DE10361629A1

DE10361629A1 - Monoklonaler Antikörper gegen ein Epitop eines Prionenproteins

Info

Publication number: DE10361629A1
Application number: DE2003161629
Authority: DE
Inventors: Ingolf Dr. Lachmann; Thomas Dr. Köhler; Awad A. Dr. Osman
Original assignee: Roboscreen GmbH
Current assignee: Roboscreen GmbH
Priority date: 2003-12-27
Filing date: 2003-12-27
Publication date: 2005-07-21

Abstract

Die Erfindung betrifft den monoklonalen Antikörper 3B8/D5 und die denselben produzierende Hybridomzellinie. Es ist die Aufgabe gestellt, einen monoklonalen Antikörper zur Verfügung zu stellen, der ein bisher nicht bekanntes Epitop besitzt und aufgrund seiner Struktur sich an ein Prionenprotein bildet und dergestalt seine Identifizierung ermöglicht. Die Aufgabe wird gelöst durch Herstellen der Hybridomzellinie H-3B8D5 und deren Kultivierung. Als Kopplungsstelle am Prionenprotein ist die Region DRYY erkannt worden. Es ist ein Assay angegeben, der zur Diagnostik von BSE, Scrapie und dergleichen eingesetzt werden kann.

Description

Die Erfindung betrifft den monoklonaler Antikörper (MAk) 3B8/D5, die murine monoklonale Hybridomzelllinie 3B8/D5 und das Epitop DRYY. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die veterinärmedizinische Diagnostik, die Humandiagnostik, die Lebensmittelindustrie, die Untersuchung von Blutseren, das Entfernen von Prionenprotein aus Spenderblut und die pharmazeutische Industrie.
Es ist bereits bekannt, Prionenproteine nachzuweisen. Zum immunologischen Nachweis nach dem Prinzip des Festphasen-Immunassays werden üblicherweise zwei monoklonale Antikörper verwendet, die jeweils unterschiedliche Regionen am Prionenprotein erkennen. Allerdings ist das Prionprotein nur schwach immunogen und seine Primär- und Sekundärstruktur ist in vielen Organismen sehr ähnlich bzw. konserviert. Die Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen Prionenprotein geschieht bisher auf zwei Wegen. Einmal werden sogenannte Knockout-Mäuse eingesetzt, bei denen Prionenprotein mit gentechnischen Methoden ausgelöst wird. Werden solche Mäuse mit Prionenproteinen immunisiert, bilden sie eine Immunantwort gegen das Protein. Diese wird in bekannter Weise zur Herstellung monoklonaler Antikörper verwendet. In einem zweiten Weg werden Peptide bestimmter Bereiche am Prionenprotein synthetisiert und für die Immunisierung normaler Mäuse verwendet. Diese Peptide durchbrechen die Immuntoleranz und es wird eine Immunantwort gegen diese Peptide erzeugt. In DE 197 41 607 sind synthetische Polypeptide dieser Art beschrieben und ein Verfahren zu ihrer Herstellung ist angegeben.
Der Stand von Wissenschaft und Technik hat einige Nachteile. Die bezeichneten modernen Methoden erlauben es nur unbefriedigend, Antikörper herzustellen, die nur das pathologische Prionenprotein (PrP^SC ) erkennen bzw. für die Verwendung in Immunoassays zur Detektion des pathologischen Prionenproteins geeignet sind.
Die Ursache für die Schwierigkeiten bei der Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das pathologische Prionenprotein (PrP^SC ) liegt in der komplizierten Gewinnung von pathologischem Prionenprotein, das für die Immunisierung von Mäusen gebraucht wird und in der Konformationsänderung der pathologischen gegenüber der gesunden Form.
Die Erfindung hat das Ziel, einen monoklonalen Antikörper zu entwickeln, der spezifisch das physiologische und das pathologische Prionenprotein erkennt.
Die Erfindung hat die Aufgabe, einen monoklonalen Antikörper zur Verfügung zu stellen, der ein bisher nicht bekanntes Epitop besitzt und aufgrund dieser Struktur sich an das Prionen-protein bindet und seine Identifizierung ermöglicht.
Die gestellte Aufgabe wird derart gelöst, dass in einem ersten Schritt PrP-Knockout-Mäuse mit rekombinantem bovinen Prionenprotein (full length) in Gerbu-Adjuvant kurzzeitimmunisiert werden, den Mäusen die B-Lymphozyten entnommen und mit der Myelomzelllinie P3X63 Ag8.653 unter Verwendung von 50-%-igem Polyethylenglycol fusioniert werden.
Die Fusionsprodukte werden mittels HAT-Selektion nach Littlefield (1964) in Zellkulturplatten auf Peritonealmakrophagen von Balb/c-Mäusen selektioniert. Die Charakterisierung der Primärzelllinie erfolgt durch folgende Testungen:

– screening auf IgG-produzierende und wachstumfähige Hybridome,
– Prüfung der Reaktivität des produzierten IgG mit dem Immunogen im Western Blot,
– und Prüfung der Reaktivität des produzierten IgG mit dem physiologischen und dem pathologischen Prionenprotein im Western Blot.

Diese Primärzellen werden per limiting dilution kloniert und subkloniert und zu monoklonalen Hybridomzellen kultiviert. Expandierte monoklonale Hybridome werden wiederum auf ihre Fähigkeit IgG zu produzieren und ihre Reaktivität gegenüber dem Immunogen sowie dem physiologischen und dem pathologischen Prionenprotein mittels Western Blot getestet. Nach erfolgreicher Testung werden die Hybridome durch Einfrieren von 3 × 10⁶ Zellen in fetalem Kälberserum + 10% Dimethylsulfoxide gesichert.
Aus der Vielzahl der entstandenen Hybridome wird die Zelllinie H-3B8/D5 als produktiver Klon ausgewählt und kultiviert.
Produktion und Sicherung des MAk und der Hybridomzelllinie H-3B8/D5 Zunächst wird eine master cell bank und eine working cell bank der monoklonalen Hybridomzelllinie H-3B8/D5 angelegt. Dann werden 5 Chargen des MAk 3B8/D5 in MiniPerm-Kleinreaktoren produziert, von denen 3 Chargen nach Prüfung zur Verwendung freigegeben werden.
Charakterisierung des MAk 3B8/D5

– Der Antikörper der monoklonalen Hybridomzelllinie H-3B8/D5 wurde charakterisiert unter Verwendung eines Maus-Hybridoma-Subtyping Kit der Firma Roche. Das Ergebnis dieser Analyse zeigt, daß der Antikörper den Isotyp IgG1 [kappa] besitzt.
– Westernblot-Analysen wurden durchgeführt nach Laemmli bzw. Kyhse-Anderson und zeigen, dass der Antikörper mit rekombinantem Prionprotein, PrP^c und PrP^res reagiert.
– Epitop-mapping erfolgte mittels 10-mer Peptide des bovinen Prionenproteins überlappend um 8 Aminosäuren (Durchführung nach Osman et al.). Der Antikörper erkennt das Epitop DRYY am Prionenprotein.
– Reaktivitätsnachweis in Immuno-Assays von Prionenprotein ist im Ausführungsbeispiel erbracht.

Ausführungsbeispiel
Prionenprotein-ELISA (PrP-ELISA)
Der PrP-ELISA ist ein enzymimmunologischer Assay, der aus einem Fang-Antikörper (monoklonal), einem Prionenprotein-Standard und einem POD-markierten Nachweis-Antikörper (monoklonal) besteht. Beide Antikörper binden an unterschiedlichen Bindungsdomänen des Prionenproteins, so dass Prionenprotein eine spezifische Brücke zwischen beiden Antikörpern (sandwich) bildet.
Beschreibung. Hundert Mikroliter einer Fang-Antikörperlösung (Klon 1E5/G6, 5 μg/ml) in 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 werden in der Vertiefung einer Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert und für 18 Stunden beladen. Der Inhalt wird abgesaugt und die freien Bindungsstellen werden mittels 3%iger Rinderserumalbuminlösung (Assaypuffer) abgesättigt. 100 μl Prionenprotein-Standard in einer Verdünnungsreihe bzw. einer unbekannter Konzen tration werden in der Vertiefung der MTP gegeben und für 90 min inkubiert. Nach 3-maligem Waschen werden 100 μl Nachweis-Antikörper-POD (Klon 3B8/D5) pipettiert und 60 min bei 4°C inkubiert. Über eine nachgeschaltete Substrat-POD (Horseradishperoxidase)-Reaktion kann die gebundene Menge des Prionenproteins bestimmt werden. Als Substrat wird Tetramethylbenzidin (TMB) verwendet. Die Höhe des Signals ist proportional der Menge des vorhandenen Prionenproteins. Unbekannte Proben werden anhand ihrer Signalhöhe aus einer Eichkurve bestimmt.

Claims

Monoklonaler Antikörper 3B8/D5
Verwendung des monoklonalen Antikörpers 3B8/D5 zum Erkennen von Prionenprotein.
Verfahren zur Herstellung des monoklonaler Antikörpers 3B8/D5 durch Kultivieren der Hybridomzellinie DSM ACC 2637.
Hybridomzellinie DSM ACC 2637.
Verfahren zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers 3B8/D5 durch Kurzzeit-Immunisierung i.p. von PrP-Knock-out-Mäusen mit rekombinantem bovinem Prionen-protein in Gerbu-Adjuvant, Entnahme der B-Lymphozyten, Fusion dieser mit der Myelomzelllinie P3X63Ag8.653 unter Verwendung von 50%-igem PEG, nachfolgen-der HAT-Selektion der Fusionsprodukte in Zellkulturplatten auf Peritonealmakro-phagen von BALB/c-Mäusen, Auswahl produktiver Hybridome anhand der IgG-Produktion und ihrer Reaktivität gegenüber dem Immunogen, Vereinzeln der Hybri-dome auf Einzelzellebene, Kultivierung der Hybridome, dadurch gekennzeichnet, daß das Kultivieren der Hybridome in vitro oder in vivo monoklonale Antikörper 3B8/D5 ergibt, die das Epitop DRYY auf einem Prionenprotein erkennen.
Epitop DRYY auf Prionenprotein, bestehend aus Asparaginsäure, Arginin, Tyrosin, Tyrosin, dadurch gekennzeichnet, daß es vom monoklonalen Antikörper 3B8/D5 erkannt wird.
Testkit zum immunologischen Nachweis von Prionenprotein, bestehend aus 1. 1E5/G6 als Fang-Antikörper (beschichtet in einer Mikrotiterplatte) 2. 3B8/D5 als Nachweis-Antikörper (konjugiert mit Peroxidase) 3. negative und positive Kontrollen 4. Färbelösung 5. Stoplösung 6. Proben-Puffer 7. Waschpuffer 8. Probenvorbereitungskit.
Verwendung des Testkit nach Anspruch 6 in der Veterinärmedizin zur Diagnostik von BSE und Scrapie, in der Humandiagnostik, in der Lebensmittelindustrie, zur Untersuchung von Blutseren, zum Entfernen von Prionenprotein aus Spenderblut und in der pharmazeutischen Industrie.