IT202100023357A1 - Peptidi con attività anti-angiogenica - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

annessa a domanda di brevetto per BREVETTO D?INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo:

?Peptidi con attivit? anti-angiogenica?

CAMPO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione riguarda peptidi con attivit? anti-angiogenica, ed una composizione farmaceutica che li comprende, utili nel trattamento di disturbi correlati all?angiogenesi, come per esempio, tumori, infiammazioni croniche, e disturbi da neo-vascolarizzazione.

STATO DELL?ARTE

L'angiogenesi ? il complesso processo di formazione dei vasi sanguigni. Il processo coinvolge sia eventi biochimici che cellulari, tra cui (i) l'attivazione delle cellule endoteliali (CE) per mezzo di uno stimolo angiogenico; (ii) la degradazione della matrice extracellulare, l'invasione delle CE attivate nei tessuti circostanti e la migrazione verso la fonte dello stimolo angiogenico; (iii) la proliferazione e la differenziazione delle CE per formare nuovi vasi sanguigni.

Il controllo dell'angiogenesi ? un processo altamente regolato che coinvolge stimolatori e inibitori angiogenici. Negli esseri umani e negli animali sani, l'angiogenesi si verifica in situazioni specifiche e limitate. Per esempio, l'angiogenesi ? normalmente osservata nello sviluppo fetale ed embrionale, nello sviluppo e nella crescita di tessuti e organi normali, nella guarigione delle ferite e nella formazione del corpo luteo, dell'endometrio e della placenta.

In certe patologie, il controllo dell?angiogenesi ? alterato e si verifica pertanto la cosiddetta angiogenesi patologica, vale a dire la formazione di vasi sanguigni in eccesso o indesiderati che supportano lo stato patologico e in molti casi contribuiscono al danno cellulare e/o tissutale associato a tali patologie.

L'angiogenesi patologica gioca un ruolo importante nella formazione dei tumori, in quanto i tumori hanno bisogno di vasi sanguigni per fornire nutrienti e ossigeno e rimuovere i rifiuti cellulari. Al contempo, la formazione di vasi sanguigni nei tumori permette alle cellule tumorali di entrare nel flusso sanguigno e di circolare in tutto il corpo, generando metastasi.

I tumori in cui l'angiogenesi ? importante includono tumori solidi cos? come tumori benigni come il neuroma acustico, il neurofibroma, il tracoma e i granulomi piogenici. L'angiogenesi patologica ? anche associata a certi tumori ematici come le leucemie e varie malattie neoplastiche acute o croniche del midollo osseo.

L'angiogenesi patologica gioca anche un ruolo importante in varie malattie infiammatorie croniche come le malattie infiammatorie intestinali, la psoriasi, la sarcoidosi e l'artrite reumatoide. L'infiammazione cronica che si verifica in tali malattie dipende dalla formazione continua di germogli capillari nel tessuto malato per mantenere un afflusso di cellule infiammatorie. L'afflusso e la presenza delle cellule infiammatorie producono granulomi e quindi mantengono lo stato infiammatorio cronico.

L?angiogenesi, sia normale che patologica, richiede l'azione di uno o pi? fattori angiogenici. Tali fattori includono, per esempio, l'angiogenina (ANG), il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF- vascular endothelial growth factor), il fattore di crescita dei fibroblasti basofili (bFGF - basic fibroblast growth factor), il fattore di crescita dei fibroblasti acidofili (aFGF - acidic fibroblast growth factor), il fattore di crescita epidermico (EGF - epidermal growth factor), il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-? - tumor necrosis factor-alpha), il fattore di crescita tumorale-alfa (TGF-? - tumor growth factor-alpha) e il fattore di crescita tumoralebeta (TGF-? - tumor growth factor-beta).

La centralit? dell'angiogenesi nella miriade di malattie legate all'angiogenesi ha motivato la ricerca di agenti anti-angiogenici (cio?, agenti che sopprimono o inibiscono l'angiogenesi patologica).

Molti agenti anti-angiogenici sono stati isolati o sviluppati. Essi comprendono fattori derivati dalla cartilagine, steroidi angiostatici, analoghi angiostatici della vitamina D, angiostatina, endostatina, e verostatina.

Ci sono molte categorie diverse di agenti anti-angiogenici che includono, a titolo di esempio, agenti che inibiscono l'azione dei fattori di crescita; agenti antiinvasivi; e agenti di disturbo vascolare.

Gli agenti che inibiscono l'azione dei fattori di crescita comprendono:

(i) antagonisti del recettore, per esempio, un anticorpo del recettore anti-VEGF come descritto in CA 2213833);

(ii) inibitori della proteina chinasi C;

(iii) inibitori della tirosin-chinasi, per esempio inibitori della tirosin-chinasi del recettore VEGF, come descritto in WO 96/40116);

(iv) modulatori della segnalazione dei recettori Tie-1 e/o Tie 2; e

(v) inibitori dell'espressione della proteina, per esempio, inibitori dell'espressione del VEGF, come descritto in US4987071).

Gli agenti anti-invasione comprendono:

(i) inibitori della metalloproteinasi di matrice, come per esempio, prinomastat (US5753653); ilomastat (WO 92/9556); marimastat (WO 94/2447); e batimastat (WO 90/5719),

(ii) antagonisti del recettore dell'attivatore plasminogeno dell'urochinasi, come per esempio, i composti descritti in WO96/40747 e WO 2000/001802, e

(iii) inibitori dell'attivatore plasminogeno dell'urochinasi, come per esempio, i composti descritti in WO 2000/005245.

Gli agenti di disturbo vascolare includono combretastatina (US4996237) e i composti descritti in WO 99/02166 e WO 00/40529.

Agenti anti-angiogenici noti includono peptidi anti-angiogenesi, come quelli descritti in EP1640382A1, EP1668129A1, EP1786451A2, EP1799716A1, EP1812030A2, EP1951750A2, EP3209683A1, EP3621597A1.

RIASSUNTO DELL'INVENZIONE

La Richiedente ha affrontato il problema di trovare nuovi peptidi per il trattamento di malattie associate all?angiogenesi patologica.

L'herpesvirus umano 6 (HHV-6) ? un ?-herpesvirus che ? altamente prevalente nella popolazione umana. HHV-6 comprende due specie riconosciute (HHV-6A e HHV-6B). HHV-6A/B mostrano un'alta omologia del genoma e ospitano il gene U94. U94 ha funzioni chiave nel ciclo di vita del virus e nelle malattie associate, avendo ruoli dimostrati o putativi nella replicazione, integrazione e riattivazione del virus. Durante l'infezione naturale, l'U94 suscita una risposta immunitaria e la prevalenza e l'estensione della risposta anti-U94 sono associate a malattie specifiche. In particolare, l'U94 pu? riprodurre interamente alcuni effetti del virus a livello cellulare, compresa l'inibizione della migrazione cellulare, l'induzione delle citochine e dell'espressione di HLA-G e l'inibizione dell'angiogenesi, sostenendo un ruolo diretto dell'U94 nello sviluppo delle malattie associate all'HHV-6 (Caselli E., et al., ?The U94 Gene of Human Herpesvirus 6: A Narrative Review of Its Role and Potential Functions?, Cells.

2020 Dec; 9(12): 2608).

Sulla base di tali osservazioni, la Richiedente ha ipotizzato che ci dovesse essere una porzione della proteina virale espressa dal gene U94 con attivit? antiangiogenica, ed ha avviato un?intensa attivit? di ricerca e sviluppo per identificare tale porzione.

La proteina virale espressa dal gene U94 ? una sequenza di 490 ammino acidi come illustrato nella Figura 6 (SEQ ID No.1).

Dopo ampia sperimentazione, la Richiedente ha sorprendentemente riscontrato che l?effetto anti-angiogenico derivava dalla sequenza di quattro ammino acidi in posizione 14-17 della proteina virale, vale a dire dalla sequenza KDKY (SEQ ID No.2).

Proseguendo nella sperimentazione, la Richiedente ha inoltre ulteriormente trovato che l?effetto anti-angiogenico derivava sorprendentemente dalla sequenza di soli tre ammino acidi in posizione 15-17 della proteina virale, vale a dire dalla sequenza DKY e che tale effetto veniva mantenuto con la sequenza DRY.

Pertanto, in un primo aspetto, la presente invenzione si riferisce ad un peptide di lunghezza uguale o inferiore a 10 ammino acidi, preferibilmente uguale o inferiore a 5 ammino acidi, o un suo derivato, comprendente la sequenza DKY, preferibilmente XDKY (SEQ ID No. 7) o DKYX (SEQ ID No. 8), oppure la sequenza DRY, preferibilmente XDRY (SEQ ID No.9) o DRYX (SEQ ID No.10), dove X ? un qualsiasi ammino acido, per uso come farmaco.

Vantaggiosamente, la presente invenzione si riferisce al peptide secondo il primo aspetto della presente invenzione per uso nel trattamento di un disturbo derivante da angiogenesi patologica, come per esempio, tumori e/o infiammazioni croniche e/o disturbi da neo-vascolarizzazione.

In un secondo aspetto la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica che comprende (a) un peptide di lunghezza uguale o inferiore a 10 ammino acidi, preferibilmente uguale o inferiore a 5 ammino acidi, o un suo derivato, comprendente la sequenza DKY, preferibilmente XDKY (SEQ ID No.7) o DKYX (SEQ ID No. 8), oppure la sequenza DRY, preferibilmente XDRY (SEQ ID No.9) o DRYX (SEQ ID No. 10), dove X ? un qualsiasi ammino acido, e (b) almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.

In un terzo aspetto la presente invenzione riguarda un metodo per il trattamento di un disturbo derivante da angiogenesi patologica, come per esempio, tumori e/o infiammazioni croniche e/o disturbi da neovascolarizzazione, in un soggetto in stato di necessit? che comprende la somministrazione di una quantit? efficace di un peptide di lunghezza uguale o inferiore a 10 ammino acidi, preferibilmente uguale o inferiore a 5 ammino acidi, o un suo derivato, comprendente la sequenza DKY, preferibilmente XDKY (SEQ ID No. 7) o DKYX (SEQ ID No. 8), oppure la sequenza DRY, preferibilmente XDRY (SEQ ID No.9) o DRYX (SEQ ID No.10), dove X ? un qualsiasi ammino acido.

In un quarto aspetto, la presente invenzione si riferisce ad un peptide di lunghezza uguale o inferiore a 10 ammino acidi, preferibilmente uguale o inferiore a 5 ammino acidi, o un suo derivato, comprendente la sequenza DKY, preferibilmente XDKY (SEQ ID No. 7) o DKYX (SEQ ID No. 8), oppure la sequenza DRY, preferibilmente XDRY (SEQ ID No.9) o DRYX (SEQ ID No.10), dove X ? un qualsiasi ammino acido.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI

La Figura 1 mostra i risultati dell?esempio 1 della parte sperimentale della presente descrizione.

La Figura 2 mostra i risultati dell?esempio 2 della parte sperimentale della presente descrizione.

La Figura 3 mostra i risultati dell?esempio 3 della parte sperimentale della presente descrizione.

La Figura 4 mostra i risultati dell?esempio 4 della parte sperimentale della presente descrizione.

La Figura 5 mostra i risultati dell?esempio 5 della parte sperimentale della presente descrizione.

La Figura 6 mostra la sequenza (SEQ ID No. 1) di 490 ammino acidi della proteina espressa dal gene U94 dell'herpesvirus umano 6 (HHV-6).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

In un primo aspetto, la presente invenzione si riferisce ad un peptide di lunghezza uguale o inferiore a 10 ammino acidi, preferibilmente uguale o inferiore a 5 ammino acidi, o un suo derivato, comprendente la sequenza DKY, preferibilmente XDKY (SEQ ID No. 7) o DKYX (SEQ ID No. 8), oppure la sequenza DRY, preferibilmente XDRY (SEQ ID No.9) o DRYX (SEQ ID No.10), dove X ? un qualsiasi ammino acido, per uso come farmaco.

Il peptide secondo la presente invenzione pu? comprendere da un minimo di 3 amminoacidi fino a 10 ammino acidi, e consiste pertanto in un peptide di 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 amminoacidi. Vantaggiosamente, il peptide secondo la presente invenzione consiste in un peptide di 3, 4 o 5 ammino acidi.

Il peptide secondo la presente invenzione pu? comprendere uno qualsiasi degli ammino acidi naturali elencati nella seguente tabella A.

Tabella A

Il peptide secondo la presente invenzione pu? inoltre comprendere uno qualsiasi degli ammino acidi modificati o non convenzionali noti nell?arte, come per esempio acido 2-amminoadipico, acido 3-amminoadipico, beta-alanina, acido beta-amminopropionico, acido 2-amminobutirrico, acido 4-amminobutirrico, acido piperidinico, acido 6-amminocaproico, acido 2-amminoeptanoico, acido 2-amminoisobutirrico, acido 3-amminoisobutirrico, acido 2-amminopimelico, acido 2,4-diamminobutirrico, desmosina, acido 2,2'-diamminopimelico, acido 2,3-diamminopropionico, N-etilglicina, N-etilasparagina, idrossilisina, alloidrossilisina, 3-idrossiprolina, 4-idrossiprolina, isodesmosina, allo-isoleucina, N-metilglicina, sarcosina, N-metilisoleucina, 6-N-metililsina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, e ornitina.

Il peptide secondo i vari aspetti della presente invenzione pu? avere la forma di un peptide modificato, in cui l'N e/o il C-terminale ? chimicamente modificato o protetto con composti organici.

Il termine "derivato" o "derivato di" come impiegato nella presente descrizione e nelle rivendicazioni che seguono in relazione a un peptide secondo i vari aspetti della presente invenzione significa un peptide in cui l'N- e/o C-terminale ? chimicamente modificato o protetto con un composto organico, come per esempio, fosforile (-PO3<2?>) , glicosile, acile, alchile, carbossile, ammina, biotina, ubiquitina.

Esempi di modifica includono fosforilazione, glicosilazione, acilazione (inclusa acetilazione, lauroilazione, miristilazione, palmitoilazione), alchilazione, carbossilazione, idrossilazione, glicazione, biotinilazione, ubiquitinazione e amidazione.

Preferibilmente, il peptide secondo i vari aspetti della presente invenzione pu? essere modificato al suo N-terminale, pi? preferibilmente tramite acilazione, che include per esempio acetilazione, lauroilazione, miristilazione, palmitoilazione.

Secondo la sua lunghezza, il peptide secondo i vari aspetti della presente invenzione pu? essere sintetizzato con un metodo ben noto nell'arte, per esempio, da un sintetizzatore peptidico automatizzato, o prodotto da una tecnologia di ingegneria genetica. Per esempio, un gene di fusione che codifica una proteina di fusione che comprende un partner di fusione ed il peptide ? preparato da ingegneria genetica e poi trasformato in una cellula ospite per esprimere la proteina di fusione. In seguito, il peptide viene scisso e isolato dalla proteina di fusione usando una proteasi o un composto in modo da produrre il peptide desiderato. A questo scopo, una sequenza di DNA che codifica i residui aminoacidici che possono essere scissi da una proteasi come il fattore Xa o enterokinase, o un composto come CNBr o idrossilammina pu? essere inserita tra i polinucleotidi che codificano il partner di fusione e il peptide.

I peptidi secondo i vari aspetti della presente invenzione possono esistere come stereoisomeri o miscele di stereoisomeri; per esempio, gli amminoacidi che li compongono possono avere configurazione L, configurazione D o essere racemici indipendentemente l'uno dall'altro. Pertanto, ? possibile ottenere miscele isomeriche cos? come racemi o miscele diastereomeriche o diastereomeri puri o enantiomeri, a seconda del numero di carboni asimmetrici e quali isomeri o miscele isomeriche sono presenti. Le strutture preferite dei peptidi sono isomeri puri, cio? enantiomeri o diastereomeri. Le strutture preferite dei peptidi includono aminoacidi che hanno la configurazione L. Se non diversamente indicato, si intende che quando viene indicato che un aminoacido pu? essere Ala, si intende che ? selezionato da L-Ala-, D-Ala- o miscele racemiche o non racemiche di entrambi.

In un secondo aspetto la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica che comprende (a) un peptide di lunghezza uguale o inferiore a 10 ammino acidi, preferibilmente uguale o inferiore a 5 ammino acidi, o un suo derivato, comprendente la sequenza DKY, preferibilmente XDKY (SEQ ID No.7) o DKYX (SEQ ID No. 8), oppure la sequenza DRY, preferibilmente XDRY (SEQ ID No.9) o DRYX (SEQ ID No. 10), dove X ? un qualsiasi ammino acido, e (b) almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.

La composizione farmaceutica della presente invenzione pu? comprendere una quantit? del peptide, o di un suo derivato, che va dallo 0,00000001% al 20% in peso, preferibilmente dallo 0,000001% al 15% in peso, pi? preferibilmente dallo 0,0001% al 10% in peso, e ancora pi? preferibilmente dallo 0,0001% al 5% in peso rispetto al peso totale della composizione.

Preferibilmente, la composizione farmaceutica della presente invenzione ? preparata in forme di dosaggio adatte che comprendono una quantit? efficace di almeno uno dei peptidi sopra descritti insieme ad almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.

Esempi di forme di dosaggio adatte sono compresse, capsule, compresse rivestite, granuli, soluzioni e sciroppi per somministrazione orale; soluzioni, pomate e unguenti per somministrazione topica; cerotti medicati per somministrazione transdermica; supposte per somministrazione rettale e soluzioni sterili iniettabili. Altre forme di dosaggio adatte sono quelle a rilascio prolungato e quelle basate su liposomi per la somministrazione orale, iniettabile o transdermica.

Come descritto qui, la composizione farmaceutica della presente invenzione comprende almeno uno dei peptidi sopra descritti insieme ad un eccipiente farmaceuticamente accettabile, che, come usato qui, include qualsiasi e tutti i solventi, diluenti, o altri veicoli, aiuti alla dispersione o alla sospensione, agenti attivi di superficie, agenti isotonici, agenti addensanti o emulsionanti, conservanti, leganti solidi, lubrificanti e simili, come adatti alla particolare forma di dosaggio desiderata.

Alcuni esempi di materiali che possono servire come eccipiente farmaceuticamente accettabile includono, ma non sono limitati a, zuccheri come lattosio, glucosio e saccarosio; amidi come amido di mais e fecola di patate; cellulosa e i suoi derivati come la carbossimetilcellulosa di sodio, l'etilcellulosa e l'acetato di cellulosa; polvere di adragosta; malto; gelatina; talco; eccipienti come il burro di cacao e le cere per supposte; oli come l'olio di arachidi, l'olio di semi di cotone; olio di cartamo; olio di sesamo; olio di oliva; olio di mais e olio di soia; glicoli, come il glicole propilenico; esteri come l'oleato di etile e il laurato di etile; agar; agenti tampone come l'idrossido di magnesio e l'idrossido di alluminio; acido alginico; acqua senza pirogeni; soluzione salina isotonica; soluzione di Ringer; alcool etilico, e soluzioni tampone di fosfato, altri lubrificanti compatibili non tossici come il laurilsolfato di sodio e lo stearato di magnesio, agenti coloranti, agenti di rilascio, agenti di rivestimento, agenti dolcificanti, aromatizzanti e profumanti, conservanti e antiossidanti.

I termini "farmaceuticamente accettabile" e "fisiologicamente accettabile" intendono definire, senza alcuna limitazione particolare, qualsiasi materiale adatto a preparare una composizione farmaceutica da somministrare a un essere vivente.

Le forme di dosaggio possono contenere anche altri ingredienti tradizionali come: conservanti, stabilizzatori, tensioattivi, tamponi, sali per la regolazione della pressione osmotica, emulsionanti, dolcificanti, coloranti, aromi e simili.

Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione possono essere somministrate per via orale, parenterale, per inalazione spray, per via topica, rettale, nasale, buccale, vaginale o attraverso un serbatoio impiantato. Il termine parenterale come usato nella presente invenzione e nelle rivendicazioni che seguono include tecniche di iniezione o infusione sottocutanea, intracutanea, endovenosa, intramuscolare, intraarticolare, intrasinoviale, intrasternale, intratecale, intralesionale e intracranica.

Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione possono anche essere somministrate per via inalatoria (spray, polvere o aerosol) o somministrate per impianto (per esempio, chirurgicamente), per esempio per mezzo di un dispositivo impiantabile come uno stent.

Le forme di dosaggio della composizione farmaceutica della presente invenzione possono essere preparate con tecniche che sono familiari a un chimico farmaceutico e comprendono la miscelazione, la granulazione, la compressione, la dissoluzione, la sterilizzazione e simili.

Vantaggiosamente, la presente invenzione si riferisce all?uso di un peptide di lunghezza uguale o inferiore a 10 ammino acidi, preferibilmente uguale o inferiore a 5 ammino acidi, o un suo derivato, comprendente la sequenza DKY, preferibilmente XDKY (SEQ ID No. 7) o DKYX (SEQ ID No. 8), oppure la sequenza DRY, preferibilmente XDRY (SEQ ID No.9) o DRYX (SEQ ID No.10), dove X ? un qualsiasi ammino acido, nel trattamento di un disturbo derivante da angiogenesi patologica.

Preferibilmente, il suddetto peptide e le composizioni farmaceutiche che lo comprendono sono usati nel trattamento di malattie derivanti da angiogenesi patologica, quali per esempio tumori e/o infiammazioni croniche e/o disturbi da neo-vascolarizzazione.

Esempi di tumori che possono essere utilmente trattati con il peptide e la composizione farmaceutica della presente invenzione sono tumori solidi e tumori ematici.

I tumori solidi che possono essere trattati con il peptide e la composizione farmaceutica dell'invenzione includono, sarcomi e carcinomi, come per esempio, astrocitoma fibroso, medulloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, emangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, e tumori solidi benigni come neuroma acustico, neurofibroma, tracoma e granulomi piogenici.

I tumori ematici come le leucemie che sono suscettibili di trattamento con il peptide e la composizione farmaceutica dell'invenzione includono, per esempio, leucemia linfocitica acuta e leucemia mielocitica acuta (mieloblastica, promielocitica, mielomonocitica, monocitica ed eritroleucemia); leucemia cronica (leucemia mielocitica cronica [granulocitica] e leucemia linfocitica cronica); e policitemia vera, linfoma (malattia di Hodgkin e malattia non Hodgkin), mieloma multiplo, macroglobulinemia di Waldenstrom.

In particolare, il peptide e la composizione farmaceutica della presente invenzione possono essere utili nel trattamento di fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumore di Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma del colon, cancro al pancreas, cancro al seno, cancro alle ovaie, cancro alla prostata, carcinoma a cellule squamose, carcinoma a cellule basali, adenocarcinoma, carcinoma delle ghiandole sudoripare, carcinoma delle ghiandole sebacee, carcinoma papillare, adenocarcinoma papillare, cistadenocarcinoma, carcinoma midollare, carcinoma broncogeno, carcinoma a cellule renali, epatoma, carcinoma del dotto biliare, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionale, tumore di Wilms, cancro cervicale, tumore testicolare, carcinoma del polmone, carcinoma del polmone a piccole cellule, carcinoma della vescica, carcinoma epiteliale, glioma, astrocitoma, medulloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, emangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, neuroma acustico, neurofibroma, trachoma e granulomi piogenici.

La composizione farmaceutica della presente invenzione utilizzata nel trattamento di tumori pu? facoltativamente comprendere uno o pi? agenti antineoplastici, come per esempio, (i) alcaloidi, come docetaxel, etoposide, trontecan, paclitaxel, teniposide, topotecan, vinblastina, vincristina e vindesina; (ii) agenti alchilanti come busulfan, improsulfan, piposulfan, aziridine, benzodepa, carboquone, meturedepa, uredepa, altretamina, trietilenemelamina, trietilenfosforamide, trietilenetiofosforamide, clorambucil, clorafazina, ciclofosfamide, estramustina, ifosfamide, mecloretamina, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembichin, perfosfamide, fenesterina, prednimustina, trofosfamide, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, dacarbazina, mannomustina, mitobronitolo, mitolactol, pipobroman, temozolomide; (iii) antibiotici e analoghi come aclacinomicina, actinomicina, antramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carubicina, carzinophilin, cromomicine, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, menogaril, mitomicina, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicine, peplomicina, pirarubicina, plicamicina, porfiromicina, puromicina, streptonigrina, streptozocin, tubercidina, zinostatina, zorubicina; (iv) antimetaboliti come denopterina, edatrexate, metotrexate, piritrexim, pteropterin, trimetrexate, cladribina, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, citarabina, doxifluridina, emitefur, enocitabune, floxuridina, fluorouracile, gemcitabina, tegafur; L-asparaginasi; (v) immunomodulatori come interferone-?, interferone-?, interferone-?, interleuchina-2, lentinan, propagermanium, PSK, roquinimex, sizofican, ubenimex; (vi) complessi platinici come carboplatino, cisplatino, miboplatino, oxaliplatino; (vii) ormone antineoplastico o analoghi come calusterone, dromostanolone, epitiostanolo, mepitiostano, testolacone, aminoglutetimide, mitotano, trilostano, bicalutamide, flutamide, nilutamide, droloxifene, tamoxifene, toremifene aminoglutetimide, anastrozolo, fadrozolo, formestane, letrozolo, fosfestrolo, esestrolo, poliestradiolo fosfato, buserelin, goserelin, leuprolide, triptorelin, clormadinone acetato, medrossiprogesterone, megestrolo acetato, melengestrolo; porfimer sodico; batimastar; e acido folinico.

Esempi di malattie infiammatorie croniche che possono essere utilmente trattate con il peptide e la composizione farmaceutica della presente invenzione sono malattie infiammatorie intestinali, come il morbo di Crohn e la colite ulcerosa, psoriasi, sarcoidosi e artrite reumatoide.

Esempi di disturbi da neo-vascolarizzazione che possono essere utilmente trattati con il peptide e la composizione farmaceutica della presente invenzione sono (i) disturbi della cornea, come per esempio, acne rosacea oculare, cheratite atopica, ulcere batteriche, ustioni chimiche, uso eccessivo di lenti a contatto, rigetto dell'innesto corneale, cheratocongiuntivite epidemica, ulcere fungine, infezioni da Herpes simplex, infezioni da Herpes zoster, sarcoma di Kaposi, degenerazione lipidica, cheratolisi marginale, infezioni da micobatteri, ulcera di Mooren, glaucoma neovascolare e fibroplasia retrolentale, cheratotomia radiale perifigoide, filectenulosi, poliarterite, infezioni da protozoi, retinopatia della prematurit?, artrite reumatoide, malattia di Steven Johnson, cheratite limbica superiore, sifilide, lupus sistemico, degenerazione marginale di Terrien, carenza di vitamina A e sarcoidosi di Wegeners, e (ii) disturbi della retina, come per esempio, occlusione arteriosa, malattia di Bechets, malattia di Bests, distacco cronico della retina, uveite/vitrite cronica, malattia carotidea ostruttiva, retinopatia diabetica, malattia di Eales, sindromi da iperviscosit?, infezioni che causano una retinite o coroidite, malattia di Lyme, degenerazione maculare, infezioni micobatteriche, fosse ottiche, malattia di Pagets, complicazioni post-laser, presunta istoplasmosi oculare, pseudoxanthoma elasticum, retinopatia della prematurit?, anemia falciforme, sarcoide, malattia di Stargarts, toxoplasmosi, malattie associate alla rubeosi e malattie causate dalla proliferazione anormale di tessuto fibrovascolare o fibroso, comprese tutte le forme di vitreoretinopatia proliferativa, associate o meno al diabete.

Gli esempi che seguono hanno lo scopo di illustrare ulteriormente la presente invenzione, senza tuttavia limitarla.

ESEMPI

Materiali e metodi

Colture cellulari

Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs) sono state isolate e caratterizzate come descritto in , ?HHV-6 infects human aortic and heart microvascular endothelial cells, increasing their ability to secrete proinflammatory chemokines?, J Med Virol.2002; 67: 528-533.

Le cellule sono state coltivate in un terreno di crescita per cellule endoteliali (EGM MV; Promo cell, Heidelberg, Germania) integrato con 10% (vol/vol) di siero fetale bovino (FBS) a 37?C in un'atmosfera umidificata comprendente il 5% di CO2.

Le cellule endoteliali microvascolari polmonari umane (HL-mECs) sono state acquistate da Lonza Clonetics (Walkersville, MD, USA) e coltivate in un terreno di crescita EGM-2 MV (Lonza, Basilea, Svizzera) contenente 10% FBS. Le cellule aderenti sono state coltivate fino al 80-90% di confluenza.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con cellule al passaggio 2-6.

Clonazione, produzione e nucleofezione di plasmidi esprimenti il gene U94

I geni derivati da U94 sono stati amplificati usando il plasmide U94 pSR2PH come modello. I prodotti PCR sono stati inseriti nel vettore di espressione pVAX1. La nucleoporazione delle cellule ? stata eseguita utilizzando la tecnologia Amaxa Nucleofector (Lonza) seguendo il protocollo del produttore. Il plasmide privo di endotossina che esprime U94 o geni derivati da U94 ? stato aggiunto a cellule (1x10<6>) risospese in 100 ?l di tampone di nucleofezione. Gli esperimenti sono stati eseguiti a 24 ore dalla nucleofezione.

Saggio di formazione dei vasi

I saggi di formazione dei vasi sono stati eseguiti come descritto in Caccuri F. et al., ?Evolution toward beta common chain receptor usage links the matrix proteins of HIV-1 and its ancestors to human erythropoietin?, Proc Natl Acad Sci USA. 2021; 11810.

In breve, 150 ?l di Cultrex Basement Membrane Extract (Matrigel; 10 mg/ml) (Trevigen Inc., Gaithersburg, MD, USA) o Matrigel con fattore di crescita ridotto (Trevigen Inc.) sono stati trasferiti in piastre di coltura a 48 pozzetti preraffreddate. Le piastre sono state poi incubate per 1 ora a 37?C.

Le cellule sono state risospese in un terreno di crescita EGM contenente 10% FBS e seminate (5x10<4 >per pozzetto). La formazione di vasi ? stata osservata in tempi diversi dopo la semina delle cellule. Le strutture capillari sono state fotografate con una macchina fotografica Hitachi KP-D50 e poi quantificate come numero di vasi/pozzetto.

In alcuni esperimenti, le HUVEC sono state stimolate con concentrazioni ottimali di molecole pro-angiogenetiche umane come il fattore di crescita vascolare endoteliale-A (VEGF-A), il fattore di crescita dei fibroblasti-2 (FGF-2), o l'interleuchina-8 (IL-8). Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando cellule nucleofettate o cellule stimolate con peptidi derivati dall'U94.

Saggio sugli sferoidi

Il test ? stato effettuato utilizzando cellule nucleofettate o cellule stimolate con peptidi derivati da U94. Gli sferoidi sono stati generati mescolando le HUVEC (1,5x10<5 >cellule/ml) con 5 mg/ml di metilcellulosa (Sigma-Aldrich) in un terreno di crescita EGM contenente 10% FBS, portando il volume finale a 10 ml.

Le cellule (100 ?l/pozzetto) sono state poi aggiunte a piastre da 96 pozzetti ( , Kremsm?nster, Austria) e incubate a 37?C, in atmosfera al 5% CO2 per 24 ore.

Separatamente, la soluzione di gel di collagene I (Rat Tail, Corning) ? stata mantenuta su ghiaccio e neutralizzata aggiungendo NaOH 0.1 M e PBS 10X fino ad un pH finale di 7,4.

Poi, le piastre da 24 pozzetti sono state rivestite con collagene neutralizzato (200 ?l/pozzetto) e incubate in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 1 ora a 37?C.

Gli sferoidi delle piastre da 96 pozzetti sono stati raccolti in provette Eppendorf e centrifugati a 4000 x rpm per 5-10 secondi. Quando si ? distinto un sedimento chiaro, il surnatante ? stato rimosso e il sedimento ? stato tenuto in un volume di circa 100 ?l di soluzione neutralizzata di collagene I.

Ogni miscela collagene-sferoide ? stata rapidamente aggiunta alle piastre a 24 pozzetti pre-rivestite a 100 ?l/pozzetto e incubata per 1 h. Dopo 1 h, 500 ?l di stimoli diversi sono stati aggiunti o meno ai pozzetti per coprire completamente la superficie e le piastre sono state ulteriormente incubate per 24 h.

La germinazione si ? verificata dal nucleo dello sferoide, fotografato con una fotocamera Hitachi KP-D50, e il numero di germogli ? stato contato con gli sferoidi di dimensioni simili da tre diversi pozzetti della piastra.

Infezione da SARS-CoV-2 di HL-mECs

Gli esperimenti di infezione sono stati eseguiti usando l'isolato clinico SARS-CoV-2 AP66 come precedentemente descritto in Caccuri F. et al.,?A persistently replicating SARS-CoV-2 variant derived from an asymptomatic individual?, J Transl Med.2020; 18: 362.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con un singolo inoculo virale in un laboratorio con livello di biosicurezza 3 (BLS-3) ad un MOI (multiplicity of infection) di 1.

Analisi statistica

I dati ottenuti da pi? esperimenti indipendenti sono espressi come media ? deviazione standard (SD). I dati sono stati analizzati per la significativit? statistica utilizzando il test ANOVA a una via, e i dati sono stati confrontati utilizzando il post-test Bonferroni. Le differenze sono state considerate significative per P < 0,05. I test statistici sono stati eseguiti utilizzando il software GraphPad Prism 8.

Esempio 1

Per valutare la capacit? del peptide di sequenza SEQ ID No.2 di influenzare la capacit? delle HUVEC di rispondere alla stimolazione esercitata da diversi mediatori angiogenici, le HUVEC sono state seminate su Matrigel a crescita ridotta in assenza (NT) o in presenza di concentrazioni ottimali di diversi stimoli pro-angiogenici (VEGF-A, FGF-2, o IL-8) da soli o in presenza di un peptide di controllo (CTRL) o del peptide di sequenza SEQ ID No. 2 (KDKY).

Come mostrato in Fig. 1, le HUVEC non trattate (NT) hanno formato un monostrato a 8 ore dalla semina su Matrigel. Allo stesso tempo, le HUVEC trattate con ciascuna delle molecole pro-angiogenetiche (VEGF-A, FGF-2, o IL-8) migravano e si allineavano per formare tubi organizzati in una rete capillare. Questa attivit? angiogenica non veniva alterata dal peptide di controllo (CTRL) ed ? stata significativamente compromessa nelle cellule trattate con il peptide di sequenza SEQ ID No.2.

Il grafico di Fig.1 illustra il numero di vasi formati in ciascun pozzetto. I valori rappresentano la media di un esperimento rappresentativo su tre con risultati simili, eseguiti in triplicato. L'analisi statistica ? stata eseguita utilizzando il test ANOVA a una via, e i dati sono stati confrontati utilizzando il post-test Bonferroni (**** p < 0.0001).

Esempio 2

Gli sferoidi HUVEC incorporati in gel biopolimerico possono essere indotti a formare germogli endoteliali dopo la stimolazione con fattori angiogenici, rappresentando cos? un modello cellulare 3D che imita l'angiogenesi in vivo come descritto in .

Su questa base, sferoidi HUVEC-derivati sono stati incorporati in un gel di collagene di tipo I in assenza (NT) o in presenza di diversi stimoli pro-angiogenici (VEGF-A, FGF-2, o IL-8) da soli o in combinazione con un peptide di controllo (CTRL) o con il peptide di sequenza SEQ ID No.2 (KDKY).

Come mostrato in Fig.2, ogni stimolo pro-angiogenico (VEGF-A, FGF-2, o IL-8) ha fortemente promosso la crescita dei microvasi, mentre il peptide di sequenza SEQ ID No. 2 ha indotto una drastica riduzione della risposta di germinazione.

Il grafico di Fig.2 illustra il numero di germogli formati per ciascun sferoide. I valori rappresentano la media di un esperimento rappresentativo su tre con risultati simili, eseguiti in triplicato. L'analisi statistica ? stata eseguita utilizzando il test ANOVA a una via, e i dati sono stati confrontati utilizzando il post-test Bonferroni (**** p < 0.0001).

Questi dati suggeriscono fortemente che il peptide di sequenza SEQ ID No.2 pu? agire come un angiosuppressore interferendo con i meccanismi alla base dell'angiogenesi spontanea e ostacolando le risposte delle cellule endoteliali alla stimolazione di diverse potenti molecole pro-angiogeniche.

Esempio 3

Le HL-mEC infettate dal virus SARS-CoV-2 hanno secreto una pletora di molecole pro-angiogenetiche che sostengono la capacit? delle HL-mEC di promuovere l'angiogenesi in un terreno di crescita Matrigel con fattore di crescita ridotto.

Il secretoma delle HL-mEC infettate da SARS-CoV-2 ? infatti in grado di esprimere non solo VEGF-A e FGF-2, ma anche diversi induttori di angiogenesi come le metalloproteinasi (MMPs), la proteina 1 insulino-simile in grado di legare il fattore di crescita (IGFBP-1, insulin growth factor binding protein-1), Il fattore di crescita simile all'EGF legato all'eparina (HB-EGF, heparin binding-epidermal growth factor), il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF, granulocyte macrophage-colony stimulating factor), endoglina, angiogenina e artemina.

Per capire se il peptide di sequenza SEQ ID No. 2 potesse contrastare l'angiogenesi indotta dalla pletora di molecole pro-angiogenetiche secrete dalle HL-mEC infette da SARS-CoV-2, sono stati eseguiti degli esperimenti seminando le cellule infette su Matrigel con fattore di crescita ridotto in assenza o in presenza del peptide di controllo (CTRL) o del peptide di sequenza SEQ ID No.2 (KDKY).

Come mostrato in Fig.3, in presenza di del peptide di sequenza SEQ ID No.

2, le HL-mEC infettate da SARS-CoV-2 non hanno svolto alcuna attivit? angiogenica. D'altra parte, il peptide di controllo CTRL non ha interferito con l'attivit? pro-angiogenica indotta dall'infezione da SARS-CoV-2.

Il grafico di Fig.3 illustra il numero di vasi formati in ciascun pozzetto. I valori rappresentano la media di un esperimento rappresentativo su tre con risultati simili, eseguiti in triplicato. L'analisi statistica ? stata eseguita utilizzando il test ANOVA a una via, e i dati sono stati confrontati utilizzando il post-test Bonferroni (**** p < 0.0001). NT indica le HL-mEC non infettate.

Esempio 4

L'effetto anti-angiogenico del peptide di sequenza SEQ ID No. 2 ? stato osservato anche nel test degli sferoidi.

Infatti, come mostrato in Fig. 4, una drammatica crescita di germogli ? stata osservata negli sferoidi infettati da SARS-CoV-2 trattati o meno con il peptide di controllo CTRL, mentre il peptide di sequenza SEQ ID No. 2 (KDKY) ha potentemente inibito l'angiogenesi indotta da SARS-CoV-2.

Il grafico di Fig.4 illustra il numero di germogli formati per ciascun sferoide. I valori rappresentano la media di un esperimento rappresentativo su tre con risultati simili, eseguiti in triplicato. L'analisi statistica ? stata eseguita utilizzando il test ANOVA a una via, e i dati sono stati confrontati utilizzando il post-test Bonferroni (**** p < 0.0001). NT indica le HL-mEC non infettate.

Questi dati confermano la forte e ampia attivit? anti-angiogenetica del peptide di sequenza SEQ ID No.2.

Esempio 5

Per comprendere esattamente quali amminoacidi erano necessari per ottenere l?attivit? anti-angiogenica, sono stati sintetizzati quattro tetra-peptidi in configurazione D, nei quali ciascun singolo amminoacido del peptide originale KDKY (SEQ ID No. 2) veniva sostituito da un?alanina (A), cio? ADKY (SEQ ID No. 3), KAKY (SEQ ID No.4), KDAY (SEQ ID No.5) e KDKA (SEQ ID No.6).

Le HUVEC sono state seminate su pozzetti rivestiti di Matrigel a fattore di crescita ridotto in terreno completo contenente 50 ng/ml di VEGF-A o FGF-2 da solo o in combinazione con 10 ng/ml del peptide di controllo (CTRL), oppure di KDKY, AKDY, KAKY, KDAY o KDKA.

Come mostrato in Fig.5 A-B, solo il peptide di sequenza ADKY (SEQ ID No.

3) ha mantenuto una potente attivit? anti-angiogenica su HUVECs trattati con VEGF-A o FGF-2.

Quindi, il peptide di sequenza DKY e il peptide di sequenza DRY sono stati sintetizzati e la loro attivit? anti-angiogenica ? stata verificata come descritto in precedenza.

Le HUVEC sono state seminate su pozzetti rivestiti di Matrigel a fattore di crescita ridotto in terreno completo contenente 50 ng/ml di VEGF-A o FGF-2 da solo o in combinazione con 10 ng/ml di CTRL, KDKY, DKY o DRY.

Come mostrato in Fig. 5 C-D, entrambi i peptidi di sequenza DKY e di sequenza DRY erano in grado di bloccare l'attivit? angiogenica promossa da VEGF-A o FGF-2 come il peptide di sequenza KDKY (SEQ ID No.2).

Questo risultato ha confermato l'importanza della sequenza DKY per l'attivit? anti-angiogenica ed ha confermato la consueta tolleranza della sostituzione di Lys (K) con Arg (R) negli epitopi biologicamente attivi.

I grafici di Fig.5 illustrano il numero di vasi formati in ciascun pozzetto. I valori rappresentano la media di un esperimento rappresentativo su tre con risultati simili, eseguiti in triplicato. L'analisi statistica ? stata eseguita utilizzando il test ANOVA a una via, e i dati sono stati confrontati utilizzando il post-test Bonferroni (**** p < 0.0001). NT indica le cellule non trattate.

ELENCO DELLE SEQUENZE

SEQ ID No.1

MFSIINPSDDFWTKDKYIMLTIKGPVEWEAEIPGISTDFFCKFSNVPVPHFRD

MHSPGAPDIKWITACTKMIDVILNYWNNKTAVPTPAKWYAQAENKAGRPSLTL LIALDGIPTATIGKHTTEIRGVLIKDFFDGNAPKIDDWCTYAKTKKNGGGTQVFS LSYIPFALLQIIRPQFQWAWTNINELGDVCDEIHRKHIISHFNKKPNVKLMLFPK DGTNRISLKSKFLGTIEWLSDLGIVTEDAWIRRDVRSYMQLLTLTHGDVLIHRAL SISKKRIRATRKAIDFIAHIDTDFEIYENPVYQLFCLQSFDPILAGTILYQWLSHRR GKKNTVSFIGPPGCGKSMLTGAILENIPLHGILHGSLNTKNLRAYGQVLVLWW KDISINFENFNIIKSLLGGQKIIFPINENDHVQIGPCPIIATSCVDIRSMVHSNIHKI NLSQRVYNFTFDKVIPRNFPVIQKDDINQFLFWARNRSINCFIDYTVPKIL

SEQ ID No.2

KDKY

SEQ ID No.3

ADKY

SEQ ID No.4

KAKY

SEQ ID No.5

KDAY

SEQ ID No.6

KDKA

SEQ ID No.7

XDKY

SEQ ID No.8

DKYX

SEQ ID No.9

XDRY

SEQ ID No.10

DRYX

Claims (10)

RIVENDICAZIONI

1. Un peptide di lunghezza uguale o inferiore a 10 ammino acidi, o un suo derivato, comprendente la sequenza DKY, preferibilmente XDKY (SEQ ID No.7) o DKYX (SEQ ID No. 8), oppure la sequenza DRY, preferibilmente XDRY (SEQ ID No.9) o DRYX (SEQ ID No.10), dove X ? un qualsiasi ammino acido, per uso come farmaco.

2. Il peptide secondo la rivendicazione 1, per uso nel trattamento di un disturbo derivante da angiogenesi patologica.

3. Il peptide secondo la rivendicazione 2, dove detto disturbo derivante da angiogenesi patologica e scelto nel gruppo che consiste di tumori, infiammazioni croniche, e disturbi da neo-vascolarizzazione.

4. Il peptide per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, dove detto peptide ha lunghezza uguale o inferiore a 5 ammino acidi, preferibilmente uguale a 3 o 4 ammino acidi.

5. Il peptide per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, dove detto derivato ? un peptide in cui l'N- e/o C-terminale ? chimicamente modificato o protetto con un composto organico scelto nel gruppo che consiste di fosforile (-PO3<2?>) , glicosile, acile, alchile, carbossile, ammina, biotina, ubiquitina.

6. Una composizione farmaceutica che comprende (a) un peptide di lunghezza uguale o inferiore a 10 ammino acidi, preferibilmente uguale o inferiore a 5 ammino acidi, o un suo derivato, comprendente la sequenza DKY, preferibilmente XDKY (SEQ ID No. 7) o DKYX (SEQ ID No. 8), oppure la sequenza DRY, preferibilmente XDRY (SEQ ID No.9) o DRYX (SEQ ID No.10), dove X ? un qualsiasi ammino acido, e (b) almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.

7. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 6, dove detta composizione farmaceutica comprende una quantit? di detto peptide, o un suo derivato, compresa da 0,00000001% a 20% in peso, preferibilmente da 0,000001% a 15% in peso, pi? preferibilmente da 0,0001% a 10% in peso, e ancora pi? preferibilmente da 0,0001% a 5% in peso.

8. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 6, dove detta composizione ? formulata per somministrazione orale, parenterale, inalatoria (spray, polvere o aerosol), topica, rettale, nasale, buccale, vaginale o attraverso un dispositivo impiantato.

9. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 6, dove detta composizione comprende inoltre un agente antineoplastico, preferibilmente scelto nel gruppo che consiste di (i) alcaloidi, (ii) agenti alchilanti, (iii) antibiotici e analoghi, (iv) antimetaboliti, (v) immunomodulatori, (vi) complessi platinici, e (vii) ormoni antineoplastici o analoghi.

10. Un peptide di lunghezza uguale o inferiore a 10 ammino acidi, preferibilmente uguale o inferiore a 5 ammino acidi, o un suo derivato, comprendente la sequenza DKY, preferibilmente XDKY (SEQ ID No. 7) o DKYX (SEQ ID No.8), oppure la sequenza DRY, preferibilmente XDRY (SEQ ID No.9) o DRYX (SEQ ID No.10), dove X ? un qualsiasi ammino acido.