CN101358184A - 尖吻蝮蛇蛇毒血凝酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种尖吻蝮蛇血凝酶，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种高活性血凝酶，由α、β两个亚基构成，亚基链间由二硫键连接，其中α亚基具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，β亚基具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明尖吻蝮蛇血凝酶为丝氨酸蛋白酶，能够水解人纤维蛋白原α链。本发明还提供了该酶的纯化方法，包括通过预处理去除不容物和小分子多肽，并降低溶液离子强度，在通过两次DEAE－Sephrose FF柱层析，收集活性洗脱峰，经透析或超滤除盐后即得高纯度蛇毒血凝酶，其比活为800－1200u/mg蛋白，HPLC分析纯度可达95％以上，纯化收得率为0.3％－0.5％。

Description

尖吻蝮蛇蛇毒血凝酶
技术领域
本发明涉及一种丝氨酸蛋白酶，具体地说是一种蛇毒血凝酶，本发明还涉及其分离纯化方法。
背景技术
据国内外文献的报导，在蝮亚科(Crotalinae)蛇毒中多存在一类与血液凝固相关的蛋白酶，通常称之为“类凝血酶”(thrombin-likeenzyme，简称：TLC)。类凝血酶与凝血酶(thrombin)的作用相似，可以使血浆中纤维蛋白原转化为纤维蛋白而“凝固”。现已在30多种蝮科蛇毒中发现并分离纯化出20余种TLC。到目前为止，已发现的TLC分子量多在30,000左右，大多数为酸性糖蛋白。
在以往已经发现的蛇毒TLC中，蛋白质一级结构多为单链，其代表产品“立止血”是由巴西矛头蝮蛇蛇毒中分离出的凝血酶，但在蝮亚科蛇毒TLC中也存在双链分子结构，链间由二硫键连接。Xin Cheng等(中国科技大学)1999年报导：从五步蛇(Agkistrodonacutus)中分离到一种“类凝血酶”，命名为“Agkisacutacin”。该蛋白由两条肽链构成，α-亚基分子量15kDa，β-亚基分子量14kDa。Agkisacutacin能够水解纤维蛋白原中的α链。肖昌华(中科院昆明动物研究所)2004年从五步蛇(Agkistrodon acutus)中分离到两种“类凝血酶”，均为双链分子结构。凝血酶I的A亚基含有132个氨基酸，分子量16,000Da；B亚基含有123个氨基酸，分子量14,000Da，酶比活性为：160U/mg。凝血酶II的A亚基含有122个氨基酸，分子量15,000Da；B亚基含有120个氨基酸，分子量13,000Da，酶比活性为：70U/mg。该两种TLC经药理实验证明：均具有止血功效。
我国具有丰富的蛇毒研究资源，本发明人从我国的尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus，俗称五步蛇)的蛇毒中分离得到一种高活性血凝酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛇毒血凝酶，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种类凝血酶。
本发明的另一个目的在于提供一种分离纯化上述血凝酶的方法。
本发明血凝酶是从中国尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分离得到的高活性血凝酶。该酶具有如下特征：①酶蛋白分子量为29,800Dalton。②由α、β两个亚基构成，亚基链间由二硫键连接。③α亚基含129个氨基酸，分子量为15,500Dalton，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；β亚基含123个氨基酸，分子量为14,300Dalton，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。④酶活性可被苯甲基磺酰氟(PMSF)完全抑制，表明其是一种丝氨酸蛋白酶。
本发明还提供上述蛇毒血凝酶的纯化方法，其包括如下步骤：
1)、蛇毒预处理；
2)、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE-Sephrose FF层析柱，用0.01M pH7.4PBS洗柱，再用含0～1M NaCl的0.01M pH7.4PBS分步洗脱，收集0.06M NaCl溶液的洗脱液；
3)、将上述洗脱液适当浓缩后透析或多次稀释超滤去除NaCl；
4)、将透析后的溶液再次上经预平衡的DEAE-Sephrose FF层析柱，用0.01M pH7.4PBS洗柱，再用含0～1M NaCl的0.01M pH7.4PBS分步洗脱，收集0.06M NaCl溶液洗脱液的最后洗脱峰；
5)、将上述洗脱液适当浓缩后透析或多次稀释超滤去除NaCl。
其中，步骤1)蛇毒预处理的方法是将蛇毒用适量预冷的0.01MpH7.4PBS溶解，离心取上清液进行透析或超滤(可用分子截留量为5000D的膜进行切向流超滤)，通过预处理可以去除不容的杂质以及小分子多肽，并降低溶液离子强度。
具体地说可通过如下步骤进行蛇毒的预处理：称取蛇毒若干克，用蛇毒重量20倍体积预冷的0.01M pH7.4PBS于4-8℃的层析柜中搅拌溶解30分钟，于4℃、10000g离心10分钟，将离心上清液倾入透析袋中，离心沉淀用PBS搅拌悬浮，再次离心。合并两次离心上清液于透析袋中，在层析柜中对0.01M pH7.4PBS透析24小时，中间换液3次，以去除小分子多肽和降低溶液离子强度。
如上所述，各透析步骤均可采用切向流超滤(选用截止值5000分子量膜)方法代替，通过稀释、超滤浓缩，再稀释再超滤浓缩的方式以去除小分子多肽和脱盐降低溶液离子强度。
其中，步骤2)和步骤4)可采用0.01M pH7.4PBS预平衡DEAE-Sephrose FF层析柱，然后上样。
其中，步骤3)和步骤5)的目的均是去除溶液中存在的NaCl。洗脱液浓缩的方法可采用硫酸铵沉淀后溶解，然后进行透析，或反复采用稀释和超滤浓缩的方法去除硫酸铵。具体可采用如下方法：在搅拌条件下逐步添加粉末固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到80％，4℃、10,000g离心10分钟，收集沉淀蛋白，沉淀蛋白用适量的0.01MpH7.4PBS溶解，装入一透析袋中，对0.01M pH7.4PBS进行透析，共透析24小时。期间换液三次。如上所述，也可不经硫酸铵沉淀，而使用切向流超滤(选用截止值5000分子量膜)通过稀释、超滤浓缩，再稀释再超滤浓缩的方式以浓缩蛋白，脱去NaCl。
经本发明方法纯化的血凝酶比活为800-1200u/mg蛋白(活性随不同批次蛇毒原料而有所变化)，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)一条带，HPLC分析纯度可达95％以上。以蛇毒原料重量计，本法纯化收得率为0.3％-0.5％。
本发明血凝酶具有良好的凝集活性，可制成各种止血药物，例如经适当稀释到规定酶活浓度，再添加冻干保护剂(低分子右旋糖酐20或人血白蛋白)，病毒膜过滤，分装西林瓶，冷冻干燥制成医用注射冻干粉剂。用于外科手术中止血，以及各种临床出血症状。
附图说明
图1显示的是本发明血凝酶对人纤维蛋白原的水解作用，4h、2h、、1h、0.5h：分别代表血凝酶水解人纤维蛋白原的时间；F：人纤维蛋白原对照；M：蛋白质分子量标准物。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1蛇毒血凝酶的纯化
取10g尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批号20061001，广西蛇毒研究所)，用200ml预冷的0.01M pH7.4PBS于4-8℃的层析柜中搅拌溶解30分钟，4℃8000g离心10分钟，将离心上清液倾入一个3000ml烧杯中，采用Millipore Pellicon 2切向流超滤器(0.1M2 cut off 5k膜)超滤浓缩至100ml，再加入300ml 0.01M pH7.4的PBS，再超滤至100ml。该超滤浓缩过程循环3次。向100ml超滤浓缩液中加入100ml 0.01MpH7.4的PBS，按30ml/min流速上样到经0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)预平衡的DEAE-Sephrose FF柱。上样后，按以下方法进行洗脱，洗脱速度50ml/min：a.用5升0.01M pH7.4PBS淋洗柱子；b.用2升0.01M pH7.4PBS内含0.02M NaCl的溶液洗脱；c.用2升0.01M pH7.4PBS内含0.06M NaCl的溶液洗脱；d.用4升0.01MpH7.4PBS内含1M NaCl的溶液洗脱，以除去强吸附蛋白；e.用20升0.01M pH7.4PBS平衡层析柱，备用。经电泳分析目的物出现在0.06MNaCl的洗脱液的前3瓶中，合并此3瓶洗脱液，共得587ml，在搅拌条件下往此溶液中逐步添加329.3克固体硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度达到80％以沉淀目的蛋白。沉淀静置过夜后10000g离心10min，倾去上清液，沉淀物用15ml 0.01M pH7.4PBS溶解，待搅拌溶解后装入一只容量约50ml的透析袋中，再用适量的0.01MpH7.4PBS洗涤离心管两次，洗涤液也倒入透析袋中，使袋中溶液体积为30ml。对0.01M pH7.4PBS进行，共透析三次，每次用液1升，共透析24小时。透析结束后，将透析液倒入50ml离心管中，用10ml0.01M pH7.4PBS洗透析袋，洗涤液也倒入离心管中，10000g离心10min，小心倾出上清液于另一50ml离心管，加0.01M pH7.4PBS以补足溶液量为50ml。上样至DEAE-Sephrose FF柱中，按上述方法进行第二次层析，0.01M pH7.4PBS淋洗后，依次用含0.02M、0.04M、0.06M以及1M NaCl的0.01M pH7.4PBS进行洗脱。血凝酶出现在0.06MNaCl洗脱液的最后一个峰中，收集该峰洗脱液得352ml。聚丙烯酰胺凝胶电泳检查为一条带，说明已经得到纯化。该收集液在搅拌条件下逐步添加195克固体硫酸铵粉末，使蛋白沉淀下来，过夜后10000g离心10min收集沉淀蛋白用15ml 0.01M pH7.4PBS溶解后转移至一支50ml离心管中，10000g离心10min后，上清液小心地吸出装入一只容量约为30ml的透析袋中，对蒸馏水进行透析，共透析3次，每次1.5升。透析后测定酶活性为1203u/mg蛋白，收获蛋白32.1mg。最终收率0.32％。HPLC分析纯度98.1％，SDS-PAGE(非还原)为一条带，还原SDS-PAGE(还原)为两条带，其分子量大致为16KD和14KD。
实施例2蛇毒血凝酶的纯化
取10g尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批号：20061001，广西蛇毒研究所)，按上述工艺进行第一次DEAE-Sephrose FF层析，经电泳分析目的物出现在0.06MNaCl的洗脱液的前3瓶中，合并此3瓶洗脱液，共得595ml，在搅拌条件下往此溶液中逐步添加334克固体硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度达到80％以沉淀目的蛋白。沉淀静置过夜后10000g离心10min，倾去上清液，沉淀物用15ml0.01M pH7.4PBS溶解，待搅拌溶解后装入一只容量约50ml的透析袋中，再用适量的0.01MpH7.4PBS洗涤离心管两次，洗涤液也倒入透析袋中，使袋中溶液体积为32ml。对0.01M pH7.4PBS进行，共透析三次，每次用液1升，共透析24小时。透析结束后，将透析液倒入50ml离心管中，用10ml0.01M pH7.4PBS洗脱透析袋，洗涤液也倒入离心管中，10000g离心10min，小心倾出上清液于另一50ml离心管，加0.01M pH7.4PBS以补足溶液量为50ml。上样至DEAE-Sephrose FF柱中，进行第二次层析。血凝酶出现在0.06MNaCl洗脱液的最后一个峰中，收集该峰洗脱液得364ml。聚丙烯酰胺凝胶电泳检查为一条带，说明已经得到纯化。该收集液在搅拌条件下逐步添加202克固体硫酸铵粉末，使蛋白沉淀下来，过夜后10000g离心10min收集沉淀蛋白用15ml0.01MpH7.4PBS溶解后转移至一支50ml离心管中，10000g离心10min后，上清液小心地吸出装入一只容量约为30ml的透析袋中，对蒸馏水进行透析，共透析3次，每次1.5升。透析后测定酶活性为1190u/mg蛋白，收获蛋白33.4mg。最终收率0.33％。HPLC分析纯度97.8％，SDS-PAGE(非还原)为一条带，还原SDS-PAGE(还原)为两条带，其分子量大致为16KD和14KD。
实施例3蛇毒血凝酶的纯化
取10克尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批号：20061102广西蛇毒研究所)，按上述工艺进行第一次DEAE-Sephrose FF层析，经电泳分析目的物出现在0.06MNaCl的洗脱液的前3瓶中，合并此3瓶洗脱液，共得622ml，在搅拌条件下往此溶液中逐步添加349克固体硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度达到80％以沉淀目的蛋白。沉淀静置过夜后10000g离心10min，倾去上清液，沉淀物用15ml 0.01M pH7.4PBS溶解，待搅拌溶解后装入一只容量约50ml的透析袋中，再用适量的0.01MpH7.4PBS洗涤离心管两次，洗涤液也倒入透析袋中，使袋中溶液体积约为30ml。对0.01M pH7.4PBS进行，共透析三次，每次用液1升，共透析24小时。透析结束后，将透析液倒入50ml离心管中，用10ml0.01M pH7.4PBS洗脱透析袋，洗涤液也倒入离心管中，10000g离心10min，小心倾出上清液于另一50ml离心管，加0.01M pH7.4PBS以补足溶液量为50ml。上样至DEAE-Sephrose FF柱中，进行第二次层析。血凝酶出现在0.06MNaCl洗脱液的最后一个峰中，收集该峰洗脱液得354ml。聚丙烯酰胺凝胶电泳检查为一条带，说明已经得到纯化。该收集液在搅拌条件下逐步添加211.5克固体硫酸铵粉末，使蛋白沉淀下来，过夜后10000g离心10min收集沉淀蛋白用15ml 0.01MpH7.4PBS溶解后转移至一支50ml离心管中，10000g离心10min后，上清液小心地吸出装入一只容量约为30ml的透析袋中，对蒸馏水进行透析，共透析3次，每次1.5升。透析后测定酶活性为803u/mg蛋白，收获蛋白49.9mg。最终收率0.50％。HPLC纯度96.8％，SDS-PAGE(非还原)为一条带，还原SDS-PAGE(还原)为两条带，其分子量大致为16KD和14KD。
实施例4蛇毒血凝酶的纯化
1、装柱：在一根7cm×30cm的柱中装入柱床体积约为1000mlDEAE-Sephrose FF(DEAE Sepharose Fast Flow column，GEHealthcare公司)柱料，并用15升0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)进行充分平衡。
2、称取50克尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批号20061102，广西蛇毒研究所)用1000ml预冷的0.01M pH7.4PBS于4-8℃的层析柜中搅拌溶解30分钟，4℃8000g离心10分钟，将离心上清液倾入一个3000ml烧杯中，采用Millipore Pellicon 2切向流超滤器(0.1M2 cut off 5k膜)超滤浓缩至500ml，再加入1500ml 0.01M pH7.4的PBS，再超滤至500ml。该超滤浓缩过程循环3次。
3、向500ml超滤浓缩液中加入500ml 0.01M pH7.4的PBS，按30ml/min流速上样到DEAE-Sephrose FF柱。
4、上样后，按以下方法进行洗脱，洗脱速度50ml/min：
a.用12升0.01M pH7.4PBS淋洗柱子
b.用5升0.01M pH7.4PBS内含0.02M NaCl的溶液洗脱；
c.用5升0.01M pH7.4PBS内含0.06M NaCl的溶液洗脱；
d.用10升0.01M pH7.4PBS内含1M NaCl的溶液洗脱，以除去强吸附蛋白；
e.用20升0.01M pH7.4PBS平衡层析柱，备用。
5、收集的目的蛋白出现在0.06M NaCl溶液洗脱液中，洗脱峰共收集2620ml。
6、将收集液超滤浓缩至500ml。
7、向500ml超滤浓缩液中加入1500ml 0.01M pH7.4的PBS，再超滤至500ml。该超滤浓缩过程循环3次。
8、向500ml超滤浓缩液中加入500ml 0.01M pH7.4的PBS，按30ml/min流速上样至DEAE-Sephrose FF柱。
9、上样后，按以下方法进行洗脱，洗脱速度为50ml/min：
a.用5升0.01M pH7.4PBS淋洗柱子；
b.用5升0.01M pH7.4PBS内含0.02M NaCl的溶液洗脱；
c.用5升0.01M pH7.4PBS内含0.04M NaC的溶液洗脱；
d.用5升0.01M pH7.4PBS内含0.06M NaCl的溶液洗脱；
e.用10升1M pH7.4PBS内含1M NaCl的溶液洗脱，以除去强吸附蛋白；
f.用20升0.01M pH7.4PBS平衡层析柱，备用。
10、目的蛋白出现在0.06M NaCl洗脱液中，按紫外检测收集各峰，最后一峰有很好的分离度，该洗脱峰共收集1530ml。
11、将1530ml收集液进行15倍超滤浓缩。再加入1000ml预冷的无离子水继续进行10倍超滤浓缩。该稀释、超滤浓缩过程循环3次。测量最终超滤浓缩液体积为110ml，测定蛋白浓度为2.2mg/ml。共收获蛋白242mg。
12、用Millipore Viresolve NFP Filters OptiScale-25病毒膜过滤，分装西林瓶，冷冻干燥。
13、冻干粉经聚丙烯酰胺凝胶电泳检查为一条带，HPLC纯度达97.2％。比活为812u/mg蛋白。收获总酶活185，586单位(蛋白228.5mg)。最终收率0.46％。SDS-PAGE(非还原)为一条带，还原SDS-PAGE(还原)为两条带，其分子量大致为16KD和14KD。
实施例5尖吻蝮蛇血凝酶的丝氨酸蛋白属性实验
将实施例3中分离的血凝酶(纯度96.8％)再经HPLC纯化制备，获得蛋白纯度为100％的尖吻蝮蛇血凝酶溶液，酶活性为14U/ml。
用生理盐水配制1％的牛纤维蛋白原(Sigma公司)溶液。
用异丙醇溶解苯甲基磺酰氟(PMSF，Merck公司产品)，溶液浓度为4mg/ml。。
实验操作步骤如下：
(1)取2ml 1％牛纤维蛋白原溶液，37℃下恒温5分钟。
(2)取三支小试管，分别标注1#、2#、3#，每管加入200μl经蒸馏水稀释一倍的血凝酶溶液(7U/ml)。
(3)分别向1#试管加入10μl蒸馏水，2#试管加入10μl异丙醇，3#试管加入10μl PMSF，于37℃水浴保温5分钟。
(4)按试管编号顺序分别单独进行凝集试验观察。向试管中加入恒温好的1％牛纤维蛋白原溶液200ul，立即计时，同时轻轻摇动混匀，于37℃水浴中静置，观察试管中凝集反应的情况。以溶液呈现完全凝固状态时终止计时。
结果见表一
                   表一、PMSF对凝集时间的影响
  试管号  1％纤维蛋白原溶液   血凝酶溶液7u/ml   凝集时间
  1#   200μl   200μl   10μl蒸馏水   50秒
  2#   200μl   200μl   10μl异丙醇   50秒
  3#   200μl   200μl   10μl PMSF   大于600秒
根据表一中的实验结果，得出以下结论：①100ppm浓度的PMSF完全抑制了该血凝酶活性，证明尖吻蝮蛇血凝酶为丝氨酸蛋白酶。②微量异丙醇对本凝集反应无影响。
实施例6尖吻蝮蛇血凝酶水解人纤维蛋白原实验
用50mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液配制4mg/ml的人纤维蛋白原溶液。分别向5支小试管中各加入0.5ml人纤维蛋白原溶液，分别按4个不同水解保温时间顺序间隔向其中4管中加入经提取纯化的1个活性单位的血凝酶。37℃水浴保温4、2、1和0.5小时，保温后立即进行SDS-PAGE电泳，观察人纤维蛋白原的水解程度。另一支0.5ml纤维蛋白原对照管同时于37℃水浴保温4小时。
如图1结果所示：未经血凝酶水解的纤维蛋白原对照的电泳图呈现出三条带，图中F列从上至下分别为α、β、γ亚基。纤维蛋白原在血凝酶(1单位)作用0.5小时和1小时后，α亚基带逐渐变浅，作用于2小时和4小时后，α亚基带完全消失。该结果证实血凝酶有水解纤维蛋白原α亚基的作用。
                              序列表
<110>康辰医药股份有限公司
<120>尖吻蝮蛇蛇毒血凝酶
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>129
<212>PRT
<213>Agkistrodon acutus
<400>1
Asp Cys Ser Ser Gly Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr Lys
1               5                   10                  15
Val Phe Lys Gln Ser Lys Thr Trp Ala Asp Ala Glu Ser Phe Cys
                20                  25                  30
Thr Lys Gln Val Asn Gly Gly His Leu Val Ser Leu Glu Ser Ser
                35                  40                  45
Gly Glu Ala Asp Phe Val Gly Gln Leu Leu Ala Gln Lys Leu Lys
                50                  55                  60
Ser Ala Lys Leu His Val Trp Leu Gly Leu Arg Ala Gln Asn Lys
                65                  70                  75
Glu Lys Gln Cys Ser Leu Gln Trp Ser Asp Gly Ser Ser Leu Ser
                80                  85                  90
Tyr Glu Asn Trp Leu Glu Glu Glu Ser Lys Lys Cys Leu Gly Val
                95                  100                 105
His Leu Glu Thr Gly Phe His Lys Trp Glu Asn Phe Tyr Cys Glu
                110                 115                 120
Gln Gln Asp Pro Phe Val Cys Glu Ala
                125
<210>2
<211>123
<212>PRT
<213>Agkistrodon acutus
<400>2
Asp Cys Pro Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr Lys
1               5                   10                  15
Pro Phe Asn Glu Pro Lys Asn Trp Ala Asp Ala Glu Asn Phe Cys
                20                  25                  30
Thr Lys Gln His Thr Gly Gly His Leu Val Ser Phe Gln Ser Thr
                35                  40                  45
Glu Glu Ala Asp Phe Val Val Lys Leu Ala Phe Gln Thr Phe Asp
                50                  55                  60
Tyr Gly Leu Phe Trp Phe Gly Leu Ser Lys Leu Trp Asn Gln Cys
                65                  70                  75
Asn Trp Gln Trp Ser Asn Ala Ala Met Leu Lys Tyr Thr Asp Trp
                80                  85                  90
Ala Glu Glu Ser Tyr Cys Val Tyr Phe Lys Ser Thr Asn Asn Lys
                95                  100                 105
Trp Arg Ser Leu Thr Cys Arg Met Leu Ala Asn Phe Val Cys Glu
               110                  115                 120
Phe Gln Ala

Claims (9)

1、尖吻蝮蛇蛇毒血凝酶，其由α、β两个亚基构成，亚基链间由二硫键连接，其中α亚基具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，β亚基具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
2、如权利要求1所述的蛇毒血凝酶，其特征在于该酶是一种丝氨酸蛋白酶，能够水解人纤维蛋白原α链。
3、含有权利要求1或2所述蛇毒血凝酶的药物。
4、如权利要求3所述的药物，其为冻干粉。
5、权利要求1或2所述血凝酶的纯化方法，其包括如下步骤：
1)、蛇毒预处理；
2)、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE-Sephrose FF层析柱，用0.01M pH7.4PBS洗柱，再用含0～1M NaCl的0.01M pH7.4PBS分步洗脱，收集0.06M NaCl溶液的洗脱液；
3)、将上述洗脱液适当浓缩后透析去除NaCl；
4)、将透析后的溶液再次上经预平衡的DEAE-Sephrose FF层析柱，用0.01M pH7.4PBS洗柱，再用含0～1M NaCl的0.01M pH7.4PBS分步洗脱，收集0.06M NaCl溶液洗脱液的最后洗脱峰；
5)、将上述洗脱液适当浓缩后透析去除NaCl。
6、如权利要求5所述的方法，其中，步骤1)蛇毒预处理的方法是将蛇毒用适量预冷的0.01M pH7.4PBS溶解，离心取上清液进行透析或超滤。
7、如权利要求6所述的方法，其特征在于其中步骤1)蛇毒预处理的方法是：称取蛇毒若干克，用蛇毒重量20倍体积预冷的0.01MpH7.4PBS于4-8℃的层析柜中搅拌溶解30分钟，于4℃、10000g离心10分钟，将离心上清液倾入透析袋中，离心沉淀用PBS搅拌悬浮，再次离心，合并两次离心上清液于透析袋中，在层析柜中对0.01MpH7.4PBS透析24小时，中间换液3次；或将蛇毒溶解后用分子截留量为5000D的超滤膜进行超滤。
8、如权利要求5所述的方法，其中，步骤2)和步骤4)采用0.01M pH7.4PBS预平衡DEAE-Sephrose FF层析柱，然后上样。
9、如权利要求5～8任一项所述的方法，其特征在于其中步骤2)和步骤4)在搅拌条件下向洗脱液中逐步添加粉末固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到80％，4℃、10,000g离心10分钟，收集沉淀蛋白，沉淀蛋白用适量的0.01M pH7.4PBS溶解，装入一透析袋中，对0.01MpH7.4PBS进行透析，共透析24小时，期间换液三次；或采用分子截留量为5000D的超滤膜将洗脱液经反复稀释超滤除盐以浓缩蛋白。
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