CN109876154A - 一类枸杞多糖修饰的纳米粒子制备及其抗肿瘤活性研究 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一类枸杞多糖修饰的纳米粒子制备及其抗肿瘤活性研究，具体涉及枸杞多糖作为主链，5‑氨基水杨酸和铂的配合物进行共价键合制备低毒性的复合纳米粒子（LBP/5‑ASA/Pt），提高药物的抗癌疗效。通过测定细胞的半致死数（IC50）表明复合纳米粒子对肺癌细胞有很强的杀伤力和抑制性，达到40μg/mL，但是对人体正常肝细胞几乎没有毒性，本发明利用枸杞多糖为主体修饰键合分子，为高毒性抗癌药物的修饰和应用提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及一类枸杞多糖修饰的纳米粒子制备及其抗肿瘤活性研究。
背景技术
癌症作为一种致命的疾病，一直受到研究者的密切关注，铂类药物能够与细胞核内染色体DNA结合适其发挥抗肿瘤药物的主要机制，在各种抗癌药物中，铂类药物的使用占据了所有抗癌药物的一半以上，然而，传统的小分子铂抗癌药物具有剂量限制性毒性，例如神经性毒性，肾毒性、周期短、代谢快、选择性差和耐药性等，限制了铂类药物的临床应用(Mol. Neurobiol. 2017, 10, 364-367)；为了减少铂类抗癌药物对正常组织的损伤，纳米粒子药物输送系统可用于铂类抗癌药物的输送 (Eur. J. Med. Chem. 2018, 155, 639-650, Adv. Polym. Nanopart. 2015, 7, 17964-17979)。
纳米粒子给药系统可以提高抗癌药物的传输效率，减少药物副作用，其主要目的是防止非靶向性组织或者部位暴露于治疗药物中，或因特定药物的高剂量而对靶向组织造成损害 (ACS Symp. Ser. 2006, 934, 289-303, Tissue Barriers. 2014, 2: 58-65)，但是单一用药系统作用比较弱，长时间使用激发肿瘤其他相关恶性增殖机制, 导致药物疗效降低，肿瘤复发等不良反应，而智能多糖给药系统提供了一种有效的治疗方法，可以在疾病组织或细胞的固定点释放，也可以在特定的损伤和特定的生理环境中释放(Biomaterial, 2014, 35, 6439-6453)。
枸杞属于茄科植物，芭蕉的红色果实被用作传统的中草药，以促进健康和长寿，并作为数千年来的食品补充剂，具有多种生物活性和药理作用，用于治疗多种疾病，包括高脂血症、糖尿病、肝炎、血栓形成、癌症、男性不育和免疫功能低下（Separation andPurification Technology, 2012, 100: 66-73），其中枸杞多糖 (lycium barbarumpolysaccharide，LBP)是枸杞的主要活性成分，其抗氧化、免疫调节、抗应激、抗结肠癌、神经保护等活性（Int. J. Biol. Macromol, 2016, 85: 294-301）。
为了减少药物的用量和不良反应，本发明提供一类枸杞多糖修饰的纳米粒子制备及其抗肿瘤活性研究，具体涉及枸杞多糖作为主链，与5-氨基水杨酸和铂的配合物进行共价键合制备低毒性的复合纳米粒子（LBP/5-ASA/Pt），提高药物的抗癌疗效，通过测定细胞的半致死数（IC50）表明复合纳米粒子对癌细胞的抑制性，为高毒性抗癌药物的修饰和应用提供了新的思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一类枸杞多糖修饰的纳米粒子制备及其抗肿瘤活性研究。
本发明提供一类枸杞多糖修饰的纳米粒子制备及其抗肿瘤活性研究，反应方程式如式I所示，标记为LBP/5-ASA/Pt的复合纳米粒子：
式I
LBP/5-ASA/Pt的复合纳米粒子
LBP/5-ASA/Pt的复合纳米粒子的合成过程如下：
将500 mg的枸杞多糖用不同pH值的缓冲液100 mL中完全溶解，然后加入一定质量的5-氨基水杨酸(5-ASA)在不同温度下搅拌24 h；然后将500 mg的化合物1一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析一定时间，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt。
LBP/5-ASA/Pt纳米粒子抗肿瘤活性研究方法如下：
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100.0 μL的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL不同质量浓度的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt，处理48 h后加入MTT（20 μL 5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h，分离体系中产生的紫色沉淀，用200 µL 二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，计算细胞半致死数IC50值。
本发明所述的缓冲液pH值为2-7，其中优选5，
本发明其特征在于，所述5-氨基水杨酸的质量为100-1000 mg，其中优选500，；
本发明所述反应温度为25-50 ℃，其中优选25 ℃，
本发明所述去离子水透析时间为12-72 h，其中优选48 h，
本发明所述加入复合纳米粒子的质量浓度为10-200 μg/mL，其中优选40 μg/mL。
与已经报道的抗癌药物相比，本发明提供了一类枸杞多糖修饰的纳米粒子制备及其抗肿瘤活性研究，以枸杞多糖作为主链，与5-氨基水杨酸和铂的配合物进行共价键合制备低毒性的复合纳米粒子（LBP/5-ASA/Pt），通过枸杞多糖和5-氨基水杨酸与铂药的联合使用，能够使两种药物在低含量时对肿瘤细胞具有明显的抑制作用，本发明利用枸杞多糖为主体修饰键合分子，克服抗癌药物的耐药性和毒副作用问题，为高毒性抗癌药物的修饰和应用提供了新的思路。
附图说明
本发明有3幅附图：
图1为枸杞多糖修饰的纳米粒子LBP/5-ASA/Pt的扫描电镜图，
图2为枸杞多糖修饰的纳米粒子LBP/5-ASA/Pt的XRD谱图，
图3为枸杞多糖修饰的纳米粒子LBP/5-ASA/Pt抗癌活性数据。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段更易于了解，下面结合具体实施例进一步进行描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
将500 mg的枸杞多糖用pH=2的缓冲液100 mL完全溶解，然后加入500 mg的5-氨基水杨酸(5-ASA)在25℃下搅拌24 h，然后将500 mg的化合物1一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析48 h，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt。
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100.0 μL的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL 40 µg/mL的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt ，处理48 h后加入MTT（20 μL 5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h，分离体系中产生的紫色沉淀，用200µL 二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，其IC50分别为80 μg/mL，155 μg/mL。
实施例2
将500 mg的枸杞多糖用pH=5的缓冲液100 mL完全溶解，然后加入500 mg的5-氨基水杨酸(5-ASA)在25℃下搅拌24 h，将500 mg的化合物1一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析48 h，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt。
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100.0μl的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL，40 µg/mL的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt，处理48 h后加入MTT（20 μL 5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h，分离体系中产生的紫色沉淀，用200 µL二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，其IC50分别为40 μg/mL，195 μg/mL。
实施例3
将500 mg的枸杞多糖用pH=7的缓冲液100 mL完全溶解，然后加入500 mg的5-氨基水杨酸(5-ASA)在25℃下搅拌24 h，然后将500 mg的化合物1一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析48 h，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt。
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100.0μl的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL，40 µg/mL的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt，处理48 h后加入MTT（20 μL 5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h，分离体系中产生的紫色沉淀，用200 µL二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，其IC50分别为107 μg/mL，182 μg/mL。
实施例4
将500 mg的枸杞多糖用pH=5的缓冲液100 mL中完全溶解，然后加入500 mg的5-氨基水杨酸(5-ASA)在50 ℃下搅拌24 h，然后将500 mg的化合物1一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析48 h，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt。
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100.0 μL的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL，40 µg/mL的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt (0-1280 µg/mL)，处理48 h后加入MTT（20 μL 5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h，分离体系中产生的紫色沉淀，用200 µL 二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，其IC50分别为60 μg/mL，180 μg/mL。
实施例5
将500 mg的枸杞多糖用pH=5的缓冲液100 mL中完全溶解，然后加入500 mg的5-氨基水杨酸(5-ASA)在37 ℃下搅拌24 h，然后将500 mg的化合物1一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析48 h，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt。
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100.0 μL的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL，40 µg/mL的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt (0-1280 µg/mL)，处理48 h后加入MTT（20 μL 5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h，分离体系中产生的紫色沉淀，用200 µL 二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，其IC50分别为98 μg/mL，216 μg/mL。
实施例6
将500 mg的枸杞多糖用pH=5的缓冲液100 mL完全溶解，然后加入500 mg 的5-氨基水杨酸(5-ASA)在25 ℃下搅拌24 h，然后将500 mg的铂的化合物1一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析12 h，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt。
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100.0 μL的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL，40 µg/mL的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt，处理48 h后加入MTT（20 μL 5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h，分离体系中产生的紫色沉淀，用200 µL 二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，其IC50分别为87 μg/mL，225 μg/mL。
实施例7
将500 mg的枸杞多糖用pH=5的缓冲液100 mL完全溶解，然后加入500 mg的5-氨基水杨酸(5-ASA)在25 ℃下搅拌24 h，然后将500 mg的铂的化合物1一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析24 h，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt。
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100.0 μL的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL，40 µg/mL的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt，处理48 h后加入MTT（20 μL 5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h，分离体系中产生的紫色沉淀，用200 µL 二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，其IC50分别为91 μg/mL，225 μg/mL。
实施例8
将500 mg的枸杞多糖用pH=5的缓冲液100 mL完全溶解，然后加入100 mg的5-氨基水杨酸(5-ASA)在25 ℃下搅拌24 h，然后将500 mg的铂的化合物1一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析48 h，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt。
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100.0 μL的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL，40 μg/mL的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt，处理48 h后加入MTT（20 μL 5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h，分离体系中产生的紫色沉淀，用200 µL 二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，其IC50分别为114 μg/mL，226 μg/mL。
实施例9
将500 mg的枸杞多糖用pH=5的缓冲液100 mL完全溶解，然后加入250 mg的5-氨基水杨酸(5-ASA)在25 ℃下搅拌24 h，然后将500 mg的化合物1一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析48 h，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt。
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100.0 μL的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL，40 μg/mL的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt，处理48 h后加入MTT（20 μL 5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h，分离体系中产生的紫色沉淀，用200 µL 二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，其IC50分别为125 μg/mL，178 μg/mL。
实施例10
将500 mg的枸杞多糖用pH=5的缓冲液100 mL完全溶解，然后加入1000 mg的5-氨基水杨酸(5-ASA)在25 ℃下搅拌24 h，然后将500 mg的化合物1一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析48 h，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt。
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100.0 μL的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL，40 μg/mL的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt，处理48 h后加入MTT（20 μL 5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h，分离体系中产生的紫色沉淀，用200 µL 二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，其IC50分别为103 μg/mL，165 μg/mL。
实施例11
将500 mg的枸杞多糖用pH=5的缓冲液100 mL完全溶解，然后加入500 mg的5-氨基水杨酸(5-ASA)在25 ℃下搅拌24 h，然后将500 mg的化合物1一次性加入上述混合液中，一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析48 h，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt。
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100.0 μL的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL，20 μg/mL的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt，处理48 h后加入MTT（20 μL 5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h，分离体系中产生的紫色沉淀，用200 µL 二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，其IC50分别为58 μg/mL，198 μg/mL。
实施例12
将500 mg的枸杞多糖用pH=5的缓冲液100 mL完全溶解，然后加入500 mg的5-氨基水杨酸(5-ASA)在25 ℃下搅拌24 h，然后将500 mg的化合物1一次性加入上述混合液中，一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析48 h，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt。
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100.0 μL的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL，100 μg/mL的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt，处理48 h后加入MTT（20 μL，5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h，分离体系中产生的紫色沉淀，用200µL二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，其IC50分别为23 μg/mL，95 μg/mL。
实施例13
将500 mg的枸杞多糖用pH=5的缓冲液100 mL完全溶解，然后加入500 mg的5-氨基水杨酸(5-ASA)在25 ℃下搅拌24 h，然后将500 mg的化合物1一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析48 h，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt。
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100.0 μL的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL，200 μg/mL的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt，处理48 h后加入MTT（20 μL，5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h，分离体系中产生的紫色沉淀，用200µL 二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，其IC50分别为8 μg/mL，23 μg/mL。
Claims (6)
1.一类枸杞多糖修饰的纳米粒子制备及其抗肿瘤活性研究，其特征在于：反应方程式如式I所示，标记为LBP/5-ASA/Pt的复合纳米粒子：
式I
LBP/5-ASA/Pt复合纳米粒子
LBP/5-ASA/Pt的复合纳米粒子的合成过程如下：
将500 mg的枸杞多糖用不同pH值的缓冲液100 mL中完全溶解，然后加入一定质量的5-氨基水杨酸(5-ASA)在不同温度下搅拌24 h；然后将500 mg的化合物1一次性加入上述混合液中，在室温反应24小时后将混合溶液置于透析袋（MWCO:3500 Da）中用去离子水透析一定时间，溶液冷冻干燥后，获得复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt；
LBP/5-ASA/Pt纳米粒子抗肿瘤活性研究方法如下：
将肺癌细胞（A549）和正常肝细胞（293A）分别用100 μl的1640培养基和DMEM基孵育贴壁生长24 h，分别加入100 µL不同质量浓度的复合纳米粒子LBP/5-ASA/Pt，处理48 h后加入MTT（20 μL 5 mg/mL），放于培养箱继续培养4 h；分离体系中产生的紫色沉淀，用200 µL二甲基亚砜溶液溶解后测定吸光度，计算细胞半致死数IC50值。
2.根据专利1要求所述一类枸杞多糖修饰的纳米粒子制备及其抗肿瘤活性研究，其特征在于，所述缓冲液的pH值为2-7，其中优选5。
3.根据专利1要求所述一类枸杞多糖修饰的纳米粒子制备及其抗肿瘤活性研究，其特征在于，所述5-氨基水杨酸的质量为100-1000 mg，其中优选500 mg。
4.根据专利1要求所述一类枸杞多糖修饰的纳米粒子制备及其抗肿瘤活性研究，其特征在于，所述反应温度为25-50 ℃，其中优选25 ℃。
5.根据专利1要求所述一类枸杞多糖修饰的纳米粒子制备及其抗肿瘤活性研究，其特征在于，所述去离子水透析时间为12-72 h，其中优选48 h。
6.根据专利1要求所述一类枸杞多糖修饰的纳米粒子制备及其抗肿瘤活性研究，其特征在于，所述加入复合纳米粒子的质量浓度为10-200 μg/mL，其中优选40 μg/mL。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112121060A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-12-25 | 安徽大学 | 一种具有肿瘤细胞生长抑制效应的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物及其制备与用途 |
| CN115120560A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-30 | 宁夏医科大学 | 一种抗肿瘤靶向药物递送系统及其制备方法和应用 |
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| 王莹等: "枸杞多糖-铂基纳米药物的组装及其抗肿瘤活性研究", 《中国化学会第十四届全国生物无机化学学术会议会议手册》 * |
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