CN102958362A - 含有白藜芦醇的组合物和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了含有白藜芦醇的组合物，所述组合物能够向对象提供治疗益处，例如调节生物活性、改善细胞移植疗法、或者改善黄斑变性或营养不良的治疗。所述组合物包含反式白藜芦醇、金属螯合剂、和一种或多种其他抗氧化剂例如酚类抗氧化剂或维生素D。

Description

含有白藜芦醇的组合物和应用方法

背景技术

尽管有高水平的风险因素例如胆固醇、糖尿病、高血压和饱和脂肪的高摄入，但法国男性在西方工业化国家中却表现出最低的因缺血性心脏病和心血管疾病引起的死亡率（比美国低36%，比英国低39%）。所谓的“法国悖论”（特别是因心血管疾病引起的死亡率低）可能主要因归于定期饮用葡萄酒（Renaud,S.等（1998）Novartis Found.Symp.216:208-222,152-158）。

白藜芦醇（3,4',5-三羟基-反式芪）是在例如葡萄皮中发现的天然存在的酚类化合物，已经证明它具有与人类健康有关的有益性质。具体地，白藜芦醇被认为有益于心脏的功能和延长人类细胞的寿命。当白藜芦醇被用在膳食增补剂中时，通常将它作为植物来源的醇提取物进行生产。

已经证明卡路里限制饮食通过上调生存/长寿基因或下调其表达增强细胞损伤的基因而提高生存和寿命。小鼠已被广泛用作用于与人类进行基因表达比较的模型。不作为限制，鼠类模型对于人类基因表达而言的正确性反映了人类与鼠类基因有98%是同源以及小鼠与人类具有大致相同的基因数量（例如，大约30,000个）的这一事实。

尽管卡路里限制饮食有确定的益处，但是所要求的膳食方案的严格程度限制了采用这种方法来增加寿命。因此，希望提供用于获得卡路里限制益处的替代途径，该替代途径避免了膳食调节需要并适合普遍采用。本发明的实施方式是针对这种和其他需要。

发明内容

本发明实施方式中的实施方式提供了包含反式白藜芦醇、金属螯合剂和一种或多种其他抗氧化剂例如芹菜素、咖啡酸、EGCG、阿魏酸、槲皮素或维生素D的组合物，以及所述组合物的应用方法。反式白藜芦醇可以被囊封以基本上保持所述组合物的生物活性免于因反式白藜芦醇暴露于光或氧气而损失。其他实施方式提供了通过与干细胞植入一起或在干细胞植入之后施用包含反式白藜芦醇、金属螯合剂以及一种或多种其他抗氧化剂例如芹菜素、咖啡酸、EGCG、阿魏酸、槲皮素或维生素D的组合物来保护植入的干细胞的方法。

附图说明

图1显示了施用白藜芦醇或本发明实施方式的组合物

的小鼠相对于对照动物和保持卡路里限制饮食的动物的体重改变。

图2显示了施用白藜芦醇或本发明实施方式的组合物

的小鼠相对于对照动物和保持卡路里限制饮食的动物的血清胰岛素水平。

图3显示了施用白藜芦醇（P=0.97）或本发明实施方式的组合物

（P=0.07）的小鼠相对于对照动物和保持卡路里限制饮食的动物（P=0.10）的血清葡萄糖水平。

图4显示了符合所观察到的本发明实施方式组合物的生物活性的作用机制的示意图。

图5是柱状图，显示了白藜芦醇和本发明实施方式的组合物

对分离并灌注后的大鼠心脏中主动脉流量的效应。

图6是柱状图，显示了白藜芦醇和本发明实施方式的组合物

对分离并灌注后的大鼠心脏中冠脉流量的效应。

图7是柱状图，显示了白藜芦醇和本发明实施方式的组合物对分离并灌注后的大鼠心脏中左心室形成压（LVDP）的效应。

图8是柱状图，显示了白藜芦醇和本发明实施方式的组合物

对分离并灌注后的大鼠心脏中左心室形成压的最大一阶导数（LV[dP/dt]max）的效应。

图9是柱状图，显示了白藜芦醇和本发明实施方式的组合物对分离并灌注后的大鼠心脏中心肌梗塞面积的效应。

图10是柱状图，显示了白藜芦醇和本发明实施方式的组合物对分离并灌注后的大鼠心脏中心肌细胞凋亡的效应。

图11是曲线图，显示了白藜芦醇的毒物兴奋作用，其中将白藜芦醇剂量[x轴]针对心脏功能、梗塞面积和凋亡的值进行绘图。

图12是柱状图，显示了100mg/kg白藜芦醇和本发明实施方式的组合物

对分离的兔子心脏中心肌梗塞面积的效应。

图13A至13F是柱状图，比较了白藜芦醇和本发明实施方式的组合物

对分离并灌注后的大鼠心脏中主动脉流量（图13A）、分离并灌注后的大鼠心脏中冠脉流量（图13B）、分离并灌注后的大鼠心脏中左心室形成压（LVDP）（图13C）、分离并灌注后的大鼠心脏中左心室形成压的最大一阶导数（LV[dP/dt]max）（图13D）、分离并灌注后的大鼠心脏中心肌梗塞面积（图13E）和分离并灌注后的大鼠心脏中心肌细胞凋亡（图13F）的效应。

图14A和14B是箱须图（图14A）和谱图（图14B），比较了白藜芦醇和本发明实施方式的组合物

对总miRNA表达的效应。

图15A至15C是所有样品的散点图（图15A）、热图（图15B）和主分量分析（图15C），比较了白藜芦醇和本发明实施方式的组合物

对miRNA表达模式的效应。

图16A和16B是柱状图，比较了白藜芦醇和本发明实施方式的组合物

对ERK1/2（图16A）和p38 MAPK（图16B）磷酸化的效应。

图17A至17C是对Western印迹结果（下方）进行定量的柱状图（上方），描绘了对miR-20b的调节以及antagomiR-20b对VEGF的效应，Western印迹分析（图17A）、用antagomiR-20b预处理的样品的Western印迹分析（图17b）和Taqman实时PCR定量（图17C）。

图18A和18B是对Western印迹结果（下方）进行定量的柱状图（上方），描绘了对miR-20b的调节和antagomiR-20b对HIF-1a表达的效应，包括Western印迹分析（图18A）和用antagomiR-20B预处理时样品的Western印迹分析（图18B）。

图19是柱状图，比较了对于白藜芦醇和本发明实施方式的组合物而言的活性氧物质的细胞内定量。

具体实施方式

本发明实施方式涉及含有白藜芦醇的组合物，特别是含有白藜芦醇的膳食组合物（即，适合接受者口服摄取的组合物），并涉及利用这样的组合物进行治疗和/或预防的方法。

A.本发明实施方式的组合物

在优选实施方式中，所述组合物包含或基本上由以下组分组成：一种或多种包含反式白藜芦醇的植物提取物，金属螯合剂，和一种或多种其他抗氧化剂例如芹菜素、咖啡酸、EGCG、阿魏酸、槲皮素或维生素D。与单独的纯白藜芦醇相比，这些组合物表现出许多益处。优选的组合物包含白藜芦醇（优选地，组成剂量从约1mg/kg体重至约2g/kg体重（更优选从约1mg/kg体重至约5mg/kg体重）、螯合剂和抗氧化剂，并且也可以包含其他化合物例如乳化剂、糖胺聚糖等。

在优选实施方式中，所述组合物被计划用于人类，并包含或基本上由其量为约1.0至约5.0mg/kg体重、优选约1.5至约2.5mg/kg或约3至约4.5mg/kg患者的反式白藜芦醇和一种或多种以下组分组成：

（a）螯合剂，例如植酸，其量为约0.5至1.5、0.75至1.25mg/kg、或约1mg/kg患者；

（b）其他酚类抗氧化剂，例如其量为约0.05至2、约0.1至1.5、或约0.15至1mg/kg患者的槲皮素或阿魏酸，或其总量为约0.15至约6、约0.3至4.5、或约0.45至3mg/kg患者的槲皮素与阿魏酸二者；和

（c）其他抗氧化剂，例如维生素D，其量为约2.5至2500或约25至1250微克/千克患者。

在优选实施方式中，所述组合物包含白藜芦醇并作为

（Resveratrol Partners，LLC，San Dimas，CA）商业销售。四种不同的

制剂已经有售，每种均基本上由包含反式白藜芦醇的植物提取物、槲皮素二水合物和包含植酸的米糠提取物组成。

的每个剂量适合于每天一次施用于平均体重（例如70kg）的人类。第一代

组合物的每个剂量（例如一个胶囊）基本上由以下组分组成：5mg维生素E（作为混合的生育酚），共包含100mg反式白藜芦醇的215mg欧洲葡萄（Vitis vinifera）（法国红葡萄酒葡萄）与虎杖（Polygonum cuspidatum）（虎杖（giant knotweed））提取物混合物，25mg槲皮素二水合物，75mg包含植酸的米糠提取物，380mg包含阿魏酸的米糠油，和55mg葵花卵磷脂。第二代组合物的每个剂量（例如胶囊）基本上由以下组分组成：共包含100mg反式白藜芦醇的215mg欧洲葡萄（法国红葡萄酒葡萄）和虎杖提取物混合物，25mg槲皮素二水合物，75mg包含植酸的米糠提取物，和50mg阿魏酸盐。第三代

的每个剂量（例如两个胶囊）基本上由以下组分组成：包含100mg反式白藜芦醇的虎杖提取物，1000IU的胆钙化醇（维生素D3），槲皮素，和包含植酸的米糠提取物。作为LongevinexAdvantage^TM销售的第四代

的每个剂量（例如两个胶囊）基本上由以下组分组成：包含100mg反式白藜芦醇的虎杖提取物，1000IU的胆钙化醇（维生素D3），葡萄籽提取物，槲皮素，阿魏酸，可可提取物，叶黄素，绿茶提取物，包含植酸的米糠提取物，和玻尿酸。

白藜芦醇

白藜芦醇已被认为具有多种有益的生物效应（参见，例如美国专利No.7,345,178，其关于所公开的效应的列举纳入本文作为参考），包括防止或治疗心血管疾病；防止或治疗癌症；防止或治疗黄斑变性；减轻或防止与衰老有关的疾病以及其他病症和疾病，包括神经变性疾病例如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病的发生和严重度；以及抗炎活性。

白藜芦醇，亦称3,4',5三羟基芪，以顺式和反式立体异构形式天然存在。研究显示白藜芦醇是有生物活性的，提供了若干种健康益处，包括防癌、抗炎性质和心血管效应。为了使保持生物活性的时间“期限延长”，这种植物或合成来源的小分子优选在一定时间期限内保持生物活性，直至所述分子由于暴露于光、热或氧气而降解或分子异构化导致自然成为无生物活性。这些破坏性过程可能会出现在提取、囊封或储存期间。例如，白藜芦醇具有大约一天的半衰期；因此，它的生物活性通常在暴露于环境条件两天内以及在膳食增补剂的加工期间显著损失。优选地，用于本发明组合物的白藜芦醇完全或主要（例如，超过75、80、85、90或95%）是反式立体异构形式，即反式白藜芦醇。

可以化学合成白藜芦醇，或者更优选地，可以从植物来源提取白藜芦醇。白藜芦醇存在于分布在31个属和12个科之中的至少72种植物中。据发现含有白藜芦醇的所有科均属于种子植物门：葡萄科、桃金娘科、龙脑香科、莎草科、买麻藤科、豆科、松科、桑科、山毛榉科、百合科。白藜芦醇最常被报告在不可食用的植物中：藤，桉树，云杉，和热带落叶树总状花羊蹄甲（Bauhinia racemosa）、PterolobiumHexapetallum。白藜芦醇特别存在于葡萄皮和虎杖、可可和巧克力中。花生芽也是白藜芦醇的丰富来源。

在优选实施方式中，白藜芦醇是天然来源的，即来源于至少一种天然来源例如植物（或其部分，例如植物的块茎或果实（包括果肉和皮））。一个优选的来源是葡萄例如欧洲葡萄、美洲葡萄（Vitis labrusca）和圆叶葡萄（Vitis rotundifolia）的籽和/或皮。另一个优选的来源是蓼科（虎杖（Giant Knotweed）），并特别是虎杖（Polygonum cuspidatum）（虎杖（Giant Knotweed）的物种）。天然获取过程包括本技术领域中通常已知的那些过程，包括提取过程，其中使用溶剂从天然来源提取所述小分子。所述溶剂包括水性溶剂、有机溶剂，及其混合物。溶剂可以包括但不限于醇，例如乙醇。作为具体的实例，提取的材料可以包括植物（或其部分）、果汁（例如葡萄汁)、和从植物或果汁产生的发酵液（例如葡萄酒）、或任何前述项的混合物的水性溶剂或有机溶剂提取物。提取的材料还可以包括在提取过程期间天然提出的惰性植物材料。提取的材料可以被加工（物理和/或化学）以去除溶剂并增加所述小分子的浓度。例如，可以从提取物去除溶剂（例如通过干燥），留下干燥粉末。

在优选实施方式中，所述组合物包含或基本上由以下组分组成：包含反式白藜芦醇的植物提取物，例如来自欧洲葡萄、美洲葡萄或圆叶葡萄的植物（葡萄）提取物、来自蓼科物种的植物提取物、或葡萄提取物和/或蓼科提取物的组合。在优选实施方式中，所述组合物包含或基本上由葡萄提取物和蓼科提取物的混合物组成，所述葡萄提取物和蓼科提取物各自包含反式白藜芦醇。在本文中使用时，术语“提取物”或“植物提取物”具有它平常的含义，即通过用合适的溶剂或溶媒提出活性组分（例如反式白藜芦醇）而获得的植物的浓缩药物制剂，所述溶剂或溶媒被蒸发掉或以其它方式去除以产生植物提取物的残留物质。所述提取物可以被调节到规定的标准。因此，本技术领域的技术人员应理解，“提取物”或“植物提取物”不是简单的纯活性成分，而是含有来自源植物的次要材料，例如，取决于源植物，含有有机盐和无机盐、有机碱和有机酸、皂苷、多酚、丹宁、糖、多糖等。

在优选实施方式中，反式白藜芦醇在组合物中的存在量为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95重量%；或者以这些量中任何两个量之间的任何范围存在，例如在约10和30%之间，以小于或大于这些量中任何两个量的量存在，例如小于1 5%或大于75%，或以小于或等于、或者大于或等于这些量中任何两个量的量存在，例如小于或等于15%。在不同的优选实施方式中，反式白藜芦醇在组合物中的存在量为约5-50重量%、7.5-45重量%、10-40重量%、12.5-35重量%、15-30重量%、或20-25重量%。在另一种优选实施方式中，反式白藜芦醇在组合物中的存在量为约5-30重量%或10-20重量%。在不同的优选实施方式中，反式白藜芦醇在组合物中的存在量为约10-35重量%、12.5-30重量%、或15-25重量%，或者存在量为约15-35重量%或20-30重量%。

在优选实施方式中，反式白藜芦醇在组合物中的存在量被计算成提供一定的剂量，该剂量以相对于所述剂量将要施用的患者的每千克体重，反式白藜芦醇的毫克数表示，例如，存在量为约0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75或5mg反式白藜芦醇/千克患者，该存在量对于典型的70kg人类患者来说相当于约17.5、35、52.5、70、87.5、105、122.5、140、157.5、175、192.5、210、227.5、245、262.5、280、297.5、315、332.5、或350mg反式白藜芦醇的剂量。在另一种优选实施方式中，反式白藜芦醇在组合物中的存在量为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100mg反式白藜芦醇/千克患者，或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200mg反式白藜芦醇/千克患者。反式白藜芦醇也可以以这些量中任何两个量之间的任何范围存在，例如在约0.25和4mg/kg之间或在约26和33mg/kg之间；以小于这些量中任何量的量存在，例如小于约2.5mg/kg或50mg/kg；以小于或等于这些量中任何量的量存在，例如小于或等于约50mg/kg；以大于这些量中任何量的量存在，例如大于约1.25mg/kg或25mg/kg；或以大于或等于这些量中任何量的量存在，例如大于或等于约2.5mg/kg或100mg/kg。在优选实施方式中，反式白藜芦醇在组合物中的存在量为约1.5至约2.5mg/kg人类患者，或约3至约4.5mg/kg人类患者。

螯合剂

在本文中使用时，术语“螯合剂”是指与溶液中的游离金属离子结合并从溶液去除所述游离金属离子的有机化合物。合适的螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸（EDTA）、组氨酸、四环素家族的抗生素药物、吡哆醛2-氯苯甲酰腙、去铁胺、右雷佐生、地拉罗司、绿脓菌素（pyoverdine）、pseudan、柠檬酸盐、NDGA（去甲二氢愈创木酸：1,4-二[3,4-二羟基苯基]2,3-二甲基丁烷）、阿魏酸和植酸。优选地，本发明实施方式的组合物将提供约1g至约15g、更优选约2g至约12g的螯合剂组成剂量。

对于本发明实施方式的目的而言，植酸是特别优选的螯合剂。在本文中使用时，术语“植酸”是指肌醇六磷酸（（2,3,4,5,6-五磷酰氧基环己基）二氢磷酸酯；亦称“IP6”）。植酸在完整的谷粒、谷物、豆、坚果和种子中大量存在，并且是发芽植物的主要能源。植酸和它的低级磷酸化形式（例如IP3）也存在于大多数哺乳动物细胞中，它们在所述哺乳动物细胞中协助调节多种重要的细胞功能。植酸优选以包含植酸的米糠提取物的形式提供。据报告，植酸通过螯合二阶阳离子例如铜和铁，从而防止产生造成细胞损伤和致癌的活性氧物质，来起到抗氧化剂的作用。植酸（例如，作为来源于米糠的提取物）的优选组成剂量在200-12,000mg/天、更优选约250-2500mg/天的范围内。

植酸还被认为降低了在肿瘤细胞中充当生长因子的金属矿物质的可利用性，并被认为是钙结晶的抑制剂。它还被认为起到中性粒细胞的引发剂（priming agent）和活力剂（motility agent）的作用。另外，已经发现植酸有神经保护性，并因此减轻与神经变性疾病（特别是帕金森氏病、躯干前曲症和阿尔茨海默氏病）有关的病症的严重度。本发明组合物的组分被认为增强了这种神经保护性。

螯合剂可以是天然或合成来源的，可以包括但不限于合成螯合剂例如去铁胺、EDTA、和d-青霉胺，或天然螯合剂例如乳铁蛋白、肌醇六磷酸（IP6）、槲皮素、儿茶素、阿魏酸、姜黄素、鞣花酸、羟基酪醇、花色素等。

在优选实施方式中，螯合剂在组合物中的存在量为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95重量%，或者存在量为约0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75或5mg螯合剂/千克患者；或者以这些量中任何两个量之间的任何范围存在，以小于或大于这些量中任何两个量的量存在，或以小于或等于、或大于或等于这些量中任何两个量的量存在。在优选实施方式中，螯合剂在组合物中的存在量为约10至35%、15至30%、20至30%、或17.5至27.5%，或者存在量为约0.5至1.5mg/kg患者、0.75至1.25mg/kg患者、或约1mg/kg患者。

其他抗氧化剂

组合物中可以添加其他抗氧化剂，例如酚类抗氧化剂或维生素D。其他酚类抗氧化剂可以是例如槲皮素、阿魏酸、紫铆因、非瑟酮、杨梅素、堪非醇、顺式白藜芦醇或白皮杉醇。所述抗氧化剂被认为通过抑制白藜芦醇葡萄糖醛酸化来提供改善的白藜芦醇生物利用度，并且还与白藜芦醇协同作用或独立于白藜芦醇而起作用以提供有益功能。

其他酚类抗氧化剂可以属于许多化学类别的酚类抗氧化剂化合物，例如查尔酮（例如紫铆因）、类黄酮、羟基肉桂酸和芪类（例如顺式白藜芦醇，白皮杉醇）。类黄酮是一大类酚类化合物，包括黄烷醇（2-苯基-3,4-二氢-2H-色烯-3-醇，例如儿茶素和表儿茶素）、黄酮（2-苯基色烯-4-酮，例如芹菜素）和黄酮醇（3-羟基-2-苯基色烯-4-酮，例如槲皮素）。

在一种实施方式中，其他酚类抗氧化剂包含抗氧化剂查尔酮例如紫铆因或由其组成。在另一种实施方式中，其他酚类抗氧化剂包含羟基肉桂酸或由其组成，所述羟基肉桂酸选自咖啡酸、菊苣酸、绿原酸、咖啡酰酒石酸、香豆酸、香豆酰酒石酸（coutaric acid）、双阿魏酸、阿魏酰酒石酸（fertaric acid）和阿魏酸，或其组合。在优选实施方式中，其他酚类抗氧化剂包含咖啡酸和阿魏酸的组合或由其组成。在又一种实施方式中，其他酚类抗氧化剂包含芪类或由其组成，所述芪类选自顺式白藜芦醇和白皮杉醇。

在另一种实施方式中，其他酚类抗氧化剂包含黄烷醇或由其组成，所述黄烷醇选自儿茶素（C）、儿茶素3-没食子酸酯（CG）、表儿茶素（EC）、表儿茶素3-没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素3-没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素（GC）和没食子儿茶素3-没食子酸酯（GCG），或其组合。在优选实施方式中，其他酚类抗氧化剂包含表没食子儿茶素3-没食子酸酯（EGCG）或由其组成。在另一种实施方式中，其他酚类抗氧化剂包含黄酮或由其组成，所述黄酮选自芹菜素、黄芩素、白杨素、香叶木甙、毛地黄黄酮、野黄芩素、红桔素和汉黄芩素，或其组合。在优选实施方式中，其他酚类抗氧化剂包含芹菜素或由其组成。在又一种实施方式中，其他酚类抗氧化剂包含黄酮醇或由其组成，所述黄酮醇选自槲皮素、堪非醇、杨梅素、非瑟酮、异鼠李素、藿香黄酮醇、和鼠李金，或其组合。在优选实施方式中，其他酚类抗氧化剂包含槲皮素或由其组成。

其他酚类抗氧化剂还可以包含酚类抗氧化剂的组合例如一种或多种类黄酮与一种或多种羟基肉桂酸的组合等，或由所述组合组成。在一种实施方式中，其他酚类抗氧化剂包含芹菜素、咖啡酸、EGCG、阿魏酸和槲皮素的组合或由该组合组成。

在优选实施方式中，一种或多种其他酚类抗氧化剂在组合物中的存在量为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95重量%，或者存在量为约0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75或5mg其他酚类抗氧化剂/千克患者；或者以这些量中任何两个量之间的任何范围存在，以小于或大于这些量中任何两个量的量存在，或以小于或等于、或大于或等于这些量中任何两个量的量存在。在优选实施方式中，所述一种或多种其他酚类抗氧化剂在组合物中的存在量为约1至25%、2.5至20%、5至15%、或7.5至12.5%，或者存在量为约5-10%，或者存在量为约0.05至2、约0.1至1.5、或约0.15至1mg/kg患者，或者存在量为约0.15至约6、约0.3至4.5、或约0.45至3mg/kg患者。

非酚类抗氧化剂例如维生素D也可以存在于组合物中。在本文中使用时，术语“维生素D”是指脂溶性激素原。维生素D的两种主要形式是维生素D₂（麦角钙化醇）和维生素D₃（胆钙化醇）（DeLuca,H.F.等（1998）Nutr.Rev.56:S4-S10）。维生素D表现出许多生物作用。虽然维生素D防止骨病（发育中儿童的软骨病，年长成人的骨质疏松症）的能力是众所周知的，但它也正成为与癌症战斗的核心作用者。关于维生素D在免疫和癌症中的作用，维生素D改善了趋化性中性粒细胞的调动和迁移（中性粒细胞调动和迁移的倾向性）。据观察，由于维生素D缺乏而患有软骨病的患者具有不能恰当迁移的行动缓慢的中性粒细胞。维生素D刺激单核细胞成熟为巨噬细胞。这导致用于攻击肿瘤的免疫战斗细胞队伍的壮大。维生素D是在商业上广泛可得的，并且这类制品适合本发明实施方式的目的。

维生素D对最优的肌肉、骨、大脑、免疫和心血管健康而言是必不可少的，并正在经受由全世界的衰老研究者进行的重新发现。据显示，维生素D补充至多达2000IU显著降低死亡率，因此将维生素D添加到现在被认为是真正的长寿因素的分子阵容中（Autier,P.等（2007）Arch Intern Med.167（16）:1730-1737）。它的抗钙化性质（Zittermann,A.等（2007）Curr.Opin.Lipidology 18（1）:41-46）使维生素D有资格作为另一种有效力的药剂来抑制人体中随着年龄增长进行性的过度矿化，并与本发明实施方式的组合物中其他无机螯合剂的作用相似。虽然1200IU剂量比推荐的每日允许量（Recommended Daily Allowance）多三倍，但它完全在国家科学院（National Academy of Sciences）确定的安全上限（2000IU）之内，并与最近在人类临床试验中发现有益的补充剂量相当（Lappe,J.M.等（2007）Amer.J.Clin.Nutr.85（6）:1586-1591）。2,000IU的剂量大致等于在南纬中午时分全身暴露于夏季日光15-30分钟所产生的天然维生素D3，据报告，这种剂量没有副作用。优选地，本发明实施方式的组合物将提供约100IU至约100,000IU、更优选约1,000IU至约50,000IU的维生素D组成剂量。

维生素D3作为模拟对生物应激物太阳辐射发生响应的药剂起作用。具体地，维生素D3上调参与激活免疫系统、特别是中性粒细胞的数目和运动性的保护性基因，并有助于克服内源性维生素D3的生产随着年龄增长由于皮肤变厚而引起的减退，所述皮肤变厚降低了维生素D的日光/皮肤生产。此外，维生素D3发挥协同作用，使IP6降解为被认为是主要活性分子的IP3。白藜芦醇还发挥协同作用，使细胞对维生素D3敏感化（使细胞表面上的维生素D受体敏感化）。维生素D起到将IP6降解为其主要活性形式IP3的作用。维生素D还被认为起到免疫系统增强剂的作用，提高了人类中的先天免疫。以这种能力，维生素D已经在实验中显示出具有重要的防止癌症和治愈癌症的性质。白藜芦醇增加细胞表面上维生素D受体的敏感性，因此被认为起到维生素D增强剂和抗癌剂的作用。白藜芦醇上调健康和癌细胞表面上的维生素D受体，并使癌细胞对维生素D敏感化。白藜芦醇还被认为是单胺氧化酶抑制剂（MAO抑制剂）。

在优选实施方式中，维生素D在组合物中的存在量为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95重量%，或者存在量为约0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75或5微克（μg）维生素D/千克患者，或者存在量为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000微克（μg）维生素D/千克患者。维生素D的存在量也可以是约50-150,000IU、约100-100,000IU、或约1000至50,000IU，其中1微克（μg）维生素D等于40IU。维生素D也可以以这些量中任何两个量之间的任何范围存在，以小于或大于这些量中任何两个量的量存在，或者以小于或等于、或大于或等于这些量中任何两个量的量存在。在优选实施方式中，维生素D在组合物中的存在量为约2.5至2500微克/千克患者，或约25至1250微克/千克患者。

糖胺聚糖

所述组合物可以包含构建胶原的营养素（例如，维生素C-抗坏血酸、赖氨酸、脯氨酸等）、和/或糖胺聚糖例如短（低分子量）链的透明质酸（HA）或其单一组分（葡萄糖胺，葡糖醛酸）或硫酸软骨素，它们是担任软骨的结构组分的线性二糖（糖样分子），但是以这种组合在活细胞周围的非细胞（结缔）组织中担任协同性的共同修复剂。构建胶原的营养素促进在细胞内基础上起作用的胶原和小分子的产生。

在本文中使用时，术语“透明质酸”（亦称玻尿酸）是指由D-葡糖醛酸和D-N-乙酰基葡萄糖胺经由交替的β-1,4和β-1,3糖苷键连接在一起的重复二糖组成的线性聚合物（[-β(1,4)-GlcUA-β(1,3)-GlcNAc-]n）。透明质酸的长度可以是25,000个二糖重复（n）。透明质酸是保水分子，在人体中天然产生，但是随着身体衰老，量逐渐减少。透明质酸是多功能的糖胺聚糖，形成了细胞的细胞外周基质的基础。透明质酸由3种不同但是相关的酶合成。美国专利申请公布2004/0234497公开了透明质酸用于癌症药物递送的应用。该公布的全部公开内容纳入本文作为参考。传统上已从公鸡冠、从牛或鱼玻璃体液、从微生物生产或从其他来源提取到透明质酸。最优选地，本发明实施方式的透明质酸从公鸡冠获得。透明质酸是在商业上广泛可得的，并且这类制品适合本发明实施方式的目的。优选地，本发明实施方式的组合物将提供约1mg至约400mg、更优选约50mg至约200mg的透明质酸组成剂量。

透明质酸是人体的水胶凝分子，起到人体的骨架和水化剂的作用。随着衰老的进展，产生的透明质酸减少，导致皮肤起皱、头发变稀、关节不润滑。本发明组合物的螯合剂也有助于保留体内的透明质酸。透明质酸组分和无机螯合组分（例如白藜芦醇、槲皮素、植酸IP6、阿魏酸盐）作为总的抗衰老策略起作用，以保持细胞和结缔组织内的年轻功能。透明质酸被认为对癌细胞具有亲和性。认为它担任血液循环中的递送和靶向（药物递送剂）分子并解决结缔组织的衰老。细胞之间结缔组织的萎陷和完整性丧失提供了衰老的迹象（例如皮肤起皱，头发变稀，关节僵硬，身材丧失等）。向本发明组合物添加透明质酸被认为激活了人体中的成纤维细胞以产生额外的透明质酸，因此起到保持结缔组织（胶原）处于年轻状态的作用。

在优选实施方式中，一种或多种糖胺聚糖在组合物中的存在量为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95重量%，或者存在量为约0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75、5、5.25、5.5、5.75、6、6.25、6.5、6.75、7、7.25、7.5、7.75、8、8.25、8.5、8.75、9、9.25、9.5、9.75或10mg糖胺聚糖/千克患者；或者以这些量中任何两个量之间的任何范围存在，以小于或大于这些量中任何两个量的量存在，或者以小于或等于、或大于或等于这些量中任何两个量的量存在。在优选实施方式中，所述一种或多种糖胺聚糖在组合物中的存在量为约0.25至4、0.5至3.75、或0.75至3.5mg/kg患者。

其他组分

本发明实施方式的组合物可以含有其他组分，包括起到增强白藜芦醇生物活性的作用的其他活性组分和非活性化合物（例如香料，甜味剂，染料，维生素，氨基酸（例如赖氨酸、脯氨酸等），矿物质，营养素等）。例如，生育酚如维生素E、葵花卵磷脂、葡萄籽提取物、可可提取物、叶黄素和绿茶提取物在某些实施方式中是优选的其他组分。乳化剂、填充剂、粘合剂等也可以被包含在本发明实施方式的组合物中。

本发明实施方式的组合被计划作为膳食增补剂用于人类或动物口服摄取。例如，这样的组合物可以在膳食增补剂中包含白藜芦醇和玻尿酸的组合，所述膳食增补剂起到医治包括一些癌症在内的多种疾病的作用。已知白藜芦醇是抗癌分子并具有其他医治和提高寿命的性质。玻尿酸（透明质酸，HA）作为口服的增补剂服用或者可以静脉内给予以靶向癌细胞。当与其他分子组合或连接时，玻尿酸会将其他抗癌和医治剂如白藜芦醇递送到肿瘤部位。所述组合可以包括或可以不包括螯合剂、抗氧化剂和/或乳化剂。当被囊封或以其它方式一起应用时，有或者没有那些添加剂，白藜芦醇和HA都对动物和人类具有强大的医治性质。

最优选地，本发明实施方式的组合物稳定白藜芦醇比活度，致使所述组合物的白藜芦醇的比活度大于在氧气存在下保持的或者在没有螯合剂、透明质酸或维生素D下保持的白藜芦醇比活度。优选地，所述组合物的非白藜芦醇组分的量会稳定所述组合物的白藜芦醇，使得它表现出比在氧气存在下保持的或在没有螯合剂、透明质酸或维生素D下保持的白藜芦醇活性多至少10%的活性、多至少20%的活性、多至少50%的活性、至少2倍的活性、至少5倍的活性、或至少10倍的活性，因此它在环境温度和湿度条件下（即不需要针对温度或湿度的专门防范措施），在延长的时间（例如1、2、4、6、10、12、18、24或36个月或更长）中，仍然能够表现出这样的比活度。

在优选实施方式中，所述组合物包含或基本上由一种或多种含有反式白藜芦醇的植物提取物和一种或多种以下组分组成：螯合剂例如植酸；一种或多种其他酚类抗氧化剂例如槲皮素或阿魏酸（阿魏酸盐）；和维生素D。与单独的纯白藜芦醇相比，这些组合物表现出许多益处。在下面实施例6中详细说明的一个具体益处是本发明组合物没有表现出白藜芦醇特征性的毒物兴奋作用（hormetic action）（剂量-响应关系，其在低剂量下是刺激性的，但是在较高剂量下是有害的，导致J形或反U形剂量响应曲线）。相反，本发明组合物具有L形剂量响应曲线，这意味着它们即使在高剂量时也是安全的（无毒）。

优选的组合物包含白藜芦醇（优选地，组成剂量从约10mg至约2g，更优选从约100mg至约500mg）、以及至少一种选自螯合剂、糖胺聚糖（例如透明质酸）和维生素D的化合物，并且也可以包含其他化合物例如抗氧化剂、乳化剂等。

B.治疗方法

施用本发明的组合物可以是出于“预防”或“治疗”目的。如果本发明的组合物的施用量具有对疾病的实际症候提供治疗的生理学意义，则本发明的组合物被认为是出于“治疗”目的而施用的。当治疗性提供时，优选在鉴定到实际疾病的症状之时（或之后不久）提供所述组合物。化合物的治疗性施用起到减轻这种疾病的严重度或逆转其进展的作用。如果本发明的组合物的施用量具有对潜在的疾病或病症提供治疗的生理学意义，例如降低心脏病发作的风险、保持健康、保持年轻的外表、保持功能（例如保持某个水平的视觉灵敏度）等，则本发明的组合物被认为是出于“预防”目的而施用的。当预防性提供时，优选在其任何症状之前提供所述组合物。预防性施用组合物起到防止或减轻疾病的任何后续进展的作用。

提供疗法或“治疗”是指在治疗或改善损伤、病理或病症方面的任何成功迹象，包括任何客观或主观参数例如减轻、缓和、减少症状或使得损伤、病理或病症对于患者更可耐受；减缓变性或衰退的速率；使得变性的最终点较少使人虚弱；或改善患者的身体或精神健康。症状的治疗或改善可以是基于客观或主观参数，包括体检结果、神经精神病学检查、和/或实验室方法。

优选的治疗对象包括动物，最优选哺乳动物物种，例如人类和家畜例如狗、猫等，所述对象患有疾病及其他病理状况。“患者”是指对象，优选哺乳动物（包括人类）。在优选实施方式中，对象或患者是人类，在更优选的实施方式中，对象或患者是患有心血管疾病、癌症、黄斑变性、衰老、神经变性疾病（例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等）和炎症中的一种或多种或具有发展出前述疾病的风险的人类。

本发明的组合物有多种施用途径可用。所选择的具体方式当然将取决于所选择的具体治疗剂、所述施用是否用于防止、诊断或治疗疾病、正在治疗的医学病症的严重度、和疗效所需的剂量。可以利用医学上可接受的并产生有效的活性化合物水平而不引起临床不可接受的不良作用的任何施用方式来实践本发明实施方式的方法。这样的施用方式包括但不限于口服、口腔、舌下、吸入、粘膜、直肠、鼻内、局部、眼、眼周、眼内、经皮、皮下、动脉内、静脉内、肌内、胃肠外或输注方法。在优选实施方式中，施用是口服的。

对治疗和预防用途有效的剂量安排和量，即“给药方案”，将取决于多种因素，包括疾病或病症的阶段、疾病或病症的严重度、患者的一般健康状态、患者的身体状态、年龄等。在计算患者的给药方案中，施用方式也要加以考虑。给药方案还要考虑本技术领域众所周知的药代动力学参数，即吸收速率、生物利用度、代谢、清除率等（参见，例如，Hidalgo-Aragones(1996)J.Steroid Biochem.Mol.Biol.58:611-617；Groning(1996)Pharmazie 51:337-341；Fotherby(1996)Contraception 54:59-69；Johnson(1995)J.Pharm.Sci.84:1144-1146；Rohatagi(1995)Pharmazie 50:610-613；Brophy(1983)Eur.J.Clin.Pharmacol.24:103-108）。现有技术允许临床医生针对每个个体患者、治疗剂和所治疗的疾病或病症来确定给药方案。可以根据所需要的和患者耐受的剂量和频率，来实施单次或多次施用本发明的组合物。预防性和治疗性治疗的时程将根据所治疗的具体疾病或病症而异。一些疾病适合于急性治疗，而其他需要长期治疗。

本发明实施方式的组合物可以单独施用于对象，或施用于正接受或将接受另一种药物或医学疗法的对象。例如，在优选实施方式中，本发明实施方式的组合物与干细胞疗法或对黄斑变性或黄斑营养不良的治疗一起共同施用于对象。共同施用可以是同时、顺次、同时期、或任何其他合适的方式。

在优选实施方式中，所述施用或共同施用向对象提供了比单独由白藜芦醇、单独由卡路里限制、或单独由另一种药物或医学疗法（例如干细胞疗法或者对黄斑变性或黄斑营养不良的治疗）达到的治疗或预防益处高至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍或大于7倍的治疗或预防益处。在另一种优选实施方式中，所述共同施用向对象提供了比单独由白藜芦醇、单独由卡路里限制、或单独由干细胞疗法或者对黄斑变性或黄斑营养不良的治疗所达到的治疗或预防益处高至少125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%或大于500%的治疗或预防益处。

这些实施方式的组合物提高了白藜芦醇的比活度。因此，本发明实施方式的组合物可有效用于治疗或预防其中需要调节“生存/长寿”基因和/或“诱导损伤的”基因的表达的疾病（或改善疾病症状）例如心血管疾病、癌症、黄斑变性、衰老、神经变性疾病（例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等）和炎症。当矿物质例如钙和铁随着时间推移蓄积在人体中时，基因以有害的方式进行响应。Liu,Y.等(2005)Ann.Clin.Lab.Sci.35(3):230-239；Templeton,D.M.等(2003)Biochim.Biophys.Acta.1619(2):113-124；Ikeda,H.等(1992)Hepatology15(2):282-287。本发明实施方式在治疗黄斑变性、癌症和衰老病症中具有特别的效用。

其他实施方式提供了改善与个体的现有疾病有关的症状或者在个体中的疾病发生之前防止个体中的症状发作的方法，所述方法包括向所述个体施用含有白藜芦醇的组合物，相对于单独的白藜芦醇或卡路里限制，所述含有白藜芦醇的组合物调节生存/长寿基因的产物或其表达增强细胞损伤的基因的产物的浓度或活性，其中白藜芦醇的提供量有效引起对改善疾病症状的基因的浓度或活性的调节，并且其中所述疾病选自：心血管疾病、癌症、黄斑变性、与衰老有关的疾病、和炎症。所述实施方式还提供了这样的方法，其中所述疾病是癌症、或与衰老有关的疾病（特别是神经变性疾病）。

干细胞相关方法

在一种优选实施方式中，本发明实施方式的组合物与细胞植入或移植疗法例如干细胞植入或注入一起共同施用于对象。所述细胞可以是干细胞或干细胞衍生的细胞，例如人类胚胎干细胞、或成体干细胞例如骨髓干细胞、心脏干细胞、内皮干细胞、造血干细胞、乳腺干细胞、间充质干细胞、神经嵴干细胞、神经干细胞、嗅觉成体干细胞、睾丸干细胞、和非常小的胚胎样“VSEL”干细胞、或其组合，或者从任何前述项衍生的细胞。在优选实施方式中，移植细胞选自心脏干细胞、神经干细胞、和视网膜色素上皮（RPE）细胞。

在这类细胞移植相关的实施方式中可以显示的治疗益处包括一种或多种选自改善干细胞分化、改善细胞粘附、改善细胞存活、改善细胞增殖及其组合的益处。

干细胞被视为人体中所有新生细胞的起源。干细胞植入被认为在损伤组织再生中具有益处，所述损伤组织特别是由梗塞或创伤损伤的大脑或心脏组织、或没有正常表现出快速细胞更新和更替的组织。Chacko等，Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.2009396(5):H1263-73；Wakabayashi等，J.Neurosci.Res.201088(5):1017-25。

已知，干细胞植入在例如心脏病发作之后的损伤组织再生中只表现出有限或适中的益处，而且用注入的干细胞处理的动物经常在干细胞植入的数周内进展成心衰。Assmus等，New England J.Med.2006355(12):1222-32；Shake等；Ann.Thorac.Surg.200273(6):1919-25。然而，在缺氧（缺血）的心脏组织中注入干细胞所表现出的短期死亡率看起来确实降低。Assmus等，Circ.Res.2007100(8):1234-41。

还已知，植入的干细胞必须粘附于现有的细胞基质以促进组织再生，而且自由基损害干细胞的组织粘附。Song等，Stem Cells 201028(3):555-63。此外，自由基抑制干细胞分化成所需的细胞（例如心肌、大脑神经元等），并且已经证明抗氧化剂提高干细胞分化。参考同上。

已经证明，抗氧化剂减少自由基并在植入期间和植入之后提高干细胞粘附和干细胞存活。Song等，Stem Cells 2010 28(3):555-63；Rodriguez-Porcel等，Mol.Imaging Biol.2010 12（3）:325-34；Kashiwa等，Tissue Eng.Part A.2010 16（1）:91-100。还已知，白藜芦醇，一种小分子，增强内源性抗氧化剂例如谷胱甘肽、超氧化物歧化酶（特别是锰型SOD）过氧化氢酶的活性，并上调干细胞本身的合成。Kao等Stem Cells Dev.2010 19(2):247-58。

在动物中已经证明，口服施用的白藜芦醇在相对低剂量浓度（2.5毫克/千克体重，175毫克/160磅人类）下就有助于保持还原的细胞环境（自由基活性较低），从而导致干细胞存活提高和心脏功能（射血分数等）增强。Gurusamy等，J.Cell.and Mol.Medicine 14(9):2235-39(2010)。特别是，Gurusamy等报告了在将心脏干细胞注入到心肌中之前，用低剂量白藜芦醇预处理大鼠两周，显著改善了心脏功能参数，例如左心室射血分数和缩短分数。正如由干细胞分化成心肌再生所证明的，预处理还提高了干细胞存活和增殖。

根据本发明的优选实施方式，将小分子抗氧化剂的基质与其他小分子和维生素D3组合，并进行口服施用以保持植入之后的干细胞。具体而言，小分子口服抗氧化剂的基质包括但不限于白藜芦醇。将这种基质与其他小分子例如槲皮素、IP6植酸酯（肌醇六磷酸）、阿魏酸、EGCG（绿茶）、咖啡酸、芹菜素相组合，并联合维生素/激素维生素D3。这种组合在保持植入之后的干细胞方面发挥了意想不到的协同能力，超过并超越了个体成分的预期相加性质。

剂量浓度低于根据现有技术实验认为是必需的浓度，从而证实组合的组分产生了协同作用。例如，在所述组合中白藜芦醇的剂量范围是大约1.0毫克至大约5.0毫克/千克体重，所有分子的总剂量浓度是大约1.0毫克g至大约5.0毫克/千克体重。施用这种混合物的结果包括更高的基因组响应、和改善的组织功能（即心肌活性–射血分数），等于或大于在以前的实验中已经表现出的结果。优选将组分的混合物提供成胶囊，但是可以是丸剂、片剂或液体形式。

黄斑变性

在美国，过去的几十年中人类寿命的延长引起了年龄相关的眼病——黄斑变性的增长。虽然没有导致视力完全丧失，但该疾病剥夺了老年成人用来阅读的中心视力以及色觉。黄斑变性影响眼睛的被称为黄斑的视中心。黄斑是视网膜的一部分，色觉细胞（视锥）位于其中。

在优选实施方式中，将本发明实施方式的组合物与一种或多种黄斑变性或黄斑营养不良的治疗共同施用于对象，所述治疗选自抗血管生成药物（例如乙酸阿奈可他、贝伐单抗、贝伐西尼、哌加他尼钠、雷珠单抗等）、抗脉络膜疣药物（例如，ARC1905、克帕松、艾库组单抗、芬维A胺、RN6G等）、在眼睛中植入微型望远镜、激光凝固、光动力疗法、或施用另一种疗法例如前列地尔、AREDS2、皮质植入物、黄斑移位术、微电刺激、NT-501、光生物调节、辐射疗法、视网膜植入物或移植物、净化疗法（rheopheresis）、细胞移植（例如RPE细胞移植、干细胞移植等）、黄斑下手术，或其组合。

在这种黄斑相关的实施方式中可能显示的治疗益处包括一种或多种选自下列的益处：保持或改善视力（例如视觉灵敏度），缩小视力缺陷或停止视力缺陷的扩大，节用中心黄斑中的细胞，容许黄斑周围或相邻组织发挥正常功能，减少眼睛中脉络膜疣或β-淀粉样蛋白的量或防止眼睛中脉络膜疣或β-淀粉样蛋白的量增加，改善或增加到达眼睛（特别是黄斑和视网膜）的血流，抑制血管生长和渗漏（例如血管生成），抑制瘢痕形成，改善视网膜功能，防止或减慢黄斑变性，防止或减慢细胞特别是视网膜细胞的死亡，减少或消除眼睛病变（例如地图状萎缩病变），及其组合。

黄斑变性是进行性的、年龄相关的疾病，它可以分为四个阶段。在第一阶段，在生命的大约第三个十年开始，被称为视网膜色素上皮细胞（RPE）的“垃圾清洁”细胞不能吞没和去除眼睛后面的细胞碎片，导致形成称为脂褐质的小的微观沉积物。脂褐质由铁和铜诱导的细胞碎片氧化形成，它的蓄积与生物体的过早衰老和寿命缩短相关。黄斑变性的发病率在高加索人中比深色皮肤的人高，并且高加索人的视网膜中有更多的脂褐质沉积物。视网膜中这种细胞碎片的一部分由人眼中每天早上从夜视力（视杆）细胞脱落的用弃的维生素A组成。由于铁和钙蓄积在RPE内，导致所述RPE细胞不能发挥功能。在第二阶段，在生命的大约第五个十年中，位于RPE和供血层（脉络膜）之间的下层的玻璃纸样薄的视网膜层、称为Bruch膜，出现进行性钙化。虽然在视网膜内形成的脉络膜疣部分由胆固醇组成，但这种脂质并非来源于血液循环或产生大部分胆固醇的肝脏。Bruch膜内的钙化进一步削弱了脂质（脂肪）、蛋白质和细胞碎片从感光细胞层离开，导致在视网膜上形成被称为脉络膜疣的黄色斑点。在眼科检查期间用检眼镜可以观察到脉络膜疣。目前没有去除脉络膜疣的方法。

RPE细胞的死亡是这种进行性疾病的第三阶段。这有时被称为RPE失落（RPE dropout）。因为RPE细胞受损或死亡，并且Bruch膜被钙阻塞，则感光细胞得不到滋养并也开始相继死亡。当前对1-3阶段的黄斑变性没有治疗方法。1-3阶段被称作黄斑变性的“干性”形式，因为它没有引起出血或水肿或新血管形成。大约85%的黄斑变性患者有这种疾病的“干性”形式。在第四阶段，因为Bruch膜出现破裂或Bruch膜变得完全钙化，因此，感光细胞层缺氧并且形成了新的血管（称为新生血管化），这可以侵入黄斑中的感光细胞层并损害视力；或者可能有血清渗漏或红血球的直接释放，导致水肿或出血。这是黄斑变性更晚期并且危及视力的形式，经常被称为“湿性”黄斑变性，因为出现血清或红血球渗漏到感光细胞层。疾病的这个阶段，如果及早发现，可以用激光束进行治疗，激光束可以密封住渗漏的血管。然而，这种治疗只对延迟疾病进展有效，而不能治愈该疾病。

在一生时间中，由溶酶体促进的细胞清洁过程跟不上代谢废物的蓄积。视杆细胞密度最高并且因此脱落了更多的用弃的维生素A斑块的中心窝旁环是黄斑变性开始的地方，并且是在视网膜中观察到脂褐质浓度最高的地方。最后，RPE细胞随着年龄增长相继死亡，这增加了剩余的RPE细胞维持健康视网膜的负担。

在过去，脂褐质被认为是细胞代谢的无害且损耗性副产物。本发明实施方式的一个方面涉及下面这个认识：由铁和铜诱导的氧化形成的并在视网膜色素上皮细胞内的溶酶体内硬化的脂褐质，使视网膜对轻量辐射和氧化的损伤敏感化。随着年龄增长，视网膜变得对蓝光损伤日益敏感。视网膜内脉络膜疣的形成与RPE细胞不能生产内源性抗氧化酶——超氧化物歧化酶有关。超氧化物歧化酶缺陷小鼠产生人类中年龄相关的黄斑变性的典型特征。超氧化物歧化酶保护视网膜细胞抵御非结合的（游离）铁。高铁饮食和细胞环境已经显示出降低超氧化物歧化酶活性。

视网膜感光细胞和视网膜色素上皮细胞被认为特别容易受到由铁的低分子量复合物引起的损伤。因为血液循环中的抗氧化剂可能未必总是能够穿过血液-视网膜屏障，所以视网膜产生了它自己的与铁结合的保护性抗氧化剂。铁螯合剂抑制了非结合的（游离）铁（没有与蛋白质结合）的不良作用。血红素加氧酶也以与铁螯合剂类似的方式发挥作用，以防止由自由的铁引起的视网膜损伤。

许多药剂已被实验性地用于清除脂褐质和脉络膜疣。通常用来降低血清胆固醇水平的他汀类药物也已被检验出可防止动物中的脂褐质沉积物。他汀类药物减少脂褐质形成，但是对肝脏有毒性，并且导致这些动物早期死亡。吡拉西坦是神经递质GABA的衍生物，现在可用作膳食增补剂，它已被成功用于减少脑组织中脂褐质形成。索比尼尔是酶抑制药物（醛糖（aklose）还原酶抑制剂），在1990年代，它在防止与糖尿病有关的视网膜问题方面经历过不成功的人类试验。索比尼尔已经显示出部分减少啮齿动物的视网膜色素上皮细胞细胞中的脂褐质沉积物。海特琴是用来治疗老年性痴呆的药物。在啮齿动物研究中，据报告，海特琴减低了大脑的脂褐质水平，但也导致动物的早期死亡。东印度香料姜黄含有被称为姜黄素的抗氧化分子。姜黄素已在实验性小鼠研究中用于减少大脑中的脂褐质。马齿苋是一种富含镁、β胡萝卜素和ω-3油的开花植物。据显示，向小鼠提供马齿苋减少了小鼠大脑中脂褐质沉积。在实验皿研究中，1992年在穿甘蓝和花椰菜中发现的抗氧化分子，莱菔硫烷，已被成功用于减少暴露于蓝光的RPE细胞中的脂褐质沉积物。

向老年大鼠腹膜内施用硫辛酸在大脑的皮层、小脑、纹状体、海马和下丘脑中分别引起脂褐质和酶活性的减少和升高。这些结果提示，天然代谢的抗氧化剂硫辛酸作为在防止老年个体神经元功能障碍方面的治疗工具应该是有用的。硫辛酸是活组织内产生的天然抗氧化剂，并也可用作膳食增补剂，据显示，它在实验皿研究中保护RPE细胞免于氧化性损伤。

在饮酒之后，脑组织中脂褐质形成急剧增加。补充高剂量葡萄籽黄酮醇防止了脂褐质形成增加。脂褐质是在饮酒之后急剧增加的脂质过氧化的终端产物。乌龙茶和绿茶饮料在小鼠中逆转认知损害和脂褐质形成。表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）是绿茶的主要组分，在实验皿研究中上调血红素加氧酶的活性。血红素加氧酶是对抗发生在视网膜中的铁诱导性氧化的保护酶。已经显示，提供补充性雌激素减少了脑组织中脂褐质沉积。在实验皿研究中，向RPE细胞提供叶黄素和玉米黄质减少脂褐质形成。在给予补充的乙酰基-L-肉毒碱的啮齿动物中，已经测出脑细胞中脂褐质沉积物减少。

US专利No.5,747,536描述了L-肉毒碱、低级烷酰基L-肉毒碱或其药理可接受的盐与白藜芦醇、白藜芦醇衍生物或含有白藜芦醇的天然产物，在生产用于预防和治疗心血管疾病、外周血管病和外周性糖尿病性神经病变的药物中的联合治疗应用。黑色素是视网膜中铁结合性抗氧化剂。随着视网膜中黑色素水平因年龄增长而减退，脂褐质的蓄积更高。

在一种实施方式中，本发明实施方式涉及组合物，所述组合物包含下列组分的组合：（a）金属例如铁、铜、重金属的螯合剂，例如肌醇六磷酸（IP6）、反式白藜芦醇、槲皮素、或任何多酚或生物类黄酮；（b）钙螯合剂，例如肌醇六磷酸（IP6）；（c）血红素加氧酶活化剂，例如反式白藜芦醇、白皮杉醇、或白藜芦醇的任何天然类似物，或相似的小分子例如非瑟酮、杨梅素、槲皮素或其他生物类黄酮；（d）降低氧对红血球的亲和性的药剂，例如肌醇六磷酸（IP6）；以及任选的（e）其他抗氧化剂例如维生素E、叶黄素/玉米黄质、α硫辛酸。该制剂有以下功能：（1）限制视网膜组织（感光细胞、视网膜色素上皮细胞（RPE）、脉络膜，特别是RPE细胞中的线粒体和溶酶体）中的氧化；（2）抑制脂褐质沉积物的蓄积；（3）抑制脉络膜疣的形成；和（4）限制视网膜组织、特别是Bruch膜的钙化。

癌症

癌症治疗中的主要挑战是将细胞毒性药剂选择性靶向肿瘤细胞（Luo,Y.等(2000)Biomacromolecules 1(2):208-218）。为了减少小分子抗癌剂的不希望有的副作用，已经研究了许多靶向途径。最有希望的方法之一涉及细胞毒素与大分子载体特别是透明质酸的组合或共价连接（Luo,Y.等(1999)Bioconjug.Chem.10(5):755-763；Luo,Y.等(1999)Bioconjug.Chem.12(6):1085-1088；Luo,Y.等(2002)Pharm.Res.19(4):396-402）。

在一种实施方式中，本发明实施方式涉及用于治疗癌症的含有白藜芦醇和透明质酸的组合物，所述组合物包含：白藜芦醇、玻尿酸、和任选的维生素D和/或IP6。据信，这些组分彼此协同地起作用以介导在治愈和/或防止人类中的癌症和/或改善受到肿瘤威胁的患者中的免疫力（例如免疫系统应答）方面的效应。本发明实施方式的这个方面部分基于天然分子可以提高癌症免疫力这个认识，天然分子可能是以防癌小鼠中观察到的类似方式提高癌症免疫力。

在提供这样的组合物后，先天免疫系统的哨兵树突状细胞能够发出警报，并且能够显著提高中性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞的活性。通过白藜芦醇提高维生素D受体是治疗或防止癌症的组合方法的又一个主要优点。这种方法似乎更适合于年长的成人，他们是癌症的最高风险群，由于营养差或营养吸收不足而往往是免疫受损的。这种疗法现在可以通过无创癌细胞计数技术直接测定有效性这个事实意味着可能不需要昂贵的和意义不明确的动物试验来证明疗效。

维生素D表现出许多生物作用。虽然维生素D防止骨病（发育中儿童的软骨病，年长成人的骨质疏松症）的能力是众所周知的，但它也正成为与癌症战斗的核心作用者。最近它还刚刚获得作为抗生素的关注。维生素D缺乏的小鼠在面对感染或炎症时表现出有缺陷的吞噬细胞应答。维生素D缺乏症经常伴有反复发生感染。与维生素D水平足够的动物相比，在维生素D缺乏的动物中，只有大约一半的巨噬细胞聚集在炎症部位。

对于更深入研究维生素D在免疫和癌症中的作用，维生素D改善了趋化性中性粒细胞（的调动和迁移（中性粒细胞调动和迁移的倾向性）。据观察，由于维生素D缺乏而患有软骨病的患者具有不能恰当迁移的行动缓慢的中性粒细胞。维生素D刺激单核细胞成熟为巨噬细胞。这导致用于攻击肿瘤的免疫战斗细胞队伍的壮大。现在更为关注的是作为抗癌武器的维生素D，因为研究显示，补充维生素D大幅降低了所有类型的癌症的风险。一项采用1100IU维生素D3的研究在仅仅4年时间内就在Nebraska女性当中产生癌症风险降低60-77%。

虽然在地理上阳光充足地区和赤道地区中癌症风险是最低的，这些地区的阳光暴露人群中维生素D水平较高，但维生素D的抗癌保护效应被反复否认或低估。口服维生素D消除了过度暴露于未过滤的太阳光线导致皮肤癌的顾虑。最新的一项分析显示，每天摄取2000IU维生素D可以将结肠癌的风险减半，而且每天摄取3500IU的维生素D可以将乳腺癌风险减半。维生素D饮食摄入量的中位数每天只有约230IU，因此食品强化或补充以防止或治疗癌症的前景现在变成了现实。

为了使组织利用和受益于维生素D，所述组织在它们的细胞外层（细胞膜）中必须具有被设计成接受和结合维生素D的蛋白质。例如，约80%的人类乳腺肿瘤产生维生素D细胞受体，虽然维生素D受体的基因表达（生产）处于低水平。维生素D抑制癌症的能力在它得到饮食中弱雌激素样分子的帮助时可以提高。白藜芦醇是普遍存在于红葡萄酒中的雌激素样分子，它上调乳腺癌细胞中的维生素D受体但不增加癌的生长。实际上，白藜芦醇可以使乳腺癌细胞对维生素D的抗癌性质敏感化。

实验室的实验显示，低剂量维生素D3不降低乳腺肿瘤细胞的生长，但是当与白藜芦醇组合时，肿瘤细胞数量减少了40%。在更高的浓度下，维生素D3将实验皿中的乳腺癌细胞数量减少了约25%，而当与白藜芦醇组合时，这种减少提高到50%。虽然雌激素增加维生素D受体基因表达，但它也刺激乳腺肿瘤生长。白藜芦醇没有这个缺点。白藜芦醇增强或“武装”了维生素D的抑癌效应。此外，白藜芦醇本身已经显示出使吞噬细胞对外来的侵入物如细菌和肿瘤细胞的应答平稳。白藜芦醇减弱活性氧物质（自由基）的产生并使巨噬细胞中的颗粒摄入正常化。因此，白藜芦醇防止可能产生自体免疫的免疫细胞的过度应答。

白藜芦醇以如此多的方式阻断癌症，使得难以找到不受白藜芦醇阻碍的癌症途径。白藜芦醇引起肿瘤细胞中被称为线粒体的细胞能量室释放被称为细胞色素C氧化酶的酶，这种酶通常引起其他酶的级联反应，导致被称为凋亡的程序性细胞死亡。但是最近的实验还显示，白藜芦醇使细胞色素C从卵巢肿瘤细胞中释放，这通过被称为自体吞噬的过程导致快速细胞死亡，自体吞噬过程是肿瘤细胞内产生的酶实际上消化了它的内部结构的过程（类似于细胞内同类相食的形式）。白藜芦醇在肿瘤细胞中激活这种细胞自杀形式，但在健康细胞中则没有。

在癌症生物学中有点忽视了先天免疫在监管肿瘤中的贡献。噬菌作用，或“细胞吞食”是先天免疫应答的基石。焦点已经对准被认为是先天免疫应答的哨兵的树突状细胞。已经研究了数量有限的免疫提高剂。

对先天免疫途径治疗癌症的关注充满了怀疑。例如，采取免疫抑制的患者发生癌症的频率不一定更高。然而，这可能被误解。过度响应的免疫系统可能导致更多的组织和器官损伤，这对癌症患者可能是致命的。用于乳腺癌疗法的大多数药物引起免疫抑制。

最有效力的天然铁螯合剂是肌醇六磷酸（IP6），它存在于种子和完整谷粒的麸皮部分中。已经发现低剂量IP6将横纹肌肉瘤细胞的生长抑制了50%。IP6的去除让这些肿瘤细胞恢复并再次生长。与未处理的小鼠相比，具有注入的肿瘤的IP6处理小鼠表现出小50倍的肿瘤。据显示，IP6还在小鼠中降低注入的纤维肉瘤细胞的生长并延长小鼠的生存。在研究IP6的免疫增强性质中，据显示，它提高了自由基（超氧化物）的产生，并在在细菌存在下提高了中性粒细胞的细胞消化作用。IP6增加白介素-8的释放。IP6提高了参与肿瘤细胞破坏的自然杀伤细胞的作用。

在一种实施方式中，将这种组合物的透明质酸与化疗剂结合。所述实施方式具体涉及其中化疗剂是泰素这样的组合物。所述实施方式具体涉及这样的组合物，即，所述组合物另外并优选包含螯合剂、和/或维生素D。大多数恶性实体肿瘤含有水平升高的透明质酸（Rooney,P.等(1995)Int.J.Cancer 60(5):632-636），并且这些高水平的HA生产提供了促进侵袭的基质（Hua,Q.等(1993)J.Cell.Sci.106(Pt 1):365-375；Luo,Y.等(2000)Biomacromolecules 1(2):208-218）。因此，与透明质酸结合的化疗剂靶向肿瘤细胞，并且可以在较低的总浓度下提供有效的抗肿瘤剂量。

简单说来，优选的结合方法需要形成化疗剂的NHS（N-羟基-琥珀酰亚胺衍生物）。可以通过在室温下向搅拌过的含泰素和琥珀酸酐的CH₂Cl₂溶液中添加摩尔过量的无水吡啶来制造这样的衍生物。然后将该反应混合物在室温下搅拌几天，然后真空浓缩。将残余物溶解在5mLCH₂Cl₂中，所产生的泰素-2'-半琥珀酸酯可以在硅胶上进行纯化（用己烷洗涤；用乙酸乙酯洗脱），以产生所需的产物（Luo,Y.等(1999)Bioconjug.Chem.10(5):755-763）.

然后将化疗剂的N-羟基-琥珀酰亚胺衍生物与己二酸二酰肼基官能化的透明质酸结合。己二酸二酰肼基官能化的透明质酸优选按如下列文献所述进行制备：Pouyani,T.等(1994)(Bioconjugate Chem.5:339-347)；Pouyani,T.等(1994)(J.Am.Chem.Soc.116:7515-7522)；Vercruysse,K.P.等(1997)(Bioconjugate Chem.8:686-694)。因此，透明质酸优选溶解在水和过量的己二酸二酰肼（ADH）中。通过添加酸将反应混合物的pH调节到4.75。接着，添加1当量固体形式的1-乙基-3-[3-(二甲氨基)-丙基]碳二亚胺（EDCI）。通过添加酸将反应混合物的pH保持在4.75。通过添加0.1N NaOH将反应混合物的PH调节到7.0，来淬灭反应。然后将反应混合物转移到预处理过的透析管（Mw截止值3,500）中，并用100mM NaCl、然后是25% EtOH/H₂O、最后是水进行彻底透析。然后将该溶液通过0.2m乙酸纤维膜过滤，快速冷冻，并冻干（Luo,Y.等(1999)Bioconjug.Chem.10(5):755-763）。

衰老

细胞的钙化和衰退削弱了由溶酶体产生的酶从细胞中清除细胞碎片（脂褐质），并导致细胞内线粒体产生的细胞能量（ATP）的削弱。本发明实施方式的组合物抑制和/或逆转细胞衰老和/或结缔组织衰老，并且特别抑制和/或逆转由主要矿物质（例如铁、钙等）的蓄积引起的细胞衰老和/或结缔组织衰老。因此，本发明实施方式的组合物的接受者表现出寿命提高以及细胞和结缔组织的健康和结构增强。

人体在细胞水平上通过被称为脂褐质的细胞碎片的缓慢蓄积而衰老，而脂褐质的蓄积被溶酶体和线粒体内铁和钙的进行性蓄积所促进。被称为自体吞噬的细胞清洁和更新过程在年轻人发育的岁月期间防止脂褐质的蓄积，但是这种溶酶体机制一旦达到完成发育后就由于细胞内铁和钙的蓄积而衰退。去除细胞碎片的进行性失能造成了细胞功能衰退，然后细胞过早死亡。年轻的细胞有效地从内部去除碎片。年老的细胞不能有效去除碎片并蓄积脂褐质。一旦儿童期发育结束，为溶酶体执行它们的细胞清洁活性提供细胞能量的线粒体也逐渐变得钙化和铁化。在80岁时，只有约5%的线粒体还发挥功能。铁和钙的螯合剂被提议用于补救影响细胞功能例如溶酶体酶活性的线粒体衰老。

人体因被称为成纤维细胞的细胞不能再生胶原蛋白和透明质酸而在结缔组织内衰老，透明质酸是间隙填充和保水的分子。饮食中的维生素和氨基酸（维生素C、赖氨酸、脯氨酸）促进胶原蛋白形成。成纤维细胞可以被身体内天然制造的雌激素和饮食中提供的存在于植物中的被称为植物雌激素的雌激素样分子刺激或被透明质酸本身刺激而产生透明质酸。年轻的女性，得益于产生雌激素的能力，由于透明质酸丰富而表现出头发更稠密、皮肤更光滑和关节更灵活。所有这些是青春的特性。

不能再生透明质酸导致组织由于丧失了透明质酸的间隙填充性质而失去了它们的物理完整性。没有足够的透明质酸时，产生了失水状态并且组织收缩并皱缩。例如，缺乏透明质酸的皮肤将显得起皱和干燥。关节间隙将缺乏缓冲并需要间隙填充来防止骨与骨的摩擦。眼睛的大小将开始缩小。头发将因缺乏水合作用而变细。这些是最明显可见的或美容方面的衰老迹象。

在一种实施方式中，本发明实施方式解决细胞和细胞外（结缔组织）的这两种衰老，因此（a）通过从细胞中去除多余的矿物质、主要是钙和铁来保持活细胞的年轻功能，这促进了自体吞噬（通过溶酶体酶清除细胞碎片，例如脂褐质），和（b）通过HA、植物雌激素（白藜芦醇、槲皮素、染料木黄酮是其中几种）刺激成纤维细胞来激发和保持玻尿酸的生产，通过提供金属螯合剂例如植酸、阿魏酸盐、槲皮素、白藜芦醇等抑制HA的降解。

在一种实施方式中，饮食增补剂通过它刺激借助细胞内溶酶体进行细胞碎片的酶促降解而从内部更新活细胞的能力，解决了细胞和细胞外的这两种衰老。这是通过在配方内包括金属（铁、铜、重金属）和钙螯合分子而促成的。随着铁、铜及其他金属的进行性蓄积和钙的结晶化，溶酶体失去了它们酶促消化细胞碎片的能力。在另一种实施方式中，膳食增补剂刺激成纤维细胞再次产生年轻水平的透明质酸。这是通过提供刺激成纤维细胞产生透明质酸的口服分子而实现的。在另一种实施方式中，膳食增补剂包括帮助保持年轻的溶酶体功能的金属螯合分子，它们被鉴定为抗氧化剂如维生素E或维生素C、硫辛酸、金属螯合剂如IP6植酸酯、槲皮素、生物类黄酮或多酚、白藜芦醇。白藜芦醇通过它刺激血红素加氧酶生产的能力而起作用，血红素加氧酶是一种有助于控制铁的酶。所述膳食增补剂也可以包括抑制钙结晶化的分子，它们是镁和IP6植酸酯；以及刺激成纤维细胞产生透明质酸的口服分子，它们是透明质酸、葡萄糖胺、软骨素、或雌激素样分子，例如染料木黄酮、木酚素、羟基酪醇或结构像雌激素的其他分子。口服的HA刺激更多的HA和软骨素合成。类似地，葡萄糖胺刺激成纤维细胞产生HA。替代地或附加地，葡萄糖胺刺激滑膜生产透明质酸，这种透明质酸主要负责滑液的润滑和冲击吸收性质（McCarty,M.F.(1998)Medical Hypotheses 50:507-510,1998）。在又一种实施方式中，所述膳食增补剂可以包括刺激胶原蛋白生产的口服分子，它们是维生素C、脯氨酸和赖氨酸。

在这样的实施方式中，本发明实施方式涉及含有白藜芦醇和透明质酸的膳食增补剂，所述膳食增补剂恢复人类细胞和组织的年轻功能和外观。所述实施方式具体涉及这样的组合物，即，所述组合物还包含螯合剂、和/或维生素D。最优选地，所述组合物将包含螯合剂植酸（肌醇六磷酸；IP6）。本发明实施方式的组合物协同提高白藜芦醇和/或透明质酸的比活度，因此本发明实施方式的组合物提供提高的活性，所述活性超过和优于单个施用所述组分而获得的活性。在这样的实施方式中，所述实施方式涉及用于恢复人类细胞和组织的年轻功能和外观的方法，所述方法包括下列步骤：（a）刺激活细胞借助细胞内溶酶体进行的细胞碎片的酶促降解而从内部更新（优选通过提供帮助保持年轻的溶酶体功能的金属螯合分子，这样的分子包括抗氧化剂例如维生素E或维生素C、硫辛酸、金属螯合剂如IP6植酸酯、槲皮素、生物类黄酮或多酚、和/或白藜芦醇）；和（b）刺激成纤维细胞产生透明质酸（包括提供刺激成纤维细胞产生透明质酸的口服分子，这样的口服分子包括例如透明质酸、葡萄糖胺、软骨素、和/或雌激素样分子，例如染料木黄酮、木酚素、羟基酪醇或结构像雌激素的其他分子）。优选地，这样的刺激是通过膳食中施用包含所说明的化合物的组合物来实现的，更优选将所述化合物与刺激胶原蛋白生产的口服分子组合，这样的分子包括例如维生素C、脯氨酸和/或赖氨酸。

所述组合物的各个组分被认为协同起作用以提高例如白藜芦醇的效应。没有打算藉此进行限制，有人提出，在已经达到发育完全之后，身体对铁和钙的控制或螯合作用调控着衰老速度。在儿童期发育期间，所有的铁和钙的目的在于生产新骨和新红细胞（血红蛋白）。儿童期发育结束导致铁、铜和钙过剩，于是它们逐渐使组织（a）钙化和（b）衰退。溶酶体开始蓄积铁和钙，这导致了它们的功能障碍。随着线粒体也逐渐衰退和钙化，它们开始功能失常。本发明实施方式的组合物被认为能够限制或减慢细胞和细胞器的进行性衰退和钙化，从而促进减慢或逆转衰老的过程。螯合作用是控制基因的。然后基因被有利地上调或下调。白藜芦醇和铜螯合剂被认为担任：（1）钙浓度的控制剂，这是通过上调帮助将钙保留在骨中的激素——骨钙蛋白，和（2）铁浓度的控制剂，这依靠抗氧化酶血红素加氧酶。

MAO抑制剂和铁螯合剂已被提议作为帕金森氏病的治疗（Youdim,M.B.等(2004)J.Neural.Transm.111(10-11):1455-1471；M.等(2006)Eur.J.Pharmacol.542(1-3):54-60；Bureau,G.等(2008)J.Neurosci.Res.86(2):403-410；Singh,A.等(2003)Pharmacol.68(2):81-88；Gao,X.等(2007)Am.J.Clin.Nutr.86(5):1486-1494；Johnson,S.(2001)Med.Hypotheses 56(2):171-173）。本发明实施方式的含有MAO抑制剂和铜螯合剂、白藜芦醇、铁螯合剂和MAO抑制剂、槲皮素、和广谱金属螯合剂、植酸的组合物是用于治疗神经变性疾病（特别是帕金森氏病、躯干前曲症、和阿尔茨海默氏病）或改善这类疾病的症状所特别优选的。

C.调节基因产物浓度或活性

在示例性实施方式中，所述组合物能够调节基因表达达到大于用单独的白藜芦醇或用卡路里限制所观察到的程度。在优选实施方式中，含有白藜芦醇的组合物中的白藜芦醇比活度已被稳定化或增强。在本文中使用时，术语“比活度”是指每单位白藜芦醇施用量（质量）下，基因调节程度（相对于对照）的比率。在另一种优选实施方式中，所述组合物在施用于接受者后上调生存/长寿基因或下调其表达增加细胞损伤的基因。

所述实施方式涉及在施用于接受者后增加生存/长寿基因产物的浓度或活性和/或降低引起或造成细胞损伤的基因产物的浓度或活性的组合物。在本文中使用时，浓度或活性的这种增加（或降低）可以通过任何机制来实现。例如，这种增加（或降低）可以反映引起生存/长寿基因产物的编码基因、或调控（例如诱导或抑制）这种表达或活性或者其产物调控这种表达或活性的基因表达增加（或降低）的基因表达调节。替代地或者结合地，浓度或活性的这种增加（或降低）可以反映对接受者降解或稳定任何这样的基因产物的能力的调节。替代地或者结合地，浓度或活性的这种增加（或降低）可以反映对接受者提高、加快、抑制或减慢任何这样的基因产物的活性的能力的调节。

上面讨论的浓度或活性的调节可以是对这种生存/长寿基因产物或引起或造成细胞损伤的这种基因产物的细胞内、细胞间和/或组织浓度或活性的调节。这样的调节可以通过在一种或多种类型的细胞、组织等中进行的DNA表达分析、基因产物活性分析、基因产物水平分析、基因产物更替速率分析等来鉴别。

生存/长寿基因产物的浓度增加可以起因于，例如，生存/长寿基因产物的编码基因的转录增加、诱导生存/长寿基因产物的编码基因表达的基因的转录增加、抑制生存/长寿基因产物的编码基因表达的基因的转录降低、表达的生存/长寿基因产物分子的降解减少或稳定性提高（致使生存/长寿基因产物的蓄积提高）。类似地，生存/长寿基因产物的浓度降低可以起因于，例如，生存/长寿基因产物的编码基因的转录降低、诱导生存/长寿基因产物的编码基因表达的基因的转录降低、抑制生存/长寿基因产物的编码基因表达的基因的转录增加、表达的生存/长寿基因产物分子的降解增加或稳定性降低（致使生存/长寿基因产物的耗散提高）。

因此，本发明实施方式的一个方面涉及白藜芦醇和含有白藜芦醇的组合物用于调节基因表达、特别是调节“生存/长寿”基因和/或“诱导损伤的”基因的表达的应用。在本文中使用时，如果化合物的施用导致这类基因的表达（相对于对照）改变至少10%，则认为它“调节”基因表达。调节可以包括表达增加（“上调”）或者可以包括表达降低（“下调”）。因此，术语上调表示表达增加至少10%、至少20%、至少50%、至少2倍、至少5倍、或者最优选至少10倍（相对于对照）。术语下调相反地表示表达降低至少10%、至少20%、至少50%、至少2倍、至少5倍、或者最优选至少10倍（相对于对照）。

本发明实施方式的第二方面涉及白藜芦醇和含有白藜芦醇的组合物用于调节“生存/长寿”基因和/或“诱导损伤的”基因的表达产物的浓度或活性的应用。在本文中使用时，如果化合物的施用导致这类基因产物的细胞内、细胞间或组织浓度或活性（相对于对照）改变至少10%，则认为它“调节”这类表达产物的浓度或活性。调节例如可以包括“蓄积提高”或“活性提高”，或者例如可以包括“蓄积减少”或“活性减少”。术语“蓄积提高”（或“活性提高”）表示浓度（或活性）增加至少10%、至少20%、至少50%、至少2倍、至少5倍、或最优选至少10倍（相对于对照）。术语“蓄积减少”或“活性减少”相反地表示浓度（或活性）降低至少10%、至少20%、至少50%、至少2倍、至少5倍、或最优选至少10倍（相对于对照）。

在本文中使用时，“生存/长寿”基因是其表达造成表达这种基因的对象（例如哺乳动物，特别是人类）的生存或寿命增加的基因。相反，“诱导损伤的”基因是其表达在这种对象中造成DNA、细胞或组织损伤的基因。这样的基因是生物应激物的应答者，它们响应于应激物例如辐射（例如日光、γ射线、紫外线等）、拟辐射剂（例如维生素D）、热、接近饥饿（卡路里限制，或它的模拟物白藜芦醇）而通过调节它们的表达来启动作用。

在优选实施方式中，生存/长寿基因是sirtuin基因。Sirtuin是脱乙酰基酶和单ADP核糖基转移酶的保守家族，它们已成为细胞存活和生物体长寿的关键调节剂。哺乳动物具有至少七种sirtuin，包括sirtuin 1至7。Sirtuin 1是细胞核脱乙酰基酶，它调节包括葡萄糖稳态、脂肪代谢和细胞存活在内的功能。已知Sirtuin 1基因依靠它产生DNA修复酶和模拟卡路里限制的有益作用的能力来控制活生物体的衰老速度。白藜芦醇的反式形式（但不是顺式白藜芦醇）激活Sirtuin 1基因。Sirtuin3基因是线粒体sirtuin，其调节乙酰CoA合成酶2，因此，它的调节具有生理作用，包括增加线粒体的生物合成或代谢、增加脂肪酸氧化、和减少活性氧物质。美国专利申请公布No.2011/0082189中证实了Sirtuin 3在基因毒性应激期间促进细胞生存的作用。优选的实施方式具体涉及调节（增加或降低）Sirtuin 1或Sirtuin 3生存/长寿基因产物的浓度的组合物，特别是与白藜芦醇单独调节所述基因产物的能力相比时。

具体地，本发明实施方式的商业制剂（作为

销售）已经显示出以比单独的白藜芦醇大出高达2.95倍的比率上调Sirtuin 3。Mukherjee等，Can.J.Pharmol.Physiol.2010 Nov;88(11):1017-25。Sirtuin3蛋白调节线粒体内的锰型超氧化物歧化酶（Mn SOD），这对线粒体随着年龄增长和在疾病状态下的衰老、功能和生存可能具有直接影响。数据还提示，商业

制剂降低C-反应蛋白（炎症标志物）、减少胰岛素、提高HDL胆固醇并消除血流介导的动脉扩张的损害，血流介导的动脉扩张是动脉粥样硬化疾病的第一个征兆。

生存/长寿基因和其表达增加细胞损伤的基因的实例包括例如分别被公开在表1和2中的基因。最优选地，这样的基因是人类基因。

一些实施方式提供了包含反式白藜芦醇和金属螯合剂并且可以另外包含槲皮素、一种或多种糖胺聚糖和/或维生素D的组合物。反式白藜芦醇可以被囊封以基本上保持所述组合物的生物活性免于因反式白藜芦醇暴露于光或氧气而损失。具体提供了包含白藜芦醇、螯合剂、透明质酸和/或维生素D的组合物，和包含螯合剂植酸（肌醇六磷酸；IP6）、糖胺聚糖透明质酸和维生素D的组合物。

其他实施方式提供了含有白藜芦醇的组合物，所述组合物能够调节基因表达达到大于用单独的白藜芦醇或用卡路里限制所观察到的程度。所述组合物可以在施用于接受者后用于上调生存/长寿基因或下调其表达增加细胞损伤的基因，并且还可以用于治疗或防止癌症、心血管疾病、与衰老有关的疾病、及其他病症和疾病。具体的实施方式提供了含有白藜芦醇的组合物，所述组合物在施用于接受者后，相对于单独的白藜芦醇或卡路里限制，调节生存/长寿基因的产物或其表达增加细胞损伤的基因的产物的浓度或活性。施用优选为通过口服摄入。

实施方式还特别涉及增加forkhead Foxo 1（daf-16，dFoxO）转录因子生存/长寿基因产物的浓度的组合物。

具体的实施方式提供了组合物和方法，其中所述调节改变了：（A）氧化磷酸化；（B）肌动蛋白丝的长度或聚合；（C）胞内转运；（D）细胞器的生物合成；（E）胰岛素信号转导；（F）糖酵解；（G）糖原异生；或（H）脂肪酸代谢。基因产物可以是生存/长寿基因产物，特别是Sirtuin 1、Sirtuin 3或forkhead Foxo 1转录因子。所述基因产物可以增加细胞损伤，并具体可以是由解偶联蛋白3、Pgc-1或丙酮酸脱氢酶激酶4基因编码的。

D.组合物的包装

白藜芦醇通常对光和氧化不稳定（中国咸阳，陕西科技大学(2007)Zhong Yao Cai.30(7):805-80）。本发明实施方式的白藜芦醇优选以使其比活度最大化的方式进行制备、包装和/或储存。优选在少光（或在黑暗中）和/或低氧下制备、包装和/或储存白藜芦醇，以便使光引起的降解（例如光异构化）或氧引起的降解最小化。本发明实施方式的优选组合物被配制成丸剂、菱锭、胶囊、酏剂、糖浆等形式的口服摄入型膳食增补剂。或者可以采用其他施用形式（例如鼻内、胃肠外、静脉内、动脉内、局部等）。

白藜芦醇或包含白藜芦醇的植物提取物优选被囊封在基本上无氧的环境中。在本文中使用时，短语“基本上无氧”意在包括具有小于约百万分之100份氧的环境。理想地，囊封过程将在提取或形成小分子之后立即进行并且避免暴露于光、热和氧。或者，包含小分子的材料可以被储存在基本上无氧的环境中，直到囊封。囊封过程包括以下步骤：（1）提供包括头部分和体部分的胶囊；（2）用包含生物活性小分子的材料至少部分填充体部分；（3）将头部分沿轴向放置在体部分之上，致使这两部分至少部分重叠；和（4）沿着重叠部分形成不透流体的（不可渗透空气和液体）密封件。

对构成胶囊部分的材料没有特别的限制。优选地，所述胶囊部分包含具有透氧率低的材料。例如，优选的是，所述胶囊部分包含的材料的透氧率（按ASTM D3985测量）对于100μm而言为小于约165cm³/m²/天，更优选对于100μm而言为小于约4cm³/m²/天，最优选对于100μm而言为小于约1cm³/m²/天。构成胶囊部分的示例性材料包括但不限于可摄取的材料例如明胶、羟丙基甲基纤维素或淀粉。作为具体的实例，所述材料可以包括氧传输率对于100μm而言为小于约3.5cm³/m²/天的明胶。所产生的胶囊可以包括透氧率最多为约0.04cm³/胶囊/天的硬明胶胶囊或软明胶胶囊（ASTM D3985，27°C，相对湿度50%）。另外，高度优选不透明的胶囊。这可以通过向胶囊材料制剂添加颜料例如二氧化钛来实现。二氧化钛是惰性的并具有高分子量，这防止了它在摄入时被吸收到血液循环中。不透明的胶囊发挥作用以防止含有白藜芦醇的组合物通过光变性过程例如光氧化而降解。具有低透氧性的可商购不透明胶囊可得自Capsugel（Greenwood,SC--www.capsugel.com），以商品名

销售。

用来囊封包含生物活性小分子材料的组合物的系统必须在胶囊部分周围产生不透流体的（不可渗透空气和液体的）密封件。特别优选的囊封系统和方法被公开在WO 01/08631A1中，所述文献以其全文纳入本文作为参考。在这种系统和相关的方法中，将胶囊头部分和胶囊体部分置于填充腔中。用所需剂量的材料填充胶囊体部分，然后两个胶囊部分套筒式连接，致使头部分与体部分部分重叠。在重叠部分之间形成的间隙中施加包含溶剂的密封液，干燥所述胶囊以去除溶剂并形成不透流体的密封件。

重要的是，所述囊封过程发生在基本上无氧的环境中。另外，优选的是，囊封过程在黑暗（基本上无光）的环境中进行。如上面所说明的，小分子例如白藜芦醇在暴露于光和/或氧后（例如，由于氧化过程）而失去它们的生物活性。因此，含有小分子的组合物应该在包括不透气且黑暗的混合腔和填充腔的系统中进行混合和/或囊封，所述系统具有基本上无氧的环境。这可以通过使用去除了氧的封闭系统来实现。可以利用真空、用惰性气体流置换系统内的氧、或其组合来去除氧。例如，可以利用受控的氮气层清除所述系统的氧。另外，通过在囊封过程期间使用氮气流，使所述系统保持基本上无氧。氮气吹扫也可以用来从每个个体胶囊中去除氧。具体地说，在密封之前，可以向每个胶囊施加正压力，以用氮气替换胶囊内存在的任何氧。在密封后，氮气泡留在胶囊内。能够在基本上无氧和无光的环境下填充胶囊的可商购的囊封系统，可得自Capsugel（Greenwood,SC--www.capsugel.com），以商品名CPS 1000胶囊填充机销售。

在优选实施方式中，本发明实施方式的组合物被配制成气密胶囊，其中实施了囊封以便防止暴露于氧或使对氧的暴露最小化。在一种实施方式中，在无氧环境中实施这样的囊封。例如，本发明实施方式的组合物的组分可以在惰性气体（例如氮气、氩气等）环境下被插入到胶囊中。优选地，可以在胶囊中引入氮气泡（例如，胶囊体积的5-20%），以进一步稳定和保护所述组分对抗氧化（参见，PCT公布No.WO01/08631，纳入本文作为参考）。该国际申请具有相应的美国专利申请。可用于囊封白藜芦醇和其他容易氧化的膳食增补剂成分的合适的胶囊包括气密明胶胶囊

（Capsugel）。存在具有保护所述组分免于金属诱导氧化的能力的植酸，加强了这种抗氧化预防措施。这种含有白藜芦醇的组合物的特别优选的实例是

（ResveratrolPartners，LLC，San Dimas，CA），它包含白藜芦醇和植酸。

含有下列活性成分（每个胶囊）：5mg维生素E（作为混合的生育酚），215mg总白藜芦醇（从法国红葡萄酒和虎杖获得，并提供100mg的反式白藜芦醇），25mg槲皮素二水合物，75mg植酸（米糠提取物），380mg米糠油，55mg葵花卵磷脂。

一旦组合物已经被密封在气密胶囊中，重要的是在胶囊周围的包装中保持低氧或无氧环境，以便如果在密封胶囊中出现破裂或泄露的情况下，保护组合物免于氧化。因此，优选采用吸收氧的小包装（packette），以减少游离氧的存在。在气密材料中真空或充氮包装（瓶子，丸剂盒等）是理想的。

在备选实施方式中，本发明实施方式的组分和组合物可以按照微囊化方法制备（一般参见，Rubiana,M.等(2004)Current Drug Targets,5(5):449-455）。微囊化是将细小的颗粒或液滴（大小范围从几纳米至一微米）包被保护层以产生具有受控性质的小胶囊的方法。利用下列公司的微囊化方法，可以获得合适的微米尺寸的囊封制品：MaxxPerformance Inc.（Chester,NY），Blue California（Rancho Santa Margarita,CA），Southwest Research Institute（San Antonio,TX），Coating Place,Inc.（Verona,WI），Microtek Laboratories（Dayton,OH），Particle Sciences,Inc.（Bethlehem,PA）等。第三代

（Resveratrol Partners,LLC）含有维生素D3、维生素E、白藜芦醇、槲皮素和植酸，是本发明实施方式的组合物特别优选的微囊化形式。本发明实施方式还包括稳定槲皮素和可能接触到氧化金属的其他容易氧化的膳食增补剂成分的实用方法。

虽然现在已经大体上描述了实施方式，但通过参考下列实施例，将更容易理解所述实施方式，所述实施例是以说明的方式提供的，而不是意在限制本发明的实施方式，除非明确说明。

实施例1

白藜芦醇和本发明实施方式的组合物的比较性效应

为了确定本发明实施方式的组合物在介导白藜芦醇生物活性中是否比单独的白藜芦醇更有效，实施了基因表达的分析，将通过卡路里限制达到的对基因表达的调节与通过本发明实施方式的组合物达到的对基因表达的调节进行了比较。

因此，利用卡路里限制（“CR”）的动物的表达谱作为阳性对照，正常饲养动物的表达谱作为阴性对照，比较了单独的白藜芦醇和本发明实施方式的含有白藜芦醇的组合物上调生存/长寿基因或下调其表达增加细胞损伤的基因的能力。因此，对雄性B6CHF1小鼠（2月龄）应用40%卡路里限制饮食、提供商业获得的反式白藜芦醇（SigmaChemical；1.25mg/kg/天）、提供本发明实施方式的含有白藜芦醇的组合物

Resveratrol Partners LLC；含100mg反式白藜芦醇的胶囊/80kg人/天（即，白藜芦醇2.5mg/kg/天（反式白藜芦醇1.25mg/kg/天）、槲皮素二水合物0.31mg/kg/天、米糠提取物0.94mg/kg/天、米糠油4.75mg/kg/天和葵花卵磷脂0.70mg/kg/天））。监测小鼠直到它们达到五个月龄。

测量体重、血清葡萄糖水平、血清胰岛素水平以及大脑和肌肉组织中的脂质过氧化。结果显示，

没有引起可与对照动物区分的重量增加（图1）。发现血清胰岛素水平与卡路里限制动物中观察到的水平大致相同（图2）。发现血清葡萄糖水平低于在卡路里限制动物中观察到的水平（图3）。

实施例2

白藜芦醇和本发明的组合物对心脏组织中基因表达的比较性效应将接受白藜芦醇或本发明实施方式de组合物

的小鼠的心脏组织中的基因表达谱与应用卡路里限制饮食的小鼠和对照小鼠的所述基因表达谱进行比较。利用每个阵列含有45,101个探针组的Affymetrix MG4302.0阵列来监测基因表达。在所述阵列用多个探针表示同一基因的情形下，使用具有最高信号强度的探针组。不分析未知的基因（包括未表征的EST和cDNA序列）。因此，所述阵列提供了用于分析具有单一Entrez Gene ID的20,341个基因的工具。基本上按照Lee,C.-K.等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)99:14988-14993所描述的进行分析，所述文献纳入本文作为参考。计算一组中所有阵列的平均值。将处理组的平均值与对照组的平均值进行比较，并利用双尾t-检验确定任何差异的统计学显著性（P<0.01）。分析结果示于表3中。在表3中，使用了下列缩写：CO，对照；CR，卡路里限制；RES，白藜芦醇；LGX，

FC，改变倍数。按照处理组的平均值除以对照组的平均值来计算FC，然后出于统计学目的，将该值进行log转换（底数是2）。作为实例，在对照组中的表达为100而在处理组中为200的基因的Fc为2（即，表达增加两倍）；在对照组中的表达为100而在处理组中为50的基因的Fc为-2（即，表达降低两倍）。

表3

据报告，用阿魏酸、槲皮素或白藜芦醇处理人类脐静脉上皮细胞，在10,000个基因探针中引起363个基因的基因表达改变为下调大于2倍，而233个基因的基因表达改变为上调大于2倍（Nicholson,S.K.等(2008)Proc.Nutr.Soc.67(1):42-47）。相比之下，表3显示，在处理小鼠与对照小鼠的对比中，发现2,829个基因表现出统计学显著性的表达改变。这些基因中，在只接受卡路里限制的小鼠中发现有7%表现出表达改变；在只接受白藜芦醇的小鼠中发现有8%表现出表达改变。卡路里限制与施用白藜芦醇组合未能改变任何其他基因的表达。相反，发现施用

改变了2,829个基因中61%基因的表达。据发现，向卡路里限制小鼠施用

改变了所述基因中另外2%基因的表达。据发现，向接受白藜芦醇的小鼠施用

改变了所述基因中另外21%基因的表达。因此，发现

单独或与其他给药方案组合，影响了总基因中85%基因（2,406）显示出表达改变。

几种特别受关注的基因显示的表达模式表明，本发明实施方式的组合物

上调生存/长寿基因或下调其表达增加细胞损伤的基因的程度高于白藜芦醇，所述基因包括sirtuin家族的基因、Pgc-1α、解偶联蛋白-3、和丙酮酸脱氢酶激酶4。

Sirtuin家族的基因，特别是Sirtuin 1，被认为是延长寿命的关键媒介（Boily,G.等(2008)PLoS ONE 3(3):e1759；Huang,J.等(2008)PLoS ONE 3(3):e1710）。虽然接受白藜芦醇的小鼠显示出Sirtuin 1表达只降低了1.22倍并且接受卡路里限制饮食的小鼠显示出Sirtuin 1表达只降低了1.12倍，但在接受

的小鼠中发现Sirtuin 1的表达降低了1.71倍。Pgc-1α（过氧化物酶体增殖活化受体，γ，共激活剂1α；ppargc1a）是转录辅因子，它控制能量代谢和线粒体的生物合成；在长期卡路里限制后，它在骨骼肌组织中的表达增加（Conley,K.E.等(2007)Curr.Opin.Clin.Nutr.Metab.Care.10(6):688-692;Wu,Z.等(2007)Expert Opin.Ther.Targets 11(10):1329-1338）。虽然接受白藜芦醇的小鼠显示出Pgc-1α表达只增加了1.6倍并且接受卡路里限制饮食的小鼠显示Pgc-1α表达没有增加，但接受

的小鼠显示出Pgc-1α的表达增加了1.94倍。

解偶联蛋白-3被认为是Pgc-1α的靶标，并在脂肪酸代谢中起作用；在长期卡路里限制后，它在心脏组织中的表达增加（Bézaire,V.等（2007年1月3日电子出版）FASEB J.21(2):312-324；Chan,C.B.等(2006)Curr.Diabetes Rev.2(3):271-283）。虽然接受白藜芦醇的小鼠显示出解偶联蛋白-3的表达只增加了2.02倍并且接受卡路里限制饮食的小鼠显示出解偶联蛋白-3的表达只增加了1.8倍，但接受

的小鼠显示出解偶联蛋白-3的表达增加了2.79倍。丙酮酸脱氢酶激酶4在禁食期间协调燃料选择以促进脂肪酸代谢（Sugden,M.C.等(2006)Arch.Physiol.Biochem.112(3):139-149；Pilegaard,H.等(2004)Proc.Nutr.Soc.63(2):221-226；Sugden,M.C.(2003)Obes.Res.11(2):167-169）。它是Pgc-1α的靶标，并被长期卡路里限制在多种组织中诱导。虽然接受白藜芦醇的小鼠显示出丙酮酸脱氢酶激酶4的表达只增加了2.78倍并且接受卡路里限制饮食的小鼠显示出丙酮酸脱氢酶激酶4的表达只增加了1.48倍，但接受

的小鼠显示出丙酮酸脱氢酶激酶4的表达增加了3.25倍。

对被本发明实施方式的化合物

上调或下调的基因进行分析揭示，正如表4中所指出的，参与线粒体ATP生产的氧化磷酸化基因被明显地上调。

实施例3

本发明实施方式的组合物所影响的生化途径

最近的研究认为，复杂的性状是受到复杂的基因座和环境因素调节的分子网络的突出性质。Chen,Y.等（2008年3月16日电子出版）Nature 452(7186):429-435）。确实，最近十年内的研究揭示，大多数慢性疾病如癌症、心肺血管病、神经系统疾病、糖尿病和自体免疫病均表现出多个细胞信号转导途径的调节异常（Harikumar,K.B.等（2008年2月15日电子出版）Cell Cycle.2008:7(8)）。因此，评价了本发明实施方式的化合物对生化途径的表达的影响，并发现本发明实施方式的化合物影响了参与220个生物过程的基因的表达（P<0.05），如表5所示。

卡路里限制所影响的基因与这些过程中5%的过程有关，施用白藜芦醇所影响的基因与这些过程中10%的过程有关。发现本发明实施方式的化合物（例如

影响了这些过程中85%的过程。向卡路里限制小鼠施用白藜芦醇不能影响这些过程中任何过程的任何基因。据发现，向卡路里限制小鼠施用

影响了与这些过程中8%的过程有关的基因。据发现，施用白藜芦醇和

两者影响了与这些过程中12%的过程有关的基因。表6显示了由卡路里限制（CR）、单独的白藜芦醇（Res）、或

（LGX）引起的对氧化磷酸化途径的基因（GO:0006119）的调节。

表7显示了由卡路里限制（CR）、单独的白藜芦醇（Res）、或本发明实施方式的组合物（LGX）引起的对葡萄糖代谢途径的基因（GO:0006006）的调节。

表8显示了由卡路里限制（CR）、单独的白藜芦醇（Res）、或本发明实施方式的组合物（LGX）引起的对三羧酸代谢途径的基因（GO:0006099）的调节。

表9显示了由卡路里限制（CR）、单独的白藜芦醇（Res）、或本发明实施方式的组合物（LGX）引起的对脂肪酸代谢途径的基因（GO:0006631）的调节。

心脏组织中20,341个基因的表达研究揭示，2,829个基因表现出统计学显著性的表达差异（P<0.01）。其中，7%的基因（大约189个基因）在只接受卡路里减少饮食的动物中表现出表达改变；8%的基因（大约226个基因）在只接受白藜芦醇的动物中表现出表达改变；在接受白藜芦醇并且接受卡路里减少饮食的动物中，没有另外的基因表现出表达改变。相比之下，在只接受本发明实施方式的化合物（例如

的动物中，20,341个基因中61%的基因（大约1,729个基因）表现出表达改变；在接受本发明实施方式的化合物（例如

并且接受卡路里减少饮食的动物中，所述基因中另有2%的基因（大约56个基因）表现出表达改变；在接受本发明实施方式的化合物（例如和白藜芦醇的动物中，所述基因中另有21%的基因（大约594个基因）表现出表达改变；在接受本发明实施方式的化合物（例如

白藜芦醇并且接受卡路里减少饮食的动物中，所述基因中另有1%的基因（大约28个基因）表现出表达改变。

上述数据证明，本发明实施方式的化合物（例如

有效调节心脏组织中的基因表达，达到了甚至胜过卡路里限制所达到的程度。在非心脏组织中观察到类似的效应。脑组织中20,341个基因的表达研究揭示，3,572个基因表现出统计学显著性的表达差异（P<0.01）。其中，在只接受卡路里减少饮食的动物中，有124个基因表现出表达改变；在只接受白藜芦醇的动物中，424个基因表现出表达改变；在接受白藜芦醇并且接受卡路里减少饮食的动物中，10个基因表现出表达改变。相比之下，在只接受本发明实施方式的化合物（例如

的动物中，2,560个基因表现出表达改变；在接受本发明实施方式的化合物（例如并且接受卡路里减少饮食的动物中，另有19个基因表现出表达改变；在接受本发明实施方式的化合物（例如

和白藜芦醇的动物中，另有430个基因表现出表达改变；在接受本发明实施方式的化合物（例如

白藜芦醇并且接受卡路里减少饮食的动物中，另有5个基因表现出表达改变。

实施例4

本发明实施方式的组合物的作用机制模型

因此，发现本发明实施方式的化合物极大地超过卡路里限制后所观察到的基因表达调节，并且改变脂质代谢、葡萄糖代谢、氧化磷酸化、Kreb循环、ATP合成和脂肪酸β氧化的关键途径中的基因的表达。总之，发现本发明实施方式的化合物在影响的基因数量和不同生化途径的数量两方面上，都具有比单独的白藜芦醇更高的比活度。结果是显著性的，因为卡路里限制（CR）被认为是在所有形式的生命中明确延长生命的方法。通常，减少50%的卡路里摄入使任何生物体的寿命加倍。上述实验证明了，本发明实施方式的组合物对基因组表达施加了比白藜芦醇或CR更有力的影响，并且在任何技术所已经显示的当中，第一次标识着超过CR的效应。此外，发现本发明实施方式的组合物与CR相比，在生命的更早期影响基因组表达（CR需要一生时间坚持CR饮食来使基因有差异）。

不想要受到任何作用机制的约束，以上结果提示，本发明实施方式的化合物通过提高forkhead Foxo1（daf-16,dFoxO）转录因子的活性而起作用（图4）。在生物体模型中的研究显示，Foxo 1通过提高基因表达来介导寿命表达。胰岛素/IGF-1信号转导使Foxo1磷酸化，从而造成它被排除出细胞核并且下调其作用。因此，发现本发明实施方式的化合物降低胰岛素和IGF-1信号转导，从而减少Foxo1磷酸化。与该模型一致的是，观察到胰岛素受体信号转导途径（例如GO:008286；Ide、Igfbp4和Igfbp6基因）受本发明实施方式的化合物的影响。Foxo1的表达增加了1.75倍。本发明实施方式的化合物介导糖酵解降低和糖原异生增加（例如GO:0006006）、Pgc-1α表达增强（从而导致刺激Pdk4表达（例如Ppargc1α增加1.94倍以及Pdk4增加3.25倍）、脂质代谢基因表达增加（例如，Ucp3增加2.79倍，Cpt1a增加1.49倍，和Cpt1b增加1.45倍）。脂质和脂肪酸代谢基因GO:0006629和GO:0006635只受本发明实施方式的化合物的影响。因此，本发明实施方式的化合物对受卡路里限制和白藜芦醇影响的关键过程（例如染色质重塑、从RNA聚合酶II启动子开始的转录、和泛素循环）施加更明显的且有利的影响。基因GO:0006333和GO:0006367只受本发明实施方式的化合物的影响；基因GO:0006512受白藜芦醇和

的影响。因此，总而言之，提出的作用机制是，本发明实施方式的组合物向细胞递送白藜芦醇，在细胞处，它穿过细胞壁，进入细胞质，并促进Foxo1基因易位到细胞核中，从而产生长寿效应。

实施例5

本发明实施方式的组合物的制造和囊封

从欧洲葡萄和虎杖中经由乙醇提取，获得白藜芦醇形式的小分子。去除乙醇，所得的提取物包含大约25%欧洲葡萄皮白藜芦醇和25%虎杖白藜芦醇，其余部分包含非白藜芦醇的惰性植物材料。利用SIRT1荧光活性分析/药物发现试剂盒（Drug Discovery Kit）AK-555（可得自

Research Laboratories,Inc.；Plymouth Meeting,PA；www.biomol.com），证实提取物中白藜芦醇的生物活性。将提取物保持在氮环境中并添加到包括大约25重量%槲皮素、33重量%卵磷脂、和9%植酸（米糠提取物的形式）的混合物中。组合物的其余部分包括大约33重量%的白藜芦醇提取物。

将所得的浆料放入胶囊填充机中。将各个剂量囊封在用二氧化钛着色的明胶胶囊

胶囊，可得自Capsugel；Greenwood,SC；www.capsugel.com）中。利用连续充氮的胶囊填充机（Capsugel CFS 1000胶囊填充和密封机，可得自Capsugel；Greenwood,SC；www.capsugel.com），将所述剂量囊封在基本上无氧的环境中。所产生的每个胶囊包括至少15mg白藜芦醇、100mg卵磷脂、75mg槲皮素、和25mg植酸。将这些胶囊样品在环境条件下储存大约8个月。通过测定每个样品是否可以激活sirtuin酶，并且特别是，所述样品是否刺激SIRT1催化活性，来测试所述样品的生物活性。在囊封之后4个月和8个月测试样品。利用SIRT1荧光活性分析/药物发现试剂盒AK-555（可得自

Research Laboratories,Inc.；Plymouth Meeting,PA；www.biomol.com）进行测试。在测试后，确定了样品内所含的白藜芦醇是生物活性的、刺激SIRT1活性、与不存在白藜芦醇时相比产生最多约8倍的酶活性刺激。类似地，测试槲皮素的生物活性，确定了囊封的槲皮素保持了生物活性（即，与不存在槲皮素时相比，刺激SIRT1活性的能力）。

实施例6

白藜芦醇和本发明组合物的毒物兴奋作用的比较性评价

大量的研究结论性地证明了白藜芦醇的心脏保护效应，但是往往忽视了一个明显的事实——白藜芦醇的毒物兴奋作用。白藜芦醇是植物抗毒素，许多植物衍生的产物表现出毒物兴奋效应。Calabrese等(2001)Ann Rev Public Health 22:15-33。毒物兴奋效应被定义为剂量-响应关系，其在低剂量下是刺激性的，但是在较高剂量下是有害的，从而产生J形或反U形剂量响应曲线。相当长时间以来已经知道，摄入酒精或葡萄酒的心脏保护效应遵循J形曲线。Constant J(1997)ClinCardiol 20:420-424。大量文献检索暗示红葡萄酒中存在的白藜芦醇也表现出类似的健康益处，在较低剂量下高度有效，而在较高剂量下是有害的。开展本研究来确定白藜芦醇介导的心脏保护的剂量-响应曲线，并将这种剂量-响应曲线与另一种可商购的白藜芦醇增补剂

（Resveratrol Partners LLC,USA）进行比较。研究结果揭示，虽然白藜芦醇表现出毒物兴奋作用，但

没有。

动物.按照与动物和涉及动物的实验相关的法规，用于这个研究的所有动物均接受人道照顾，并遵循《实验动物护理和应用指南》（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）（NIH出版，1996版）中说明的原则，所有的方案都经美国康涅狄格州Farmington的康涅狄格健康中心大学的机构动物管理委员会（Institutional Animal CareCommittee of University of Connecticut Health Center）批准。重量在250和300g之间的雄性Sprague–Dawley大鼠随意进食普通大鼠饲料并饮水，直到开始实验程序。将动物随机分为三组，其中对照组管饲含有5% quartering和5%水合物的1ml水，另两组管饲白藜芦醇或

分离的工作心脏的标本.在完成喂饲方案之后，用戊巴比妥钠（80mg/kg，腹膜内）（Abbott Laboratories,North Chicago,IL,USA）麻醉动物，肝素钠（500U/kg，静脉内）（Elkins-Sinn Inc.,Cherry Hill,NJ,USA）被用作抗凝剂。深度麻醉之后，切下心脏，对主动脉进行插管，并以Langendorff模式在37°C下用Krebs-Henseleit碳酸氢盐以恒定（100cm水）灌注压通过主动脉对心脏灌注达5min的冲洗期，如以前所描述的。Ray等(1999)Free Rad Biol Med 27:160-9。灌注介质由改性的Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液（毫摩尔浓度：氯化钠118，氯化钾4.7，氯化钙1.7，碳酸氢钠25，磷酸二氢钾0.36，硫酸镁1.2和葡萄糖10）构成，在它氧化之后，pH在37°C下是7.4。

在冲洗期期间，对左心房进行插管，并将Langendorff标本切换到工作模式10min，其中左心房充盈压为17cm H2O；主动脉后负荷压被设置在100cm水。在10min结束时，记录基线心脏功能例如心率（HR，次/分钟）、主动脉流量（AF，ml/min）、冠脉流量（CF，ml/min）、左心室形成压（LVDP，mmHg）和形成压的一阶导数（LVdp/dt，mmHg/sec）。然后，通过在接近左心房流入和主动脉流出管根部的点处夹紧左心房流入和主动脉流出管，开始30min的全心缺血。30min后，通过松开心房流入和主动脉流出管的夹钳，开始120min的再灌注。前10min的再灌注为Langendorff模式以避免心室纤颤，然后将心脏切换为顺行的工作模式。Ray等(1999)Free Rad Biol Med 27:160-9。

心脏功能评价.在10min的工作模式后，记录基线参数。为了监测心脏的恢复，在再灌注60和120min后记录左心室的心功能。每组有六只大鼠。使用校准的流量计（Gilmont Instrument Inc.,Barrington,IL,USA）测量主动脉流量。通过定时收集从心脏滴出的冠脉流出液，测量冠脉流量。在整个实验期间，利用与主动脉插管的侧臂连接的GouldP23XL压力传感器（Gould Instrument Systems Inc.,Valley View,OH,USA）监测主动脉压；利用Gould 6600系列信号调节器（GouldInstrument Systems Inc.）放大信号。CORDAT II实时数据获取和分析系统（Triton Technologies,San Diego,CA,USA）。Dudley等(2009)JNutr Biochem.20:443-52。心率、左心室形成压、和形成压的一阶导数全部根据连续产生的压力信号进行计算。

梗塞面积估算.利用三苯基氯化四唑（TTC）染色法测量梗塞面积。Malik等(2006)Antioxidant Redox Signal 8:2101-9。在再灌注两小时后，将40mL在磷酸盐缓冲液中的1%（w/v）TTC溶液输注到主动脉插管中，并将心脏样品储存在-70°C，以备后续分析。将冷冻心脏的切片（0.8mm）固定在2%多聚甲醛中，放置在两个盖玻片之间，并利用Microtek ScanMaker 600z（Microtek,USA）进行数字成像。为了以像素定量梗塞面积，使用标准的国立卫生研究院（National Institutes ofHealth）图像程序。以像素定量并表示梗塞面积。

心肌细胞凋亡.利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法，执行凋亡细胞的免疫化学检测。Malik等(2006)Antioxidant Redox Signal 8:2101-9。将所述切片与识别心脏肌球蛋白重链的小鼠单克隆抗体一起孵育，以特异性检测凋亡的心肌细胞。用共聚焦激光显微镜观察荧光染色。对凋亡细胞的数量进行计数，并表示为全部肌细胞群体的百分比。

统计学分析.心肌功能参数、梗塞面积和凋亡的值均被表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）。执行单因素方差分析来检验组之间平均值的差异。如果确定了差异，通过改良的Student t检验，将药物处理组的值与无药组的值相比较。如果p<0.05，则认为结果有显著性。

不同剂量的白藜芦醇的心脏保护效应.首先，通过每天管饲，用不同剂量的白藜芦醇（2.5mg/kg,25mg/kg和100mg/kg）处理动物21天。在21天结束时，处死动物，切下它们的心脏并分离，通过终止冠脉流量来诱发缺血30min（如方法章节所述）。然后，以工作模式再灌注2h；在再灌注期间监测左心室功能。如图5至8所描绘的，正如由改善的主动脉流量、左心室形成压和形成压的最大一阶导数所证明的，2.5和25mg/kg剂量的白藜芦醇提供了心脏保护。超过25mg/kg时，正如由主动脉流量、LVDP和最大LVdP/dt显著降低所证明的，心室功能退化。超过50mg/kg（数据未显示）时，特别是在100mg/kg下，没有了主动脉流量或形成压，表明心脏停止工作。

在每个实验结束时，心脏或接受TTC染色来测定梗塞面积或接受TUNEL染色来检测凋亡。结果显示在图9和10中。白藜芦醇在2.5和25mg/kg的剂量下显著降低心肌梗塞面积和心肌细胞凋亡。然而，超过50mg/kg[50mg/kg下的数据未显示］时，心肌梗塞面积和凋亡的心肌细胞的数量显著增加，表明细胞损伤。

不同剂量的

的心脏保护效应.通过用三种不同剂量的

（2.5mg/kg，50mg/kg和100mg/kg）管饲大鼠直至一个月，来实施

的平行试验。结果显示在图5至10中。与显示出毒物兴奋效应的白藜芦醇不同，

表现出相同程度的心脏保护，直到剂量为100mg/kg。有意思的是注意到，正如在左心室功能、LVDP、最大LVDP/dt以及梗塞面积和心肌细胞凋亡的结果中所描绘的，甚至在低到25mg/kg的剂量下，

仍可以提供相同程度的心脏保护。白藜芦醇（J形）和

（图9）的剂量-响应曲线明确证明，只有纯的白藜芦醇而不是

表现出毒物兴奋效应。

因为

被证明在很宽的浓度范围内是心脏保护性的，所以在另一个动物种类上对它进一步进行测试。用

（100mg/kg）管饲一组新西兰白兔，持续6个月，而对照组给予安慰剂。在完成喂饲方案后，使分离的兔子工作心脏接受30min缺血，然后是2h再灌注。梗塞面积的结果显示在图12中。在直到喂饲

6个月期间，心脏功能保持被改善（下表10），在相同的持续时间内，梗塞面积和凋亡保持降低。

本研究的结果明确证明，白藜芦醇只在低剂量下有益于心脏，在较高剂量下是有害的。此外，白藜芦醇的作用被迅速实现，在大多数情况下是在14天到30天内；延长使用白藜芦醇不增加任何其他益处。然而，我们没有研究延长使用白藜芦醇是否可以造成任何不良作用。知道这种毒物兴奋效应已超过100年，并经常在毒素当中观察到。白藜芦醇是植物抗毒素，其增长受环境应激例如真菌感染、UV辐射和缺水的刺激。Adrian等(1996)J Agri Food Chem 44:1979-81。

白藜芦醇通过它预调节心脏的能力来施加心脏保护效应，对心脏的预调节导致发生细胞内应激，引起细胞内防御体系例如抗氧化剂和热休克蛋白的上调。Wallerath等(2002)Circulation 106:1652-1658。预调节是毒物兴奋效应的另一个实例，该效应通过让器官（例如心脏）经历循环的短期缺血事件而加强，其中每次缺血都接着另一个短期的再灌注。Das等(2003)Arch Biochem Biophys.420:305-311。这种小但是治疗量的应激赋予了心脏对后来致死性缺血损伤的耐受性。随着衰老，可普遍观察到这种适应性响应。与这种理念相符，已经发现白藜芦醇刺激长寿基因，并且至少在原核物种中延长了寿命。Mukherjee等(2009)Free Rad Biol Med 46:573-578；Wood等(2008)Nature 7:63-78。在这个方面，白藜芦醇可以满足毒物兴奋素（hormetin）的定义。Rattan(2008)Aging Res Rev 7:63-78。

无疑地，酒精、葡萄酒和葡萄酒来源的白藜芦醇全部表现出毒物兴奋效应。已知摄入酒精或葡萄酒的心脏保护效应遵循J形曲线，Calabrese等(2001)Ann Rev Public Health 22:15-33和Constant J(1997)Clin Cardiol 20:420-424，并且本研究符合这个发现（图11）。在较低剂量下，白藜芦醇起到抗凋亡剂的作用，提供了心脏保护，正如由与对照相比，细胞生存蛋白质的表达增加、缺血后心室恢复改善以及因保持稳定的氧化还原环境引起心肌梗塞面积和心肌细胞凋亡减少所证明的。可是，在较高剂量下，白藜芦醇降低心脏功能、提高凋亡蛋白质的表达水平、产生不稳定的氧化还原环境并增加心肌梗塞面积和凋亡细胞的数量。在文献中有显著数量的报告显示，在高剂量下，白藜芦醇不仅阻碍肿瘤生长，而且抑制RNA、DNA和蛋白质的合成；引起结构染色体畸变、染色质断裂、染色质交换、非整倍体性弱、较高的S期阻滞；阻断细胞增殖；降低通过成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）进行的伤口愈合、内皮细胞生长；并抑制健康组织细胞中的血管生成，导致细胞死亡。Dudley等(2009)JNutr Biochem.20:443-52。

与纯白藜芦醇的并行测试.高达100mg/kg剂量的

都没有显示出任何毒物兴奋作用（细胞毒性）。应该注意，任何超过50mg/100g剂量的纯白藜芦醇都使心脏停止。Dudley等(2009)J Nutr Biochem.20:443-52。我们还测定了对不同种类的动物例如兔子的长期效应，并发现甚至在6个月的处理后，

仍提供心脏保护。在本研究中发现的结果对科学家、临床医生和非医疗社区而言是重要的，因为它强调了单独使用仅较低剂量的白藜芦醇的重要性，因为在较高剂量下可以出现有害或毒性效应，产生对健康的不良作用。然而，

在低或高剂量下都没有表现出有害或毒性副作用。流行病学试验和临床试验需要建立在清楚了解白藜芦醇的毒物兴奋型有益效应的基础上。

实施例7

用本发明实施方式的组合物使在缺血心脏中改变的MicroRNA表达恢复

正如由Mukhopadhyay P、Mukherjee S、Ahsan K、Bagchi A、PacherP、和Das D所报告的，用miRNA表达谱调查了白藜芦醇和它的衍生物在缺血/再灌注[I/R]大鼠模型中的心脏保护作用。Mukhopadhyay等(2010)用白藜芦醇使缺血心脏中改变的MicroRNA表达恢复（Restoration of Altered MicroRNA Expression in the Ischemic Heartwith Resveratrol）.PLoS ONE 5(12):e15705.doi:10.1371/journal.pone.0015705。发现每个样品具有唯一的表达模式，特别是采用了

是本发明实施方式的可商购白藜芦醇增补剂，可得自Resveratrol Partners LLC,USA。根据PCA分析，

和白藜芦醇预处理将miRNA的表达模式调节至接近于对照水平。在超过50个miRNA中观察到差异表达，其中的一些例如mir21事先参与心脏重塑。差异表达的miRNA的靶基因包括具有各种分子功能例如金属离子结合、钠-钾离子、转录因子的基因，它们可能在限制心脏中的损伤方面发挥了关键的作用。

如下面更详细地论述的，

尤其对microRNA miR-539和miR-20b施加了比单纯白藜芦醇高得多的影响。这两种microRNA控制参与新生血管形成的VEGF和HIF-1基因，这表明了在湿性黄斑变性、任何新生血管性眼病（青光眼）、糖尿病性视网膜病和尤其是癌症方面的治疗应用。

结果和讨论：白藜芦醇和

在IR大鼠心脏中改善了心脏功能并降低了心肌梗塞面积和心肌细胞凋亡。根据以前的研究，白藜芦醇和

两者都改善2小时再灌注期的心输出功能，包括主动脉流量、冠脉流量、左心室形成压（LVDP）及其一阶导数LVmaxdp/dt（图13）。Gurusamy等，Cardiovasc.Res.86:103-112（2010）。图13描绘了白藜芦醇和Longevinex对主动脉流量（图13A）、冠脉流量（图13B）、LVDP  （图13C）、dp/dtmax（图13D）、梗塞面积（图13E）、和凋亡（图13F）的效应。估算在基线时和在指定的再灌注时间时的冠脉流量、主动脉流量和LVDP。测定两小时再灌注结束时的梗塞面积和凋亡。结果表示为每组六只动物的平均值加/减SEM。*p<0.05，与介质（VEH）相比。#p<0.05，与相应的I/R相比。BL：基线；I/R1h：缺血30min和再灌注1h；I/R2h：缺血30min和再灌注2h；RESV：白藜芦醇；LONG：

正如所预料的，这些化合物还降低由于心肌细胞凋亡所致的梗塞面积和死亡。文献中有显著数量的研究证实了白藜芦醇的心脏保护作用。最近的研究还显示，可商购的白藜芦醇制剂

具有同等的心脏保护性。由于最近的研究确定具有同等的心脏保护性，而且没有表现出白藜芦醇的毒物兴奋作用，因此，我们比较了白藜芦醇与的效应，发现白藜芦醇和

的心脏保护效应与由Mukherjee等,J.Exp.Clin.Cardiology（待刊）以前发表的报告一致。

缺血再灌注的大鼠心脏中总miRNA表达谱分析.通过特异性针对大鼠的586个miRNA和5个内源性对照的TLDA阵列，对microRNA谱进行分析。在六个不同的组中执行阵列，即基础水平（BL）：（1）对照介质，（2）白藜芦醇，（3）

以及缺血再灌注的（IR）：（4）对照介质I/R，（5）用白藜芦醇预处理（21天）I/R，和（6）用

预处理（21天）I/R。在心脏缺血30min和再灌注2小时后从IR样品分离RNA或从以相同方式处理但没有缺血和再灌注的基线（BL）样品中分离RNA。

图14A是箱须图，显示了所有样品的总miRNA表达的独特分布。所述箱须图显示了在箱中间的中位数，第25百分位数（下四分位数）和第75百分位数（上四分位数）。须是箱的延伸，中断于在1.5倍四分位内的点。绘出了在须外部的点，因为它们被认为是界外值并从分析中排除。基于内源性基因，将数据（Ct值）归一化。观察到很少的miRNA是界外值，并且观察到586种miRNA中的385种miRNA至少在六种情况的一种中表达。图14B是谱图，显示了将每种样品针对内源性对照归一化之后，385种miRNA的表达。通过转化成与基础水平对照样品相比的“改变倍数”，对miRNA表达进行进一步的分析。BL：基线；I/R2h：缺血30min和再灌注2h；VEH：介质；RESV：白藜芦醇；LONG：

213种miRNA的表达在六种情况之一下被表达至少2倍以上。在寻找到IR样品中上调或下调2倍的miRNA之后，进一步过滤该列表。列出了在IR条件中上调或下调的前25种miRNA（表11），并且大多数调节被白藜芦醇和

的预处理逆转。在表11所列出的25种miRNA中的11种miRNA中，用白藜芦醇和

预处理的IR样品都以相反方向逆转了IR对照中的上调或下调。白藜芦醇或但不是两者，在5种情况下逆转了与IR对照相比的上调或下调。其余9种miRNA表达被二者之一或二者减弱。

在25种miRNA的15种中，

超过白藜芦醇的效应，其中包括miR-10a、miR-20b、miR-21。然而，在少数miRNA例如miR-29c中，

具有与白藜芦醇相反的效应，该差异可能是由于许多可能性所致，包括

中存在其他成分、白藜芦醇的生物利用度等等。白藜芦醇（上调391.4）和（760.9）使基础水平对照中的miR-21表达有极大的上调，而这种上调在IR中则明显降低（上调61.5和59.3）。miR-539在IR样品中被上调到高水平（214倍），并在白藜芦醇预处理的样品中被进一步上调。类似的观察结果还见于miR-27a、miR-101、miR-9、miR-667。在许多其他miRNA中也见到类似但是明显度较低的改变。

图15描绘了白藜芦醇和对miRNA表达模式的效应。图15A利用散点图描绘了基础水平和IR对照心脏之间miRNA表达的相关性。如表11所示，选择了少数miRNA表达用于显示。双线表示改变倍数为2。图15B描绘了用于样本间差异表达的miRNA的聚类分析的热图：每种miRNA基于它们的Ct值被表示为单个条，下面显示了具有从蓝色（负和最低的Ct值）到红色（正和最高的Ct值）的梯度颜色编码。未检出的miRNA显示为黑色条。每一栏表示指示在上面的样品。从所述热图明显看出，在对照样品中用白藜芦醇或

处理显著改变了miRNA的表达水平，它们中的一些可能在心脏保护中发挥重要的关键作用。图15C示出了所有样品的主分量分析。这种多变量分析证明了和白藜芦醇处理的IR样品接近于对照（介质）样品。六种样品的主分量分析揭示，

和IR白藜芦醇的样品在基因表达方面明显与BL介质样品相似。在大多数情况下，它们还容易地在各组之间进行区分。这些结果确实是极为重要的，因为它们证明了白藜芦醇和

二者可以通过恢复IR诱导的基因表达上调或下调来保护缺血心脏。BL：基线；IR：缺血30min和再灌注2h；VEH：介质；RESV：白藜芦醇；LONG：Longevinex。

miR-539是上调最高的miRNA，它具有271个保守的基因靶标，然而它的功能性靶标并没有被报告在文献中。通过计算机分析获得的miR-539的靶标包括基质金属肽酶20、成纤维细胞生长因子14、网格蛋白、轻链多肽（light polypeptide）、骨保护素和转录因子如forkheadbox B1，它们可能在心脏重塑中具有作用。据显示，miR-21调节心脏成纤维细胞中的ERK-MAP激酶信号转导途径，该途径对整个心脏的结构和功能具有作用。Thum等，Nature 456:980-986(2008)。早先还已经表明，白藜芦醇触发MAPK信号转导途径作为心脏中的预调节机制。Das等，J.Pharmacol.Exp.Ther.317:980-988(2006)。我们还调查了样品中的ERK-MAPK途径。如图16A所示，观察到ERK磷酸化在白藜芦醇和处理的基线样品中均增加，而在相应的IR样品中降低。在图16A中，绘制了所指示样品中的磷酸化ERK1/2与总ERK1/2的比率。在p38磷酸化中观察到类似但相反的效应，其中在白藜芦醇或

处理的BL样品中发生的磷酸化明显较少，如图16B所绘出的。在I/R2h样品中出现p38MAPK磷酸化增加，而在白藜芦醇和

处理的I/R2h样品中均由于预调节而减少。在图16B中，绘制了所描述样品中的磷酸化p38MAPK与总p38MAPK的比率。结果表示为每组六只动物的平均值加/减SEM。*p<0.05，与介质（VEH）相比。#p<0.05，与相应的I/R相比。BL：基线；I/R2h：缺血30min和再灌注2h；RESV：白藜芦醇；LONG：

VEGF在心肌细胞中由miR-20b通过HIF1a进行调节，而FOXO1在癌细胞中由miR-27a调节。Cascio等，J.Cell Physiol.224:242-249(2010)；Guttilla等，J.Biol.Chem 284:23204-23216(2009)；Tang等，Cell Death and Differentiation(2008)15:667-671。观察到SIRT1在干细胞中由miR-9调节。Saunders等，Aging(2010)。最近的研究证明，冠状动脉疾病（CAD）中miR-1增加，而在大鼠心肌梗塞模型中，miR-1被β-阻滞剂普萘洛尔下调。Lu等，Cardiovasc.Res.84:434-441(2009)。在任何体内模型中，尚没有显示白藜芦醇对microRNA的具体调节。最近已在人类急性单核细胞性白血病细胞系（THP-1）和人类结肠腺癌细胞系（SW480）中演示了对白藜芦醇效应的微阵列分析。Tili等Biochem.Pharmacol.80:2057-2065(2010)；Tili等，Carcinogenesis 31:1561-1566(2010)。白藜芦醇降低THP-1中的miR-155水平并且调节癌症发生中的关键调节剂JunB和JunD。白藜芦醇还调节靶向TGFbeta途径的效应子的microRNA。参考同上。在癌细胞系SW480中用白藜芦醇处理导致miR-21和miR29c水平降低，而在用白藜芦醇处理的健康心脏中，该水平增加。参考同上。这种异常可能是由于下面这一事实引起的：心肌细胞是几乎不分裂的细胞，而SW480细胞生长迅速，导致细胞内部的微环境完全不同。同样重要的是要指出，白藜芦醇的剂量在癌细胞中高得多（50微摩尔），相似的剂量对培养的人类心肌细胞和内皮细胞是部分有害的（数据未显示）。

针对靶基因和途径分析的miRNA综合分析.利用TargetScan进一步分析差异表达的miRNA它们推定的靶基因，并列在表12中。

大部分靶基因（>1400个基因）具有结合金属离子、结合钙-钾-氯离子的分子功能，与IR损伤后的心脏重构相关。重要的是，miRNA靶基因调节序列特异性DNA因子，例如FOXO1、TRAF3等。SirT1调节几种转录因子，包括FoxO1，其经Akt磷酸化而失活。Brunet等，Science 303:2011-2015(2004)。最近的出版物显示，FoxO1的磷酸化以及SirT1、SirT3和SirT4的激活位于线粒体中，它们在线粒体中调节衰老和能量代谢。Mukherjee等，Free Radic.Biol.Med.46:573-578(2009)。多年来，已知SIRT1被白藜芦醇激活。Baxter等，J.Cosmet.Dermatol.7:2-7。然而，白藜芦醇在激活SIRT1方面可能没有直接作用。Pacholec等，J.Biol.Chem.285:8340-8351(2010)。因为miRNA例如miR-21的调节异常与心脏病如缺血性心脏病直接相关，并且因为白藜芦醇可以通过调节几种miRNA来改善心肌的缺血再灌注损伤，所以本研究的结果说明了在心脏保护中由白藜芦醇通过miRNA介导的复杂调控网络的机制。

总之，microRNA通常通过抑制翻译并且有时通过激活翻译来调节靶基因。在此，我们证明了白藜芦醇或

调节健康心脏和缺血再灌注心脏中的miRNA表达。未来基于这些分析的详细研究将为开发急性I/R损伤中心脏保护用的新型治疗干预铺平道路。

方法.动物.按照与动物和涉及动物的实验相关的法规，用于这个研究的所有动物均接受人道照顾，并遵循NIH出版的1996版《实验动物护理和应用指南》（Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals）中陈述的原则，所有的方案（提案#2008-484）都经美国康涅狄格州Farmington的康涅狄格健康中心大学的机构动物管理委员会（Institutional Animal Care Committee of University of ConnecticutHealth Center）批准。重量在250和300g之间的雄性Sprague–Dawley大鼠随意进食普通大鼠饲料并自由饮水，直到开始实验程序。用白藜芦醇（5mg/kg/天）[Sigma Chemical Company,St.Louis,MO]或

（100mg/kg/天）管饲动物21天。我们实验室以前的研究确定了各化合物用于这个实验的适当剂量和时间期限。Hattori等，Am.J.Physiol.Heart.Circ.Physiol.282:H1988-1995(2002)；Mukherjee等，Can.J.Pharmol.Physiol.2010Nov;88(11):1017-25。

分离的工作心脏的标本和心脏功能评价.在完成喂饲方案之后，用戊巴比妥钠（80mg/kg，i.p.）（Abbott Laboratories,North Chicago,IL,USA）麻醉动物，并腹膜内使用肝素钠（500IU/kg，i.v.）（Elkins-SinnInc.,Cherry Hill,NJ,USA）作为抗凝剂。在符合深度麻醉之后，切下心脏，对主动脉进行插管，并以Langendorff模式在37C下用KHB以恒定（100cm水）灌注压通过主动脉对心脏灌注达5min的冲洗期，如以前所描述的。灌注介质由改性的Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液（毫摩尔浓度：氯化钠118，氯化钾4.7，氯化钙1.7，碳酸氢钠25，磷酸二氢钾0.36，硫酸镁1.2和葡萄糖10）构成，在它氧化之后，pH在37C下是7.4。在冲洗期期间，对左心房进行插管，并将Langendorff标本切换到工作模式10min，其中左心房6充盈压为17cm H2O；主动脉后负荷压被设置在100cm水。在10min结束时，记录基线心脏功能如心率（HR，次/分钟）、主动脉流量（AF，ml/min）、冠脉流量（CF，ml/min）、左心室形成压（LVDP，mmHg）和形成压的一阶导数（LVdp/dt，mmHg/sec）。然后，通过在接近左心房流入和主动脉流出管根部的点处夹紧左心房流入和主动脉流出管，开始30min的全心缺血。在30min缺血结束后，通过松开心房流入和主动脉流出管的夹钳，开始60min或120min的再灌注。前10min的再灌注为Langendorff模式，以避免心室纤颤，然后将心脏切换为顺行工作模式。Mukherjee等，Free Radic.Biol.Med.46:573-578(2009)。

梗塞面积估算.根据TTC方法测量梗塞面积。Mukherjee等，FreeRadic.Biol.Med.46:573-578(2009)；Imamura等，Am.J.Physiol.HeartCirc.Physiol.282:H1996-2003(2002)。在再灌注2h后，将40mL在磷酸盐缓冲液中的1%（w/v）三苯基氯化四唑（TTC）溶液输注到主动脉插管中，并将心脏样品储存在-70C，以备后续分析。将冷冻心脏的切片（0.8mm）固定在2%多聚甲醛中，放置在两个盖玻片之间，并利用Microtek ScanMaker 600z进行数字成像。为了以像素定量梗塞面积，使用标准的NIH图像程序。以像素定量并表示梗塞面积。Mukherjee等，Free Radic.Biol.Med.46:573-578(2009)；Imamura等，Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.282:H1996-2003(2002)。

凋亡性细胞死亡的评价.利用TUNEL法（Promega,Madison,WI）执行凋亡细胞的免疫组织化学检测。Mukherjee等，Free Radic.Biol.Med.46:573-578(2009)；Imamura等,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.282:H1996-2003(2002)。简单地说，在分离心脏的实验之后，将心脏组织立即放入10%福尔马林中并在自动组织固定机中进行固定。按照制造商的说明书执行TUNEL染色。用荧光显微镜（AXIOPLAN2IMAGING,Carl Zeiss Microimaging Inc.,New York），在对荧光素的绿色荧光而言的520620nm下和在对碘化丙啶的红色荧光而言的620nm下，观察荧光染色。对凋亡细胞的数量进行计数，并表示为全部肌细胞群体的百分比。

microRNA分离和cDNA制备.利用Trizol试剂（Invitrogen）从大鼠心脏样品分离总RNA，并利用mirVANA miRNA分离试剂盒（Ambion）进行进一步纯化。Mukhopadhyay等，Am.J.Physiol.HeartCirc.Physiol.296:H1466-1483(2009)。利用Taqman miRNA反转录试剂盒和Megaplex Rodent Pool A和B引物组制备cDNA。

miRNA表达谱分析.在7900HT实时PCR仪（Applied Biosystem,Foster City）中，按照制造商的推荐，在384孔微流体卡上通过TaqManH基因标签啮齿动物阵列（TaqManH Gene Signature Rodent Array），利用定量实时PCR方法执行miRNA表达谱分析。通过两个特异性扩增子引物和一个特异性探针来定量每个miRNA。使得Sanger miRBase v10的全面覆盖度能够跨过TaqManHmicroRNA低密度阵列（TaqManHMicroRNA Low Density Array）的两卡片组（TLDA阵列A和B），分别是对大鼠miRNA特异性的总共518和303个唯一分析。另外，每个阵列含有六个对照分析——5个是精心选择的候选内源性对照分析，一个是阴性对照分析。以前已经使用过通过阵列分析miRNA谱。Chen等，BMC Genomics 10:407(2009)。

miRNA基因表达数据的分析.利用R script（由GeneSpringInformatics Support Team提供）组合被表示为来自阵列A和B的Ct值的实时PCR数据，并利用GeneSpringGX 11.0.2软件（AgilentTechnologies,Santa Clara）进行处理。在分析之后，从阵列A和B检测到591个实体。包括对内源性对照归一化、质量控制、过滤、相关性分析和主分量分析在内的所有统计学分析均由GeneSpring GX软件来执行。

miRNA靶标预测.利用在GeneSpring GX软件内内置和插入的TargetScan预测miRNA靶标。

Western印迹分析.在含有25mM Tris-HCl、25mM NaCl、1mM原钒酸盐、10mM NaF、10mM焦磷酸盐、10mM冈田酸、0.5mM EDTA和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲液中对心脏进行匀浆。将每个心脏均浆液的100微克蛋白质通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并固定在聚偏二氟乙烯膜上。用ERK1/2、磷酸化-ERK1/2、p38MAPK和磷酸化-p38MAPK（Cell signaling Technology,MA）对所述膜进行免疫印迹以评价所述化合物的磷酸化。所产生的印迹被数字化并利用标准NIH图像程序进行密度扫描。

统计学分析.心肌功能参数、梗塞面积和凋亡的值均被表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）。首先执行单因素方差分析，以检验组之间平均值的任何差异。如果确定了差异，通过改良的t检验，将白藜芦醇处理组的值与对照组的值相比较。如果p>0.05，则认为结果有显著性。

实施例8

本发明实施方式的组合物在缺血心肌中的抗血管生成作用

按照Mukhopadhyay P、Das S、Gorbunov N、Otani H、Pacher P和Das D所报告的，设计了一项研究来调查白藜芦醇和

与或不与γ-生育三烯酚一起在缺血心肌中对血液动力功能以及血管生成因子VEGF和HIF-1α的影响。Mukhopadhyay等，白藜芦醇和Longevinex对microRNA20b的调节与缺血心肌中有力的抗血管生成作用有关：白藜芦醇与γ-生育三烯酚的协同效应（Modulation of MicroRNA 20b withResveratrol and Longevinex is Linked with Potent Anti-Angiogenic Actionin the Ischemic Myocardium:Synergistic Effects of Resveratrol andGamma-Tocotrienol）（待刊）。结果证明，

确实对心脏具有有力的抗血管生成作用，这印证了它下调VEGF和HIF-1α的能力。对miRNA20b特异性的antagomir逆转了

的抗血管生成作用。

antagomir-20b对白藜芦醇、

和γ生育三烯酚诱导的HIF-1α和VEGF表达的影响.HIF-1α和VEGF的表达结果显示在图17和18中。

图17A至17C是对Western印迹结果（下方）进行定量的柱状图（上方），描绘了对miR-20b的调节以及antagomiR-20b对VEGF的效应。图17A描绘了以下实验组的VEGF Western印迹分析及其定量：（1）IR假处理（介质），（2）IR+γ-生育三烯酚，（3）IR+白藜芦醇，（4）IR+γ-生育三烯酚+白藜芦醇，和（5）

*p<0.05，与IR假处理相比，其中n=4/组。图17B描绘了相同组的样品在用antagomiR-20b预处理时的VEGF Western印迹分析及其定量。*p<0.05，与IR假处理相比，其中n=4/组。图17C描绘了相同样品的Taqman实时PCR定量。

图18A和18B是对Western印迹结果（下方）进行定量的柱状图（上方），描绘了对miR-20b的调节和antagomiR-20b对HIF-1a表达的效应。图18A描绘了以下实验组的HIF-1a Western印迹分析及其定量：（1）IR假处理（介质），（2）IR+γ-生育三烯酚，（3）IR+白藜芦醇，（4）IR+γ-生育三烯酚+白藜芦醇，和（5）

图18B描绘了相同组的样品在用antagomiR-20b预处理时的HIF-1aWestern印迹分析及其定量。*p<0.05，与IR假处理相比，其中n=4/组。

动物.按照与动物和涉及动物的实验相关的法规，用于这个研究的所有动物均接受人道照顾，并遵循在NIH出版的1996版《实验动物护理和应用指南》（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）中陈述的原则，所有的方案（提案# 2008-484）都经美国康涅狄格州Farmington的康涅狄格健康中心大学的机构动物管理委员会（Institutional Animal Care Committee of University of ConnecticutHealth Center）批准。重量在250和300g之间的雄性Sprague-Dawley大鼠随意进食普通大鼠饲料并自由饮水，直到开始实验程序。用白藜芦醇（5mg/kg/天）[Sigma Chemical Company,St.Louis,MO]或

（100mg/kg/天）或γ-生育三烯酚[5mg/kg/day]，单独或与白藜芦醇（5mg/kg/天）组合管饲动物21天。我们实验室以前的研究确定了各化合物用于这个实验的适当剂量和时间期限。Hattori等，Am.J.Physiol.Heart.Circ.Physiol.282:H1988-1995(2002)；Mukherjee等，Can.J.Pharmol.Physiol.（待刊）。

Antagomir miR-20b对心脏保护以及HIF-1α和VEGF表达的影响.因为包括用白藜芦醇、

和γ-生育三烯酚处理的干预表明miRNA 20b上调数倍，因此，使用antagomir mirRNA 20b来特异性研究miRNA 20b在这些化合物的心脏保护效应方面的作用。在实验之前72h，用antagomir miRNA20b[i.v.]处理所述动物。在72h之后，处死所有动物并测定心肌功能和执行Western印迹分析。HIF-1α和VEGF的Western印迹分析：利用针对VEGF和HIF-1α的抗体，通过Western印迹分析评价白藜芦醇、

和γ-生育三烯酚对HIF-1α和VEGF表达的影响。

结果显示在图17和18中，表明HIF-1α和VEGF二者的表达在处理之后均被显著下调。对VEGF而言，当将γ-生育三烯酚与白藜芦醇一起使用时，VEGF表达进一步降低，提示有协同作用。

引起非常显著的VEGF表达降低，远大于白藜芦醇和γ-生育三烯酚。HIF-1α表达也被所述处理降低；然而，白藜芦醇（reservation）和γ-生育三烯酚之间没有组间差异。同样，

表现出更大的HIF-1α降低[与白藜芦醇和γ-生育三烯酚相比]。antagomir miRNA20b恢复了所有处理中的VEGF和HIF-1α二者的表达，提示VEGF和HIF-1α的表达依赖于miRNA 20b。

缺血心脏中miR-20b的调节以及用白藜芦醇和γ-生育三烯酚逆转.与Western印迹结果一致，miR-20b在缺血再灌注的大鼠心脏中显示出被显著调节。正如用Taqman实时PCR所定量的（图17C），miR-20b在I/R心脏中被显著下调。mir-20b的下调（9.8倍）在γ-生育三烯酚、白藜芦醇、白藜芦醇+γ-生育三烯酚和

预处理的I/R心脏中，分别被逆转到9.4、8.2、15.2和27.5倍。miR-20b靶向HIF1α并调节VEGFα表达。

白藜芦醇、

和γ-生育三烯酚对细胞内活性氧物质（ROS）的活性的影响.通过测量细胞溶质中的荧光氧化产物CM-DCF来监测荧光水平，以此测定的细胞内ROS活性被显示在图19中。图19是柱状图，描绘了在以下实验组中通过DCFDA进行的细胞内活性氧物质的定量：（1）IR假处理（介质），（2）IR+γ-生育三烯酚，（3）IR+白藜芦醇，（4）IR+γ-生育三烯酚+白藜芦醇，和（5）

*p<0.05，与IR假处理相比，其中n=4/组。与对照相比，包括γ-生育三烯酚、白藜芦醇和

在内的所有化合物都降低了细胞内ROS浓度。然而，组之间没有差异。

因为白藜芦醇通过将缺血/再灌注介导的有害的氧化环境转变为还原的环境来发挥功能，因此，用DCF-DA的衍生物CM-H2DCFDA[5-(和-6)-氯甲基-2',7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯，乙酰基酯][10μM；Molecular Probes；Eugene,OR]来测定细胞内ROS浓度，该化合物有附加的硫醇反应性氯甲基，该基团增强了该化合物与细胞内组分结合的能力，从而延长了所述染料的细胞滞留。在诱导缺血/再灌注之前和在实验结束时，静脉内注射所述染料，通过在480nm的激发波长和520nm的发射波长下测量细胞溶质中的荧光氧化产物CM-DCF，为产生的ROS确定荧光水平。

非常有意思的是，正如由VEGF和HIF-1α的下调所证明的，

组合物对心脏显示出更有力的心脏保护作用和更有力的抗血管生成作用。将白藜芦醇的结果与Longevinex组合物相比较，确定了与白藜芦醇相比，

表现出下调VEGF和HIF-1α，并还显示出许多倍诱导microRNA 20-b（有力的抗血管生成因子）。

本说明书中提到的所有出版物和专利均纳入本文作为参考，其程度就像每篇出版物或专利申请各自被具体并单独指出以其全文纳入作为参考一样。虽然已经结合具体实施方式描述了实施方式，但应理解，所述实施方式能够作进一步修改，并且如果对实施方式的变化、应用、或调整总体上遵循了所述实施方式的原则并且所包括的偏离于本公开的内容是在所述实施方式所属技术领域内已知或惯例实践内的并可以适用于上文所阐述的基本特征的话，则本申请旨在涵盖任何这样的变化、应用、或调整。

Claims (20)

1.调节人类对象中的生物活性的方法，所述方法包括：

向有需要的人类对象施用组合物，该组合物包含：

反式白藜芦醇，其量为0.25至5毫克/千克人类对象，

金属螯合剂，和

一种或多种其他抗氧化剂，

其中所述施用与单独施用白藜芦醇相比，有效调节人类对象中的生物活性。

2.权利要求1的方法，其中金属螯合剂包括植酸。

3.权利要求1的方法，其中金属螯合剂的存在量为0.25至5毫克/千克人类对象。

4.权利要求1的方法，其中一种或多种其他抗氧化剂的存在量为0.05至2毫克/千克人类对象。

5.权利要求1的方法，其中一种或多种其他抗氧化剂包括酚类抗氧化剂。

6.权利要求5的方法，其中酚类抗氧化剂选自芹菜素、咖啡酸、表没食子儿茶素3-没食子酸酯（EGCG）、阿魏酸和槲皮素。

7.权利要求1的方法，其中一种或多种其他抗氧化剂包括维生素D。

8.权利要求1的方法，其中所述组合物还包含一种或多种选自透明质酸和硫酸软骨素的糖胺聚糖。

9.权利要求1的方法，其中调节生物活性包括治疗或防止选自以下的疾病或病症：心血管疾病、癌症、黄斑变性、与衰老有关的疾病、神经变性疾病和炎症。

10.权利要求1的方法，其中调节生物活性包括调节生存基因或长寿基因的表达。

11.权利要求10的方法，其中生存基因或长寿基因选自Sirtuin 1、Sirtuin 3、forkhead Foxol转录因子、解偶联蛋白3或丙酮酸脱氢酶激酶4。

12.权利要求1的方法，其中调节生物活性包括调节选自以下的生物活性：氧化磷酸化、肌动蛋白丝的长度或聚合、胞内转运、细胞器的生物合成、胰岛素信号转导、糖酵解、糖原异生和脂肪酸代谢。

13.改善人类对象中的细胞移植疗法的方法，所述方法包括：

向人类对象共同施用移植细胞和组合物，该组合物包含：

反式白藜芦醇，其量为0.25至5毫克/千克人类对象，

金属螯合剂，和

一种或多种其他抗氧化剂，

其中所述共同施用与单独施用移植细胞相比，有效改善人类对象中细胞移植的有效性。

14.权利要求13的方法，其中所述共同施用有效改善移植细胞的存活。

15.权利要求13的方法，其中所述共同施用有效改善移植细胞的增殖。

16.权利要求13的方法，其中移植细胞选自心脏干细胞、神经干细胞、和视网膜色素上皮（RPE）细胞。

17.权利要求13的方法，其中移植细胞是心脏干细胞，并且其中所述共同施用有效改善心脏干细胞的分化。

18.改善人类对象中黄斑变性的治疗的方法，所述方法包括：

向患有黄斑变性或黄斑营养不良的人类对象施用组合物，该组合物包含：

反式白藜芦醇，其量为0.25至5毫克/千克人类对象，

金属螯合剂，和

一种或多种其他抗氧化剂，

其中所述施用与单独施用白藜芦醇相比，有效改善人类对象中黄斑变性治疗的有效性。

19.权利要求18的方法，其中所述施用有效提供一种或多种选自以下的益处：改善视力、缩小视力缺陷和减少眼睛中的脉络膜疣。

20.权利要求18的方法，其还包括向人类对象共同施用所述组合物和黄斑变性治疗，所述黄斑变性治疗选自抗血管生成药物和抗脉络膜疣药物。

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