CN106692956A - 多酚氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用 - Google Patents

多酚氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多酚氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用，所述多酚氧化酶是茶多酚氧化酶、苹果多酚氧化酶、血浆铜蓝蛋白中的一种，茶多酚氧化酶、苹果多酚氧化酶和血浆铜蓝蛋白均具有优异的抗肿瘤活性，能够显著抑制宫颈癌、肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌等肿瘤细胞增殖及治疗实验性肿瘤的效果，且没有明显的毒副作用；所述抗肿瘤药物含有最少一种所述多酚氧化酶，所述抗肿瘤药物用于治疗包括宫颈癌、肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌。

Description

多酚氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用
技术领域
本发明涉及生物医药及应用领域，尤其涉及多酚氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用。
背景技术
肿瘤尤其是恶性肿瘤是病患者死亡率极高的恶性疾病，其治疗难度极大。20世纪后期近30年以来肿瘤的发病率一直呈趋势，目前世界癌症发病率和死亡率比1990年上升了22%，今后20年还将大约上升50%。到2020年，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万，并有1000万人死于癌症，且其中大部分将发生在发展中国家。我国肿瘤引起的死亡率在所有病因中占17.9%，居第二位，且发病率呈上升趋势。目前我国每年癌症的发病人数约为200万，死于癌症的人数超过140万。长期以来，国际社会花费巨资用于研究治疗癌症的新药和方法。世界制药公司研究开发抗肿瘤新药也不遗余力，抗肿瘤的新技术和新方法随之不断涌现。目前治疗肿瘤的方法可分为：外科治疗、放射治疗、化学治疗、药物治疗和综合治疗等。长期大量的临床表明，外科手术适用于某些局部肿瘤的早期和中期治疗，但多数人靠手术治疗不能防止肿瘤的复发和转移。放疗和化疗虽然有较高的治愈率，但是常引起如骨髓抑制、免疫低下等毒副作用，是的患者难以坚持治疗。而且，化疗药物在治疗过程中出现的耐药性，也成为目前临床治疗的难题之一。而且各种治疗方法所带来的和患者生存质量的下降问题使如何保护机体以及各个器官的功能，提高人的生活质量也日益成为广泛重视的课题。由于上述的各种原因，使世界上许多国家把研究重心移向药物治疗和新药研发方面。
申请人发现多酚氧化酶在抑制肿瘤细胞增殖及治疗实验性肿瘤方面具有令人满意的效果，更令人满意的是该多酚氧化酶在抗肿瘤的同时，没有明显的毒副作用。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供了多酚氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用，具体技术方案如下：
多酚氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用，所述多酚氧化酶是茶多酚氧化酶、苹果多酚氧化酶、血浆铜蓝蛋白中的一种，所述抗肿瘤药物含有最少一种所述多酚氧化酶。也就是说，所述茶多酚氧化酶、苹果多酚氧化酶、血浆铜蓝蛋白中的任一种或任两种以上的组合为所述抗肿瘤药物的主要活性成分。
作为上述技术方案的改进，所述抗肿瘤药物含有茶多酚氧化酶，所述茶多酚氧化酶的制备方法如下：称取-4℃茶鲜叶25重量份，放入组织捣碎机内，加聚乙烯吡咯烷酮50重量份，再加入4℃的pH为5.6的柠檬酸-磷酸盐缓冲液200体积份，启动组织捣碎机进行捣碎作业3min，关闭组织捣碎机并休息5min，再开启组织捣碎机进行捣碎作业2min，将组织捣碎机中的混合物利用四层纱布抽滤得到第一滤液和滤渣，将滤渣放入研钵中，加入25重量份的石英砂以及pH为5.6的柠檬酸-磷酸盐缓冲液25体积份于冰浴中研磨5min，利用尼龙布过滤得到第二滤液，把第一滤液和第二滤液合并放入离心机中进行离心10min，离心机的转速为4000rpm，离心机中的上清液即为茶多酚氧化酶粗酶液；茶多酚氧化酶粗酶液利用硫酸铵进行盐析、DEAE-Sepbarose阴离子交换层析，最终得到电泳纯的茶多酚氧化酶。
作为上述技术方案的改进，所述抗肿瘤药物含有苹果多酚氧化酶，所述苹果多酚氧化酶的制备方法为：将苹果洗净后在4℃保温，再将4℃的苹果去皮后取果肉200重量份加到组织捣碎机中，往组织捣碎机中加入500体积份-20℃的丙酮，组织捣碎机匀浆作业2min；将组织捣碎机中的混合物用布氏漏斗抽滤得到滤饼，滤饼用200体积份-20℃的丙酮再次提取抽滤得到白色粉末，白色粉末冷冻真空干燥即得PPO丙酮粉；将0.5重量份PPO丙酮粉溶于250体积份浓度为0.05mol/L且pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐缓冲溶液的温度为4℃，用磁力搅拌器搅拌磷酸盐缓冲溶液20min得到混合液，将混合液倒入离心机中进行离心作业，离心机转速为5000r/min，离心作业10min后，离心机中的上清液即为苹果多酚氧化酶粗酶液；所述苹果多酚氧化酶粗酶液经过硫酸铵盐析、DEAE Fast Flow柱层析分离后，得到电泳纯的苹果多酚氧化酶。
作为上述技术方案的改进，所述抗肿瘤药物含有血浆铜蓝蛋白，所述血浆铜蓝蛋白的制备方法为：将500体积份的0℃的人血清倒入离心机中，在4℃且转速为6000rpm下离心15min后取上清液X，将取出的上清液X倒入容器中，在往容器中倒入与上清液X同等体积的浓度为0.05mol/L且pH为6.5的磷酸盐缓冲液，在容器中使用磁力搅拌器搅拌，在搅拌过程中还加入250体积份0℃的正丁醇；正丁醇加完后，关闭磁力搅拌器，容器中的物料在4℃下静止30min，再将容器中的物料倒入离心机中，在4℃且转速为8000rpm下离心30min后取上清液Y，上清液Y经过灭菌纱布过滤得脱脂血清；脱脂血清经过硫酸铵盐析、DEAE FastFlow柱层析分离后，获得电泳纯的血浆铜蓝蛋白。
作为上述技术方案的改进，所述抗肿瘤药物用于治疗包括宫颈癌、肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌。
作为上述技术方案的改进，所述抗肿瘤药物还含有紫杉醇和华蟾素。
作为上述技术方案的改进，用所述多酚氧化酶制备抗肿瘤药物时，先使用甲氧基聚乙二醇对所述多酚氧化酶进行表面修饰。
所述多酚氧化酶是一种含铜的单电子氧化酶，属于氧化还原酶类，以直连或芳香族化合物等还原性分子及氧气为底物，能发生催化氧化、脱氢、交联聚合等化学反应的一类酶；多酚氧化酶具有酶的催化活性，可以对酚类化合物进行降解。茶多酚氧化酶、苹果多酚氧化酶、血浆铜蓝蛋白均具有抗肿瘤活性。
所述多酚氧化酶加入药物学上可接受的辅料可制备成多种给药途径的抗肿瘤药物，例如通过口服（包括颊内或舌下）、经鼻、局部（包括颊内、舌下或经皮）、不经肠道（包括皮下、皮内肌肉内、关节内、骨膜内、胸骨内、鞘内、病灶内、静脉内或皮内注射或输注）途径给药。抗肿瘤药物可通过药剂学技术中已知的任何方法，例如通过使活性成分与载体或赋形剂结合来制备。例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸、微球、滴丸、控释制剂缓释制剂或注射剂。
适于口服给药的药物制剂可呈现为独立单位，诸如胶囊、片剂、粉末或颗粒；水性或非水性液体中的溶液、悬浮液、水包油型液体乳液或油包水型乳液。可以以单位计量形式制备口服液体，如溶液、糖浆和酏剂。糖浆可通过使化合物溶解于经适当调味的水溶液中来制备，而酏剂是经由使用无毒载体（vehicle）来制备。还可添加增溶剂和乳化剂（如乙氧基化异十八醇和聚氧化乙烯山梨糖醇醚）、防腐剂。适当时，用于口服给药的剂量单位制剂可以是微胶囊化的也可通过涂布或包埋颗粒物质于聚合物、蜡或类似物中来制备制剂以延长或持续释放还可以以脂质体给药系统（诸如小单层脂质体、大单层脂质体和多层脂质体）的形式给药，脂质体可由各种各样的磷脂，如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。
适于经皮给药的药物制剂可以以意欲保持与接触者表皮紧密接触较长时段的独立贴片形式呈现。适于局部给药的药物制剂可配制为软膏剂、乳膏、悬浮液、洗剂、粉末、溶剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂、搽剂或油剂。
本发明的有益效果：本发明茶多酚氧化酶、苹果多酚氧化酶、血浆铜蓝蛋白均具有优异的抗肿瘤活性，能够显著抑制宫颈癌、肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌等肿瘤细胞增殖及治疗实验性肿瘤的效果，且没有明显的毒副作用；尤其是血浆铜蓝蛋白分别与紫杉醇、华蟾素合用，显著提高紫杉醇合华蟾素的抑瘤率，给多酚氧化酶与其他抗肿瘤药物的联合应用会显著提高抗肿瘤药效带来技术启示。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
茶多酚氧化酶的制备方法：
称取-4℃茶鲜叶25g，放入组织捣碎机内，加聚乙烯吡咯烷酮50g，再加入4℃的pH为5.6的柠檬酸-磷酸盐缓冲液200ml，启动组织捣碎机进行捣碎作业3min，关闭组织捣碎机并休息5min，再开启组织捣碎机进行捣碎作业2min，将组织捣碎机中的混合物利用四层纱布抽滤得到第一滤液和滤渣，将滤渣放入研钵中，加入25g的石英砂以及pH为5.6的柠檬酸-磷酸盐缓冲液25ml于冰浴中研磨5min，利用尼龙布过滤得到第二滤液，把第一滤液和第二滤液合并放入离心机中进行离心10min，离心机的转速为4000rpm，离心机中的上清液即为茶多酚氧化酶粗酶液；茶多酚氧化酶粗酶液利用硫酸铵进行盐析、DEAE-Sepbarose阴离子交换层析，最终得到电泳纯的茶多酚氧化酶。
茶多酚氧化酶粗酶液利用硫酸铵进行盐析、DEAE-Sepbarose阴离子交换层析的纯化作业过程如下：
1）、向茶多酚氧化酶粗酶液中加入固体硫酸铵粉末直至形成饱和度为20%的硫酸铵溶液，饱和度为20%的硫酸铵溶液在4℃下静止30min后，将硫酸铵溶液放入离心机中在8000rpm、4℃下离心30min，分别收集离心机中的上层液和沉淀；将沉淀物保存，所余上层液加固体硫酸铵粉末至饱和度为30%，重复上述操作直至硫酸铵饱和度为85%为止；上述过程中，硫酸铵溶液的饱和度以5%/次的速率递增。
2）、经硫酸铵沉淀后透析的粗蛋白质溶液，加样于经50mmol/L磷酸缓冲液(pH=6.8)平衡的DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(1.0cm×10cm)，用平衡缓冲液冲洗400mL，然后进行NaCl分梯度洗脱。
3）、NaCl分梯度洗脱：分别用含0、0.1、0.2、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液，pH值6.8的磷酸缓冲液进行洗脱，每个梯度洗脱40mL，洗脱速度为0.3mL/min，每管3mL；检测对应试管中茶多酚氧化酶活性，紫外监测波长为280nm，收集茶多酚氧化酶活性峰。将所得酶活最高的蛋白质组分经30kDa超滤离心管浓缩后即得电泳纯的茶多酚多铜氧化酶。茶多酚氧化酶粗酶液利用硫酸铵进行盐析、DEAE-Sepbarose阴离子交换层析后被纯化109.3倍，得到电泳纯的茶多酚多铜氧化酶。
其中，茶多酚氧化酶活性测定方法如下：
取茶多酚氧化酶粗酶液1ml、pH5.6的0.1M柠檬酸盐缓冲液2ml、反应混合液3ml在37℃恒温水浴锅保温中反应10min后，立即加入1g/L偏磷酸0.7ml终止反应；其中，反应混合液是由浓度为0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH5.6）、质量分数为0.l%的脯氨酸和质量分数为1%的邻苯二酚按照体积比10:2:3配制；460nm波长处用10mm比色皿比色，空白混合液中用pH5.6的柠檬酸盐缓冲液代替邻苯二酚。酶活性以460nm波长处每分钟OD增加0.1为1个活力单位。
实施例2
苹果多酚氧化酶的制备方法：
将苹果洗净后在4℃保温，再将4℃的苹果去皮后取果肉200g加到组织捣碎机中，往组织捣碎机中加入-20℃的丙酮500ml，组织捣碎机匀浆作业2min；将组织捣碎机中的混合物用布氏漏斗抽滤得到滤饼，滤饼用-20℃的丙酮200ml再次提取抽滤得到白色粉末，白色粉末冷冻真空干燥即得PPO丙酮粉；将0.5g的PPO丙酮粉溶于250ml浓度为0.05mol/L且pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐缓冲溶液的温度为4℃，用磁力搅拌器搅拌磷酸盐缓冲溶液20min得到混合液，将混合液倒入离心机中进行离心作业，离心机转速为5000r/min，离心作业10min后，离心机中的上清液即为苹果多酚氧化酶粗酶液；所述苹果多酚氧化酶粗酶液经过硫酸铵盐析、DEAE Fast Flow柱层析分离后，得到电泳纯的苹果多酚氧化酶。
所述苹果多酚氧化酶粗酶液经过硫酸铵盐析、DEAE Fast Flow柱层析分离后的作业过程如下：
1）、向苹果多酚氧化酶粗酶液中加入固体硫酸铵粉末直至形成饱和度为20%的硫酸铵溶液，饱和度为20%的硫酸铵溶液在4℃下静止30min后，将硫酸铵溶液放入离心机中在12000rpm、4℃下离心15min，分别收集离心机中的上层液和沉淀；将沉淀物保存，所余上层液加固体硫酸铵粉末至饱和度为30%，重复上述操作直至硫酸铵饱和度为85%为止；上述过程中，硫酸铵溶液的饱和度以5%/次的速率递增。
2）、经硫酸铵沉淀后透析的粗蛋白质溶液，加样于经50mmol/L磷酸缓冲液(pH=6.8)平衡的 DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(1.0cm×10cm)，用平衡缓冲液冲洗400mL，然后进行加盐洗脱。
3）、NaCl分梯度洗脱：分别用含0、0.1、0.2、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液，pH值6.8的磷酸缓冲液进行洗脱，每个梯度洗脱40mL，洗脱速度为0.3mL/min，每管3mL；检测对应试管中苹果多酚氧化酶活性，紫外监测波长为280nm，收集苹果多酚氧化酶活性峰。将所得酶活最高的蛋白质组分经30kDa超滤离心管浓缩后即得电泳纯的苹果多酚氧化酶。苹果多酚氧化酶粗酶液利用硫酸铵进行盐析、DEAE-Sepbarose阴离子交换层析后被纯化57.30倍，得到电泳纯的苹果多酚氧化酶。
苹果多酚氧化酶活性测定方法如下：
取pH为6.8磷酸盐缓冲溶液1ml于1cm比色皿中，加入0.1mol/L邻苯二酚溶液1ml，混合均匀后在400mm处比色，苹果多酚氧化酶的酶液加入后开始记时，每15s记录一次OD随时间的变化值，以最初直线段的斜率△OD/t表示酶活力，一个酶活力单位（U）定义为：在测定条件下，每分钟引起吸光度改变0.001所需的酶量。
实施例3
血浆铜蓝蛋白的制备方法如下：将500ml的0℃的人血清倒入离心机中，在4℃且转速为6000rpm下离心15min后取上清液X，将取出的上清液X倒入容器中，在往容器中倒入与上清液X同等体积的浓度为0.05mol/L且pH为6.5的磷酸盐缓冲液，在容器中使用磁力搅拌器搅拌，在搅拌过程中还加入250ml0℃的正丁醇；正丁醇加完后，关闭磁力搅拌器，容器中的物料在4℃下静止30min，再将容器中的物料倒入离心机中，在4℃且转速为8000rpm下离心30min后取上清液Y，上清液Y经过灭菌纱布过滤得脱脂血清；脱脂血清经过硫酸铵盐析、DEAE Fast Flow柱层析分离后，获得电泳纯的血浆铜蓝蛋白。
所述脱脂血清经过硫酸铵盐析、DEAE Fast Flow柱层析分离后的作业过程如下：
1）、向脱脂血清中加入固体硫酸铵粉末直至形成饱和度为20%的硫酸铵溶液，饱和度为20%的硫酸铵溶液在4℃下静止30min后，将硫酸铵溶液放入离心机中在12000rpm、4℃下离心15min，分别收集离心机中的上层液和沉淀；将沉淀物保存，所余上层液加固体硫酸铵粉末至饱和度为30%，重复上述操作直至硫酸铵饱和度为85%为止；上述过程中，硫酸铵溶液的饱和度以5%/次的速率递增。
2）、经硫酸铵沉淀后透析的粗蛋白质溶液，加样于经50mmol/L磷酸缓冲液(pH=6.8)平衡的 DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(1.0cm×10cm)，用平衡缓冲液冲洗400mL，然后进行加盐洗脱。
3）、NaCl分梯度洗脱：分别用含0、0.1、0.2、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液，pH值6.8的磷酸缓冲液进行洗脱，每个梯度洗脱40mL，洗脱速度为0.3mL/min，每管3mL；检测对应试管中血浆铜蓝蛋白活性，紫外监测波长为280nm，收集血浆铜蓝蛋白活性峰。将所得酶活最高的蛋白质组分经30kDa超滤离心管浓缩后即得电泳纯的血浆铜蓝蛋白。
血浆铜蓝蛋白活性测定方法如下：
取血浆铜蓝蛋白50ul及醋酸盐缓冲液850ul置30℃水浴8分钟后加入基质液900ul，倒置混均，立即吸入Gilford仪器中。试验前仪器用蒸馏水校正零点。实验温度30℃，分析波长550nm，光路1cm，延迟时间30秒，读数间隔30秒，读数点7，因数K4932，以上数字按要求输入syva Clinieal Processor 5000。以2分钟△A值为测定结果。用1U/L表示，即反应在最合适的pH值和基质溶液下，每升血浆铜蓝蛋白每分钟能催化转变1ug分子基质的酶量为一个国际单位（U）。
其中基质液：精取DPPD(CH3)2NC6H4NH2·2HCl 69.08g，放入100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，室温下置20分钟后使用。须新鲜配制。该溶液室温下可保留6-8小时。仪器：Gilford Staster System Ⅲ interfaced with a Syva Clinieal Processor5000。
实施例4
用所述多酚氧化酶制备抗肿瘤药物时，先使用甲氧基聚乙二醇（简称：mPEG）对所述多酚氧化酶进行表面修饰；所述多酚氧化酶为实施例1中制备的茶多酚氧化酶或为实施例2中制备的苹果多酚氧化酶或为实施例3中制备的血浆铜蓝蛋白，具体方法如下：
1）、mPEG的活化
将1.0g的氰脲酰氯与10.0g的mPEG混合，再加入2.0g的无水碳酸钠和5.0g的5A分子筛，溶于无水苯中，常温下搅拌反应，离心去除碳酸钠、5A分子筛等悬浮物，用乙醚沉淀后，再用无水苯溶解沉淀；重复沉淀、溶解6次，去除未反应的氰脲酰氯，真空干燥，得白色粉末，即为活化的mPEG。
2）、固定化酶的制备
将600mg活化的mPEG与20ml多酚氧化酶溶于浓度为0.1mol/L且pH为5的磷酸缓冲液中，在常温下磁力搅拌反应4h，在4℃下，磷酸缓冲液（浓度为0.1mol/L，pH为7.0）中透析24h（透析袋截留相对分子质量8000-14000）将透析液冷冻干燥，即可得到修饰的多酚氧化酶。
所述多酚氧化酶在制备抗肿瘤药物时，用甲氧基聚乙二醇对多酚氧化酶进行表面修饰，能够有效减少蛋白质免疫原性，提高多酚氧化酶在体内的抗消化性，延长代谢半衰期，减少抗肿瘤药物的用量。
抗肿瘤实验1
取实施例1制备的茶多酚氧化酶、实施例2制备的苹果多酚氧化酶和实施例3制备的血浆铜蓝蛋白，分别使用无菌水溶解。取处于对数生长期的各种肿瘤细胞，如：宫颈癌肿瘤细胞Hela；人肝癌细胞株SMMC-7721；人肺癌细胞株A549；人结肠癌细胞株Caco-2；胃癌细胞株MGC-803；分别使用离心机离心5min，离心机转速为2000rpm，用含有质量分数为10%胎牛血清的相应培养液将沉淀细胞浓度调为1×105个/ml细胞悬液后，将细胞接种于96孔培养板。每孔加细胞悬液200ul，然后分别加入一定浓度无菌的多酚氧化酶溶液，使每孔的多酚氧化酶终浓度为0.002、0.01、0.02、0.04、0.05、0.08、0.10、0.20mg/ml，混匀后置37℃、5%CO2孵箱置培养24h后，吸出培养液并用PBS洗涤两次，再向每孔加入5mg/ml的MTT磷酸缓冲液20ul以及150ul培养基，同样条件下继续培养4h后种植培养。2000rpm离心5min，然后弃去培养板孔内的培养液，每孔加入150ul的DMSO，震荡10min，使形成的甲臜颗粒充分溶解后，选择测定波长为570nm，酶标仪检测吸光值。计算多酚氧化酶对肿瘤细胞的IC50，结果见表1。
表1三种多酚氧化酶对肿瘤细胞的抑制作用
细胞株 茶多酚氧化酶 苹果多酚氧化酶 血浆铜蓝蛋白
Hela 0.0236mg/ml 0.0347mg/ml 0.0112mg/ml
SMMC-7721 0.1352mg/ml 0.1252mg/ml 0.0346mg/ml
A549 0.0121mg/ml 0.0157mg/ml 0.0067mg/ml
Caco-2 0.0885mg/ml 0.0951mg/ml 0.0631mg/ml
MGC-803 0.1852mg/ml 0.0823mg/ml 0.0497mg/ml
由结果可知，茶多酚氧化酶、苹果多酚氧化酶和血浆铜蓝蛋白都具有很好的抗肿瘤活性，特别是血浆铜蓝蛋白表现出更好的活性。
抗肿瘤实验2：茶多酚氧化酶、苹果多酚氧化酶和血浆铜蓝蛋白对S180小鼠的影响。
选取接种8d健康状况良好的S180瘤源小鼠，腹部皮肤消毒后抽取腹水，以无菌生理盐水按1:4（腹水体积:生理盐水体积）混悬备用。雄性昆明小鼠82只，18-20g，按体重分层随机均分为7组，分别为模型对照组（0.5%西黄芪胶）、阳性对照组（环磷酰胺，CTX）、茶多酚氧化酶组、苹果多酚氧化酶组、血浆铜蓝蛋白组，均在其右侧腋部皮下接种0.2ml前述悬液。2h后模型对照组和多酚氧化酶组分别灌胃给予受试物或混悬剂，每日一次，连续14日；阳性对照组腹腔注射给予CTX，隔日一次，共7次。末次给药后24h颈椎脱臼处死小鼠，剥离瘤块称重，并计算抑瘤率（1-实验组平均瘤重/模型对照组平均瘤重）×100%。
表2茶多酚氧化酶、苹果多酚氧化酶和血浆铜蓝蛋白对S180小鼠的影响（±s）
组别 动物数（只） 剂量 瘤重（g） 抑瘤率（%）
模型对照 12 —— 1.2±0.45 ——
阳性对照（CTX） 12 40mg/kg 0.35±0.58** 70.8
茶多酚氧化酶组 12 4.8g/kg 0.57±0.45** 52.5
苹果多酚氧化酶组 12 4.8g/kg 0.44±0.29** 63.3
血浆铜蓝蛋白组 12 4.8g/kg 0.34±0.43** 71.7
与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果表明，血浆铜蓝蛋白4.8g/kg灌胃给予，可显著抑制S180在小鼠体内的生长，且其作用强度与环磷酰胺40mg/kg隔日灌胃给予类似；茶多酚氧化酶和苹果多酚氧化酶4.8g/kg灌胃给予也可有效降低瘤重，抑瘤率均超过50%，表明茶多酚氧化酶、苹果多酚氧化酶和血浆铜蓝蛋白均具有较好的抗肿瘤活性。
抗肿瘤实验3：茶多酚氧化酶、苹果多酚氧化酶和血浆铜蓝蛋白对荷艾氏腹水瘤小鼠的影响。
选取接种8d健康状况良好的S180瘤源小鼠，腹部皮肤消毒后抽取腹水，以无菌生理盐水按1:4（腹水体积：生理盐水体积）混悬备用。雄性昆明小鼠82只，18-20g，按体重分层随机均分为7组，分别为模型对照组（0.5%西黄芪胶）、阳性对照组（环磷酰胺，CTX）、茶多酚氧化酶组、苹果多酚氧化酶组、血浆铜蓝蛋白组，均在其右侧腋部皮下接种0.2ml前述悬液。2h后模型对照组和多酚氧化酶组分别灌胃给予受试物或混悬剂，每日一次，持续给药直至动物垂死；阳性对照组腹腔注射给予CTX，隔日一次，共7次。动物垂死时即颈椎脱臼处死小鼠，垂死时间计为生存天数；处死后称重体重，随后放尽腹水，再次称重，其差值计为腹水重量。
表3茶多酚氧化酶、苹果多酚氧化酶和血浆铜蓝蛋白对荷艾氏腹水瘤小鼠的影响（±s）
组别 动物数（只） 剂量 生存天数（天） 腹水量（g）
模型对照 12 —— 16.3±2.5 21.4±1.8
阳性对照（CTX） 12 40mg/kg 17.2±2.3 15.9±1.5**
茶多酚氧化酶组 12 4.8g/kg 19.6±2.3** 15.5±1.1**
苹果多酚氧化酶组 12 4.8g/kg 19.0±3.1* 16.9±2.5**
血浆铜蓝蛋白组 12 4.8g/kg 20.1±2.9** 17.2±2.2**
与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果表明，血浆铜蓝蛋白4.8g/kg灌胃给予，可显著抑制艾氏腹水瘤在小鼠体内的生长，延长动物生存时间，且其作用强度与环磷酰胺40mg/kg隔日灌胃给予类似；茶多酚氧化酶和苹果多酚氧化酶4.8g/kg灌胃给予也可有效延长生存时间，抑制腹水生成，表明茶多酚氧化酶、苹果多酚氧化酶和血浆铜蓝蛋白具有较好的抗肿瘤活性。
抗肿瘤实验4：血浆铜蓝蛋白与紫杉醇及华蟾素联合应用对荷S180小鼠的影响。
选取接种8d健康状况良好的S180瘤源小鼠，腹部皮肤消毒后抽取腹水，以无菌生理盐水按1:4（腹水体积：生理盐水体积）混悬备用。雄性昆明小鼠84只，18-20g，按体重分层随机均分为7组，分别为模型对照组（0.5%西黄芪胶）、阳性对照组（环磷酰胺，CTX）、血浆铜蓝蛋白组、紫杉醇组、华蟾素组、与紫杉醇联合用药组、与华蟾素联合用药组，均在其右侧腋部皮下接种0.2ml前述悬液。2h后模型对照组和多酚氧化酶组分别灌胃给予受试物或混悬剂，每日一次，连续14日；阳性对照组腹腔注射给予CTX，隔日一次，共7次。末次给药后24h颈椎脱臼处死小鼠，剥离瘤块称重，并计算抑瘤率（1-实验组平均瘤重/模型对照组平均瘤重）×100%。
表4血浆铜蓝蛋白与紫杉醇及华蟾素联合应用对荷S180小鼠的影响（±s）
组别 动物数（只） 剂量 瘤重（g） 抑瘤率（%）
模型对照组 12 —— 1.30±0.55 ——
阳性对照组（CTX） 12 40mg/kg 0.48±0.41** 63.1
血浆铜蓝蛋白组 12 1.6g/kg 1.04±0.40 20.0
紫杉醇组 12 5mg/kg 0.85±0.38* 34.6
与紫杉醇联合用药组 12 血浆铜蓝蛋白1.6g/kg+紫杉醇组5mg/kg 0.52±0.26**@ 60.0
华蟾素组 12 1mg/kg 0.73±0.42* 43.8
与华蟾素联合用药组 12 血浆铜蓝蛋白1.6g/kg+华蟾素1mg/kg 0.37±0.18**# 71.5
与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与紫杉醇组比较@P＜0.05；与华蟾素组比较，#P〈0.05。
实验结果表明，血浆铜蓝蛋白1.6g/kg灌胃给予，对S180在小鼠体内肿瘤的生长无明显抑制作用，紫杉醇5mg/kg、华蟾素1mg/kg则显示一定效果。但同样剂量的血浆铜蓝蛋白分别与紫杉醇组5mg/kg、华蟾素1mg/kg合用，则均可显著提高紫杉醇合华蟾素的抑瘤率，表明血浆铜蓝蛋白与其他抗肿瘤药物联合应用可提高这些药物的抗肿瘤药效，同时也给具有抗肿瘤活性的多酚氧化酶与其他抗肿瘤药物的联合应用会显著提高抗肿瘤药效带来技术启示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.多酚氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征在于，所述多酚氧化酶是茶多酚氧化酶、苹果多酚氧化酶、血浆铜蓝蛋白中的一种，所述抗肿瘤药物含有最少一种所述多酚氧化酶。
2.根据权利要求1所述多酚氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物含有茶多酚氧化酶，所述茶多酚氧化酶的制备方法如下：称取-4℃茶鲜叶25重量份，放入组织捣碎机内，加聚乙烯吡咯烷酮50重量份，再加入4℃的pH为5.6的柠檬酸-磷酸盐缓冲液200体积份，启动组织捣碎机进行捣碎作业3min，关闭组织捣碎机并休息5min，再开启组织捣碎机进行捣碎作业2min，将组织捣碎机中的混合物利用四层纱布抽滤得到第一滤液和滤渣，将滤渣放入研钵中，加入25重量份的石英砂以及pH为5.6的柠檬酸-磷酸盐缓冲液25体积份于冰浴中研磨5min，利用尼龙布过滤得到第二滤液，把第一滤液和第二滤液合并放入离心机中进行离心10min，离心机的转速为4000rpm，离心机中的上清液即为茶多酚氧化酶粗酶液；茶多酚氧化酶粗酶液利用硫酸铵进行盐析、DEAE-Sepbarose阴离子交换层析，最终得到电泳纯的茶多酚氧化酶。
3.根据权利要求1所述多酚氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物含有苹果多酚氧化酶，所述苹果多酚氧化酶的制备方法为：将苹果洗净后在4℃保温，再将4℃的苹果去皮后取果肉200重量份加到组织捣碎机中，往组织捣碎机中加入500体积份-20℃的丙酮，组织捣碎机匀浆作业2min；将组织捣碎机中的混合物用布氏漏斗抽滤得到滤饼，滤饼用200体积份-20℃的丙酮再次提取抽滤得到白色粉末，白色粉末冷冻真空干燥即得PPO丙酮粉；将0.5重量份PPO丙酮粉溶于250体积份浓度为0.05mol/L且pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐缓冲溶液的温度为4℃，用磁力搅拌器搅拌磷酸盐缓冲溶液20min得到混合液，将混合液倒入离心机中进行离心作业，离心机转速为5000r/min，离心作业10min后，离心机中的上清液即为苹果多酚氧化酶粗酶液；所述苹果多酚氧化酶粗酶液经过硫酸铵盐析、DEAE Fast Flow柱层析分离后，得到电泳纯的苹果多酚氧化酶。
4.根据权利要求1所述多酚氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物含有血浆铜蓝蛋白，所述血浆铜蓝蛋白的制备方法为：将500体积份的0℃的人血清倒入离心机中，在4℃且转速为6000rpm下离心15min后取上清液X，将取出的上清液X倒入容器中，在往容器中倒入与上清液X同等体积的浓度为0.05mol/L且pH为6.5的磷酸盐缓冲液，在容器中使用磁力搅拌器搅拌，在搅拌过程中还加入250体积份0℃的正丁醇；正丁醇加完后，关闭磁力搅拌器，容器中的物料在4℃下静止30min，再将容器中的物料倒入离心机中，在4℃且转速为8000rpm下离心30min后取上清液Y，上清液Y经过灭菌纱布过滤得脱脂血清；脱脂血清经过硫酸铵盐析、DEAE Fast Flow柱层析分离后，获得电泳纯的血浆铜蓝蛋白。
5.根据权利要求1所述多酚氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物用于治疗包括宫颈癌、肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌。
6.根据权利要求1所述多酚氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物还含有紫杉醇和华蟾素。
7.根据权利要求1所述多酚氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用，其特征在于，用所述多酚氧化酶制备抗肿瘤药物时，先使用甲氧基聚乙二醇对所述多酚氧化酶进行表面修饰。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112007145A (zh) * 2020-09-10 2020-12-01 四川大学华西医院 血浆铜蓝蛋白在治疗多发性硬化症中的新用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1749258A (zh) * 2005-07-19 2006-03-22 华中师范大学 多酚氧化酶模型化合物制备和应用
CN101760453A (zh) * 2008-12-11 2010-06-30 湖州来色生物基因工程有限公司 苹果多酚氧化酶的提取及测定方法
CN104498448A (zh) * 2014-12-31 2015-04-08 湖南农业大学 茶叶多酚氧化酶同工酶单体pp01和pp02及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1749258A (zh) * 2005-07-19 2006-03-22 华中师范大学 多酚氧化酶模型化合物制备和应用
CN101760453A (zh) * 2008-12-11 2010-06-30 湖州来色生物基因工程有限公司 苹果多酚氧化酶的提取及测定方法
CN104498448A (zh) * 2014-12-31 2015-04-08 湖南农业大学 茶叶多酚氧化酶同工酶单体pp01和pp02及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
顾其胜: "人铜蓝蛋白的抗肿瘤及中和毒性激素活性", 《国外医学.生物制品分册》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112007145A (zh) * 2020-09-10 2020-12-01 四川大学华西医院 血浆铜蓝蛋白在治疗多发性硬化症中的新用途

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