CN105586330B - 一种尖吻蝮蛇凝血酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高活性尖吻蝮凝血酶的制备方法。该方法将蛇毒粗品经超滤膜超滤后通过阴离子柱层析，以磷酸缓冲液洗脱后，再通过分子筛凝胶柱除热源与脱盐，最终得到高活性、高纯度的凝血酶。本发明方法与现有技术相比具有以下优点：该方法适合大规模生产、操作简单、效率高；制备的尖吻蝮属凝血酶产品产率高达8％，纯度高达99％以上，比活力不低于180U/mg。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种尖吻蝮蛇凝血酶的制备方法。
背景技术
蛇毒是毒蛇毒腺分泌的一种成分复杂的液体，含有多种蛋白质、多肽、酶类和其它小分子物质，具有广泛的生物活性，目前研究人员已从蝰科洞蝮蛇属蝮蛇(Bothropsatrox)、长白山白眉蝮蛇等蛇毒中发现多种类凝血酶。
尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus)，蝰科尖吻蝮属，广泛分布于中国华南地区。尖吻蝮蛇凝血酶(HaemocoagulaseAcutus，简写为Halase)是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化的一种类凝血酶。它通过水解纤维蛋白的Aα链，使纤维蛋白原降解为纤维蛋白单体。专利CN1218747公开了尖吻蝮蛇凝血酶Halase用作治疗出血性疾病药物的用途，药理和毒理研究表明其具有较强的止血作用和极低的毒性。
专利CN100523185公开了一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备方法，通过透析、两步DEAE-SepharoseFF层析梯度洗脱和SephadexG25层析分离得到蛇毒类凝血酶，其纯度为95％。
专利CN101812436公开了一种单肽链的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶及其制备方法,得率为0.028％。其工艺包含三次DEAE-SepharoseFF层析，其中前两次使用酸性的低浓度NaCl-PBS溶液进行梯度洗脱，第三次层析使用碱性的低浓度NaCl-PBS溶液进行梯度洗脱。
专利CN101560510公开了一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶，通过在两次DEAE-SepharoseFF中使用碱性NaCl-PBS溶液进行梯度洗脱，再采用透析或Sephadex-G25脱盐制备得纯度不低于95％的产品，得率为0.7％-0.8％。
专利CN102757948公开了一种低流速下通过两次Sephadex-G75层析和一次DEAE-SepharoseFF层析制备出纯度为97.5％的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的方法。
专利CN103160485公开了一种尖吻蝮蛇凝血酶-C，通过硫酸铵分级沉淀、两次DEAE-SepharoseFF层析，最后以透析或Sephadex-G25脱盐得到比活力不低于40U/mg、纯度不低于95％的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶。
现有的从尖吻蝮蛇蛇毒中提取纯化尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的方法大多涉及长时间的透析且需多次换液，另外阴离子交换层析步骤往往要求线性洗脱或多步洗脱，存在方法复杂、效率不高等问题。
因此，有必要寻找一种简单高效、可应用于大规模生产的分离纯化工艺，制备出高活性的尖吻蝮蛇凝血酶。
发明内容
本发明目的在于提供一种尖吻蝮蛇凝血酶及其制备方法。该方法适合大规模生产、操作简单、效率高；制备的尖吻蝮蛇凝血酶产品产率高，纯度高达99％以上，比活力不低于180U/mg。
本发明提供的技术方法通过以下步骤实现：
(1)粗品澄清：以0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH值为6.2～6.9)溶解尖吻蝮蛇蛇毒粗品制成蛇毒溶液，蛇毒溶液经孔径0.45μm的微滤膜过滤，收集滤液；
(2)超滤除杂：将步骤(1)所得滤液经孔径10NMWC超滤膜过滤，收集滤液；
(3)将步骤(2)所得滤液进行DEAE-SepharoseFast Flow第一次层析，用含0.05MNaCl的0.01M磷酸盐缓冲液(pH值为6.2～6.9)洗脱，收集有效峰组分，以孔径为10NMWC超滤膜超滤浓缩，收集滤液；
(4)将步骤(3)所得滤液进行DEAE-SepharoseFast Flow第二次层析，用含0.03MNaCl和0.1M NaCl的0.01M磷酸盐缓冲液(pH值为7.2～7.9)-磷酸盐缓冲液依次洗脱，收集有效峰组分，以孔径10NMWC超滤膜超滤浓缩，收集滤液；
(5)除热原：将步骤(4)所得滤液使用Superdex-75pg层析柱，用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH值为7.2～7.9)洗脱，收集有效峰组分；
(6)脱盐：将步骤(5)所得滤液使用Sepadex-G25层析柱，用注射用水洗脱，对已除热原的上述组分进行脱盐，收集有效峰组分，得到尖吻蝮蛇凝血酶。
将所得的尖吻蝮蛇凝血酶加赋形剂过滤、分装和冷冻干燥，可制作成注射用尖吻蝮蛇凝血酶。
步骤(1)是对尖吻蝮蛇蛇毒的预处理，以微滤替代传统的离心取上清液，可有效去除悬浮物、部分细菌、大分子胶体等物质，获得适合进一步分离的澄清蛇毒溶液，操作简便、效率高。
步骤(2)通过超滤截留分子量大于10kDa的物质，可除去蛇毒溶液中大部分小分子杂质。应用超滤技术，操作简单，截留效果好，能够极大地提高下一步阴离子交换层析的分离效率。而传统的透析方法不仅耗时长，且若透析期间换液不当会严重影响透析效果。
步骤(3)使用偏酸性的磷酸盐缓冲液冲洗，再用含低浓度NaCl的磷酸盐缓冲液进行目标物的洗脱。
步骤(4)使用偏碱性的磷酸盐缓冲液冲洗，再分别两个不同浓度的NaCl-磷酸盐缓冲液进行目标物的洗脱。步骤(4)可分离得尖吻蝮蛇凝血酶，纯度可达到95％以上。操作简单，纯化效率高。
步骤(5)中的Superdex-75pg层析柱分辨率高，可进一步纯化尖吻蝮蛇凝血酶并去除热原。步骤(6)采用Sepadex-G25层析柱进行脱盐。由于脱盐后的蛋白质容易变性，在对尖吻蝮蛇凝血酶去除热原后再进行脱盐可最大限度地保留酶活力。脱盐后的尖吻蝮蛇凝血酶宜马上冷冻干燥，或加入赋形剂制成冻干粉注射剂等剂型。
本发明分离纯化的尖吻蝮蛇凝血酶的HPLC分析纯度高达99以上％，比活力不低于180U/mg，SDS-PGE电泳呈现两条带。
本发明的优势在于，通过微滤与超滤可替代长耗时且操作相对复杂的离心与透析，在有效缩短分离纯化工艺时间,同时较好地保护了尖吻蝮蛇凝血酶的活性。两步阴离子柱层析的洗脱步骤简单明确，可控性强；结合超滤技术，大大提高了尖吻蝮蛇凝血酶分离纯化的效率，得率远高于现有技术，适合大规模工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的尖吻蝮蛇凝血酶HPLC图谱。
图2为本发明实施例1制得的尖吻蝮蛇凝血酶的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明并不局限于此。根据本发明精神对本发明方法、步骤或条件所作的修改均属于本发明的范围。
实施例1
取尖吻蝮蛇蛇毒粉末7.5g，至于4℃层析柜中用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 6.8)搅拌溶解，待蛇毒完全溶解后，用磷酸盐缓冲液稀释，使用QuixStandand Benchtop System(GE Healthcare公司)进行微滤(微滤柱型号：CFP-4-E-4MA，0.45μm，GE Healthcare)，收集滤液并加入磷酸盐缓冲液稀释。使用QuixStandand Benchtop System对上述滤液稀释液进行超滤(超滤柱型号：UFP-10-E-4MA，10NMWC，GE Healthcare)，样品溶液用于进一步的层析。层析柱皆连接于AKTA prime plus蛋白分离纯化仪(GE Healthcare)。
用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 6.8)先平衡DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱(GE Healthcare)，然后对上述样品溶液进行上样(10ml/min)。上样完毕后，即用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 6.8)冲洗(35ml/min)至紫外检测器无峰信号检出，再用含0.05MNaCl的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)洗脱目标物(10ml/min)，收集出峰组分，超滤浓缩。用HPLC、SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分，结果与目标产一致。
用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 7.5)先平衡DEAE-SepharoseFast Flow层析柱(GEHealthcare)，然后对上述滤液进行上样(10ml/min)。上样完毕后，即用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 7.5)冲洗(35ml/min)至紫外检测器无峰信号检出，再分别用含0.03M NaCl和0.1MNaCl的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)洗脱目标物(20ml/min)，收集出峰组分，并超滤浓缩，收集滤液。用HPLC、SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分。
用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 7.5)先平衡Superdex-75pg层析柱(GEHealthcare)，然后对上述含有目标组分的滤液进行上样(20ml/min)。上样完毕后，用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 7.5)洗脱目标物(20ml/min)，收集最大出峰组分。用HPLC、SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分。
用注射用水先平衡Sephadex-G25层析柱(GE Healthcare)，然后对上述溶液进行上样(20ml/min)，上样完毕后，用注射用水洗脱目标物(20ml/min)，收集出峰组分。经测定，分离纯化所得的尖吻蝮蛇凝血酶HPLC分析纯度高达99.69％，得率为：8.43％。结果见表1、表2。尖吻蝮蛇凝血酶比活力不低于180U/mg，SDS-PGE电泳呈现两条带。
表1 尖吻蝮蛇凝血酶的HPLC谱图相对峰面积
表2 尖吻蝮蛇凝血酶的分离纯化结果
实施例2
取尖吻蝮蛇蛇毒粉末30g，至于4℃层析柜中用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 6.5)搅拌溶解，待蛇毒完全溶解后，用磷酸盐缓冲液稀释，使用QuixStandand Benchtop System(GE Healthcare公司)进行微滤(微滤柱型号：CFP-4-E-4MA，0.45μm，GE Healthcare)，收集滤液并加入磷酸盐缓冲液稀释。使用QuixStandand Benchtop System对上述滤液稀释液进行超滤(超滤柱型号：UFP-10-E-4MA，10NMWC，GE Healthcare)，样品溶液用于进一步的层析。层析柱皆连接于AKTA prime plus蛋白分离纯化仪(GE Healthcare)。
用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 6.2)先平衡DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱(GE Healthcare)，然后对上述样品溶液进行上样(40ml/min)。上样完毕后，即用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 6.2)冲洗(140ml/min)至紫外检测器无峰信号检出，再用含0.05MNaCl的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 6.2)洗脱目标物(40ml/min)，收集出峰组分，超滤浓缩。用HPLC、SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分。结果与目标产一致。
用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 7.2)先平衡DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱(GE Healthcare)，然后对上述滤液进行上样(40ml/min)。上样完毕后，即用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 7.2)冲洗(140ml/min)至紫外检测器无峰信号检出，再分别用含0.03M NaCl和0.1M NaCl的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)洗脱目标物(80ml/min)，收集出峰组分，并超滤浓缩，收集滤液。用HPLC、SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分。
用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 7.2)先平衡Superdex-75pg层析柱(GEHealthcare)，然后对上述含有目标组分的滤液进行上样(80ml/min)。上样完毕后，用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 7.2)洗脱目标物(80ml/min)，收集最大出峰组分。用HPLC、SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分。
用注射用水先平衡Sephadex-G25层析柱(GE Healthcare)，然后对上述溶液进行上样(80ml/min)，上样完毕后，用注射用水洗脱目标物(80ml/min)，收集出峰组分。经测定，分离纯化所得的尖吻蝮蛇凝血酶HPLC分析纯度为99.61％。得率8.22％,尖吻蝮蛇凝血酶比活力不低于180U/mg，SDS-PGE电泳呈现两条带。
实施例3
取尖吻蝮蛇蛇毒粉末150g，至于4℃层析柜中用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 6.6)搅拌溶解，待蛇毒完全溶解后，用磷酸盐缓冲液稀释，使用Versarflux13(GE Healthcare公司)进行微滤(微滤柱型号：CFP-4-E-5A，0.45μm，GE Healthcare)，收集滤液并加入磷酸盐缓冲液稀释。使用Versarflux13对上述滤液稀释液进行超滤(超滤柱型号：UFP-10-C-5A，10NMWC，GE Healthcare)，样品溶液用于进一步的层析。层析柱皆连接于AKTAprocess蛋白分离纯化仪(GE Healthcare)。
用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 7.0)先平衡DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱(GE Healthcare)，然后对上述样品溶液进行上样(400ml/min)。上样完毕后，即用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 7.0)冲洗(1400ml/min)至紫外检测器无峰信号检出，再用含0.05MNaCl的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗脱目标物(400ml/min)，收集出峰组分，超滤浓缩。用HPLC、SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分，结果与目标产一致。
用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 8.0)先平衡DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱(GE Healthcare)，然后对上述滤液进行上样(400ml/min)。上样完毕后，即用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 8.0)冲洗(1400ml/min)至紫外检测器无峰信号检出，再分别用含0.03MNaCl和0.1M NaCl的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)洗脱目标物(800ml/min)，收集出峰组分，并超滤浓缩，收集滤液。用HPLC、SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分。
用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 8.0)先平衡Superdex-75pg层析柱(GEHealthcare)，然后对上述含有目标组分的滤液进行上样(800ml/min)。上样完毕后，用0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH 8.0)洗脱目标物(800ml/min)，收集最大出峰组分。用HPLC、SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分。
用注射用水先平衡Sephadex-G25层析柱(GE Healthcare)，然后对上述溶液进行上样(800ml/min)，上样完毕后，用注射用水洗脱目标物(800ml/min)，收集出峰组分。经测定，分离纯化所得的尖吻蝮蛇凝血酶HPLC分析纯度为99.65％,得率7.80％。凝血酶比活力不低于180U/mg，SDS-PGE电泳呈现两条带。
实施例4
将现有尖吻蝮蛇凝血酶制备方法与本发明方法作对比实验，结果见表3。
表3 本发明与现有制备技术工艺数据对比
| 工艺 | 分子量(KDa) | 等电点 | HPLC纯度(％) | 比活(U/mg) | 得率(％) |
| CN 100523185 | 29.3～29.5 | 5.51-5.64 | ≥95 | —— | 0.5 |
| CN 101560510 | 29.3～29.5 | 5.5 | ≥95 | ≥180 | 0.7-0.8 |
| CN101812436 | 37 | 4.28 | —— | ≥560 | 0.028 |
| CN 102757948 | 29.1 | —— | ≥97.5 | —— | —— |
| CN103160485 | 29.2 | 5.7 | ≥95 | ≥40 | 0.4-0.5 |
| 本发明工艺 | 28.9～29.3 | 5.78 | ≥99 | ≥180 | 8.15 |
说明：上表制备工艺项中1到5项为各对应公开号的专利文献工艺数据，第六项为本发明工艺实验的数据。
实施例5
称取分离纯化所得的尖吻蝮蛇凝血酶1000个单位，加赋形剂右旋糖酐10g，置于玻璃容器中，加适量无菌注射用水溶解混匀后，最终将无菌注射水加至500ml。用0.22μm滤膜过滤除菌后，在洁净室超净工作台分装成1个单位每瓶的尖吻蝮蛇凝血酶后加盖，冷冻干燥后即得注射用尖吻蝮蛇凝血酶粉针剂。
关于本发明试验方法的说明：
1、尖吻蝮蛇凝血酶HPLC测定方法
按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版(四部)通则0512)测定。色谱条件与系统适应性实验：用BIOSEP SEC-S2000(7.8×300mm)色谱柱；以pH6.8的磷酸盐缓冲液为流动相。检测波长为280nm，流速为1ml/min。理论塔板数不得少于2000。结果与分析：本品的高效液相色谱呈单一对称峰，记录色谱图，并按面积归一化法计算主成分相对百分含量。
2、SDS-PAGE方法说明。
(1)样品制备：按照样品：5×上样缓冲液体积＝4:1的比例制备样品，充分混匀后沸水浴加热5min。
(2)上样：将约20μl样品与10μl蛋白Marker加入到泳道中。
(3)电泳：首先恒压100V，直至溴酚蓝染料呈一细直线后，改用120V，直至溴酚蓝条带到达分离胶的底部约1cm处，停止电泳。
(4)染色：使用0.1％考马斯亮蓝溶液染色，室温摇床孵育1h。
(5)脱色：使用脱色液脱色，直至条带清晰可见，背景干净为止。
(6)凝胶扫描：使用BioRadGS-800凝胶扫描仪扫描结果，保存图像。
3、尖吻蝮蛇凝血酶活性检测及效价测定。
人血浆凝固时间：取尖吻蝮蛇凝血酶样品，用蒸馏水溶解后制成供试品溶液。量取人血浆0.2ml至于试管中，在37℃水浴中保温约2分钟，加入上述配置的供试品溶液0.2ml后，立即摇匀计时，人血浆溶液应在60±20秒内振摇后出现凝结。再加入1ml 5M尿素溶液后振摇，凝块溶解，溶液变清。
活性单位定义：在37℃条件下，一个尖吻蝮蛇凝血酶活性单位是指使标准人血浆在60±20秒内振摇后出现絮状物的尖吻蝮蛇凝血酶量。
所述得率以所得的尖吻蝮蛇凝血酶与尖吻蝮蛇毒原料的质量百分比计。
Claims (2)
1.一种尖吻蝮蛇凝血酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)粗品澄清：以浓度为0.01M、pH值为6.5-7.1的磷酸缓冲液，溶解尖吻蝮蛇蛇毒粗品，制成蛇毒溶液，蛇毒溶液经孔径0.45μm的微滤膜过滤，收集滤液；
(2)超滤除杂：将所得滤液经孔径10NMWC超滤膜过滤，收集滤液；
(3)将步骤(2)所得滤液用DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱进行第一次层析，用含有0.05mol/L NaCl，浓度为0.01M，pH值为6.2-6.8的磷酸缓冲液洗脱，收集出峰组分，以孔径为10NMWC超滤膜超滤浓缩，收集滤液；
(4)将步骤(3)所得滤液用DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱进行第二次层析，再分别用含0.03mol/L和0.1mol/L NaCl，浓度为0.01M，pH值为7.2-7.8的磷酸缓冲液依次洗脱，收集0.1mol/L的洗脱峰流出液，以孔径10NMWC超滤膜超滤浓缩，收集滤液；
(5)除热原：将步骤(4)所得滤液用Superdex-75pg层析柱，用pH值为7.2-7.8的0.01M磷酸缓冲液层析洗脱，收集出峰组分；
(6)脱盐：将步骤(5)所得滤液用Sepadex-G25层析柱，用注射用水洗脱，对已除热原的上述组分进行脱盐，得到尖吻蝮蛇凝血酶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)粗品澄清：以浓度为0.01M、pH值6.8的磷酸缓冲液，溶解尖吻蝮蛇蛇
毒粗品，制成蛇毒溶液，蛇毒溶液经孔径0.45μm的微滤膜过滤，收集滤液；
(2)超滤除杂：将所得滤液经孔径10NMWC超滤膜过滤，收集滤液；
(3)将步骤(2)所得滤液用DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱进行第一次层析，用含有0.05mol/L NaCl，浓度为0.01M，pH值为6.8的磷酸缓冲液洗脱，洗脱速度10ml/min，收集出峰组分，以孔径为10NMWC超滤膜超滤浓缩，收集滤液；
(4)将步骤(3)所得滤液用DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱进行第二次层析，再分别用含0.03mol/L和0.1mol/L NaCl，浓度为0.01M，pH值为7.5的磷酸缓冲液依次洗脱，洗脱速度20ml/min，收集0.1mol/L的洗脱峰流出液，以孔径10NMWC超滤膜超滤浓缩，收集滤液；
(5)除热原：将步骤(4)所得滤液使用Superdex-75pg层析柱，用pH值为7.5的0.01M磷酸缓冲液洗脱，洗脱速度20ml/min，收集出峰组分；
(6)脱盐：将步骤(5)所得滤液使用Sepadex-G25层析柱，用注射用水洗脱，洗脱速度20ml/min，对已除热原的上述组分进行脱盐，得到尖吻蝮蛇凝血酶。
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