CN102021160A

CN102021160A - 一种蛇毒丝氨酸蛋白酶、其编码基因及应用

Info

Publication number: CN102021160A
Application number: CN 201010542434
Authority: CN
Inventors: 许文涛; 罗云波; 马骉; 黄昆仑; 张雅楠; 宋梦薇; 商颖
Original assignee: BEIJING SAISHENG PHARMACEUTICAL Co Ltd; China Agricultural University
Current assignee: Beijing Science Sun Pharmaceutical Co., Ltd.; China Agricultural University
Priority date: 2010-11-11
Filing date: 2010-11-11
Publication date: 2011-04-20
Anticipated expiration: 2030-11-11
Also published as: CN102021160B

Abstract

本发明提供一种从蛇毒中分离得到的丝氨酸蛋白酶，测得该酶N端15个氨基酸的序列(VIGGDECNINEHRSL)，据此设计上游引物；然后根据与其它蛇毒丝氨酸蛋白酶3’端非编码区同源性较高区域设计下游引物。从蛇毒毒腺中提取总RNA，通过PCR扩增出该丝氨酸蛋白酶的基因，克隆后经全序列测定表明该成熟蛋白的cDNA为702bp。本发明提供的江浙蝮蛇蛇毒中的丝氨酸蛋白酶与其粗毒相比，具有很高的活力，克隆得到该丝氨酸蛋白酶基因并测定其基因序列，为开发研制基因工程产品创造了良好的条件。

Description

一种蛇毒丝氨酸蛋白酶、其编码基因及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛇毒丝氨酸蛋白酶、其编码基因及应用。

背景技术

丝氨酸蛋白酶(serineproteases)是一类蛋白水解酶，在蛇毒蛋白酶中占据着独特的位置，特别是蛙亚科和蝮亚科。其活性中心有His(Arg)-Asp-Ser三联体残基结构，因而得名。其活性可被丝氨酸修饰剂苯甲基磺酰氟(PMSF)或者二异丙基氟磷酸(DFP)抑制。另外，其氨基酸质序列与胰蛋白酶、激肽释放酶有较大同源性，均具有一个共同活性中心和相同的酶催化机制。蛇毒丝氨酸蛋白酶具有高度的序列相似性(6％-75％)，相同的活性中心构造和酶催化机制，但底物专一性却具较大的分化，这是由于活性中心外可变区序列的差异造成的，因而进一步体现为生物学和药理学功能的差异。根据其所具有的活性，蛇毒丝氨酸蛋白酶大致可以分为三类。第一类为类凝血酶：具有催化血纤蛋白原降解为血纤蛋白的活性；第二类是类激肽释放酶：有几种蛇毒丝氨酸蛋白酶具有裂解激肽原释放舒缓激肽的活性，其功能相当于哺乳动物的激肽释放酶或激肽原酶，因此被称为“类激肽释放酶”；第三类是有独特活性的蛇毒丝氨酸蛋白酶：包括激活C蛋白、血小板、凝血因子V以及纤溶酶原等。

综合以上这些特性使丝氨酸蛋白成为蛋白酶结构与功能研究的优良模型，并在临床医学诊断及心血管疾病治疗中得到广泛应用，丝氨酸蛋白不仅具广阔的药物开发前景，更是药理研究的优良工具。由于许多蛇毒丝氨酸蛋白酶的功能与凝血、溶血栓相关，有可能开发出治疗脑血栓和各种心血管疾病的药物，因此有关蛇毒丝氨酸蛋白酶研究也是国内外目前研究的热点领域之一。至今有相当一部分蛇毒丝氨酸蛋白酶已获得一级结构序列。随着分子生物学技术的发展，越来越多的蛇毒丝氨酸蛋白酶的基因得到了分离、鉴定和表达，并且一些已经达到了商品化。

发明内容

本发明的目的是提供一种蛇毒中的丝氨酸蛋白酶、其编码基因及应用。

本发明从江浙蝮蛇(Agkistrodon halys pallas)蛇毒中获得一种丝氨酸蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。全长233aa，理论分子量为25.495KD。实验表明该蛋白酶具有较高的精氨酸酯酶活性，具有抗血液凝结的活性。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，例如在非活性位点，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到由该蛋白衍生的蛋白。这些衍生的蛋白也属于本发明的范围。

本发明还包括编码前述丝氨酸蛋白酶的基因。优选地，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。此外，应当理解，与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有较高同源性的核苷酸序列也能编码具有与上述丝氨酸蛋白酶具有同等活性的蛋白。例如，同源性在80％以上的核苷酸序列。因此，本发明基因还包括与SEQ ID No.1所示核苷酸序列同源性在80％以上的编码具有上述丝氨酸蛋白酶活性的核苷酸序列。

具体地，本发明的目的可采用以下技术措施进一步实现：

1、江浙蝮蛇中丝氨酸蛋白酶的分离纯化

取江浙蝮蛇蛇毒冻干粉(来源于辽宁省清源县)，用Tris-HCl缓冲液溶解，离心取上清透析后，过DEAE-Sepharose阴离子交换柱，得到活性洗脱液；取少量的活性洗脱液制作免疫亲和层析柱，将经过阴离子交换层析后的活性组分通过该亲和柱，即亲和色谱法纯化，得到的活性组分，进一步经过高效液相色谱HPLC检测，最终得到高纯度的丝氨酸蛋白酶。

2、总RNA提取

切下江浙蝮蛇的蛇头，立即取出毒腺，与液氮中速冻，置于-70℃备用，采用酸性硫氰酸胍-酚-氯仿一步法(参阅Chomczynski P.等，Analytical Biochemistry.1987，162：156)抽提毒腺总RNA。

3、引物设计、合成的方法

根据测定的丝氨酸蛋白酶成熟蛋白N端的氨基酸序列(VIGGDECNINEHRSL)，设计了上游寡核苷酸引物，即5’-GTCATTGGAGGTGATGAATGTAACATA-3’；根据其它蛇种丝氨酸蛋白酶氨基酸序列上的同源性(Serrano，M.T.S.，Hagiwara，Y.，Murayama，N.等，1998.Purification and characterization of a kinin-releasing and fibrinogen-clotting serine proteinase(KN-BJ)from the venom of Bothrops jararaca，and molecular cloning and sequence analysis of its cDNA.Eur.J.Biochem.251，845-853.)在3’端的保守区段设计了下游寡核苷酸引物，即5’-TCACGGGGGGCATGTCA-3’。

4、反转录、PCR扩增和基因克隆

以江浙蝮蛇毒腺总RNA为模板，以5’-TCACGGGGGGCATGTCA-3’为引物进行反转录，以得到的cDNA为模板，用上、下游引物进行PCR扩增，产物大小约700bp。回收PCR产物，将回收的PCR产物插入pGEM-T easy载体，并转入DH 5α大肠感受态细胞，经蓝白斑筛选和酶切鉴定，获得10个阳性克隆。对阳性克隆进行DNA测序，得到本发明的江浙蝮蛇蛇毒中的丝氨酸蛋白酶编码基因的DNA序列，其序列如SEQ ID No.1所示，共702bp。使用DNAMAN软件，根据这个蛇毒丝氨酸蛋白酶编码基因的DNA序列，得出该蛇毒丝氨酸蛋白酶的蛋白质的一级结构(氨基酸序列如SEQID No.2所示，共233aa)。

实验表明，本发明丝氨酸蛋白酶具有较高的精氨酸酯酶活性，可以用于制备各种抗血栓药物。进而，本发明还提上述丝氨酸蛋白酶、其编码基因在制备抗血栓药物中的应用，尤其是脑血栓及心血管血栓，以及在制备治疗血栓引起的疾病的药物中的应用。

本发明的优点在于：由于蛇毒资源有限，其丝氨酸蛋白酶的活力及疗效远优于其他来源的丝氨酸蛋白酶，本发明克隆得到丝氨酸蛋白酶基因并测定其基因序列，为开发研制基因工程产品创造了良好的条件。

附图说明

图1为本发明丝氨酸蛋白酶cDNA的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。1：PCR产物；2：阴性对照；3：DL 2000Marker。

图2为本发明丝氨酸蛋白酶纯化谱峰，A：DEAE-Sepharose离子交换色谱；B：亲和色谱；C：高效液相(HPLC)色谱。

图3为本发明去糖基化修饰后丝氨酸蛋白酶的SDS-PAGE电泳图。1：去糖基化修饰后的丝氨酸蛋白酶；2：蛋白Marker。

图4为本发明MALDI-TOF-MS测得的丝氨酸蛋白酶分子量谱图，峰值为13125.4的峰为溶剂峰，峰值为26244.5的峰为目标蛋白峰。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1江浙蝮蛇蛇毒中的丝氨酸蛋白酶的编码基因的获得

1、总RNA提取

切下江浙蝮蛇的蛇头，立即取出毒腺，于液氮中速冻，置于-70℃备用。取出100mg毒腺组织，加1ml溶液D(含4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，pH7.0；5％十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)，0.1M β-巯基乙醇)，在组织匀浆器中充分匀浆后，将匀浆液转入10ml离心管中，再加入0.1ml 2M的乙酸钠(pH4)，1ml的水饱和酚和0.2ml的氯仿∶异戊醇(49∶1)混合物，充分振荡混匀后，在冰上静置15min。样品在日立冷冻离心机(Hitach Centrifuge 20PR-52D)以10000g于4℃离心20min，吸取上层水相，与等体积异丙醇混匀，置-20℃冷冻至少1小时。以10000g离心20min收集沉淀并溶于0.3ml溶液D，加入0.03ml 2M乙酸钠和0.3ml异丙醇，混匀，置于-20℃冷冻1小时。以10000g离心20min收集沉淀再溶于0.3ml焦炭酸二乙酯(DEPC)处理过的H₂O，再加入0.03ml乙酸钠和0.75ml乙醇，混匀，置于-20℃冷冻1小时，以10000g离心20min收集沉淀，用75％洗涤RNA沉淀，自然干燥后将RNA溶于DEPC处理过的水中，分装，置于-70℃备用。

2、引物设计、合成的方法

本发明根据测定的丝氨酸蛋白酶成熟蛋白N端的氨基酸序列，即VIGGDECNINEHRSL，设计上游寡核苷酸引物为：5’-GTCATTGGAGGTGATGAATGTAACATA-3’；根据其它蛇种丝氨酸蛋白酶氨基酸序列上的同源性(Serrano，M.T.S.，Hagiwara，Y.，Murayama，N.等，1998.Purification and characterization of a kinin-releasing and fibrinogen-clotting serine proteinase(KN-BJ)from the venom of Bothrops jararaca，and molecular cloning and sequence analysis of its cDNA.Eur.J.Biochem.251，845-853.)在3’端的保守区段设计了下游寡核苷酸引物，即5’-TCACGGGGGGCATGTCA-3’。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

3、反转录、PCR扩增和基因克隆

以江浙蝮蛇毒腺总RNA为模板，5’-TCACGGGGGGCATGTCA-3’为引物进行反转录。反转录试剂盒购自天根生物科技有限公司，操作按其说明书进行。

以得到的cDNA为模板，用上、下游引物进行PCR扩增。反应的总体积为30μl，其中10×PCR缓冲液3μl，dNTP的终浓度为0.2m M，Taq DNA聚合酶0.3μl(购自Takara公司)。反应条件为：95℃变性5min；95℃变性30s，59℃退火40s，72℃延伸30s，进行40个循环；最后72℃保温10min。取8μl反应产物经1％琼脂糖电泳检测。PCR扩增出一条700bp左右的DNA片段，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳见图1。产物用天根生化科技有限公司的胶回收试剂盒进行胶回收。

将回收的PCR产物插入pGEM-T easy载体(质粒载体购自Promega公司)，连接体系10μl，其中PCR产物1μl，pGEM-T easy载体0.5μl，T4连接酶1μl，2×连接缓冲液5μl，dd H₂O 2.5μl，4℃过夜。将连接产物转入DH 5α大肠感受态细胞，经蓝白斑筛选和酶切鉴定，获得10个阳性克隆。对阳性克隆进行DNA测序，得到本发明的江浙蝮蛇蛇毒中的丝氨酸蛋白酶编码基因的DNA序列。使用DNAMAN软件，该蛇毒丝氨酸蛋白酶编码基因的DNA序列，得出该蛇毒丝氨酸蛋白酶的一级结构(氨基酸序列)。

实施例2江浙蝮蛇蛇毒中的丝氨酸蛋白酶的分离纯化及其生物活性测定

1.丝氨酸蛋白的分离纯化

(1)DEAE-Sepharose离子交换色谱：称取来源于辽宁省清源县的江浙蝮蛇蛇毒冻干粉15g，用0.02mol/L pH7.8的Tris-HCl缓冲液溶解，以4000r/min离心20min，取上清，透析12h后，以6.0mL/min的流速上阴离子交换柱(DEAE-Sepharose)，上样完毕后以0.02mol/LpH7.8的Tris-HCl缓冲液洗去未吸附的杂蛋白。

(2)亲和色谱法：①免疫抗体亲和层析柱的制备：取上述离子交换色谱活性洗脱液，用高效液相色谱法纯化，色谱条件为：TSK2000凝胶层析柱，0.1mol/L pH7.8磷酸盐为流动相，检测波长为280nm，流速1.0ml/min，进样量20μl。经定性得到蛇毒丝氨酸蛋白酶。

取该蛇毒丝氨酸蛋白酶50g与等量的完全佐剂(制备方法：将弗氏完全佐剂10ml，羊毛脂1份，石蜡油5份，卡介苗10mg～200mg混合后100℃10min灭活处理，即得)混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2mL，每周1次，共免疫6次。在采集血清前3d取0.2mL刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。用抗原亲和层析柱纯化抗体。用溴化氰活化4B-Sepharose琼脂糖凝胶，把得到的蛇毒激肽原酶抗体偶联到多糖基质上，从而制成免疫亲和层析柱。②亲和色谱法纯化蛇毒激肽原酶：将经离子交换纯化的酶用平衡液透析，上抗体亲和层析柱。用亲和层析洗脱液(0.02mol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.2，含0.5mol/L NaCl，70g/LArg溶液)洗脱。收集洗脱峰，冷冻干燥保存。

(3)纯度检测：取主峰组分适当稀释，用高效液相色谱(HPLC)法检测。色谱条件：TSK-2000SW凝胶柱，280nlTl检测，流速1.0ml/min，0.5mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)为流动相，进样量20μl。最终得到高纯度的丝氨酸蛋白酶。(见图2)

2.精氨酸酯酶活性的定量测定：

以BAEE为底物测定。测定方法：在253nm波长处，以底物溶液为空白，准确读取1分钟的吸光度A1和3分钟的吸光度A3，ΔA值(ΔA＝A3-A1)的平均值代入下式计算：

结果：与粗毒(样品溶液)相比，提纯高的丝氨酸蛋白酶比活提高了约300倍，回收率可达60％以上，水解BAEE的比活可达到800单位/mg以上(表1)。

表1各提取过程中蛇毒类丝氨酸蛋白酶的水解BAEE比活变化

实施例3江浙蝮蛇蛇毒中的丝氨酸蛋白酶的氨基酸组成测定

于试管中加入0.5g由上述层析法制得的丝氨酸蛋白酶样品，加1ml 6mol/L HCl及一滴巯基乙醇，减压封管。在105-110℃烘箱中水解24小时，打开封管，抽出HCl气体，在氨基酸自动分析仪L-8500上测定氨基酸组成。

该蛇毒丝氨酸蛋白酶的氨基酸组成，与具有同源性的其他蛋白的对比情况如表2所示。由本发明得到的蛇毒丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列，其氨基酸组成与测定值一致。

表2丝氨酸蛋白酶与具有同源性的其他蛋白的氨基酸组成比较

实施例4江浙蝮蛇蛇毒中的丝氨酸蛋白酶的分子量测定

去除蛋白的糖基化修饰后，该蛋白的分子量由SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS测定的分子量为26.2445KD，与本发明中蛋白质序列计算得到的分子量25.495KD基本符合，如图3和图4所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种蛇毒丝氨酸蛋白酶，其为：1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列构成的蛋白；或

2)SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由1)衍生的蛋白。

2.编码权利要求1所述丝氨酸蛋白酶的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列同源性在80％以上的核苷酸序列。

4.扩增权利要求3所述基因的引物，该引物的序列为：

上游引物：5’-GTCATTGGAGGTGATGAATGTAACATA-3’

下游引物：5’-TCACGGGGGGCATGTCA-3’。

5.权利要求1所述的丝氨酸蛋白酶、权利要求2和3所述基因在制备抗血栓药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗血栓药物为抗脑血栓药物或心血管血栓药物。

7.权利要求1所述的丝氨酸蛋白酶、权利要求2和3所述基因在制备治疗血栓引起的疾病的药物中的应用。

8.含有权利要求1所述丝氨酸蛋白酶的抗血栓药物。