CN113416724B - 一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用 - Google Patents

一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113416724B
CN113416724B CN202110708872.3A CN202110708872A CN113416724B CN 113416724 B CN113416724 B CN 113416724B CN 202110708872 A CN202110708872 A CN 202110708872A CN 113416724 B CN113416724 B CN 113416724B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tpa
hsa
fbp
recombinant protein
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110708872.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113416724A (zh
Inventor
黄明东
许燕艳
袁彩
徐芃
江龙光
陈丹
陈珊莉
蒋大林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fuzhou University
Original Assignee
Fuzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuzhou University filed Critical Fuzhou University
Priority to CN202110708872.3A priority Critical patent/CN113416724B/zh
Publication of CN113416724A publication Critical patent/CN113416724A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113416724B publication Critical patent/CN113416724B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21068—Tissue plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Abstract

本发明提供一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用，该重组蛋白在组织型纤溶酶原激活剂的催化结构域高活性突变体tPA146Y羧基端融合人血清白蛋白HSA和纤维蛋白靶向肽FBP。本发明重组蛋白，具有显著纤维蛋白靶向性，能抵抗其内源性抑制剂PAI‑1抑制和增强纤溶酶原激活的能力，可作为血栓性疾病药物，用于治疗包括急性心肌梗塞、急性肺栓塞、脑卒中、及静脉血栓在内的多种疾病。

Description

一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用。
背景技术
随着社会经济的发展，大众生活水平显著提高，健康问题也随之而来，根据世界卫生组织（WHO）最新发布的有关全球疾病状况的最新评估报告《2020世界卫生统计报告》（World Health Statistics 2020）显示，目前心血管疾病已经成为全球四大致死疾病之一，尤其是血栓栓塞性疾病。血栓形成已然成为全世界人类残疾和死亡的主要原因，全球接近四分之一的人死于血栓栓塞性疾病，包括中风、急性心肌梗死（AMI）、肺栓塞和动脉粥样硬化等。由此可见血栓栓塞性疾病已经成为了影响全人类健康和幸福的最大威胁。
溶栓药物被广泛应用，是治疗血栓类疾病的重要手段。根据国内外的急性缺血性脑卒中治疗指南推荐，临床上的一线溶栓药物为阿替普酶。阿替普酶是体内生理性激活剂组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，tPA）的重组蛋白（recombinant tPA, rtPA）。
tPA作为体内纤溶系统主要组成成分，与血栓基质纤维蛋白具有较强的特异性亲和力，能在血栓局部有效的激活纤溶酶原为纤溶酶而使血栓溶解。tPA的溶栓特性与其结构相关。体内初始合成的tPA是以单链形式存在，在纤溶酶存在下，单链tPA会被水解变成A链和B链，两条链由二硫键连接，A链含有① F 区（第 4~50 位氨基酸，与纤连蛋白的 Finger结构同源）；② E 区（第 51~87 位氨基酸，与表皮生长因子结构同源）；③ 2个K区（K1区，第88~176位氨基酸；K2 区，第 177~256 位氨基酸。K 区与纤溶酶原的 Kringle 结构同源）；④ 丝氨酸水解酶SPD 区（serine protease domain,第 276~527 位氨基酸，与其他丝氨酸蛋白酶的催化区同源），含活性位点 His322，Asp371 和 Ser478。通过设计合成 tPA变异体，发现tPA上述结构域与其功能有关，如 F 区和 K2 区与 tPA 结合到纤维蛋白有关，tPA在体内快速清除与 F 区或 E 区及糖侧链有关，tPA 酶活性与SPD 区有关。其中tPA序列Lys296-His-Arg-Arg299介导了 tPA 被其生理抑制剂 PAI-1 快速抑制失活。
虽然， rtPA是自1996年美国FDA批准用于治疗急性缺血性卒中的唯一药物，但其在临床上的应用仍然受到许多限制。第一，时间窗口小，rtPA需要在脑卒中发生的4.5个小时以内给药。第二，rtPA的使用会产生神经毒性和出血副作用，因为体内PAI-1的抑制以及对纤维蛋白的非特异性作用，往往会使病人在使用纤溶酶原激活剂时加大药物用量，进而引发出血并发症。为了解决tPA的临床使用限制问题，研究者在 tPA 分子结构修饰改造方面进行了大量工作，希望得到具有更强纤溶酶原激活能力、更高纤维蛋白特异性、对PAI-1具有更强耐受性和更低血浆清除率的变异体，以进一步提高 tPA 的溶栓性质。其中代表性突变体有瑞替普酶（reteplase）和替奈普酶（tenecteplase），分别为第二代和第三代重组tPA。这些突变体的改造主要是基于tPA的结构特征。
其中瑞替普酶是天然人 tPA 蛋白的非糖基化变异体，含有其 Kringle 2 区和SPD区（第1~3和176~527位氨基酸）。瑞替普酶生产成本低于阿替普酶，由于缺少与纤维蛋白结合有关的F结构域，其纤维蛋白特异性不如tPA，且与内皮细胞和肝细胞的亲和力也降低，故延长其在体内的半衰期。替奈普酶的分子结构在人天然tPA分子的基础上做了如下修改：将位于Kringle 1区的第103位苏氨酸和第117位天冬酰胺分别换成天冬酰胺和谷氨酰胺，将C端胰蛋白酶样蛋白水解区的第296~299位氨基酸换成4个丙氨酸。这种突变形成了一个新的糖基化位点（T103N）并去除一个原有的糖基化位点（N117Q），而四残基替代是为了逃避内源性抑制剂PAI-1的抑制作用。有实验表明替奈普酶比阿替普酶对纤维蛋白的特异性更高，对PAI-1耐受性更强，血浆清除率更低。
综上，临床上亟需开发溶栓效率高、纤维蛋白特异性高、半衰期长以及有效逃逸PAI-1抑制的新型溶栓剂，并能安全用于治疗急性缺血性脑卒中、急性心肌梗塞、肺栓塞等血栓栓塞性疾病。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用。该重组蛋白tPA146Y-HSA-FBP由tPA催化结构域高活性突变体（tPA146Y）与人血清白蛋白HSA以及纤维蛋白靶向肽（fibrin binding peptide，FBP）重组构成，该重组蛋白具更强的血栓靶向能力、抵抗内源性抑制剂（PAI-1）抑制能力和纤溶酶原激活能力。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白，以组织型纤溶酶原激活剂为基础，将人血清白蛋白以及纤维蛋白靶向肽在其羧基端融合，获得重组蛋白tPA146Y-HSA-FBP。
一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白tPA146Y-HSA-FBP，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
上述重组蛋白tPA146Y-HSA-FBP的制备方法：tPA催化结构域突变体（tPA146Y）与人血清白蛋白HSA以及纤维蛋白靶向肽（fibrin binding peptide，FBP）融合构成重组蛋白tPA146Y-HSA-FBP。
一种表达上述组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白的重组质粒，该重组质粒包含由tPA催化结构域突变体（tPA146Y）、人血清白蛋白HSA基因以及纤维蛋白靶向肽FBP基因组成的融合基因。
上述人血清白蛋白HSA基因的序列如SEQ ID NO.2所示；纤维蛋白靶向肽FBP基因由两条互补序列退火互补形成；所述两条互补序列为：
F4: 5’-GTGGAAGAGCCTCAGGGTGGTTTTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTTGGGAATGTCCATACGGTTTGTGTTGGATTCAA-3’;
R4:5’-TTGAATCCAACACAAACCGTATGGACATTCCCAAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCTGGCGCGCCGAC-3’。
的序列如SEQ ID NO.3所示。
一种表达上述组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白的重组质粒的构建方法：以LIC法将HSA基因片段连接至tPA146Y-pPICZαA质粒上，构建质粒tPA146Y-HSA-pPICZαA，然后将FBP基因片段连接至质粒tPA146Y-HSA-pPICZαA上，获得重组质粒tPA146Y-HSA-FBP-pPICZαA。
上述重组质粒的构建方法中，扩增HSA基因的引物为：
F1: 5’-GACGGTGGTGGTGGTGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’;
R1: 5’-ATGATGATGATGGTGTTGAATCCAACACAAACCGTATGGACATT-3’；
扩增tPA146Y-pPICZαA扩增引物为：
F2:5’-CACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGCCTTAGACATGAC-3’；
R2: 5’-ACCACCACCACCGTCGACAGAACCACCACCACCAGCAACTCTACC-3’；
扩增tPA146Y-HSA-pPICZαA扩增引物为：
F3: 5’-TCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAG-3’;
R3:5’- AGGCTACAAACTCAATGATGATGATGATGATGGTG-3’。
上述一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白tPA146Y-HSA-FBP与tPA146Y在PAI-1抵抗能力和纤溶酶原激活能力无明显差异，但具有更强纤维蛋白靶向性，在保持高抵抗内源性抑制剂PAI-1的能力和强激活纤溶酶原的能力同时，又增强了其血栓靶向性以及小鼠体内半衰期。
上述重组蛋白tPA146Y-HSA-FBP在增加组织型纤溶酶原激活剂体内半衰期或血栓靶向性的应用。
上述重组蛋白tPA146Y-HSA-FBP在增强组织型纤溶酶原激活剂对血栓靶向性的应用。
上述重组蛋白tPA146Y-HSA-FBP在制备血栓栓塞性疾病药物中的应用。
本发明的优点在于：
本发明在tPA催化结构域高活性突变体（tPA146Y）的C端融合白蛋白（HSA）和纤维蛋白靶向肽（fibrin binding peptide，FBP），提高其血栓溶解力、血栓靶向性以及延长体内半衰期。通过实施实验证明，本发明重组蛋白tPA146Y-HSA-FBP具有良好的纤维蛋白特异性、半衰期以及在体外溶栓效果。该重组蛋白能够应用于治疗血栓栓塞性疾病，包括急性心肌梗塞、急性肺栓塞、急性缺血性脑卒中等。
附图说明
图1：重组蛋白制备。A：tPA146Y-HSA-FBP-pPICZαA融合基因示意图；B：重组蛋白superdex 200 纯化和SDS-PAGE电泳图，其中1为marker，2为重组蛋白tPA146Y-HSA-FBP。
图2：tPA146Y-HSA-FBP及tPA146Y水解小分子发色底物活性测定。
图3：tPA146Y-HSA-FBP及tPA146Y激活大分子底物纤溶酶原活性测定。
图4：重组蛋白与纤维蛋白结合能力。A: tPA146Y-HSA-FBP与纤维蛋白结合能力的测定; B: tPA146Y-HSA与纤维蛋白结合能力的测定。
图5：重组蛋白体外溶栓评价。
图6：重组蛋白在小鼠体内半衰期测定。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明的方法和其优点作进一步说明，但这些实施例并不构成对本发明权利要求范围的限制。在不脱离本发明主要特征的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
实施例1 tPA146Y-HSA-FBP重组蛋白的构建、表达和纯化
基于实验室前期的研究成果（Peng S, Xue G, Chen S, et al. tPA PointMutation at Autolysis Loop Enhances Resistance to PAI-1 Inhibition andCatalytic Activity. Thromb Haemost, 2019, 119(1): 77-86.）——我们通过测定tPA与PAI-蛋白复合物的结构，解析了tPA被抑制的机理，结合利用计算生物学的方法构建的tPA 激活纤溶酶原的结构模型，筛选了一系列tPA的突变体，筛选出比tPA溶栓效率高5倍，还能有效逃逸PAI-1抑制的新型tPA突变体。本发明则是在此基础上在筛选到的tPA催化结构域突变体（tPA146Y）的C端融合人血清白蛋白（HSA）和纤维蛋白靶向肽FBP，以提高其纤维蛋白靶向性和延长其体内半衰期。
（a）LIC法构建重组质粒tPA146Y-HSA-pPICZαA
设计 LIC引物（F1: 5’-GACGGTGGTGGTGGTGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’;R1: 5’-ATGATGATGATGGTGTTGAATCCAACACAAACCGTATGGACATT-3’）从人肝细胞cDNA模板中PCR扩增出HSA基因片段（如SEQ ID NO.2所示），同时设计载体扩增引物（F2:5’-CACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGCCTTAGACATGAC-3’；R2: 5’-ACCACCACCACCGTCGACAGAACCACCACCACCAGCAACTCTACC-3’）将课题组已有tPA146Y-pPICZαA突变体质粒（即tPA催化结构域突变体（tPA146Y））载体（Mingdong Huang, Peng Shuangzhou, Cai Yuan,等. 一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用.2018）进行扩增。通过LIC的方法将HSA片段连入tPA146Y-pPICZαA突变体质粒载体中，构建质粒tPA146Y-HSA-pPICZαA。连接产物通过42℃热激发转化至大肠杆菌DH5α，涂平板，挑单克隆测序，将含有正确突变的菌液采用ZDNA质粒小抽试剂盒（OMEGA）抽提tPA146Y-HSA-pPICZαA质粒，备用。
以质粒tPA146Y-HSA-pPICZαA为模板，设计扩增引物（F3: 5’-TCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAG-3’;R3:5’-AGGCTACAAACTCAATGATGATGATGATGATGGTG-3’）,扩增质粒tPA146Y-HSA-pPICZαA。同时，通过上海生工公司合成两条互补序列，经退火互补后获得FBP基因片段；两条互补片段具体为：F4: 5’-GTGGAAGAGCCTCAGGGTGGTTTTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTTGGGAATG TCCATACGGTTTGTGTTGGATTCAA-3’;R4: 5’-TTGAATCCAACACAAACCGTATGGACATTCCCAAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCTGGCGCGCCGAC-3’。通过LIC的方法将FBP基因片段连入tPA146Y-HSA-pPICZαA质粒载体中，构建重组质粒tPA146Y-HSA-FBP-pPICZαA（图1）。
上述LIC法中，反应体系如下：
Figure 819036DEST_PATH_IMAGE001
LIC流程为：片段+载体+ExonucleaseⅢ buffer连入片段，冰浴10min → 加入ExonucleaseIII，冰浴1h→ 加入1 μl 0.5 mM EDTA后，65℃水浴10min。
重组质粒tPA146Y-HSA-FBP-pPICZαA在LB培养基中进行活化、扩大，采用EZNA质粒小抽试剂盒（OMEGA）抽提tPA146Y-HSA-FBP-pPICZαA质粒。对抽提的质粒进行线性化。线性化体系如下：
Figure 401196DEST_PATH_IMAGE002
37℃，过夜。乙醇沉淀回收。
将回收得到的线性化DNA片段电转到毕赤酵母X-33菌株。涂于YPDS（含终浓度100µg/ml Zeocin）平板，挑单菌落，小量表达进行验证。
（b）重组蛋白tPA146Y-HSA-FBP的表达和纯化
将小量表达成功的tPA146Y-HSA-FBP X-33菌株接种于YPD（含终浓度100 µg/mlZeocin），28℃培养至OD6002-6，以1：10（v/v）接种于BMGY培养基，28℃扩大培养1天，以1：4（v/v）接种于BMMY培养基进行诱导表达，继续培养3天，每天补加1 %（v/v）的甲醇。诱导第4天，收集发酵液，10000 rpm离心30 min，将上清液用孔径0.45 μm的滤膜抽滤。抽滤液流过已经用平衡液（30 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl）平衡好的Ni-NTA柱（GE公司，流速5ml/min, 柱体积25 ml），此时抽滤液中带有6个His标签的突变体蛋白就会结合在Ni-NTA柱上。再用五个柱体积的平衡液（30 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，50 mM 咪唑）对Ni-NTA柱继续冲洗去杂蛋白。最后，用洗脱液（30 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，300 mM咪唑）对蛋白进行洗脱，对收集的蛋白用透析液（30 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM 的NaCl）进行透析两次，每次透析至少进行2 h。透析后所得蛋白溶液用Millipore超滤管（30000Da）进行浓缩，然后离心20 min（20000 rpm，Hitachi Koki CR22N 高速冷冻离心机，R20A2转头）去除沉淀。所得的蛋白过Superdex 200 HR 10/300 column分离层析柱（Chicago,Illinois, United States）, 见图1-A。采用SDS-PAGE电泳对分离纯化的蛋白进行鉴定，纯化所得到的重组蛋白tPA146Y-HSA-FBP条带单一，具有100 kDa的分子量，见图1-B，测序的序列如SEQ ID NO.1所示。分析所得蛋白溶液用Millipore超滤管（30000 Da）进行浓缩，然后分装，-80℃保存备用。
实施例2 tPA146Y-HSA-FBP水解小分子发色底物活性测定
用小分子发色底物法（chromogenic assay）进行酶活性测定。其反应原理如下，在100 µL体积的反应体系中，加入一定浓度的tPA146Y-HSA-FBP。然后加入发光底物S-2288（Chromogenix），tPA146Y-HSA-FBP能特异识别其中的酶切位点并将其发色基团-p-硝基苯胺（pNA）切下来。通过酶标仪检测405 nm的吸光度值就可以测定tPA146Y-HSA-FBP的活性。
具体测定过程：
（a）材料
经上述实施例1获得的tPA146Y-HSA-FBP、tPA底物S-2288。
Buffer：30 mM Tris-HCl pH7.4，150 mM NaCl. 0.22 μm孔径滤膜过滤。
（b）步骤
用BCA蛋白定量试剂盒测定各蛋白质质量浓度，再换算成摩尔浓度。将实验室已有的蛋白tPA146Y、实施例1获得的tPA146Y-HSA-FBP稀释至500 nM，并配制1 mM浓度的S-2288。根据需要加入到100 μl反应体系中配制成实验所需的终浓度。均按照以下顺序加入样品：
85 μl buffer + 5 μl tPA146Y-HSA-FBP + 10 μl S-2288；
85 μl buffer + 5 μl tPA146Y + 10 μl S-2288；
在加入发色底物S-2288，并立即放入BioTek Synergy 4酶标仪中在405 nm处，30s/read进行检测30 min。每个测试至少重复3次。取平均值使用GraphPad Prism 5软件进行反应线性拟合。
酶活性测定结果（图2）显示， tPA146Y-HSA-FBP对发色底物S-2288的切割反应速度比tPA146Y高1.5倍，说明tPA146Y-HSA-FBP酶活性与tPA146Y相比，HSA及FBP的融合并没有在很大程度上影响tPA146Y本身的活性。
实施例3 tPA146Y-HSA-FBP激活天然底物纤溶酶原能力检测
用小分子发色底物法（chromogenic assay）测定tPA146Y-HSA-FBP激活天然底物纤溶酶原的能力。其反应原理如下，tPA146Y-HSA-FBP自身并不会酶切发色底物S2403，但其可激活纤溶酶原（Plasminogen, 简称PLG）生成纤溶酶（plasmin, 简称Pn），Pn能特异识别发色底物S2403的酶切位点并将其发色基团-p-硝基苯胺（pNA）切下来。在反应体系中，加入一定浓度的tPA146Y-HSA-FBP和纤溶酶原（Plasminogen, 简称PLG），然后加入Pn特异性的发色底物S2403，可通过检测405 nm的吸光度值反映重组蛋白激活纤溶酶原的能力。
具体测定过程：
（a） 材料
经上述实施例1获得的tPA146Y-HSA-FBP、实验室已有的蛋白tPA146Y及购买PLG、Pn底物S-2403。
Buffer：30 mM Tris-HCl pH7.4, 150 mM NaCl，0.22 μm孔径滤膜过滤。
（b） 步骤
用BCA蛋白定量试剂盒测定各蛋白质质量浓度，再换算成摩尔浓度。将tPA146Y和tPA146Y-HSA-FBP稀释至500 nM，并配制1.5 μM PLG和1 mM S-2403 （Chromogenix）。根据需要加入到100 μl反应体系中配制成实验所需的终浓度。均按照以下顺序加入样品：
75 μl buffer + 10 μl PLG + 5 μl tPA146Y + 10 μl S-2403；
75 μl buffer + 10 μl PLG + 5 μl tPA146Y-HSA-FB + 10 μl S-2403；
在加入发色底物S-2403后，酶标板立即放入BioTek Synergy 4酶标仪，在405 nm处，30 s/read连续检测30 min，每个测试至少重复3次。使用GraphPad Prism 5软件进行数据处理。
结果如图3所示，tPA146Y-HSA-FBP与tPA146Y相比，对PLG的激活能力几乎不受HSA以及FBP的影响。
实施例4 tPA146Y-HSA-FBP与纤维蛋白（Fibrin，Fn）结合能力测定
通过氨基偶联将10000 unit纤维蛋白原（Fibrinogen，Fg）包覆到羧基甲基葡聚糖包覆的生物传感器芯片（CM5）上。用5 U/mL凝血酶以2 μl/min的速度注入HBSC缓冲液（10mM HEPES, 140 mM NaCl, and 2.5 mM CaCl2 with 0.05% EP-20, pH 7.4）45 min。当响应信号RU（Response unit）值没有进一步降低时，说明纤维蛋白原（Fibrinogen，Fg）已完全转化为纤维蛋白（Fibrin，Fn）。注射1 M NaCl去除凝血酶。
注射tPA146Y-HSA-FBP 30 μl /min，2 min，监测解离2 min。用1 M NaCl（pH 7.4）以30 μl/min的速度再生表面30 s，然后用运行缓冲液（10 mM HEPES, 140 mM NaCl, and2.5 mM CaCl2 with 0.05% EP-20, 2.5 mM Benzamidine pH 7.4）重新平衡5 min。利用origin软件分析蛋白亲和和动力学数据（图4），通过非线性回归分析确定tPA146Y-HSA-FBPKd值为25±0.9 μM，而tPA146Y-HSA 与纤维蛋白（Fibrin，Fn）不结合，无法计算其Kd值。
实施例5 tPA146Y-HSA-FBP逃逸PAI-1抑制，溶解血块能力测定
用血块溶解实验方法（clot lysis assay）进行tPA146Y-HSA-FBP血栓溶解能力检测。由于Ca2+的加入会激活血液凝血反应，形成血栓，从而提高了反应体系的浑浊度，在405nm的吸光度值具有最大的变化。在100 µL体积的反应体系中，加入30%（v/v）人源血清与一定浓度的tPA146Y-HSA-FBP，再加入一定量的PAI-1反应10 min，然后加入Ca2+，最后通过酶标仪检测405 nm吸光度值的变化来评价tPA146Y-HSA-FBP的逃逸PAI-1抑制，溶解血栓的能力。
具体测定过程：
（a） 材料
经上述实施例1获得的tPA146Y-HSA-FBP、实验室已有的蛋白tPA146Y 和CaCl2溶液。
贫血小板血清（Platelet Poor Plasma，简称：PPP），来自健康的自愿者的血液。通过3500 rpm离心10 min 获得。
Buffer：30 mM Tris-HCl pH7.4, 150 mM NaCl. 0.22 μm孔径滤膜过滤。
（b） 步骤
用BCA蛋白定量试剂盒测定各蛋白质质量浓度。tPA146Y、tPA146Y-HSA-FBP分别稀释至浓度为1.5 μM，并配制1.5 μM PAI-1和100 mM CaCl2溶液。根据需要加入到100 μl反应体系中配制成实验所需的终浓度。均按照以下顺序加入样品：
50 μl buffer + 30 μl PPP + 10 μl PAI-1 + 10 μl CaCl2；
40 μl buffer + 30 μl PPP + 10 μl tPA146Y-HSA-FBP + 10 μl PAI-1 +1 0 μlCaCl2；
40 μl buffer + 30 μl PPP + 10 μl tPA146Y + 10 μl PAI-1 + 10 μl CaCl2；
其中tPA146Y、tPA146Y-HSA-FBP、PAI-1、 30%（v/v）PPP以及buffer充分混匀后室温孵育10 min。最后加入Ca2+，充分混匀后，放入BioTek Synergy 4酶标仪中在405 nm处，30 s/read进行检测60 min。每个测试至少重复3次，取平均值。数据处理采用GraphPad Prism 5软件。
结果如图5所示，tPA146Y-HSA-FBP比tPA146Y具有更强的逃逸PAI-1，溶解血栓的能力。20分钟后tPA146Y-HSA-FBP已将血块完全溶解，而tPA146Y 20 min 还未完全溶解血块,25min 后血块才完全溶解。
实施例6 tPA146Y-HSA-FBP小鼠体内半衰期的测定
将终浓度10µM的tPA146Y-HSA-FBP通过尾静脉注入小鼠体内，30 min后通过小鼠尾静脉采血，将小鼠血液加入到柠檬酸钠抗凝试管，离心5000 rpm, 10 min制作无血小板血浆（platelet-free plasma，PFP）。取50 µl PFP加入40 µl buffer，最后加入10 µl S-2288，通过测量tPA146Y-HSA-FBP残留活性（方法如上述实例2）推算血浆中tPA146Y-HSA-FBP含量。结果如图6，通过计算，tPA146Y的半衰期低于5 min，但tPA146Y-HSA-FBP的半衰期为144±5min，相比rtPA（5 min）延长了29倍，远远高于tPA146Y。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用
<130> 10
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 890
<212> PRT
<213> SEQ ID NO.1
<400> 1
Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala
1 5 10 15
Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys
20 25 30
Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys
35 40 45
Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg
50 55 60
Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu
65 70 75 80
Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp
85 90 95
Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu
100 105 110
Ser Ser Val Val Arg Thr Val Ala Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu
115 120 125
Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Tyr
130 135 140
Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Gln Arg Thr Val
165 170 175
Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln
180 185 190
Ser Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val
195 200 205
Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly
210 215 220
Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr
225 230 235 240
Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro Ala Ala Ala Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Val Asp Gly Gly Gly Gly Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
275 280 285
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
290 295 300
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
305 310 315 320
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
325 330 335
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
340 345 350
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
355 360 365
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
370 375 380
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
385 390 395 400
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
405 410 415
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
420 425 430
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
435 440 445
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
450 455 460
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
465 470 475 480
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
485 490 495
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
500 505 510
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
515 520 525
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
530 535 540
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
545 550 555 560
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
565 570 575
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
580 585 590
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
595 600 605
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
610 615 620
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
625 630 635 640
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
645 650 655
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
660 665 670
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
675 680 685
Val Ala Tyr Thr Gln Gln Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
690 695 700
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
705 710 715 720
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
725 730 735
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
740 745 750
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
755 760 765
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
770 775 780
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
785 790 795 800
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
805 810 815
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
820 825 830
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
835 840 845
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
850 855 860
Leu Val Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Trp
865 870 875 880
Glu Cys Pro Tyr Gly Leu Cys Trp Ile Gln
885 890
<210> 2
<211> 1155
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.2
<400> 2
gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60
gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120
aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180
aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240
cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300
tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360
gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420
gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480
tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540
aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600
gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660
cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720
gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780
gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840
aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900
gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960
gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020
tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080
tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140
gtggaagagc ctcag 1155
<210> 3
<211> 78
<212> DNA
<213> F4
<400> 3
gtggaagagc ctcagggtgg ttttggttct ggtggtggtg gttcttggga atgtccatac 60
ggtttgtgtt ggattcaa 78
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> R4
<400> 4
ttgaatccaa cacaaaccgt atggacattc ccaagaacca ccaccaccag aaccaccacc 60
acctggcgcg ccgac 75
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> F1
<400> 5
gacggtggtg gtggtgatgc acacaagagt gaggt 35
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> R1
<400> 6
atgatgatga tggtgttgaa tccaacacaa accgtatgga catt 44
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> F2
<400> 7
caccatcatc atcatcatca ttgagtttgt agccttagac atgac 45
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> R2
<400> 8
accaccacca ccgtcgacag aaccaccacc accagcaact ctacc 45
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> F3
<400> 9
tcgatgaatt taaacctctt gtggaagagc ctcag 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> R3
<400> 10
aggctacaaa ctcaatgatg atgatgatga tggtg 35

Claims (7)

1.一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白以组织型纤溶酶原激活剂为基础，将人血清白蛋白以及纤维蛋白靶向肽在其羧基端融合，获得重组蛋白tPA146Y-HSA-FBP；所述重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白的制备方法，其特征在于：tPA催化结构域突变体tPA146Y与人血清白蛋白HSA以及纤维蛋白靶向肽FBP融合构成重组蛋白。
3.一种表达如权利要求1所述组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒由tPA催化结构域突变体tPA146Y质粒tPA146Y-pPICZαA连接人血清白蛋白HSA基因以及纤维蛋白靶向肽FBP基因构建而成。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于：所述人血清白蛋白HSA基因的序列如SEQ ID NO.2所示；所述纤维蛋白靶向肽FBP基因序列由两条互补序列退火互补形成；
所述两条互补序列为：
F4: 5’-GTGGAAGAGCCTCAGGGTGGTTTTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTTGGGAATGTCCATACGGTTTGTGTTGGATTCAA-3’;
R4:5’-TTGAATCCAACACAAACCGTATGGACATTCCCAAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCTGGCGCGCCGAC-3’。
5.如权利要求3所述重组质粒的构建方法，其特征在于：以LIC法将HSA基因片段连接至tPA146Y-pPICZαA突变体质粒上，构建质粒tPA146Y-HSA-pPICZαA，然后将FBP基因片段连接至质粒tPA146Y-HSA-pPICZαA上，获得重组质粒tPA146Y-HSA-FBP-pPICZαA。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：
扩增HSA基因的引物为：
F1: 5’-GACGGTGGTGGTGGTGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’;
R1: 5’-ATGATGATGATGGTGTTGAATCCAACACAAACCGTATGGACATT-3’；
tPA146Y-pPICZαA突变体质粒扩增引物为：
F2:5’-CACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGCCTTAGACATGAC-3’；
R2: 5’-ACCACCACCACCGTCGACAGAACCACCACCACCAGCAACTCTACC-3’；
质粒tPA146Y-HSA-pPICZαA扩增引物为：
F3: 5’-TCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAG-3’;
R3:5’-AGGCTACAAACTCAATGATGATGATGATGATGGTG-3’。
7.如权利要求1所述的一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白在制备血栓栓塞性疾病药物中的应用。
CN202110708872.3A 2021-06-25 2021-06-25 一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用 Active CN113416724B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110708872.3A CN113416724B (zh) 2021-06-25 2021-06-25 一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110708872.3A CN113416724B (zh) 2021-06-25 2021-06-25 一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113416724A CN113416724A (zh) 2021-09-21
CN113416724B true CN113416724B (zh) 2023-05-23

Family

ID=77717676

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110708872.3A Active CN113416724B (zh) 2021-06-25 2021-06-25 一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113416724B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024060167A1 (zh) * 2022-09-23 2024-03-28 庄伟哲 靶向整合素αIIbβ3的含组织纤维溶酶原活化剂或其变异体的融合蛋白质及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999009184A1 (de) * 1997-08-13 1999-02-25 Roche Diagnostics Gmbh Plasminogenaktivator mit verbesserter zymogenität und verminderter fibrinbindung
CN1757745A (zh) * 2004-04-23 2006-04-12 黄秀东 一种利用甲醇酵母系统高效表达tPA等外源蛋白的方法及其表达产物的纯化制备技术
CN107760660A (zh) * 2017-12-13 2018-03-06 福州大学 一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2019241439A1 (en) * 2018-03-27 2020-10-22 Umc Utrecht Holding B.V. Targeted thrombolysis for treatment of microvascular thrombosis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999009184A1 (de) * 1997-08-13 1999-02-25 Roche Diagnostics Gmbh Plasminogenaktivator mit verbesserter zymogenität und verminderter fibrinbindung
CN1757745A (zh) * 2004-04-23 2006-04-12 黄秀东 一种利用甲醇酵母系统高效表达tPA等外源蛋白的方法及其表达产物的纯化制备技术
CN107760660A (zh) * 2017-12-13 2018-03-06 福州大学 一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
溶血栓药物研究进展;姚天赐等;《海峡药学》;20100615(第06期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113416724A (zh) 2021-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. A novel plasminogen activator from snake venom: Purification, characterization, and molecular cloning (∗)
US5580560A (en) Modified factor VII/VIIa
US8383386B2 (en) Compositions and methods for modulating hemostasis
Schatteman et al. Proteolytic activation of purified human procarboxypeptidase U
US5770699A (en) Process for production of inhibited forms of activated blood factors
Vivas-Ruiz et al. Coagulant thrombin-like enzyme (barnettobin) from Bothrops barnetti venom: molecular sequence analysis of its cDNA and biochemical properties
US6159722A (en) Chimeric serine proteases
CN113416724B (zh) 一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用
Lee et al. Isolation and properties of a blood coagulation factor X activator from the venom of king cobra (Ophiophagus hannah)
CN107760660B (zh) 一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用
Lee et al. Proteolytic processing of human protein C in swine mammary gland
JPH03505967A (ja) 組織プラスミノーゲン活性化因子類似体
Marcotte et al. Characterization of a metalloprotease which cleaves with high site-specificity the Glu (143)-Leu (144) bond of urokinase
US20120058537A1 (en) Chimeric truncated and mutant variant of tissue plasminogen activator (t-pa) resistant to plasminogen activator inhibitor-1
Fenton Structural regions and bioregulatory functions of thrombin
Bando et al. Thrombolytic effect of pro-urokinase in vitro
CA2162986A1 (en) Proteins having fibrinolytic and coagulation-inhibiting properties
Lijnen et al. Biochemical and biological properties of a recombinant tissue-type plasminogen activator derived from the rat JMI-229 cell line
Kochanowski et al. Expression and intein-mediated purification of novel staphylokinase SakSTAR with reduced immunogenicity and antiplatelet and antithrombin activation
JP2001505765A (ja) 組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ―ＰＡ）の変異体：組成物およびその使用方法
Iwata et al. The coexistence of Ser84 in renin and His13 in angiotensinogen brings a pH profile of two separate peaks to the reaction of human renin and sheep angiotensinogen
US8999322B2 (en) Compositions and methods for modulating hemostasis
JPH0377900A (ja) 血漿因子、その精製方法およびそれを有効成分として含有する血栓溶解剤
Geiger et al. Intermolecular Interactions and Characterization of the
Davami et al. Research Article Expression of a Novel Chimeric Truncated t-PA in CHO Cells Based on in Silico Experiments

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant