CN108348563A - 含有紫草根提取物作为有效成分的用于预防、改善或治疗周围神经病变的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防、改善或治疗周围神经病变(peripheral neuropathy)，尤其由抗癌剂诱发的周围神经病变(chemotherapy‑induced peripheral neuropathy，CIPN)的组合物，其含有紫草根(Lithospermi Radix)提取物作为有效成分，具体而言，确认到本发明的紫草根提取物不会对正常细胞诱发毒性，不会对人癌细胞株中抗癌剂的固有的细胞毒性效力产生影响，同时缓解由抗癌剂引起的神经突生长的抑制，并且在由抗癌剂诱发的周围神经病变动物模型中能够有效减少对于增加的疼痛刺激的敏感度，因此所述紫草根提取物能够有效地用作用于预防、改善或治疗由抗癌剂诱发的周围神经病变的组合物的有效成分。

Description

含有紫草根提取物作为有效成分的用于预防、改善或治疗周 围神经病变的组合物
技术领域
本发明涉及用于预防、改善或治疗周围神经病变(peripheral neuropathy)的组合物，其含有紫草根(Lithospermi Radix)提取物作为有效成分。
背景技术
周围神经病变(peripheral neuropathy)是由直接对神经组织造成损伤或对神经组织带来影响的疾病而发病，根据所受影响的神经组织的种类可以区分为感觉神经病症(sensory neuropathy)、运动神经病症(motor neuropathy)、自主神经病症(autonomicneuropathy)。就感觉神经病症而言，会感觉到触觉麻木和抖动现象，对温度变化的感觉会降低，或者感觉到刺痛感或灼痛感，并且会在皮肤上感觉到异常性疼痛等。就运动神经病症而言，会伴随平衡感的减弱和肌力的弱化等，就自主神经病症而言，根据该神经带来影响的器官，会弱化调节膀胱的功能，从而导致尿失禁，或者引发异常的血压及心跳(R.A.Hughes，2002，BMJ，v324，pp466-469；J.M.Torpy et al.，2010，JAMA，v303，p1556)。
作为周围神经病变的原因提出了多种因素，已知的发病原因为遗传性疾病、代谢及内分泌系统的疾病、炎症性疾病、缺乏维生素等营养、治疗癌的过程中施用的抗癌剂等。其中，就由抗癌剂诱发的周围神经病变(chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN)而言，根据症状的严重程度需要减少向患者施用的抗癌剂的用量，或者严重的情况下需要中断抗癌治疗，因此，CIPN起到对抗癌治疗产生非常负面的影响的副作用。已知接受抗癌治疗的患者中，约三分之一左右会经历CIPN，并且经历CIPN的患者的三分之一会受到永久的神经损伤(A.Bhagra和R.D.Rao，2007，Curr Oncol Rep，v9，pp290-299)。CIPN相关症状有手指及脚趾感到麻木(numbness)，刺痛感(tingling)、灼热感(burning)，或者感到冷感及疼痛感，并且会降低触感和肌力(T.Armstrong et al.，2005，Oncol Nurs Forum，v32，pp305-311；C.Visovsky et al.，2008，Clin J Oncol Nurs，v12，pp243-247)。
已知，引起CIPN的抗癌剂有铂(platinum)系列、紫杉烷(taxane)系列、长春花生物碱(vinca alkaloids)、硼替佐米(bortezomib)或沙利度胺(thalidomide)等，已知CIPN的发病率是根据所使用的抗癌剂的种类、用量及施用时间而达到20～75％(G.Cavaletti etal.，2011，Curr Treat Options Neurol，v13，pp180-190)。目前，由抗癌剂引起的神经毒性的确切机理还不得而知，只是推测抗癌剂对普通癌细胞所起作用的细胞毒性机理与对周围神经系统细胞所起作用的机理彼此相似。已知，向患者施用的抗癌剂不仅蓄积在癌细胞中，而且还蓄积在周围神经系统，这种抗癌剂的蓄积最终作用为神经毒性的原因，从而诱发CIPN。
目前为止，还没有美国FDA认可的以治疗CIPN为目的的标准治疗剂。临床上，为了缓解CIPN的症状，使用诸如加巴喷丁(Gabapentin)的抗痉挛剂或诸如阿米替林(Amitriptyline)的抗抑郁剂等，但是在对于CIPN的大规模临床试验中其效果没有得到验证。此外，这种药物具有头晕、犯困等副作用，并且因低的安全界限(safety margin)而具有无法实现高剂量施用的缺点。因此，由于这种CIPN的医学上的不足，目前迫切需要开发更安全且效果得到验证的CIPN治疗剂及用于预防的新的材料。CIPN是具有复合机理的疾病，因此判断为适合开发基于多靶点的材料，由此，从这种材料开发策略观点考虑，传统上一直使用的药用植物或天然物材料可以作为重要的起始物质。
另外，紫草根(Lithospermi Radix)是紫草(Lithospermum erythrorhizonSiebold et Zuccarini)、新疆紫草(Arnebia euchroma Johnst)或内蒙紫草(Arnebiaguttata Bunge)等紫草科(Boraginaceae)的根，其为微细长的纺锤形，偶尔有分支，长度为6～10cm，直径为5～15mm。外表面呈暗紫色至紫褐色，表皮粗糙且容易起薄皮。大部分具有扭曲的深且纵向的槽，有时还到达颈部。根头上有时粘有残茎。容易被折断，被折断的截面为粒状，有很多空隙。用放大镜观察截面时，表皮的外侧呈暗紫色，内侧的淡褐色部分是以不规则的方式排列，颈部接近黄色。根头部的中央有时有空隙，其周围呈紫红色。该药有一点特有的气味，味道为微甜。已知该药可以用作紫色染料，或者降低体温，净化血液，改善血液循环，并且韩国授权专利第0558159号公开了对恢复疲劳和儿童发育具有卓越效果的利用紫草(Lithospermi Radix)根的健康辅助食品的制备方法，韩国公开专利第2015-0047173号公开了含有紫草提取物作为有效成分的用于预防或改善急性胰腺炎转移所引起的肺的渗透性炎症的组合物，但是还没有报道紫草根的周围神经病变相关的技术。
发明内容
要解决的技术问题
本发明人为了解决所述问题而努力的结果，确认了紫草根提取物不会对正常细胞诱发毒性，并且当与抗癌剂联合处理时，不会对人癌细胞中抗癌剂的固有的细胞毒性效力产生影响，同时缓解由抗癌剂引起的神经突生长的抑制，并且在由抗癌剂诱发的周围神经病变动物模型中能够有效减少对于增加的疼痛刺激的敏感度，从而完成了本发明。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供用于预防或治疗周围神经病变(peripheralneuropathy)的药学组合物，其含有紫草根(Lithospermi Radix)提取物作为有效成分。
此外，本发明提供用于预防或改善周围神经病变的健康功能食品组合物，其含有紫草根提取物作为有效成分。
此外，本发明提供抗癌助剂，其含有紫草根提取物作为有效成分。
发明效果
本发明涉及用于预防、改善或治疗周围神经病变(peripheral neuropathy)，尤其由抗癌剂诱发的周围神经病变(chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN)的组合物，其含有紫草根(Lithospermi Radix)提取物作为有效成分，具体有如下效果，本发明的紫草根提取物不对正常细胞引发毒性，不对人癌细胞株中抗癌剂的固有的细胞毒性效力产生影响，同时缓解由抗癌剂引起的神经突生长的抑制，并且在由抗癌剂诱发的周围神经病变动物模型中能够有效减少对于增加的疼痛刺激的敏感度。因此，作为本发明的有效成分的紫草根提取物能够有效地用于预防、改善或治疗由抗癌剂诱发的周围神经病变。
附图说明
图1的(A)是在紫外线(UV)检测器254nm波长下确认的利用高效液相色谱法(HPLC)的紫草根(Lithospermi Radix)提取物(WLR)的成分分析概况(profile)的色谱图，(B)为示出在HPLC上的UV检测器254nm波长下观察到的主要峰(peak)与标准品(sandard)进行比较而鉴定的指标成分的表。
图2为使用神经突生长分析试剂盒(NS225，Millipore)来确认的本发明的紫草根(Lithospermi Radix)提取物(WLR)对由神经生长因子(nerve growth factor，NGF)诱导的PC-12细胞中的神经突生长所带来的影响的结果。
无NGF：没有添加神经生长因子的PC-12细胞；
NGF：添加神经生长因子(100ng/ml)的PC-12细胞；
NGF+Oxal：同时用神经生长因子(100ng/ml)及奥沙利铂(oxaliplatin，150nM)进行处理的PC-12细胞；
NGF+Oxal+V：用神经生长因子(100ng/ml)、奥沙利铂(150nM)及作为阴性对照组的PBS盐水进行处理的PC-12细胞；以及
NGF+Oxal+WLR：用神经生长因子(100ng/ml)、奥沙利铂(150nM)及紫草根提取物(100μg/ml)进行处理的PC-12细胞。
图3的(A)为用本发明的紫草根(Lithospermi Radix)提取物(WLR)以依次增加的浓度进行处理时，确认由神经生长因子诱导的PC-12细胞中的神经突生长效果的图，(B)为相对性地示出形成神经突的细胞的比例及生长的神经突的长度之和的图。
无NGF：没有添加神经生长因子的PC-12细胞；
NGF：添加神经生长因子(100ng/ml)的PC-12细胞；
NGF+Oxal+V：用神经生长因子(100ng/ml)、奥沙利铂(200nM)及作为阴性对照组的PBS盐水进行处理的PC-12细胞；
NGF+Oxal+Ami：用神经生长因子(100ng/ml)、奥沙利铂(200nM)及作为阳性对照组的氨磷汀(amifostine，4μg/ml)进行处理的PC-12细胞；
NGF+Oxal+WLR(25)：用神经生长因子(100ng/ml)、奥沙利铂(200nM)及紫草根提取物(25μg/ml)进行处理的PC-12细胞；
NGF+Oxal+WLR(100)：用神经生长因子(100ng/ml)、奥沙利铂(200nM)及紫草根提取物(100μg/ml)进行处理的PC-12细胞；以及
##或###表示与(+)NGF处理组(b)相比有显著的差异(##，p＜0.01；###，p＜0.001)，*、**或***表示与NGF+Oxal+V处理组(c)相比有显著的差异(*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001)。
图4是为了确认紫草根(Lithospermi Radix)提取物(WLR)缓解周围神经病变性疼痛感的效果，利用由奥沙利铂诱发的周围神经病变动物模型测定机械性异常性疼痛(mechanical allodynia)的结果。
Ctrl：正常对照组；
Oxal+V：施用奥沙利铂(10mg/kg)及作为阴性对照组的0.5％羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)；
Oxal+WLR：施用奥沙利铂(10mg/kg)及紫草根提取物(250mg/kg)；
Oxal+Ami：施用奥沙利铂(10mg/kg)及作为阳性对照组的氨磷汀(100mg/kg)；以及
###表示与正常对照组(Ctrl)相比有显著的差异(p＜0.001)，*、**或***表示与奥沙利铂(10mg/kg)及作为阴性对照组的0.5％的CMC的施用组(Oxal+V)相比有显著的差异(*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001)。
图5是观察由奥沙利铂诱发的周围神经病变动物模型中的脊髓中的作为星形细胞(astrocyte)标志物的GFAP、作为小胶质细胞(microglial cell)标志物的Iba-1及脚掌中作为表皮内神经纤维(intraepidermal nerve fiber，IENF)指标的PGP9.5蛋白质的组织内分布，从而确认本发明的紫草根(Lithospermi Radix)提取物(WLR)能够抑制由奥沙利铂引起的神经系统炎症反应及损伤的图，
Ctrl：正常对照组；
Oxal+Veh：施用奥沙利铂(10mg/kg)及作为阴性对照组的0.5％羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)；
Oxal+WLR：施用奥沙利铂(10mg/kg)及紫草根提取物(250mg/kg)；
Oxal+Ami：施用奥沙利铂(10mg/kg)及作为阳性对照组的氨磷汀(100mg/kg)。
#表示与正常对照组(Ctrl)相比有显著的差异(p＜0.05)，*表示与奥沙利铂(10mg/kg)及作为阴性对照组的0.5％的CMC的施用组(Oxal+Veh)相比有显著的差异(p＜0.05)。
图6为观察由奥沙利铂诱发的周围神经病变动物模型中的背根神经节(dorsalroot ganglion，DRG)中的细胞核的形态学变化，从而确认本发明的紫草根(LithospermiRadix)提取物(WLR)能够缓解由奥沙利铂引起的DRG神经细胞的损伤的图。
Ctrl：正常对照组；
Oxal+Veh：施用奥沙利铂(10mg/kg)及作为阴性对照组的0.5％羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)；
Oxal+WLR：施用奥沙利铂(10mg/kg)及紫草根提取物(250mg/kg)；
Oxal+Ami：施用奥沙利铂(10mg/kg)及作为阳性对照组的氨磷汀(100mg/kg)；以及
#表示与正常对照组(Ctrl)相比有显著的差异(p＜0.05)，*表示与奥沙利铂(10mg/kg)及作为阴性对照组的0.5％的CMC的施用组(Oxal+Veh)相比有显著的差异(p＜0.05)。
图7为通过测定人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblastcell)中的细胞的存活率来确认本发明的紫草根(Lithospermi Radix)提取物(WLR)对正常细胞没有毒性的图。
WLR：用紫草根提取物(0～1000μg/ml)处理。
图8为用作为抗癌剂的奥沙利铂和本发明的紫草根(Lithospermi Radix)提取物(WLR)一同处理人肺癌细胞(A549)和人大肠癌细胞(HCT116)时，确认紫草根提取物不会对奥沙利铂固有的癌细胞毒性产生影响的图，
无处理(No treat)：用奥沙利铂(0～100μg/ml)单独处理；
PBS：用奥沙利铂(0～100μg/ml)及作为阴性对照组的PBS盐水进行处理；
WLR-10：用奥沙利铂(0～100μg/ml)及紫草根提取物(10μg/ml)进行处理；
WLR-30：用奥沙利铂(0～100μg/ml)及紫草根提取物(30μg/ml)进行处理；以及
WLR-100：用奥沙利铂(0～100μg/ml)及紫草根提取物(100μg/ml)进行处理。
图9的(A)为通过生物化学试验确认的本发明的紫草根(Lithospermi Radix)提取物(WLR)抑制人药物代谢酶CYP和细胞内药物转运体P-gp酶的活性的效果，(B)为通过体外(in vitro)试验和实时聚合酶链式反应(real-time PCR)来确认本发明的紫草根(Lithospermi Radix)提取物(WLR)诱导人肝细胞株HepaRG中的CYP和P-gp基因的表达的效果。
M：正常HepaRG细胞；
V：用作为阴性对照组的PBS盐水进行处理的HepaRG细胞；
WLR：用紫草根提取物(10、20、100、500μg/ml)进行处理的HepaRG细胞；以及
PC：作为阳性对照组的用50μM的奥美拉唑(omeprazole)处理CYP1A2和CYP2B6、用10μM的利福平(rifampicin)处理CYP3A4和P-gp的HepaRG细胞。
最佳实施方式
本发明提供用于预防或治疗周围神经病变(peripheral neuropathy)的药学组合物，其含有紫草根(Lithospermi Radix)提取物作为有效成分。
所述提取物优选通过使用水、C1～C4的低级醇或它们的混合物作为溶剂来进行提取，所述低级醇优选为乙醇或甲醇。
优选地，所述紫草根提取物通过包括下述步骤的制备方法来制备，但并不限定于此：
1)向紫草根中加入提取溶剂来进行提取；
2)对步骤1)的提取物进行过滤；以及
3)对步骤2)中经过过滤的提取物进行减压浓缩后进行干燥。
所述方法中，步骤1)的紫草根可以不受限制地使用栽培的紫草根或市售的紫草根等。
所述方法中，步骤1)的紫草根提取物的提取方法可以利用过滤法、热水提取、浸渍提取、回流冷却提取及超声波提取等本领域的常规的方法。所述提取溶剂优选以干燥的紫草根分量的2～40倍的量添加来进行提取。提取温度优选为20～100℃，但并不限定于此。此外，提取时间优选为0.5～10小时，更优选为1～4小时，最优选为2小时，但并不限定于此。此外，提取优选重复2次，但并不限定于此。
所述方法中，步骤3)的减压浓缩优选利用真空减压浓缩器或真空旋转蒸发器，但并不限定于此。此外，干燥优选使用减压干燥、真空干燥、沸腾干燥、喷雾干燥或冻结干燥，但并不限定于此。
所述周围神经病变优选由抗癌剂诱发，所述抗癌剂包含铂(platinum)系列、紫杉烷(taxane)系列、长春花生物碱(vinca alkaloids)、硼替佐米(bortezomib)或沙利度胺(thalidomide)，但并不限定于此，其包含临床、药学、生物医学上可使用的所有抗癌剂。
所述铂系列抗癌剂优选为选自顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)及奥沙利铂(oxaliplatin)中的任一种以上，但并不限定于此。
所述紫杉烷系列抗癌剂优选为紫杉醇(paclitaxel)或多烯紫杉醇(docetaxel)中的任一种或两种，但并不限定于此。
本发明的药学组合物可以为口服或非口服的多种剂型。对所述组合物进行制剂化时，使用通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来制备。
用于口服施用的固体制剂包含片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂是通过在一种以上的化合物中混合至少一种以上的赋形剂来制备，例如，混合淀粉、碳酸钙、蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose)、明胶等来制备。此外，除了单纯的赋形剂以外，还使用诸如硬脂酸镁、滑石等润滑剂。用于口服施用的液体制剂有悬浮剂、内用液剂、乳剂或糖浆剂等，除了经常使用的单纯稀释剂即水、液体石蜡以外，还可以包含多种赋形剂，例如，湿润剂、甜味剂、芳香剂或保存剂等。
用于非口服施用的制剂包含灭菌水溶液、非水性溶剂、悬浮溶剂、乳剂、冻结干燥制剂或栓剂等。非水性溶剂及悬浮溶剂可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物性油、诸如油酸乙酯的可注射的酯等。栓剂的基剂(base)可以使用witepsol、聚乙二醇(Macrogol)、吐温(tween)61、可可脂、月桂脂、甘油、明胶等。
本发明的药学组合物可以通过口服或非口服的方式施用，非口服施用时，优选选择皮肤外用或腹腔内、直肠、静脉、肌肉、皮下、子宫内硬膜或脑血管内注射方式，但并不限定于此。
本发明的药学组合物以药学上有效的量来施用。本发明中，药学上有效的量是指以可适用于医学治疗的合理的受益/危险比例足以治疗疾病的量，有效剂量水平可以根据包括患者的疾病的种类、严重程度、药物的活性、对药物的敏感度、施用时间、施用途径及排出比例、治疗时间、同时使用的药物在内的因素和其他医学领域中众所周知的因素而决定。本发明的组合物可以作为单独治疗剂来施用或与其他治疗剂联合施用，可以依次或同时施用现有的治疗剂和本发明的组合物，可以施用一次或施用多次。考虑到上述的所有因素时，重要的是在没有副作用的情况下能够施用以最少的量获得最大效果的量，这可以由本领域技术人员容易地决定。
就本发明的组合物的施用量而言，其根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、施用时间、施用方法、排泄率及疾病的严重程度有多种范围，以紫草根提取物的量为基准，每天的施用量为0.01～1000mg/kg，优选为30～500mg/kg，更优选为50～300mg/kg，一天可以施用1～6次。但是，可以根据施用途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等会有所增减，因此，所述施用量以任何方法也不会限定本发明的范围。
本发明的药学组合物优选与抗癌剂联合使用，但也可以单独使用，或者可以与手术、放射线治疗、激素治疗及使用生物反应调节剂的方法联合使用。
此外，本发明提供用于预防或改善周围神经病变的健康功能性食品组合物，其含有紫草根(Lithospermi Radix)提取物作为有效成分。
所述提取物优选通过使用水、C1～C4的低级醇或它们的混合物作为溶剂来进行提取，所述低级醇优选为乙醇或甲醇。
优选地，所述紫草根提取物通过包括下述步骤的制备方法来制备，但并不限定于此：
1)向紫草根中加入提取溶剂来进行提取；
2)对步骤1)的提取物进行过滤；以及
3)对步骤2)中经过过滤的提取物进行减压浓缩后进行干燥。
所述方法中，步骤1)的紫草根可以不受限制地使用栽培的紫草根或市售的紫草根等。
所述方法中，步骤1)的紫草根提取物的提取方法可以利用过滤法、热水提取、浸渍提取、回流冷却提取及超声波提取等本领域的常规的方法。所述提取溶剂优选以干燥的紫草根分量的2～40倍的量添加来进行提取。提取温度优选为20～100℃，但并不限定于此。此外，提取时间优选为0.5～10小时，更优选为1～4小时，最优选为2小时，但并不限定于此。此外，提取优选重复2次，但并不限定于此。
所述方法中，步骤3)的减压浓缩优选利用真空减压浓缩器或真空旋转蒸发器，但并不限定于此。此外，干燥优选使用减压干燥、真空干燥、沸腾干燥、喷雾干燥或冻结干燥，但并不限定于此。
所述周围神经病变优选由抗癌剂诱发，所述抗癌剂包含铂(platinum)系列、紫杉烷(taxane)系列、长春花生物碱(vinca alkaloids)、硼替佐米(bortezomib)或沙利度胺(thalidomide)，但并不限定于此，其包含临床、药学、生物医学上可使用的所有抗癌剂。
所述铂系列抗癌剂优选为选自顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)及奥沙利铂(oxaliplatin)中的任一种以上，但并不限定于此。
所述紫杉烷系列抗癌剂优选为紫杉醇(paclitaxel)或多烯紫杉醇(docetaxel)中的任一种或两种，但并不限定于此。
所述健康功能食品可以制备、加工成片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体、丸等形态，但并不限定于此，可以根据法律制备、加工成任何形态。
本发明的含有紫草根提取物作为有效成分的组合物可以直接添加到食品中，或者可以与其他食品或食品成分一起使用，可以根据常规的方法适当使用。有效成分的混合量可以根据其使用目的(用于预防或改善)适当决定。一般而言，健康食品中的所述提取物的量可以以整体食品重量的0.1～90重量份来添加。但是，以健康及卫生作为目的或以调节健康作为目的的长时间摄取时，所述量可以为所述范围以下，由于安全性方面没有任何问题，因此，有效成分也可以以所述范围以上的量来使用。
本发明的健康功能性饮料组合物中，除了以指定的比例含有所述提取物作为必要成分以外，对其他成分没有特别地限制，如同常规的饮料，可以含有多种香味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。上述天然碳水化合物的例为单糖，例如，葡萄糖、果糖等；二糖，例如，麦芽糖、蔗糖等；以及多糖，例如，糊精、环糊精等常规的糖，以及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇。除了上述香味剂以外，作为香味剂可以有利地使用天然香味剂(奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物(例如，瑞鲍迪甙A(rebaudioside A)、甘草甜素(Glycyrrhizin)等)及合成香味剂(糖精、阿斯巴甜(aspartame)等)。
除了上述以外，本发明的紫草根提取物可以含有多种营养剂、维生素、矿物(电解质)、合成风味剂及天然风味剂等风味剂、着色剂及增强剂(enhancing agent)(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂(protective colloidthickening agent)、pH调节剂、稳定化剂、防腐剂、甘油、乙醇、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。除此以外，本发明的紫草根提取物可以含有用于制备天然果汁及果汁饮料及蔬菜饮料的果肉。这些成分可以独立使用或组合使用。这些添加剂的比例并不重要，但是相对于每100重量份的本发明的紫草根提取物，一般在0.1～约20重量份的范围内选择。
此外，本发明涉及抗癌助剂，其含有紫草根(Lithospermi Radix)提取物作为有效成分。所述提取物如前所述。
所述抗癌助剂优选与包含铂(platinum)系列、紫杉烷(taxane)系列、长春花生物碱(vinca alkaloids)、硼替佐米(bortezomib)或沙利度胺(thalidomide)的抗癌剂联合施用，优选具有预防或治疗由抗癌剂诱发的周围神经病变的效果。
以下，利用实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例只是为了更具体地说明本发明而提出的，本发明的范围并不受其限制，这对于本领域具有通常知识的技术人员是显而易见的。
[材料及方法]
1.紫草根(Lithospermi Radix)提取物(WLR)的制备
对100g的购自Kwangmyungdang制药(蔚山，韩国)的干燥的紫草根(Lithospermi Radix)进行粉碎，从而准备粉末形态的样品。将100g的经过粉碎的样品和2L的水放入圆底烧瓶并进行混合。加热连接在附着有冷却管的回流提取装置的恒温水槽(water bath)，并进行提取，总进行2次重复提取，并且每次提取2小时。对于经过提取的提取物，使用滤纸(沃特曼2号(Whatman No.2))和真空泵(vacuum pump)(GAST)进行了减压过滤。利用旋转浓缩仪(旋转蒸发器(Rotary Evaporator)，EYELA)仪器对经过过滤的液体提取物进行减压浓缩。将浓缩的提取物进行冻结干燥，然后用研钵进行均质化，从而获得紫草根的水提取物(WLR)。将该提取物装在密封的塑料容器中并保存在4℃低温储藏室直到试验前。
2.紫草根(Lithospermi Radix)提取物(WLR)的高效液相色谱法(HPLC)分析
为了确认[材料及方法1]中所获得的紫草根提取物(WLR)中含有的成分，以如下所述的条件实施了高效液相色谱法(HPLC)。在1ml的蒸馏水中溶解40mg的紫草根提取物(WLR)后进行过滤。为了HPLC分析，注入20μl的样品。分析中所使用的流动相溶剂A是在超纯水(pure water，霍尼韦尔(Honeywell)Burdick-Jackson)中添加了0.1％(v/v)的三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA，Samchun Pure Chemical有限公司)，溶剂B是使用了乙腈(acetonitrile，J.T Baker，Avantor Performance Material公司)。HPLC分析使用了安装有e2695分离模块(separation module)和2998光电二极管阵列(photodiode array)检测器的Waters Alliance e2695(沃特斯公司(Waters Corporation))仪器，物质分离中所使用的色谱柱使用了Phenomenex Luna C18(2)(250×4.6mm，5μm)。色谱柱的温度设定为40℃，检测仪的波长设定为254nm，对于溶剂A与溶剂B设置梯度(gradient)来实施。以如下比例(v/v)来设置浓度梯度的方式共实施了60分钟：0分钟到10分钟区间的B溶剂∶A溶剂的比例(v/v)为90∶10％，10分钟到60分钟区间的B溶剂∶A溶剂的比例(v/v)为90∶10～40∶60％。对于紫草根提取物中所含有的物质的确认是通过在相同的分析条件下相互比较标准品(standard)的保留时间(retention time，RT)和紫外线(UV)光谱来确认的。
3.细胞的培养
3-1.PC-12细胞的培养
PC-12细胞是购自美国的ATCC(美国典型培养物保藏中心)并使用。用如下方法培养PC-12细胞：使用含有5％的非热灭活胎牛血清(non-heat inactivated fetal bovineserum，FBS)、10％的热灭活马血清(Horse serum，HS)、100单位(unit)/ml的青霉素(penicillin)、100μg/ml的链霉素(streptomycin)的DMEM生长培养基，并在维持37℃、5％的CO2的培养器中，在涂布有I型胶原蛋白的100mm细胞培养皿中培养。基础培养基、血清及其他添加物是购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)并使用。
3-2.人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblast cell)的培养
人包皮成纤维细胞是购自斯信生物(System Biosiences)公司并使用。用如下方法培养人包皮成纤维细胞并使用于之后的体外实验中：使用含有10％的热灭活FBS、100单位/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素的DMEM生长培养基，并在维持37℃、5％的CO2的培养器中，100mm细胞培养皿中培养。基础培养基、血清及其他添加物是购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)并使用。
3-3.人肺癌细胞(A549)及人大肠癌细胞(HCT116)的培养
A549和HCT116细胞是购自美国的ATCC并使用。用如下方法培养细胞并使用于之后的体外实验中：，使用含有10％的热灭活FBS、100单位/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素的RPMI1640生长培养基，并在维持37℃、5％的CO2的培养器中，在100mm细胞培养皿中培养。基础培养基、血清及其他添加物是购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)并使用。
3-4.人肝细胞株(HepaRG)的培养
HepaRG细胞购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)。购买后，HepaRG细胞在没有进行传代培养的情况下直接使用。普通的细胞培养中使用了包含解冻、板&通用的添加因子(Thaw，Plate & General purpose supplement)的William′s mediumE培养基，药物诱导时使用了包含诱导培养基添加因子(Induction Medium Supplement)的William′s medium E培养基，并在涂布有I型胶原蛋白的24孔板中，在维持37℃、5％的CO2的培养器中培养。HepaRG细胞培养中所使用的所有培养基和添加物是购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)。
4.由抗癌剂诱发的周围神经病变(chemotherapy-induced peripheralneuropathy，CIPN)动物模型的制备
本发明中使用了由奥沙利铂(oxaliplatin)诱发的周围神经病变动物模型。从OrientBio株式会社购买8周龄的C57BL6雄性小鼠，并在动物实验室内的笼子中经过一周的驯化期间，然后利用von Frey纤维丝(von Frey filament hair)分三次确认对于右后脚掌刺激反应的基线(base line，BL)并实施分组(N＝8小鼠/组)。之后，将5mg/kg的奥沙利铂注射于尾巴静脉，以一周一次的频率注射2周，共注射2次(共10mg/kg)，从而制备了周围神经病变动物模型。奥沙利铂购自LC Laboratories公司。
5.机械性异常性疼痛(Mechanical allodynia)的测定
将由奥沙利铂诱发周围神经病变2周的小鼠在UGO BASILE公司的线栅(wiregrid)中稳定化1小时，然后利用von Frey纤维丝(von Frey filament hair)向小鼠的右后脚掌给予0.4g的相同的刺激，并测定显示挪开脚掌反应的动物的频率(％)并进行记录。
6.利用实验动物样本的组织学分析
6-1.样本的确保
为了通过组织学分析来确认由奥沙利铂诱发的周围神经病变动物模型中紫草根提取物(WLR)所带来的抑制神经损伤的效果，确保了所需的样本。将戊巴比妥钠(sodiumpentobarbital，50mg/kg)溶液注射于腹腔内进行麻醉，然后将0.9％的生理盐水通过左心室灌入大动脉，从而去除血管内的血液，然后用含有4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)的0.1M的磷酸缓冲液进行灌流固定，并切除了第4号至第6号腰椎神经(lumbar spinalcord)、背根神经节(dorsal root ganglion)、后脚掌皮肤。将切除的组织固定于相同的固定溶液中，然后制作石蜡块并切成4μm，贴在载玻片上并进行干燥，然后在室温下保管直到使用。
6-2.对于小胶质细胞的免疫组织学分析
使用神经胶质细胞中作为星形细胞(astrocyte)标志物的GFAP和作为小胶质细胞(microglial cell)标志物的Iba-1的抗体，对切成4μm厚度的脊髓薄切片实施免疫组织化学荧光染色。使薄切片经过脱石蜡及水合过程后，为了提高抗体的反应性，利用微波并使其暴露于柠檬酸盐缓冲液(Vector lab.，美国)10分钟，从而诱导了抗原性的恢复。
为了使薄切片增加渗透性及防止脱落，所有反应都在包含0.05％的吐温(Tween)20的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(TBS-T)中进行。使组织切片在包含10％的正常山羊血清(normal goat serum，NGS)的TBS-T溶液中反应1小时，从而防止非特异性抗原-抗体反应，并在4℃下，在稀释为1∶200的GFAP、Iba-1的抗体溶液中反应24小时。对于该薄切片，用TBS-T溶液洗涤3次，并侵泡于附着有荧光染料的二次抗体溶液中，在室温下反应1小时，其中所述荧光染料是以1∶2000稀释的。再次用TBS-T溶液洗涤3次，然后盖住盖玻片，从而防止薄切片的损失。
神经胶质细胞的活性度是以相对于通过荧光显微镜观察到的一个视野面积的比例(％)来显示免疫染色的细胞的面积。荧光显微镜图像的分析是利用分析软件(Cellsense，奥林巴斯(Olympus))与对照组进行比较及分析。
6-3.用于表皮内神经纤维(Intraepidermal nerve fiber，IENF)定量化的组织学分析
使用皮肤内神经分布标志物PGP9.5的抗体对切成4μm厚度的后脚掌皮肤组织实施了免疫组织化学荧光染色。使薄切片经过脱石蜡及水合过程后，为了提高抗体的反应性，利用微波并使其暴露于柠檬酸盐缓冲液(Vector lab.，美国)10分钟，从而诱导了抗原性的恢复。为了使薄切片增加渗透性及防止脱落，所有反应都在包含0.05％的吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBS-T)中进行。使组织切片在包含10％的正常山羊血清(normal goatserum，NGS)的TBS-T溶液中反应1小时，从而防止非特异性抗原-抗体反应，并在4℃下，在稀释为1∶200的PGP9.5的抗体溶液中反应24小时。对于该薄切片，用TBS-T溶液洗涤3次，并侵泡于附着有荧光染料的二次抗体溶液中，在室温下反应1小时，其中所述荧光染料是以1∶2000稀释的。再次用TBS-T溶液洗涤3次，然后盖住盖玻片，从而防止薄切片的损失。表皮内神经纤维的表达程度是以相对于荧光显微镜观察视野内的表皮的基底膜长度的比例(IENF/mm)来显示荧光染色的从真皮开始的表皮内神经干细胞的个数。荧光显微镜图像的分析是利用分析软件(Cellsense，奥林巴斯(Olympus))与对照组进行比较及分析。
6-4.背根神经节(dorsal root ganglion)中的细胞形态学分析
利用Azan-Mallory三色染色法(trichrome staining)对切成4μm厚度的背根神经节组织实施了染色。利用光学显微镜观察了被染色的薄切片内的核仁，在具有可分辨的核仁的神经细胞中，具有偏心核仁(eccentric nucleoli)及多个细胞核(multinucleatednucleoli)的神经细胞的数量是以相对于一个视野中观察到的总神经细胞的数量的比例来显示。
7.人药物代谢酶(CYP)及药物转运体(P-gp)活性分析
7-1.体外(in vitro)酶的抑制
为了了解紫草根提取物(WLR)是否抑制人的药物代谢酶(CYP)和药物转运体(P-gp)蛋白质的活性，实施了利用萤光素(luciferin)的P450-Glo试验和Pgp-Glo试验。所使用的系统购自普洛麦格(Promega)公司和赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)。
为了CYP反应，将混合各个酶和基质、磷酸钾(potassium phosphate)溶液的反应混合物分别以12.5μl的量分注于96孔板中。之后，将紫草根提取物分注于该孔中以使最终浓度达到0～1,000μg/ml，并在37℃下根据酶的种类进行10～40分钟的预处理反应。为了开始酶反应，分注25μl的NADPH再生系统(regeneration system)溶液后充分混合反应混合物，然后在37℃下根据酶的种类反应10～45分钟。分注50μl的荧光素酶(luciferase)检测试剂，从而开始荧光素酶反应，并在室温下培养10～30分钟。
为了P-gp反应，在96孔板的相应的孔中分别添加20μl的钒酸钠。之后，以10μl分别添加1mM的维拉帕米(Verapamil)和各个浓度(0～1000μg/ml)的紫草根提取物，并分别添加20μl的经过稀释的P-gp酶。在37℃下反应5分钟，并为了开始ATP反应，分别添加10μl的相当于最终P-gp反应混合物的1/5的MgATP，并在37℃下培养80分钟。添加50μl的检测试剂后在室温下培养20分钟。
发光程度是使用TriStar LB 941多模式酶标仪(Multimode Microplate Reader；伯托公司(Berthold Technologies))并以相对发光单位(RLU)来测定。
7-2.体外(in vitro)酶基因表达的诱导
根据[材料及方法3-4]将人肝细胞株(HepaRG)以5×105个/ml的量接种于涂布有I型胶原蛋白的24孔板中，并在37℃、5％的CO2条件下培养72小时。之后，以用作阳性对照组的药物或各浓度(10、20、100、500μg/ml)的紫草根提取物(WLR)对细胞进行处理24小时。就所使用的阳性对照组药物而言，在CYP1A2和CYP2B6基因诱导中使用了50μM的奥美拉唑(omeprazole)，在CYP3A4和P-gp中使用了10μM的利福平(rifampicin)。阴性对照组使用了蒸馏水。用药物处理24小时，然后使用easy-spinTM总RNA提取试剂盒(iNtRONBiotechnology公司)提取了总RNA。使用多聚胸腺嘧啶(Oligo dT)、总RNA(500ng)以及iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad公司)合成了cDNA。将用PCR扩增的cDNA作为模板，并利用T100热循环仪(Thermal Cycler)(Bio-Rad公司)和SYBR Green(Bio-Rad公司)，以在95℃下进行5秒、在60℃下进行30秒的方式重复40次而实施了实时聚合酶链式反应(real-timePCR)。所述实时聚合酶链式反应(real-time PCR)中所使用的药物代谢酶(CYP)、药物转运体(P-gp)及作为对照组的GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldhehde 3-phosphatedehydrogenase))引物公开于下述表1中。药物代谢酶(CYP)及药物转运体(P-gp)的Ct值的平均是通过三次的重复实验来求出，并根据作为对照组的GAPDH的Ct值来进行补正。
[表1]
用于人CYP及P-gp蛋白质的实时聚合酶链式反应(real-time PCR)的引物及碱基序列
8.统计处理
实验结果是以平均±标准偏差(mean±S.D.)来标记，组之间的统计学平均比较是实施了方差分析/邦费罗尼事后检验(ANOVA/Bonferroni post-hoc)测试。p值用*或#＜0.05、**或##＜0.01、***或###＜0.001来标记。
实施例1.紫草根提取物的HPLC指标分析
利用根据[材料及方法1]制备的紫草根提取物(WLR)，并按照[材料及方法2]实施了HPLC分析。将紫草根提取物中所含有的成分和标准品的保留时间(retention time，RT)和UV光谱进行比较时，可以确认5个峰(peaks)(图1)。所确认的5个峰分别为：RT值为29.745分钟的迷迭香酸(rosmarinic acid)、RT值为30.101分钟的紫草酸(lithospermic acid)、RT值为31.662分钟的丹酚酸B(salvianolic acid B)、RT值为33.772分钟的丹酚酸A(salvianolic acid A)、RT值为38.551分钟的丹酚酸C(salvianolic acid C)。
实施例2.在体外(in vitro)确认紫草根提取物的保护神经的效果
2-1.紫草根提取物的神经保护效果-定性分析
使用神经突生长分析试剂盒(NS225，密理博公司(Millipore))确认了本发明的紫草根提取物的神经保护效果，其中所述神经突生长分析试剂盒利用了1μm的孔(pore)的膜(membrane)。
具体而言，实验之前用含有1％的马血清、100单位/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素、100ng/ml的神经生长因子(nerve growth factor，NGF)的DMEM低血清分化培养基(lowserum differentiation media)培养了按照所述[材料及方法3-1]培养的PC-12细胞72小时，将具有1μm的孔的膜侵泡在以400μl/孔的方式装有10μg/ml的胶原蛋白溶液的24孔板中，以在37℃下进行涂布2小时。经涂布的膜移到装有600μl的分化培养基的孔中，并将分化诱导72小时的PC-12细胞以75,000细胞/100μl/膜的数量进行分注。用引发神经毒性的200nM的奥沙利铂处理细胞，并且为了确认对神经突生长的紫草根提取物的保护效果，用奥沙利铂和所述[材料及方法1]中制备的100μg/ml的紫草根提取物(WLR)一同处理。此外，作为阴性对照组用奥沙利铂和PBS盐水(V)进行处理。将经过处理的细胞在37℃下培养48小时，以使神经突生长至膜的下面，然后取出膜用PBS进行洗涤，并用甲醇固定20分钟。将膜侵泡在装有400μl的神经突染色溶液的孔中进行染色30分钟，然后为了去除神经细胞体(cellbody)，用棉签擦去膜的上面。用PBS洗涤经过染色的膜，并用光学显微镜观察生长至膜下面的神经突。
其结果如图2所示，可以观察到因神经生长因子(NGF)而使得从PC-12细胞长出神经突，并且确认到由神经生长因子诱导的神经突的生长因奥沙利铂(NGF+Oxal)受到抑制，这种奥沙利铂的神经突生长的抑制因紫草根提取物(NGF+Oxal+WLR)得到缓解(图2)。
2-2.紫草根提取物的神经保护效果-定量分析
为了在体外(in vitro)进一步验证本发明的紫草根提取物的神经保护效果，对因神经生长因子(NGF)而从PC-12细胞中诱导的神经突的生长进行了定量分析。
具体而言，将通过所述[材料及方法3-1]的方法培养的PC-12细胞以1×104细胞/孔的浓度均匀地接种于涂布有IV型胶原蛋白的24孔板中，然后在DMEM生长培养基中进行培养，以使附着于地面。12小时后，为了诱导神经突的生成，更换为没有血清且含有100ng/ml的神经生长因子(NGF)的DMEM培养基，同时为了诱导神经毒性，用200nM的奥沙利铂(Oxal)进行处理。分别用25、100μg/ml的浓度的所述[材料及方法1]中制备的紫草根提取物(WLR)进行处理，将500μM的氨磷汀(Ami)用作阳性对照组。3天后，通过光学显微镜和图像分析对生成神经突的细胞的比例和神经突的长度进行定量化。
其结果如图3所示，确认了由神经生长因子(NGF)诱导的神经突的生长因奥沙利铂(NGF+Oxal+V)得到减少，因紫草根提取物(WLR)而使得奥沙利铂所引起的神经突生长的抑制得到缓解(图3A)，并且确认了形成神经突的细胞的比例和生长的神经突的相对长度之合因紫草根提取物得到恢复(图3B)。
实施例3.在体内(in vivo)确认紫草根提取物的抑制CIPN的效果
在由奥沙利铂诱发的周围神经病变动物模型中测量机械性异常性疼痛(mechanical allodynia)，从而确认了本发明的紫草根提取物的抑制CIPN的效果。
具体而言，按照所述[材料及方法4]准备的周围神经病变动物模型中引发疼痛感的2周后开始口服施用按照所述[材料及方法1]制备的250mg/kg的紫草根提取物(WLR)，或者作为阴性对照组的0.5％的羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)，每周施用6次，共施用4周；作为阳性对照组，腹腔施用100mg/kg的氨磷汀，每周施用2次，共施用4周。从引发疼痛感的2周后开始，在施用药物期间以每周一次的频率进行了对小鼠的后脚掌(hindpaw)施加0.4g的相同刺激的von Frey纤维丝(von Frey filament)测试。对刺激的敏感度是以对刺激反应的动物个体的频度(％)来表示。
其结果如图4所示，确认了奥沙利铂的施用使对von Frey纤维丝刺激的脚掌的敏感度约增加35％～75％，所增加的敏感度维持到结束施用奥沙利铂后的4周时间，紫草根提取物有效地减少了因奥沙利铂而增加的刺激敏感度，并持续地将敏感度降低到基础水平(basal level)(30～40％)，直到实验结束的时间点(图4)。
实施例4.通过组织学分析确认紫草根提取物的保护神经的效果
4-1.通过免疫组织学分析确认紫草根提取物的保护神经的效果
在由奥沙利铂诱发的周围神经病变动物模型中确认了紫草根提取物(WLR)带来的脊髓内神经胶质细胞(glial cell)的活性化和抑制脚掌皮肤上的神经损伤的效果。
具体而言，按照[材料及方法4]对C57BL6雄性小鼠用奥沙利铂(10mg/kg)诱发周围神经病变，然后口服施用按照[材料及方法1]制备的紫草根提取物(250mg/kg)和作为阴性对照组的0.5％的羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)，每周施用6次；作为阳性对照组，腹腔施用100mg/kg的氨磷汀，每周施用2次。施用药物2周后，按照[材料及方法6-1]切除腰椎神经(lumbar spinal cord)和后脚掌皮肤(hind foot pad)。利用所确保的样本并按照[材料及方法6-2]，通过分别检测GFAP、Iba-1标记蛋白质来测量腰椎神经的背角(dorsal horn)部位的星形细胞(astrocyte)和小胶质细胞(microglial cell)的活性化，并按照[材料及方法6-3]，通过检测PGP9.5标记蛋白质来测量后脚掌皮肤中的表皮内神经纤维(IENF)的分布。
如图5所示，可以确认因奥沙利铂而活性化的星形细胞(GFAP阳性细胞)及小胶质细胞(Iba-1阳性细胞)的分布得到增加，在施用紫草根提取物(WLR)和用作阳性对照组的氨磷汀的组中，以相似的水平被活性化的星形细胞和小胶质细胞的分布得到减少。此外，可以确认在后脚掌皮肤中，因奥沙利铂而减少的表皮内神经纤维的分布因紫草根提取物及氨磷汀而得到恢复。这种结果表示紫草根提取物能够缓解由奥沙利铂诱发的神经细胞中的炎症反应和上皮组织中的神经损伤(图5)。
4-2.通过DRG细胞形态学分析确认紫草根提取物的保护神经的效果
在由奥沙利铂诱发的周围神经病变动物模型中，确认了紫草根提取物(WLR)带来的背根神经节(DRG)神经细胞中的形态学变异。
具体而言，按照[材料及方法4]，对C57BL6雄性小鼠用奥沙利铂(10mg/kg)诱发周围神经病变，然后口服施用按照[材料及方法1]制备的紫草根提取物(250mg/kg)和作为阴性对照组的0.5％的羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)，每周施用6次；作为阳性对照组，腹腔施用100mg/kg的氨磷汀，每周施用2次。施用药物2周后，按照[材料及方法6-1]切除背根神经节(DRG)。利用所确保的样本并按照[材料及方法6-4]对背根神经节(DRG)中的细胞核及核仁的形态变化进行观察。
如图6所示，因奥沙利铂，具有DRG神经细胞的核仁的位置移动至核的边缘位置的偏心核仁(eccentric)及多个细胞核(multinucleated)的DRG神经细胞的频度得到增加。可以确认这种细胞形态学变化在施用紫草根提取物(WLR)和用作阳性对照组的氨磷汀的组中以相似的水平得到减少，尤其具有多个细胞核的神经细胞在统计上显著减少。这表示紫草根提取物能够缓解由奥沙利铂引起的神经组织内炎症及病理学疼痛感等周围神经病性损伤(Di Cesare Mannelli L，et al.，2013，Pain，v14，pp1585-1600)。
实施例5.在体外(in vitro)正常细胞中确认紫草根提取物的细胞毒性
使用人包皮成纤维细胞(Human foreskin fibroblast cells)来确认紫草根提取物的细胞毒性，以确认紫草根提取物是否在正常细胞中引发毒性。
具体而言，按照与所述[材料及方法3-2]相同的方法培养人包皮成纤维细胞，然后将细胞分注于96孔培养皿中，每孔分注2000个细胞。24小时后，用按照[材料及方法1]制备的被依次稀释的紫草根提取物进行处理，以使最终浓度达到0～1000μg/ml。处理48小时后，使用Ez-Cytox细胞存活率测试试剂盒(DaeilLab Service株式会社)测量了细胞存活率。与没有用紫草根提取物进行处理的组进行对比来计算相对的细胞存活率(％)。
其结果如图7所示，即使用最大1,000μg/ml的浓度的紫草根提取物进行处理，人包皮成纤维细胞也维持95％以上的细胞存活率，因此，确认了紫草根提取物在正常细胞中不会引发细胞毒性(图7)。
实施例6.在体外(in vitro)人肿瘤细胞中评价紫草根提取物和抗癌剂的相互作用
在体外人肿瘤细胞中确认了紫草根提取物是否影响抗癌剂的细胞毒性，以排除在肿瘤临床上对癌患者同时或保持时间间隔施用抗癌剂和紫草根提取物时紫草根提取物对利用抗癌剂的抗癌治疗结果带来负面影响的可能性。
具体而言，按照与所述[材料及方法3-3]相同的方法培养人肺癌细胞(A549)和人大肠癌细胞(HCT116)，然后分别分注于96孔培养板中，以每孔5,000个细胞来分注。24小时后，同时用依次稀释的奥沙利铂(0～100μg/ml)和按照[材料及方法1]制备的相互不同浓度的紫草根提取物(0(PBS)，10、30、100μg/ml)进行处理。阳性对照组使用了只用奥沙利铂处理的细胞组。处理72小时后，使用Ez-Cytox细胞存活率测试试剂盒测量了细胞存活率。奥沙利铂引起的细胞死亡率(％death)用(100-细胞存活率(％))来表示。
其结果如图8所示，确认了单独用奥沙利铂进行处理时，以依赖于浓度的方式抑制了A549人肺癌细胞和HCT116人大肠癌细胞的生长(没有处理(No treat))，并且即使用0(或PBS盐水)至100μg/ml的浓度的紫草根提取物与奥沙利铂一同处理，紫草根提取物也没有对奥沙利铂的抑制癌细胞生长的效果带来任何影响(图8)。因此，通过所述结果确认了在临床上将紫草根提取物与奥沙利铂一同向癌患者联合施用时，对奥沙利铂的抗癌效果不会带来负面影响。
实施例7.确认紫草根提取物对人药物代谢酶(CYPs)及药物转运体(P-gp)的活性产生的影响
联合施用紫草根提取物和包含抗癌剂的普通药的情况下，紫草根提取物与联合施用的药之间会存在发生药物的相互作用所引起的副作用的可能性。联合施用的药物之间的相互作用可以通过确认两种药物以何种形式对人药物代谢酶的活性产生影响来预测。对此，本发明人确认了紫草根提取物是否影响人药物代谢酶的活性和基因表达。调查对象酶中，对占药物代谢的大部分的CYP和药物转运体P-gp蛋白质进行了调查。
7-1.确认紫草根提取物带来的CYPs及P-gp活性的抑制
按照[材料及方法7-1]通过生物化学分析方法调查了紫草根提取物是否抑制人药物代谢酶CYP和药物转运体P-gp的活性。
具体而言，对按照[材料及方法1]制备的被依次稀释的紫草根提取物(WLR)和包含各个酶和基质的反应混合物进行混合。根据酶在预定的反应温度和时间内进行酶反应，并分注荧光素酶(luciferase)检测试剂，从而引起荧光素酶酶反应，并测量所释放出的光的强度，从而测量了相对的酶的活性。
对各个CYP和P-gp的活性进行测量的结果，确认了即使紫草根提取物增加到200μg/ml，测量中所使用的所有CYP酶的活性也维持50％以上(图9A)。尤其，P-gp的情况下，即使紫草根提取物增加到1,000μg/ml，也没有观察到特别的酶活性的抑制(图9A)。
7-2.在体外(in vitro)人肝细胞株(HepaRG)中确认紫草根提取物带来的CYPs及P-gp基因表达的诱导
按照[材料及方法7-2]通过体外(in vitro)实验测量了人肝细胞株Hepa RG，以确认紫草根提取物是否影响人药物代谢酶CYP和药物转运体P-gp基因的表达。
具体而言，将按照[材料及方法3-4]培养的HepaRG细胞暴露于按照[材料及方法1]制备的紫草根提取物(10、20、100、500μg/ml)24小时，然后提取细胞内的总RNA，并将其作为模板合成了cDNA。利用表1中公开的引物(primer)和SYBR Green实施实时聚合酶链式反应(real-time PCR)，从而对HepaRG细胞内靶基因的表达变化进行相对比较。
其结果，观察到在HepaRG细胞中CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、P-gp蛋白质因阳性对照组物质(CYP1A2和CYP2B6是因奥美拉唑(omeprazole)，CYP3A4和P-gp是因利福平(rifampicin))表达有效地得到增加，从而确认了实验中使用的体外(in vitro)系统适当运行。CYP3A4的情况下，观察到因相对高浓度的紫草根提取物而基因表达被抑制的现象，100μg/ml水平的紫草根提取物抑制约68％的CYP3A4基因表达，500μg/ml水平的紫草根提取物抑制约75％的CYP3A4基因表达。因此，由CYP3A4代谢的抗癌剂或普通药与紫草根提取物联合施用时，可能需要考虑临床方面的问题。CYP1A2和CYP2B6、及P-gp蛋白质的情况下，即使紫草根提取物增加到500μg/ml水平，基因表达增加2倍以上，或者没有减少(图9B)。

Claims (20)

1.用于预防或治疗周围神经病变的药学组合物，其含有紫草根提取物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的用于预防或治疗周围神经病变的药学组合物，其特征在于，所述提取物是通过使用水、C1～C4的低级醇或它们的混合物作为溶剂来进行提取。
3.根据权利要求2所述的用于预防或治疗周围神经病变的药学组合物，其特征在于，所述低级醇为甲醇或乙醇。
4.根据权利要求1所述的用于预防或治疗周围神经病变的药学组合物，其特征在于，所述周围神经病变为由抗癌剂诱发的周围神经病变。
5.根据权利要求4所述的用于预防或治疗周围神经病变的药学组合物，其特征在于，所述抗癌剂为铂系列、紫杉烷系列、长春花生物碱、硼替佐米或沙利度胺。
6.根据权利要求5所述的用于预防或治疗周围神经病变的药学组合物，其特征在于，所述铂系列抗癌剂为选自顺铂、卡铂及奥沙利铂中的一种以上。
7.根据权利要求5所述的用于预防或治疗周围神经病变的药学组合物，其特征在于，所述紫杉烷系列抗癌剂为选自紫杉醇及多烯紫杉醇中的一种以上。
8.用于预防或改善周围神经病变的健康功能食品组合物，其含有紫草根提取物作为有效成分。
9.根据权利要求8所述的用于预防或改善周围神经病变的健康功能食品组合物，其特征在于，所述提取物是通过使用水、C1～C4的低级醇或它们的混合物作为溶剂来进行提取。
10.根据权利要求9所述的用于预防或改善周围神经病变的健康功能食品组合物，其特征在于，所述低级醇为甲醇或乙醇。
11.根据权利要求8所述的用于预防或改善周围神经病变的健康功能食品组合物，其特征在于，所述周围神经病变为由抗癌剂诱发的周围神经病变(chemotherapy-inducedperipheral neuropathy)。
12.根据权利要求11所述的用于预防或改善周围神经病变的健康功能食品组合物，其特征在于，所述抗癌剂为铂系列、紫杉烷系列、长春花生物碱、硼替佐米或沙利度胺。
13.根据权利要求12所述的用于预防或改善周围神经病变的健康功能食品组合物，其特征在于，所述铂系列抗癌剂为选自顺铂、卡铂及奥沙利铂中的一种以上。
14.根据权利要求12所述的用于预防或改善周围神经病变的健康功能食品组合物，其特征在于，所述紫杉烷系列抗癌剂为选自紫杉醇及多烯紫杉醇中的一种以上。
15.抗癌助剂，其含有紫草根提取物作为有效成分。
16.根据权利要求15所述的抗癌助剂，其特征在于，所述提取物是通过使用水、C1～C4的低级醇或它们的混合物作为溶剂来进行提取。
17.根据权利要求16所述的抗癌助剂，其特征在于，所述低级醇为甲醇或乙醇。
18.根据权利要求15所述的抗癌助剂，其特征在于，所述抗癌助剂与包含铂系列、紫杉烷系列、长春花生物碱、硼替佐米或沙利度胺的抗癌剂联合施用，以预防或治疗由抗癌剂所诱发的周围神经病变。
19.根据权利要求18所述的抗癌助剂，其特征在于，所述铂系列抗癌剂为选自顺铂、卡铂及奥沙利铂中的一种以上。
20.根据权利要求18所述的抗癌助剂，其特征在于，所述紫杉烷系列抗癌剂为选自紫杉醇及多烯紫杉醇(docetaxel)中的一种以上。
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