KR20080055843A - 트립신 변이체에 의한 인슐린 전구체의 절단 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비-동물 숙주 유기체에서 라이신과 대비하여 아르기닌에 대한 기질 특이성이 증가된 재조합 트립신 변이체의 생산에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 재조합 트립신 변이체 및 이의 생산에 관한 것이다. 인슐린의 전구체를 절단하기 위한 당해 재조합 돼지 췌장 트립신 변이체의 용도 및 당해 트립신 변이체를 함유하는 키트가 제공된다.
재조합 트립신 변이체, 인슐린 전구체, 아르기닌에 대한 기질 특이성, 절단, 프로세싱

Description

트립신 변이체에 의한 인슐린 전구체의 절단{Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin}
본 발명은 비-동물 숙주 유기체에서 라이신과 대비하여 아르기닌에 대한 기질 특이성이 증가된 재조합 트립신의 변이체의 생산에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 재조합 트립신의 변이체 및 이의 생산에 관한 것이다. 인슐린의 전구체를 절단하기 위한 재조합 돼지 췌장 트립신 변이체의 용도 및 당해 트립신의 변이체를 함유하는 키트가 제공된다.
트립신은 염기성 아미노산 아르기닌 및 라이신의 카복실 그룹에서의 펩타이드의 가수분해성 절단을 촉매하는 세린 프로테아제이다[참조: Keil B., (1971). The 효소 Vol. II, 3rd Edition, Editor Boyer, Acad. Press NY. Pp. 249-275]. 재조합 돼지 췌장 트립신은 분자량이 약 23,000달턴이며 pH 8.0에서 최적의 효소 활성을 갖는다.
트립신은 인슐린 및 인슐린 유사체의 산업적 생산 방법에서 사용된다. 이러한 생물분자의 생산은 문헌에 기재되어 있으며 몇가지 접근법이 선택되었다. 경제적 관점에서, 사람 인슐린 및 인슐린 유사체의 화학적 합성은 적절하지 않다. 따라서, 주로 인슐린 및 인슐린 유사체의 2가지 생산 방법, 즉 출발 물질로서 돼지 인슐린을 사용하는 반합성 접근법 및 재조합 인슐린의 발현을 위한 유전적으로 변형된 미생물의 사용이 현재 존재한다.
인슐린은 21개 아미노산을 갖는 A 쇄 및 30개 아미노산을 갖는 B 쇄의 2개의 아미노산 쇄로 나뉘어진 51개 아미노산의 폴리펩타이드이다. 쇄들은 2개의 디설파이드 브릿지에 의해 서로 연결되어 있다. 인슐린 제제는 여러 해 동안 당뇨병 치료를 위해 사용되어 왔다. 치료에는 천연 발생 인슐린 뿐만 아니라, 최근에는 인슐린 유도체 및 유사체도 사용된다.
인슐린 유사체는 하나 이상의 천연 발생 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환 및/또는 상응하는, 그 밖에는 동일한 천연 발생 인슐린으로부터 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가/제거에 의해 상이한, 천연 발생 인슐린, 즉 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 유사체이다. 부가된 및/또는 치환된 아미노산 잔기는 천연적으로 발생되지 않는 아미노산일 수도 있다.
인슐린 유도체는 화학적 변형에 의해 수득되는 천연 발생 인슐린 또는 인슐린 유사체의 유도체이다. 화학적 변형은 예를 들면, 하나 이상의 아미노산에 하나 이상의 특정 화학 그룹이 부가되는 것으로 이루어질 수 있다.
인슐린 유도체의 예로는 B29-N-미리스토일-des(B30) 사람 인슐린, B29-N-팔미토일-des(B30) 사람 인슐린, B29-N-미리스토일 사람 인슐린, B29-N-팔미토일 사람 인슐린, B28-N-미리스토일 LysB28ProB29 사람 인슐린, B28-N-팔미토일-LysB28ProB29 사람 인슐린, B30-N-미리스토일-ThrB29LysB30 사람 인슐린, B30-N-팔미토일- ThrB29LysB30 사람 인슐린, B29-N-(N-팔미토일-Y-글루타밀)-des(B30) 사람 인슐린, B29-N-(N-리토콜릴-Y-글루타밀)-des(B30) 사람 인슐린, B29-N-(ω-카복시헵타데카노일)-des(B30) 사람 인슐린 및 B29-N-(ω-카복시헵타데카노일) 사람 인슐린이 있다.
인슐린 유사체는 EP 0 214 826, EP 0 375 437 및 EP 0 678 522에 기재되어 있다. EP 0 214 826는 특히, B27 및 B28의 치환에 관한 것이다. EP 0 678 522에는, 위치 B29에 글루탐산을 제외한 각종 아미노산, 바람직하게는 프롤린을 갖는 인슐린 유사체가 기재되어 있다.
기타 인슐린 유사체는 LysB28ProB29 사람 인슐린; B28 Asp 사람 인슐린; 위치 B28의 프롤린이 Asp, Lys, Leu, Val 또는 Ala으로 치환되었고 위치 B29에서 Lys가 Pro로 치환될 수 있는 사람 인슐린; AlaB26 사람 인슐린; des(B28-B30) 사람 인슐린; des(B27) 사람 인슐린; 또는 des(B30) 사람 인슐린이다.
EP 0 375 437은 B28에 라이신 또는 아르기닌을 갖고 임의로 B3 및/또는 A21에서 부가적으로 변형될 수 있는 인슐린 유사체를 포함한다.
EP 0 419 504에는, B3의 아스파라긴 및 위치 A5, A15, A18 또는 A21의 하나 이상의 추가 아미노산이 변형된 인슐린 유사체가 기술되어 있다. WO 92/00321에는, 위치 B1 내지 B6의 하나 이상의 아미노산이 라이신 또는 아르기닌으로 치환된 인슐린 유사체가 기술되어 있다.
본원에서 추가로 논의되는 중요한 인슐린 유사체는 "인슐린 글라진"(Gly A(21), Arg B (31), Arg B (32) 사람 인슐린) 및 "인슐린 글루리신"(Lys B(3), Glu B(29) 사람 인슐린)이다.
재조합 DNA 프로세싱은 인슐린 또는 인슐린 유사체, 특히, 미생물에서 제조되는 사람 인슐린과 상이한 아미노산 서열 및/또는 아미노산 쇄 길이를 갖는 사람 프로인슐린 또는 프로인슐린을 생성한다. 유전적으로 변형된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포로부터 제조된 프로인슐린은 어떠한 정확하게 결합된 시스틴 브릿지도 갖지 않는다. 이. 콜라이를 사용하여 사람 인슐린을 수득하는 방법(EP 0 055 945)은 다음 공정 단계에 근거한다:
미생물의 발효, 세포 분리, 세포 파괴, 인슐린 또는 인슐린 유사체 전구체의 분리, 프리-프로-인슐린(들)("PPI")을 산출하는 각각의 디설파이드 결합의 형성에 의한 목적하는 (천연) 3차원 구조로의 재폴딩(re-folding), 각각의 프리-프로-인슐린의 트립신 절단(가능하게는 카복시펩티다제 B의 존재하에), 기본적 정제, 제1 크로마토그래피 단계, 사람 인슐린 또는 각각의 인슐린 유사체를 산출하는 궁극적 효소적 절단, 제2 크로마토그래피 단계 및 HPLC, 결정화 및 건조에 의한 최종 정제.
프리-프로-인슐린의 트립신 절단은 복합적인 효소적 반응이다: 각각의 생성물을 산출하기 위해 이 단계에서 프리-서열 및 C-펩타이드가 절단된다. 예를 들면, 사람 인슐린 생산의 경우에, 목적하는 유용 산물은 Arg(B31), Arg(B32)-인슐린 및 Arg(B31)-인슐린이다(DE19821866).
그러나, 트립신 절단은 원치않는 부반응이 일어난 결과로서 많은 부산물의 형성을 유도한다. 트립신은 C-말단 아르기닌(Arg) 또는 라이신(Lys) 잔기에서 펩 타이드 결합을 절단하는 엔도프로테아제(세린 유형)이다. 프리-프로-인슐린 분자의 트립신 절단은 서로 다른 절단 부위에서 동시에 일어날 수 있다. 특정 프리-프로-인슐린 분자 내에는 많은 절단 부위가 존재하기 때문에, 많은 원치않는 부산물이 트립신 절단 반응 동안에 형성될 수 있다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 절단 반응 동안에 생성된 많은 부산물들은 Arg 잔기 대신에 Lys의 C-말단 측면에서 펩타이드 결합이 절단됨으로써 일어난 결과이다.
모든 프리-프로-인슐린에 있어, 프리-서열과 인슐린 B 쇄 사이의 절단 부위는 일염기성이다. 이러한 접합부에서는 오직 1회의 절단 반응만이 일어날 수 있다.
다른 2개의 접합부- B-쇄/C-펩타이드 및 C-펩타이드/A-쇄에는 상이한 절단 부위들이 존재한다. B-쇄/C-펩타이드와 C-펩타이드/A-쇄 사이의 사람 인슐린 및 인슐린 글라진 절단 부위는 둘다 일염기성이다(각각, Arg-Arg 및 Lys-Arg). 또한, B29-Lys 다음의 절단은 B30-des-Thr ("des-Thr") 형성을 유도한다.
사람 인슐린에 있어, 오직 잔기 B31-Arg 및 B32-Arg 다음의 트립신 절단만이 B-쇄/C-펩타이드 접합에 유용한 산물, 즉 B31-Arg 인슐린("mono-Arg") 및 B31-Arg, B32-Arg 인슐린 ("di-Arg")을 산출한다. 이들 생성물은 "Arg-인슐린"으로서 요약될 수 있다. 오직 Di-Arg-인슐린만이 사용될 수 있기 때문에 B32-Arg 다음의 절단이 인슐린 글라진의 생산 과정에서 중요하다. 사람 인슐린 및 인슐린 글라진에 있어, B29-Lys 다음의 절단은 des-Thr 형성을 초래한다. 인슐린 글루리신에 있어, 이러한 절단 부위는 일염기성이며 가능한 산물은 Arg-함유 종이다.
C-펩타이드/A-쇄와 관련하여, Lys 잔기가 아닌 Arg 다음의 트립신 절단은 유용한 산물을 수득하는데 있어 중요하다. Lys 다음의 가성 절단(false cleavage)은 A0-부산물의 형성을 초래한다.
최신 기술의 단점을 해결하기 위해, 프리-프로인슐린의 절단 과정에서, 도 1에 도시한 예시와 같은 상이한 절단 부위에 대한 Arg-특이성이 증강된 트립신 효소를 사용하는 것이 바람직하다. 트립신 효소에 대한 Arg-특이성을 증가시키고 이에 따라서 부산물의 Lys-특이적 형성을 감소시킴으로써, 특히 des-Thr 및 A0-성분이 예측될 수 있다.
지클러(Sichler) 등[참조: FEBS Lett. (2002) 530:220-224]은 사람 트립신에서 190번 위치(문헌[참조: Huber, R. & Bode, W., Acc. Chem. Res. (1978) 11:114-122]에 따른 키모트립시노겐 번호매김)에서의 아미노산 효과의 영향을 조사하였다. 인공 기질을 사용하는 경우에, 상기 위치에서의 야생형 세린으로부터 돌연변이형 알라닌으로의 교환은 아르기닌에 대한 절단 부위 특이성을 증가시키고 라이신에 대한 절단 부위 특이성을 감소시킨다는 것이 밝혀졌다. 동시에, 돌연변이체의 효소 활성은 야생형과 비교해 약 2의 인수만큼 감소된 것으로 밝혀졌다. 프리-프로-인슐린 프로세싱에 대한 재조합 사람 야생형 트립신 및 사람 트립신 돌연변이체(190번 위치에서 세린으로부터 알라닌으로의 교환)의 시험은 두 효소 모두에 대한 많은 양의 부산물 형성을 초래하였으며, 이는 Arg-선택성의 증가가 프리-프로-인슐린 절단으로 지정될 수 없음을 보여준다(하기 실시예 1 참조).
최신 기술의 견지에서, 해결해야 할 과제는 단백질분해 활성의 많은 손실 없 이 아르기닌에 대한 증가된 절단 부위 선택성을 나타내는 트립신 변이체를 제공하는 것이다. 해결해야 할 다른 특정 과제는 도 1에 도시된 예시와 같은 프리-프로-인슐린 프로세싱에 대한 절단 부위내의 아르기닌 잔기에 대한 절단 부위 선택성이 증가된 트립신 변이체를 제공하는 것이다.
따라서, 당해 과제는 172번 위치에서 세린으로부터 알라닌으로의 아미노산 교환을 갖는 돼지 트립신 변이체를 제공함으로써 해결된다. 바람직한 양태에서, 돼지 트립신의 Ser172Ala 변이체는 재조합 수단에 의해 제공된다. 놀랍게도, 당해 돼지 트립신의 Ser172Ala 변이체는 야생형 효소와 비교해서 프리-프로-인슐린 절단 반응이 거의 동일한 것으로 밝혀졌다.
지클러(Sichler) 등[참조: FEBS Lett. (2002) 530:220-224]에 의해 사람 트립신에서 조사된 190번 위치의 아미노산 세린은 서열번호 1로서 기재된 돼지 트립신의 172번 위치의 세린에 상응한다. 두 위치는 모두 트립신-유사 세린 프로테아제의 소위 S1 부위의 일부분이다.
따라서, 본 발명의 한 양태는 인슐린, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체의 생산 방법에서의 Ser172Ala 돼지 트립신 변이체의 용도이다.
본 발명의 다른 양태는
(a) 프리-프로-인슐린, 프리-프로-인슐린 유사체 또는 프리-프로-인슐린 유도체를 Ser172Ala 돼지 트립신으로 절단하고,
(b) 생성된 절단 산물을 분리시키고,
(aa) 생성된 절단 산물중 하나가 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체인 경우, 당해 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체를 수득하거나, 또는
(bb) 인슐린, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체의 전구체인 절단 산물을 추가로 프로세싱하고, 이러한 추가 프로세싱으로부터 생성된 인슐린, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체를 수득하는, 인슐린, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체의 생산 방법이며, 이때, 인슐린은 바람직하게는 사람 인슐린이고; 인슐린 유사체는 LysB28ProB29 사람 인슐린; B28 Asp 사람 인슐린; 위치 B28의 프롤린이 Asp, Lys, Leu, Val 또는 Ala에 의해 치환되었고 위치 B29의 Lys가 Pro에 의해 치환될 수 있는 사람 인슐린; AlaB26 사람 인슐린; des(B28-B30) 사람 인슐린; des(B27) 사람 인슐린; 및 des(B30) 사람 인슐린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 인슐린 유도체는 B29-N-미리스토일-des(B30) 사람 인슐린, B29-N-팔미토일-des(B30) 사람 인슐린, B29-N-미리스토일 사람 인슐린, B29-N-팔미토일 사람 인슐린, B28-N-미리스토일 LysB28ProB29 사람 인슐린, B28-N-팔미토일-LysB28ProB29 사람 인슐린, B30-N-미리스토일-ThrB29LysB30 사람 인슐린, B30-N-팔미토일- ThrB29LysB30 사람 인슐린, B29-N-(N-팔미토일-Y-글루타밀)-des(B30) 사람 인슐린, B29-N-(N-리토콜릴-Y-글루타밀)-des(B30) 사람 인슐린, B29-N-(ω-카복시헵타데카노일)-des(B30) 사람 인슐린 및 B29-N-(ω-카복시헵타데카노일) 사람 인슐린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 인슐린 유사체는 인슐린 글루리신(glulisine) 또는 인슐린 글라진(glargine)이다.
본 발명의 추가의 양태에서, 언급된 인슐린, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체의 전구체인 절단 산물의 추가 프로세싱은, 당해 산물을, 인슐린 글라진을 제외하고, 카복시펩티다제 B를 이용하여 절단함을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, Ser172Ala 돼지 트립신을 이용한 절단은 7.5 내지 9.5 범위, 바람직하게는 8.3의 pH 값; 1℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게는 8℃ 내지 15℃, 가장 바람직하게는 8℃의 온도에서 수행하고, 효소 반응은, 바람직하게는 1N 또는 2N HCl 용액을 부가함에 의해 샘플을 산성화시킴으로써 종결시킨다.
본 발명의 다른 양태는 서열번호 3의 서열을 특징으로 하는 Ser172Ala 돼지 트립신, Ser172Ala 돼지 트립신을 암호화하는, 바람직하게는 서열번호 4의 서열을 특징으로 하는 DNA이다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 6을 특징으로 하는, Ser172Ala 프리-트립시노겐을 암호화하는 DNA이다. 상기 프리-트립시노겐의 시그날 펩타이드는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 알파 인자로부터 유래된다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기한 DNA를 포함하는 벡터이다.
본 발명의 또 다른 양태는
(a) 청구항 제16항에 따른 벡터를 제공하는 단계,
(b) 미생물 숙주 균주를 상기 벡터로 형질전환시키는 단계,
(c) 형질전환된 미생물 숙주 균주를 영양소를 함유하는 성장 배지에서 배양하여, 미생물 숙주 균주가 Ser172Ala 돼지 트립신 또는 Ser172Ala 돼지 트립시노겐을 발현하도록 하는 단계,
(d) (c)의 발현 산물이 Ser172Ala 돼지 트립시노겐인 경우, 성숙한 Ser172Ala 돼지 트립신으로 전환시키는 단계, 및
(e) 미생물 숙주 균주 및/또는 성장 배지로부터 Ser172Ala 돼지 트립신을 정제하는 단계를 포함하는, Ser172Ala 돼지 트립신의 생산 방법이며, 이때, 특히 미생물 숙주 균주는 한세눌라(Hansenula), 피치아(Pichia), 칸디다(Candida) 및 토룰로프시스(Torulopsis) 종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 미생물 숙주 균주는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 칸디다 보이디니(Candida boidinii) 및 토룰로프시스 글라브라타(Torulopsis glabrata)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본원 명세서에서, "돼지 트립신 변이체" 및 "돼지 트립신의 변이체"는 서열번호 1에 따른 172번 위치에서의 아미노산 치환에 의해 생성된 성숙한 돼지 췌장 트립신 단백질 동종형(isotype) I의 변이체, 즉 대립유전자 형태인 단백질을 의미한다.
본원에 기술된 돼지 트립신 변이체의 단축된 명명의 목적상, 번호는 서열번호 1에 기재된 성숙한 돼지 췌장 트립신의 아미노산 서열에 따르는 아미노산 잔기/위치를 의미한다. 아미노산 식별은 아미노산의 3문자 약어 및 1문자 알파벳을 사용하는데, 즉 Asp D 아스파르트산, Ile I 이소류신, Thr T 트레오닌, Leu L 류신, Ser S 세린, Tyr Y 티로신, Glu E 글루탐산, Phe F 페닐알라닌, Pro P 프롤린, His H 히스티딘, Gly G 글리신, Lys K 라이신, Ala A 알라닌, Arg R 아르기닌, Cys C 시스테인, Trp W 트립토판, Val V 발린, Gln Q 글루타민, Met M 메티오닌, Asn N 아스파라긴이다. 아미노산 서열내 특정 위치의 아미노산은 이의 3문자 약어 및 번호로 기재된다. 따라서, Ser172는 서열번호 1 내의 아미노산 위치 172번의 세린 잔기를 의미한다. 상이한 아미노산으로의 치환은 해당 위치를 나타내는 번호 다음에 3문자 약어를 부가하여 기재한다. 예를 들면, "Ser172Ala"은 서열번호 3 내의 172번 위치의 Ser의 Ala로의 치환을 의미한다.
트립신 변이체의 "증강된 절단 부위 특이성"이란 용어는 가수분해적 절단에 대한 특이성의 이동을 의미하는 것으로, 변이체에 있어 이러한 이동은 라이신이 아니라 아르기닌의 카복실 그룹에서의 절단이 선호되도록 유도한다.
트립신 활성을 정량하는 경우, 본원 명세서는 "유닛(unit)"(U)을 언급한다. 트립신 및 이의 변이체의 단백질분해 활성은 기질 크로모자임(Chromozym) TRY, 크로모자임 TH 및 크로모자임 PL (Roche Diagnostics GmbH)을 사용한 광도측정 검정을 사용하여 정량한다. 소정의 제제의 "특이적 단백질분해 활성" 또는 "특이적 활성"은 실시예 9에서 기술된 방법에 의해 측정된, 당해 제제 중 단백질 mg당 유닛의 수로서 정의된다.
"메탄올자화 효모(methylotrophic yeast)"는 메탄올을 탄소원으로서 사용할 수 있는 효모로서 정의된다. 당해 용어는 또한 이의 실험실 균주를 포함한다. 메탄올자화 효모 균주가 영양요구성인 경우, 예를 들면 히스티딘과 같은 아미노산을 충분량으로 합성할 수 없는 메탄올자화 효모 균주의 경우에 보조적 탄소 함유 물질이 보충될 필요가 있기 때문에 이러한 보조 물질은 영양소로서 간주되며 탄소원으로서 간주되지 않는다.
"벡터"는 예를 들면, 파아지 및 플라스미드를 포괄하여, 본 발명의 DNA 단편을 포함, 즉 운반 및 유지시킬 수 있는 DNA로서 정의된다. 당해 용어는 유전공학 분야의 숙련가에 의해 이해되고 있다. "발현 카셋트"란 용어는 프로모터 및 터미네이터에 작동적으로 연결된, 프리-단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 발현 카셋트를 함유하는 벡터의 경우, "벡터" 및 "발현 벡터"란 용어들은 동의어로서 사용된다.
"올리고뉴클레오타이드"란 용어는 길이가 100개 뉴클레오타이드 미만인 핵산 분자, DNA (또는 RNA)에 대해 사용된다.
"형질전환"은 DNA를 유기체, 즉 숙주 유기체 내로 도입시켜 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합에 의해 복제될 수 있도록 함을 의미한다.
"발현"이란 용어 및 "발현시키다"란 동사는 숙주 유기체 내에서의 DNA 서열의 전사 및/또는 프리-단백질을 초래하는 전사된 mRNA의 해독을 의미하는 것으로, 즉 해독후 과정을 포함하지 않는다.
뉴클레오타이드 서열은, 핵산 또는 이의 상보체의 적어도 일부분이 직접 해독되어 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열을 제공할 수 있는 경우 또는 분리된 핵산이 단독으로 또는 발현 벡터의 일부분으로서 사용되어 시험관내, 원핵성 숙주 세포 또는 진핵성 숙주 세포내에서 펩타이드 또는 단백질을 발현시킬 수 있는 경우에 펩타이드 또는 단백질을 "암호화"하는 것이다.
"프로모터"는 전사를 자극하는 조절성 뉴클레오타이드 서열이다. 당해 용어는 유전공학 분야의 숙련가에게 이해되고 있다. 프로모터와 마찬가지로, "프로모 터 요소"는 전사를 자극하지만, 거대 프로모터 서열의 하위-단편(sub-fragment)을 구성하지는 않는다.
"작동적으로 연결된"이란 용어는 한 핵산 단편의 기능이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받도록 하는, 단일 벡터상에서의 2개 이상의 핵산 단편의 연합을 의미한다. 예를 들면, 프로모터는 이것이 암호화 서열, 즉 단백질 또는 프리-단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 경우 당해 암호화 서열과 작동적으로 연결된 것이며, 즉 암호화 서열은 프로모터의 전사적 제어하에 있게 된다.
"폴리펩타이드" 또는 단백질이란 용어는 펩타이드 결합에 의해 연결된 90개 초과의 아미노산 단량체로 이루어진 중합체를 의미한다. "펩타이드"란 용어는 펩타이드 결합에 의해 연결된 90개 이하의 아미노산 단량체로 이루어진 올리고머를 의미한다. "펩타이드 결합"은 한 아미노산의 α-아미노 그룹이 다른 아미노산의 α-카복실 그룹에 연결되는, 두 아미노산 간의 공유결합이다.
"프로-단백질", "프로-단백질 형태", "지모겐", "트립시노겐", "프리-단백질" 또는 "프리-프로-단백질"이란 용어는 성숙한 단백질의 전구체인 1차적 전사 산물을 의미하는데, 즉, 이러한 경우에 단백질은 프리-단백질의 해독후 프로세싱으로부터 생성된다.
"해독후 프로세싱"이란 용어는 세포내 구획 또는 세포외 구획 내에서 성숙한 단백질을 생성하기 위해 프리-단백질 또는 프리-프로 단백질이 겪게되는 변형 단계를 의미한다.
"시그날 펩타이드"는 분비성 단백질의 프리-단백질 또는 프리-프로 단백질 형태 내에 존재하는 아미노산의 절단가능한 시그날 서열이다. 세포 막을 가로질러 수송되는 즉 "분비되는" 단백질은 전형적으로 소수성 아미노산이 풍부한, 전형적으로 약 15개 내지 30개 아미노산 길이의 N-말단 서열을 갖는다. 때때로 막을 통과하는 과정 동안에 시그날 서열은 시그날 펩타티다제에 의해 절단된다[참조: Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (eds), Molecular Biology of the Cell, fourth edition, 2002, Garland Science Publishing]. 시그날 펩타이드의 많은 공급원은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 등으로부터의 α-인자 시그날 펩타이드의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 예는 서열번호 5, 1 내지 16번 위치에 따른 천연 돼지 췌장 트립시노겐 프리-단백질의 돼지 시그날 펩타이드이다. 일반적으로, 필수적으로 임의의 분비성 단백질의 N-말단에 있는 프리-단백질은 본 발명에서 사용하기에 적합한 시그날 펩타이드의 잠재적 공급원이다. 시그날 펩타이드는 또한 프리-단백질을 제1 및 제2 세포내 구획으로 지시하는 2개의 시그날 펩타이드를 포함하여 양분될 수 있다. 양분 시그날 펩타이드는 분비 경로의 과정 동안에 단계적으로 절단된다. 이의 구체적 예는 사카로마이세스 세레비지애로부터의 α-인자의 프리프로 펩타이드이다[참조: Waters et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 6209-14].
N-말단 시그날 펩타이드를 갖는 프리-단백질은 "분비 경로"로 진입하도록 지시된다. 분비 경로는 해독후 프로세싱 과정을 포함하고 마지막에는 단백질의 분비 를 초래한다. 글리코실화 및 디설파이드 결합의 형성은 분비 전의 분비 경로의 일부분인 과정이다. 본원 명세서에서, 메탄올자화 효모 균주에 의해 분비되는 단백질은 분비 경로를 통과하였다는 것이 이해된다.
모든 트립신-유사 세린 프로테아제는 염기성 잔기, 라이신 또는 아르기닌에 대한 기질 선호성을 공유한다. 사람 췌장 트립신의 190번 위치에 상응하는 세린에서의 아미노산 교환 돌연변이는 인공 기질에 관한 특이성에서의 목적하는 이동을 유도하는 반면, 단백질분해 활성의 감소라는 결과가 초래된다.
또한, 사람 트립신 돌연변이체를 평가한 결과, 인공 기질을 사용하였을 때 관찰된 아르기닌 잔기로의 특이성의 이동은 프리-프로 인슐린 프로세싱으로 지정될 수 없음이 밝혀졌다. 실시예 1은 사람 세린190알라닌 트립신 돌연변이체를 이용한 프리-프로-인슐린의 전환을 예시한다. 많은 양의 부산물, 주로 B30-des-Thr- 및 A0-성분이 반응 동안 형성된다.
이러한 효과가 모든 트립신-유사 세린 프로테아제에 어느 정도까지 적용될 수 있는지는 제시된 바 없다. 이러한 의문을 해명하는 한가지 방법은, Ser-Ala 교환 돌연변이를, 사람 췌장 트립신 동종형 I의 190번 위치에 상응하는 각각의 폴리펩타이드 서열 내의 부위에서 다른 포유동물 트립신 종의 아미노산 서열 내로 도입시키는 것이다. 이렇게 함으로써, 본 발명자들은 놀랍게도, 돼지 췌장 트립신에서의 이러한 교환 돌연변이가 프리-프로 인슐린 프로세싱 동안 아르기닌에 대한 절단 부위 선택성을 증가시키고 동시에 보다 높은 수준의 단백질분해 활성을 유지시킨다는 것을 발견하였다.
당업자는 단백질 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환시키는 방법을 잘 인지하고 있다. 실시예 2는 아미노산 교환 돌연변이체를 암호화 DNA 서열의 수준에서 조작할 수 있는 방법을 예시한다. 그러나, 다른 방법도 가능하다. 본원 발명에서, 서열번호 4에 기재된 돼지 췌장 트립신의 Ser172Ala 돌연변이체를 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열을 미생물 숙주 유기체에서 발현시켰다.
트립신 변이체는 바람직하게는 세균 및 진균과 같은 미생물 숙주 유기체에서 이종 단백질로서 생산된다. 당업자는 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli), 바실러스(Bacillus) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 종과 같은 다양한 진핵성 숙주용으로 존재하는 세균 발현 시스템을 잘 인지하고 있다. 보다 더욱 바람직한 미생물 숙주 유기체는 진균이다. 바람직한 진균 속의 예는 아스퍼길루스(Aspergillus)이다. 보다 더욱더 바람직한 것은 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속의 종들과 같은 효모 종이다. 하지만, 더욱 바람직한 것은 메탄올자화 효모 종의 균주이다.
메탄올자화 효모는 메탄올 이용을 위한 생화학적 경로를 갖고 있으며 세포 형태 및 성장 특징에 근거하여 4가지 속으로 분류된다: 한세눌라, 피치아, 칸디다 및 토룰로프시스. 가장 고도로 발달된 메탄올자화 숙주 시스템은 피치아 파스토리스(코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris)) 및 한세눌라 폴리모르파(피치아 안구스타(Phichia angusta))를 사용한다.
효모에서의 이종 단백질의 발현은 US　5,618,676, US　5,854,018, US　5,856,123, 및 US　5,919,651에 기재되어 있다.
효모 유기체는 세포내에서 합성되지만 세포 외부에서 작용하는 다수의 단백질을 생산한다. 이들 세포외 단백질은 분비성 단백질로서 언급된다. 초기에, 분비성 단백질은, 발현된 산물이 소포체의 막을 가로질러 세포의 분비 경로로 효과적으로 지시되도록 함을 보장하는 N-말단 시그날 펩타이드를 함유하는 전구체, 프리-단백질 또는 프리-프로-단백질의 형태로서 세포 내부에서 발현된다. 시그날 펩타이드는 일반적으로 위치이동 중에 목적 산물로부터 절단된다. 절단은 시그날 펩티다제에 의해 단백질분해적으로 일어난다. 시그날 펩타이드의 아미노산의 특정 하위-서열은 시그날 펩티다제에 의해 인식되어 절단된다. 이러한 하위-서열은 시그날 펩티다제 절단 부위로서 언급된다. 일단 분비 경로내로 진입하면, 단백질은 골지체로 수송된다. 이 골지체로부터 단백질이 원형질, 라이소좀 및 분비 소포로 분배된다.
분비성 단백질은 세포내 단백질과 대조적으로 상이한 환경 조건에 직면해 있다. 분비 경로의 과정의 일부분은 성숙화되는 세포외 단백질을 안정화시키기 위한 것이다. 따라서, 효모의 분비 경로를 통과하는 프리-단백질은 특이적 해독후 프로세싱을 겪게 된다. 예를 들면, 프로세싱은 세포간 가교결합을 형성하는 디설파이드 결합의 생성을 포함할 수 있다. 또한, 단백질의 특정 아미노산은 글리코실화될 수 있다.
효모에 대해 이종성인 단백질의 효모내 발현 및 분비를 위한 몇가지 접근법이 제시된 바 있다. EP　0　116　201에는 효모에 대해 이종성인 단백질이 목적 단백질, 시그날 펩타이드 및 시그날 펩티다제 절단 부위로서 작용하는 펩타이드를 암호화하는 DNA를 보유한 발현 벡터에 의해 형질전환되도록 하는 과정이 기재되어 있다. 형질전환된 유기체의 배양물을 제조하고 성장시키고, 단백질을 배양 배지로부터 회수한다. 효모 세포에서 사용하기에 적합한 시그날 펩티드는 사카로마이세스 세레비지애로부터의 α-인자 시그날 펩타이드이다(US　4,870,008).
분비 동안, 효모 효소 KEX-2는 프리-단백질 내에서 이의 절단 부위로서의 라이신-아르기닌 서열을 인식하는 시그날 펩티다제이다. KEX-2는 목적 단백질의 서열에 대한 접합부를 절단한다. 그 결과, 목적 유전자 산물이 방출되고 리더(leader) 부위, 즉 프리-단백질의 시그날 펩타이드가 분리된다. KEX-2 엔도프로테아제는 사카로마이세스 효모에서 최초로 특성 규명되었으며, 사카로마이세스 효모에서 KEX-2 엔도프로테아제는 교배형(mating type) α-인자 및 치사 인자(killer factor)의 전구체를 특이적으로 프로세싱한다[참조: Julius, D., et al., Cell 37 (1984) 1075-1089]. 피치아 파스토리스와 같은 메탄올자화 효모 종은 사카로마이세스 세레비지애와 함께 KEX-2-형 프로테아제를(유사한 역할 및 기능)을 공유한다[참조: Werten, M.W., et al., 효모 15 (1999) 1087-1096].
높은 수준의 재조합 단백질 발현을 위한 숙주로서 기술된 널리 확립된 메탄올자화 효모 종은 피치아 파스토리스[참조: US　4,683,293, US　4,808,537, US　4,812,405, US　4,818,700, US　4,837,148, US　4,855,231, US　4,857,467, US　4,879,231, US　4,882,279, US　4,885,242, US　4,895,800, US　4,929,555, US　5,002,876, US　5,004,688, US　5,032,516, US　5,122,465, US　5,135,868, US　5,166,329, WO　00/56903]이다. 글루코스의 부재하에, 피치아 파스토리스는 탄소원으로서 메탄올을 사용하는데, 이것이 메탄올자화 유기체의 특징이다. 서열번호 7에 기재된 알코올 옥시다제(AOX1) 프로모터는 메탄올 대사작용의 제1 단계를 촉매하는 알코올 옥시다제의 발현을 제어한다. 전형적으로, 메탄올-유도된 세포내의 전체 가용성 단백질의 30%가 알코올 옥시다제이다. 몇몇 피치아 발현 벡터는 AOX1 프로모터를 보유하며, 메탄올을 사용하여 목적 이종성 단백질의 고수준 발현을 유도한다. 발현 작제물은 또한 피치아 파스토리스 게놈내로 통합되어, 형질전환된 유전적으로 안정한 숙주를 생성시킨다.
시그날 펩타이드 또는 시그날 펩타이드와 시그날 펩티다제 절단 부위, 및 목적 단백질를 포함하는 이종성 프리-단백질을 암호화하는 발현 벡터를 사용함으로써, 피치아 파스토리스 균주와 같은 메탄올자화 효모를 조작하여 분비된 단백질이 정제될 수 있는 성장 배지내로 목적 단백질이 분비되도록 조작할 수 있다.
실질적으로 상이한 코돈 용법(condon usage)를 지니는 프리-단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 생산하는 것이 유리할 수 있다. 코돈은, 특정 코돈이 특정 효모 발현 숙주에 의해 이용되는 빈도에 따라서 프리-단백질의 발현이 당해 숙주에서 일어나는 속도를 증가시키는 것으로 선택할 수 있다. 아미노산 서열을 변경시키지 않으면서 프리-단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 실질적으로 변경시키는 다른 이유는 보다 바람직한 특성, 예를 들면, 천연 발생 서열로부터 생산된 전사체보다 긴 반감기를 갖는 RNA 전사체의 생산을 포함한다.
실시예 3은 트립신 변이체를 암호화하는 발현 벡터를 제공하기 위한 클로닝 단계를 예시한다. 발현에 적격한(competent), 예를 들면, 프로모터 또는 프로모터 요소 및 터미네이터 또는 터미네이터 요소 뿐만 아니라 효율적 해독에 요구되는 서열에 작동적으로 연결된 프리-단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 사용함으로써, 숙주 유기체를 당해 벡터로 형질전환시키고, 형질전환체를 선별한다.
한편, 발현 수율은 사카로마이세스 세레비지애로부터의 α-인자 시그날 펩타이드 또는 천연 돼지 췌장 트립시노겐의 돼지 시그날 펩타이드와 같은 시그날 펩타이드에 의한 목적 단백질의 적절한 표적화(예를 들면, 분비 경로로의 표적화)에 의존적이다. 실시예 4는 형질전환된 미생물 숙주를 제공하고, 실시예 5는 트립신 변이체의 발현이 어느 정도로 성취될 수 있는가를 보여준다. 따라서, 1차 해독 산물은 폴리펩타이드를 분비 경로로 지시하는 시그날 펩타이드를 포함한다. 실시예 6은 형질전환된 메탄올자화 효모의 상청액 중에서의 트립신 활성의 측정을 예시한다.
다른 한편, 발현 수율은 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 용량을 증가시킴으로써 증가시킬 수 있다. 따라서, 숙주 유기체내 발현 벡터 또는 발현 카셋트인 발현 작제물의 카피수를 증폭시킨다. 이를 달성하는 한 방법은 목적 단백질을 암호화하는 발현 벡터의 다중 형질전환에 의한 것이다. 다른 방법은 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 제1 및 제2 발현 벡터를 사용하여 숙주 유기체 내로 도입시키는 것이며, 이때 상기 제2 발현 벡터는 제1 발현 벡터에서 사용된 선별가능한 마커와 상이한 선별가능한 마커에 기초한다. 숙주 유기체가 제1 발현 벡터의 다수의 카피를 이미 보유한 경우에는, 동일한 목적 단백질을 암호화하는 제2 발현 벡터라도 도입시킬 수 있다[참조: US　5,324,639; Thill, G.P., et al., Positive and Negative Effects of Multi-Copy Integrated Expression in Pichia pastoris, International Symposium on the Genentics of Microorganisms 2 (1990), pp. 477-490; Vedvick, T., et al., J. Ind. Microbiol. 7 (1991) 197-201; Werten, M.W., et al., Yeast 15 (1999) 1087-1096]. 실시예 7은 산업적 규모에서의 생산을 위한 효모 클론을 제공하기 위해 트립신 변이체의 발현 수율을 어떻게 증가시킬 수 있는가를 기술한다.
형질전환체는 성장 배지내로 분비된 재조합 단백질의 수율과 관련하여 반복적으로 분석한다. 가장 높은 양의 효소적 활성 재조합 단백질을 분비하는 형질전환체를 선별한다.
돼지 트립신 변이체의 성장 배지로의 분비는 성숙한 재조합 단백질을 세포질외 공간으로 지시하고, 재조합 단백질은 이 공간으로부터 성장 배지로 확산된다. 액체 배지에서 성장된 형질전환된 메탄올자화 효모는 재조합 돼지 췌장 트립신 변이체를 액체 성장 배지, 즉 액체 배양 배지로 분비한다. 이는, 예를 들면 여과 기술을 사용하여 재조합 단백질로부터 효모 바이오매스(biomass)를 효율적으로 분리시킬 수 있게 한다. 그 결과, 이러한 공급원으로부터 정제된 재조합 돼지 트립신 변이체는 리보뉴클레아제 또는 기타 (비-트립신) 프로테아제 활성과 같은 기타 효소 활성으로부터 매우 효율적으로 분리된다.
따라서, 본 발명의 첫번째 바람직한 양태는 트립신 활성을 갖는 돼지 췌장 트립신 변이체를 형성하는 아미노산 치환에 의한, 172번 위치(서열번호 1에 따른 돼지 췌장 트립신 동종형 I의 N-말단으로부터 번호를 매김)에서 아미노산 잔기 세린이 아미노산 알라닌으로 치환된 돼지 췌장 트립신 동종형 I의 변이체이다.
바람직하게는, 돼지 췌장 트립신의 변이체는 아미노산 라이신의 카복실 그룹에서의 가수분해성 절단보다 아미노산 아르기닌의 카복실 그룹에서의 가수분해성 절단에 대해 증가된 절단 부위 선택성을 갖는다.
보다 바람직하게는, 분리된 변이체는 인슐린 전구체 폴리펩타이드 또는 이의 유사체가 기질로서 사용되는 경우 증가된 선택성을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 돼지 트립신 변이체의 특이적 단백질분해 활성은 야생형 돼지 췌장 트립신과 비교해 100%이다. 따라서, 동등한 조건하에 생산 및 정제하는 경우 재조합 돼지 췌장 트립신 변이체의 특이적 트립신 활성은 변화되지 않은, 즉 야생형인 돼지 췌장 트립신과 비교해 100%이다.
본 발명의 다른 바람직한 양태는 (a) 돼지 췌장 트립신의 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 단계, (b) 미생물 숙주 균주를 상기 벡터로 형질전환시키는 단계, (c) 형질전환된 미생물 숙주 균주를 영양소를 함유하는 성장 배지에서 배양하여, 당해 미생물 숙주 균주가 재조합 돼지 췌장 트립신의 변이체를 발현하도록 하는 단계 및 (d) 미생물 숙주 균주 및/또는 성장 배지로부터 재조합 돼지 췌장 트립신의 변이체를 정제하는 단계를 포함하는, 돼지 췌장 트립신의 변이체를 생산하는 방법이다.
이종성 단백질의 해독 효율은 이종성 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 코돈을 숙주 유기체에서 선호되는 코돈에 따라서 적합화하여 개선시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에서, 재조합 돼지 췌장 트립신의 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4이다.
본 발명의 보다 더욱 바람직한 양태에서, (a) 벡터는 서열번호 6에 기재된 바와 같은, 재조합 돼지 췌장 트립시노겐과 시그날 펩타이드로 이루어진 프리-단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, (b) 미생물 숙주 균주는 메탄올자화 효모 균주이고, (c) 성장 배지는 탄소원으로서 메탄올을 함유하고, (d) 메탄올자화 효모 균주는 당해 재조합 돼지 췌장 트립신의 변이체를 발현 및 분비하고, (e) 돼지 췌장 트립신의 변이체는 성장 배지로부터 정제된다.
특별히 언급한 시그날 펩타이드 이외에 효모 유래 및 비-효모 유래의 진핵성 시그날 펩타이드를 동일한 목적으로 사용할 수 있다. 시그날 펩타이드가 시그날 펩티다제에 의해 절단될 수 없다해도, 시그날 펩티다제 절단 펩타이드를 시그날 펩타이드의 아미노산 서열과 변이체 재조합 돼지 췌장 트립신 폴리펩타이드의 아미노산 서열 사이에서 프리-단백질 아미노산 서열 내로 삽입시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 매우 바람직한 양태에서, 시그날 펩타이드는 재조합 돼지 췌장 트립시노겐의 첫번째 (N-말단) 아미노산에 인접하여 위치하는 시그날 펩티다제 절단 부위를 함유한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 프리-단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 프로모터 또는 프로모터 요소에 작동적으로 연결된다. 벡터가 메탄올자화 효모 균주내에서 에피좀으로서 복제될 수 있는 플라스미드인 것이 바람직하다. 메탄올자화 효모 균주 내에서 복제될 수 있는 인공 염색체가 당해 벡터를 함유하는 것이 또한 바람직하다. 메탄올자화 효모 균주의 염색체가 벡터를 통합체로서 함유하는 것이 가장 바람직하다.
따라서, 메탄올자화 효모 균주, 특히 피치아 파스토리스 균주를 사용하는 바람직한 방법에서, 벡터는 분비 경로로 진입하는 돼지 췌장 트립시노겐 프리-단백질의 변이체의 아미노산 서열을 암호화한다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 메탄올자화 효모 균주는 한세눌라, 피치아, 칸디다 또는 토룰로프시스 종이다. 메탄올자화 효모 균주가 피치아 파스토리스, 한세눌라 폴리모르파, 칸디다 보이디니 및 토룰로프시스 글라브라타로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 매우 바람직하다. 메탄올자화 효모 균주가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) 수탁 번호 76273를 갖는 피치아 파스토리스 균주 또는 이의 유도체인 것이 보다 더욱 바람직하다.
본 발명의 다른 바람직한 양태는 서열번호 7에 따른 피치아 파스토리스 AOX1 프로모터 또는 이의 프로모터 요소에 작동적으로 연결된, 재조합 돼지 췌장 트립신의 변이체와 시그날 펩타이드로 이루어진 프리-단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 함유하는 염색체를 갖는 피치아 파스토리스이다.
당업자는 분비성 이종성 단백질이 발현 및 분비되어지는 프리-단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 카피 수가 증가되는 경우에, 액체 성장 배지와 같은 성장 배지로부터 수득될 수 있는 돼지 췌장 트립신의 변이체와 같은 분비성 이종성 단백질의 수율이 증가될 수 있음을 인지하고 있다. 따라서, 성장 배지로부터 수득될 수 있는 분비성 이종 단백질의 수율은 메탄올자화 효모 균주의 게놈내 벡터의 카피 수가 증가되는 경우에 증가될 수 있다. 예를 들면, 벡터의 반복적 형질전환 및 선별제(벡터내에 포함된 선별성 마커는 이에 대한 내성을 부여한다)의 농도를 증가시켜 사용하는 수차례의 반복적 선별에 메탄올자화 효모 균주를 적용시켜 벡터의 카피 수를 증가시킬 수 있다[참조: US　5,324,639; Thill, G.P., et al., Positive and Negative Effects of Multi-Copy Integrated Expression in Pichia pastoris, International Symposium on the Genentics of Microorganisms 2 (1990), pp. 477-490; Vedvick, T., et al., J. Ind. Microbiol. 7 (1991) 197-201].
선별성 마커의 예는 ZeocinTM 내성 유전자인 Sh　ble 유전자이다[참조: Drocourt, D., et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990) 4009; Carmels, T., et al., Curr. Genet. 20 (1991) 309-314]. Sh　ble 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 ZeocinTM에 강력한 친화성으로 화학량론적으로 결합한다. ZeocinTM의 결합은 이의 독성 활성을 억제함으로써 Sh　ble 유전자를 함유하는 형질전환체가 선별될 수 있게 한다. 배지 중의 선별제로서의 ZeocinTM의 농도를 증가시켜, Sh　ble 유전자를 발현하는 벡터의 카피수의 증가를 선별할 수 있음은 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 선별가능한 마커로서 Sh　ble 유전자를 갖는 벡터를 이용하여 반복적 형질전환에 의해 벡터의 다수의 카피를 함유하는 메탄올자화 효모 균주의 다수의 형질전환체를 생성시키는 것이 유리하다. 또한, 형질전환을 반복하고, 형질전환된 메탄올 자화 효모 균주에 있어, 형질전환된 메탄올자화 효모 균주가 ZeocinTM에 대한 내성 수준의 추가 증가가 더이상 수득되지 않거나 선별 배지중 ZeocinTM 농도의 추가 증가가 더이상 가능하지 않을 때까지 보다 더욱 내성인 형질전환체의 선별을 반복하는 것이 유리하다.
당업자는 크로마토그래피를 이용하는, 재조합에 의해 발현되고 분비된 돼지 췌장 트립신의 정제에 친숙하다[참조: Funakoshi, A., et al., J. Biochem. (Tokyo) 88 (1980) 1113-1138; Paudel, H.K., and Liao, T.H., J. Biol Chem. 261 (1986) 16006-16011; Nefsky, B., and Bretscher, A., Eur. J. Biochem. 179 (1989) 215-219]. 성장 배지중의 돼지 췌장 트립시노겐 변이체를 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하는 것이 바람직하다. 정제된 산물을 유도하는 하류(downstream) 프로세싱 단계가 실시예 8에 기재되어 있다. 야생형 돼지 췌장 트립신 동종형 I의 생산은 야생형 암호화 서열을 사용하여 발현 벡터를 작제한다는 점을 제외하고는 유사하게 수행하였다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 상기한 방법중 하나에 의한 돼지 췌장 트립신 동종형 I의 변이체이다. 본 발명의 다른 양태는 프리-프로-인슐린 프로세싱을 위한 돼지 췌장 트립신의 변이체의 용도이다. 상이한 프리-프로-인슐린의 효소적 절단을 위해 돼지 트립신의 Ser172Ala 변이체를 사용했을 때의 이점은 실시예 10 내지 12에 기재되어 있다. 하기 실시예, 참조문헌, 서열목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕고자 제공되며, 본 발명의 진정한 범주는 첨부된 청구의 범위에 제시된다. 제시된 방법이 본 발명의 취지에서 벗어남이 없이 변형될 수 있다는 것이 이해된다.
도 1: 사람 인슐린, 인슐린 글라진 및 인슐린 글루리신의 프리-프로-인슐린에 대한 주요 트립신 절단 부위의 도식. 검은색 삼각형은 절단 부위 산출 생성물(들)이고, 흰색 삼각형은 절단 부위 산출 부산물이다. 프리-프리-인슐린의 디설파이드 결합은 도시하지 않는다.
도 2: 재조합 야생형 사람 트립신을 이용한 프리-프로-인슐린 글라진(실시예 1).
도 3: 재조합 세린190알라닌 사람 트립신 변이체를 이용한 프리-프로-인슐린 글라진 절단 (실시예 1).
도 4: ZeocinTM에 대한 내성을 부여하는 시판되는 플라스미드 pPICZαA (Invitrogen)의 유도체인 플라스미드 pTry-Ser172Ala의 지도. 표시된 삽입체 TrySer172Ala은 Ser172Ala 아미노산 치환을 보유하고 사카로마이세스 세레비지애로부터의 α-인자 시그날 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 융합된 재조합 분비성 트립시노겐의 변이체를 암호화하는 합성 DNA 서열이다. "AOX1-Prom"는 피치아 파스토리스 AOX1 프로모터이며, "Term"은 피치아 파스토리스 AOX1 터미네이 터이다.
도 5: 천연의 재조합 돼지 트립신 (실시예 10, 표 1)을 이용한 프리-프로-인슐린 (사람 인슐린)을 도시한 것이다.
도 6: S172A 변이체 돼지 트립신 (실시예 10, 표 1)을 이용한 프리-프로-인슐린 (사람 인슐린) 절단을 도시한 것이다.
일반적으로, 하기 실시예에서는 인비트로겐(Invitrogen) 편람 "Pichia Expression Kit" Version M 011102 25-0043, "pPICZ A, B, and C" Version D 110801 25-0148, "pPICZa A, B, and C" Version E 010302 25-0150, 및 "pPIC9K" Version E 030402 25-0106에 제안되고 기술된 방법을 적용하였다. 상기 편람에 언급된 추가의 벡터, 효모 균주 및 배지를 참조한다.
기본적인 분자생물학 방법을 문헌[참조: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001]에 기재된 바와 같이 적용하였다.
HPLC 방법:
정지상: Nucleosil 120-5 C18, Macherey & Nagel, 250 x 4 mm; 이동상 A: 45 mM 인산나트륨 완충액(pH 2,5), 315 mM NaCl, 25 % (v/v) 아세토니트릴; 이동상 B: 45 mM 인산나트륨 완충액 (pH 2,5), 55 mM NaCl, 65 % (v/v) 아세토니트릴; 구배: 선형, 30분 내에 6% 상 B로부터 10% 상 B로.
하기 실시예는 본 발명을 제한함이 없이 본 발명을 설명하기 위함이다.
실시예 1: 재조합 사람 야생형 트립신 및 세린190알라닌 사람 트립신 변이체를 이용한 프리-프로-인슐린 글라진의 절단
본 실험은 8℃ 및 8.3의 pH 값(완충된 용액)에서 실시하고 최대 50mL 규모로 수행하였다.
PPI 용액을 적절한 항온 반응 용기내에 충전하고, 효소 제제를 부가하여 반응을 개시하였다. 샘플을 일정한 시간 간격 후에 취하였다; 1N 또는 2N HCl 용액에 의해 당해 샘플 용액을 산성화시켜 효소 반응을 즉시 종결시켰다. 각 생성물의 농도를 HPLC로 측정하였다.
실시예 2: 돼지 췌장 트립시노겐을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이 유발
일반적으로, 표준 분자생물학 방법을 문헌[참조: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001]에 기재된 바와 같이 적용하였다. 하기 설명된 방법은 "부위-지시된 돌연변이유발"로서도 공지된 매우 일반적인 방법의 구체적 적용이다.
돌연변이는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 부위-지시된 방식으로 생성시켰다. 목적하는 코돈, 즉 염기 트리플렛(base triplet)을 돌연변이시키기 위해, 돼지 췌장 트립시노겐을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열의 변이체 부분을 나타내는 한쌍의 상보적 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드를 고안하고 합성하 였다. 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드는 돌연변이될 트리플렛 서열을 제외하고는 서열번호 2에 기재된 서열과 동일하거나 상보적이였다. 전형적으로, DNA 올리고뉴클레오타이드는 약 20 내지 45개 뉴클레오타이드의 길이였으며; 돌연변이될 트리플렛 서열 또는 이의 상보체는 이를 포함하는 DNA 올리고뉴클레오타이드의 중심 부분에 위치하였으며, 양 측면에 약 10 내지 12개의 뉴클레오타이드가 접해있었다. DNA 올리고뉴클레오타이드를, 당해 DNA 올리고뉴클레오타이드가 '야생형' 재조합 돼지 췌장 트립시노겐 DNA(서열번호 2에 따름)에 하이브리드화하면 각 DNA 올리고뉴클레오타이드의 5' 및 3' 말단을 포함하는, 중심 미스매치(mismatch)를 갖지만 미스매치의 양측면에서 온전한 염기쌍 형성을 하는 하이브리드가 생성되도록 고안하였다.
추가로, "5' 트립신"으로 명명된 첫번째 프라이머(서열번호 8)이 서열번호 2의 5'-말단의 9개 뉴클레오타이드를 포함하고 "3' 트립신"으로 명명된 두번째 프라이머(서열번호 9)가 서열번호 2의 3'-말단의 12개 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 포함하는 2개의 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 제공하였다. 이들 두 프라이머는 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 포함하도록 고안하였다. 따라서, 첫번째 및 두번째 프라이머는 신장되었으며 서열번호 2의 합성 뉴클레오타이드 서열의 양측면에 있는 인접 서열을 포함하였다. "5' 트립신"은 EcoRI 및 3' Xba　I 부위를 함유하였다.
아미노산 치환에 의한, 야생형의 성숙한 돼지 췌장 트립신 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 수회의 PCR-기반 단계를 사용하여 합성하였 다.
첫번째 및 두번째 PCR을 벡터내에 삽입체로서 존재하는 서열번호 2에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이중가닥 DNA를 주형으로서 사용하여 수행하였다. 상기 삽입체의 양측면에 있는 벡터 서열은 PCR 동안에 프라이머 "5' 트립신" 및 "3' 트립신"이 어닐링되는 경우에 완벽하게 매치되도록 하였다. 첫번째 PCR은 "5' 트립신" 프라이머와 돌연변이된, 즉 변이체 트리플렛 서열을 포함하는 첫번째 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 한 쌍의 프라이머를 사용하여 수행하여, 두 프라이머가 맞은편 주형 DNA 가닥에 어닐링되도록 하였다. 따라서, 두번째 PCR은 "3' 트립신" 프라이머와 첫번째 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 두번째 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행하였다. 그 결과, 첫번째 및 두번째 PCR은 2개의 중간체 산물, 즉 재조합 돼지 췌장 트립신의 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 5' 및 3' 부분을 생성시켰으며, 이때 5'부분은 이의 3' 말단에 돌연변이된 서열을 보유하고, 반대로 3' 부분은 이의 5' 말단에 돌연변이된 서열을 보유하였다.
수득된 2가지 중간체 증폭 산물을 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하고, 목적 단편을 잘라내고, DNA를 "QIAquick Gel Extraction Kit"(Qiagen, 카탈로그 번호 28704)를 사용하여 아가로오스 블록으로부터 분리시켰다.
2개의 부분을 융합시키기 위해, 후속적으로 세번째 PCR을 수행하였다. 이를 위해, 2개의 부분을 단일 PCR에서 하나로 결합시키고, 다섯번째 PCR 사이클을 어떠한 추가의 상류 및 하류 프라이머도 부가하지 않고 수행하였다. 이러한 사이클 동 안에 전체길이 생성물은 거의 형성되지 않았고, 사용된 어닐링 온도는 5' 부분 및 3' 부분의 중복 서열로부터 계산하였다. 이어서, 프라이머 "5' 트립신" 및 "3' 트립신"을 부가하고 25회의 PCR 사이클을 추가로 수행하였고, 이때 사용된 어닐링 온도는 낮은 융점을 갖는 부가된 프라이머에 상응하였다.
그 다음, 돌연변이된 전체길이 DNA 단편을 "PCR 클로닝 키트 - 평활 말단"(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim; 카탈로그 번호 1　939　645)을 사용하여 클로닝 벡터내로 삽입하였다. DNA 단편을 제한 효소 분석 및 서열분석으로 확인하였다. 이어서, 확인된 DNA 단편을 Xho　I 및 Not　I를 이용한 절단에 의해 잘라내고, 동일한 제한 효소로 절단된 피치아 파스토리스 발현 벡터내로 삽입시켰다(실시예 3 및 실시예 5 참조).
Ser172Ala: 서열번호 2 내의 528번 내지 531번 위치에서 발견된 염기 트리플렛 "TCT"를 "GCT"로 치환시켰다. 이를 위해, 첫번째 PCR에서 DNA 올리고뉴클레오타이드 "5-Try-Ser172Ala"(서열번호 10)를 "3' 트립신"과 함께 프라이머로서 사용하고, 두번째 PCR에서는 "Try-Ser172Ala"(서열번호 11)를 "5' 트립신"과 함께 프라이머로서 사용하였다. 전체길이 산물을 생성시키기 위해, 분리된 중간체 단편을 후속적으로 세번째 PCR을 위해 사용하였다.
실시예 3: pPICZαA-유래의 발현 벡터에서의 변이체 재조합 돼지 췌장 트립시노겐을 암호화하는 인공 DNA의 클로닝
PCR 단편(실시예 2 참조)으로부터 생성된 변이체 재조합 돼지 췌장 트립시노 겐을 암호화하는 DNA 단편을 EcoRI 및 XbaII(Roche Diagnostics GmbH)를 이용하여 잘라냈다. 단편을 제조업자의 지침에 따라서 "QIAquick Gel Extraction Kit"를 사용하여 분리시켰다.
상기 단편을 pPICZαA 벡터에 연결시켜, 변이체 재조합 돼지 췌장 트립시노겐을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사카로마이세스 세레비지애로부터의 α-인자 시그날 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 융합시켰다. 이러한 연결 반응 전에, 벡터는 EcoRI 및 XbaI를 이용하여 유사하게 절단하고 분리시켰다.
클로닝 과정 후에 변이체 재조합 돼지 췌장 트립시노겐을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사카로마이세스 세레비지애로부터의 α-인자 시그날 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 다음에 프레임내(in frame)에서 직접적으로 삽입시켰다.
서열번호 6에 기재된 재조합 프리-프로단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 피. 파스토리스 AOX-1 프로모터(서열번호 7)의 제어하에 있으며, 당해 프로모터는 예를 들면 피치아 파스토리 내에서 메탄올에 의해 유도될 수 있다.
10㎕의 전체 용적 중에서 선형화된 벡터 단편 20ng(1㎕ 용적 중), 절단된 PCR 단편 100ng(3㎕ 중)을 연결시키고 T4 DNA 리가제(Roche Diagnostics GmbH)의 존재하에 제조업자의 지침에 따라서 16℃에서 밤새 항온처리하여 작제를 달성하였다. 이어서, 연결 제제 5㎕를 사용하여 205㎕의 전체 용적으로 적격 이. 콜라이 XL1Blue 세포(Stratagene)를 형질전환시켰다. 빙사에서 30분 동안 항온처리한 후, 세포에 42℃에서 90초 동안 열 충격을 가하였다. 이어서, 세포를 1　ml LB 배지로 옮기고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하여 선별 마커가 발현될 수 있게 하였다. 이후에 분취액을 100㎍/ml ZeocinTM을 함유하는 LB 플레이트에 플레이팅하고 37℃에서 15시간 동안 항온처리하였다. 내성 클론을 선택하고, 플라스미드를 분리시키고[참조: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001], 제한 분석과 서열 분석으로 시험하였다. 작제 클론을 오류가 없는지를 확인하고, 클로닝 인공물을 선별하였다. 사카로마이세스 세레비지애로부터의 α-인자 시그날 펩타이드를 갖는 변이체 재조합 돼지 췌장 트립신을 보유한 발현 벡터를 pTry-Ser172Ala라 명명하였다.
실시예 4: pPICZαA 유래의 pTry-Ser172Ala 발현 벡터를 이용한 피치아 파스토리스의 형질전환
사용된 숙주 균주는 피치아 파스토리스 X-33, GS115, KM71H 및 SMD1168 (Invitrogen)이었다. 바람직한 균주는 X-33 및 KM71H였다. 형질전환은 숙주 유기체의 게놈 내로 발현 작제물을 안정하게 통합시키는 것을 목표로 하였다.
먼저, 5　ml YPD 배지(YPD　= 효모 펩톤 덱스트로스; Invitrogen)를 피. 파스토리스 콜로니와 함께 항온처리하고, 진탕기상에서 30℃에서 밤새 사전배양하였다. 형질전환-적격 세포를 제조하기 위해, 사전배양물 100㎕를 접종물로서 신선한 YPD 배지 200　ml에 부가하고 OD600nm가 1.3 내지 1.5에 도달할 때까지 성장시켰다. 세포를 5분 동안 1,500　x　g로 원심분리하고 200　ml 빙냉(0℃) 멸균수에 재현탁시켰다. 세포를 다시 5분 동안 1,500　x　g로 원심분리하고 100　ml 빙냉 멸균수에 재현탁시켰다. 세포를 다시 한번 5분 동안 1,500　x　g로 원심분리하고 10　ml 빙냉 1M 소르비톨(ICN)에 재현탁시켰다. 이러한 방식으로 제조된 세포를 빙상에서 보관하고 형질전환을 위해 즉시 사용하였다.
형질전환을 위해 사용될 pPICZαA 유래의 pTrySer172Ala 발현 벡터를 Sac　I 제한 엔도뉴클레아제(Roche Diagnostics GmbH)를 사용하여 선형화시키고, 침전시키고, 물 속에 재현탁시켰다. "Gene Pulser IITM"(BioRad)을 사용하여 전기천공시켜 형질전환시켰다. 형질전환 준비를 위해, 1M 소르비톨 용액 중의 피. 파스토리스 세포 80㎕를 선형화된 발현 벡터 DNA 1㎍와 온화하게 혼합하고 빙냉 큐벳으로 옮긴 다음, 이를 빙상에서 5분 동안 유지시켰다. 이어서, 상기 큐벳을 Gene Pulser로 옮겼다. 전기천공 파라메터는 1㎸, 1㏀ 및 25㎌였다. 전기천공 후, 1M 소르비톨 용액 1ml를 세포 현탁액에 부가한 다음, 100㎍/ml ZeocinTM (Invitrogen)을 함유하는 YPDS 플레이트(YPDS　= 효모 펩톤 덱스트로스 소르비톨; Invitrogen)로 플레이팅하였으며, 이때 단일 플레이트마다 세포 현탁액 100 내지 150㎕을 도말하였다. YPDS 플레이트를 30℃에서 2 내지 4일 동안 항온처리하였다. 효모 클론을 격자상 최소 덱스트로스 플레이트로 옮겼다. 상기 플레이트로부터의 콜로니를 선택하고 멸균수에 개별적으로 재현탁시켰다. 세포를 30℃에서 1시간 동안 17.5 유닛의 라이티카제(Roche Diagnostics GmbH)로 분해시키고 이후에 -80℃에서 10분 동안 동결시켰다. PCR에 의해, 각각의 pPICZαA 유래의 pTrySer172Ala 발현 벡터의 발현 카 셋트의 존재를 확인하였다. "발현 카셋트"란 용어는 AOX1 프로모터 및 AOX1 터미네이터에 작동적으로 연결된 변이체 재조합 돼지 췌장 트립신 프리-단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 당해 발현 카셋트는 형질전환을 위해 사용된 각각의 pPICZαA-벡터로부터 유래된다. 발현 카셋트를 함유하는 벡터의 경우, "벡터" 및 "발현 벡터"란 용어들은 동의어이다.
양성 클론, 즉 게놈내로 안정적으로 통합된 완전한 발현 카셋트의 존재에 대해 양성인 것으로 판정된 클론을 변이체 재조합 돼지 췌장 트립신 발현의 추가 규명을 위해 사용하였다.
부가적으로, 본래의 pPICZαA 벡터를 사용하여 수용주 피치아 파스토리스 KM71H 균주를 이용하여 대조 형질전환을 실시하였다. 양성 클론을 수득하고 유사한 방식으로 확인하였다.
실시예 5: 변이체 재조합 돼지 췌장 트립시노겐의 발현 및 분비
pPICZαA-pTrySer172Ala 발현 벡터로 형질전환된 양성 클론(20 내지 30개)의 한 셋트를 각각 3　ml BMGY 배지(BMGY　= 완충된 글리세롤-복합 배지; Invitrogen) 중에서 진탕 배양물로서 밤새 성장시켰다. 이후에, 배양물의 OD600nm 값을, 이들 배양물을 pH　3에서 각각 10　ml BMMY 배지(Invitrogen)를 함유하는 진탕 플라스크내로 계대배양하기 전에 측정하였다. 사전배양물을 접종물로서 사용하여 각각 1의 OD600nm를 수득하였다. 배양물을 진탕기상에서 30℃에서 보관하였다. 병행하여, 양성 대조 클론을 동일한 조건하에 배양하였다.
BMMY (BMMY　= 완충된 메탄올-복합 배지) 배지는 변이체 재조합 돼지 췌장 트립시노겐을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제어하는 AOX-1 프로모터의 유도제인 메탄올(Mallinckrodt Baker B.V.)을 포함한다.
샘플 500㎕를 전체 72시간에 걸쳐서 24시간 간격으로 진탕 플라스크로부터 취하였다. 샘플 분취액을 제거하였을 때, 배양물에 0.5% 메탄올을 또한 공급하였다. 상청액 성장 배지의 샘플을 트립신 효소 활성에 대해 시험하였다.
실시예 6: 변이체 돼지 췌장 트립신의 발현의 분석
먼저, 실시예 5에서 기술한 바와 같이 수득된 샘플 분취액의 OD600nm를 측정하였다. 이어서, 세포를 원심분리하여 펠렛화하고 상청액을 모았다. 트립신 활성을 비희석된 상청액 뿐만 아니라 1:10 희석액 중에서 측정하였다.
pPICZαA 벡터로 형질전환시킨 대조 클론은 배지 중에서 어떠한 측정가능한 트립신 활성도 유도하지 못한 반면, pPICZαA-pTrySer172Ala 발현 벡터로 형질전환된 피치아 균주는 성장 배지, 즉 배양 배지로 분비된 각각의 재조합 돼지 췌장 트립신의 변이체로 인한 트립신 활성을 나타냈다. 따라서, 이러한 경우에 사카로마이세스 세레비지애로부터의 α-인자 시그날 펩타이드를 포함하는 재조합 프리-단백질의 발현은 단백질분해 활성을 갖는 활성 효소가 분비될 수 있게 한다고 결론내릴 수 있다.
실시예 7: 다중 형질전환 및 증가된 ZeocinTM 농도에 의한 발현 수율의 증가
상청액 배지 중에서 가장 높은 트립신 활성을 산출하는 것으로 밝혀진 pPICZαA- 및 pPICZA-유래의 pDNM 발현 벡터로 형질전환된 효모 클론을, 이전과 동일한 발현 벡터를 사용하여 반복적으로 전기천공시켰다. 전기천공의 조건은 YPDS 플레이트가 1,000 내지 2,000㎍/ml의 증가된 농도의 ZeocinTM을 함유하였다는 점을 제외하고는 실시예 4에 기술된 바와 같았다. 게놈내에 각각의 발현 벡터의 다수의 카피가 혼입되어진 형질전환체를 선별하기 위해 항생제의 농도를 증가시켰다. 항생제에 대해 내성이 증가된 효모 클론을 격자상 최소 덱스트로스 플레이트로 옮겼다. 실시예 5에서 이미 기술한 바와 같이 사전배양물을 개별적 효모 클론으로부터 제조하고, 실시예 6에서 기술한 바와 같이 성장 배지로 분비된 트립신 효소 활성을 측정하여 발현을 측정하였다. 개별적 클론은 증가된 양의 트립신 활성을 산출한 것으로 밝혀졌다. 평균적으로, 각각의 pPICZαA-pTry-Ser172Ala 발현 벡터로 반복적으로 형질전환된 피치아 균주의 상청액 중에서 측정된 트립신 활성은 오직 1회만 형질전환된 각각의 전구체 균주와 비교해서 2배 내지 3배 높았다.
실시예 8:
액체 배양 상청액으로부터의 돼지 췌장 트립시노겐의 정제 및 트립신 변이체를 형성하기 위한 활성화
전체 배양 브로쓰를 5 내지 30mM 염화칼슘을 함유하는 암모늄 아세테이트 완 충액(5 내지 20mM)(pH 3.5)으로 약 1:2 내지 1:4의 비율로 희석시켰다. 트립시노겐 변이체를 양이온 교환기(예: Streamline® SP, XL)를 사용하여 팽창층(expanded bed) 크로마토그래피[참조: McCornick (1993); EP 0 699 687]로 정제하였다. 추가의 정제를 충전층 컬럼(예: SP-Sepharose ® XL, ff)를 사용하여 수행하였다. 20 mM CaCl2.의 존재하에 pH를 7 내지 8로 재완충시켜 자가촉매적 활성화를 개시하였다. pH를 다시 2 내지 4의 범위로 변화시켜 활성화를 종결시켰다. 정제된 트립신은 자가단백질분해를 피하기 위해서 pH 1.5 내지 3에서 저장하였다.
실시예 9: 변이체 재조합 돼지 췌장 트립신의 특이적 트립신 활성을 측정하기 위한 검정
트립신의 활성을 25℃에서 100 mM Tris pH 8.0, 20 mM CaCl2 중에서 크로모자임 TRY(Roche Diagnostics GmbH)을 사용하여 측정하였다. 광도 측정을 405 nm에서 수행하였다. 라이신으로부터 기질 특이적 아르기닌을 구별해내기 위해, 크로모자임 TH(아르기닌 함유/Roche Diagnostics GmbH) 및 크로모자임 PL(라이신 함유/Roche Diagnostics GmbH)를 사용하였다.
실시예 10: 프리-프로-사람 인슐린의 절단
모든 실험은 8℃ 및 8.3의 pH 값(완충된 용액, 또는 NaOH 용량으로 조절함) 에서 실시하였으며 20 mL 내지 3.5 L 규모에서 수행하였다. 일부 실험에서는, 두 효소 모두를 직접 비교하기 위해서, 프리-프로-인슐린을 또한 천연의 재조합 돼지 트립신으로도 절단하였다.
PPI 용액을 적절한 항온 반응 용기내에 충전시키고, 효소 제제를 부가하여 반응을 개시하였다. 샘플을 일정한 시간 간격 후에 취하였다; 1N 또는 2N HCl 용액에 의해 당해 샘플 용액을 산성화시켜 효소 반응을 즉시 종결시켰다. 각 생성물의 농도를 HPLC로 측정하였다.
천연의 재조합 돼지 트립신 및 S172A 트립신 변이체(동일한 U/g PPI가 사용됨)를 사용한 프리-프리-인슐린(사람 인슐린) 절단 반응의 결과
규모 트립신 ∑프리-Arg-Ins [면적%] ∑Arg-Ins [면적%] des-Thr [면적%] ∑A0 화합물 [면적%] 수율 (외부 표준) [%]
3.5 L 천연 S172A 1.4 0.9 68.8 82.5 7.2 3.3 10.7 4.1 84.2 96.5
표 1에서 알 수 있는 바와 같이, S172A 트립신 변이체의 사용은 원치않는 부산물 des-Thr 및 A0-화합물의 형성을 감소시키고, 이에 따라서 유용한 Arg-인슐린(Arg-Ins)의 양 및 각각의 절단 수율을 증가시킨다.
도 5는 천연의 재조합 돼지 트립신을 이용한 프리-프로-인슐린의 절단을 도시한 것이며, 도 6은 S172A 변이체 트립신을 이용한 PPI의 전환을 도시한 것이다.
실시예 11: 프리-프로-인슐린 글라진의 절단
실시예 10의 실험 조건을 사용하였다. 두 효소 모두를 직접 비교하기 위해 프리-프로-인슐린을 또한 천연의 재조합 돼지 트립신으로도 절단하였다.
HPLC 방법: 상기 기술한 바와 같음.
표 2는 수행된 실험의 예시적 결과를 보여준다. 제시된 값은 최대 생성물 형성 값을 기록한 것이다.
천연의 재조합 트립신 및 S172A 변이체(200 U/g PPI가 사용됨)를 사용한 프리-프리-인슐린 (인슐린 글라진) 절단 반응의 결과
규모 트립신 프리-인슐린 글라진 [면적%] 인슐린 글라진 [면적%] des-Thr [면적%] ∑A0 화합물 [면적%] 수율 (외부 표준) [%]
1 L 천연 S172A 0.5 0.4 51.1 55.5 5.6 2.6 10.9 5.1 58.1 62.9
표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, S172A 트립신 변이체의 사용은 원치않는 부산물 des-Thr 및 A0-화합물의 형성을 감소시키고, 이에 따라서 인슐린 글라진의 양을 증가시킨다.
실시예 12: 프리-프로-인슐린 글루리신의 절단
실시예 10의 실험 조건을 사용하였다. 두 효소 모두를 직접 비교하기 위해 프리-프로-인슐린을 또한 천연의 재조합 돼지 트립신으로도 절단하였다.
표 3은 실험의 예시적 결과를 보여준다. 제시된 값은 최대 생성물 형성 값을 기록한 것이다.
천연의 재조합 트립신 및 S172A 트립신 변이체를 사용한 프리-프리-인슐린 (인슐린 글루리신) 절단 반응의 결과
규모 트립신 트립신 양 [U/g PPI] Arg-인슐린-글루리신 [면적%] A0-Arg-인슐린 글루리신 [면적%] 수율 (외부 표준) [%]
1 L 천연 S172A 250 250 35.8 39.2 4.7 1.2 91.6 100.0
표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, S172A 트립신 변이체의 사용은 원치않는 A0-화합물의 형성을 감소시키고, 이에 따라서 인슐린 글루리신의 양을 증가시킨다.
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Ser Gly 115 120 125 Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser 130 135 140 Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met 145 150 155 160 Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp 165 170 175 Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser 180 185 190 Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys 195 200 205 Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn 210 215 220 <210> 2 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence encoding the porcine pancreatic Trypsinogen without signal peptide and the part of the propeptide encoding the enterokinase cleavage site <400> 2 gatgatgatg ataaaattgt tggtggttat acttgtgctg ctaattctat tccatatcaa 60 gtttctttaa attctggttc tcatttttgt ggtggttctt tgattaattc tcaatgggtt 120 gtttctgctg ctcattgtta caaatcaaga atccaagtta gattgggtga acataatatt 180 gatgttttgg aaggtaatga acaatttatt aatgctgcta aaattattac tcatccaaat 240 tttaatggta atactttgga taatgatatt atgttgatta aattgtcttc tccagctact 300 ttaaattcaa gagttgctac tgtttctttg ccaagatctt gtgctgctgc tggtactgaa 360 tgtttgattt ctggttgggg taatactaaa tcttctggtt cttcttatcc atctttgttg 420 caatgtttga aagctccagt tttgtctgat tcttcttgta aatcttctta cccaggtcaa 480 attactggta atatgatttg tgttggtttt ttggaaggtg gtaaagattc ttgtcaaggt 540 gattctggtg gtccagttgt ttgtaatggt caattgcaag gtattgtttc ttggggttat 600 ggttgtgctc aaaaaaataa accaggtgtt tacactaaag tttgtaatta tgttaattgg 660 attcaacaaa ctattgctgc taattag 687 <210> 3 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: amino acid sequence of the variant porcine pancreatic Trypsin <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(223) <400> 3 Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val 1 5 10 15 Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser 20 25 30 Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val 35 40 45 Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe 50 55 60 Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr 65 70 75 80 Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu 85 90 95 Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala 100 105 110 Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly 115 120 125 Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser 130 135 140 Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met 145 150 155 160 Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp 165 170 175 Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser 180 185 190 Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys 195 200 205 Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn 210 215 220 <210> 4 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence encoding the variant of porcine pancreatic Trypsinogen without signal peptide and the part of the propeptide encoding the enterokinase cleavage site <400> 4 gatgatgatg ataaaattgt tggtggttat acttgtgctg ctaattctat tccatatcaa 60 gtttctttaa attctggttc tcatttttgt ggtggttctt tgattaattc tcaatgggtt 120 gtttctgctg ctcattgtta caaatcaaga atccaagtta gattgggtga acataatatt 180 gatgttttgg aaggtaatga acaatttatt aatgctgcta aaattattac tcatccaaat 240 tttaatggta atactttgga taatgatatt atgttgatta aattgtcttc tccagctact 300 ttaaattcaa gagttgctac tgtttctttg ccaagatctt gtgctgctgc tggtactgaa 360 tgtttgattt ctggttgggg taatactaaa tcttctggtt cttcttatcc atctttgttg 420 caatgtttga aagctccagt tttgtctgat tcttcttgta aatcttctta cccaggtcaa 480 attactggta atatgatttg tgttggtttt ttggaaggtg gtaaagatgc ttgtcaaggt 540 gattctggtg gtccagttgt ttgtaatggt caattgcaag gtattgtttc ttggggttat 600 ggttgtgctc aaaaaaataa accaggtgtt tacactaaag tttgtaatta tgttaattgg 660 attcaacaaa ctattgctgc taattag 687 <210> 5 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the mature porcine Pre-Trypsinogen <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> amino acid sequence of the signal peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (17)..(247) <223> amino acid sequence of porcine Trypsinogen <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <300> <400> 5 Ile Pro Asn Thr Phe Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ala Ala Val Ala 1 5 10 15 Phe Pro Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala 20 25 30 Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe 35 40 45 Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His 50 55 60 Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp 65 70 75 80 Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr 85 90 95 His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile 100 105 110 Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser 115 120 125 Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly 130 135 140 Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln 145 150 155 160 Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr 165 170 175 Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly 180 185 190 Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn 195 200 205 Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys 210 215 220 Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile 225 230 235 240 Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn 245 <210> 6 <211> 960 <212> DNA <213> Pichia pastoris <220> <223> Nucleotide sequence of the variant of porcine pancreatic pre-Trypsinogen <220> <221> unsure <222> (1)..(267) <223> nucleotide sequence encoding the signal peptide <220> <221> unsure <222> (268)..(960) <223> encoding the variant porcine pancreatic Trypsinogen <400> 6 atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180 aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240 tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgaa ttcgatgatg atgataaaat tgttggtggt 300 tatacttgtg ctgctaattc tattccatat caagtttctt taaattctgg ttctcatttt 360 tgtggtggtt ctttgattaa ttctcaatgg gttgtttctg ctgctcattg ttacaaatca 420 agaatccaag ttagattggg tgaacataat attgatgttt tggaaggtaa tgaacaattt 480 attaatgctg ctaaaattat tactcatcca aattttaatg gtaatacttt ggataatgat 540 attatgttga ttaaattgtc ttctccagct actttaaatt caagagttgc tactgtttct 600 ttgccaagat cttgtgctgc tgctggtact gaatgtttga tttctggttg gggtaatact 660 aaatcttctg gttcttctta tccatctttg ttgcaatgtt tgaaagctcc agttttgtct 720 gattcttctt gtaaatcttc ttacccaggt caaattactg gtaatatgat ttgtgttggt 780 tttttggaag gtggtaaaga tgcttgtcaa ggtgattctg gtggtccagt tgtttgtaat 840 ggtcaattgc aaggtattgt ttcttggggt tatggttgtg ctcaaaaaaa taaaccaggt 900 gtttacacta aagtttgtaa ttatgttaat tggattcaac aaactattgc tgctaattaa 960 <210> 7 <211> 938 <212> DNA <213> Pichia pastoris <220> <223> Nucleotice sequence of the Pichia pastoris AOX1 promoter <400> 7 agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60 gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120 tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180 agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240 acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300 tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360 agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420 gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480 ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540 cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600 ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660 ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720 gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780 atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840 actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900 caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaa 938 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer 5' -Trypsin <400> 8 gctgaagctg aattcgatga tgatg 25 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer 3'-Trypsin <400> 9 gtttttgttc tagactaatt agcagc 26 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer 5'-Try-Ser172Ala <400> 10 ggtggtaaag atgcttgtca aggtg 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer 3'-Try-Ser172Ala <400> 11 caccttgaca ggcatcttta ccacc 25

Claims (19)

  1. 인슐린, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체의 생산 방법에서의 Ser172Ala 돼지 트립신 변이체의 용도.
  2. (a) 프리-프로-인슐린, 프리-프로-인슐린 유사체 또는 프리-프로-인슐린 유도체를 Ser172Ala 돼지 트립신으로 절단하고,
    (b) 생성된 절단 산물을 분리시키고,
    (aa) 생성된 절단 산물중 하나가 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체인 경우, 당해 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체를 수득하거나, 또는
    (bb) 인슐린, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체의 전구체인 절단 산물을 추가로 프로세싱하고, 이러한 추가 프로세싱으로부터 생성된 인슐린, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체를 분리시키고 수득하는, 인슐린, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체의 생산 방법.
  3. 제2항에 있어서, 인슐린이 사람 인슐린인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 인슐린 유사체가 LysB28ProB29 사람 인슐린; B28 Asp 사람 인슐린; 위치 B28의 프롤린이 Asp, Lys, Leu, Val 또는 Ala에 의해 치환되었고 위치 B29의 Lys가 Pro에 의해 치환될 수 있는 사람 인슐린; AlaB26 사람 인슐린; des(B28-B30) 사람 인슐린; des(B27) 사람 인슐린 및 des(B30) 사람 인슐린을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 인슐린 유사체가 인슐린 글루리신(glulisine)인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 인슐린 유사체가 인슐린 글라진(glargine)인 방법.
  7. 제2항에 있어서, 인슐린 유도체가 B29-N-미리스토일-des(B30) 사람 인슐린, B29-N-팔미토일-des(B30) 사람 인슐린, B29-N-미리스토일 사람 인슐린, B29-N-팔미토일 사람 인슐린, B28-N-미리스토일 LysB28ProB29 사람 인슐린, B28-N-팔미토일-LysB28ProB29 사람 인슐린, B30-N-미리스토일-ThrB29LysB30 사람 인슐린, B30-N-팔미토일- ThrB29LysB30 사람 인슐린, B29-N-(N-팔미토일-Y-글루타밀)-des(B30) 사람 인슐린, B29-N-(N-리토콜릴-Y-글루타밀)-des(B30) 사람 인슐린, B29-N-(ω-카복시헵타데카노일)-des(B30) 사람 인슐린 및 B29-N-(ω-카복시헵타데카노일) 사람 인슐린을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  8. 제2항 내지 제5항 또는 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 인슐린, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체의 전구체인 절단 산물의 추가 프로세싱이 당해 산물을 카 복시펩티다제 B를 이용하여 절단함을 포함하는 방법.
  9. 제2항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, Ser172Ala 돼지 트립신을 이용한 절단을 7.5 내지 9.5 범위의 pH 값 및 1℃ 내지 30℃의 온도에서 수행하고, 효소 반응을 샘플을 산성화시켜 종결시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 절단을 8.3의 pH 값 및 8℃ 내지 12℃의 온도에서 수행하고, 산성화를 1N 또는 2N HCl 용액을 부가하여 실시하는 방법.
  11. 서열번호 3의 서열을 특징으로 하는 Ser172Ala 돼지 트립신.
  12. Ser172Ala 돼지 트립신을 암호화하는 DNA.
  13. 제12항에 있어서, 서열번호 4의 서열을 특징으로 하는 DNA.
  14. Ser172Ala 돼지 트립시노겐을 암호화하는 DNA.
  15. 제14항에 있어서, 서열번호 6의 서열을 특징으로 하는 DNA.
  16. 제12항, 제13항, 제14항 또는 제15항 중의 어느 한 항에 따른 DNA를 포함하 는 벡터.
  17. (a) 제16항에 따른 벡터를 제공하는 단계,
    (b) 미생물 숙주 균주를 상기 벡터로 형질전환시키는 단계,
    (c) 형질전환된 미생물 숙주 균주를 영양소를 함유하는 성장 배지에서 배양하여, 미생물 숙주 균주가 Ser172Ala 돼지 트립신 또는 Ser172Ala 돼지 트립시노겐을 발현하도록 하는 단계,
    (d) (c)의 발현 산물이 Ser172Ala 돼지 트립시노겐인 경우, 성숙한 Ser172Ala 돼지 트립신으로 전환시키는 단계 및
    (e) 미생물 숙주 균주 및/또는 성장 배지로부터 Ser172Ala 돼지 트립신을 정제하는 단계를 포함하는, Ser172Ala 돼지 트립신의 생산 방법.
  18. 제17항에 있어서, 미생물 숙주 균주가 한세눌라(Hansenula), 피치아(Pichia), 칸디다(Candida) 및 토룰로프시스(Torulopsis) 종을 포함하는 그룹으로부터 선택된 메탄올자화(methylotrophic) 효모 균주인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 미생물 숙주 균주가 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 칸디다 보이디니(Candida boidinii) 및 토룰로프시스 글라브라타(Torulopsis glabrata)를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
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