ES2557903T3 - Métodos para obtener una alta densidad celular viable en cultivos celulares de mamíferos - Google Patents

Abstract

Un método para la obtención de alta densidad de células viables en cultivo de células eucariotas de lote alimentado que comprende las etapas de: a) el cultivo de una línea celular eucariota que expresa uno o más genes heterólogos-apoptóticos resistentes (apoptoticR, donde los genes apoptoticR son E1B19K y AVEN, y uno o más genes de interés; y b) el mantenimiento de una alimentación de medios de alto contenido de glucosa de alrededor de 60 mM de glucosa durante las fases exponencial y estacionaria del cultivo celular.

Description

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EAX197 expresó niveles detectables de las tres proteínas.

[0046] Una banda ~55kDa se observó en todos los carriles incluidos en el carril de control no transfectado, C1013A, encima de la banda Aven recombinante se cree que se encontraba la proteína Aven endógena, ya que se visualizó con suero post-inmune, pero no pre-inmune (Sauerwald et al., 2002, Chau et al., 2000). El gen Aven transfectado carece de los primeros seis aminoácidos, que han demostrado no perjudicar la actividad biológica de la proteína. En consecuencia, el Aven transfectado es ligeramente más pequeño que su homólogo endógeno. Una banda de 40 kDa, que puede representar un producto de degradación del Aven, se observó en todas las líneas celulares que sobre-expresan esta proteína en conjunto con el E1B-19K. Productos de degradación de tamaños similares se observaron previamente cuando Aven fue sobre-expresado con Bcl-XL (Sauerwald et al., 2005) o Bcl-2 (Figueroa, observaciones no publicadas). Además, la expresión de Aven fue significativamente menor en los transfectantes triples, llegando incluso el EAX197 a sobre-expresarse con respecto al E1B-19K, Aven y XIAP∆.

[0047] Curiosamente, el nivel de expresión de XIAP∆ transfectado fue significativamente menor en comparación con los niveles endógenos de la proteína intacta de XIAP. Nótese que la diferencia aparente en el nivel de expresión entre el XIAP y el XIAP∆ podría explicarse en parte por la diferencia en la eficiencia de anticuerpos de estas dos formas de la proteína anti-apoptótica de unión. La diferencia aparente en el nivel de expresión entre el XIAP endógeno y el XIAP∆ transgénico pone en duda la contribución de esta proteína transfectada en la prevención de la apoptosis. De hecho, este estudio sugiere que no siempre existe una correlación directa entre el nivel de expresión de un gen anti-apoptótico dado y el nivel de inhibición de apoptosis puede que la proteína puede conferir a una línea celular.

[0048] Cada línea celular apoptoticR se examinó para la actividad de la caspasa 3/7 por APO-ONE ya que esta actividad proporciona una indicación del grado de resistencia de una línea celular a la apoptosis. Brevemente, en este ensayo, el sustrato profluorescente Z-DEVD-R110 es escindido por la caspasa 3/7 de una manera dependiente de la dosis. Cultivos exponenciales de EA167 y EAX197 así como la línea de células de control se trataron con estaurosporina durante 16 horas para inducir la apoptosis, tras lo cual se midió la caspasa 3/7. La actividad de caspasa 3/7 en las células de control de estaurosporina tratadas se fijó arbitrariamente en 100%. En estas condiciones, las actividades de caspasa de las células EA167 y EAX197 eran del 30% y del 35%, respectivamente, del control, lo que sugiere que estas líneas celulares eran por lo menos parcialmente resistentes a la inducción de la apoptosis (Fig. 2A). Como una prueba más de la naturaleza apoptoticR de EA167 y EAX197, cultivos de estaurosporina tratados de estas dos líneas celulares y la línea celular de control, se marcaron con el anticuerpo conjugado con FITC anti-caspasa 3 seguido de análisis por citometría de flujo. Como puede verse en la Fig. 3, las tres líneas celulares, ya sean sin tratar o tratados con vehículo (DMSO), tenían 1% o menos de la población caspasa 3-positiva. Sin embargo, 91% de la población de células de control dio positivo para la caspasa 3 después del tratamiento de estaurosporina. En contraste, sólo el 9% de la población derivada de la línea celular EAX197 y 30% de los procedentes de la línea celular EA167 dieron positivos para la caspasa 3, lo que confirma el fenotipo apoptoticR de estas dos líneas celulares.

[0049] Para examinar si la resistencia a la apoptosis conduce a un aumento de la longevidad, múltiples líneas celulares de EA se cultivaron en matraces de agitación (modo por lotes) y tanto la densidad de células viables (VCD) como el recuento de células viables integradas (IVCC) fueron controlados. Los aumentos en el recuento de células viables integradas mejoraron la productividad volumétrica de un cultivo, suponiendo que la productividad específica de la célula permanezca inalterada. Por lo tanto, el IVCC se puede utilizar como un parámetro para el cribado de líneas celulares superiores apoptoticR que pueden servir como anfitriones para el desarrollo de líneas celulares de producción. Como se muestra en la Fig. 2B, las líneas celulares con menor actividad relativa de caspasa 3/7 tendían a generar líneas celulares con mayor IVCC. Aunque cada una de las líneas de células de EA mostraron una reducción de la actividad de caspasa 3/7 relativa al control, no hubo correlación estricta entre IVCC y el nivel de la caspasa 3/7 que cada línea celular poseía. Además, algunas líneas celulares apoptoticR eran más estables que sus clones hermanos con respecto al grado de fenotipo anti-apoptótica. El EA167 fue elegido para su estudio porque poseía tanto la actividad anti-apoptótica potente y robusto crecimiento en cultivos en matraz oscilante. Además, EA167 fue la línea celular más estable en este panel, expresando Aven en niveles altos como se detectó por Western Blot.

[0050] Muchas de las moléculas de señalización en la vía de la apoptosis interactúan con o residen dentro de las mitocondrias. Allí estas proteínas interactúan con la membrana mitocondrial y regulan la apoptosis a través de la modulación de la permeabilidad mitocondrial. Por lo tanto, el potencial de membrana mitocondrial (MMP) sirve como otro monitor de la fisiología celular en el que proceder a la comparación de las características de la naturaleza apoptoticR de EA167 y EAX197 respecto al control. Como se ve en los resultados del ensayo de la Fig. 2C, tanto EA167 como EAX197 tuvieron mayor MMP que la línea celular de control.

Ejemplo 2

Efecto de E1B-19K sobre la densidad de células viables de CHOK1SV

[0051] Los perfiles de crecimiento de los transfectantes dobles que sobre-expresan E1B-19K en conjunción con

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