CN104498448A - 茶叶多酚氧化酶同工酶单体pp01和pp02及其制备方法 - Google Patents

茶叶多酚氧化酶同工酶单体pp01和pp02及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种茶叶多酚氧化酶同工酶单体PP01和PP02及其制备方法，是针对当前茶叶多酚氧化酶纯化倍数低、上载样品蛋白量少、操作时间长，获得的同工酶仅为某一相对分子量的同工酶而未能获得氨基酸序列结构、分子量、等电点、酶学性质等明确的同工酶单体的技术现状，依次采用丙酮粉富集酶蛋白、硫酸铵分级沉淀、强阴离子交换色谱、凝胶介质层析、分子鉴定、酶学性质分析等技术及优化工艺，分离制备了氨基酸序列结构、分子量、等电点、酶学性质等明确的两种茶叶多酚氧化酶同工酶单体。该方法不仅具有成本低、制备量大、针对性强、操作周期短等优点，而且对深化茶叶多酚氧化酶同工酶的分离纯化技术、推动利用茶叶多酚氧化酶同工酶单体定向酶促合成茶黄素组分以及茶叶多酚氧化酶优势同工酶开发利用、同工酶固定化、酶蛋白结构解析、酶基因克隆与功能验证等具有重要理论实践意义。

Description

茶叶多酚氧化酶同工酶单体PP01和PP02及其制备方法
技术领域
本发明属于酶制备技术，具体涉及一种茶叶多酚氧化酶同工酶单体PP01和PP02，及该二同工酶单体的制备方法。
背景技术
多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)是一种氧化还原酶，普遍存在于生物体中，具有多种同工酶及不同生理功能，并且不同生物体、不同品种、不同生长季节、不同组织中的多酚氧化酶同工酶存在显著差异。王坤波对不同来源多酚氧化酶同工酶进行了电泳分析，发现梨有11条同工酶、茶叶有5条、蘑菇有5条、苹果有4条、而漆酶只有1条。刘仲华在研究红茶加工工艺过程中，发现PPO同工酶酶带数目和同一酶带在不同加工阶段酶活性具有差异，并且对底物专一性也有不同。Buzen等通过聚丙烯酸胺凝胶电泳分离出6种多酚氧化酶组分，并借助电子计算机估算其分子量均在35-117KDa范围内。龚志华对20种茶树品种茶鲜叶同工酶电泳比较发现PPO同工酶在酶带数目、迁移率和酶带染色深浅方面存在差异。
茶叶多酚氧化酶是茶树体内最重要的酶类之一，它不仅对茶树生理代谢起重要作用，而且在茶叶加工过程中，通过不同程度地抑制或利用多酚氧化酶活性，可以将茶鲜叶加工成不同茶类。国内外许多学者通常将茶叶PPO作为一个整体，围绕PPO的提取与分离、酶学特性、生理遗传、酶源筛选与利用、酶促合成茶黄素以及PPO的固定化等内容，作了大量而系统的研究，并取得了显著的研究成果。但在茶叶PPO同工酶单体的分离鉴定以及利用同工酶单体来定向酶促合成茶黄素及其组分方面，则未能取得突破性进展。
无论是开展多酚氧化酶分子生物学、酶工程研究，还是利用PPO同工酶定向酶促合成茶黄素及其组分，都要从相应酶源中提取分离出多酚氧化酶单体。目前分离纯化多酚氧化酶同工酶的方法，通常是采用盐析、透析、层析等技术，但由于PPO同工酶分子间有特异性，如分子大小、酸碱性、极性和电荷等，从而使得制备同工酶单体成为这一领域的关键技术瓶颈。国内外最新报道的茶叶多酚氧化酶同工酶的分离制备技术，也由于受研究方法与技术手段的限制，存在纯化倍数低、上载样品蛋白量少、操作时间长的缺点，获得的同工酶仅为某一相对分子量的同工酶，而未能获得氨基酸序列结构、分子量及等电点等明确的同工酶单体。
因此，建立茶叶多酚氧化酶同工酶单体的制备方法，对于深化现有多酚氧化酶同工酶的分离纯化技术、推动利用多酚氧化酶同工酶单体定向酶促合成茶黄素组分以及开展多酚氧化酶优势同工酶的开发利用、同工酶的固定化、酶蛋白结构解析、酶基因克隆与功能验证等具有重要的理论实践意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种茶叶多酚氧化酶同工酶单体PP01和PP02及其制备方法，根据茶鲜叶中多酚氧化酶同工酶种类多、同工酶含量低的特点，依次采用丙酮粉富集目标酶蛋白、硫酸铵分级沉淀、强阴离子交换色谱、凝胶介质层析等技术及优化工艺，从茶叶中制备出两种多酚氧化酶组分，本方法具有成本低、制备量大、针对性强、操作周期短等优点。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种茶叶多酚氧化酶同工酶单体PP01和PP02，所述同工酶单体PP01的分子量为85089Da、等电点为6.1、能测定的4个肽段氨基酸序列为YLFAGVVDGR、AGINVIQIDEAALR、YGAGIGPGVYDIHSPR和LQEELDIDVLVHGEPER；同工酶单体PPO2的分子量为42531.7Da、等电点为5.49、能测定的3个肽段氨基酸序列为YSLKPLVPR、LASLADLYVNDAFGTAHR和VDLNVPLDDNLNTDDTR。
本发明提供的另一种技术方案是：一种制备上述茶叶多酚氧化酶同工酶单体PP01和PP02的方法，该方法步骤如下，结合参见图1-图4：
1)粗酶液制备：取茶树鲜叶，按每50-70g茶树鲜叶加150-220mL-30～-20℃预冷的体积浓度为100％的丙酮的比例，于茶树鲜叶中加入丙酮，快速匀浆2-3min，依次用80％体积浓度和100％体积浓度的-30～-20℃预冷丙酮真空抽滤淋洗，直至淋洗液无色，茶渣冷冻干燥(是指在-40～-30℃真空冷冻干燥24-30小时)成丙酮粉；再于丙酮粉中加入0-4℃预冷的pH为5.6的0.1M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液匀浆浸提1-3小时，期间震荡4-8次，取浸提液过滤、离心(离心温度为4℃，转速为8000-12000r/min，时间为15-20min)，得上清液即为粗酶液；其中，该0.1M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中含有8-10％甘油、0.08-0.12％维生素C、1mM EDTA及3-5％PVPP，加入量为每50-70g茶树鲜叶制得的丙酮粉加180-200mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；
上述茶树鲜叶取自一芽二叶的政和大白、福云6号、桃源大叶茶树品种。
2)硫酸铵分级沉淀：于粗酶液中加入无水硫酸铵粉末至30％饱和度，0-4℃静置2小时，在4℃以8000-12000r/min离心15-20min，收集上清液，再加入无水硫酸铵粉末至80％饱和度，0-4℃静置4小时，以12000-18000r/min于4℃离心10-15min，收集沉淀；按1g沉淀加10-15ml pH为7.5的含有8-10％甘油的20mM Tris-HCl平衡缓冲液的比例，于沉淀中加入Tris-HCl平衡缓冲液，置于超滤管中离心以浓缩脱盐，得超滤液；
上述于超滤管中离心以浓缩脱盐时，超滤管为Amicon Ultra 10K型号规格，在0-4℃、3500-5000r/min转速下离心，所用缓冲液是pH为7.5的含8-10％甘油的20mM Tris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液3-4次，每次离心时间为20-30min。
3)离子交换色谱：将上述超滤液上Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换柱，先用平衡缓冲液上柱至280nm吸收基线平衡，再用含有0-0.25mol/L氯化钠的平衡缓冲液进行梯度洗脱(NaCl浓度分别为0M、0.025M、0.05M、0.075M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M)，每个梯度洗脱6个柱床体积，自动收集器收集洗脱液，检测收集管酶活和280nm吸光值，分别合并具有酶活性的不同梯度洗脱液，分别置于超滤管中离心以浓缩脱盐，获得酶比活性较高的二酶液(图1及图2)；其中，平衡缓冲液是pH为7.5的含8-10％甘油的20mM Tris-HCl缓冲液；
上述于超滤管中离心以浓缩脱盐时，超滤管为Amicon Ultra 10K型号规格，在0-4℃、3500-5000r/min转速下离心，所用缓冲液是pH为7.5的含8-10％甘油的20mM Tris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液2-3次，每次离心时间为20-30min。
4)凝胶介质层析：将上述两酶液分别上Sephadex G-75凝胶柱，先用平衡缓冲液上柱至280nm吸收基线平衡，再用含0.10-0.15M NaCl的平衡缓冲液洗脱2个柱床体积，自动收集器收集洗脱液，检测酶活和280nm吸光值，合并具有酶活性的部分，最后将两酶液有酶活性的部分分别置于超滤管中离心以浓缩脱盐，得到凝胶介质层析纯化后的二酶液；
收集洗脱液，检测酶活和280nm吸光值，合并具有酶活性的部分，最后将分别置于超滤管中离心以浓缩脱盐，得到二酶液；
上述平衡缓冲液是指pH为7.5的含8-10％甘油的20mM Tris-HCl缓冲液或pH为6.8的含8-10％甘油的20mM磷酸缓冲液。
上述于超滤管中离心以浓缩脱盐时，超滤管为Amicon Ultra 10K型号规格，在0-4℃、3500-5000r/min转速下离心，所用缓冲液是pH为7.5的含8-10％甘油的20mM Tris-HCl缓冲液或pH为6.8的含8-10％甘油的20mM磷酸缓冲液，期间置换缓冲液2-3次，每次离心时间为20-30min。
5)将所得凝胶介质层析纯化后的二酶液分别再次重复步骤4)的凝胶介质层析步骤，获得两种多酚氧化酶同工酶单体，对获取的同工酶单体进行SDS-PAGE电泳后，切胶、酶解、ZipTop脱盐，采用MALDI-TOF/TOF质谱测试，分别为同工酶单体PP01和PP02。
上述二种同工酶单体的分子鉴定的具体步骤如下：
1)胶内酶解及ZipTip脱盐
将胶粒切碎后转入EP管中，加入200-400μL 100mM NH4HCO3/30％CAN脱色液，清洗脱色至透明，吸弃上清液，加入100mM NH4HCO3，室温孵育15min。吸弃上清冻干，再加入5μL 2.5-10ng/μL测序级Trypsin(Promega)溶液，37℃反应过夜，20小时左右；吸取酶解液，转移至新EP管中，原管加入100μL60％ACN/0.1％TFA，超声15min，合并酶解液冻干；若有较多盐分，则用ZipTip(millipore)进行脱盐。
2)质谱分析
冻干后的酶解样品，取2μL 20％乙腈复溶。取1μL溶解样品，直接点于样品靶上，让溶剂自然干燥后，再取0.5μL过饱和CHCA基质溶液点至对应靶位上并自然干燥。样品靶经氮气吹净后放入仪器进靶槽并用串联飞行时间质谱仪(5800MALDI-TOF/TOF，AB SCIEX)进行测试分析，激光源为335nm波长的Nd:YAG激光源，加速电压为2KV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据，一级质谱(MS)扫描范围为800-4000Da，选择信噪比大于50的母离子进行二级质谱(MS/MS)分析，每个样品上样选择8个母离子，二级质谱(MS/MS)累计叠加2500次，碰撞能量2KV，CID关闭。
3)数据库检索
质谱测试用Mascot2.2软件检索相应数据库，最后得到两种同工酶单体结果如下表1所示。
表1 同工酶单体鉴定结构表
上述二同工酶单体酶学性质分析如下：
a、同工酶单体最适温度确定
用pH＝5.6的柠檬酸-磷酸缓冲液，在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃系列温度下，以10mmol/L邻苯二酚为底物，测定多酚氧化酶的活力，分别确定各同工酶的最适温度，结果如图5所示。
b、同工酶单体最适pH值确定
在35℃温度下，设置pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0系列梯度，以10mmol/L邻苯二酚为底物，测定多酚氧化酶的活力，分别确定各同工酶的最适pH值，结果如图6所示。
c、同工酶单体热稳定性分析
在pH值5.5条件，在70℃、80℃、90℃温度下分别处理1min、2min、3min、4min、5min后，以10mmol/L邻苯二酚为底物，分析多酚氧化酶同工酶单体的酶活力及热稳定性，结果如图7、图8所示。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明采用丙酮粉和匀浆浸提相结合的方法制备粗酶液，提高了单位酶蛋白浓度，减少了茶多酚和色素类物质的干扰。
2.本发明所有缓冲液均加入了体积分数8-10％甘油，有力避免了同工酶酶变性和酶丢失，保护了游离状态下酶蛋白的稳定性。
3.本发明采用的离子交换填料为强阴离子交换剂，柱床体积仅为10-14mL，上样蛋白量达到56.57mg，在含0.05M和0.10M NaCl浓度的缓冲液洗脱时直接获取同工酶粗制液，具有针对性强、蛋白载样量大、操作时间短的优点。
4.对制备的同工酶单体进行了分子结构鉴定，确定了其分子量、等电点及匹配的肽段氨基酸序列，为可后续酶蛋白结构解析、酶学特性研究、定向酶促合成茶黄素组分以及酶基因克隆和功能验证奠定坚实的技术基础。
附图说明
图1为本发明离子交换色谱收集峰的酶比活图。
其中：1为含0M NaCl洗脱液，2为含0.025M NaCl洗脱液，3为含0.05MNaCl洗脱液，4为含0.075M NaCl洗脱液，5为含0.10M NaCl洗脱液，6为含0.15MNaCl洗脱液，7为含0.20M NaCl洗脱液，8为含0.25MNaCl洗脱液。
图2为本发明离子交换色谱收集峰的同工酶PAGE活性电泳图谱。
其中：1为含0M NaCl洗脱液，2为含0.025M NaCl洗脱液，3为含0.05MNaCl洗脱液，4为含0.075M NaCl洗脱液，5为含0.10M NaCl洗脱液，6为含0.15MNaCl洗脱液，7为含0.20M NaCl洗脱液合并浓缩样品，8为含0.25MNaCl洗脱液。
图3为本发明分离所得的茶鲜叶多酚氧化酶同工酶PPO1的SDS-PAGE电泳图谱。
其中：Marker单位为KDa，1为粗酶液，2为超滤液，3为离子层析洗脱3峰，4为3峰首次凝胶层析酶液，5为重复凝胶层析酶液。
图4为本发明分离所得的茶鲜叶多酚氧化酶同工酶PPO2的SDS-PAGE电泳图谱。
其中：Marker单位为KDa，1为粗酶液，2为超滤液，3为离子层析洗脱5峰，4为5峰首次凝胶层析酶液，5为重复凝胶层析酶液。
图5为同工酶单体最适温度图。
图6为同工酶单体最适pH图。
图7为同工酶单体PPO1热稳定性图。
图8为同工酶单体PPO2热稳定性图。
图9为对比实例结果的SDS-PAGE电泳图谱。
其中：1为对比实验制备的PPO2样品，2为对比实验制备的PPO1样品。
具体实施方式
实验准备：
1.主要设备和材料：
组织匀浆机；真空抽滤装置；低温离心机(美国Thermo公司)；多功能酶标仪(美国Thermo公司)；中压层析系统；5800MALDI-TOF/TOF质谱仪(AB SCIEX公司)；Starorius精密电子天平(瑞士Starorius公司)；DSY-2-8水浴锅(北京国华医疗器械厂)；GAMMA1-20真空冷冻干燥机(德国Christ公司)，AmiconUltra 10K型号超滤管。政和大白茶树一芽二叶鲜叶、福云6号茶树一芽二叶鲜叶及桃源大叶茶树一芽二叶鲜叶(-80℃保存备用)。
2.酶活测定
取酶液50μL，加反应混合液150μL(反应混合液按pH5.6柠檬酸-磷酸缓冲液:0.1％脯氨酸:1％邻苯二酚＝10:2:3体积比配制)于酶标板中，空白对照用煮沸过的酶液代替。在37℃孵育下，用多功能酶标仪420nm处测酶活，每隔30s记录一次OD值。酶活性以每毫升酶液每30秒E420值增加0.001为1个酶活力单位(U)。
实施例1
(1)粗酶液制备
称取50g政和大白茶树一芽二叶鲜叶，加入-20℃预冷丙酮150mL组织匀浆2.5min后，用1000mL的-20℃丙酮(80％体积浓度)真空抽滤淋洗，直至淋洗液无色，最后加200mL的-20℃丙酮(100％体积浓度)淋洗，将茶渣-30℃冷冻干燥24小时得丙酮粉。于得到的干燥丙酮粉中加入180mL的0.1M的pH＝5.6的柠檬酸-磷酸缓冲液(含10％甘油、0.2gVc、1mM的EDTA、6g PVPP)中，在4℃下匀浆，然后置于4℃下浸提1h，期间震荡4次，取浸提液于四层纱布过滤后，以8000r/min离心20min，收集上清液，即为粗酶液。
(2)硫酸铵分级沉淀
于上述粗酶液中缓慢加入22.14g无水硫酸铵粉末，用磁力搅拌器溶解完全后，于4℃静置2h，然后于4℃以10000r/min离心18min，收集上清液，再缓慢加入43.605g无水硫酸铵粉末，用磁力搅拌器溶解完全后，于4℃静置4h；然后于4℃以12000r/min离心15min，收集沉淀，于沉淀中加入20mL的pH＝7.520mM的Tris-HCl缓冲液(含10％甘油)，置于超滤管中离心浓缩脱盐(用pH为7.5的含10％甘油的20mM Tris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液4次，4℃、3500r/min、每次30min)，得超滤液。
(3)离子交换色谱
将上述超滤液上样于Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换柱，柱床体积为10mL，首先用pH＝7.5的20mM Tris-HCl平衡缓冲液(含10％甘油)平衡，直到280nm吸光值基线平衡，然后用含有0-0.25mol/L氯化钠的Tris-HCl平衡缓冲液(20mmol/L，pH＝7.5，含10％甘油)进行梯度洗脱，每个梯度洗脱6个柱床体积，自动收集器收集洗脱液，按每3min时间间隔收集，3mL/管。检测收集管酶活和280nm吸光值，分别合并具有酶活性的不同梯度洗脱液，并分别置于超滤离心管中离心以浓缩脱盐(所用缓冲液为pH＝7.5的含10％甘油的20mMTris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液2次，4℃、5000r/min、每次20min)，获得酶比活力较高的两部分酶液。
(4)凝胶介质层析
将步骤(3)得到的两部分酶液分别上样于Sephadex G-75凝胶柱，柱床体积170mL，首先用pH＝7.5的20m Tris-HCl缓冲液(含10％甘油)洗脱，直到280nm吸光值基线平衡，然后用含0.10mol/L氯化钠的Tris-HCl平衡缓冲液(20mmol/L，pH＝7.5，含10％甘油)洗脱2个柱床体积，按每6min时间间隔收集，3mL/管，测定酶活和280nm吸光值，合并有酶活性的吸收峰，最后置于超滤离心管中离心以浓缩脱盐(所用缓冲液为pH＝7.5的含10％甘油的20mMTris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液2次，4℃、5000r/min、每次20min)，分别获得酶液。
(5)重复凝胶层析
将步骤(4)得到的二酶液再次上样于Sephadex G-75凝胶柱，其它操作与步骤(4)相同，进一步去除杂蛋白，获得多酚氧化酶同工酶单体PP01和PP02。
实施例2
(1)粗酶液制备
称取60g福云6号茶树一芽二叶鲜叶，加入-25℃预冷丙酮200mL组织匀浆2min后，用1400mL的-20℃丙酮(80％体积浓度)真空抽滤淋洗，直至淋洗液无色，最后加200mL的-20℃丙酮(100％体积浓度)淋洗，将茶渣于-25℃冷冻干燥26小时得丙酮粉。于得到的干燥丙酮粉中加入190mL的0.1M的pH＝5.6的柠檬酸-磷酸缓冲液(含9％甘油、0.24gVc、1mM的EDTA、10g PVPP)中，在4℃下匀浆，然后置于4℃下浸提2h，期间震荡6次，取浸提液于四层纱布过滤后，用10000r/min离心18min，收集上清液，即为粗酶液。
(2)硫酸铵分级沉淀
于上述粗酶液中缓慢加入24.6g无水硫酸铵粉末，用磁力搅拌器溶解完全后，于2℃静置2h，然后于4℃以12000r/min离心15min，收集上清液，再缓慢加入48.45g无水硫酸铵粉末，用磁力搅拌器溶解完全后，于2℃静置4h；然后于4℃以18000r/min离心10min，收集沉淀，在沉淀中加入25mL的pH＝7.520mM的Tris-HCl缓冲液(含8％甘油)，置于超滤管中离心浓缩脱盐(用pH为7.5的含8％甘油的20mM Tris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液3次，4℃、4200r/min、每次25min)，得超滤液。
(3)离子交换色谱
将上述超滤液上样于Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换柱，柱床体积为14mL，首先用pH＝7.5的20mM Tris-HCl缓冲液(含8％甘油)平衡，直到280nm吸光值基线平衡，然后用含有0-0.25mol/L氯化钠的Tris-HCl平衡缓冲液(20mmol/L，pH＝7.5，含8％甘油)进行梯度洗脱，每个梯度洗脱6个柱床体积，自动收集器收集洗脱液，按每3min时间间隔收集，3mL/管。检测收集管酶活和280nm吸光值，分别合并具有酶活性的不同梯度洗脱液，并分别置于超滤离心管中离心以浓缩脱盐(所用缓冲液为pH＝7.5的含8％甘油的20mMTris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液3次，4℃、4000r/min、每次25min)，获得酶比活力较高的两部分酶液。
(4)凝胶介质层析
将步骤(3)得到的两部分酶液分别上样于Sephadex G-75凝胶柱，柱床体积200mL，首先用pH＝6.8的20mM磷酸缓冲液(含8％甘油)洗脱，直到280nm吸光值基线平衡，然后用含0.15mol/L氯化钠的pH＝6.8的20mM磷酸缓冲液(含8％甘油)洗脱2个柱床体积，按每6min时间间隔收集，3mL/管，测定酶活和280nm吸光值，合并有酶活性的吸收峰，最后置于超滤离心管中以浓缩脱盐(所用缓冲液为pH＝6.8的含8％甘油的20mM磷酸缓冲液，期间置换缓冲液2次，4℃、4000r/min、每次25min)，分别获得酶液。
(5)重复凝胶层析
将步骤(4)得到的二酶液再次上样于Sephadex G-75凝胶柱，其它操作与步骤(4)相同，进一步去除杂蛋白，获得多酚氧化酶同工酶单体PP01和PP02。
实施例3
(1)粗酶液制备
称取70g桃源大叶茶树一芽二叶鲜叶，加入-30℃预冷丙酮220mL组织匀浆3min后，用1500mL的-25℃丙酮(80％体积浓度)真空抽滤淋洗，直至淋洗液无色，最后加320mL的-25℃丙酮(100％体积浓度)淋洗，将茶渣于-30℃冷冻干燥30小时得丙酮粉。于得到的干燥丙酮粉中加入200mL的0.1M的pH＝5.6的柠檬酸—磷酸缓冲液(含9％甘油、0.22gVc、1mM的EDTA、8g PVPP)中，在4℃下匀浆，然后置于4℃下浸提3h，期间震荡8次，取浸提液于四层纱布过滤后，以12000r/min离心15min，收集上清液，即为粗酶液。
(2)硫酸铵分级沉淀
于上述粗酶液中缓慢加入22.96g无水硫酸铵粉末，用磁力搅拌器溶解完全后，于4℃静置2h，然后于4℃以8000r/min离心20min，收集上清液，再缓慢加入45.22g无水硫酸铵粉末，用磁力搅拌器溶解完全后，于4℃静置4h；然后于4℃以15000r/min离心12min，收集沉淀，在沉淀中加入18mL的pH＝7.520mM的Tris-HCl缓冲液(含9％甘油)，置于超滤管中离心浓缩脱盐(用pH为7.5的含9％甘油的20mM Tris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液4次，4℃、5000r/min、每次20min)，得超滤液。
(3)离子交换色谱
将上述超滤液上样于Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换柱，柱床体积为12mL，首先用pH＝7.5的20mM Tris-HCl缓冲液(含9％甘油)平衡，直到280nm吸光值基线平衡，然后用含有0-0.25mol/L氯化钠Tris-HCl缓冲液(20mmol/L，pH＝7.5，含9％甘油)进行梯度洗脱，每个梯度洗脱6个柱床体积，自动收集器收集洗脱液，按每3min时间间隔收集，3mL/管。检测收集管酶活和280nm吸光值，分别合并具有酶活性的不同梯度洗脱液，并分别置于超滤离心管中离心以浓缩脱盐(所用缓冲液为pH＝7.5的含9％甘油的20mMTris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液2次，4℃、3500r/min、每次30min)，获得酶比活力较高的两部分酶液。
(4)凝胶介质层析
将步骤(3)得到的两部分酶液分别上样于Sephadex G-75凝胶柱，柱床体积180mL，首先用pH＝7.5的20mM Tris-HCl缓冲液(含9％甘油)洗脱，直到280nm吸光值基线平衡，然后用含0.15mol/L氯化钠的Tris-HCl缓冲液(20mmol/L，pH＝7.5，含9％甘油)洗脱2个柱床体积，按每6min时间间隔收集，3mL/管，测定酶活和280nm吸光值，合并有酶活性的吸收峰，最后置于超滤离心管中离心以浓缩脱盐(所用缓冲液为pH＝7.5的含9％甘油的20mMTris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液2次，4℃、3500r/min、每次30min)，分别获得酶液。(5)重复凝胶层析
将步骤(4)得到的二酶液再次上样于Sephadex G-75凝胶柱，其它操作与步骤(4)相同，进一步去除杂蛋白，获得多酚氧化酶同工酶单体PP01和PP02。
对比实例
(1)粗酶液制备
称取50g一芽二叶的政和大白鲜叶，加入-20℃预冷丙酮125mL组织匀浆2min后，用1000mL的-20℃丙酮(80％体积浓度)真空抽滤淋洗，直至淋洗液无色，最后加200mL的-20℃丙酮(100％体积浓度)淋洗，将茶渣于-20℃冷冻干燥24小时得丙酮粉。于丙酮粉中加入180mL 0.1M的pH＝5.6的柠檬酸-磷酸缓冲液(0.2gVc、1mM的EDTA、6g PVPP)中，在4℃下匀浆，然后置于4℃下浸提1h，期间震荡3次，取浸提液于四层纱布过滤后，以8000r/min离心20min，收集上清液，即为粗酶液。
(2)硫酸铵分级沉淀
在步骤(1)得到的粗酶液中缓慢加入21.32g无水硫酸铵粉末，用磁力搅拌器溶解完全后，于4℃静置4h，然后于4℃8000r/min离心20min，收集上清液，再缓慢加入41.99g无水硫酸铵粉末，用磁力搅拌器溶解完全后，于4℃静置12h；然后于4℃15000r/min离心10min，收集沉淀，在沉淀中加入20mL的pH＝7.520mM的Tris-HCl缓冲液，置于超滤管中离心以浓缩脱盐(用pH为7.5的20mM Tris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液4次，4℃、5000r/min、每次20min)，得酶液。
(3)离子交换色谱
将步骤(2)得到的酶液上样于Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换柱，柱床体积为25mL，首先用pH＝7.5的20mM Tris-HCl缓冲液平衡，直到280nm吸光值基线平衡，然后用含有0-0.25mol/L氯化钠Tris-HCl缓冲液(20mmol/L，pH＝7.5，)梯度洗脱，每个梯度洗脱6个柱床体积，自动收集器收集洗脱液，按每3min时间间隔收集，3mL/管。检测收集管酶活和280nm吸光值，分别合并具有酶活性的不同梯度洗脱液，分别置于超滤离心管中离心以浓缩脱盐(用pH为7.5的20mM Tris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液2次，4℃、5000r/min、每次20min)，获得酶比活力较高的两部分酶液。
(4)凝胶介质层析
将步骤(3)得到的两部分酶液分别上样于Sephadex G-75凝胶柱，柱床体积150mL，首先用pH＝7.5的20m Tris-HCl缓冲液洗脱，直到280nm吸光值基线平衡，然后用含0.10mol/L氯化钠的Tris-HCl缓冲液(20mmol/L，pH＝7.5)洗脱2个柱床体积，按每6min时间间隔收集，3mL/管，测定酶活和280nm吸光值，合并有酶活性的吸收峰，最后置于超滤离心管中以浓缩脱盐(用pH为7.5的20mMTris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液2次，4℃、5000r/min、每次20min)，分别获得酶液。
(5)重复凝胶层析
将步骤(4)得到的二酶液再次上样与Sephadex G-75凝胶柱，其它操作与步骤(4)相同，进一步去除杂蛋白，将获得二酶液进行SDS-PAGA电泳，如图9所示。由图9可知，所获同工酶仍含有多种杂蛋白，未能达到制备茶叶多酚氧化酶同工酶单体的要求。

Claims (9)

1.一种茶叶多酚氧化酶同工酶单体PP01和PP02，其特征在于，所述同工酶单体PP01的分子量为85089Da、等电点为6.1、匹配的4个肽段氨基酸序列为YLFAGVVDGR、AGINVIQIDEAALR、YGAGIGPGVYDIHSPR和LQEELDIDVLVHGEPER；同工酶单体PPO2的分子量为42531.7Da、等电点为5.49、匹配的3个肽段氨基酸序列为YSLKPLVPR、LASLADLYVNDAFGTAHR和VDLNVPLDDNLNTDDTR。
2.一种制备权利要求1所述的茶叶多酚氧化酶同工酶单体PP01和PP02的方法，其特征在于：该方法步骤如下：
1)粗酶液制备：取茶树鲜叶，按每50-70g茶树鲜叶加150-220mL-30～-20℃预冷的体积浓度为100％的丙酮的比例，于茶树鲜叶中加入丙酮，快速匀浆2-3min，依次用80％体积浓度和100％体积浓度的-30～-20℃预冷丙酮真空抽滤淋洗，直至淋洗液无色，茶渣冷冻干燥成丙酮粉；再于丙酮粉中加入0-4℃预冷的pH为5.6的0.1M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液匀浆浸提1-3小时，期间震荡4-8次，取浸提液过滤、离心，得上清液即为粗酶液；其中，该0.1M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中含有8-10％甘油、0.08-0.12％维生素C、1mM EDTA及3-5％PVPP，加入量为每50-70g茶树鲜叶制得的丙酮粉加180-200mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；
2)硫酸铵分级沉淀：于粗酶液中加入无水硫酸铵粉末至30％饱和度，0-4℃静置2小时，在4℃以8000-12000r/min离心15-20min，收集上清液，再加入无水硫酸铵粉末至80％饱和度，0-4℃静置4小时，以12000-18000r/min于4℃离心10-15min，收集沉淀；按1g沉淀加10-15ml pH为7.5的含有8-10％甘油的20mM Tris-HCl平衡缓冲液的比例，于沉淀中加入Tris-HCl平衡缓冲液，置于超滤管中离心以浓缩脱盐，得超滤液；
3)离子交换色谱：将上述超滤液上Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换柱，先用平衡缓冲液上柱至280nm吸收基线平衡，再用含有0-0.25mol/L氯化钠的平衡缓冲液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱6个柱床体积，自动收集器收集洗脱液，检测酶活和280nm吸光值，分别合并具有酶活性的不同梯度洗脱液，分别置于超滤管中离心以浓缩脱盐，获得酶比活性较高的二酶液；其中，平衡缓冲液是pH为7.5的含8-10％甘油的20mM Tris-HCl缓冲液；
4)凝胶介质层析：将上述两酶液分别上Sephadex G-75凝胶柱，先用平衡缓冲液上柱至280nm吸收基线平衡，再用含0.10-0.15M NaCl的平衡缓冲液洗脱2个柱床体积，自动收集器收集洗脱液，检测酶活和280nm吸光值，合并具有酶活性的部分，最后将两酶液有酶活性的部分分别置于超滤管中离心以浓缩脱盐，得到凝胶介质层析纯化后的二酶液；
5)将所得凝胶介质层析纯化后的二酶液分别再次重复步骤4)的凝胶介质层析步骤，获得两种多酚氧化酶同工酶单体，通过质谱分析进行鉴定，分别为同工酶单体PP01和PP02。
3.如权利要求2所述的一种制备茶叶多酚氧化酶同工酶单体的方法，其特征在于，所述步骤1)中的茶树鲜叶为一芽二叶的政和大白、福云6号、桃源大叶茶树品种鲜叶。
4.如权利要求2所述的一种制备茶叶多酚氧化酶同工酶单体的方法，其特征在于，所述步骤1)中的茶渣在-40～-30℃真空冷冻干燥24-30小时成丙酮粉。
5.如权利要求2所述的一种制备茶叶多酚氧化酶同工酶单体的方法，其特征在于，所述步骤1)中的离心温度为4℃，转速为8000-12000r/min，时间为15-20min。
6.如权利要求2所述的一种制备茶叶多酚氧化酶同工酶单体的方法，其特征在于，所述步骤2)中于超滤管中离心以浓缩脱盐时，超滤管为Amicon Ultra10K型号规格，在0-4℃、3500-5000r/min转速下离心，所用缓冲液是pH为7.5的含8-10％甘油的20mM Tris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液3-4次，每次离心时间为20-30min。
7.如权利要求2所述的一种制备茶叶多酚氧化酶同工酶单体的方法，其特征在于，所述步骤3)中于超滤管中离心以浓缩脱盐时，超滤管为Amicon Ultra10K型号规格，在0-4℃、3500-5000r/min转速下离心，所用缓冲液是pH为7.5的含8-10％甘油的20mM Tris-HCl缓冲液，期间置换缓冲液2-3次，每次离心时间为20-30min。
8.如权利要求2所述的一种制备茶叶多酚氧化酶同工酶单体的方法，其特征在于，所述步骤4)中的平衡缓冲液是pH为7.5的含8-10％甘油的20mMTris-HCl缓冲液或pH为6.8的含8-10％甘油的20mM磷酸缓冲液。
9.如权利要求2所述的一种制备茶叶多酚氧化酶同工酶单体的方法，其特征在于，所述步骤4)中于超滤管中离心以浓缩脱盐时，超滤管为Amicon Ultra10K型号规格，在0-4℃、3500-5000r/min转速下离心，所用缓冲液是pH为7.5的含8-10％甘油的20mM Tris-HCl缓冲液或pH为6.8的含8-10％甘油的20mM磷酸缓冲液，期间置换缓冲液2-3次，每次离心时间为20-30min。
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