CN109943554A - 一种从蛇毒中提取凝血因子x激活剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从蛇毒中提取凝血因子X激活剂的方法,以及所述方法提取的凝血因子X激活剂在制备止血药和治疗出血性疾病的药物中的用途。本发明的方法包括羟基磷灰石柱层析步骤,其中层析条件如下:填料为I型或II型羟基磷灰石填料,洗脱液为含NaCl的pH值为6.5‑7.5的磷酸缓冲液,其中磷酸缓冲液的浓度为10mM‑30mM;NaCl的浓度为0.1M‑0.8M。本发明的方法以蛇毒为原材料,首次将羟基磷层析方法应用到规模化提取凝血因子X激活剂的方法中。本发明方法获得的最终产品的比活性高,纯度高,收率高;没有透析操作,工艺稳定,适合大规模生产;层析柱可反复使用,节约成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物提取物技术领域,特别是涉及从蛇毒中提取凝血因子X激活剂的方法。
背景技术
人类的凝血机制是一个非常复杂而精细的过程,到现在为止,发现参与凝血的因子共有12个。其中凝血因子X是凝血系统中非常关键的成分之一。凝血因子X激活剂在血管破损处激活凝血因子X,促进凝血酶生成。在凝血酶的作用下,溶于血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白单体;同时,凝血酶将XIII激活为XIIIa,使纤维蛋白单体相互连接形成不溶于水的纤维蛋白多聚体,并彼此交织成网,将血细胞网罗在内,形成血凝块,以达到迅速止血的目的。
蛇毒中有多种能够影响哺乳动物凝血系统的酶类。临床上运用较为成功的蛇毒凝血药是瑞士生产的立止血(Reptilase)。国内一些从蛇岛蝮蛇、圆斑蝰蛇、尖吻蝮蛇以及浙江蝮蛇的蛇毒中提取得到的凝血酶产品与立止血中成分相似,都是类凝血酶和类凝血酶激活剂的混合物。而从蛇毒中分离专一的凝血因子X激活剂开发成生物制剂,具有更好的临床应用前景。
已经报道的含有凝血因子X激活剂的种属包括:Bothrops(矛头蝮蛇)、Bungarus(环蛇)、Cerastes(角蝰)、Calloselasma(蝮蛇)、Daboia(山蝰)、Naja(眼镜蛇)、Ophiophagus(眼镜王蛇)和Vipera(蝰蛇)、Crotalusadamanteus(响尾蛇)等。圆斑蝰蛇(ViperaRuselli,英文名:Russlli’s viper)包含的凝血因子X激活剂被称为RVV-X(Coagulation factor X activator from Russell’s viper venom)。RVV-X属于金属蛋白酶,由一条重链和两条轻链组成,重链含有催化结构域,轻链和C型凝集素同源,在凝血因子X激活剂钙依赖的活化过程中发挥调节作用。
然而,从蛇毒中直接分离纯化专一的凝血因子X激活剂的报道较少。中国专利申请CN1249338A记载了利用Molo Q柱进行快速蛋白质液相层析,从鲁氏蝰蛇(Russell’s vipervenom)毒素中提取凝血因子X活化酶,该方法步骤少,能满足研发需要,但是过于简单的纯化步骤无法满足制药行业的要求。
中国专利申请CN101104847A记载了从圆斑蝰蛇蛇毒中依次经过DEAE-SehadexA-50离子交换层析、透析、纤维素DEAE-32离子交换层析和Superose-12凝胶过滤层析获得凝血因子X激活酶的方法;该工艺中用到透析步骤,透析处理时间长,操作繁琐,不适于大规模生产。
中国专利申请CN102242102A记载了从矛头蝮蛇蛇毒通过DEAE-Sepharose FastFlow离子交换层析、透析、纤维素DEAE-52离子交换层析和Sephadex-G75凝胶过滤层析获得凝血因子X激活剂活性蛋白,但是该方法中10g蛇毒干粉经过纯化收获蛋白为34mg,收率仅为0.34%,该方法收率较低,经济成本较高。
发明内容
本发明目的在于提供一种从蛇毒中提取凝血因子X激活剂的方法,其包括:
(a)获得蛇毒原料液;
(b)进行羟基磷灰石柱层析,收集目标峰对应的组分获得凝血因子X激活剂,
其中羟基磷灰石柱层析的层析条件如下:
填料为I型或II型羟基磷灰石填料;
洗脱液为含NaCl的pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液,其中磷酸缓冲液的浓度为10mM-30mM,NaCl的浓度为0.1M-0.8M;
优选地,磷酸缓冲液pH值为6.8,磷酸缓冲液浓度为20mM;NaCl的浓度为0.4M;
0-100%线性洗脱5-10个柱体积。
所述步骤(b)羟基磷灰石柱层析的洗脱流速为50cm/小时-1000cm/小时,优选为100cm/小时-800cm/小时,最优选为600cm/小时。
本发明上下文中,羟基磷灰石柱层析填料包括但不限于I型或II型羟基磷灰石填料。羟基磷灰石柱层析填料可为:CHT Ceramic Hydroxyapatite(Bio-rad),Type I,CHTCeramic Hydroxyapatite,TypeII(Bio-rad)。
在本发明的上下文中,蛇毒原料液可以是从毒蛇直接采集的蛇毒液或者商购获得的蛇毒液,也可以是蛇毒液或蛇毒液制成的冻干粉经合适的缓冲液,例如Tris缓冲液稀释得到的溶液。
在本发明的一个优选实施方案中,羟基磷灰石层析柱在使用前用10mM-30mM磷酸缓冲液(pH6.5-7.5)、优选为20mM的磷酸缓冲液(pH6.8)平衡2-3个柱体积。
在本发明的另一个优选实施方案中,在步骤(b)的羟基磷灰石柱层析之前,还包括:
(c)将蛇毒原料液进行阴离子交换柱层析,收集目标峰对应的组分,其后用于步骤(b)的羟基磷灰石柱层析,
其中阴离子交换柱层析的层析条件如下:
填料为琼脂糖介质,优选Sepharose H.P.、Sepharose F.F.或Capto,优选为QSepharose H.P.、Q Sepharose F.F.或Capto Q;
洗脱液为含NaCl的pH值为8.0-8.6的Tris-HCl缓冲液,其中Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM-30mM,NaCl的浓度为0.1M-0.5M;
优选地,Tris-HCl缓冲液的pH值为8.5,Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM;NaCl的浓度为0.2M;
洗脱条件为20%-100%线性洗脱5-20个柱体积。
步骤c)的阴离子交换柱层析的洗脱流速为30cm/小时-150cm/小时,优选为80cm/小时-120cm/小时,更优选为90cm/小时。
本发明上下文中,阴离子交换层析填料选自琼脂糖介质,优选Sepharose H.P.、Sepharose F.F.或Capto,包括但不限于Q Sepharose H.P.、Q Sepharose F.F.或Capto Q。
在本发明的一个优选实施方案中,阴离子交换层析柱在使用前用10mM-30mMTris-HCl缓冲液(pH8.0-8.6)、优选为20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)平衡2-3个柱体积。
在本发明的又一个优选实施方案中,在步骤(b)的羟基磷灰石柱层析之后,还包括:
(d)将步骤(b)收集的目标峰对应的组分进行分子筛层析,收集目标峰对应的组分获得凝血因子X激活剂,
其中分子筛层析的层析条件如下:
填料选自凝胶过滤介质,优选为Sephacryl、Superdex或Sephadex;进一步优选为Sephacryl S-200HR,Superdex75pg、Superdex200pg或Sephadex G25;
洗脱液为pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液,磷酸缓冲液浓度为40mM-80mM;
优选地,磷酸缓冲液pH值为6.8,浓度为50mM。
步骤d)分子筛层析的层析流速为10cm/小时-35cm/小时,优选为20cm/小时。
优选地,上样体积为分子筛柱体积的3%-5%。
本发明上下文中,分子筛层析填料选自凝胶过滤介质,优选为Sephacryl、Superdex或Sephadex;包括但不限于Sephacryl S-200HR、Superdex75pg、Superdex200pg或Sephadex G25。
在本发明的一个优选实施方案中,分子筛层析柱在使用前用40-80mM磷酸缓冲液(pH6.5-7.5)、优选50mM的磷酸缓冲液(pH6.8)充分平衡2-3个柱体积。
在本发明的再一个优选实施方案中,在步骤(b)进行羟基磷灰石柱层析后,还包括:
(e)将步骤(b)收集的目标峰对应的组分用超滤膜置换40mM-80mM磷酸缓冲液,磷酸缓冲液的pH值为6.5-7.5,超滤膜的截留分子量为10kD-50kD;
优选地,磷酸缓冲液的浓度为50mM,pH值为6.8,超滤膜截留分子量为30kD。
在本发明的一个优选实施方案中,在步骤(c)之后,还包括:
(f)将步骤(c)收集的目标峰对应的组分用超滤膜浓缩5-20倍,置换成10mM-30mM磷酸缓冲液,磷酸缓冲液的pH值为6.5-7.5,超滤膜的截留分子量为10kD-50kD;
优选地,磷酸缓冲液的浓度为20mM,pH值为6.8,超滤膜截留分子量为30kD,浓缩倍数为10倍。
在本发明的一个优选实施方案中,在步骤(a)获得蛇毒原料液之后,
(g)将蛇毒原料液进行病毒灭活处理。
在本发明的一个优选实施方案中,步骤(g)包括:
蛇毒原料液经滤膜过滤后,先后加入聚山梨酯和磷酸三丁酯、或先后加入TrionX-100和磷酸三丁酯,充分混匀后,20℃-30℃静置1-6小时,优选静置温度为25±2℃,优选灭活2-4小时,
其中聚山梨酯或TrionX-100的终体积浓度为0.5%-3%,磷酸三丁酯的终体积浓度为0.15%-0.9%;
优选地,聚山梨酯或TrionX-100的终体积浓度为1%;磷酸三丁酯的终体积浓度为0.3%;
优选地,所述聚山梨酯为吐温-20、吐温-60或吐温-80。
本发明采用S/D法病毒灭活步骤,能有效的灭活脂包膜病毒。在本发明的一个优选实施方案中,步骤(a)包括:
将毒蛇的蛇毒液或冻干粉用10mM-30mMTris-HCl稀释至浓度为15mg/ml-35mg/ml,离心,取上清液为蛇毒原料液;其中Tris-HCl的pH为8.0-8.6;
优选地,Tris-HCl的浓度为20mM,pH值为8.5;
优选地,为8000×g-12000×g离心;离心时间为10-30分钟,优选为20分钟;离心温度为2℃-8℃,优选为4℃。
在本发明的一个优选实施方案中,所述蛇毒来自选自以下的毒蛇品种:圆斑蝰蛇、矛头蝮蛇、尖吻蝮蛇、环蛇、角蝰、山蝰、蝮蛇、眼镜王蛇、蝰蛇、响尾蛇和/或眼镜蛇。
本发明还提供了上述方法提取的凝血因子X激活剂在制备止血药和治疗出血性疾病的药物中的用途。
在本发明的一个特别优选的实施方案中,经以下步骤从从蛇毒中提取凝血因子X激活剂:
(1)制备蛇毒原料液
将毒蛇的蛇毒液或冻干粉用(10mM-30mM)Tris-HCl缓冲液(pH8.0-8.6)稀释浓度至15mg/ml-35mg/ml。稀释液在2-8℃、以8000×g-12000×g离心10-30分钟。收集上清液用于后续步骤。
(2)S/D法灭活病毒
将步骤(1)制得的蛇毒原料液用0.45μm滤膜过滤。过滤完成后,先后加入聚山梨酯和磷酸三丁酯、或TrionX-100和磷酸三丁酯,其中聚山梨酯或TrionX-100终体积浓度为0.5-3%,磷酸三丁酯终体积浓度为0.15-0.9%。充分混匀后,混合物在20-30℃静置1-6小时,进行病毒灭活。
所述聚山梨酯选自吐温-20、吐温-60或吐温-80。
(3)阴离子交换柱层析
阴离子交换层析柱使用前用(10mM-30mM)Tris-HCl(pH8.0-8.6)平衡2-3个柱体积。然后进行上样,流速为30cm/小时-150cm/小时。上样完成后用(10mM-30mM)Tris-HCl(pH8.0-8.6)平衡液冲洗至基线,流速30cm/小时-150cm/小时。
用(10mM-30mM)Tris-HCl-(0.1M-0.5M)NaCl(pH8.0-8.6)溶液进行洗杂,流速30cm/小时-150cm/小时。
洗杂完成后20%-100%的(10mM-30mM)Tris-HCl-(0.1M-0.5M)NaCl(pH8.0-8.6)溶液进行线性洗脱5-20个柱体积,流速30cm/小时-150cm/小时,收集目标峰对应的组分。
(4)超滤浓缩
步骤(3)收集的目标峰对应的组分用超滤膜浓缩5-20倍,然后将目标峰对应的组分所在的溶液等体积置换为10mM-30mM磷酸缓冲液(pH6.5-7.5)。
所述超滤膜截留分子量为10kD-50kD。
(5)羟基磷灰石柱层析
羟基磷灰石层析柱使用前用10mM-30mM磷酸缓冲液(pH6.5-7.5)平衡2-3柱体积。然后上样,流速50cm/小时-1000cm/小时。之后用(10mM-30mM)磷酸缓冲液-(0.1M-0.8M)NaCl(pH 6.5-7.5)进行0-100%线性洗脱5-10个柱体积,流速为50cm/小时-1000cm/小时。收集目标峰对应的组分。将目标峰对应的组分直接进行分子筛层析或重复步骤(4)浓缩后再进行分子筛层析。
(6)分子筛层析或超滤
将羟基磷灰石柱层析收集的目标峰对应的组分直接进行分子筛层析,用40mM-80mM磷酸缓冲液(pH6.5-7.5)充分平衡2-3个柱体积后上样。层析流速10cm/小时-35cm/小时。上样体积控制在分子筛层析柱体积的3%-5%。收集目标峰对应的组分即为凝血因子X激活剂。
或者将(5)步骤收获的目标峰对应的组分所在的溶液直接用10kD-50kD的超滤膜置换成等体积的40mM-80mM磷酸缓冲液(pH6.5-7.5)。
本发明方法以蛇毒为原材料,首次将羟基磷灰石柱层析方法应用到规模化提取凝血因子X激活剂的方法中。本发明的方法提高了样品纯度和比活性,残留指标能得到很好的控制,收率高,工艺稳定,为凝血因子X激活剂的大规模分离纯化提供了新的途径。进一步地,本发明方法还可以将阴离子交换层析和羟基磷灰石柱层析结合使用,提高样品纯度和比活性。更进一步地,本发明的方法还可以加入病毒灭活的步骤,进一步提高样品的安全性;还可以加入超滤方法进行缓冲液置换和浓缩,省去了透析步骤,更适合于规模化生产。
本发明方法有益效果具体如下:
1、本发明方法获得的产品收率高且纯度高:收率达到2.7%或更高,收率显著高于现有技术的0.34%;产品纯度能高达到98%以上;
2、本发明方法获得的产品比活性高,在3.0×104U/mg以上;
3、本发明方法进一步可加入采用病毒灭活,安全性高;
4、本发明方法没有透析操作,批次差异小,工艺稳定,适合大规模生产;层析柱可反复使用,节约成本。
当然,需要说明的是,本发明实施例的方法不必同时实现上述全部优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1:20160306批次HPLC纯度检测峰图;
图2:20160307批次HPLC纯度检测峰图;
图3:20160308批次HPLC纯度检测峰图;
图4:20160306批次SDS-PAGE纯度检测图;
图5:20160307批次SDS-PAGE纯度检测图;
图6:20160308批次SDS-PAGE纯度检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1:制备蛇毒原料液
取蝰蛇蛇毒液(广西)约10ml(蛋白浓度约为260mg/ml),用20mMTris-HCl溶液(pH8.5)稀释至浓度为26mg/ml,在4℃下12000×g离心20分钟,收集上清液。
实施例2:病毒灭活
采用S/D法对实施例1获得的蛇毒原料液进行病毒灭活,具体步骤如下:
将实施例1收集的上清液用0.45μm滤膜过滤后,先后加入吐温-80和磷酸三丁酯,使吐温-80终体积浓度为1%,磷酸三丁酯终体积浓度为0.3%。充分混匀后,混合物在25℃±2℃水浴2小时,进行病毒灭活。
实施例3:阴离子交换层析
Q Sepharose HP层析柱使用前用20mMTris-HCl(pH8.5)缓冲液平衡3个柱体积。
用实施例2获得的经病毒灭活的蛇毒原料液上样,流速90cm/小时。上样完成后用20mM Tris-HCl(pH8.5)溶液洗杂至基线,流速90cm/小时。
用20mM Tris-HCl-0.2M NaCl(pH8.5)溶液进行洗杂,流速90cm/小时。
洗杂完成后再用20%-100%的20mM Tris-HCl-0.2M NaCl(pH8.5)溶液洗脱10个柱体积,流速90cm/小时。当电导升高至10ms/cm时,目标峰开始出现,收集目标峰对应的组分。至目标峰下降至基线停止收集目标峰对应的组分。
实施例4:超滤浓缩
将实施例3收集的目标峰对应的组分用30kD超滤膜浓缩约10倍。然后将浓缩液用20mM磷酸缓冲液(pH 6.8)进行等体积置换。
实施例5:羟基磷灰石柱层析
CHT Ceramic Hydroxyapatite(Bio-rad)Type I羟基磷灰石层析柱在使用前用20mM磷酸缓冲液(pH6.8)充分平衡3个柱体积。
5.1用实施例1收集的上清液上样,流速600cm/小时。用20mM磷酸缓冲液-0.4MNaCl(pH 6.8)进行0-100%线性洗脱5个柱体积,流速为600cm/小时。首先出现一个杂峰,第二个峰为目的峰,收集目标峰对应的组分。目标峰对应的组分下降至基线时停止收集目标峰对应的组分。
5.2用实施例3收集的目标峰对应的组分,流速600cm/小时。用20mM磷酸缓冲液-0.4M NaCl(pH 6.8)进行0~100%线性洗脱5个柱体积,流速为600cm/小时。首先出现一个杂峰,第二个峰为目的峰,收集目标峰对应的组分。目标峰对应的组分下降至基线时停止收集目标峰对应的组分。
5.3用实施例4获得的产物,流速600cm/小时。用20mM磷酸缓冲液-0.4M NaCl(pH6.8)进行0-100%线性洗脱5个柱体积,流速为600cm/小时。首先出现一个杂峰,第二个峰为目的峰,收集目标峰对应的组分。目标峰对应的组分下降至基线时停止收集目标峰对应的组分。
实施例6:分子筛层析
将实施例5.3收集的目标峰对应的组分直接进行分子筛层析,Sephacryl S-200HR层析柱在使用前用50mM磷酸缓冲液(pH6.8)充分平衡3个柱体积后上样。上样体积控制在分子筛柱体积的5%。层析流速20cm/小时。收集目标峰对应的组分。
采用本实施例的方法获得了三个批号的样品:20160306、20160307、20160308,用于后续检测。
实施例7-9:样品纯化
根据实施例1-6的方法、采用表1中列出的参数进行实施例7-9。
表1实施例7-9相关参数
实施例10:收率检测
采用《中国药典》2015年版三部通则0731蛋白质含量测定法第二法福林酚法(Lowry法)检测纯化后的凝血因子X激活剂蛋白浓度,测量体积,获得最终纯化后的蛋白总量,通过与投料时的总蛋白浓度进行比较,获得纯化收率。
对实施例3、4、5.1、5.2、5.3、6、7、8和9获得的样品的收率分别进行了统计,结果见表2。
表2凝血因子X激活剂纯化收率
从表2可以看出,各批次收率能够达到2.7%或更高,本发明方法收率高且非常稳定。
实施例11:HPLC纯度检测
采用尺寸排阻原理的高效液相色谱法(HPLC)进行纯度检测。对实施例3、4、5.1、5.2、5.3、6、7、8和9获得的样品分别进行了HPLC纯度检测(见表3)。其中实施例6获得的三批产品的HPLC检测峰图见图1-3。
表3 HPLC纯度结果汇总
批号 | HPLC纯度 |
实施例3 | 85.29% |
实施例4 | 85.30% |
实施例5.1 | 90.10% |
实施例5.2 | 98.41% |
实施例5.3 | 98.71% |
实施例6(20160306) | 99.83% |
实施例6(20160307) | 99.03% |
实施例6(20160308) | 98.97% |
实施例7 | 98.97% |
实施例8 | 99.02% |
实施例9 | 98.86% |
从HPLC纯度检测结果可以看到,当只有一步阴离子交换层析时,凝血因子X激活剂HPLC纯度只有85%左右,只有一步羟基磷灰石柱层析时,HPLC纯度能达到90%左右,而羟基磷灰石柱层析加上阴离子交换层析,纯度能达到98%以上。进一步加上超滤和/分子筛层析,纯度可达近99%。且从连续三批实验数据可以看出,多批次之间结果稳定,说明工艺稳定,批间差异小。
实施例12:SDS-PAGE纯度检测
参照“《中国药典》三部(2015年版)通则0541第五法”进行,非还原电泳,分离胶12%,上样量不少于10μg,采用考马斯亮蓝法染色,通过灰度扫描判断样品纯度。对实施例3、4、5.1、5.2、5.3、6、7、8和9获得的样品进行了SDS-PAGE的纯度检测。各实施例样品的SDS-PAGE纯度结果见表4,其中实施例6获得的三批产品的SDS-PAGE检测图见图4-6。
表4 SDS-PAGE纯度结果汇总
批号 | SDS-PAGE纯度 |
实施例3 | 80.2% |
实施例4 | 81.5% |
实施例5.1 | 90.6% |
实施例5.2 | 96.8% |
实施例5.3 | 100% |
实施例6(20160306) | 100% |
实施例6(20160307) | 100% |
实施例6(20160308) | 100% |
实施例7 | 100% |
实施例8 | 100% |
实施例9 | 100% |
从表中数据可以看出,如果柱纯化只包括一步阴离子交换层析,样品纯度在80%左右,而只有一步羟基磷灰石柱层析,样品纯度能提高到90%,如果有阴离子交换层析和羟基磷灰石柱两步层析的情况下,样品纯度能达到95%以上,进一步加上超滤/分子筛层析,SDS-PAGE纯度能达到100%,且多批次之间结果稳定,说明该工艺稳定,批间差异小,获得产品纯度高。
实施例12:比活性检测
参考文献《生物底色连续速率法测定圆斑蝰蛇凝血因子X激活剂的活性》(中国医药杂志2007,第16卷第18期)的方法,对实施例3、4、5.1、5.2、5.3、6、7、8和9获得的样品进行比活性检测,结果见表5。
表5多批次凝血因子X激活剂比活性汇总
批号 | 比活性(U/mg) |
实施例3 | 2.0×10<sup>4</sup> |
实施例4 | 2.2×10<sup>4</sup> |
实施例5.1 | 2.9×10<sup>4</sup> |
实施例5.2 | 3.2×10<sup>4</sup> |
实施例5.3 | 3.3×10<sup>4</sup> |
实施例6(20160306) | 3.1×10<sup>4</sup> |
实施例6(20160307) | 3.4×10<sup>4</sup> |
实施例6(20160308) | 3.3×10<sup>4</sup> |
实施例7 | 3.2×10<sup>4</sup> |
实施例8 | 3.3×10<sup>4</sup> |
实施例9 | 3.2×10<sup>4</sup> |
比活性与样品纯度相关,当样品纯度高时,比活性较高。加入羟基磷灰石柱层析后样品,比活性均不低于2.9×104U/mg。实施例6三个连续批次(20160306、20160307、20160308)的样品比活性均在3.0×104U/mg以上,批间差异小,说明生产工艺稳定、产品活性高。
需要说明的是,在本文中,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述,各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可,每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均包含在本发明的保护范围内。
Claims (13)
1.一种从蛇毒中提取凝血因子X激活剂的方法,其特征在于,包括:
(a)获得蛇毒原料液;
(b)进行羟基磷灰石柱层析,收集目标峰对应的组分获得凝血因子X激活剂;
其中所述羟基磷灰石柱层析的层析条件如下:
填料为I型或II型羟基磷灰石填料;
洗脱液为含NaCl的pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液,其中磷酸缓冲液的浓度为10mM-30mM,NaCl的浓度为0.1M-0.8M;
优选地,磷酸缓冲液pH值为6.8,磷酸缓冲液浓度为20mM;NaCl的浓度为0.4M。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(b)羟基磷灰石柱层析的洗脱流速为50cm/小时-1000cm/小时,优选为100cm/小时-800cm/小时,最优选为600cm/小时。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤(b)的羟基磷灰石柱层析之前,还包括以下步骤:
(c)将蛇毒原料液进行阴离子交换柱层析,收集目标峰对应的组分,其后用于所述步骤(b)的羟基磷灰石柱层析;
其中所述阴离子交换柱层析的层析条件如下:
填料为琼脂糖介质,优选Sepharose H.P.、Sepharose F.F.或Capto,优选为QSepharose H.P.、Q Sepharose F.F.或Capto Q;
洗脱液为含NaCl的pH值为8.0-8.6的Tris-HCl缓冲液,其中Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM-30mM,NaCl的浓度为0.1M-0.5M;
优选地,Tris-HCl缓冲液的pH值为8.5,Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM;NaCl的浓度为0.2M。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤c)的阴离子交换柱层析的洗脱流速为30cm/小时-150cm/小时,优选为80cm/小时-120cm/小时,更优选为90cm/小时。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤(b)的羟基磷灰石柱层析之后,还包括以下步骤:
(d)将步骤(b)收集的目标峰对应的组分进行分子筛层析来进一步纯化,收集目标峰对应的组分获得凝血因子X激活剂,
其中所述分子筛层析的层析条件如下:
填料选自凝胶过滤介质,优选为Sephacryl、Superdex或Sephadex;进一步优选为Sephacryl S-200HR,Superdex75pg、Superdex200pg或Sephadex G25;
洗脱液为pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液,磷酸缓冲液浓度为40mM-80mM;
优选地,磷酸缓冲液pH值为6.8,浓度为50mM。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤d)分子筛层析的洗脱流速为10cm/小时-35cm/小时,优选为20cm/小时。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤(b)进行羟基磷灰石柱层析后,还包括以下步骤:
(e)将步骤(b)收集的目标峰对应的组分用超滤膜置换40mM-80mM磷酸缓冲液,磷酸缓冲液的pH值为6.5-7.5,超滤膜的截留分子量为10kD-50kD;
优选地,磷酸缓冲液的浓度为50mM,pH值为6.8,超滤膜截留分子量为30kD。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤(c)之后,还包括以下步骤:
(f)将步骤(c)收集的目标峰对应的组分用超滤膜浓缩5-20倍,再将目标峰对应的组分所在的溶液置换成10mM-30mM磷酸缓冲液,磷酸缓冲液的pH值为6.5-7.5,超滤膜的截留分子量为10kD-50kD;
优选地,磷酸缓冲液的浓度为20mM,pH值为6.8,超滤膜截留分子量为30kD,浓缩倍数为10倍。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤(a)获得蛇毒原料液之后,还包括步骤:
(g)将蛇毒原料液进行病毒灭活处理。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,步骤(g)包括:
蛇毒原料液经滤膜过滤后,先后加入聚山梨酯和磷酸三丁酯、或者先后加入TrionX-100和磷酸三丁酯,充分混匀后,20-30℃静置1-6小时,优选静置温度为25±2℃,优选灭活2-4小时,
其中聚山梨酯或TrionX-100的终体积浓度为0.5%-3%,磷酸三丁酯的终体积浓度为0.15%-0.9%;
优选地,聚山梨酯或TrionX-100的终体积浓度为1%;磷酸三丁酯的终体积浓度为0.3%;
优选地,所述聚山梨酯为吐温-20、吐温-60或吐温-80。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(a)包括:
将毒蛇的蛇毒液或冻干粉用10mM-30mMTris-HCl稀释至浓度为15mg/ml-35mg/ml,离心,取上清液为蛇毒原料液;其中Tris-HCl的pH为8.0-8.6;
优选地,Tris-HCl的浓度为20mM,pH值为8.5;
优选地,8000×g-12000×g离心;离心时间为10-30分钟,优选为20分钟;离心温度为2℃-8℃,优选为4℃。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其特征在于,所述蛇毒来自选自以下的毒蛇品种:圆斑蝰蛇、矛头蝮蛇、尖吻蝮蛇、环蛇、角蝰、山蝰、蝮蛇、眼镜王蛇、蝰蛇、响尾蛇和/或眼镜蛇。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法提取的凝血因子X激活剂在制备止血药和治疗出血性疾病的药物中的用途。
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