EA019812B1 - Способы получения высокой плотности жизнеспособных клеток в культуре клеток млекопитающих - Google Patents

Abstract

Заявляются способы увеличения жизнеспособности в подпитываемой культуре эукариотических клеточных линий.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам, позволяющим достичь получения высокой плотности жизнеспособных клеток и увеличения продолжительности жизни подпитываемой клеточной культуры за счет использования среды, обогащенной глюкозой. Предложенные способы могут быть использованы для увеличения производства любых представляющих интерес секретируемых белков.

Предпосылки создания изобретения

Культура клеток млекопитающих является предпочтительной системой для производства многих рекомбинантных белков благодаря способности производить белки с требуемыми посттрансляционными модификациями. Вследствие увеличения спроса на производство таких белков существует сильная мотивация для улучшения эффективности процесса за счет увеличения производства продукта. Увеличение производства биотерапевтических или других белков в процессе промышленного производства до необходимого уровня, исчисляемого в г/л, основывается на оптимизации как культуры клеток млекопитающих, так и инженерных методов. Проблема клеточной гибели является обычной для культуры клеток млекопитающих высокой плотности, не содержащей белка, причем до 80% клеточной гибели в типичном биореакторе с подпиткой приходится на долю апоптоза, индуцированного в ответ на такие условия, как недостаток фактора роста, питательных веществ, нехватка кислорода, накопление токсинов и напряжение сдвига (Сок\\'апй е! а1., Вю!есйпо1 Вюепд 62:632-640 (1999)). Апоптоз ограничивает максимальную плотность жизнеспособных клеток, ускоряет наступление фазы клеточной гибели и потенциально уменьшает производство гетерологичного белка (СЫапд апб 8ίδΚ. Вю!есйпо1 Вюепд 91:779-792 (2005); Ндцегоа е! а1., Вю!есйпо1 Вюепд 73:211-222 (2001), Ме1аЬ Епд 5:230-245 (2003), Вю!есйпо1 Вюепд 85:589600 (2004); МегсШе апб Макйе, Вю!есйпо1 Вюепд 44:1140-1154 (1994)).

Апоптоз является результатом сложной сети сигнальных путей, которые активизируются как внутри, так и снаружи клетки и кульминацией которых является активация специфических цистеиновых протеаз, расщепляющих белки после остатков аспарагиновой кислоты (Сук-Акр-протеаз, сокращенно каспаз) и опосредующих финальные стадии клеточной смерти; см. фиг. 1. Для поддержания жизнеспособности клеток в культуре клеток млекопитающих в течение удлиненного производственного цикла используются различные методы (Агбеп апб ВеЮпЬандй Тгепбк Вю!есйпо1 22:174-180 (2004); Ушек е! а1., Ме!аЬ Епд 5:124-132 (2003)). Изменение внеклеточной среды за счет добавления к среде факторов роста, гидролизатов и лимитирующих питательных компонентов обычно приводит к увеличению производства белка и снижению апоптоза (Вийеаи е! а1., 1п Уйго Се11 Эеу Вю1 Атт. 39:291-296 (2003); 21апд апб ВоЬшкоп, Су1о1ес11по1оду 48: 59-74 (2005)). Некоторые исследователи склоняются к использованию химических и генетических стратегий с целью ингибирования внутриклеточного апоптозного сигнального каскада (5>аиег\са1б е! а1., Вю!есйпо1 Вюепд 77:704-716 (2002), Вю!есйпо1 Вюепд 81:329-340 (2003)).

Ученые обнаружили, что сверхэкспрессия генов, которые интенсивно производятся в раковых клетках, может увеличить продолжительность жизни у клеток, культивируемых в биореакторах, за счет предотвращения апоптоза до момента активации каспаз (Сок\\'апй е! а1., выше; Мак1гапде1о е! а1., Тгепбк Вю!есйпо1 16:88-95 (1998); Мееп!к е! а1., Вю!есйпо1 Вюепд 80:706-716 (2002); Теу е! а1., 1. Вю!есйпо1 79:147-159 (2000) и Вю!есйпо1 Вюепд 68:31-43 (2000)). Увеличенная экспрессия этих белков в продуктивных клеточных линиях эффективно супрессирует апоптозный сигнальный процесс внутри клетки, уменьшая тем самым в некоторых случаях гибель клеток, поддерживая жизнеспособность и увеличивая выход биотерапевтической продукции.

Проблема аккумуляции продуктов жизнедеятельности и их отрицательное влияние на клеточный рост также является обычной для культур клеток млекопитающих высокой плотности, свободных от белка. Лактат и аммиак являются двумя наиболее часто встречаемыми в клеточных культурах продуктами жизнедеятельности. Для решения проблемы аккумуляции избыточного лактата были предложены многочисленные стратегии, включая: 1) поддержание низкой концентрации глюкозы в питательной среде (Кцгока^а е! а1., Вю!есйпо1 Вюепд 44:95-103 (1994); Х1е апб ^апд, Вю!есйпо1 Вюепд 43:1175-1189 (1993); 2йапд е! а1., 1. С1ет Тес1по1 Вю!есйпо1 79:171-181 (2004); ΖΙμι! е! а1., Вю!есйпо1 Вюепд 46:579587 (1995)); 2) использование альтернативных сахаров, включая фруктозу (Майте11е е! а1., Вю!есйпо1 Вюепд 60:508-517 (1998), А1!ат1гапо е! а1., 1. Вю!есйпо1 110:171-179 (2004) и 1. Вю!есйпо1 125:547-556 (2006), \Уа1кс1пп апб ^ц, 1. Вю!есйпо1 131:168-176 (2007)); 3) частичное подавление экспрессии лактатдегидрогеназы (ЙПН) за счет гомологичной рекомбинации или κίΚΝΛ-технологии; 4) сверхэкспрессию пируваткарбоксилазы; 5) использование дихлорацетата (ОСА), являющегося активатором пируватдегидрогеназы (ΡΌΗ) (за счет ингибирования ΡΌΗ-киназы); 6) использование оксаминовой кислоты, являющейся конкурирующим ингибитором ЬОН, и 7) удаление с помощью перфузии (заявка на патент США № 2009/0042253 А1).

Первоначально предполагалось, что исключительной функцией многих белков, участвующих в процессе апоптоза, является связывание с мембраной митохондрий и регулирование апоптоза за счет изменения проницаемости митохондрий. Недавние открытия показали, что ключевые белки, вовлеченные в апоптозный сигнальный процесс, оказывают влияние на те белки и взаимодействуют с теми белками, которые контролируют метаболизм и энергетический гомеостаз клетки. С обзором можно ознакомиться в работах Ма)огк е! а1., Ме!аЬ Епд 9:317-326 (2007) и ^Ы!е е! а1., №11 Се11 Вю1 7:1021-1028 (2005).

- 1 019812

Микроматричный анализ сверхэкспрессирующих белок Вс1-ХЬ клеток культуры СНО, проведенный в одном из недавних исследований, показал, что лактатдегидрогеназа, являющаяся ключевым ферментом глюконеогенеза, имеет повышенную экспрессию.

Некоторые клетки и вирусы производят антиапоптозные белки, участвующие в митохондриальном апоптозном пути. Они могут быть разделены на три группы: 1) белки, которые действуют в начале апоптозного пути, такие как белки семейства Вс1-2; 2) белки, которые действуют в середине пути, разрушая или ингибируя апоптосомный комплекс, например, Ауеп, и 3) белки, которые действуют на поздних этапах апоптозного пути, например ингибиторы каспазы, такие как Х1АР. Действие большинства названных генов было изучено с помощью сверхэкспрессии в экспрессионной системе млекопитающих, и в некоторых случаях был определен эффект одновременной сверхэкспрессии двух или большего числа генов, относящихся к разным периодам апоптозного пути. Примеры включают: 1) аддитивный эффект гена Вс1ХЬ и делеционной мутации Х1АР (ΧΙΑΡΔ) в клетках СНО (Идиетоа е! а1., Ме!аЬ. Епд. 5:230-245 (2003)); 2) гены Е1В-19К и Ауеп в клетках ВНК (Муйсйапуопд е! а1., Вю1есйпо1 Вюепд 98:825-841 (2007)) и 3) гены Вс1-ХЬ, Ауеп и ΧΙΑΡΔ (8аиег\\а1б е! а1., выше (2003); 8аиег\\а1б е! а1., Вю1есйпо1 Вюепд 94:362-369 (2006)). Однако ни в одной из указанных работ не был исследован эффект антиапоптозных генов на состояние клеточного метаболизма. Итак, существует необходимость оптимизации условий потребления питательных веществ и аккумуляции метаболитов в культуре клеток млекопитающих с целью увеличения плотности жизнеспособных клеток, длительности жизни и продуктивности.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показаны компоненты митохондриального апоптозного пути.

На фиг. 2А-2С показаны характеристики клеточных линий в состоянии апоптоза ^к

На фиг. 3 с использованием метода поточной цитометрии показано подтверждение апоптоза ^к в культурах ЕА167 и ЕАХ197.

На фиг. 4А-4С показаны кривые роста апоптозных ^к клеточных линий, полученных в результате трансфекции генами Е1В-19К, Е1В-19К+Ауеп и Е1В-19К+Ανеп+XIΑΡΔ. Плотность жизнеспособных клеток и жизнеспособность изучались в контрольных ^*) полунепрерывных культурах, культивируемых в качалочных колбах, а также в линиях Е64 (*), ЕА167 () и ЕАХ197 .

На фиг. 5А-5С показаны кривые, характеризующие метаболизм в апоптозных ^к клеточных линиях, полученных в результате трансфекции генами Е1В-19К+ΑVЕN±XIΑΡΔ. Наличие различных метаболи(·) тов исследовалось в полунепрерывных контрольных культурах, культивируемых в качалочных колбах, а также в клеточных линиях ЕА167 () и ЕАХ197 (▼) ·

На фиг. 6А и 6В показано ежедневное увеличение лактата в апоптозных ^к клеточных линиях. А) контроль, ЕА167: без подпитки, и подпитка лактатом, В) ЕАХ197 без подпитки и подпитка лактатом).

На фиг. 7А-7О показаны кривые роста и метаболизма контрольных и апоптозных ^к клеточных линий ЕА167 и ЕАХ197, при применении и без применения подпитки лактатом. Контроль к) г ЕА167 (□ ~ без подпитки и ~ подпитка лактатом), ЕАХ197 без подпитки и ▼“ подпитка лактатом).

На фиг. 8А-8О показаны кривые уменьшения концентрации аминокислот в апоптозных ^к клеточных линиях при подпитке лактатом. Контроль (·) ζ ЕА167 (□ ~ без подпитки и ~ подпитка лактатом), ЕАХ197 ^_ без подпитки и подпитка лактатом).

На фиг. 9А-9Э показаны кривые роста и кривые накопления лактата в контрольных и апоптозных ^к клеточных линиях ЕАХ197, культивированных при высокой концентрации глюкозы в адаптированной среде. Апоптозные ^к клеточные линии ЕАХ197 ' контрольные клеточные линии (♦) ·

На фиг. 10А и 10В показаны титры антител в линии ЕАХ197 и в контрольных линиях клетокхозяев; культивированных в адаптированной среде, содержащей 30 либо 60 мМ глюкозы. Апоптозные ^к клеточные линии ЕАХ197 ' контрольные клеточные линии (□) На фиг. 11А и 11В показаны УСЭ и титры клеточных линий, содержащих апоптозный ^к ген Вс1-2, при условиях высокой и низкой плотности посева, а также при содержании глюкозы 30 и 60 мМ.

Краткое описание изобретения

Первый аспект настоящего изобретения заключается в способе достижения высокой плотности жизнеспособных клеток в подпитываемых эукариотических культурах клеток, включающем следующие этапы:

a) культивирование эукариотической клеточной линии, экспрессирующей один или более гетерологичных генов устойчивости к апоптозу (апоптозный ^к). а также один или более представляющих интерес генов; и

b) поддержание высокого уровня глюкозы в среде в течение экспоненциальной и стационарной фаз

- 2 019812 роста клеточной культуры.

Другой аспект изобретения заключается в способе увеличения производства секретируемых белков в подпитываемой культуре клеток эукариот, включающем следующие этапы:

a) культивирование эукариотических клеточных линий, экспрессирующих один или более гетерологичных генов устойчивости к апоптозу (апоптозный ^к), а также один или более представляющих интерес генов; и

b) поддержание высокого уровня глюкозы в среде в течение экспоненциальной и стационарной фаз роста клеточной культуры.

Подробное описание изобретения

Все публикации, упоминаемые в данном описании, включая патенты и патентные заявки, но не ограничиваясь ими, включенные путем ссылок, являются частью настоящего документа, как если бы они были изложены непосредственно в настоящем документе.

Термин подпитываемая клеточная культура, используемый в настоящем документе, относится к процессу культивирования клеток, основанному на добавлении лимитирующего питательного субстрата в культуру. Стратегия подпитываемой культуры обычно используется в биопромышленных процессах для достижения высокой клеточной плотности в биореакторе. Однако добавление такого питательного вещества, как глюкоза, приводит к образованию лактата и аммиака в качестве продуктов метаболизма. Согласно опубликованным данным концентрации лактата 18 мМ (Кигапо с1 а1., 1990) и аммиака 8 мМ (Напзеп апб ЕтЬотд, 1994) являются ингибиторами роста эукариотических клеток.

Для решения проблемы аккумуляции избыточного лактата в полунепрерывных клеточных культурах были предложены различные стратегии, описанные выше. В настоящем изобретении представлен альтернативный подход к уменьшению концентрации лактата и увеличению плотности жизнеспособных клеток и жизнеспособности. Предложенный способ использует сверхэкспрессию одного или более антиапоптозных генов в линии клеток-хозяев. Получаемые при этом устойчивые к апоптозу клеточные линии стимулируют дыхание митохондрий и аккумулируют меньше лактата. Поэтому данные клеточные линии хорошо развиваются при содержании в средах с высоким содержанием глюкозы. Следовательно, культуры устойчивых к апоптозу клеточных линий могут достигать высокой плотности жизнеспособных клеток. Благодаря устойчивости к апоптозу эти клеточные линии также обладают продленной продолжительностью жизни.

Предложенные в изобретении способы могут быть полезны для увеличения плотности жизнеспособных клеток и жизнеспособности в подпитываемых клеточных линиях, таких как культура клеток яичника китайского хомячка (СНО), культуры клеток миеломы и гибридомы. В частности, предложенные в данном изобретении способы могут использоваться для увеличения общего числа жизнеспособных клеток (1УСС) в культурах клеток СНО. Предложенный в изобретении способ состоит из определенных этапов: культивирования клеточной линии, экспрессирующей один или более гетерологичных генов устойчивости к апоптозу (апоптозный ^к) и один или более представляющих интерес генов, а также поддержания высокого содержания глюкозы в питательной среде в течение экспоненциальной и стационарной фаз роста клеточной культуры. Эти культуры являются превосходными хозяевами для создания производственных клеточных линий, экспрессирующих представляющие интерес белки, такие как пептиды, пептиды слияния, факторы роста, гормоны, антитела, сконструированные белки с анкириновыми повторами (ΌΆΚΡίη) и другие полипептиды, используемые в терапевтических, диагностических либо исследовательских целях. Клеточные линии СНО, которые могут быть использованы в предложенном в изобретении способе, включают линии СНО-К1 (1пуйтодеи, СагКЬаб. СА) и СН0-К18У (Бопха В1о1оц1е8, 81оидй, БК). Клеточные линии миеломы, используемые в данном способе, включают линии N80 и 8р2/0.

Все клеточные линии, которые могут быть использованы в предложенном в изобретении способе, экспрессируют один или более гетерологичных антиапоптозных генов. В частности, могут быть использованы гены, кодирующие белки Е1В19К (8Еф ΙΌ N0: 1 и 2) и Ауеп (8Еф ΙΌ N0: 3 и 4). Также может быть использован ген, кодирующий ΧΙΑΡΔ (8Еф ΙΌ N0: 5 и 6). Эти антиапоптозные гены представляют собой гены, действующие на ранних, средних и поздних стадиях апоптозного сигнального пути соответственно. Кроме того, также может быть использован ген, кодирующий Βο1-2Δ (8Еф ΙΌ N0: 7 и 8). Экспрессия антиапоптозных генов может быть достигнута с помощью методик трансфекции, хорошо знакомых специалистам, работающим в области. Предполагается, что в предложенных способах возможно также использование других участвующих в указанных выше стадиях апоптозного сигнального пути антиапоптозных генов, таких как ΜΌΜ2 (8Еф ΙΌ N0: 9 и 10) и Вс1-ХЬ (8Еф ΙΌ N0: 11 и 12).

Использование в настоящем изобретении клеточных линий, экспрессирующих гетерологичные антиапоптозные гены, позволяет обеспечить уменьшение секреции лактата или, как вариант, потребление аккумулированного лактата и достигнуть практически в два раза большего общего числа жизнеспособных клеток (ГУСС), чем в контрольных клеточных линиях, при сохранении высокого содержания глюкозы в питательной среде. При увеличении плотности жизнеспособных клеток в культуре продуктивных клеточных линий увеличивается также выход продукта, получаемого в результате одного цикла работы биореактора. В результате увеличения производительности может быть достигнуто снижение стоимости

- 3 019812 сложных биологических продуктов, кроме того, отсутствие лизиса нежизнеспособных клеток позволяет произвести продукт лучшего качества, так как в результате лизиса освобождаются протеазы, приводящие к деградации продукта. В соответствии с вышесказанным данные линии являются превосходными хозяевами для создания продуктивных клеточных линий, экспрессирующих один или более представляющих интерес белков.

Предложенный в изобретении способ предлагает стратегию культивирования клеточных культур, позволяющую обеспечить рост культуры как при высоком содержании глюкозы, так и при снижении ее концентрации, на основе способности апоптозных ⁴ клеточных линий потреблять лактат или производить меньшее количество лактата, который в других линиях накапливается как продукт метаболизма. В разнообразных примерах осуществления предложенный в изобретении способ обеспечивает увеличение пиковой плотности жизнеспособных клеток, продолжительности жизни культуры, увеличение титра секретируемых белков, общего числа жизнеспособных клеток, а также уменьшение потока кальция и увеличение мембранного потенциала митохондрий в полунепрерывных клеточных культурах. Кроме того, для высокой продуктивности клеточных линий нет необходимости в стратегиях подпитываемого культивирования, которые ранее использовались для ограничения высокого содержания токсичных веществ, таких как лактат и аммиак.

При трансфекции место хромосомной интеграции антиапоптозного трансгена может определять уровень его экспрессии. Более того, при трансфекции нескольких антиапоптозных генов уровень экспрессии отдельного антиапоптозного трансгена может влиять на активность остальных антиапоптозных белков, находящихся в клетке, так как многие из них прямо или косвенно взаимодействуют друг с другом, производя физиологические изменения в клетке. Таким образом, определение количественного вклада каждого отдельного антиапоптозного гена в общие апоптозные ⁴ характеристики клеточной линии, содержащей множество генов, может быть затруднено вследствие синергического эффекта апоптозных ⁴ генов. Кроме этого, имеет место значительное варьирование между клонами в отношении апоптозных ⁴ характеристик, даже если все клоны были получены при трансфекции идентичным набором трансгенов. Из результатов, приведенных в примерах ниже, ясно, что каждый тестированный антиапоптозный ген добавляет некоторое улучшение к апоптозным ⁴ характеристикам клеточной линии-хозяина, подвергнутой трансфекции. В пределах указанных ограничений, тройные трансфектанты обычно превосходили двойные трансфектанты, которые, в свою очередь, были лучше трансфектантов, сверхэкспрессирующих только один антиапоптозный трансген.

Вследствие трансфекции соответствующими векторами экспрессии были получены клоны с варьирующим уровнем экспрессии Е1В-19К, Луеи и ΧΙΑΡΔ. Уровень экспрессии белка Е1В-19К был относительно низкий, и редкие клоны, имевшие высокий уровень экспрессии этого белка, были либо нестабильны, либо имели слабую способность к росту (данные не приводятся). В приведенных ниже примерах, в клетках СНО, экспрессирующих только белок Е1В-19К, наблюдалась лишь ограниченная защита от клеточной гибели (фиг. 4).

В противоположность результатам, полученным при наблюдении клеточных линий, экспрессирующих только Е1В-19К, данные, представленные в приведенных ниже примерах, показывают, что клеточные линии СНО-К1, экспрессирующие совместно Ауеи (ЕА167) или Ауеи и ΧΙΑΡΔ (ЕАХ197), проявили улучшения в жизнеспособности, клеточной плотности и 1УСС. Результаты, представленные в приведенных ниже примерах, демонстрируют, что экспрессия двух антиапоптозных генов в клетках линии СНО-К1 приводит к значительному уменьшению активности каспазы и улучшению мембранного потенциала митохондрий при повреждающих воздействиях, таких как воздействие стауроспорина или продленное культивирование.

В приведенных ниже примерах исследуется влияние экспрессии гена Е1В-19К, функционального гомолога Вс1-ХЬ, в комбинации с генами Ауеи и ΧΙΑΡΔ на замедление клеточной гибели. Уровень экспрессии белка ΧΙΑΡΔ в трансфицированных клетках был невысокий по отношению к эндогенному белку ΧΙΑΡ дикого типа, уже присутствующему в клетке, вероятно, вследствие использования в этой системе двух введенных плазмид. Тем не менее, введение гена ΧΙΑΡΔ в клеточную линию ЕАХ197 (дополнительно к генам Ανеη и Е1В-19К) обеспечило стабильное увеличение максимальной плотности жизнеспособных клеток в обеих культурах, как в культуре без добавления лактата (фиг. 5 и 7), так и в культуре с подпиткой лактатом (фиг. 7). Действительно, клеточная линия ЕАХ197, культивируемая в среде с добавлением лактата, была способна поддерживать высокую жизнеспособность на приблизительно 60% или немногим больше, в течение 14 дней, что оказалось на два дня больше, чем в линии ЕА167, и на четыре дня больше, чем в контрольной культуре. Включение в клетку гена ΧΙΑΡΔ приводит к увеличению устойчивости клетки к активации каспазы, это также подтверждается очень низкой активностью каспазы в линии ЕАХ197, показанной на фиг. 3, даже после обработки стауроспорином. Кроме того, использование мутантного гена ΧΙΑΡ (ΧΙΑΡΔ) приводит к усилению апоптозной устойчивости по сравнению с геном ΧΙΑΡ дикого типа. Таким образом, защищающая способность делеционного мутанта ΧΙΑΡ (ΧΙΑΡΔ) может быть значительной, даже если экспрессия белка в линии СНО невысока.

В приведенных ниже примерах была исследована роль одного или более антиапоптозных генов в

- 4 019812 клеточном метаболизме. В апоптозных ¹ клеточных линиях, экспрессирующих белок Е1В-19К в комбинации с белками Ауеи и/или ΧΙΑΡΔ, было определено потребление питательных веществ и производство продуктов метаболизма. В частности, накопление двух самых обычных продуктов жизнедеятельности в клеточных культурах (а именно, лактата и аммония) сравнили в апоптозных ¹ и контрольной клеточных линиях. В данных, представленных ниже, показано, что при полунепрерывном культивировании в качалочных колбах в среде СЭ-СНО. на 6-7-й день после посева контрольная культура аккумулировала лактат в количестве 2,8 г/л (31 мМ) и аммоний - 12 мМ (фиг. 5), что значительно выше концентрации лактата 18 мМ (Кигапо е! а1., выше) и аммония 8 мМ (Наикеи аий ЕтЬогд, выше), являющихся лимитирующими для клеточного роста, согласно опубликованным данным. Высокий уровень лактата и аммония частично объясняют потерю жизнеспособности, отмеченную в контрольной линии СНО на 8-й день после инокуляции (фиг. 4).

Несмотря на то что представленные ниже данные демонстрируют, что апоптозные ¹ клеточные линии накапливают некоторое количество лактата в начале процесса культивации, эти линии начинали потреблять лактат в течение экспоненциальной фазы и продолжали наращивать УСЭ, значительно превосходя по этому показателю контрольные культуры. Либо способность потреблять лактат после исчезновения в среде глюкозы, либо усиленное ингибирование апоптоза, либо оба фактора одновременно внесли вклад в продление клеточного роста. Более того, апоптозные ¹ клетки вступают в стационарную фазу роста только после исчерпания всего эндогенного лактата. С целью определить, является ли потребление лактата общей характеристикой сконструированных клеточных линий, для восполнения потребленного лактата к апоптозным ¹ культурам был добавлен экзогенный лактат (фиг. 6). Результаты, представленные в приведенных ниже примерах, показывают, что апоптозные ¹ культуры потребляли добавленный лактат и сохраняли высокие показатели УСЭ и жизнеспособность на 4-7 дней дольше, чем контрольные культуры (без добавления лактата и при подпитке лактатом соответственно; фиг. 7А и 7В). Дополнительным преимуществом процесса является то, что низкий уровень лактата в апоптозных ¹ клеточных линиях приводит к низкой осмолярности и высокому значению рН, а оба этих показателя являются в высшей степени желательными для улучшения качества продукта.

Некоторые исследователи уже отмечали потребление лактата в клеточных линиях гибридомы, миеломы N80 и культурах СНО (йе/епдоШа е! а1., 2000; 2йои е! а1., 1995 и 1997; Вигку е! а1., 2007; Раксое е! а1., 2007). Однако для этих клеток типично производство лактата во время экспоненциальной фазы роста и переход к потреблению этого соединения во время стационарной фазы, что позволяет предположить, что лактат может представлять собой как промежуточный продукт метаболизма, так и углеводный источник (Вигку е! а1., 2007; Вгоокк е! а1., 1985). В результатах, представленных ниже, контрольные культуры СНО потребляли некоторое количество лактата во время стационарной фазы роста, в особенности в среде с высоким содержанием глюкозы (фиг. 9), как уже было отмечено в предыдущих исследованиях. Апоптозные ¹ клетки, напротив, вели себя совершенно иначе: в этих клетках лактат потреблялся в течение экспоненциальной фазы, и клетки вступали в стационарную фазу, только когда экзогенный лактат был исчерпан.

Превращение пирувата в лактат, катализируемое лактатдегидрогеназой (ЬИН), является обратимым, но равновесие значительно сдвинуто в сторону формирования лактата с константой равновесия, равной 3,6х10⁴/М. Тем не менее, когда гликолиз не успевает удовлетворять потребность в трикарбоновых кислотах (ТСА), лактат может быть вновь превращен в пируват одним из изоэнзимов БОН, катализирующим эту реакцию. Потребляемый в апоптозных ¹ клеточных линиях лактат, вероятно, используется в цикле трикарбоновых кислот, принимая тем самым участие в клеточной энергетике и производстве аминокислот. Интересно, что апоптозные ¹ культуры отличаются от контрольных культур в отношении концентрации аммиака: в них отмечается периодичное преходящее снижение производства аммиака как без добавления, так и при добавлении лактата в клеточную культуру, а также общее уменьшение производства аммиака. Использование аминокислот в качестве источника энергии в цикле ТСА способствует накоплению аммиака. Уменьшение производства аммиака, следовательно, позволяет предположить, что апоптозные ¹ клеточные линии получают меньшее количество энергии из расщепления аминокислот, чем контрольные линии, что кажется вполне обоснованным, поскольку апоптозные ¹ клетки также потребляют большее количество лактата в качестве источника энергии. Следует отметить, тем не менее, что снижение содержания аммиака является временным и что апоптозные ¹ клетки все же могут использовать аминокислоты в качестве источника энергии. Действительно, три аминокислоты, изолейцин, лейцин и валин, являющиеся аминокислотами с разветвленной цепью, потреблялись быстрее в апоптозных ¹ клеточных линиях, и их потребление было особенно выражено при подпитке лактатом (фиг. 8А-8С). Так как в апоптозных ¹ клеточных линиях период роста был продлен по сравнению с контрольными клеточными линиями, эти три аминокислоты могут быть использованы в качестве блоков в формировании жирных кислот и других белков, необходимых апоптозным ¹ клеткам, а также могут расщепляться в цикле ТСА в качестве источника энергии. Сходная динамика потребления наблюдается также в отношении метионина (фиг. 8Ό).

В противоположность названным аминокислотам, концентрация которых в среде уменьшалась, не

- 5 019812 которые аминокислоты, такие как аланин и аспартат, временно секретировались в контрольной культуре. Некоторая часть пирувата может быть превращена в аланин при содействии аланинаминотрансферазы. Вполне вероятно, что данный путь является более активным в апоптозных ^к клетках, что приводит к увеличению концентрации аланина по сравнению с контрольными клеточными линиями (фиг. 8В). Аспартат, кроме того, относится к аминокислотам семейства аспарагиновой кислоты и образуется вместе с альфа-кетоглутаровой кислотой в результате превращения оксалоацетата и глутамата, промежуточных соединений, образующихся в цикле ТСА при участии аспартатаминотрансминазы. Уровень аспартата увеличивается только в контрольных клетках в течение первых шести дней, в апоптозных ^к клеточных линиях он постоянно понижается. Поскольку указанная реакция является обратимой, уменьшение концентрации аспартата в апоптозных ^к клеточных линиях в самом начале фазы роста указывает, возможно, на присутствие ограничения количества обратимого оксалоацетата, образующегося в результате цикла ТСА в апоптозных ^к клеточных линиях. Учитывая, что оксалоацетат в начальной стадии цикла ТСА также взаимодействует с ацетил-СоА, увеличение превращения пирувата, забираемого из обратимого равновесия с лактатом, в ацетил-СоА, может усиливать потребность в оксалоацетате в апоптозных ^к клеточных линиях. Контрольные клеточные линии, наоборот, нуждаются в меньшем количестве ацетил-СоА, поскольку они не усваивают лактат и, следовательно, производят аспартат из оксалоацетата. Действительно, отсутствие потребности в ацетил-СоА могло бы приводить к увеличению концентрации лактата, являющегося альтернативным побочным продуктом при образовании ацетил-СоА, в контрольных клетках в течение первых семи дней культивирования. С другой стороны, отсутствие потребления лактата в контрольных клеточных линиях может привести к ограничению запаса ацетил-СоА и сопутствующему увеличению производства аспартата.

Данные результаты указывают на повышенную энергетическую эффективность цикла ТСА в клеточных линиях, экспрессирующих антиапоптозные гены, несмотря на то, что для точной интерпретации реакций, происходящих в клетке, необходим детальный анализ метаболических путей. Вне зависимости от дальнейшей судьбы потребленного лактата, в настоящем изобретении продемонстрировано, что апоптозные ^к клеточные линии потребляют накопленный лактат, что, в свою очередь, способствует увеличению длительности жизни и увеличению 1УСС.

Если апоптозные ^к клеточные линии уникальны в том, что они могут увеличивать длительность своей жизни, потребляя накопленный лактат, тогда существует возможность для культивирования этих линий в среде, содержащей лактат, или в среде, содержащей глюкозу в концентрации, превышающей норму. Несмотря на то что при использовании лактата в качестве единственного источника углерода клеточная линия любого типа едва ли имела хорошие показатели роста и жизнеспособности, в апоптозных ^к клеточных линиях наблюдалось потребление лактата, когда он добавлялся в качестве одного из компонентов, в дополнение к глюкозе (данные не приводятся), либо когда лактат накапливался в культуре в результате жизнедеятельности. Эти наблюдения позволяют предположить, что апоптозные ^к клетки не могут осуществлять глюконеогенез из пирувата или получать достаточно энергии из лактата, но, если глюкоза присутствует вместе с лактатом, клетки могут потреблять как глюкозу, так и накопленный или добавленный в культуру лактат. Кроме того, в среде с высоким содержанием глюкозы (60 мМ) 1УСС (а также УСЭ и жизнеспособность, фиг. 9А-9С) апоптозных ^к клеточных линий значительно превышали соответствующие показатели контрольных клеточных линий. Это являлось следствием того, что в среде с высоким содержанием глюкозы контрольные клеточные линии накапливали лактат в количестве, превышающем 20 мМ, которое могло быть токсичным. Напротив, апоптозные ^к клеточные линии потребляли лактат в начале фазы роста и поэтому содержали большее число жизнеспособных клеток, которое, в пересчете на прирост 1УСС, превышало контроль на 170% (фиг. 9С).

Поскольку апоптозные ^к клеточные линии потребляли лактат и достигали более высокого показателя 1УСС, производственные клеточные линии, экспрессирующие представляющие интерес белки, например терапевтические антитела, полученные из апоптозных ^к линий-хозяев, достигали значительно более высокого титра производимого продукта, чем контрольные клеточные линии. Более высокие титры производимых белков иллюстрируют потенциальные коммерческие преимущества использования антиапоптозных генов в клеточных линиях млекопитающих, производящих терапевтические или какие-либо другие представляющие интерес белки.

Настоящее изобретение далее будет рассмотрено со ссылкой на конкретные, но не лимитирующие примеры.

Примеры

В следующих примерах перемешиваемых культур клеток СНО, содержащихся в качалочных колбах и характеризующихся сверхэкспрессией антиапоптозных генов, были проанализированы пик плотности жизнеспособных клеток, продолжительность жизни, активация каспазы 3, а также мембранный потенциал митохондрий (ММР). Кроме того, чтобы понять, оказывает ли экспрессия антиапоптозных генов какое-либо влияние на потребление питательных веществ и аккумуляцию метаболитов в системе культуры клеток млекопитающих, потребление питательных веществ и производство метаболитов сравнили в клеточных линиях, содержащих антиапоптозные гены, с соответствующими показателями в контрольных клеточных линиях.

- 6 019812

Материалы и способы.

Клеточные культуры.

Клеточная линия СНО-К18У (Ъопха Βίοίο^ίεδ, δίοιίβΐι. ИК), обозначенная как контрольная клеточная линия С1013А, культивировалась в среде СЭ-СНО (Са1. Νο. 10743-011, Ιηνίΐτο^βη, СатНЬаф СА), содержащей 30 мМ глюкозы при добавлении 6 мМ Ь-глутамина (Ιηνίΐτο^βη Са1. Νο. 10313-021). В некоторых примерах была использована другая среда, свободная от животного белка и содержащая различные концентрации глюкозы, включая также концентрацию 60 мМ (обозначенная как среда с высоким содержанием глюкозы). Эмбриональная бычья сыворотка была приобретена у Нус^пе ЬаЬк, Εοβηη, ИТ (Са1. Νο. 8Н30071.03). Наблюдение клеточных культур производилось с помощью автоматического счетчика клеток Себех (Iηиονаΐ^8, Сеттапу). Общее число жизнеспособных клеток (1УСС, клеток-дней/мл) определялось согласно следующей формуле:

где УС'Э - плотность жизнеспособных клеток.

Конструкция плазмид.

Вектор рВиЭСЕ4.1 предназначался для конститутивной экспрессии Е1В-19К (ЕЕ-1а промотор), либо в одиночку, либо вместе с Асеп (СМУ промотор), и был охарактеризован в других работах (Νίνίΐсйаиуοид е1 а1., 2007). Вектор, экспрессирующий ΧΙΑΡΔ (СМУ промотор), был сконструирован согласно 8аиег\уа1б е1 а1., 2002. Название пустой вектор относится к оригинальному вектору рВиЭСЕ4.1.

Экспрессирующий вектор для модельных антител (АЬ №1) был сконструирован за счет клонирования кДНК, кодирующей тяжелую и легкую цепи, в экспрессирующий вектор, содержащий глутаминсинтетазу (С8) (получен от Εοπζη Βίοίο^κκ, δίοιίβΐτ ИК, по исследовательской лицензии).

Создание апоптозных ^Κ клеточных линий.

Клеточная линия СНО-К18У, находящаяся в экспоненциальной фазе роста, была трансфицирована векторами: 1) рВиЭСЕ4.1; 2) рВиЭСЕ4.1-Е1В-19К; 3) рВиЭСЕ4.1-Е1В-19К-Асеи и 4) рВиЭСЕ4.1-Е1В19К-Асеп и рСМУ-XIΑΡΔ. Трансфекция была выполнена с помощью реагента Еидепе (Κο^, Са1. № 1815075, Ва§е1, 8\\1Мег1апб) в соответствии с рекомендациями производителя. Спустя два дня клетки были помещены для роста в 96-луночные планшеты, питательную среду, содержащую 300 мкг/мл зеоцина (для перечисленных выше трансфекций 1, 2 и 3); 300 мкг/мл зеоцина и 400 мкг/мл гидромицина (для трансфекций № 4), см. таблицу. Приблизительно 200 устойчивых к антибиотику клонов были размножены; активность каспаз 3 и 7 была проанализирована, как описано далее. Представляющие интерес клоны были проверены на стабильность в течение 10 этапов в отсутствие антибиотика.

Клоны
Клеточная	Использованные векторы	Сверхэкспресоирован-	критерии
линия		ньте гены	отбора
Контрольный	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует
образец
Пуст.	рВ1ЮСЕ4.1	Отсутствует	гео
Е64	рВиОСЕ4.1-Е1В-19К	Е1В19К	2ео
ЕА63	рВЦССЕ4 .1-Е1В-19К -Ахеп	Е1В-19К, Ανβη	гео
ЕА112
ЕА167
ЕА190
ЕАХ64	рВЦЦСЕ4. 1-Ε1Β-19Κ-Ανβη	Е1В-19К, Ανβη, ΧΙΑΡΔ	2ео, Нудго
ЕАХ99	и ρϋΜν-ΧΙΑΡΔ
ЕАХ148
ЕАХ197

В первую очередь были созданы контрольные клеточные линии за счет трансфекции пустого вектора в клетки линии СНО-К18У и отбора устойчивых к зеоцину клонов. Показатель 1УСС в этих клеточных линиях был в среднем на 20% ниже, чем в нетрансфицированных контрольных линиях СНО-К18У, поэтому линии СНО-К18У были использованы во всех последующих экспериментах в качестве контрольных. Апоптозная ^Κ клеточная линия ЕАХ197, представляющая наибольший интерес, а также контрольная клеточная линия были впоследствии использованы для создания продуктивной линии, экспрессирующей модельные антитела, с помощью экспрессирующего вектора, содержащего С8, в соответствии с рекомендациями производителя. Содержание антител в клеточной культуре измерялось посредством нефелометрии (Весктап Аггау 8у§1ет).

Культивирование апоптозных ^Κ клеточных линий в качалочных колбах.

Отобранные апоптозные ^Κ клеточные линии культивировались подпитываемым способом в среде СЭ-СНО с добавлением 6 мМ глутаминовой кислоты и необходимого для отбора антибиотика. В некото

- 7 019812 рых экспериментах в полунепрерывные культуры апоптозных ^Β клеточных линий добавляли лактат для восполнения его содержания в среде. Кроме того, отобранные клеточные линии, экспрессирующие ЛЬ, культивировались в адаптированной среде, свободной от животного белка, с добавлением 6 мМ глутаминовой кислоты и 60 мМ глюкозы.

Анализ активности каспаз 3 и 7.

Клетки каждого клона, приблизительно 3х10⁵, были высеяны в 1 мл питательной среды на 24луночный планшет. На четвертый день (64) после посева клетки, приблизительно 1 х 10⁵, перенесли на 96луночный планшет, сделав три копии. До начала анализа активности каспаз 3 и 7 клетки инкубировались в среде с добавлением стауроспорина (2 мкМ £с) в течение 16 ч; оценка производилась с помощью набора реагентов ΑΡΟ-ΟΝΕ (ΒΌ ЬаЬк). Процедуру повторили на 10-й день без стауроспорина. Клоны, проявившие значительно более низкую активность каспаз 3 и 7 в оба указанных дня, были пересеяны на бессывороточную среду (8Е). Апоптозные ^Β свойства выбранных клонов были подтверждены с помощью поточной цитометрии (см. далее) и в отдельных случаях измерением мембранного потенциала митохондрий.

Анализ апоптозных ^к клонов в системе поточной цитометрии.

Клетки были взяты из линий, культивируемых в качалочных колбах и находящихся на экспоненциальной фазе роста, приблизительно 1х 10⁶ из каждой культуры, и перенесены на 24-луночный планшет; клетки инкубировались в течение 16 ч в среде со стауроспорином (2 мкМ £с), затем были собраны и отмыты в фосфатно-солевом буферном растворе. После этого клетки были подвергнуты инкубации с Су1оРсгш (Са1. Νο. 2075КК, ΒΌ Вю8с1еисе) для фиксации и достижения проницаемости. После промывания в фосфатно-солевом буферном растворе и до анализа в системе поточной цитометрии клетки инкубировались с антителами к каспазе 3, меченными МТС (Са1. Νο. 68654, ΒΌ Вю8аепсе).

Анализ мембранного потенциала митохондрий (ММР).

Клетки, культивируемые в качалочных колбах, были взяты на 6-й день после посева и инкубировались в присутствии стауроспорина (5 мкМ £с) в течение 2 ч. Затем клетки были промыты и обработаны липофильным катионным красителем 1С-1 (Саутап ЬаЬк, Αηη АгЬог, ΜΙ) в соответствии с рекомендациями производителя. Сканирование спектра эмиссии планшетов проводилось на каналах, соответствующих длинам волн 535 и 595 нм; было рассчитано соотношение полученных величин.

Вестерн-блоттинг.

Клетки из указанных культур, приблизительно 1 х 10⁷, были собраны, промыты в фосфатно-солевом буферном растворе и подвергнуты лизису в буфере ΒΙΡΑ, содержащем 1% ΝΡ-40, 120 мМ ТИ8-НС1, 150 мМ №С1, 0,2 мМ ΡΜ8Ε и 1 мМ ΕΌΤΑ. 50 мкг цитозольного белка из каждого образца поместили в градиентный гель ΝιιΡΑΟΕ 4-12% и разделили с помощью метода 8Ό8-ΡΑ6Ε в системе Νο\όχ (1пуйтодеп). Разделенные белковые полосы были перенесены на нитроцеллюлозу и проанализированы с использованием: 1) антимышиных антител к человеческому белку Е1В-19К, разведение 1:40 (Са1 Νο. ΌΡ-17, Са1Вюсйет, йЬЬзЮуп, ΜΌ); 2) антикроличьих антител к человеческому белку Α\όπ. разведение 1:1000 (Са1 Νο. 612521, ΒΌ Вю8с1епсе, 8ап .Вхе. СΑ); и 3) антимышиных антител к человеческому белку ΧΙΑΡ (Са1 Νο. 616713, ΒΌ Вю8аепсе). Вышеизложенный протокол, включая использованные антитела, был оптимизирован и стандартизирован с использованием известных количеств (~10 нг каждого) очищенных белков Е1В-19К, Ανеη и ΧΙΑΡ, приобретенных в коммерческих фирмах. Для визуализации белковых зон был использован набор ЕСЬ (СЕ НеаИйсате, ЕБсаи-пУзу. Ν1).

Определение концентрации метаболитов в среде.

Концентрации ключевых метаболитов и продуктов жизнедеятельности были определены в автоматическом анализаторе Υ8Ι 2700. Концентрация ионов аммония определялась с помощью проточноинжекционного анализа (Сатртащ е1 а1., 1994). Аминокислоты измерялись с помощью ΗΡΕ-С (\Уа1ег5. Μίΐίοτά, ΜΑ), используя колонку с обратимой фазой (\Уа1ег5).

Пример 1.

Создание устойчивых к апоптозу клеточных линий и исследование их свойств.

Список клеточных линий, использованных в настоящем исследовании, экспрессионные плазмиды, которые были использованы для трансфекции при создании каждой клеточной линии, и селективные агенты, использованные для изоляции трансфектом, перечислены в приведенной выше таблице. Указанные в таблице клеточные линии представляют собой множественные клоны, созданные в результате каждой трансфекции. Название каждой клеточной линии является производным от антиапоптозных генов, трансфицированных в клеточную линию-хозяина. Например, ЕАХ197 - это клеточная линия, которая была трансфицирована генами Е1В-19К (Е), Луеп (А) и ΧΙΑΡΔ (X). Название апоптозная ^Β будет в дальнейшем использоваться для обозначения клеточных линий, трансфицированных одним или более указанными антиапоптозными генами.

Оценка свойств апоптозных ^Β клеточных линий, использованных в настоящей работе, была произведена с помощью вестерн-блоттинга, анализа активности каспаз 3 и 7, а также с помощью анализа мембранного потенциала митохондрий (данные не приводятся). Как единичные Е64, так и двойные трансфектанты ЕА63, ЕА112, ЕА167 и ЕА190 экспрессировали большее, чем фоновое, наблюдаемое в не

- 8 019812 трансфицированных контрольных линиях С1013А, количество белка Е1В-91К. Из четырех клеточных линий, являющихся двойными трансфектантами, ЕА112 и ЕА167 экспрессировали как белок Е1В-19К (~19 кДа), так и белок Ауеп (~55 кДа). Клеточные линии ЕА63 и ЕА190 экспрессировали белок Е1В-19К в довольно большом количестве, тогда как производство белка Ауеп было очень низким. Из четырех клеточных линий, созданных при трансфекции двойными векторами рВиЭСЕ4.1-Е1В-19К-Ауеп и рСМУ-ΧΙΑΡΔ, а именно линий ЕАХ64, ЕАХ99, ЕАХ148 и ЕАХ197, только линия ЕАХ197 экспрессировала все три белка в детектируемых количествах.

Полоса, соответствующая белку с массой ~55 кДа, наблюдалась во всех лунках планшета, включая лунку, соответствующую нетрансфицированной контрольной линии С1013А; выше рекомбинантного белка Ауеп предположительно располагалась полоса, соответствующая эндогенному белку Ауеп, как подтверждалось постиммунной, но не преимунной сывороткой (8аиег\\а1б е1 а1., 2002, Сйаи е1 а1., 2000). У трансфицированного гена Ауеп отсутствуют первые шесть аминокислот, которые, как оказывается, не нарушают биологическую активность белка. Следовательно, трансфицированный Ауеп немного меньше, чем его эндогенный аналог. Полоса, соответствующая массе 40 кДа, которая, вероятно, представляет собой частично разрушенный белок Ауеп, присутствовала во всех клеточных линиях, сверхэкспрессирующих этот белок одновременно с Е1В-19К. Деградированные продукты сходных размеров наблюдались и прежде при одновременной сверхэкспрессии Ауеп с Ве1-ХЬ (8аиег\\а1б е1 а1., 2005) или с Вс1-2 (Идлетоа, неопубликованные данные). Кроме того, экспрессия Ауеп была значительно ниже в тройных трансфектантах, включая линию ЕАХ197, сверхэкспрессирующую Е1В-19К, Ауеп и XIАΡΔ.

Любопытно, что уровень экспрессии трансфицированного XIАΡΔ был значительно ниже, чем эндогенный уровень оригинального белка Х1АР. Заметим, что значительные отличия между XI АР и XIАΡΔ в уровнях экспрессии отчасти могут быть объяснены отличием в эффективности связывания антител этими различными формами антиапоптозного белка. Столь явные отличия в экспрессии между эндогенным Х1АР и трансгенным XIАΡΔ ставят под сомнение вклад последнего в предотвращение апоптоза. Действительно, настоящее исследование позволяет предположить, что прямая корреляция между уровнем экспрессии данного антиапоптозного гена и уровнем защиты от апоптоза, который соответствующий белок обеспечивает клеточной линии, существует не всегда.

Активность каспаз 3 и 7 анализировалась в каждой апоптозной ^к клеточной линии с помощью АРООИЕ, поскольку активность каспазы служит индикатором степени устойчивости клеточной линии к апоптозу. Коротко говоря, этот анализ состоит в том, что профлюоресцентный субстрат 2-ЭЕУЭ-В110 расщепляется каспазами 3 и 7, причем эффективность разрушения зависит от количества каспаз. Культуры ЕА167 и ЕАХ197, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, также как и контрольная клеточная линия, инкубировались в присутствии стауроспорина в течение 16 ч с целью индукции апоптоза, после чего измерялась активность каспаз 3 и 7. Активность каспаз 3 и 7 в обработанных стауроспорином контрольных клеточных линиях была принята за 100%. В этом случае активность каспазы в клетках линий ЕА167 и ЕАХ197 составила соответственно 30 и 35% от контроля, позволяя предположить, что эти клеточные линии имели, по крайней мере, частичную устойчивость к индукции апоптоза (фиг. 2А). Для дальнейшего выяснения апоптозных ^к свойств ЕА167 и ЕАХ197 обработанные стауроспорином культуры этих двух клеточных линий, также как и контрольной клеточной линии, инкубировались с антителами против каспазы 3, меченными Р1ТС, и затем были проанализированы в системе поточной цитометрии. На фиг. 3 можно увидеть, что все три клеточные линии, вне зависимости от того, подвергались ли они обработке веществом-носителем (в данном случае был использован ΌΜ8Ο), имели 1% или меньшее количество клеток, позитивных в отношении каспазы 3. Однако 91% популяции контрольных клеток после обработки стауроспорином являлись позитивными в отношении каспазы 3. Напротив, только 9% всей популяции, полученной из клеточной линии ЕАХ197, и 30% клеток, полученных из клеточной линии ЕА167, были позитивны к каспазе 3, подтверждая апоптозный ^к фенотип этих двух клеточных линий.

Чтобы проверить, приводит ли устойчивость к апоптозу к увеличению длительности жизни, в достаточно большом числе клеточных линий ЕА, культивируемых в качалочных колбах (продленное культивирование), измеряли плотность жизнеспособных клеток (УСЭ) и общее число жизнеспособных клеток (1УСС). Увеличение общего числа жизнеспособных клеток улучшает продуктивность культуры в заданном объеме, при допущении, что продуктивность каждой конкретной клетки остается неизменной. Таким образом, показатель 1УСС может быть использован в качестве параметра для отбора лучших апоптозных ^к клеточных линий, которые могут быть использованы в качестве хозяев при создании продуктивных клеточных линий. Как показано на фиг. 2В, клеточные линии с относительно низкой активностью каспаз 3 и 7, как правило, позволяли создавать клеточные линии с более высоким показателем 1УСС. Несмотря на то что любая клеточная линия ЕА имела уменьшенную по сравнению с контролем активность каспаз 3 и 7, показатель 1УСС не имел четкой корреляции с уровнем активности каспаз 3 и 7, присутствующих в каждой клеточной линии. Кроме того, некоторые апоптозные ^к клеточные линии проявляли большую стабильность, чем их клоны, в отношении выраженности антиапоптозного фенотипа. Клеточная линия ЕА167 была использована для дальнейшего изучения, потому что она имела значительную антиапоптозную активность и устойчивый рост при культивировании в качалочных колбах. Кроме

- 9 019812 того, ЕА167 являлась самой стабильной из всех использованных клеточных линий и интенсивно экспрессировала Ауеи, что было подтверждено с помощью вестерн-блоттинга.

Многие сигнальные молекулы, участвующие в апоптозном пути, либо взаимодействуют с митохондриями, либо находятся внутри них. Эти белки взаимодействуют с митохондриальной мембраной и регулируют апоптоз за счет изменения проницаемости митохондрий. Поэтому мембранный потенциал митохондрий (ММР) служит дополнительным показателем физиологии клетки, по которому можно сравнивать апоптозные ^к свойства линий ЕА167 и ЕАХ197 относительно контроля. Как можно проследить по результатам анализа, представленным на фиг. 2С, обе клеточные линии ЕА167 и ЕАХ197 имели более высокий ММР, чем контрольные линии.

Пример 2.

Влияние Е1В-19К на плотность жизнеспособных клеток в клеточной линии СНО-К18У.

На фиг. 4 сравнивается динамика роста двойных трансфектантов, сверхэкспрессирующих белок Е1В-19К вместе с Ауеи (ЕА167), тройных трансфектантов, сверхэкспрессирующих Е1В-19К вместе с Ауеи и ΧΙΑΡΔ (ЕАХ197), а также трансфектантов, сверхэкпрессирующих только Е1В-19К (Е64), с динамикой роста контрольной линии (линии-хозяина). Тогда как пик УСЭ контрольной клеточной линии составил 7,7х10⁶ клеток/мл, а линии Е64 (экспрессирующей только Е1В-19К) - 8,9х10⁶ клеток/мл, тот же показатель в линии ЕА167 достиг 1,4х10⁷ клеток/мл, а в линии ЕАХ197 - более чем 1,5х10⁷ клеток/мл, что составило увеличение до 190% относительно контрольной линии. Жизнеспособность линий ЕА167 и ЕАХ197 резко снизилась на 8-й или 9-й день после посева, что предположительно явилось следствием снижения содержания питательных веществ в среде, при этом в контрольной линии и в клеточных линиях Е64 жизнеспособность снижалась значительно медленнее (фиг. 4В). Суммарное влияние на 1УСС показано на фиг. 4С. Показатель 1УСС контрольной линии составил 4,9х10⁷ клеток-дней/мл, за ней следовала линия Е64 (5,2х10⁷ клеток-дней/мл). Очевидно, что показатели 1УСС двух апоптозных ^к клеточных линий, ЕА167 (6,3х10⁷ клеток-дней/мл) и ЕАХ197 (6,6х10⁷ клеток-дней/мл) были значительно выше, чем в контроле (136 и 140% в ЕА167 и ЕАХ197 соответственно).

Так же как ЕА167 и ЕАХ197, несколько других апоптозных ^к линий проявили сходный фенотип, производя низкое количество лактата (данные не приводятся). Кроме того, было отмечено существование редких клеточных линий дикого типа, производящих мало лактата (Раксое е1 а1., 2007).

Пример 3.

Динамика метаболизма в апоптозных ^к клеточных линиях.

С целью сравнения физиологических характеристик апоптозных ^к клеточных линий ЕА167 и ЕАХ197, предположительно защищенных от апоптоза, и контрольной линии в полунепрерывных культурах, исследовались концентрации основных питательных веществ и аминокислот: глюкозы, глутамата и глутамина, добавленных в полунепрерывную культуру в самом начале процесса культивации. Кроме того, также происходило наблюдение за накоплением отходов жизнедеятельности, таких как аммиак и лактат. На фиг. 5 показаны количества названных метаболитов в линиях ЕАХ197 и ЕА167, а также в контрольной линии при культивировании в качалочных колбах в полунепрерывном режиме на серийно выпускаемой среде СЭ-СНО. Как показано на фиг. 5А, концентрация глюкозы в среде быстро уменьшается во всех трех клеточных линиях на 6-7-й день после посева. Не было замечено сколько-нибудь значимых различий в снижении концентрации глутамина между апоптозными ^к и контрольными клеточными линиями; уровень глутамата также не варьировал - ни между культурами, ни по дням культивирования (данные не приводятся). Все три клеточные линии накапливали лактат в течение первых четырех дней культивирования, соответствовавших начальной фазе роста культуры (фиг. 5В). Контрольная клеточная линия продолжала накапливать лактат вплоть до 6-го дня (к этому времени его концентрация достигала 2,8 г/л), затем наблюдалось небольшое уменьшение концентрации лактата до 1,8 г/л. Считается, что такое количество лактата снижает рН в культуре, а поскольку в биореакторе рН контролируется добавлением бикарбоната, то это может приводить к увеличению осмолярности. Эти факторы, наряду с другими стрессовыми факторами, могут приводить к формированию токсичной для животных клеток среды. Напротив, концентрация лактата в апоптозных ^к клеточных линиях возрастала в течение меньшего промежутка времени, а затем, начиная с 5-го дня резко снижалась, так что лактат полностью исчезал на 7-й (в линии ЕА167)-8-й (в линии ЕАХ197) день жизни культуры. Интересно, что в последних двух линиях, вслед за моментом, когда концентрация лактата опускалась до нуля, сразу же наступал период резкого снижения УСЭ. как это можно проследить по фиг. 5А, позволяя предположить, что потеря жизнеспособности клеток была следствием отсутствия глюкозы или лактата в среде.

Динамика концентрации аммиака в среде выявила еще одно отличие между апоптозной ^к и контрольной клеточными линиями (фиг. 5С). Концентрация аммиака слегка уменьшалась на 6-й день в линиях ЕА167 и ЕАХ197 (с этим периодом также совпадало начало уменьшения концентрации лактата), а затем снова увеличивалась. Тем не менее, итоговый уровень аммиака в апоптозных ^к линиях был ниже, чем в контрольных, что удивительно, если иметь в виду, что апоптозные ^к линии достигали более высокого показателя 1УСС и, следовательно, большего итогового роста по сравнению с контрольными клеточными линиями (фиг. 4С).

- 10 019812

Приведенные данные свидетельствуют о том, что характеристики апоптозных ^к клеточных линий существенно отличаются от свойств контрольных линий. Тем не менее, среди апоптозных ^к трансфектантов можно встретить широкий спектр фенотипов при наблюдении большого числа клонов в слегка отличающихся экспериментальных условиях. Поскольку в разных изолированных клонах контрольной линии также наблюдается фенотипическое разнообразие, то при применении соответствующих режимов отбора можно выделить редкие апоптозные ^к клоны из контрольной клеточной линии. С этой целью Ма1Ιαηονίοΐι и Вог111 (2006) проанализировали использование методов сортировки клеток для изоляции редких вариантов с желаемыми характеристиками непосредственно из клеточной линии дикого типа (контрольной линии).

Пример 4.

Влияние добавления лактата в культуру.

Количество лактата, присутствующего в клеточной культуре в некоторый момент времени, зависит от количества секретированного клетками лактата, а также от количества потребленного ими лактата. С целью определить, действительно ли апоптозные ^к клеточные линии потребляли лактат, или же итоговая продукция лактата в этих линиях была ниже, производили ежедневное наблюдение за всеми тремя линиями, и любое фиксируемое отличие в концентрации лактата между апоптозными ^к и контрольными клеточными линиями устранялось за счет добавления экзогенного лактата. Как указано выше, уровень лактата в апоптозных ^к линиях ЕА167 и ЕАХ197 в условиях культивирования без подпитки начинал снижаться на 5-й день (фиг. 6А и 6В), полное исчезновение происходило на 7-й день (в линии ЕА67, без подпитки) или 8-й день (в линии ЕАХ197, без подпитки). Содержание лактата в контрольной клеточной линии продолжало увеличиваться вплоть до 6-го дня, затем слегка уменьшалось в течение следующих трех дней, но никогда не падало до нуля. Лактат добавляли в отдельные подпитываемые апоптозные ^к культуры, доводя его количество до 2,5 г/л на 7-й день культивирования (для линии ЕА167, фиг. 6А) и до 2 г/л на 8-й день культивирования (для линии ЕАХ197, фиг. 6В), так чтобы количество лактата было сходно с контрольными культурами; при этом наблюдение за культурами велось ежедневно. Даже при добавлении дополнительного лактата, в апоптозных ^к культурах его количество уменьшалось значительно быстрее, чем в контрольных, в промежуток между 6-м и 12-м днями культивирования. Действительно, в то время как в культуре ЕА167 с подпиткой количество лактата снижалось с 2,5 до 0,2 г/л с 6-го на 7-й день, в контрольной культуре происходило всего лишь снижение с 2,7 до 2,4 г/л. Таким образом, в апоптозных ^к клеточных линиях лактат потреблялся быстрее, чем в контрольных, в течение по крайней мере 7 дней после добавления лактата.

Влияние добавления лактата на УСЭ и жизнеспособность клеток иллюстрируется на фиг. 7А и 7В соответственно. Как уже отмечалось (фиг. 5А), показатель УСЭ апоптозных ^к культур без подпитки быстро уменьшался, начиная с 8-го (в линии ЕА167) и 9-го (в линии ЕАХ197) дней. Вероятно, это происходило в результате полного истощения одного или более существенных компонентов среды, включая глюкозу и (или) лактат. Контрольные клеточные линии проявляли легкое снижение, начиная с 7-го дня. Однако добавление лактата в культуры (ЕА167, подпитка лактатом, и ЕАХ197, подпитка лактатом) приводило к значительно более медленному снижению УСЭ. а в одной клеточной линии (ЕАХ197, подпитка лактатом) показатель УСЭ стабилизировался между 8х10⁶ и 10х10⁶ клеток/мл и поддерживался вплоть до 14-го дня, когда эта линия погибла. Аналогично, жизнеспособность клеток в двух апоптозных ^к культурах, показанная на фиг. 7В, проявила более плавное снижение при добавлении лактата в среду. Эти результаты позволяют предположить, что апоптозные ^к клеточные линии способны эффективно усваивать как эндогенный, так и добавленный в среду лактат, восстанавливая плотность жизнеспособных клеток и жизнеспособность, тогда как контрольные клеточные линии неспособны использовать столь эффективную стратегию потребления лактата. Указанное отличие находит отражение в 1УСС: апоптозные ^к культуры при подпитке лактатом имели показатель 1УСС приблизительно 180-220%, если сравнивать с апоптозными ^к культурами без подпитки, и почти 235-250%, если сравнивать с контрольными культурами.

Динамика большинства других питательных веществ и метаболитов, показанная на фиг. 7Ό-7Ε, была аналогична динамике соответствующих компонентов, характерной для рассмотренных культур без подпитки (см. фиг. 5). Глюкоза и глутамин активно потреблялись уже на ранних этапах жизни культуры. Кривая, характеризующая концентрацию аммиака в апоптозных ^к культурах, проявляла легкое снижение в тот момент, когда начиналось потребление лактата, как в культурах подпиткой, так и в культурах без подпитки лактатом. Как и в предыдущих экспериментах, конечный уровень аммиака в апоптозных ^к клеточных линиях был ниже, чем в контроле, даже несмотря на то, что показатель 1УСС был значительно выше во всех четырех апоптозных ^к культурах. Культуры, как с подпиткой, так и без подпитки лактатом отличались по содержанию глутамата в среде, причем снижение уровня глутамата было более выражено в культурах с подпиткой, чем в культурах без подпитки и контрольных культурах.

Пример 5.

Изменение концентрации аминокислот в апоптозных ^к и контрольных клеточных линиях.

Концентрация каждой из двадцати аминокислот исследовалась в контрольных клеточных линиях, а также в апоптозных ^к культурах с подпиткой и без подпитки лактатом (фиг. 8). Рассматривая потребле

- 11 019812 ние или производство аминокислот, кроме глутамина и глутамата, в первую очередь следует отметить, что ни одна из девяти незаменимых аминокислот (фенилаланин, треонин, метионин, лизин, триптофан, лейцин, изолейцин, валин и гистидин) не была полностью исчерпана. В апоптозных ^к культурах (без подпитки) и в культурах контрольных клеточных линий аспарагин, серин, триптофан и цистеин (выделены курсивом) были исчерпаны практически полностью. Интересно, что концентрация всех трех аминокислот с разветвленной цепью: изолейцина, лейцина и валина - в апоптозных ^к культурах уменьшалась быстрее, чем в контроле, и была более выражена в культурах с подпиткой лактатом (фиг. 8Ά-8Ό). Как и в случае глутамата, финальный уровень трех названных аминокислот был значительно ниже, чем в культурах с подпиткой лактатом. Аминокислоты, потребленные в большом количестве (финальная концентрация составила менее 50% от начальной концентрации) включали тирозин, фенилаланин, метионин (фиг. 8Ό) и аспарагиновую кислоту (фиг. 8Е).

Интересно также сравнить аминокислоты, секретируемые в среду, в культуре контрольных и апоптозных ^к клеточных линий. На фиг. 8Е показано, что контрольные клеточные линии накапливали аспарагиновую кислоту в течение первых шести дней, тогда как во всех четырех апоптозных ^к культурах в продолжение того же периода происходило уменьшение концентрации аспарагиновой кислоты. Кроме того, апоптозные ^к клеточные линии секретировали значительно больше аланина (фиг. 8Е) в течение первых шести дней, чем контрольные клеточные линии, причем все клеточные линии начинали потреблять аланин позднее. Кроме того, за весь период культивирования в целом, апоптозные ^к клеточные линии производили больше гомоцистеина, чем контрольные культуры (фиг. 8С).

Пример 6.

Характеристики полунепрерывных культур при высокой концентрации глюкозы.

Если апоптозные ^к клеточные линии могут усваивать лактат, то существует вероятность, что эти линии будут хорошо развиваться при концентрациях глюкозы, обычно являющихся лимитирующими для роста контрольных клеточных линий из-за накопления токсичных уровней лактата. Кроме того, возможно, что эти линии будут иметь лучшие показатели роста в среде, содержащей лактат в качестве единственного источника углерода. Среда СЭ-СНО, использованная в предыдущих экспериментах, оказалась непригодной в данном случае, поскольку такая высокая концентрация глюкозы привела бы к непереносимому повышению осмолярности, таким образом, возникла необходимость в новой среде. Поэтому мы сравнили кинетику роста клеточной линии ЕАХ197, показавшей наибольший устойчивый рост в предыдущих экспериментах, и контрольных линий при культивировании на адаптированной среде, не содержащей животного белка, в присутствии 60 мМ глюкозы (высокий уровень глюкозы) или 30 мМ лактата. Ни апоптозные ^к. ни контрольные клеточные линии не имели устойчивого роста при полном отсутствии глюкозы, например, только в присутствии лактата (данные не приводятся).

Когда оба типа клеточных линий культивировали в одинаковой адаптированной среде, содержащей высокую (60 мМ) концентрацию глюкозы, клеточные линии ЕАХ197 имели более высокие показатели УСЭ, жизнеспособности и ГУСС (фиг. 9А-9С), чем контрольные линии, в особенности на более поздних этапах культивирования. Клеточные линии ЕАХ197 показали меньшее по сравнению с контролем увеличение ГУСС (130%), чем это было отмечено в среде СЭ-СНО, использованной в предыдущих экспериментах, но отличие все же было значимым вследствие увеличения жизнеспособности на более поздних этапах. Кривые концентрации лактата в среде этих двух клеточных линий при культивировании в условиях высокого содержания глюкозы, показаны на фиг. 9Ό. Так же как и в случае с ГУСС, динамика изменения лактата в культурах обеих клеточных линий отличалась от динамики, наблюдаемой в среде СЭСНО (фиг. 5Ό). В соответствии с результатами, полученными в среде СЭ-СНО, при содержании в адаптированной среде, апоптозные ^к клеточные линии начали потребление лактата раньше (на 2-й день, как показано на фиг. 9Ό), чем контрольные культуры, и максимальное содержание лактата, достигнутое в этих культурах, было ниже (1,2 г/л против 2,4 г/л в контрольных клеточных линиях). Контрольные клетки производили лактат до пятого дня, после чего перешли к потреблению лактата. Поскольку среда СЭСНО - это коммерчески реализуемый продукт, формула которого не разглашается, не представлялось возможным детальное сравнение компонентов сред, чтобы понять, по какой причине клеточные линии демонстрируют различия в потреблении лактата.

Пример 7.

Продуктивность апоптозных ^к клеточных линий в среде, содержащей высокую концентрацию глюкозы.

Апоптозная ^к клеточная линия ЕАХ197, также как и контрольная линия, впоследствии были использованы в качестве линий-хозяев для создания продуктивных клеточных линий, экспрессирующих модельные антитела. Для каждой клеточной линии было исследовано одинаковое количество клонов; в условиях полунепрерывного культивирования в качалочных колбах сравнивалась продуктивность по АЬ между лучшими клонами, произошедшими от разных линий-хозяев. Для сравнения поведения клеточных линий в условиях высокой концентрации глюкозы использовалась адаптированная среда, содержащая 60 мМ (высокое содержание) глюкозы в качестве источника углерода. На стандартной среде (фиг. 10А), титр продукции клеточных линий, производных от линии ЕАХ197, составил 489 мг/л, что представляет собой 145% увеличение по сравнению с контролем, в котором титр составил 337 мг/л. Те же линии в

- 12 019812 среде с высоким содержанием глюкозы (фиг. 10В) имели титр 687 мг/л, что означало увеличение на 178% по сравнению с контрольными линиями (384 мг/л). Увеличение продуктивности произошло, по крайней мере отчасти, благодаря увеличению на 188% показателя 1УСС в линиях ЕАХ197 по сравнению с контрольными клеточными линиями (данные не приводятся).

Пример 8.

Влияние сверхэкспрессии генов Ε1Β19Κ+ΑνΕΝ±ΧΙΑΡΔ на предотвращение апоптоза.

Основные активаторы апоптозного каскада в митохондриях показаны на фиг. 1. С целью создания устойчивых против апоптоза клеточных линий СНО авторы изобретения остановили свой выбор на трех антиапоптозных генах, действующих на ранней, средней и поздней стадиях апоптозного процесса. Это были гены Ε1Β19Κ (Е), ΑνΕΝ (А) и ΧΙΑΡΔ (X). Клеточная линия СНОЖ18У, наиболее часто используемая в качестве клеточной линии-хозяина, была трансфицирована генами Ε1Β19Κ+ΑνΕΝ с/без ΧΙΑΡΔ. Исследованию подвергли большое число трансфектом, и несколько клонов от каждой трансфекции было отобрано для дальнейшего изучения. Эти линии характеризовались очень высоким показателем УСП в целом, показатель 1УС.'С в этих линиях был почти в два раза выше, чем в контроле. Жизнеспособность в апоптозных ^к клеточных линиях уменьшалась на 8-й день после посева, однако восстанавливалась на 10й день, за счет потребления лактата. Среда апоптозных ^к линий, экспрессирующих белки Ε1Β19Κ+ΑνΕΝ±ΧΙΑΡΔ имела следовые или невыявляемые количества аммиака и лактата, а также характеризовалась истощением запасов глутамата.

Пример 9.

Использование Вс1-2б для увеличения титра антител.

Приведенные выше результаты показывают, что апоптозные ^к клеточные линии накапливают меньше лактата, чем контрольные линии, а также, что жизнеспособность апоптозных ^к культур может поддерживаться в среде с высоким содержанием глюкозы. Эксперимент заключался в том, что посев апоптозных ^к линий, экспрессирующих Вс1-2б, а также тяжелую и легкую цепи антитела (С2088В), произвели при различных плотностях при условиях нормальной (4,8 г/л) и высокой концентрации глюкозы (9,5 г/л); полунепрерывное культивирование осуществлялось в качалочных колбах. Результаты показывают, что апоптозные ^к клеточные линии, посеянные при плотности 1x6 клеток/мл в среду, содержащую 9,5 г/л глюкозы, достигли пика УСЭ, равного 14x6 клеток/мл на 7-й день после посева (фиг. 11А), а титр антител составил 2 г/л. Для сравнения, в линии С2088В, культивированной в стандартных условиях (инокуляция при 0,3x5 клеток/мл и 4,8 г/л), наблюдался пик УСЭ, составивший 7x6 клеток/мл, а титр антител составил 1 г/л (фиг. 11В). Это равнозначно 200% увеличению титра антител при высоком содержании глюкозы по сравнению со стандартными условиями (а именно, плотность посева 0,3x6 клеток/мл в среде, содержащей 4,8 г/л глюкозы).

В завершение полного описания настоящего изобретения подразумевается, как известно специалисту в данной области, что в описываемые объекты может быть внесено множество изменений и модификаций, не выходящих за пределы сущности и объема предлагаемой формулы изобретения.

Claims (17)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ увеличения плотности жизнеспособных клеток в подпитываемых культурах эукариотических клеток, включающий следующие этапы:

   a) культивирование эукариотической клеточной линии, экспрессирующей один или более гетерологичных генов устойчивости к апоптозу (апоптозных ^к) и один или более представляющих интерес генов; и

   b) поддержание высокого содержания глюкозы в среде в течение экспоненциальной и стационарной фаз роста клеточной культуры, где апоптозные ^к гены представляют собой гены Ε1Β19Κ и ΑνΕΝ, а концентрация лактата в клеточной культуре составляет приблизительно 1 г/л или менее после 5 дней культивирования.
2. 2. Способ по п.1, в котором эукариотическая клеточная линия представляет собой клетки яичника китайского хомячка (СНО).
3. 3. Способ по п.2, в котором клеточная линия СНО представляет собой клетки СНО-ΚΤ
4. 4. Способ по п.2, в котором клеточная линия СНО представляет собой клетки СНО-ЕТ8У.
5. 5. Способ по п.1, в котором эукариотическая клеточная линия представляет собой клетки миеломы.
6. 6. Способ по п.5, в котором клеточная линия миеломы представляет собой клетки N80.
7. 7. Способ по п.5, в котором клеточная линия миеломы представляет собой клетки 8р2/0.
8. 8. Способ по п.1, в котором эукариотическая клеточная линия представляет собой клетки гибридомы.
9. 9. Способ по п.1, в котором апоптозные ^к гены дополнительно включают ген ΧΙΑΡΔ.
10. 10. Способ по п.1, в котором пик плотности жизнеспособных клеток (УСЭ) увеличен.
11. 11. Способ по п.1, в котором длительность жизни клеточной культуры увеличена.
12. 12. Способ по п.1, в котором титр клеточной культуры увеличен.
13. 13. Способ по п.1, в котором общее число жизнеспособных клеток (1УСС) клеточной культуры уве

    - 13 019812 личено.
14. 14. Способ по п.1, в котором поток кальция в клетках уменьшен.
15. 15. Способ по п.1, в котором мембранный потенциал митохондрий увеличен.
16. 16. Способ по п.1, в котором представляющие интерес гены кодируют тяжелую и легкую цепи антитела.
17. 17. Способ по п.1, в котором высокая концентрация глюкозы в среде составляет приблизительно 60 мМ, а концентрация лактата в клеточной культуре составляет приблизительно 0,1 г/л или менее после 7 дней культивирования.