CN103040861A - 一种硫化氢释放剂在制备治疗肾脏纤维化疾病药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肾脏纤维化疾病治疗用药领域，特别涉及一种硫化氢释放剂在制备治疗肾脏纤维化疾病药物中的用途。该用途是一种硫化氢释放剂用于制备治疗肾脏纤维化疾病药物的应用，硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。本发明提供的用途通过硫氢化钠或硫化钠作用于肾脏成纤维细胞，抑制了肾间质成纤维细胞增殖和分化，抑制了肾间质胶原纤维沉积，同时改善了肾功能，而不引起血肌酐和血钾水平的进一步升高，具有抗肾脏纤维化作用。
Description
技术领域
本发明涉及肾脏纤维化疾病治疗用药领域，特别涉及一种硫化氢释放剂在制备治疗肾脏纤维化疾病药物中的用途。
背景技术
慢性肾脏病是世界范畴的公共健康问题，是发病率仅次于心脑血管疾病、恶性肿瘤和糖尿病的威胁人类健康的疾病。各种原因引起的慢性肾脏病，其最终结果将发展成终末期肾功能衰竭而需要进行肾脏替代治疗，严重威胁人类生命健康，并造成社会和家庭的沉重负担。在美国和澳洲，患病率约为11～16%，最近的一份报告指出，中国北京成年人群中慢性肾脏病的发病率为13.0%，国内各地区发病率也呈逐年上升趋势。
慢性肾脏病尽管病因不同（如慢性肾小球肾炎、糖尿病肾病、高血压肾病等），但当病情进展到一定阶段后病理都将表现为肾脏纤维化，具体表现为肾小球硬化，肾小管萎缩和肾间质纤维化，即所谓的“共同通道”学说。因此，近年来肾脏纤维化成为各种原因引起的慢性肾脏病的研究热点，也是慢性肾脏病防治的重点和难点问题。目前的观点认为肾脏纤维化是由炎症促发的，多种致纤维化细胞及细胞因子参与的病理过程。其病理特点为肾小管和肾周毛细血管消失，间质炎症细胞浸润，肌纤维母细胞和细胞外基质积聚。活化的肌纤维母细胞是最重要的致纤维化细胞，其分子标志为平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。致纤维化细胞因子中PDGF和TGF-β1在肾间质成纤维细增殖和分化过程中发挥着重要作用，是肾脏纤维化的重要治疗靶点。PDGF也是促进成纤维细胞增殖最重要的丝裂原之一。
开发抗肾脏纤维化的药物也成为慢性肾脏病药物研究的前沿和热点。随着对肾脏纤维化发病机制认识的不断深入，产生了许多新的潜在治疗靶点及药物如BMP-7，治疗靶点为TGF-β1，但是这些药物临床疗效欠佳，而且由于肾脏纤维化的关键调控靶点一直不清楚，纤维化的发病机制提示抗纤维化需要针对多靶点治疗。肾素-血管紧张素系统抑制剂（ACEI）是目前临床最 主要使用的抗纤维化药物，然而这类药物的使用有严格的适应症。因为ACEI扩张肾小球出球小动脉的能力大于入球小动脉，理论上会降低肾小球滤过率，尤其是当患者已经出现肾功能不全，或存在血容量不足时，ACEI可能会导致肾功能急剧恶化，表现为血清肌酐升高和高钾血症，加剧了肾功能恶化，增加了心脏骤停的风险而无法继续使用，因此目前临床上对于这类患者并无特效药物，透析及肾移植成为了最后的治疗策略。ACEI的另一大禁忌症是孤立肾和双侧肾功能狭窄，单侧肾动脉狭窄则需慎用，其原理也是因为在这三种疾病中使用ACEI后会诱发急性肾功能衰竭。另外，肾动脉缺血性疾病也将导致肾脏纤维化，肾脏固缩，最终发展成尿毒症。如何进一步延缓这部分患者的肾功能恶化，从而降低尿毒症的发生率至今仍是肾脏纤维化疾病治疗的难题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种硫化氢释放剂在制备治疗肾脏纤维化疾病药物中的用途。该用途通过硫氢化钠或硫化钠作用于肾脏成纤维细胞，抑制了肾间质成纤维细胞增殖和分化，抑制了肾间质胶原纤维沉积，同时改善了肾功能，而不引起血肌酐和血钾水平的进一步升高，具有抗肾脏纤维化作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种硫化氢释放剂作为肾脏成纤维细胞增殖抑制剂的应用，硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
硫化氢（H2S）在过去300多年一直被认是一种毒性气体。然而，近年研究发现哺乳动物细胞代谢过程本身就会产生H2S，H2S合成相关酶如胱硫醚β合成酶（CBS）和胱硫醚γ裂解酶（CSE）在心、脑、肝、肾以及血管系统内广泛表达，表明H2S在体内发挥着重要的生理和病理调节功能。动物实验研究表明H2S具有抗氧化、抗炎症、抗高血压及其他作用。临床研究也发现高血压、动脉粥样硬化及其终末性肾病患者血浆中H2S水平显著下降。新近研究发现慢性肾脏病模型大鼠外周血H2S含量、肝脏及肾脏中H2S合成酶（CBS或CSE）表达均下降，提示慢性肾脏病是一种伴有H2S缺乏的疾病。最近有证据表明H2S在慢性肾脏病中有保护作用。
硫化氢释放剂是指能够释放硫化氢的化合物或组合物，常用的为硫化钠和硫氢化钠。
肾脏成纤维细胞可通过细胞计数和BrdU渗入率验证其增殖，也可以通过测定细胞增殖相关基因pcna和c-myc的蛋白表达验证其增值。
本发明还提供了一种硫化氢释放剂作为肾脏成纤维细胞分化抑制剂的应用，硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
肾脏成纤维细胞分化成肌纤维母细胞的分子标识是α-SMA，α-SMA的mRNA转录和蛋白表达表明肾脏成纤维细胞分化成肌纤维母细胞。肾脏成纤维细胞分化还表现为肾脏成纤维细胞中胶原相关基因collagen-I与细胞外基质相关基因fibronectin的mRNA转录和蛋白表达。
本发明还提供了一种硫化氢释放剂作为MAPK信号通路的抑制剂，硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
MAPK信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一，在哺乳动物细胞中MAPK亚族主要包括JNK、p38和ERK等，这几种蛋白通过磷酸化参与细胞的增殖、分化、转化及凋亡的调节。
优选地，硫化氢释放剂抑制肾脏成纤维细胞内ERK、P38或JNK蛋白磷酸化。
本发明还提供了一种硫化氢释放剂用于制备治疗肾脏纤维化疾病药物的用途，硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
本发明还提供了一种药物制剂，包含硫化氢释放剂以及药学上可接受的辅料，硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
优选地，药物制剂的剂型为口服剂或注射剂。
作为优选，口服剂为丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或散剂。
本发明利用硫化氢释放剂释放硫化氢作用于病灶，对肾脏纤维化机制进行了研究。但硫化钠和硫氢化钠都为强碱，可与肠胃道消化液中的酸发生反应，迅速释放硫化氢，口服后能引起硫化氢中毒。因此，硫化钠和硫氢化钠需要制成释药速率不受胃肠道消化液影响的口服缓释制剂。口服缓释制剂指口服后在规定释放介质中缓慢地释放药物的制剂，缓释制剂能降低药物进入机体的吸收速率，与相应的普通制剂比较，缓释制剂减少了普通剂型给药所 呈现血药浓度的峰谷现象，使血药浓度保持在比较平稳持久的有效范围内，给药频率至少减少一半或有所减少，且能显著增加患者的顺应性或疗效，提高了药物的安全性。
目前常用膜包衣技术、骨架技术和渗透泵技术制备口服缓释制剂。膜包衣技术是指通过包衣膜控制药物扩散到胃肠液的速度，控制和调节制剂中药物的释放速度，片剂、颗粒、小丸甚至药物粉末均可包衣，膜包衣技术是常用的缓释制剂制备技术之一，膜包衣是在特定的设备中按特定的工艺将糖料或其它能成膜的材料涂覆在药物固体制剂的外表面，使其干燥后成为紧密粘附在表面的一层或数层不同厚薄、不同弹性的多功能保护层；骨架技术是指药物和一种或多种惰性固体骨架材料通过压制或融合技术等制成片状、小粒或其他形式的制剂；渗透泵技术是利用渗透压差为驱动力并结合半透膜控制药物释放的技术。
本发明利用包衣技术对硫化钠或硫氢化钠进行缓释处理。
作为优选，注射剂为粉针剂或注射液。
优选地，注射剂的注射方式为肌肉注射。
本发明提供了一种硫化氢释放剂用于制备治疗肾脏纤维化疾病药物的应用，硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。该发明以血清（FBS）刺激肾间质成纤维细胞，测定细胞增殖和细胞增殖相关基因的蛋白表达，结果显示Na2S抑制了FBS所致的肾间质成纤维细胞的增殖，抑制了肾间质成纤维细胞的DNA合成和BrdU渗入，并抑制了细胞增殖相关基因的蛋白PCNA和c-myc的表达；本发明以TGF-β1刺激肾间质成纤维细胞，测定细胞内α-SMA、Collagen-I和Fibronectin的mRNA转录和α-SMA蛋白表达变化，结果显示Na2S抑制了α-SMA的mRNA转录和蛋白表达，抑制了Collagen-I和Fibronectin的mRNA的转录；本发明通过检测p38、ERK和JNK的蛋白磷酸化水平变化，结果显示Na2S抑制了MAPK通路的激活。在细胞实验的基础上，本发明通过在体实验，研究硫化钠或硫氢化钠对肾脏组织、肾功能、胶原纤维面积、相关蛋白表达的影响，结果显示NaHS治疗组的皮质厚度显著高于UUO模型组，显著降低了血肌酐、尿素氮水平，但未对血钾和尿酸水平产生显著影响，显著减少了间质胶原纤维沉积，显著抑制了α-SMA蛋 白表达水平。由此可见，本发明通过硫氢化钠或硫化钠作用于肾脏成纤维细胞，抑制了肾间质成纤维细胞增殖和分化，抑制了肾间质胶原纤维沉积，同时改善了肾功能，而不引起血肌酐和血钾水平的进一步升高，具有抗肾脏纤维化作用。
附图说明
图1示实施例1提供的MTT法测定肾间质成纤维细胞增殖统计图；以血清（FBS）模拟EGF、PDGF等生长因子的作用，MTT法测定细胞活力；1为1%FBS组，2为1%FBS＋Na2S组，3为3%FBS组，4为3%FBS＋Na2S组，5为5%FBS组，6为5%FBS＋Na2S组，7为10%FBS组，8为10%FBS＋Na2S组；#P<0.01vs1%FBS组，*P<0.01vs10%FBS组，n=6；Na2S（100μM）抑制了不同浓度FBS所致的肾间质成纤维细胞（NRK-49F）的增殖，抗增殖效应在10%FBS组尤为明显。
图2示实施例2提供的MTT法测定肾间质成纤维细胞增殖统计图；1为空白对照组，2为FBS组，3为1μM Na2S＋FBS组，4为10μM Na2S＋FBS组，5为50μM Na2S＋FBS组，6为100μM Na2S＋FBS组，7为500μM Na2S＋FBS组，其中，FBS采用10%的FBS；#P<0.01vs1%FBS组，*P<0.01vs10%FBS组，n=6；不同浓度Na2S抑制了血清所致的肾间质成纤维细胞的增殖；100μM Na2S＋FBS组与FBS组之间的肾间质成纤维细胞增殖差异极显著（P＜0.01）；
图3示实施例3提供的BrdU渗入法测定肾间质成纤维细胞的增殖情况的荧光显微镜图；以血清模拟EGF、PDGF等生长因子的作用，BrdU染色检测细胞增殖，在荧光显微镜下观察BrdU发红色光，在说明书附图的图片中为白色的点；在荧光显微镜下观察，DAPI染色后的细胞核发蓝色光，在说明书附图的图片中为白色的点；其中，图3（a）示空白对照的BrdU渗入图片，图3（b）示空白对照组的DAPI染色的细胞核，图3（c）示图3（a）和图3（b）的叠加图，图3（d）示FBS组的BrdU渗入图片，图3（e）示FBS组的DAPI染色的细胞核，图3（f）示图3（d）和图3（e）的叠加图，图3（g）示Na2S＋FBS组的BrdU渗入图片，图3（h）示Na2S＋FBS组的DAPI 染色的细胞核，图3（i）示图3（g）和图3（h）的叠加图，图3（j）示Na2S组的BrdU渗入图片，图3（k）示Na2S组的DAPI染色的细胞核，图3（l）示图3（j）和图3（k）的叠加图；
图4示实施例3提供的肾间质成纤维细胞的BrdU渗入率统计图；***P<0.01vs10%FBS组，n=6；100μM Na2S＋10%FBS组与10%FBS组之间的BrdU渗入率差异极显著（P＜0.01）；H2S供体Na2S（100μM）作用24小时后抑制了10%FBS所致的肾间质成纤维细胞（NRK-49F）的DNA合成和Brdu渗入；
图5示实施例4提供的PCNA蛋白和C-myc蛋白的电泳图；其中，图5（a）是PCNA蛋白的电泳图，图5（b）是C-myc蛋白的电泳图，β-actin为内参；
图6示实施例4提供的PCNA蛋白和C-myc蛋白与β-actin的累积光密度比率统计图；*P<0.05vs10%FBS组，n=3；其中，图6（a）示PCNA蛋白和β-actin累积光密度比率柱状图，100μM Na2S＋10%FBS组与10%FBS组之间的蛋白表达量差异显著（P＜0.05）；图6（b）示C-myc蛋白和β-actin累积光密度比率柱状图，100μM Na2S＋10%FBS组与10%FBS组之间的蛋白表达量差异显著（P＜0.05）；Na2S（100μM）抑制了10%FBS刺激NRK-49F24小时后PCNA和C-myc的蛋白表达；
图7示实施例5提供的Collagen-I、Fibronectin和α-SMA的cDNA电泳图；其中，图7（a）示Collagen-I的cDNA电泳图，图7（b）示Fibronectin的cDNA电泳图，图7（c）示α-SMA的cDNA电泳图，β-actin和GAPDH为内参；
图8示实施例5提供的α-SMA、Collagen-I、Fibronectin的cDNA与内参的累积光密度比率柱状图；其中，图8（a）示α-SMA cDNA与GAPDH累积光密度比率柱状图，100μM NaHS＋2ng/mL TGF-β1组与2ng/mL TGF-β1组之间的累积光密度比率差异显著（P＜0.05）；图8（b）示Collagen-I cDNA与GAPDH累积光密度比率柱状图，100μM NaHS＋2ng/mL TGF-β1组与2ng/mL TGF-β1组之间的累积光密度比率差异显著（P＜0.05）；图8（c）示Fibronectin的cDNA与GAPDH累积光密度比率柱状图，100μM NaHS＋ 2ng/mL TGF-β1组与2ng/mL TGF-β1组之间的累积光密度比率差异显著（P＜0.05）；GAPDH为内参，CON为假手术组；*P<0.05vs TGF组，n=3；NaHS（100μM）抑制了TGF-β1（2ng/ml）刺激NRK-49F 24小时后α-SMA，collagen-I和Fibronectin mRNA的表达；
图9示实施例5提供的α-SMA cDNA和蛋白的电泳图；图9（a）示α-SMA cDNA的电泳图；图9（b）示α-SMA蛋白的电泳图；其中，β-actin和GAPDH为内参；
图10示实施例5提供的α-SMA蛋白和cDNA与内参的累积光密度比率统计图；其中，图10（a）示α-SMA cDNA与内参的累积光密度比率统计图；图10（b）示与内参的累积光密度比率统计图；#P<0.01vs对照组，*P<0.01vs TGF组，n=3；Na2S（100μM）抑制了TGF-β1（2ng/ml）刺激NRK-49F24小时后α-SMA mRNA和蛋白表达；
图11示实施例6提供的p-ERK、p-P38和p-JNK蛋白的电泳图；其中，图11（a）示p-ERK的电泳图，ERK作为p-ERK内参，图11（b）示p-P38的电泳图，P38作为p-P38内参，图11（c）示p-JNK的电泳图，JNK作为p-JNK内参；
图12示实施例6提供的p-ERK/ERK、p-P38/P38和p-JNK/JNK的累积光密度比率柱状图；图12（a）示p-ERK/ERK的累积光密度比率柱状图，100μMNaHS＋2ng/mL TGF-β1组与2ng/mL TGF-β1组之间的累积光密度比率差异极显著（P＜0.01）；图12（b）示p-P38/P38的累积光密度比率柱状图，100μMNaHS＋2ng/mL TGF-β1组与2ng/mL TGF-β1组之间的累积光密度比率差异极显著（P＜0.01）；图12（c）示p-JNK/JNK的累积光密度比率柱状图，100μMNaHS＋2ng/mL TGF-β1组与2ng/mL TGF-β1组之间的累积光密度比率差异极显著（P＜0.01）；#P<0.01vs对照组，*P<0.01vs TGF组，n=3；Na2S（100μM）预处理30分钟降低了TGF-β1(5ng/ml）刺激细胞60分钟后细胞内p-ERK、p-P38及p-JNK的水平；
图13示实施例7提供的SD大鼠单侧输尿管梗阻诱导的肾脏纤维化模型 （UUO）及各治疗组患侧肾脏剖面图；其中，1为假手术组，2为UUO组，3为依那普利（ACEI）+UUO给药组，4为PAG（25mg/kg/d）+UUO给药组，5为AOAA（5mg/kg/d）+UUO给药组，6为NaHS（0.1μmol/kg/d）+UUO给药组，7为NaHS（1μmol/kg/d）+UUO给药组，8为NaHS（10μmol/kg/d）+UUO给药组；
图14示实施例7提供的SD大鼠单侧输尿管梗阻诱导的肾脏纤维化模型（UUO）及各治疗组患侧肾脏皮质厚度统计图，显示了不同浓度NaHS（0.1-10μmol/kg/d.ip（腹腔注射）），CBS抑制剂（AOAA5mg/kg/d.ip（腹腔注射））以及CSE抑制剂（PAG25mg/kg/d.ip（腹腔注射）)对单侧输尿管梗阻诱导的肾脏纤维化模型（UUO）皮质厚度的影响；***P<0.01vs UUO组，n=5；其中，1为假手术组，2为UUO组，3为依那普利（ACEI）+UUO给药组，4为NaHS（0.1μmol/kg/d）+UUO给药组，5为NaHS（1μmol/kg/d）+UUO给药组，6为NaHS（10μmol/kg/d）+UUO给药组，7为AOAA（5mg/kg/d）+UUO给药组，8为PAG（25mg/kg/d）+UUO给药组；依那普利（ACEI）+UUO给药组和NaHS（1μmol/kg/d）+UUO给药组与UUO组之间的肾脏皮质厚度差异显著（P＜0.05）；
图15示实施例8提供的SD大鼠单侧输尿管梗阻诱导的肾脏纤维化模型（UUO）及各治疗组的血肌酐、尿素氮、尿酸和血钾检测结果统计图，显示了不同浓度NaHS（0.1-10μmol/kg/d.ip（腹腔注射）），CBS抑制剂（AOAA5mg/kg/d.ip（腹腔注射））以及CSE抑制剂（PAG25mg/kg/d.ip（腹腔注射）)对大鼠单侧输尿管梗阻诱导肾脏纤维化模型（UUO）血肌酐、尿素氮、尿酸和血钾的影响；*P<0.05vs UUO组，n=5；图15（a）示血肌酐摩尔浓度柱状图，NaHS（1μmol/kg/d）+UUO给药组与UUO组之间的血肌酐摩尔浓度差异显著（P＜0.05）；图15（b）示尿素氮摩尔浓度柱状图，NaHS（1μmol/kg/d）+UUO给药组与UUO组之间的尿素氮摩尔浓度差异显著（P＜0.05）；图15（c）示血钾摩尔浓度柱状图，各组之间血钾摩尔浓度无统计学差异；图15（d）示尿酸摩尔浓度柱状图，各组之间尿酸摩尔浓度无统计学差异；其中，1为假手术组，2为UUO组，3为依那普利（ACEI）+UUO给药组，4为NaHS（0.1μmol/kg/d）+UUO给药组，5为NaHS（1μmol/kg/d）+UUO给药组，6 为NaHS（10μmol/kg/d）+UUO给药组，7为AOAA（5mg/kg/d）+UUO给药组，8为PAG（25mg/kg/d）+UUO给药组；
图16示实施例9提供的SD大鼠单侧输尿管梗阻诱导的肾脏纤维化模型（UUO）及各治疗组肾脏组织切片HE染色光镜图；其中，图16（a）示假手术组，图16（b）示UUO组，图16（c）示依那普利（ACEI）+UUO给药组，图16（d）示NaHS（0.1μmol/kg/d）+UUO给药组，图16（e）示NaHS（1μmol/kg/d）+UUO给药组，图16（f）示NaHS（10μmol/kg/d）+UUO给药组，图16（g）示PAG（25mg/kg/d）+UUO给药组，图16（h）示AOAA（5mg/kg/d）+UUO给药组；
图17示实施例9提供的SD大鼠单侧输尿管梗阻诱导的肾脏纤维化模型（UUO）及各治疗组肾脏组织切片Masson染色光镜图；其中，图17（a）示假手术组，图17（b）示UUO组，图17（c）示依那普利（ACEI）+UUO给药组，图17（d）示NaHS（0.1μmol/kg/d）+UUO给药组，图17（e）示NaHS（1μmol/kg/d）+UUO给药组，图17（f）示NaHS（10μmol/kg/d）+UUO给药组，图17（g）示PAG（25mg/kg/d）+UUO给药组，图17（h）示AOAA（5mg/kg/d）+UUO给药组；
图18示实施例9提供的SD大鼠单侧输尿管梗阻诱导的肾脏纤维化模型（UUO）及各治疗组肾脏组织切片HE和Masson染色结果统计图，显示了不同浓度NaHS（0.1-10μmol/kg/d.ip（腹腔注射）），CBS抑制剂AOAA（5mg/kg/d.ip（腹腔注射））及CSE抑制剂PAG（25mg/kg/d.ip（腹腔注射））对单侧输尿管梗阻诱导的肾脏纤维化模型（UUO）病理形态HE染色和肾间质胶原面积（Masson染色）的影响；***P<0.01vs UUO组，n=10；纵坐标为每个光镜视野中蓝色胶原纤维占整个视野的面积百分比，其中，1为假手术组，2为UUO组，3为依那普利（ACEI）+UUO给药组，4为NaHS（0.1μmol/kg/d）+UUO给药组，5为NaHS（1μmol/kg/d）+UUO给药组，6为NaHS（10μmol/kg/d）+UUO给药组，7为AOAA（5mg/kg/d）+UUO给药组，8为PAG（25mg/kg/d）+UUO给药组；
图19示实施例10提供的单侧输尿管梗阻模型（UUO）造模后肾脏组织匀浆中CBS和CSE表达的变化；**P<0.05vs UUO组，n=4；图19（a）示 CBS蛋白电泳图，图19（b）示CSE蛋白电泳图，图19（c）示CBS与β-actin的累积光密度比率统计分析柱状图；图19（d）示CSE与β-actin的累积光密度比率统计分析柱状图；
图20示实施例10提供的单侧输尿管梗阻模型（UUO）造模后肾脏组织匀浆中α-SMA蛋白表达的变化，显示了不同浓度NaHS（0.1-10μmol/kg.d.ip），CBS抑制剂AOAA（5mg/kg/d.ip）及CSE抑制剂PAG（25mg/kg/d.ip）对单侧输尿管梗阻模型（UUO）肾脏α-SMA表达的影响；*P<0.05vs UUO组，n=4；其中，1为假手术组，2为UUO组，3为依那普利（ACEI）+UUO给药组，4为NaHS（0.1μmol/kg/d）+UUO给药组，5为NaHS（1μmol/kg/d）+UUO给药组，6为NaHS（10μmol/kg/d）+UUO给药组，7为AOAA（5mg/kg/d）+UUO给药组，8为PAG（25mg/kg/d）+UUO给药组；与假手术组相比，UUO组的α-SMA蛋白表达量明显升高（P＜0.05）；依那普利（ACEI）+UUO给药组和NaHS（1μmol/kg/d）+UUO给药组的蛋白表达量与UUO组相比，具有统计学差异（P＜0.05）；其中，图20（a）示α-SMA蛋白电泳图，图中分子量42kd的条带为目的条带α-SMA（如箭头所示），另外一条条带是由于抗体质量等因素造成的杂带，杂带可以通过优化杂交条件去除；图20（b）示α-SMA蛋白的累积光密度比率统计分析柱状图。
具体实施方式
本发明公开了一种硫化氢释放剂在制备治疗肾脏纤维化疾病药物中的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种硫化氢释放剂作为肾脏成纤维细胞增殖抑制剂的应用，硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
硫化氢释放剂是指能够释放硫化氢的化合物或组合物，常用的为硫化钠和硫氢化钠。
细胞的增殖依赖于生长因子的刺激作用。生长因子是具有刺激细胞生长 活性的细胞因子，它是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质，存在于血小板和各种成体与胚胎组织及大多数培养细胞中，对不同种类细胞具有一定的专一性，通常培养细胞的生长需要多种生长因子顺序的协调作用。生长因子多为广义的肽激素，有胰岛素、表皮生长因素（EGF）、成纤细胞生长因素（FGF）、血小板来源增殖因素（PDGF）以及生长激素释放抑制因子等。离体培养的细胞一般需在其培养液中加入具有刺激细胞生长作用的胎牛或小牛血清（血清中含有多种生长因子）。本发明中以血清模拟EGF、PDGF等生长因子的作用。
在本发明提供的一些实施例中，肾脏成纤维细胞通过细胞计数和BrdU渗入率验证其增殖；在本发明提供的另外一些实施例中，通过测定细胞增殖相关基因pcna和c-myc的蛋白表达验证其增值。
本发明还提供了一种硫化氢释放剂作为肾脏成纤维细胞分化抑制剂的应用，硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
细胞的分化依赖转化生长因子（TGF）的作用。TGF是指两类多肽类生长因子，TGF-α和TGF-β。TGF-α是由巨噬细胞，脑细胞和表皮细胞产生，可诱导上皮发育；人类TGF-β有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三个亚型，它是一多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。TGF-β可以结合到细胞表面的TGF-β受体结合而激活其受体。TGF-β受体是丝氨酸/苏氨酸激酶受体。
肾脏成纤维细胞分化成肌纤维母细胞的分子标识是α-SMA，在本发明提供的实施例中，通过测定α-SMA的mRNA转录和蛋白表达水平的变化验证肾脏成纤维细胞的分化；通过肾脏成纤维细胞中胶原相关基因collagen-I与细胞外基质相关基因fibronectin的mRNA转录和蛋白表达验证肾脏成纤维细胞的分化。
本发明还提供了一种硫化氢释放剂作为MAPK信号通路的抑制剂，硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
MAPK信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一，在哺乳动物细胞中MAPK亚族主要包括JNK、p38和ERK等，这几种蛋白通过磷酸化参与细胞的增殖、分化、转化及凋亡的调节。
在本发明提供的实施例中，硫化氢释放剂抑制了肾脏成纤维细胞内ERK、P38或JNK蛋白磷酸化。
本发明还提供了一种硫化氢释放剂用于制备治疗肾脏纤维化疾病药物的用途，硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
本发明还提供了一种药物制剂，包含硫化氢释放剂以及药学上可接受的辅料，硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
根据给药途径，本发明提供的药物制剂可以为口服剂，也可以为注射剂。
根据药物状态，本发明提供的口服剂可以为丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或散剂。
直接口服硫化钠或硫氢化钠药物制剂，硫化钠或硫氢化钠药物制剂会与胃肠道中的酸发生反应迅速释放硫化氢气体，对身体造成毒害，因此，本发明提供的口服剂需利用包衣技术对硫化钠或硫氢化钠进行缓释处理。
根据注射剂的状态，本发明提供的注射剂为粉针剂或注射液。
硫化氢是有毒气体，直接进入血液可能会引起中毒，因此，本发明中注射剂的注射方式为肌肉注射。
本发明提供了一种硫化氢释放剂用于制备治疗肾脏纤维化疾病药物的应用，硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。在本发明提供的一些实施例中，以血清（FBS）刺激肾间质成纤维细胞，测定细胞增殖和细胞增殖相关基因的蛋白表达，结果显示100μM的Na2S抑制了FBS所致的肾间质成纤维细胞的增殖，抑制了肾间质成纤维细胞的DNA合成和BrdU渗入，并抑制了细胞增殖相关基因的蛋白PCNA和c-myc的表达；在本发明提供的另外一些实施例中，以TGF-β1刺激肾间质成纤维细胞，测定细胞内α-SMA、Collagen-I和Fibronectin的mRNA转录和α-SMA蛋白表达变化，结果显示Na2S抑制了α-SMA的mRNA转录和蛋白表达，抑制了Collagen-I和Fibronectin的mRNA的转录；通过检测p38、ERK和JNK的蛋白磷酸化水平变化，结果显示Na2S抑制了MAPK通路的激活。在细胞实验的基础上，本发明提供的一些实施例通过在体实验，研究硫化钠或硫氢化钠对肾脏组织、肾功能、胶原纤维面积、相关蛋白表达的影响，结果显示0.1μmol/kg/d和1μmol/kg/d NaHS治疗组的皮质厚度显著高于UUO模型组，1μmol/kg/d NaHS治疗组的皮质厚度优 于ACEI治疗组；与UUO组相比，1μmol/kg/d NaHS治疗组显著降低了血肌酐水平，0.1μmol/kg/d NaHS治疗组显著降低了尿素氮水平，但各治疗组均未对血钾和尿酸水平产生显著影响；0.1μmol/kg/d和1μmol/kg/d NaHS治疗组显著减少了间质胶原纤维沉积，显著抑制了α-SMA蛋白表达水平。由此可见，本发明通过硫氢化钠或硫化钠作用于肾脏成纤维细胞，抑制了肾间质成纤维细胞增殖和分化，抑制了肾间质胶原纤维沉积，同时改善了肾功能，而不引起血肌酐和血钾水平的进一步升高，具有抗肾脏纤维化作用。
本发明中硫化氢释放剂的用途及含有硫化氢释放剂的药物中所用试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 MTT法测定肾间质成纤维细胞的增殖
将肾间质成纤维细胞株用含10%胎牛血清的DMEM培养基置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。隔天换液，0.25%胰酶消化，1：3传代，获得肾间质成纤维细胞（NRK-49F）。
取2×103个肾间质成纤维细胞（NRK-49F）接种于96孔板中培养。以血清（FBS）模拟EGF、PDGF等生长因子的作用。根据FBS浓度梯度进行实验细胞分组：1%FBS，3%FBS，5%FBS，10%FBS，1%FBS＋Na2S，3%FBS＋Na2S，5%FBS＋Na2S，10%FBS＋Na2S，其中，Na2S的浓度为100μM。Na2S先预处理30分钟。细胞处理24小时后每个孔加入MTT（5mg/mL）20μL，4小时后弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解甲臢，酶标仪490nm波长读取OD值。试验结果参见图1。
由图1可知，H2S供体Na2S（100μM）预处理抑制了不同浓度FBS所致的肾间质成纤维细胞（NRK-49F）的增殖，抗增殖效应在10%FBS组尤为明显。
实施例2 MTT法测定肾间质成纤维细胞的增殖
取实施例1制备的2×103个肾间质成纤维细胞（NRK-49F）接种于96孔板中培养。以血清（FBS）模拟EGF、PDGF等生长因子的作用。根据Na2S 浓度梯度进行实验细胞分组：空白对照组，FBS组，1μM Na2S＋FBS，10μMNa2S＋FBS，50μM Na2S＋FBS，100μM Na2S＋FBS，500μM Na2S＋FBS，其中，FBS采用10%的FBS。Na2S先预处理30分钟。细胞处理24小时后每个孔加入MTT（5mg/mL）20μL，4小时后弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解甲臜，酶标仪490nm波长读取OD值。试验结果参见图2。
由图2可知，Na2S浓度为10～100μM时，10%FBS所致的NRK-49F的抗增殖效应显著，Na2S浓度为100μM时尤为明显。
实施例3 BrdU渗入法测定肾间质成纤维细胞的增殖
取实施例1制备的4×104个细胞（NRK-49F）接种于24孔板内，用含0.5%胎牛血清的DMEM培养基培养过夜。细胞贴壁后进行实验分组：空白对照组，10%FBS组，Na2S组（100μM），10%FBS+Na2S（100μM）组。10%FBS刺激细胞增殖5小时，加入Brdu（10μM）继续孵育5小时。细胞处理结束后用4%多聚甲醛固定20分钟，继以2N HCL DNA37℃变性20分钟。5%BSA封闭1h后加入anti-Brdu一抗（1：100）4℃过夜，Alexa Fluor555Donkey Anti-Mouse IgG二抗（1：500）室温1小时，使用含DAPI的Vector mounting media封片。荧光显微镜下观察10个互不重叠的视野，荧光显微镜图片如图3所示，用Image-J软件进行细胞计数，计算染色阳性细胞（红色）与细胞核（蓝色）的百分比。使用SPSS17.0软件进行统计分析，所有数据均采用均值±标准误（SEM）来表示。各组间差异比较采用One-wayANOVA方差分析，P<0.05为统计学上有显著性差异，结果见图4。
由图3可知，与对照组相比，10%FBS所致的肾间质成纤维细胞（NRK-49F）的DNA合成和Brdu（红色）渗入增加。Na2S（100μM）预处理30分钟后，NRK-49F细胞的DNA合成和Brdu渗入减少，着红色的细胞核较FBS组减少，荧光强度减弱。由图4可知，10%FBS组与10%FBS+Na2S（100μM）组的Brdu渗入量差异显著，表明Na2S处理组的Brdu渗入明显减少。
实施例4 肾间质成纤维细胞内PCNA、C-myc蛋白的检测
取实施例1制备的细胞（NRK-49F）接种于35mm培养皿。待细胞融合至70%时进行实验分组：空白对照组，10%FBS组，Na2S（100μM）组，Na2S/NaHS（100μM）加10%FBS组。Na2S预处理30分钟。
用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，所有操作在冰上进行，其步骤为：首先将细胞裂解液（RIPA原液10mL+蛋白酶抑制剂（罗氏complete ultra tablets）一片）加入培养皿中，加入量为100μL/皿，用细胞刮刮取细胞，转入1.5mL EP管，EP管置于普通冰盒上静置30min；然后进行低温高速离心，温度为4℃，转速为13200rpm，离心15min；最后，将EP管中上清液转移至一新EP管中，-80℃保存。
使用BCA试剂盒进行总蛋白浓度的测定，操作步骤按照产品说明书操作。
配制上样蛋白。通过换算，取适量蛋白原液，加入5×上样缓冲液，并用ddH2O将每个上样的蛋白样品配平成1ug/μL，总体积100μL。95℃煮5分钟，使蛋白变性。煮过后的样品-20℃保存。
制备10%的分离胶，体系如下：
制备4%的浓缩胶，体系如下：
取总量约20ug蛋白上样进行电泳，恒压90V，待marker跑开后，改用恒压120V，直至蓝色指示条带至胶底部。然后进行转膜，转膜条件为恒流350mA，90min。取出PVDF膜，用5%milk-TBST封闭1小时。之后进行一抗孵育，用TBST洗涤PVDF膜3次，10min/次，分别孵anti-PCNA抗体（1：1000稀释），anti-C-myc抗体（1：500稀释）4℃过夜。最后进行二抗孵育，用TBST洗涤PVDF膜3次，10min/次，分别孵Anti-rabbit/Anti-rabbit IgG，HRP-LinkedAntibody（1：2000稀释），室温孵育1小时。
二抗孵育结束后，ECL发光试剂A液和B液等体积混合，均匀覆盖在PVDF表面，半分钟后用凝胶成像仪显影。NRK-49F增殖相关蛋白PCNA和C-myc的凝胶成像图参见图5。
采用Image J软件对条带的光密度进行分析，β-actin作为内参校正各条带的累积光密度。使用SPSS17.0软件对PCNA和C-myc蛋白的光密度进行统计分析，所有数据均采用均值±标准误（SEM）来表示。各组间差异比较采用One-way ANOVA方差分析。P<0.05为统计学上有显著性差异。PCNA和C-myc蛋白光密度的统计分析结果见图6。
由图5可知，与对照组相比，10%FBS处理24小时后NRK-49F增殖相关蛋白（PCNA和C-myc）表达增加。Na2S（100μM）预处理30分钟降低了NRK-49F增殖相关蛋白PCNA和C-myc的表达；由图6可知，与对照组相比，Na2S（100μM）预处理30分钟后的NRK-49F增殖相关蛋白PCNA和C-myc的表达量显著降低了。结果表明Na2S能够通过降低增殖相关蛋白的表达降低细胞增殖。
实施例5 肾间质成纤维细胞内α-sma、collagen-I、fibronectin的mRNA和α-SMA蛋白的检测
取实施例1制备的细胞（NRK-49F）接种于35mm培养皿。待细胞融合至70%时进行实验分组：空白对照组，TGF-β1（2ng/mL）组，Na2S/NaHS（100μM）组，Na2S/NaHS（100μM）加TGF-β1（2ng/mL）组。Na2S/NaHS预处理30分钟，细胞处理12小时后提取细胞RNA，24小时后提取细胞总 蛋白。
Trizol法提取细胞总RNA。每个培养皿中加入1mL Trizol试剂（Invitrogen），细胞提取物转入1.5mL EP管。每管加入氯仿200μL，剧烈震荡15秒后，4℃12000g离心15分钟。离心后小心吸取上层透明水相400μL，加入等体积异丙醇，静置15分钟后4℃、12000g离心15分钟。弃去上清后加入1mL75%乙醇，4℃、7500g离心10分钟，晾干沉淀后加DEPC水10μL/管，测定RNA浓度。
使用Fenmentas第一链合成试剂盒，按照说明书操作，将1μg总RNA逆转成cDNA，反应体系为：
模板RNA 1μg
oligo（dT）primer 1μL
加入灭菌水补足体系总量至12μL。
65℃变性5分钟，加入以下体系：
加入灭菌水补足体系总量至20μL。42℃孵育60分钟。
使用Fenmentas第二链合成试剂盒，按照说明书操作，扩增DNA。其中，利用核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物对α-sma进行扩增；利用核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物对collagenI进行扩增；利用核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物对fibronectin进行扩增，利用核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物对GAPDH进行扩增。
PCR反应体系为：
加入灭菌水17.85μL补足体系总量至25μL。
PCR反应条件为：94℃5分钟，94℃30秒，54℃45秒，72℃30秒，72℃10分钟，35个循环。
配制2%琼脂糖胶，PCR扩增产物在水平电泳仪上电泳后，使用凝胶成像仪成像，α-sma、collagen-I和fibronectin PCR扩增产物的电泳图见图7、图9（a）。
将α-SMA蛋白进行Western Blot分析，方法同前。所用抗体为α-SMA（1：500）。α-SMA蛋白的凝胶成像图见图9（b）。
采用Image J软件对条带的光密度进行分析，GAPDH、β-actin作为内参校正各条带的累积光密度。使用SPSS17.0软件对α-sma PCR扩增产物、collagen-I PCR扩增产物、bronectin PCR扩增产物和α-SMA蛋白的光密度进行统计分析，所有数据均采用均值±标准误（SEM）来表示。各组间差异比较采用One-way ANOVA方差分析。P<0.05为统计学上有显著性差异。统计分析结果见图8、图10。
由图7可知，TGF-β1（2ng/mL）孵育12小时后，细胞内α-sma、collagen-I和fibronectin mRNA水平升高，提示肾脏成纤维细胞转化为肌纤维母细胞；NaHS（100μM）抑制了α-sma、collagen-I和fibronectin的mRNA表达，并具有统计学意义（图8）。
由图9可知，TGF-β1（2ng/mL）孵育12小时后，细胞内α-SMA的mRNA和蛋白表达升高；Na2S（100μM）预处理降低了α-SMA mRNA和蛋白的表达，表明Na2S（100μM）抑制了TGF-β1（2ng/ml）刺激NRK-49F24小时后α-SMA mRNA和蛋白表达，并具有统计学意义（图10）。
实施例6 肾间质成纤维细胞内p-ERK、p-P38和p-JNK蛋白的检测
取实施例1制得的细胞（NRK-49F）接种于35mm培养皿。待细胞融合至70%时进行实验分组：空白对照组，TGF-β1（2ng/mL）组，Na2S/NaHS（100μM）组，Na2S/NaHS（100μM）加TGF-β1（2ng/mL）组。Na2S/NaHS预处理30分钟。处理1小时后，每皿加入100μL1×loading buffer，刮取细胞后，95℃煮5分钟，使蛋白变性，-20℃保存。然后进行Western Blot检测，操作同前，所用抗体为p-ERK/total-ERK（1：500）、p-P38/total-P38（1：500）和p-JNK/total-JNK（1：500）。凝胶成像图见图11。
采用Image J软件对条带的光密度进行分析，ERK、P38和JNK作为内参校正各条带的累积光密度。使用SPSS17.0软件对其光密度进行统计分析，所有数据均采用均值±标准误（SEM）来表示。各组间差异比较采用One-way ANOVA方差分析。P<0.05为统计学上有显著性差异。统计分析结果见图12。
由图11、图12可知，TGF-β1（2ng/mL）孵育1小时后，细胞内p-P38、p-JNK和p-ERK蛋白表达升高，Na2S（100μM）预处理降低了p-ERK、p-P38和p-JNK蛋白的磷酸化，结果表明H2S可以通过抑制MAPK通路抑制肾脏成纤维细胞分化为肌纤维母细胞。
实施例7 肾脏标本的制备及皮质厚度的测定
动物材料为SD大鼠，雄性，体重180±15.6g，由苏州大学实验动物中心提供，饲养于室温环境下，明暗周期12h，自由进食，饮水不限，普通大鼠饲料喂养，实验前适应环境3天。
用4%水合氯醛溶液（1mL/100g）腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧固定于手术台上，腹部备皮，常规消毒铺巾，沿左侧腹直肌外缘垂直切开皮肤、肌肉和筋膜，暴露腹腔，翻出肠管，于左侧髂动脉处找到并钝性分离左侧输尿管，取4-0号手术缝线于输尿管中上段结扎两道，并从中间剪断，肠管复位后逐层缝合，获得单侧输尿管梗阻模型（UUO）。假手术组仅分离，但不结扎和剪断左侧输尿管。
随机分成8组，分别为假手术组、模型（UUO）组（生理盐水）、UUO+依那普利（ACEI）组、UUO+NaHS给药组（0.1μmol/kg/d）、UUO+NaHS给药组（1μmol/kg/d）、UUO+NaHS给药组（10μmol/kg/d）、UUO+AOAA（H2S合成酶CBS抑制剂）给药组（5mg/kg/d）、UUO+PAG（H2S合成酶CSE抑制剂）给药组（25mg/kg/d）。给药于造模前3天开始，每日一次直至术后14天。NaHS、AOAA和PAG给予腹腔注射给药，依那普利给予灌胃。
术后14天，4%水合氯醛麻醉动物，打开腹腔暴露下腔静脉，静脉取血4mL，得到静脉血标本。剪断下腔静脉，用生理盐水经心脏灌注至肾脏色泽转白，取出左侧肾脏，剥除肾包膜，去除肾积水后，得到肾脏标本。
取肾脏标本，称重，测量肾脏长径。肾脏再纵切为二，记录经肾门中段肾皮质厚度。
如图13所示，与假手术组相比，UUO组肾脏体积增大，皮质变薄；依那普利组和NaHS给药组（1μmol/kg/d）与UUO组相比，肾脏体积缩小，皮质厚度增加。
如图14所示，依那普利组和NaHS给药组（1μmol/kg/d）与UUO组相比，皮质厚度增加差别有统计学意义（P<0.05）。而NaHS给药组（0.1μmol/kg/d）、NaHS给药组（10μmol/g/d）以及H2S合成酶抑制剂组与UUO组相比肾脏体积和皮质厚度差别不明显。
实施例8 肾功能和电解质的测定
取实施例7制备的肾脏静脉血标本4mL，送检苏州大学附属第二医院检验科生化室测定肾功能（尿素氮、肌酐和尿酸）和电解质（钾、钠、钙、磷）。
由图15可知，与假手术组相比，UUO组血肌酐和尿素氮升高，提示模型组肾功能受损。与UUO组相比，NaHS给药组（1μmol/kg/d）血肌酐和尿素氮水平下降，差别有统计学意义（P<0.05），H2S合成酶抑制剂组血肌酐和尿素氮有升高趋势。各治疗组均没有对血钾和尿酸水平产生显著影响。各组别血钾水平虽无无统计学差别，NaHS（1μmol/kg/d）给药组血钾有下降趋势，但提示此剂量下NaHS不会造成血钾升高。
实施例9 肾脏组织的病理染色
取实施例7制备的肾脏标本，用石蜡包埋，切成4μm切片进行HE染色和Masson染色。
HE染色过程：4μm切片二甲苯脱蜡30分钟×3次，无水酒精各3分钟×2次，95%酒精3分钟，85%酒精3分钟，75%酒精3分钟，自来水洗5分钟，苏木素染10分钟，自来水洗2分钟，1%盐酸酒精分化10-30秒，自来水洗返蓝15分钟，90%酒精1分钟，伊红30秒，95%酒精各1秒，无水酒精2分钟×3次，二甲苯5分钟×2次，中性树胶封片。
HE染色评分：每例标本光镜下观察，200倍视野下观察左上、右上、左下、右下和中间5个视野。根据肾小管空泡变性、小管扩张、小管萎缩、红细胞和蛋白管型、间质水肿和间质纤维化和间质炎症细胞浸润等8项指标观察肾脏病理变化和对肾小管间质损伤进行评分。
Masson染色过程：4μm切片二甲苯脱蜡30分钟×3次。无水酒精各3分钟×2次，95%酒精3分钟，85%酒精3分钟，75%酒精3分钟，水洗5分钟。3%重铬酸钾溶液氧化过夜，水洗10分钟，Weigert铁苏木素溶液5分钟，水洗3分钟，1%盐酸酒精分化30秒，水洗5分钟，丽春红酸性品红液5分钟，水洗2分钟，0.2%乙酸溶液洗2次，1%磷目酸液分化5分钟，2%苯胺兰液5分钟，0.2%乙酸溶液洗3次，无水酒精脱水3次，Van cleart透明剂透明，Van mount封片。
Masson染色半定量分析：200倍视野下随机选取互不重叠的视野10个，使用Image-Pro Plus6.0软件计算每个视野中蓝色胶原纤维占整个视野的面积百分比。
肾组织HE和Masson染色结果分别见图16、图17，统计分析结果见图18。结果显示，UUO组肾小管萎缩，伴肾小管腔扩张，肾间质扩大，肾间质炎症细胞增多，蓝色胶原纤维沉积明显。与UUO组相比，依那普利组、NaHS给药组（0.1μmol/kg/d）和NaHS给药组（1μmol/kg/d）肾小管萎缩程度相对较轻，蓝色胶原面积减少，差别有统计学意义（P<0.05），尤以NaHS给药组（1μmol/kg/d）组蓝色胶原面积最少。H2S合成酶抑制剂组与UUO相比肾间质胶原纤维面积无明显减少。
实施例10 CBS、CSE和α-SMA蛋白的检测
取实施例7制得的肾脏标本用RIPA裂解液提取大鼠肾脏总蛋白，所有操作在冰上进行，操作步骤为：切取肾脏标本，称重（约20～30mg）后置入1.5mL EP管；按照1mg/10μL的比例加入相应体积的组织裂解液（RIPA原液10mL+蛋白酶抑制剂（罗氏complete ultra tablets）一片），组织匀浆器匀浆；匀浆结束后置于普通冰盒上静置30min；将匀浆置于冷冻离心机中低温高速离心，温度为4℃，转速为13200rpm，离心15min；离心结束后，将EP管中上清液转移至EP管中，-80℃保存。
使用BCA试剂盒按照产品说明书操作，测定总蛋白浓度。
通过换算，取适量蛋白原液，加入5×上样缓冲液，并用ddH2O将每个上样的蛋白样品配平成4ug/μL，总体积100μL。95℃煮5分钟，使蛋白变性。煮过后的样品-20℃保存。然后取蛋白样品进行Western Blot印迹试验，方法同前，所用抗体为anti-CBS抗体（1：1000稀释），anti-CSE抗体（1：250稀释）和anti-SMA抗体（1：1000稀释）。
采用Image J软件对条带的光密度进行分析，β-actin作为内参校正各条带的累积光密度。使用SPSS17.0软件进行统计分析，所有数据均采用均值±标准误（SEM）来表示。各组间差异比较采用One-way ANOVA方差分析。P<0.05认为统计学上有显著性差异。
由图19可知，与假手术组相比，UUO组CBS蛋白表达明显下降（P<0.05），而CSE表达两组无统计学差异。这一结果提示肾脏纤维化模型中，内源性H2S水平可能也是下降的，支持外源性补充或适度提高H2S水平、或通过调节内源性H2S生成对肾脏纤维化具有切实的疗效。
由图20可知，与假手术组相比，UUO组α-SMA蛋白表达明显升高（P<0.05），进一步验证造模成功。与UUO组相比，依那普利组、和NaHS（1μmol/kg/d）给药组α-SMA表达下降（P<0.05），其余组别α-SMA表达与UUO组相比无差异，表明NaHS1μmol/kg/d腹腔注射能够改善肾脏纤维化。
图20（a）中分子量42kd的条带为目的条带α-SMA（如箭头所示），另外一条条带是由于抗体质量等因素造成的杂带，杂带可以通过优化杂交条件 去除。
实施例11 硫化氢释放剂药物片剂的制备
取市售的硫化钠与常规辅料，按照常规方法制备获得硫化氢释放剂药物片剂。
实施例12 硫化氢释放剂药物丸剂的制备
取市售的硫氢化钠与常规辅料，按照常规方法制备获得硫化氢释放剂药物丸剂。
实施例13 硫化氢释放剂药物颗粒剂的制备
取市售的硫化钠与常规辅料，按照常规方法制备获得硫化氢释放剂药物颗粒剂。
实施例14 硫化氢释放剂药物胶囊剂的制备
取市售的硫化钠与常规辅料，按照常规方法制备获得硫化氢释放剂药物胶囊剂。
实施例15 硫化氢释放剂药物散剂的制备
取市售的硫氢化钠与常规辅料，按照常规方法制备获得硫化氢释放剂药物散剂。
实施例16 硫化氢释放剂药物粉针剂的制备
取市售的硫氢化钠与常规辅料，按照常规方法制备获得硫化氢释放剂药物粉针剂，制得的硫化氢释放剂药物粉针剂的注射方式为肌肉注射。
实施例17 硫化氢释放剂药物注射液的制备
取市售的硫化钠与常规辅料，按照常规方法制备获得硫化氢释放剂药物注射液，制得的硫化氢释放剂药物注射液的注射方式为肌肉注射。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种硫化氢释放剂作为肾脏成纤维细胞增殖抑制剂的应用，所述硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
2.一种硫化氢释放剂作为肾脏成纤维细胞分化抑制剂的应用，所述硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
3.一种硫化氢释放剂作为MAPK通路的抑制剂，所述硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
4.根据权利要求3所述的抑制剂，其特征在于，所述硫化氢释放剂抑制肾脏成纤维细胞内ERK、P38或JNK蛋白磷酸化。
5.一种硫化氢释放剂用于制备治疗肾脏纤维化疾病药物的用途，所述硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
6.一种药物制剂，其特征在于，包含硫化氢释放剂以及药学上可接受的辅料，所述硫化氢释放剂为硫氢化钠或硫化钠。
7.根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型为口服剂或注射剂。
8.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述口服剂为丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或散剂。
9.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述注射剂为粉针剂或注射液。
10.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述注射剂的注射方式为肌肉注射。
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| CN1823815A (zh) * | 2005-02-26 | 2006-08-30 | 杨云 | 硫化钠静脉注射液在制备治疗脑梗死后遗症药剂中的应用 |
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