均性能を最も良く表す2つの代表的なsiRNAクローン及び2つの代表的なmockクローンを、siRNA及びmockプラスミドトランスフェクションに使用されている親株と共に、バイオリアクター評価のために選択した。細胞培養物サンプルを、乳酸、グルコース、オスモル濃度、及び力価分析のために毎日(6及び13日目を除く)収集した。siRNAクローンの乳酸レベルは一般的に横ばいであったが、mock及び親クローンの乳酸レベルは14日の生産期間の間増加し続けた。14日目に、2つのsiRNAクローンは、mockクローン又は親クローンより、培地において平均で86%低い乳酸レベルを有し(図5A)、mockクローン及び親株より低い比乳酸生産を有した(図5B)。同様に、siRNAクローンのオスモル濃度は約300mOsmを維持したが、mockクローン又は親クローンのオスモル濃度は14日の生産期間の間増加し続けた。14日目に、2つのsiRNAクローンの平均オスモル濃度は、mock及び親クローンのオスモル濃度より60%低かった(図5C)。重要なことには、14日目に、siRNAクローンはmockクローンより平均で125%多い抗体を生産した(図6)。流加振とうフラスコ評価に観察されるように、siRNA及びmockクローンは、2Lバイオリアクターにおいて同等な生存率及び細胞増殖を有する。
過去の研究は、LDHa遺伝子発現単独の下方制御が乳酸生産を低減できることを示した。Kim and Lee, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74(1):152-9 (2007)。しかしながら、彼らの研究では、乳酸レベルにおける45−79%の低減にも関わらず、Qp及び産物力価における有意な改善は無く、CHO細胞におけるLDHa単独のノックダウンは、Qp及び産物収率を効果的に改善するには十分でないことを示唆する。更に、CHO細胞におけるPDHK1、2、及び3の同時下方制御は、乳酸レベルの低減にも、抗体生産性の増加にも十分ではなかった。細胞が乳酸を生産する唯一の方法はピルビン酸の減少を通してであり、ピルビン酸はLDHによって乳酸に変換されるだけでなく、PDHによってアセチル-CoAに変換され酸化のためにTCAサイクルに入るため、LDHa発現をノックダウンして乳酸生産を減少させ、PDHKをノックダウンしてピルビン酸をTCAサイクルに促進することは相乗効果を与え、乳酸レベルを低減し、細胞により多くのエネルギーとおそらく代謝中間体を与え、増加した抗体生産に導きうる。
Claims (44)
- 培養細胞における乳酸生産を低下させる方法であって、乳酸脱水素酵素(LDH)に特異的な低分子干渉RNA(siRNA)をコードする第一異種性核酸配列、及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(PDHK)に特異的なsiRNAをコードする第二異種性核酸配列を含んでなる細胞を培養することを含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている方法。
- LDHがLDHaである請求項1に記載の方法。
- 培養細胞が、第二PDHKに特異的なsiRNAをコードする第三異種性核酸配列を更に含み、第三異種性核酸配列は第三プロモーターに作動的に連結されている請求項1又は2に記載の方法。
- 培養細胞が、第三PDHKに特異的なsiRNAをコードする第四異種性核酸配列を更に含み、第四異種性核酸配列は第四プロモーターに作動的に連結されている請求項3に記載の方法。
- 培養細胞が、第四PDHKに特異的なsiRNAをコードする第五異種性核酸配列を更に含み、第五異種性核酸配列は第五プロモーターに作動的に連結されている請求項4に記載の方法。
- PDHKが、PDHK1、PDHK2、PDHK3、及びPDHK4から成る群から選択される請求項1、2、3、4、及び5の何れか一項に記載の方法。
- PDHKが、PDHK1、PDHK2、及びPDHK3から成る群から選択される請求項1、2、3、及び4の何れか一項に記載の方法。
- PDHKが、PDHK1及びPDHK2から成る群から選択される請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- PDHKが、PDHK1及びPDHK3から成る群から選択される請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- PDHKが、PDHK2及びPDHK3から成る群から選択される請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- LDHがLDHaであり、第一PDHKがPDHK1であり、第二PDHKがPDHK2であり、第三PDHKがPDHK3である請求項4に記載の方法。
- 培養細胞が異種性ポリペプチドを生産する請求項1〜11の何れか一項に記載の方法。
- 異種性ポリペプチドが抗体である請求項12に記載の方法。
- 培養細胞の平均乳酸生産速度が、ネガティブ0.02mg/106細胞/日未満である請求項1〜13の何れか一項に記載の方法。
- 培養細胞が、PDHK及びLDHを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、少なくとも75%高い異種性ポリペプチド生産性を有する請求項1〜14の何れか一項に記載の方法。
- 培養細胞が、300mOsm未満のオスモル濃度を有する請求項1〜15の何れか一項に記載の方法。
- 培養細胞が、PDHK及びLDHを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、少なくとも68%高い異種性ポリペプチド生産性を有する請求項1〜16の何れか一項に記載の方法。
- 培養細胞が哺乳類細胞である請求項1〜17の何れか一項に記載の方法。
- 培養細胞における乳酸脱水素酵素(LDH)及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(PDHK)転写をサイレンシング又は下方制御する方法であって、
LDHに特異的な低分子干渉RNA(siRNA)をコードする第一異種性核酸配列、及びPDHKに特異的なsiRNAをコードする第二異種性核酸配列を含んでなるベクターを細胞に導入する工程を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されており、siRNAが発現され、それによってLDH及びPDHKの遺伝子転写がサイレンシング又は下方制御される方法。 - 培養において低下された乳酸生産を呈する細胞を作成する方法であって、LDHに特異的な低分子干渉RNA(siRNA)をコードする第一異種性核酸配列、及びPDHKに特異的なsiRNAをコードする第二異種性核酸配列を含んでなるベクターを細胞に導入する工程を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている方法。
- 乳酸脱水素酵素(LDH)に特異的な第一低分子干渉RNA(siRNA)をコードする第一異種性核酸配列、及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(PDHK)に特異的な第二siRNAをコードする第二異種性核酸配列を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている、培養物中における細胞。
- 細胞が、第二PDHKに特異的なsiRNAをコードする第三異種性核酸配列を更に含み、第三異種性核酸配列が第三プロモーターに作動的に連結されている請求項21に記載の細胞。
- 細胞が、第三PDHKに特異的なsiRNAをコードする第四異種性核酸配列を更に含み、第四異種性核酸配列は第四プロモーターに作動的に連結されている請求項22に記載の細胞。
- 細胞が、第四PDHKに特異的なsiRNAをコードする第五異種性核酸配列を更に含み、第五異種性核酸配列は第五プロモーターに作動的に連結されている請求項23に記載の細胞。
- PDHKが、PDHK1、PDHK2、PDHK3、及びPDHK4から成る群から選択される請求項21、22、23、及び24の何れか一項に記載の細胞。
- PDHKが、PDHK1、PDHK2、及びPDHK3から成る群から選択される請求項21、22、及び23の何れか一項に記載の細胞。
- PDHKが、PDHK1及びPDHK2から成る群から選択される請求項21又は22に記載の細胞。
- PDHKが、PDHK1及びPDHK3から成る群から選択される請求項21又は22に記載の細胞。
- PDHKが、PDHK2及びPDHK3から成る群から選択される請求項21又は22に記載の細胞。
- LDHがLDHaであり、第一PDHKがPDHK1であり、第二PDHKがPDHK2であり、第三PDHKがPDHK3である請求項23に記載の細胞。
- 細胞が異種性ポリペプチドを生産する請求項21〜30の何れか一項に記載の細胞。
- 異種性ポリペプチドが抗体である請求項31に記載の細胞。
- 細胞がネガティブ0.02mg/106細胞/日未満の平均乳酸生産率を有する請求項21〜32の何れか一項に記載の細胞。
- 細胞が、LDH及びPDHKを含んでなる異種性核酸配列を持たない細胞より、少なくとも75%高い異種性ポリペプチド生産性を有する請求項21〜33の何れか一項に記載の細胞。
- 細胞が、300mOsm未満のオスモル濃度を有する請求項21〜34の何れか一項に記載の細胞。
- 細胞が、LDH及びPDHKを含んでなる異種性核酸配列を持たない細胞より、少なくとも68%高い異種性ポリペプチド生産性を有する請求項21〜33及び35の何れか一項に記載の細胞。
- 細胞が哺乳類細胞である請求項21〜36の何れか一項に記載の細胞。
- 乳酸脱水素酵素(LDH)に特異的な低分子干渉RNA(siRNA)をコードする第一異種性核酸配列、及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(PDHK)に特異的なsiRNAをコードする第二異種性核酸配列を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されているベクター。
- 培養細胞における乳酸生産を低減させる方法であって、a)乳酸脱水素酵素(LDH)に特異的な低分子干渉RNA(siRNA)、及びb)ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(PDHK)に特異的なsiRNAを発現する細胞を培養することを含んでなる方法。
- 培養細胞が、第二PDHKに特異的なsiRNAを更に発現する請求項39に記載の方法。
- 培養細胞が、第三PDHKに特異的なsiRNAを更に発現する請求項40に記載の方法。
- 培養細胞が、第四PDHKに特異的なsiRNAを更に発現する請求項40又は41に記載の方法。
- 培養細胞が、LDH及びPDHKに特異的なsiRNAを持たない培養細胞より、少なくとも68%高いポリペプチド生産性を有する請求項39〜42の何れか一項に記載の方法。
- 培養細胞において異種性ポリペプチドを生産する方法であって、
前記培養細胞における乳酸の生産を減少させる工程を含んでなり、前記細胞は、乳酸脱水素酵素(LDH)に特異的な低分子干渉RNA(siRNA)をコードする第一異種性核酸配列、及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(PDHK)に特異的なsiRNAをコードする第二異種性核酸配列を含み、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている方法。
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