CN100424172C - 一种定向突变的基因工程巴曲酶及用途 - Google Patents

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Abstract

一种定向突变的基因工程巴曲酶，能使含抗凝剂的动物血浆凝固，其特征在于所述定向突变的基因工程巴曲酶氨基酸序列相对于天然的巴曲酶氨基酸序列的C-末端删除了十个氨基酸，同时第133位的Tyr突变为Glu。本发明能够通过以分泌表达的方式获得，同时具有较高的生物活性。

Description

一种定向突变的基因工程巴曲酶及用途
技术领域：
本发明涉及一种基因重组方法制备定向突变的巴曲酶——Batroxobin。其关键是巴曲酶基因的定向改造、合成、克隆、表达及产物的发酵表达和分离纯化制备。突变的巴曲酶既可以作为止血药的主要成份，也可以直接用作止血药物。
背景技术：
自1963年奥地利学者Von Klobusitzky首次从巴西矛头蝮蛇(Bothropsatrox)毒液中分离得到一种丝氨酸蛋白水解酶(类凝血酶)，也就是所说的巴曲酶。至今已发现30多种蛇毒中含有类凝血酶组份，并有20多种先后得到分离和纯化，它们都能作用于哺乳动物血浆中纤维蛋白原A链中的Arg16-Gly17间的肽键，释放出纤维蛋白肽A，从而快速地将血液中的纤维蛋原转变为纤维蛋白，这些纤维蛋白就能聚集成疏松的栓子来封闭伤口，实现快速止血的效果。同时，在体内它并不激活凝血因子XIII，由其水解产生的纤维蛋白凝块的侧链不能交联，易被纤维蛋白溶酶降解，所以不会造成血液系统的栓塞。巴曲酶现已经被成功地开发成止血药——进口的有立止血(Reptilase)，国产的有巴曲亭，在临床上具有很好的止血效果。
成熟的巴曲酶分子是由231个氨基酸残基组成的单链蛋白，
其氨基酸序列如下：
1  VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEWVLTAA
51 HCNRRFMRIH LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN
81 VITDKDIMLI RLDIPVKNSE HIAPLSLPSN PPSVGSVCRI
121 MGWGAITTSE DT
Figure C20051004733400051
PDVPHCA NINLFNNTVC REAYNGLPAK
161 TLCAGVLQGG IDTCGGDSGG PLICNGQFQG ILSWGSDPCA
201 EPRKPAFYTK VFDYLPWIQS
Figure C20051004733400052
其DNA序列如下：
1   GTCATTGGAG GTGATGAATG TGACATAAAT GAACATCCTT TCCTTGCATT
51  CATGTACTAC TCTCCCCGGT ATTTCTGTGG TATGACTTTG ATCAACCAGG
101 AATGGGTGCT GACCGCTGCA CACTGTAACA GGAGATTTAT GCGCATACAC
151 CTTGGTAAAC ATGCCGGAAG TGTAGCAAAT TATGATGAGG TGGTAAGATA
201 CCCAAAGGAG AAGTTCATTT GTCCCAATAA GAAAAAAAAT GTCATAACGG
251 ACAAGGACAT TATGTTGATC AGGCTGGACA GACCTGTCAA AAACAGTGAA
301 CACATCGCGC CTCTCAGCTT GCCTTCCAAC CCTCCCAGTG TGGGCTCAGT
351 TTGCCGTATT ATGGGATGGG GCGCAATCAC GACACTATC  GATACGTATC
401 CCGATGTCCC TCATTGTGCT AACATTAACC TGTTCAATAA TACGGTGTGT
451 CGTGAAGCTT ACAATGGGTT GCCGGCGAAA ACATTGTGTG CAGGTGTCCT
501 GCAAGGAGGC ATAGATACAT GTGGGGGTGA CTCTGGGGGA CCCCTCATCT
551 GTAATGGACA ATTCCAGGGC ATTTTATCTT GGGGAAGTGA TCCCTGTGCC
601 GAACCGCGTA AGCCTGCCTT CTACACCAAG GTCTTTGATT ATCTTCCCTG
651 GATCCAGAGC ATTATTGCAG GAAATAAAAC TGCGACTTGC CCG
理论计算出其分子量为25.5KD，等电点为7.39，国外从Bothrops atrox毒液中提取的巴曲酶，其实际分子量为42KD，这种分子量的偏差是由于糖基化修饰的缘故。从巴曲酶蛋白质一级结构中可以发现，其分子内有两个N-糖基化位点：Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr228。此外，Bothropsatrox的其他亚种以及其他种类毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白，不过其分子量从29.1KD到42KD不等，这可能是由于不同亚种之间氨基酸组成上差别或糖基化的程度不同所引起的。巴曲酶分子中有12个半胱氨酸，根据已知的丝氨酸蛋白酶类分子的研究结果，推测这12个半胱氨酸可能有Cys7-Cys139、Cys26-Cys42、Cys74-Cys230、Cys118-Cys184、Cys150-Cys168、Cys174-Cys199六个分子内二硫键的形成(Itoh n.et al.The J.of BiologicalChemistry，262，3132，1987)。
考虑到从巴西进口蛇毒原料成本较高，同时，巴西矛头蝮蛇也是稀有的保护蛇种，蛇毒产量也有限，因此，我们设想采用基因工程的方法大量生产重组巴曲酶，以满足研究和临床应用的需要。
巴曲酶蛋白虽然只有一条肽链，但是由于分子内二硫键多，还有糖基化修饰等，所以采用基因工程手段生产这种蛋白有很大的技术难度。这也应该是一直没有重组产品问世的主要原因之一。
虽然研究者对天然巴曲酶的性质有比较多的了解，但是，对其分子生物学方面的研究一直进展缓慢，直到1987、1988年才由日本的研究者完成对巴曲酶基因的cDNA和基因组DNA测序工作(Nobuyuki Itoh etalJ.Biol.Chem.262(7)：3132-3135，1987；J.Biol.Chem.，263：7628-7631，1988)。Maeda M等采用基因重组方法，在E.coli中，采用融合表达系统，以包涵体(Inclusion Body)的形式表达出该成份，据报道得到了所谓有生物学活性巴曲酶(Maeda M.etal，J Biochem(Tokyo)，109(4)：632-637，1991)，而且还为此申请了专利(Pat，No.：JP2124092，1990)。但到目前为止，还没有重组巴曲酶用于动物试验和临床研究工作的相关研究报导。
在E.coli中表达某些蛋白已经是较为常规的生产药用蛋白的基本手段，但是在对蛇毒类凝血酶实际研究中发现，在E.coli中表达蛇毒类凝血酶的量很少。潘华等采用RT-PCR法扩增出蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒类凝血酶基因Pallas，以表达载体pET-24a(+)构建T-7启动子控制下的表达质粒pET-Pallas，转化E.coli BL21(DE3)，并用0.4mmol/L IPTG诱导表达，经SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹分析表明有生物活性的Pallas表达(潘华等，蝮蛇类凝血酶基因的分析及表达研究，生物化学与生物物理学报，1999，31，79)。Fan等采用PCR法扩增出蝮蛇(Agkistrodon acutus)的蛇毒类凝血酶基因Acutin，克隆到表达载体pET-24a，在E.coli BL21DE(3)中表达，经SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹分析表明有生物活性的Acutin表达(Fan C.Y.等，Biochemistry and Molecular Biology International，1999，47，217)。但它们的表达效率普遍较低，没有实际生产价值。
杨青等报道了用甲醇酵母表达Gussurobin，获得每升发酵液产10mg有活性的Gussurobin(杨青等，Biotechnology Letters，2002，24，135)；Weon-KyooYou等报道了用甲醇酵母表达Batroxobin，获得了每升发酵液产13.16mg有活性的Batroxobin(Weon-Kyoo You等，FEBS Letters，2004，571，67)。
上海万兴生物制药有限公司申请了基因工程表达Batroxobin的专利(公开号CN1534093A，2004)，在大肠杆菌和甲醇酵母中均获得表达，但在大肠杆菌中表达的Batroxobin均为无活性蛋白。在甲醇酵母中获得一定量Batroxobin的表达，产量达每毫升发酵液20克氏单位(20KU/ml)，这一产量已初步具备生产意义。上述研究结果表明利用基因工程方法生产蛇毒类凝血酶是可行的，但要用真核表达系统。到目前为止，Batroxobin的基因工程产品还没有被开发成功。
采用基因工程的手段生产富含多对二硫键的蛋白一直是一个技术难题，尤其是生产有六对二硫键的丝氨酸蛋白水解酶。这是因为二硫键配对错误率很高，在原核中得到的几乎全是包涵体，虽然对包涵体的变性复性能得到少量的有活性的目的蛋白，但是其成本决定了不具备实际生产意义。真核表达系统(酵母、CHO和昆虫细胞等)能保证较高的二硫键配对正确率。另外，蛇毒类凝血酶分子中有不同含量的糖基化，原核细胞不能对所表达的外原蛋白进行糖基化，而糖基对蛋白的空间结构和酶活性都起稳定作用。因此空间结构复杂、有糖链的蛋白本身就不适合用原核细胞进行表达。而真核表达系统除能保证较高的二硫键配对正确率外，还能对表达产物进行一定程度的糖基化，虽然糖基化的含量和种类与蛇毒中类凝血酶分子所含的糖基不同，但也很好地保证了表达产物的活性。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种定向突变的基因工程巴曲酶，它能够通过以分泌表达的方式大量生产获得，同时具有较高的生物活性。
本发明提供了一种定向突变的基因工程巴曲酶，能使含抗凝剂的动物血浆凝固，其特征在于所述定向突变的基因工程巴曲酶氨基酸序列相对于天然的巴曲酶氨基酸序列的C-末端删除了十个氨基酸，同时第133位的Tyr突变为Glu，具体为：
1   VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEWVLTAA
51  HCNRRFMRIH LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN
81  VITDKDIMLI RLDRPVKNSE HIAPLSLPSN PPSVGSVCRI
121 MGWGAITTSE DTEPDVPHCA NINLFNNTVC REAYNGLPAK
161 TLCAGVLQGG IDTCGGDSGG PLICNGQFQG ILSWGSDPCA
201 EPRKPAFYTK VFDYLPWIQS I
本发明具有生物活性的定向突变的基因工程巴曲酶，可以通过将人工合成的定向突变的巴曲酶结构基因在酵母菌中或哺乳动物细胞中，以分泌表达的方式获得。
优选地，本发明定向突变的基因工程巴曲酶可以通过甲醇酵母菌以分泌表达的方式获得。
在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，可以依据巴曲酶的天然氨基酸序列，选择甲醇酵母菌比较偏好的密码子，人工合成定向突变的巴曲酶结构基因序列，再将人工合成的定向突变的巴曲酶结构基因插入到甲醇酵母菌表达载体pPIC9K和pPICZα中。
其中人工合成定向突变的巴曲酶结构基因序列最好为：
1   GTTATTGGTG GTGATGAATG TGATATTAAC GAACATCCAT TTTTGGCTTT
51  TATGTACTAC TCTCCAAGAT ACTTTTGTGG TATGACTTTG ATTAACCAAG
101 AATGGGTTTT GACTGCTGCT CATTGTAACA GAAGATTTAT GAGAATTCAT
151 TTGGGTAAGC ATGCTGGTTC TGTTGCTAAC TACGATGAAG TTGTTAGATA
201 CCCAAAGGAA AAGTTTATTT GTCCAAACAA GAAGAAGAAC GTTATTACTG
251 ATAAGGATAT TATGTTGATT AGATTGGATA GACCAGTTAA GAACTCTGAA
301 CATATTGCTC CATTGTCTTT GCCATCTAAC CCACCATCTG TTGGTTCTGT
351 TTGTAGAATT ATGGGTTGGG GTGCTATTAC TACTTCTGAA GATACTGAAC
401 CAGATGTTCC ACATTGTGCT AACATTAACT TGTTTAACAA CACTGTTTGT
451 AGAGAAGCTT ACAACGGTTT GCCAGCTAAG ACTTTGTGTG CTGGTGTTTT
501 GCAAGGTGGT ATTGATACTT GTGGTGGTGA TTCTGGTGGT CCATTGATTT
551 GTAACGGTCA ATTTCAAGGT ATTTTGTCTT GGGGTTCTGA TCCATGTGCT
601 GAACCAAGAA AGCCAGCTTT TTACACTAAG GTTTTTGATT ACTTGCCATG
651 GATTCAATCT ATT
在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，可以利用酵母菌的α-信号肽，PHO1信号肽，或者利用巴曲酶的天然信号肽将巴曲酶移出细胞，其中在信号肽序列与巴曲酶蛋白序列之间插入KEX2蛋白酶识别序列。
本发明定向突变的基因工程巴曲酶，可作为止血药的主要成份，也可以直接作为止血药之用。
本发明对巴曲酶进行定向改造。TSV-PA是Trimeresurus stejnegeri蛇毒中含有的单链凝血酶原激活剂，它是一种丝氨酸蛋白酶，功能、结构、氨基酸序列均与蛇毒类凝血酶相似(61-73％)，而且在同类蛋白中，TSV-PA是唯一有三维结构分析的蛋白。根据巴曲酶的结构类似蛋白TSV-PA和底物-纤维蛋白原的空间结构对巴曲酶进行定向改造。用Modeller 8v1软件包进行巴曲酶的三维结构的同源模建，在同源模建的过程中，用TSV-PA的
Figure C20051004733400101
的x衍射结构用作巴曲酶的三维结构模型的模板，首先把结构保守区(SCRs)的蛋白质主链坐标由模板蛋白质复制到目标蛋白质上，然后再添加氨基酸侧链；非结构保守区(Loops)的空间坐标需要进行数据库搜索，根据搜索结果的RMS(root-mean-square)值进行选择，然后将选定的搜索得到的片段的坐标复制给目标蛋白质；然后把模建得到的初级模型用Gromacs3.21程序在溶剂化条件下，进行常温1ns的分子动力学模拟，每隔0.2ps收集一个构象。得到的优势构象再依次用最陡下降法300步及共扼梯度法进行结构优化，直至RMS达到10-6 kcal mol-1
Figure C20051004733400102
最后，模型的精确性和有效性用PROCHEK程序运行评估。根据上述运算结果和美国Genebank中公开的巴曲酶(X12747)的核酸序列，定向删除巴曲酶C末端的十个氨基酸外，还对酶活中心位点的第133位的Tyr突变为Glu，增强活性中心的负电势区域的负电势，进而增强酶与底物结合时的静电相互作用。其它的核酸序列按酵母菌喜好的遗传密码子，人工合成巴曲酶的定向改造的结构基因序列，除定向突变外均为同义突变，即并没改变氨基酸种类。
本发明定向突变的意义就在于，通过定向突变，增强活性中心的负电势区域的负电势，进而增强酶与底物结合时的静电相互作用，提高巴曲酶与底物的亲和力，从而提高酶活效率。在国内外还未见对巴曲酶进行定向改造的研究报道。
将人工合成定向改造的巴曲酶的结构基因插入到酵母菌表达载体pPIC9K和pPICZα中，在酵母菌中实现分泌表达。确定了酵母菌发酵表达条件，并对表达产物进行分离纯化，得到了高活性的基因工程巴曲酶。结果表明，基因工程巴曲酶较天然巴曲酶的比活性提高了一倍多。产率达16mg/L发酵液。
具体实施方式：
实施例1
根据美国Genebank中公开的巴曲酶(X12747)的核酸序列，选择酵母菌喜好的遗传密码子，人工合成巴曲酶的定向改造的结构基因序列，定向删除巴曲酶C末端的十个氨基酸外，还对酶活中心位点的第133位的Tyr突变为Glu，增强活性中心的负电势区域的负电势，进而增强酶与底物结合时的静电相互作用。为使合成的目的基因插入到酵母菌分泌型表达载体pPIC9K和pPICZα中，在基因的5′端添加Xho I酶切位点、基因的3′端添加终止密码子TAATGA及Not I酶切位点。另外，在Xho I酶切位点与巴曲酶蛋白N-端第一个氨基酸Val密码子之间加入KEX2蛋白酶识别序列Lys-Arg对应的密码子AAAAGA，这就确保目的蛋白在分泌到发酵液中时能够顺利地切除α-信号肽。
将合成的目的基因及pPIC9K和pPICZα载体经Xho I和Not I双酶切，电泳、回收，将目的基因分别插入到pPIC9K和pPICZα中，转化到大肠杆菌Top10F’中，分别进行筛选。1、转化有pPIC9K的大肠杆菌Top10F’在LB+Amp250ug/ml的平板上进行培养，挑取单菌落，在液体培养基中培养，提取质粒，Xho I-Not I双酶切检测或进行a-factor priming和3AOX1priming PCR检测，说明pPIC9K中含有目的基因，可以用来转化Pichiapastoris GS115(his4)或KM71(arg4 his4aox1::ARG4)宿主菌。2、转化有pPICZα的大肠杆菌Top10F’在LB+25ug/mg Zeocin的平板上的进行培养，挑取单菌落，在液体培养基中培养，提取质粒，Xho I-Not I双酶切检测或进行a-factor priming和3′AOX1 priming PCR检测，说明pPICZα中含有目的基因，可以用来转化Pichia pastoris X-33或GS115His+宿主菌。
实施例2
用DNA限制性内切酶SacI将pPIC9K-Bg线性化，按照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit Version F中的方法制备酵母宿主感受态并进行转化，将转化后的细胞铺在RDB培养基上生长，30℃培养，4-6天后可出现单菌落。在加有不同浓度Geneticin的YPD平板上检测重组到酵母基因组中的拷贝数数量：YPD+Geneticin(0-0.25mg/ml)用于检测含有一个拷贝数的宿主菌；YPD+Geneticin(0.5-4mg/ml)用于检测含有二个以上拷贝的宿主菌。30℃培养，2-5天后可出现单菌落，挑取单菌落划线培养，保存菌种。
用DNA限制性内切酶SacI将pPICZα-Bg线性化，按照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit Version B中的方法制备酵母宿主感受态并进行转化，将转化后的细胞铺在YPD+500ug/ml Zeocin培养基上生长，30℃下放置3-4天可出现单菌落。挑选菌落大而饱满的克隆进行表达筛选。
实施例3
用在试管中筛选出的高表达的工程菌，接种到摇瓶中增殖作为种子液，再转接至30L发酵罐，按甲醇酵母发酵的常规方法进行中试规模的发酵。诱导50小时。将发酵液离心收集上清，或超滤浓缩脱盐，采用疏水柱层析、离子交换柱层析、，亲和柱层析、凝胶柱层析等生化分离技术，得到纯度达97％以上的活性蛋白。
实施例4
种子液：在2L酵母氮原基础培养基中30℃发酵24小时后转到40L发酵液中进行发酵培养。培养基：H3PO4，27ml/L；CaSO4·2H2O，0.9g/L；K2SO418g/L；MgSO4·7H2O，15g/L；KOH，4.13g/L；甘油40g/L；4.4ml/L微量矿物质溶液。
在发酵过程中，用12.5％(w/v)的NH4OH调pH值，使其维持在5.0。30℃通氧剧烈搅拌(1000rpm)发酵，添加消泡剂。发酵20小时后，加入含12ml/L微量矿物质的50％甘油，溶氧浓度为40％，继续培养10小时。当碳原饥饿30分钟后，加入甲醇诱导。刚开始的5小时加入甲醇的速率低，不提供氧量，以使酵母适应甲醇，100％甲醇含12ml/L微量矿物质溶液，其溶氧量在40％以上。继续发酵72小时。
实施例5
发酵液离心，收集上清液，加入(NH4)2SO4使其浓度达到2M，然后加到phenyl-Sepharose层析柱上，用(NH4)2SO4从2-0mol/L进行梯度洗脱，收集活性峰，然后上亲和柱benzamidine-SepharoseCL-6B，50mMTris/HCL，pH 8.2，洗脱液含0.5M NaCL，收集活性峰。接着上Sephadex G-50，流动相50mMTris/HCL，pH8.2，含0.5M NaCL，收集活性峰。最后，Sephadex G-25脱盐，收集活性峰。冻干，存于-20℃。SDS-PAGE电泳检测纯度达97％以上。送样品测定氨基酸序列，结果同理论设计的完全一致。见突变后的batroxobin氨基酸序列。
实施例6
发酵液离心，收集上清液，用65％固体(NH4)2SO4使活性蛋白盐析低温过夜，离心，收集沉淀，溶于50mmol/L Tris-HCL，pH8.2，并透析，离心，取上清上亲和柱benzamidine-SepharoseCL-4B，用含0.5mol/L NaCL的上述缓冲液进行洗脱，收集活性峰。用50mmol/L Tris-HCL，pH8.2缓冲液稀释，上阴离子交换柱Mono Q，用含0.5mol/L NaCL上述缓冲液进行洗脱，收集活性峰，最后，上用相同缓冲液平衡好的Sephacryl S-200柱，收集活性峰。SDS-PAGE电泳检测纯度达97％以上。冻干，存于-20℃。
实施例7
采用同类产品活性的测定方法进行体外凝血试验，具体实验方法为：取人-枸橼酸抗凝血浆0.2ml，加入直径1cm的试管中，置37℃水浴中保温3分钟，加入37℃预热的样品溶液0.2ml，立即混匀计时，于40秒开始，检查血浆凝固情况，记录初凝时间，同时测定3管，3管初凝时间误差应小于20秒。若初凝时间小于40秒，则适当稀释供试品溶液，记录60±20秒内凝固的供试品溶液浓度，在上述条件下，能使0.2ml人-枸橼酸抗凝血浆在60秒凝固的酶量，定义为一个单位。
称取天然巴曲酶和基因工程巴曲酶各0.1mg，溶于10ml水中，进行适当稀释，按上述方法测定活性，阳性对照为立止血(1单位)，结果见表1。
表1  巴曲酶体外凝血活性测定结果
Figure C20051004733400151
结果表明，重组巴曲酶的比活性比天然巴曲酶比活性提高近一倍。

Claims (7)

1. 一种定向突变的基因工程巴曲酶，能使含抗凝剂的动物血浆凝固，其特征在于所述定向突变的基因工程巴曲酶氨基酸序列相对于天然的巴曲酶氨基酸序列的C-末端删除了十个氨基酸，同时第133位的Tyr突变为Glu，具体为：
1   VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEWVLTAA
51  HCNRRFMRIH LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN
81  VITDKDIMLI RLDRPVKNSE HIAPLSLPSN PPSVGSVCRI
121 MGWGAITTSE DTEPDVPHCA NINLFNNTVC REAYNGLPAK
161 TLCAGVLQGG IDTCGGDSGG PLICNGQFQG ILSWGSDPCA
201 EPRKPAFYTK VFDYLPWIQS I
2. 按照权利要求1所述定向突变的基因工程巴曲酶，其特征在于所述具有生物活性的定向突变的基因工程巴曲酶，通过将人工合成的定向突变的巴曲酶结构基因在酵母菌中或哺乳动物细胞中，以分泌表达的方式获得。
3. 按照权利要求2所述定向突变的基因工程巴曲酶，其特征在于所述酵母菌为甲醇酵母菌。
4. 按照权利要求3所述定向突变的基因工程巴曲酶，其特征在于：在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，将人工合成的定向突变的巴曲酶结构基因插入到甲醇酵母菌表达载体pPIC9K或pPICZα中。
5. 按照权利要求4所述定向突变的基因工程巴曲酶，其特征在于所述人工合成定向突变的巴曲酶结构基因序列为：
1  GTTATTGGTG GTGATGAATG TGATATTAAC GAACATCCAT TTTTGGCTTT
51 TATGTACTAC TCTCCAAGAT ACTTTTGTGG TATGACTTTG ATTAACCAAG
101 AATGGGTTTT GACTGCTGCT CATTGTAACA GAAGATTTAT GAGAATTCAT
151 TTGGGTAAGC ATGCTGGTTC TGTTGCTAAC TACGATGAAG TTGTTAGATA
201 CCCAAAGGAA AAGTTTATTT GTCCAAACAA GAAGAAGAAC GTTATTACTG
251 ATAAGGATAT TATGTTGATT AGATTGGATA GACCAGTTAA GAACTCTGAA
301 CATATTGCTC CATTGTCTTT GCCATCTAAC CCACCATCTG TTGGTTCTGT
351 TTGTAGAATT ATGGGTTGGG GTGCTATTAC TACTTCTGAA GATACTGAAC
401 CAGATGTTCC ACATTGTGCT AACATTAACT TGTTTAACAA CACTGTTTGT
451 AGAGAAGCTT ACAACGGTTT GCCAGCTAAG ACTTTGTGTG CTGGTGTTTT
501 GCAAGGTGGT ATTGATACTT GTGGTGGTGA TTCTGGTGGT CCATTGATTT
551 GTAACGGTCA ATTTCAAGGT ATTTTGTCTT GGGGTTCTGA TCCATGTGCT
601 GAACCAAGAA AGCCAGCTTT TTACACTAAG GTTTTTGATT ACTTGCCATG
651 GATTCAATCT ATT
6. 按照权利要求3所述定向突变的基因工程巴曲酶，其特征在于在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，利用酵母菌的α-信号肽，PHO1信号肽，或者利用巴曲酶的天然信号肽将巴曲酶移出细胞，其中在信号肽序列与巴曲酶蛋白序列之间插入KEX2蛋白酶识别序列。
7. 权利要求1～6之一所述定向突变的基因工程巴曲酶在制造止血药物方面的用途。
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蛇毒类凝血酶的研究进展. 李民等.生命科学研究，第6卷第1期. 2002
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