CN108159124A - 一种延胡索提取物的制备方法及其在镇痛药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制药领域，公开了一种延胡索提取物的制备方法及其在镇痛药物中的应用，该方法包括：（1）取延胡索饮片，回流提取；（2）将提取液减压浓缩至无醇味，离心，取上清液制成上样液；（3）将预处理后的大孔树脂湿法装柱，上样，除杂，弃去除杂液；（4）用洗脱溶剂进行洗脱，舍去前0.5‑1.5BV的洗脱液后收集；（5）将洗脱液减压浓缩干燥。本发明方法制得的延胡索总生物碱纯度高，转移率高，药效作用强，且操作简便，利于工业化生产、后期推广和应用。

Description

一种延胡索提取物的制备方法及其在镇痛药物中的应用

技术领域

本发明涉及制药领域，尤其涉及一种延胡索提取物的制备方法及其在镇痛药物中的应用。

背景技术

中医药在镇痛药物的应用上，具有历史悠久、方法独特、疗效肯定等优点。中药延胡索为罂粟科植物延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥块茎，又称玄胡索、元胡素、延胡，味辛、苦，性温，归心、肝、脾经，具有活血、利气、止痛之功效，用于胸胁、脘腹疼痛、跌扑肿痛等，主产地为浙江，为著名的浙八味之一，为历代中医药学家所推崇的著名镇痛药。李时珍在《本草纲目》中描述延胡索：“专治一身上下诸痛，用之中的，妙不可言，盖延胡索活血化气，第一品药也”。由此可见，延胡索在镇痛方面具有悠久的历史与较好的应用前景。

目前研究普遍以延胡索总生物碱或一种或几种单体碱为指标进行工艺考察和优化，得到某一成分较高的方案，然而中药的疗效是以整体形式表现的，并不是某个成分的独自作用，而是几个成分之间相互作用的结果，故以单一成分为指标进行中药制备方案的优化和选择是相对片面的。

查阅相关文献和专利，发现较多文献资料都没有报道转移率，究其原因，可能是因为一些生物碱纯度相对高的方案转移率过低，若大批量生产成本太高，不利于药物的推广和销售。且有专利报道用大孔吸附树脂法纯化延胡索总生物碱后，再用有机溶剂进行萃取，其纯度可达到90％以上，但此类方法存在着操作复杂、过程繁琐、易燃易爆、成本高、对人体产生不良影响，难以用于工业化生产等一系列问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种延胡索提取物的制备方法及其在镇痛药物中的应用，本发明方法得到的延胡索提取物及其所含四种生物碱单体不仅纯度高，操作简便，且转移率皆大于85％，成本相对较低，非常利于工业化生产、后期推广和应用。本发明得到的延胡索提取物，通过相关药效学实验与延胡索乙素的镇痛效果做对比，结果表明延胡索提取物镇痛作用强于延胡索乙素，这也证明中药是一个整体，应该以总生物碱及其四种生物碱单体为指标进行方案的优化。

本发明的具体技术方案为：一种延胡索提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)取延胡索饮片，用乙醇提取，取提取液；

(2)将提取液浓缩至无醇味，离心，取上清液制成上样液。

(3)将预处理后的大孔树脂装柱，上样，除杂；

(4)用洗脱溶剂进行洗脱，舍去前0.5～1.5BV的洗脱液后，收集洗脱液。

在现有技术中，都是收集全部洗脱液。但是本发明人偶然发现，舍去初期的部分洗脱液能够显著提高洗脱液的纯度。经过后续研究后发现，其原因是加入洗脱溶剂后，会有部分除杂溶剂还残留在层析柱里，此时洗脱液里主要是一些非生物碱类的杂质，所以需弃去后洗脱液再正式开始收集，有利于提高纯度。

(5)将收集所得洗脱液浓缩、干燥即得。

本发明给出了一个提取延胡索总生物碱并提高其纯度和转移率的新方案，主要是较大限度地提取中药延胡索中的生物碱类有效成分，并通过纯化方法去除提取物中的淀粉、粘液质、树脂、挥发油等杂质，解决了总生物碱纯度低、转化率低的问题，且总体过程还以四种生物碱单体(盐酸巴马汀、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、延胡索甲素)为指标进行优化，使总生物碱及四种生物碱单体的纯度最大化。同时从镇痛角度探究延胡索纯化物的药效，为开发延胡索总生物碱类镇痛药物提供参考依据。

本发明不仅仅以延胡索总生物碱的含量为指标，而是以延胡索总生物碱和四种生物碱单体的含量为指标进行提取、纯化、浓缩及干燥工艺的考察。查阅已发表文献和专利，可发现基本都是以延胡索总生物碱、延胡索乙素或其他单一指标进行工艺的优化，未见以延胡索总生物碱和四种生物碱单体的含量为指标，共同进行工艺的优化和筛选。

本发明所得延胡索总生物碱提取物以延胡索乙素计，总生物碱纯度为：60～80％，延胡索总生物碱(含量为100％计)中四种单体生物碱的比例为盐酸巴马汀、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、延胡索甲素＝1∶(5.96～7.63)∶(2.46～2.86)∶(2.92～3.46)。延胡索总生物碱的转移率大于85％，四种单体碱的转移率皆大于95％。与现有技术相比，取得了显著的进步。

作为优选，步骤(1)中，提取方法为：以延胡索饮片6～15倍质量、浓度为30-90wt％的乙醇，回流提取1～3次，每次1.0～2.5h。

作为进一步优选，步骤(1)中，提取方法为：以延胡索饮片6～12倍质量、浓度为50～80wt％的乙醇，回流提取1～3次，每次1.5～2.5h。

作为再进一步优选，步骤(1)中，提取方法为：以延胡索饮片8～10倍质量、浓度为55-65wt％的乙醇，回流提取1～3次，每次1.5～2.5h。

本发明人在试验中采用煎煮法、回流提取法、超声提取法。结果表明，回流提取法较冷浸法、煎煮法、超声提取法，所测得的延胡索总生物碱提取率最高，符合富集总生物碱的目的。

经检测，本发明步骤(1)中所得的提取液中含有盐酸巴马汀、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、延胡索甲素四种生物碱，纯度分别为：0.2～0.4％、1.5～2.0％、0.8～1.5％、1.0～2.0％；所得提取液中延胡索总生物碱以延胡索乙素计，纯度为：10.0～20.0％。

作为优选，步骤(2)中，浓缩条件为：50～80℃浓缩至无醇味；离心条件为：2-20℃下3000～15000rpm离心15～45min；上样液的浓度0.1～1.0g生药/mL。

作为进一步优选，步骤(2)中，浓缩条件为：50～80℃浓缩至无醇味；离心条件为：3-10℃下4000-13000rpm、离心20-40min；上样液的浓度0.3～0.8g生药/mL。

作为再进一步优选，步骤(2)中，浓缩条件为：50～80℃浓缩至无醇味；离心条件为：3-5℃下5000-10000rpm离心25-35min；a上样液的浓度0.3～0.6g生药/mL。

上样液经离心后可沉淀出部分杂质，取其上清液进行纯化时，不易使大孔吸附树脂结块、堵塞，可较好地纯化延胡索总生物碱。

作为优选，步骤(3)中，所述大孔吸附树脂的型号为XDA-8、NKA-9、D101、D141、HPD200A或AB-8。

作为优选，步骤(3)中，以径高比1∶3～1∶11湿法装柱，上样量为0.3～4BV，上样速度为1-3BV/h；除杂时的除杂溶剂为超纯水、0.1-0.3wt％NaCl溶液或8-12wt％乙醇溶液中的一种或几种；除杂溶剂的用量为0.3～3.3BV。

作为进一步优选，步骤(3)中，以径高比1∶5～1∶9湿法装柱，上样量为1～3BV，上样速度为1～3BV/h；除杂时的除杂溶剂为超纯水、0.1-0.3wt％NaCl溶液或8-12wt％乙醇溶液中的一种或几种；除杂溶剂的用量为1～3BV。

作为再进一步优选，步骤(3)中，以径高比1∶5～1∶9湿法装柱，上样量为1.5-2.3BV，上样速度为1.5～2.5BV/h；除杂时的除杂溶剂为超纯水、0.1-0.3wt％NaCl溶液或8-12wt％乙醇溶液中的一种或几种；除杂溶剂的用量为1.0～1.5BV。

上样后进行静置1～3h，静置是为了让延胡索总生物碱与大孔吸附树脂进行充分的作用，减少除杂时生物碱的损失，增强其纯化的效果。

作为优选，步骤(4)中，所述洗脱溶剂为80～95wt％的乙醇溶液，洗脱溶剂的用量为0.3～8.0BV，洗脱速度为2～4BV/h。

作为进一步优选，步骤(4)中，所述洗脱溶剂为80～95wt％的乙醇溶液，洗脱溶剂的用量为2～8BV，洗脱速度为2～4BV/h。

作为再进一步优选，步骤(4)中，所述洗脱溶剂为80～95wt％的乙醇溶液，洗脱溶剂的用量为5.5～6.5BV，洗脱速度为2～4BV/h。

作为优选，步骤(5)中，洗脱液经减压浓缩后，先将洗脱液于50～70℃下减压浓缩至无醇味，再喷雾干燥，即得；或将其减压浓缩至稠浸膏，再于50～65℃下真空干燥即得；或减压浓缩至稠浸膏，再于60～80℃下常压干燥，即得。

作为进一步优选，步骤(5)中，洗脱液经减压浓缩后，先将洗脱液于55-65℃下减压浓缩至无醇味，再喷雾干燥，即得；或将其减压浓缩至稠浸膏，再于50～60℃下真空干燥即得；或减压浓缩至稠浸膏，再于60～80℃下常压干燥，即得。

作为再进一步优选，步骤(5)中，先将洗脱液于55～60℃下减压浓缩至无醇味，再喷雾干燥，即得；或将其减压浓缩至稠浸膏，再于50～60℃下真空干燥即得；或减压浓缩至稠浸膏，再于60～80℃下常压干燥，即得。

现有技术中，通常直接将洗脱液进行常压干燥、真空干燥或喷雾干燥。但是本发明人发现，常压干燥速度较快，但得到的浸膏质地较硬不好收集；真空干燥的浸膏质地脆易研磨成粉，但其干燥效率过低；喷雾干燥由于其粘壁现象使其损失量偏大，导致延胡索总生物碱和四种单体碱的转移率降低。故本发明创造性地将洗脱液先减压浓缩至稠浸膏，再常压干燥，最后真空干燥，便可解决上述技术问题。

本发方法制备的延胡索总生物碱可作为镇痛药物以应用。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

本发明公开了一种能够高效制备、高效转移中药延胡索中总生物碱的方法及其纯化物在镇痛药效学方面的应用。本发明可以在延胡索中制备出较高纯度的总生物碱(60～80％)，延胡索总生物碱(含量为100％计)中上述四种单体生物碱的比例为1∶(5.96～7.63)∶(2.46～2.86)∶(2.92～3.46)。总生物碱转移率大于85％且四种生物碱单体的转移率皆大于95％，解决了延胡索总生物碱纯度低、利用率低以及治疗镇痛药效低的问题。

本发明方法操作简便，得到的延胡索总生物碱镇痛作用优于延胡索乙素，具有良好的开发价值，用于治疗各种疾病引起的疼痛。

附图说明

图1为盐酸巴马汀泄漏曲线，

图2为脱氢紫堇碱泄漏曲线，

图3为超纯水的除杂曲线(n＝3)，

图4为巴马汀及脱氢紫堇碱的泄漏曲线(n＝3)，

图5固化物中有效成分的损失率曲线(n＝3)，

图6为盐酸巴马汀的洗脱曲线(n＝3)，

图7为脱氢紫堇碱的洗脱曲线(n＝3)，

图8为延胡索乙素洗脱曲线(n＝3)，

图9为延胡索甲素洗脱曲线(n＝3)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

总实施例

一种延胡索总生物碱的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取方法为：以延胡索饮片6～15倍质量、浓度为30～90wt％的乙醇，回流提取1～3次，每次1.0～2.5h。取提取液。

(2)将提取液减压浓缩(50～80℃，50RPM)至无醇味，离心(2-20℃下3000～15000rpm离心15～45min)，取上清液制成浓度为0.1～1g生药/mL的上样液。

(3)将预处理后的大孔树脂以径高比1∶3～1∶11湿法装柱，加入上样液(上样量为0.3～4BV，上样速度为1～3BV/h)，静置1-3h，用除杂溶剂进行除杂，弃去除杂液。

所述除杂溶剂为超纯水、0.1-0.3wt％NaCl溶液或8-12wt％乙醇溶液中的一种或几种；除杂溶剂的用量为0.3～3.3BV。

(4)用洗脱溶剂进行洗脱，从加入洗脱溶剂开始接收洗脱液，舍去前0.5-1.5BV的洗脱液后正式开始收集。

其中所述洗脱溶剂为80～95wt％的乙醇溶液，洗脱溶剂的用量为0.3～8BV，洗脱速度为2～4BV/h。

(5)洗脱液经减压浓缩后，先将洗脱液于50～70℃下减压浓缩至无醇味，再喷雾干燥，即得；或将其减压浓缩至稠浸膏，再于50～65℃下真空干燥即得；或减压浓缩至稠浸膏，再于60～80℃下常压干燥，即得。

实施例1

一种延胡索总生物碱的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取方法为：以延胡索饮片8倍质量、浓度为60wt％的乙醇，回流提取3次，每次2h。取提取液。

(2)将提取液减压浓缩(60℃，50RPM)至无醇味，离心(4℃下7000rpm离心30min)，取上清液制成浓度为0.6g生药/mL的上样液。

(3)将预处理后的大孔树脂以径高比1∶6湿法装柱，加入上样液(上样量为2BV，上样速度为2BV/h)，静置2h，用除杂溶剂进行除杂，弃去除杂液。

其中，大孔吸附树脂的预处理方式为：用2倍质量、95wt％的乙醇浸泡大孔吸附树脂24h，滤过，将树脂湿法上柱，继续用95wt％的乙醇以2BV/h的流速冲洗，洗至洗脱液与蒸馏水1∶3混合后澄清为止，然后用蒸馏水以同样的流速洗至无醇味，备用。

所述除杂溶剂为超纯水，除杂溶剂的用量为1.3BV。

(4)用洗脱溶剂进行洗脱，从加入洗脱溶剂开始接收洗脱液，舍去前0.7BV的洗脱液后正式开始收集。

其中所述洗脱溶剂为95wt％的乙醇溶液，洗脱溶剂的用量为6BV，洗脱速度为2BV/h。

(5)洗脱液经减压浓缩后，先将洗脱液于60℃下减压浓缩至稠浸膏，于60℃下常压干燥时间24h，再于60℃下真空干燥24h，即得。

本实施例制得的延胡索总生物碱及其各组分纯度为79.1％(延胡索总生物碱)、1.92％(盐酸巴马汀)、14.65％(脱氢紫堇碱)、4.94％(延胡索乙素)、6.33％(延胡索甲素)。

研究过程实施例

一、单因素试验考察延胡索总生物碱的提取工艺

1.延胡索总生物碱提取方法的确定

采用三种方式提取延胡索总生物碱，分别是：(1)煎煮法：称取延胡索饮片3份，每份约50g，分别加入10倍量水，冷浸1h后再加热回流煎煮1h。(2)回流提取法：称取延胡索饮片3份，每份约50g，分别加入10倍量50％乙醇，冷浸1h后再80℃回流1h。(3)超声提取法：称取延胡索饮片3份，每份约50g，分别加入10倍量50％乙醇，冷浸1h后超声提取，提取时间1h，80℃，50Hz。将上述三种方式的提取液过滤，补足500mL，得0.1g生药/mL的延胡索提取液。精密移取1mL，置蒸发皿中，水浴挥干，残渣用甲醇溶解并定容至10mL。采用HPLC及酸性染料比色法分别测延胡索总生物碱和其中四种单体碱的峰面积及吸光度，计算各自的提取率，结果见表1。

表1提取方法对延胡索总生物碱及4种单体碱提取率的影响

结果表明，乙醇回流提取较超声提取和煎煮，所测得的延胡索总生物碱和4种单体含量最高，因此，本发明选择乙醇回流提取进行接下来的实验研究。

2.溶剂容量的考察

称取延胡索饮片12份，均分成4组，每组3份，每份50g，分别加入6倍量、8倍量、10倍量、12倍量的50％的乙醇，冷浸1h后于80℃水浴锅中加热回流1h，将提取液过滤，补足至500mL容量瓶中，得0.1g生药/mL的延胡索提取液。精密移取1mL，置蒸发皿中，水浴挥干，残渣用甲醇溶解并定容至10mL。按HPLC及酸性染料比色法分别测各四种单体碱及总生物碱的峰面积及吸光度，计算各自的提取率，结果见表2。

表2溶剂用量对延胡索总生物碱及4种单体提取率的影响

结果表明，10倍量的50％乙醇对延胡索总生物碱的提取率较大，但各溶剂用量差异不明显，在正交实验中将对溶剂用量进一步探讨，暂定10倍量的溶剂用量进行单因素考察。

3.乙醇浓度考察

称取延胡索饮片12份，均分成4组，每组3份，每份50g，分别加入10倍量90％、70％、50％、30％的乙醇，于90℃水浴锅中加热回流1h，将提取液过滤，补足溶剂得0.1g生药/mL提取液。精密移取1mL，置蒸发皿中，水浴挥干，残渣用甲醇定容至10mL。按HPLC及酸性染料比色法分别测各单体及总生物碱的峰面积及吸光度，计算各自的提取率，结果见表3。

表3乙醇浓度对延胡索总生物碱及4种单体提取率的影响

结果表明，乙醇浓度在50％时，延胡索生物碱提取率较高，但由于溶剂浓度梯度较大，故拟在正交试验中进一步对溶剂浓度进行考察。

4.提取时间考察

称取延胡索饮片9份，均分成3组，每组3份，每份50g，加入10倍量50％的乙醇，分别于90℃水浴锅中加热回流1h、1.5h、2h、2.5h，将提取液过滤，补足溶剂得0.1g生药/mL的提取液。用移液管移取1mL，置蒸发皿中，水浴挥干，残渣用甲醇定容至10mL。按HPLC及酸性染料比色法分别测各单体及总生物碱的峰面积及吸光度，计算各自的转移率，结果见表4。

表4提取时间对延胡索总生物碱及4种单体提取率的影响

结果表明，提取时间2小时，其提取率明显提高。故本发明选择延胡索饮片的提取时间为2小时。

二、正交设计优化延胡索总生物碱的提取工艺

1.因素水平设计

通过单因素实验考察，已确定提取方法、提取时间、提取温度，未确定的以及需要进一步考察的有乙醇用量、乙醇浓度、提取次数。因此采用L9(3⁴)正交设计表，以延胡索总碱提取率为评价指标，对乙醇用量、乙醇浓度、提取次数进行考察，因素水平见表5，设计和结果见表6～7。

表5正交试验因素水平表

表6正交试验安排及结果

表7方差分析结果

通过比较各因素的极值R，可以得出影响总生物碱提取率的因素顺序，从主到次排序为：提取次数、乙醇浓度、乙醇用量。由方差分析结果可知，提取次数对总生物碱提取率有显著性的影响，记做，其余两因素对延胡索总生物碱提取率影响相对较低。最终确定提取条件的最佳组合为A3B2C3，即8倍量60％的乙醇，90℃回流提取3次，每次2小时。

2.验证试验

称取延胡索饮片3份，各50g，按照选定的较优工艺条件进行提取，即加入8倍量60％乙醇，90℃，回流提取3次，每次2h。合并所得提取液，60℃减压浓缩至0.1g生药/mL提取液，精密移取1mL，置蒸发皿中，水浴挥干，残渣用甲醇溶解并定容至10mL。按HPLC及酸性染料比色法分别测各单体及总生物碱的峰面积及吸光度，计算延胡索总生物碱及四种单体碱的纯度和提取率(％)，结果见表8。

表8延胡索总生物碱及四种单体碱的纯度和提取率

三、大孔吸附树脂型号的选择

1.大孔吸附树脂的预处理和再生

分别称取XDA-8、NKA-9、D101、D141、HPD200A、AB-8大孔吸附树脂，用2倍量的95％乙醇浸泡24h，滤过。将树脂湿法上柱，继续用95％乙醇以2BV/h的流速冲洗，洗至洗脱液与蒸馏水1∶3混合澄清为止，然后用蒸馏水以同样的流速洗至无醇味，备用。

用3BV5％的HCl溶液以2BV/h的流速冲洗树脂柱，然后用蒸馏水以同样的流速洗至pH中性；以同样的流速用3BV5％的NaOH溶液，用蒸馏水以同样的流速洗至pH中性；备用。

2.延胡索醇提液的上样前处理

按“第一部分”提取工艺研究中确定的条件制备延胡索提取液，将提取液进行减压浓缩，于冷冻离心机(4℃，7000rpm，30min)离心，取上清液，制成0.3g生药/mL的延胡索上样液，备用。

3.静态试验

称取经静态试验预实验选择的6种树脂各3g于锥形瓶中，精密量取25mL0.3g生药/mL样品，置于恒温振荡器中(160r.min-1，32℃)震荡24h，分别测定原液及滤液中延胡索中四种单体的含量，计算比吸附量和吸附率，公式如下：

比吸附量m₁(mg·g^-1)＝(C0×V0-C1×V1)/M(C0：吸附前生物碱浓度，C1：吸附后生物碱浓度，V0：吸附前溶液体积，V1：吸附后溶液体积)

吸附率(％)＝(C0×V0-C1×V1)/(C0×V0)

取吸附后的树脂，抽滤至干，置100mL锥形瓶中，精密加入70％乙醇25mL，置于恒温振荡器中(160r·min-1，32℃)震荡14h，取洗脱液测定延胡索4种单体的含量，计算比洗脱量和洗脱率，公式如下：

比洗脱量m2(mg·g^-1)＝(C2×V2)/M(C2：解吸后生物碱浓度，V2：解吸后体积)

洗脱率(％)＝(C2×V2)/(C0×V0-C1×V1)

结果见表9～13。

表9盐酸巴马汀静态试验结果

表10脱氢紫堇碱静态试验结果

表11延胡索乙素静态试验结果

表12延胡索甲素静态试验结果

表13四种生物碱加和结果

由结果可知，盐酸巴马汀与脱氢紫堇碱洗脱结果较一致，其中D141、AB-8、NKA-9三种树脂洗脱最好；延胡索甲素与延胡索乙素洗脱结果较一致，其中D141、XDA-8、HPD200A三种树脂洗脱最好。因此，将延胡索总生物碱四种单体的比洗脱量的加和作为选择依据，D141、AB-8、NKA-9适合用于延胡索总生物碱的纯化，最终本发明选择这三种树脂进行动态试验。

4.动态试验

称取5g处理过的树脂湿法装柱(1cm×7cm)，每个平行3份，以0.8mL·min^-1速度上样约0.3g生药/mL的提取液60mL(浓度为：盐酸巴马汀0.1146mg·mL^-1，脱氢紫堇碱0.7241mg·mL^-1，延胡索乙素0.3311mg·mL^-1，延胡索甲素0.4479mg·mL^-1)。用100mL(约11BV)超纯水洗至无色，用100mL80％乙醇洗脱，收集洗脱液，计算比吸附量、吸附率、比洗脱量、洗脱率和纯度，结果见下表14～18。

表14盐酸巴马汀动态试验结果

表15脱氢紫堇碱动态试验结果

表16延胡索乙素动态试验结果

表17延胡索甲素动态试验结果

表18延胡索总生物碱及各单体的纯度

综合比吸附量、吸附率、比洗脱量、洗脱率和纯度的实验结果，并结合实验设计的新颖性，本发明最终选择D141树脂纯化延胡索总生物碱。

四、大孔树脂纯化工艺参数的确定

1.上样量及上样速度的考察

取处理好的D141树脂1∶5(2cm*10cm)湿法上柱，取约0.6g生药/mL浓度的延胡索上样液(盐酸巴马汀0.22mg·mL^-1，脱氢紫堇碱1.36mg·mL^-1，延胡索乙素0.54mg·mL^-1，延胡索甲素0.44mg·mL^-1)分别以1BV/h、2BV/h、3BV/h上样120mL，每10mL收集1次流出液，测定每10mL中4种生物碱的含量，并绘制泄漏曲线。结果见图1～2。

由结果可知，当流速为3BV/h时，第8份流出液中，盐酸巴马汀和脱氢紫堇碱开始出现泄漏；当流速为2BV/h时，第9份流出液中，盐酸巴马汀和脱氢紫堇碱开始出现泄漏；当流速为1BV/h时，第10份流出液中，盐酸巴马汀和脱氢紫堇碱开始出现泄漏。为确保效果及效率，最终选取上样速度2BV/h，上样浓度为0.6g生药/mL的延胡索上样液，上样量为60mL(约2BV)。

2.径高比的考察

称取处理好的D141树脂以1∶3(2cm*6cm)1∶5(2cm*10cm)、1∶7(2cm*14cm)、1∶9(2cm*18cm)、1∶11(2cm*22cm)湿法上柱，以2BV/h分别上样40mL、60mL、85mL、110mL、140mL(约2BV)，分别以25mL、40mL、55mL、75mL、90mL(约1.3BV)超纯水作为除杂溶剂，分别以110mL、180mL、270mL、330mL、414mL(约6BV)95％乙醇作为洗脱溶剂，收集洗脱液，真空干燥得干浸膏，计算总生物碱及4种生物碱转移率、纯度。结果见表19。

表19径高比对延胡索总生物碱及4种单体转移率的影响

结果显示，径高比1∶3～1∶11时，延胡索总生物碱的转移率均在80％以上，纯度均在60％以上，故径高比在1∶3～1∶11范围内均可满足纯化的要求。

3.除杂溶剂的选择

取处理好的D141树脂15g(2cm*10cm)湿法上柱，以2BV/h速度上样60mL0.6g生药/mL的延胡索上样液，然后分别以100mL超纯水、80mL0.3％NaCl+20mL超纯水、100mL10％乙醇作为除杂溶剂，HPLC测定除杂溶液中有效成分的含量，取50mL除杂溶液干燥后称重，得除杂溶液中的固化物的重量，以及盐酸巴马汀及脱氢紫堇碱的损失量。结果见表20。

损失率(％)＝(除杂溶液中生物碱含量/上样液中生物碱含量)*100％

表20不同除杂溶剂下浸膏重及盐酸巴马汀、脱氢紫堇碱的损失量

由结果可知，3种除杂溶剂下，浸膏重差异较小，但是10％乙醇除杂时，有效成分损失最高，超纯水及0.3％NaCl损失较少。因此，选取100mL超纯水、80mL 0.1％NaCl+20mL超纯水、80mL 0.2％NaCl+20mL超纯水、80mL 0.3％NaCl+20mL超纯水进一步考察，并用100mL80％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，测定延胡索总生物碱及4种单体的纯度。结果见表21。

表21除杂溶剂对延胡索总生物碱及4种单体纯度的影响

结果显示，0.3％NaCl及超纯水的除杂效果较好，结合新颖性及经济性，本发明最终选取超纯水作为除杂溶剂。

4.除杂溶剂用量考察

称取处理好的D141树脂15g(2cm*10cm)湿法上柱，以2BV/h上样约60mL0.6g生药/mL的延胡索上样液，以超纯水作为除杂溶剂，平行三份，每10mL收集一份，挥干溶剂，称量洗脱液中固化物的重量，按HPLC测定峰面积，计算其中盐酸巴马汀与脱氢紫堇碱的含量。结果见表22及图3～5。

表22除杂流出液中固化物重量及有效成分的含量

结果显示，超纯水用量为40mL后，固化物的增重较少，其中有效成分在固化物中所占的比例也较小，因此本发明选取40mL(约1.3BV)的超纯水作为除杂溶剂用量。

5.洗脱溶剂及用量考察

称取处理好的D141树脂15g(2cm*10cm)湿法上柱，以2BV/h上样60mL0.6g生药/mL的延胡索上样液，以40mL超纯水作为除杂溶剂，分别用80％乙醇、88％乙醇、95％乙醇作为洗脱溶剂，洗脱速度为2BV/h，各平行3份。收集各洗脱液，每10mL收集1次，HPLC测定四种生物碱单体，绘制洗脱曲线。结果见图6～9。

结果显示，80％乙醇、88％乙醇、95％乙醇对于盐酸巴马汀和脱氢紫堇碱洗脱效果基本一致；80％乙醇对延胡索乙素与延胡索甲素洗脱效果均较差，88％乙醇及95％乙醇对于延胡索乙素基本一致；95％乙醇在170～180mL(约6BV)对于延胡索甲素基本洗脱完全。因此，本发明最终选取95％乙醇180mL(约6BV)进行洗脱。

6.洗脱速度的考察

称取处理好的D141树脂15g(2cm*10cm)湿法上柱，以2BV/h上样60mL(约2BV)0.6g生药/mL的延胡索上样液，以40mL(约1.3BV)超纯水作为除杂溶剂，以180mL(约6BV)95％乙醇作为洗脱溶剂，洗脱速度分别为2BV/h、3BV/h、4BV/h，各平行3份。收集各洗脱液，测定四种生物碱单体及总碱的转移率及纯度。结果见表23。

表23洗脱速度对延胡索总生物碱及4种单体转移率的影响

结果显示，洗脱速度越快，延胡索总生物碱的转移率及纯度越低，当流速为2BV/h时，延胡索总生物碱的转移率及纯度最高，故洗脱速度宜选择2BV/h。

五、纯化工艺的验证及放大试验

1.验证工艺的验证试验

称取处理好的D141树脂15g(2cm*10cm，径高比1∶5)湿法上柱，以2BV/h上样60mL(约2BV)，以1.3BV超纯水作为除杂溶剂，以6BV95％乙醇作为洗脱溶剂，收集洗脱液，真空干燥得干浸膏，计算总生物碱及4种生物碱转移率、纯度。结果见表24。

表24验证试验结果-转移率

结果显示：延胡索总生物碱及四种单体的转移率均能达到88.52％以上；延胡索总生物碱纯度能达到68.25％～79.91％。

2.放大试验

经过上样、除杂、洗脱，确定的工艺参数，以5倍、10倍进行纯化放大试验。分别称取处理好的D141树脂75g、150g湿法上柱(径高比约1∶5～1∶7)，以2BV/h上样2BV 0.6g生药/mL的上样液，以1.3BV超纯水作为除杂溶剂，以6BV95％乙醇作为洗脱溶剂，收集洗脱液，真空干燥得干浸膏，计算总生物碱及4种生物碱转移率、纯度，结果见表25。

表25放大试验结果-转移率

六、浓缩干燥工艺的考察

1.浓缩温度的选择

按选定的纯化工艺得到的洗脱液，平均分为9份，每份200mL，分别于50℃、60℃、70℃条件下减压浓缩至粘稠状，各平行三份，将其置于容器中，于60℃真空干燥，即得，测定各生物碱的纯度。结果见表26。

表26浓缩温度对延胡索总生物碱及4种单体纯度的影响

结果显示：浓缩温度50℃、60℃、70℃下，延胡索生物碱的纯度差异较小，但结果发现，延胡索乙素、延胡索甲素纯度发生了一定程度的降低，因此，干燥过程中浓缩温度、干燥温度有待进一步考察。

2.干燥方法的选择

按选定的纯化工艺得到的洗脱液，平均分为6份，每份200mL，三份于60℃条件下浓缩至粘稠状，将其置于容器中，常压干燥后于60℃真空干燥。另三份于60℃条件下挥去乙醇，以入口温度180℃喷雾干燥。测定真空干燥及喷雾干燥所得的纯化物纯度，结果见表27。

表27干燥方法对延胡索4种单体纯度的影响

结果显示，常压干燥、真空干燥及喷雾干燥所得延胡索总生物碱中延胡索乙素及延胡索甲素均有一定程度的降低，延胡索生物碱对温度较为敏感。本实验将进一步对浓缩前后的4种生物碱的纯度进行测定，以明确是否浓缩过程对其造成影响。结果见表28。

表28浓缩对延胡索4种单体纯度的影响

(1为洗脱液，2为洗脱液浓缩后干燥前。)

结果显示，浓缩对延胡索总生物碱中延胡索乙素及延胡索甲素的纯度影响较小，可明确是干燥过程中的温度影响延胡索甲素及乙素的稳定性，而喷雾干燥的过高温度将不适用于延胡索总生物碱的干燥，因此，将选择真空干燥方法对延胡索总生物碱进行干燥，并进一步考察干燥过程中的温度。

3.干燥条件的选择

按选定的纯化工艺得到的洗脱液，平均分为6份，每份100mL，于60℃条件下减压浓缩至粘稠状，将其置于容器中，考察不同常压干燥温度、真空干燥温度、干燥时间对延胡索4种单体生物碱纯度的影响，结果见表29。

表29不同干燥条件对延胡索4种单体纯度的影响

结果显示，常压干燥温度60℃、真空干燥温度50℃、干燥48h或者常压干燥温度为60℃时，真空干燥温度为60℃、干燥24h，所得的延胡索4种单体之间的比例变化较小，工艺较稳定。最终本发明确定以60℃减压浓缩至稠浸膏，于60℃常压干燥24h，再于60℃真空干燥24h。

七、延胡索纯化物镇痛作用研究

1小鼠醋酸扭体试验

取体重(20±2)g的ICR小鼠，雌雄各半，经适应性饲养一周后，随机分成10组，每组10只，分别设：超纯水组、阿司匹林组、延胡索乙素组、高+剂量组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、低-剂量组、延胡索提取物1组及延胡索提取物2组，其中高+剂量组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、低-剂量组使用的延胡索提取物中四种单体比例为1∶6.09∶2.56∶2.92，延胡索提取物1(外购)组的四种单体比例为1∶1.24∶7.45∶1.51，延胡索提取物2(外购)组的四种单体比例为1∶0.94∶1.06∶6.35。灌胃给药，0.4mL/20g。各组于给药后1h，经腹腔注射0.6％冰醋酸0.2mL/20g，然后记录15min内小鼠的扭体次数，并计算扭体次数抑制率，结果见表30。

表30延胡索总生物碱对醋酸致小鼠扭体反应的影响

与空白对照组比较，^**p＜0.01；与阿司匹林组比较，^▲▲p＜0.01，^▲p＜0.05；与延胡索乙素组比较，^☆p＜0.05；与中剂量组比较，^*p＜0.01。

由表30可知，与空白对照组比较，各给药组对冰醋酸所致的小鼠扭体均具有显著的抑制作用，差异均具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)；与阿司匹林组比较，除延胡索乙素组、低-剂量组、延胡索提取物1组及2组，其他各组与阿司匹林组药效无显著性差异；与延胡索乙素组比较，各给药组均优于其镇痛作用；与高剂量组比较，延胡索乙素组、低-剂量组、延胡索提取物1组及2组，差异有统计学意义，延胡索提取物1组及2组的镇痛效果不如高剂量组。说明延胡索总生物碱提取物具有较好的镇痛作用，其镇痛效果为：阿司匹林组、延胡索总生物碱提取物中、低剂量组＞高+、高剂量组＞低-剂量组、延胡索提取物1组、2组＞延胡索乙素组＞空白组。

2小鼠热板致痛试验

取体重(20±2)g的KM小鼠，经适应性饲养一周后，将小鼠放入(55±0.5)℃的热板中，筛选合格的雌性小鼠100只(凡舔后足时间小于5s或大于30s的弃之不用)，将合格小鼠随机分成10组，每组10只，分别设：超纯水组、吗啡注射液组、延胡索乙素组、高+剂量组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、低剂量组、延胡索提取物1组及延胡索提取物2组，其中高+剂量组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、低-剂量组使用的延胡索提取物中四种单体比例为1∶6.09∶2.56∶2.92，延胡索提取物1(外购)组的四种单体比例为1∶1.24∶7.45∶1.51，延胡索提取物2(外购)组的四种单体比例为1∶0.94∶1.06∶6.35。吗啡组腹腔注射，0.2mL/20g，其他各组均灌胃给药，0.4mL/20g。各组于给药前重复测量痛阈3次，取平均值作为该小鼠给药前痛阈值。给药后30min、90min、180min各测定1次痛阈，计算痛阈提高百分率，结果见表31～32。

表31延胡索总生物碱对小鼠热刺激痛反应潜伏期的影响

与空白对照组比较，^**p＜0.01；与吗啡组比较，^▲▲p＜0.01；与延胡索乙素组比较，^☆p＜0.05，^☆☆p＜0.01。

表32延胡索总生物碱对小鼠热刺激痛反应痛阈值提高率的影响(n＝10)

由表31～32可知，给药30min后，与空白对照组比较，除低-剂量组，其他各组均具有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，说明各组均具有较好的镇痛作用；与吗啡组比较，各给药组镇痛作用低于阳性给药组；与延胡索乙素组比较，除延胡索总生物碱低-剂量组，其他各组镇痛作用均强于延胡索乙素组。给药30min后，镇痛效果为：吗啡组＞延胡索总生物碱高+、高、中、低剂量组＞延胡索提取物1组、延胡索提取物2组＞延胡索乙素组＞低-剂量组＞超纯水组。

给药90min后，吗啡组的镇痛作用出现了下降，而其他各组的镇痛效果具有不同程度地增强。与空白对照组比较，各组均具有较好的镇痛作用，且差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)；与吗啡组比较，除中剂量组及低-剂量组外，吗啡镇痛效果低于其他各组；与延胡索乙素组比较，高+剂量组、高剂量组和延胡索提取物1组、2组镇痛效果优于乙素组。给药90min后，镇痛效果为：延胡索总生物碱高+、高剂量组、延胡索提取物1组、延胡索提取物2组＞延胡索乙素组、中、低剂量组＞吗啡组＞低-剂量组＞超纯水组。

给药180min后，吗啡组的镇痛作用出现了升高，而其他各组镇痛效果出现了下降，其中低-剂量组几乎无镇痛效应。与空白对照组比较，除低-剂量组，其他各组镇痛作用较好；与吗啡组比较，高+和高剂量组镇痛作用要优于吗啡组，而其他各给药组镇痛作用均低于吗啡组；给药180min后，镇痛效果为：延胡索总生物碱高+＞高剂量组、吗啡组、延胡索提取物2组、延胡索提取物1组＞延胡索乙素组＞中、低、低-剂量组＞空白组。

进一步说明，该方法制备的四种单体比例为1∶(5.96～7.63)∶(2.46～2.86)∶(2.92～3.46)的延胡索总生物碱提取物具有较好的镇痛作用。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种延胡索提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取延胡索饮片，用乙醇提取，取提取液；

（2）将提取液浓缩至无醇味，离心，取上清液制成上样液；

（3）将预处理后的大孔树脂装柱，上样，除杂；

（4）用洗脱溶剂进行洗脱，舍去前0.5~1.5BV的洗脱液后，收集洗脱液；

（5）将收集所得洗脱液浓缩、干燥即得。

2.如权利要求1所述的一种延胡索提取物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，提取方法为：以延胡索饮片6~15倍质量、浓度为30-90wt%的乙醇，回流提取1~3次，每次1.0~2.5h。

3.如权利要求2所述的一种延胡索提取物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，提取方法为：以延胡索饮片6~12倍质量、浓度为50~80wt%的乙醇，回流提取1~3次，每次1.5~2.5h。

4.如权利要求1所述的一种延胡索提取物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，浓缩条件为：50~80℃浓缩至无醇味；离心条件为：2-20℃下3000～15000rpm离心15～45min；上样液的浓度0.1~1.0生药/mL。

5.如权利要求1所述的一种延胡索提取物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，以径高比1:3~1:11湿法装柱，上样量为0.3~4BV，上样速度为1-3BV/h；除杂时的除杂溶剂为超纯水、0.1-0.3wt%NaCl溶液或8-12wt%乙醇溶液中的一种或几种；除杂溶剂的用量为0.3~3.3BV。

6.如权利要求5所述的一种延胡索提取物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，以径高比1:5~1:9湿法装柱，上样量为1~3BV，上样速度为1~3BV/h；除杂时的除杂溶剂为超纯水、0.1-0.3wt%NaCl溶液或8-12wt%乙醇溶液中的一种或几种；除杂溶剂的用量为1~3BV。

7.如权利要求1所述的一种延胡索提取物的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述洗脱溶剂为80~95wt%的乙醇溶液，洗脱溶剂的用量为0.3~8.0BV，洗脱速度为2~4BV/h。

8.如权利要求1所述的一种延胡索提取物的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，洗脱液经减压浓缩后，先将洗脱液于50~70℃下减压浓缩至无醇味，再喷雾干燥，即得；或将其减压浓缩至稠浸膏，再于50~65℃下真空干燥即得；或减压浓缩至稠浸膏，再于60~80℃下常压干燥，即得。

9.一种权利要求1-8之一所述方法得到的延胡索提取物，其特征在于，以延胡索乙素计，纯度为：60~80%；以含量为100%计，延胡索提取物中四种单体生物碱的比例为盐酸巴马汀、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、延胡索甲素=1：（5.96~7.63）：（2.46~2.86）：（2.92~3.46）。

10.如权利要求1-8之一所述方法制备的延胡索提取物在镇痛药物中的应用。