CN101253196A

CN101253196A - 通过胰蛋白酶变体切割胰岛素前体

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Publication number: CN101253196A
Application number: CNA200680031396XA
Authority: CN
Inventors: F·盖佩尔; S·格拉泽; C·霍; E·科佩茨基; R·米勒; F·措赫尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2005-09-14
Filing date: 2006-08-26
Publication date: 2008-08-27
Anticipated expiration: 2026-08-26
Also published as: JP5027812B2; AU2006291780A1; WO2007031187A8; BRPI0616054B8; KR101304958B1; MY146082A; BRPI0616054B1; PL1926749T3; CA2621344C; IL189887A; ATE517919T1; IL189887A0; AR055428A1; CA2621344A1; JP2009507500A; HK1124341A1; SI1926749T1; WO2007031187A1; KR20080055843A; CN101253196B

Abstract

本发明涉及在非动物宿主生物中产生对精氨酸与对赖氨酸相比具有增加的底物特异性的重组胰蛋白酶变体。此外，本发明涉及重组胰蛋白酶变体和其产生。本发明还提供了用于切割胰岛素前体的重组猪胰腺胰蛋白酶变体的用途，以及包含该胰蛋白酶变体的试剂盒。

Description

通过胰蛋白酶变体切割胰岛素前体

本发明涉及重组胰蛋白酶变体的产生，在非动物宿主生物中所述重组胰蛋白酶变体与对赖氨酸相比，对精氨酸的底物特异性增加。此外，本发明涉及重组胰蛋白酶和其产生。本发明还提供了用于切割胰岛素前体的重组猪胰腺胰蛋白酶变体的用途，以及包含该胰蛋白酶变体的试剂盒。

胰蛋白酶是在碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸的羧基端催化肽水解切割的丝氨酸蛋白酶(Keil B.，(1971).The Enzyme第2卷，第三版，编辑Boyer，Acad.Press NY.Pp.249-275)。重组猪胰腺胰蛋白酶的分子量为约23000道尔顿，并且在pH 8.0时具有最佳酶活性。

胰蛋白酶用在产生胰岛素和胰岛素类似物的工业过程中。这些生物分子的产生描述在文献中并且已经选择了一些方法。从经济学的角度，人胰岛素和胰岛素类似物的化学合成是不可行的。因此，现在主要存在两种产生胰岛素和胰岛素类似物的方法，即使用猪胰岛素作为起始材料的半合成方法，以及使用遗传修饰的微生物用于表达重组胰岛素。

胰岛素是51个氨基酸的多肽，其被分为2个氨基酸链：具有21个氨基酸的A链和具有30个氨基酸的B链。链通过2个二硫键彼此连接。胰岛素制品已经被用于糖尿病治疗很多年。在此不仅使用天然存在的胰岛素，近期还使用胰岛素衍生物和类似物。

胰岛素类似物是天然存在的胰岛素(即人胰岛素或动物胰岛素)的类似物，其区别在于用其它氨基酸残基取代至少一个天然存在的氨基酸残基和/或从对应的天然存在的胰岛素中添加/移除至少一个氨基酸残基(否则是相同的)。添加和/或替换的氨基酸残基也可以是非天然存在的氨基酸残基。

胰岛素衍生物是天然存在的胰岛素或胰岛素类似物的衍生物，其得自化学修饰。化学修饰可以在于例如向一个或多个氨基酸加入一个或多个特定化学基团。

胰岛素衍生物的实例是B29-N-肉豆蔻酰-去(B30)人胰岛素、B29-N-棕榈酰-去(B30)人胰岛素、B29-N-肉豆蔻酰人胰岛素、B29-N-棕榈酰人胰岛素、B28-N-肉豆蔻酰Lys^B28Pro^B29人胰岛素、B28-N-棕榈酰-Lys^B28Pro^B29人胰岛素、B30-N-肉豆蔻酰-Thr^B29Lys^B30人胰岛素、B30-N-棕榈酰-Thr^B29Lys^B30人胰岛素、B29-N-(N-棕榈酰-Y-谷氨酰)-去(B30)人胰岛素、B29-N-(N-石胆酰(lithocholyl)-Y-谷氨酰)-去(B30)人胰岛素、B29-N-(ω-羧基十七酰)-去(B30)人胰岛素和B29-N-(ω-羧基十七酰)人胰岛素。

胰岛素类似物描述在EP 0 214 826、EP 0 375 437和EP 0 678 522中。EP 0214826涉及B27和B28的取代等。EP 0678 522描述了在第B29位具有多种氨基酸，优选脯氨酸，但是没有谷氨酸的胰岛素类似物。

其它胰岛素类似物是Lys^B28Pro^B29人胰岛素、B28 Asp人胰岛素、其中第B28位的脯氨酸已经被Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代并且第B29位的Lys可以被Pro取代的人胰岛素；AlaB26人胰岛素；去(B28-B30)人胰岛素；去(B27)人胰岛素或去(B30)人胰岛素。

EP 0 375 437包括在第B28位具有赖氨酸或精氨酸的胰岛素类似物，其可以任选的额外地在B3和/或A21被修饰。

在EP 0 419 504中，公开了被保护免于化学修饰的胰岛素类似物，其中在第B3位的天冬酰胺和至少一个在第A5、A15、A18或A21位的氨基酸被修饰。在WO 92/00321中，描述了其中至少一个第B1-B6位的氨基酸被赖氨酸或精氨酸所替换的胰岛素类似物。

本文描述的重要的胰岛素类似物还是“甘精胰岛素”(insulinglargine)(Gly A(21)，Arg B(31)，Arg B(32)人胰岛素)和“谷赖胰岛素”(insulin glulisine)(Lys B(3)，Glu B(29)人胰岛素)。

重组DNA方法允许胰岛素的前体或胰岛素类似物，特别是人胰岛素原或所具有的氨基酸序列和/或氨基酸链长不同于人胰岛素的胰岛素原在微生物中制备。从遗传修饰的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞中制备的胰岛素原不具有任何正确结合的胱氨酸键。使用大肠杆菌得到人胰岛素的方法(EP 0 055 945)是基于下列处理步骤：

微生物的发酵、细胞分离、细胞破坏、胰岛素或胰岛素类似物的分离、通过形成各自的二硫键再折叠成所需(天然)三维结构以产生前-胰岛素原(pre-pro-insulin)(“PPI”)、各自的前-胰岛素原的胰蛋白酶切割(可能在羧肽酶B存在时)、基本纯化、第一层析步骤、最终酶促切割以产生人胰岛素或各自的胰岛素类似物、第二层析步骤以及通过HPLC的最终纯化、结晶和干燥。

前-胰岛素原的胰蛋白酶切割是酶促和复杂的反应：在此步骤中切下前序列和C-肽，从而产生各自的产物。例如，在人胰岛素产生的情形中，所需的有价值的是Arg(B31)、Arg(B32)-胰岛素和Arg(B31)-胰岛素(DE19821866)。

但是，胰蛋白酶切割导致许多副产物的形成，这是发生不需要的副反应的结果。胰蛋白酶是在C端精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)残基处切割肽键的内切蛋白酶(丝氨酸类型)。前-胰岛素原分子的胰蛋白酶切割可以同时发生在不同的切割位点。由于在特定前-胰岛素原分子中的许多切割边，在胰蛋白酶切割反应期间可以形成许多不需要的副产物。如在图1中可见的，在切割反应期间生成的许多副产物是由于在Lys而非Arg残基的C端侧的肽键切割的结果。

对于所有的前-胰岛素原，前-序列和胰岛素B链之间的切割位点是单基的。在此接点，只有一个切割反应可以发生。

在两个其它接点--B-链/C-肽和C-肽/A-链--存在不同的切割位点。在人胰岛素和甘精胰岛素的情形中，B-链/C-肽和C-肽/A-链之间的切割位点都是二碱基的(分别为Arg-Arg和Lys-Arg)。另外，B29-Lys后的切割导致B30-去-Thr(“去-Thr”)形成。

对于人胰岛素，只有在残基B31-Arg和B32-Arg之后的胰蛋白酶切割产生了对于B-链/C-肽接点有价值的产物，即B31-Arg胰岛素(“单-Arg”)和B31-Arg，B32-Arg胰岛素(“双-Arg”)。可以将这些产物总结为“Arg-胰岛素”。B32-Arg后的切割在产生甘精胰岛素的过程中是很重要的，因为只有双-Arg-胰岛素可以使用。对于人胰岛素和甘精胰岛素，在B29-Lys后的切割导致des-Thr形成。对于甘精胰岛素，这一切割位点是单基的并且可能的产物是包含Arg的种类。

对于C-肽/A-链，在Arg而非Lys残基后的胰蛋白酶切割对于产生有价值的产物是很重要的。在Lys后的错误切割导致A0副产物的形成。

为了克服本领域的缺点，希望在前-胰岛素原切割的过程中使用胰蛋白酶，其具有对在图1中所例示的不同的切割位点的增强的Arg特异性。通过增加胰蛋白酶的Arg-特异性——并因此通过减少Lys-特异性——可以预期减少副产物，特别是去-Thr和A0-成分的形成。Sichler等人，FEBSLett.(2002)530：220-224检查了人胰蛋白酶中190位的氨基酸交换的影响(根据Huber，R.& Bode，W.，Acc.Chem.Res.(1978)11：114-122的糜蛋白酶原编号)。当使用人造底物时，发现在此位置从野生型丝氨酸改变成突变的丙氨酸引起了切割位点对精氨酸选择性的增加和对赖氨酸的降低。同时，发现突变体的酶促活性与野生型相比降低了大约1/2。用于前-胰岛素原处理的重组人野生型胰蛋白酶和人胰蛋白酶突变体(在190位从丝氨酸改变为丙氨酸的氨基酸改变)的测试导致形成两种酶的大量的副产物，表明Arg-选择性的增加不可分配给前-胰岛素原的切割(见下文，实施例1)。

考虑到本领域现状，待解决的问题是提供胰蛋白酶的变体，所述胰蛋白酶的变体表现出对精氨酸的增加的切割位点选择性，而没有大的蛋白水解活性的损失。另一待解决的具体问题是提供胰蛋白酶的变体，所述变体具有对前-胰岛素原加工的切割位点中的精氨酸残基具有增加的切割位点选择性，如在图1中所说明的。

因此，通过提供猪胰蛋白酶变体解决了该问题，所述变体在第172位具有从丝氨酸改变成丙氨酸的氨基酸改变。在优选的实施方案中，通过重组方法提供猪胰蛋白酶的Ser172Ala变体。令人惊奇地，发现猪胰蛋白酶的Ser172Ala变体对于前-胰岛素原切割反应的酶促活性几乎与野生型酶相等。

通过Sichler等人(FEBS Lett.(2002)530：220-224)在人胰蛋白酶中检测到的氨基酸第190位丝氨酸对应于SEQ ID NO：1中所提供的猪胰蛋白酶的第172位丝氨酸。两个位置都是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的所谓的S1位点的部分。

因此本发明的一个实施方案是Ser172Ala猪胰蛋白酶在制备胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物中的用途。

本发明的另一个实施方案是制备胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物的方法，其中

(a)用Ser172Ala猪胰蛋白酶切割前-胰岛素原、前-胰岛素类似物原或前-胰岛素衍生物原，

(b)将得到的切割产物分离并且

(aa)如果得到的切割产物之一是胰岛素类似物或胰岛素衍生物，则得到该胰岛素类似物或胰岛素衍生物，或

(bb)将是胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物前体的那些切割产物进一步处理，并且分离并得到从此进一步处理得到的胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物；

其中胰岛素优选是人胰岛素；并且胰岛素类似物选自Lys^B28Pro^B29人胰岛素、B28 Asp人胰岛素、人胰岛素(其中第B28位的脯氨酸已经被Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代并且其中第B29位的Lys可以被Pro取代)；AlaB26人胰岛素；去(B28-B30)人胰岛素；去(B27)人胰岛素和去(B30)人胰岛素，并且胰岛素衍生物选自以下：B29-N-肉豆蔻酰-去(B30)人胰岛素、B29-N-棕榈酰-去(B30)人胰岛素、B29-N-肉豆蔻酰人胰岛素、B29-N-棕榈酰人胰岛素、B28-N-肉豆蔻酰Lys^B28Pro^B29人胰岛素、B28-N-棕榈酰-Lys^B28Pro^B29人胰岛素、B30-N-肉豆蔻酰-Thr^B29Lys^B30人胰岛素、B30-N-棕榈酰-Thr^B29Lys^B30人胰岛素、B29-N-(N-棕榈酰-Y-谷氨酰)-去(B30)人胰岛素、B29-N-(N-石胆酰(lithocholyl)-Y-谷氨酰)-去(B30)人胰岛素、B29-N-(ω-羧基十七酰)-去(B30)人胰岛素和B29-N-(ω-羧基十七酰)人胰岛素。

在本发明优选的实施方案中，胰岛素类似物是谷赖胰岛素或甘精胰岛素。

在本发明的另一实施方案中，提到的那些切割产物(为胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物的前体)的进一步处理包括用羧肽酶B切割所述产物，甘精胰岛素除外。

在本发明的另一实施方案中，用Ser172Ala猪胰蛋白酶切割是在pH值范围7.5至9.5(优选8.3)、温度在1℃至30℃之间，更优选在8至15℃之间，最优选在8℃下进行；并且酶促反应通过酸化样品终止，优选通过添加1N或2N HCl溶液。

本发明的另一实施方案是由序列SEQ ID NO：3所表征的Ser172Ala猪胰蛋白酶，优选由序列SEQ ID NO：4所表征的编码Ser172Ala猪胰蛋白酶的DNA。

本发明的另一实施方案是由SEQ ID NO：6所表征的编码Ser172Ala前-胰蛋白酶原的DNA。这一前-胰蛋白酶原的信号肽来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α因子。

本发明的另一实施方案是包含上述DNA的载体。

本发明的另一实施方案是产生Ser172Ala猪胰蛋白酶的方法，其包括步骤：

(a)提供根据权利要求16的载体，

(b)用该载体转化微生物宿主菌株，

(c)在包含营养物的生长培养基中培养转化的微生物宿主菌株，从而该微生物宿主菌株表达Ser172Ala猪胰蛋白酶或Ser172Ala猪胰蛋白酶原，

(d)如果(c)的表达产物是Ser172Ala猪胰蛋白酶原，将其转化成成熟Ser172Ala猪胰蛋白酶，并且

(e)从微生物宿主菌株和/或生长培养基纯化Ser172Ala猪胰蛋白酶，

特别是其中微生物宿主菌株是甲基营养酵母菌株，其选自物种汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)和球拟酵母属(Torulopsis)；优选其中微生物宿主菌株选自巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)和光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)。

在此文件中，术语“猪胰蛋白酶变体”和“猪胰蛋白酶的变体”是指作为变体的蛋白质，即成熟猪胰腺胰蛋白酶蛋白质同种型I的等位基因形式，通过根据SEQ ID NO：1的第172位的氨基酸取代生成。

对于本文描述的猪胰蛋白酶变体的速记名称，注意到数字是指在如SEQ ID NO：1给出的成熟猪胰腺胰蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸残基/位置。氨基酸标识使用氨基酸的三字母缩写以及单字母，即Asp D天冬氨酸、Ile I异亮氨酸、Thr T苏氨酸、Leu L亮氨酸、Ser S丝氨酸、Tyr Y酪氨酸、Glu E谷氨酸、Phe F苯丙氨酸、Pro P脯氨酸、His H组氨酸、Gly G甘氨酸、Lys K赖氨酸、Ala A丙氨酸、Arg R精氨酸、Cys C半胱氨酸、Trp W色氨酸、Val V缬氨酸、Gln Q谷氨酰胺、Met M甲硫氨酸、Asn N天冬酰胺。在氨基酸序列的特定位置的氨基酸通过其三字母缩写和数字给出。因此，Ser172是指在SEQ ID NO：1的氨基酸第172位的丝氨酸残基。不同氨基酸的取代作为在指示位置的数字后添加三字母缩写来给出。例如，“Ser172Ala”是指SEQ ID NO：3的第172位Ser被Ala取代。

术语胰蛋白酶变体的“增加的切割位点选择性”是指对于水解切割的特异性的转变，因此对于变体，该转变导致在精氨酸而不是赖氨酸的羧基处优选的切割。

当定量胰蛋白酶活性时，本文献是指“单位(U)”。胰蛋白酶和其变体的蛋白水解活性使用光度计测定(用Chromozym TRY、Chromozym TH和Chromozym PL(Roche Diagnostics GmbH)作为底物)来定量。给定制品的“特异性蛋白水解活性”或“特异性活性”定义为在制品中每mg蛋白质的单位数，其通过实施例9中描述的方法测定。

将“甲基营养酵母”定义为能够使用甲醇作为碳源的酵母。该术语还包括其实验室菌株。如果甲基营养酵母菌株是营养缺陷型的并且因此需要补充辅助的包含碳的物质如组氨酸(在甲基营养酵母菌株不能合成充足量的该氨基酸时)，该辅助物质被认为是营养物而非碳源。

将“载体”定义为包含(即携带)并且保持本发明DNA片段的DNA，包括例如噬菌体和质粒。这些术语是遗传工程领域技术人员所理解的。术语“表达盒”是指编码有效连接启动子和终止子的前蛋白质的核苷酸序列。对于包含表达盒的载体，术语“载体”和“表达载体”作为同义词使用。

术语“寡核苷酸”用于具有长度少于100个核苷酸的核酸分子、DNA(或RNA)。

“转化”意思是将DNA引入生物，即宿主生物，从而该DNA作为染色体外元件或通过染色体整合而是能复制的。

术语“表达”和动词“表达”是指DNA序列在宿主生物中的转录和/或经转录的mRNA的翻译，得到前-蛋白质，即不包括翻译后加工。

当至少部分的核酸或其互补序列可以被直接翻译以提供肽或蛋白质的氨基酸序列时，或当分离的核酸可以单独或作为表达载体的一部分被使用以在体外、在原核宿主细胞或在真核宿主细胞中表达肽或蛋白质时，核苷酸序列“编码”肽或蛋白质。

“启动子”是刺激转录的调节核苷酸序列。这些术语是遗传工程领域技术人员所理解的。类似于启动子，“启动子元件”刺激转录但是构成了更大启动子序列的亚-片段。

术语“有效连接”是指两个或多个核酸片段在单个载体上的结合，从而一个的功能受到另一个影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，该启动子与该编码序列(即编码蛋白质或前-蛋白质的核苷酸序列)有效连接，即该编码序列受到该启动子的转录调控。

术语“多肽”或“蛋白质”是指由多于90个通过肽键连接的氨基酸单体组成的聚合物。术语“肽”是指由90个或更少的通过肽键连接的氨基酸单体组成的寡聚体。“肽键”是两个氨基酸之间的共价键，其中一个氨基酸的α-氨基与另一个氨基酸的α-羧基结合。

术语“蛋白原(pro-protein)”、“蛋白原形式”、“酶原”、“胰蛋白酶原”、“前-蛋白质”或“前-蛋白原”是指作为成熟蛋白质前体的初级翻译产物，即在此情形中蛋白质从前-蛋白质的翻译后加工得到。

术语“翻译后加工”是指前-蛋白质或前-蛋白原受到的修饰步骤，从而在细胞或细胞外区室中得到成熟蛋白质。

“信号肽”是存在于可分泌蛋白质的前-蛋白质或前-蛋白原形式的氨基酸中的可切割信号序列。通过细胞膜转运(即分泌的)的蛋白质通常具有富含疏水氨基酸的N-端序列，通常大约15至30个氨基酸长。有时在穿过膜的过程期间，信号序列被信号肽酶切割(Alberts，B.，Johnson，A.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，Walter，P.(编著)，Molecular Biology of the Cell，第4版，2002，Garland Science Publishing)。信号肽的许多来源是本领域技术人员已知的并且可以包括例如来自酿酒酵母的α-因子信号肽的氨基酸序列等。另一实例是根据SEQ ID NO：5的天然猪胰腺胰蛋白酶原前蛋白质的猪信号肽(第1-16位)。通常，基本上任何分泌的蛋白质的前-蛋白质N-端是适合用于本发明的信号肽的潜在来源。信号肽也可以是二分的，包括将前-蛋白质导向到第一和第二细胞区室的两个信号肽。二分信号肽在分泌途径过程中被逐步切掉。因此特定的实例是来自酿酒酵母的α-因子的前肽原(Waters等人，J.Biol.Chem.263(1988)6209-14)。

具有N-端信号肽的前-蛋白质被导向进入“分泌途径”。分泌途径包括翻译后加工的过程并且最终导致蛋白质分泌。糖基化和二硫键的形成是作为分泌前分泌途径部分的过程。在本文件中，要理解甲基营养酵母菌株分泌的蛋白质已经穿过了分泌途径。

发明详述

所有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶共有对于碱性残基赖氨酸或精氨酸的底物优先性。尽管在对应于人胰腺胰蛋白酶的第190位的丝氨酸处的氨基酸交换突变导致在人造底物特异性方面的所需转变，但是结果是蛋白水解活性降低。

另外，人胰蛋白酶突变体的评估表明，使用人造底物所观察到的针对精氨酸残基的特异性转变不能分配给前-胰岛素原加工。实施例1说明了用人丝氨酸190丙氨酸胰蛋白酶突变体的前-胰岛素原的转化。在反应过程中形成了大量的副产物，主要是B30-去-Thr-和A0-成分。

还未表明这一效应应用到所有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶时的程度。一种说明这一问题的方法是将Ser-Ala交换突变引入到其它哺乳动物胰蛋白酶种类的氨基酸序列中处于各自的多肽序列对应于人胰腺胰蛋白酶同种型I的第190位的位置上。进行这样的工作后，发明人令人惊奇地发现在猪胰腺胰蛋白酶中的此类交换突变增加了在前-胰岛素原加工中的对于精氨酸的切割位点选择性，并且同时维持了蛋白水解活性的更高水平。

本领域的技术人员熟知在蛋白质中取代一个或多个氨基酸残基的方法。实施例2表明如何在编码DNA序列的水平上改造氨基酸交换突变。但是，其它方法是可能的。在本发明中，如在Seq ID NO：4中给出的编码猪胰腺胰蛋白酶的Ser172Ala突变体的合成核苷酸序列在微生物宿主生物中表达。

优选将胰蛋白酶变体作为异源蛋白质在微生物宿主生物如细菌和真菌中产生。本领域的技术人员熟知存在多种原核宿主如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)物种(仅举几个例子)的细菌表达系统。甚至更优选的微生物宿主生物是真菌。优选的真菌属的实例是曲霉属(Aspergillus)。但是甚至更优选的是酵母物种例如酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Sachizosaccharomyces)。但是甚至更优选的是甲基营养酵母物种的菌株。

甲基营养酵母具有甲醇利用必需的生物化学途径并且基于细胞形态和生长特征被分为4个属：汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属和球拟酵母属；最高度发育的甲基营养宿主系统使用巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(Komagataella pastoris)和多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)(安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))。

异源蛋白质在酵母中的表达描述在US 5,618,676、US 5,854,018、US 5,856,123和US 5,919,651中。

酵母生物产生许多在细胞内合成但是在细胞外发挥功能的蛋白质。这些细胞外蛋白质被称为分泌的蛋白质。最初分泌的蛋白质以包含N-端信号肽的前体、前-蛋白质或前-蛋白原的形式在细胞内部表达，所述信号肽确保将表达的产物有效的导向到细胞的分泌途径，穿过内质网的膜。在易位的过程中通常从所需产物上切掉信号肽。通过信号肽酶以蛋白水解实现切割。信号肽酶识别并且切割信号肽氨基酸的特定亚-序列。这一亚-序列被称作信号肽酶切割位点。一旦进入到分泌途径中，所述蛋白质被转运到高尔基体中。蛋白质被从高尔基体分布到质膜、溶酶体和分泌小泡。

与细胞内蛋白质相反，分泌的蛋白质面临不同的环境条件。分泌途径过程的部分是稳定成熟胞外蛋白质。因此，穿过酵母的分泌途径的前-蛋白质经历特异的翻译后加工。例如，加工可以包括二硫键的生成以形成分子内交联。此外，蛋白质的某些氨基酸可以被糖基化。

已经提出了一些方法用于在酵母中表达和分泌对该酵母异源的蛋白质。EP 0 116 201描述了用表达载体转化对酵母异源的蛋白质的方法，所述表达载体具有编码所需蛋白质的DNA、信号肽和作用为信号肽酶切割位点的肽。制备并且培养转化的生物的培养物，从培养基中回收蛋白质。发现了适当的信号肽作为来自酿酒酵母的α-因子信号肽，以用于酵母细胞中(US 4,870,008)。

在分泌过程中，酵母酶KEX-2是识别赖氨酸-精氨酸序列作为其在前-蛋白质中的切割位点的信号肽酶。KEX-2在所需蛋白质序列的接点处切割。因此，所需基因产物被释放并且没有前导区部分，即前-蛋白质的信号肽。KEX-2内切蛋白酶最初特征在于酵母属酵母，其中它特异性加工接合型α-因子的前体和放毒者因子(Julius，D.，等人，Cell 37(1984)1075-1089)。甲基营养酵母物种如巴斯德毕赤酵母与酿酒酵母共有KEX-2-型蛋白酶(类似的角色和功能)(Werten，M.W.，等人，Yeast 15(1999)1087-1096)。

例示性地描述作为宿主用于高水平重组蛋白质的良好建立的甲基营养酵母物种是巴斯德毕赤酵母(US 4,683,293、US 4,808,537、US 4,812,405、US 4,818,700、US 4,837,148、US 4,855,231、US 4,857,467、US 4,879,231、US 4,882,279、US 4,885,242、US 4,895,800、US 4,929,555、US 5,002,876、US 5,004,688、US 5,032,516、US 5,122,465、US 5,135,868、US 5,166,329、WO 00/56903)。在没有葡萄糖时，巴斯德毕赤酵母使用甲醇作为碳源，这同时作为甲基营养生物的标志。在SEQ ID NO：7中给出的醇氧化酶(AOX)启动子控制醇氧化酶的表达，所述醇氧化酶催化甲醇代谢中的第一步。通常，甲醇诱导的细胞中总可溶蛋白质的30％是醇氧化酶。一些毕赤酵母属表达载体携带AOX1启动子并且使用甲醇来诱导所需异源蛋白质的高水平表达。表达构建体也整合到巴斯德毕赤酵母基因组中，产生转化的和遗传稳定的宿主。

使用编码异源前-蛋白质的表达载体(包含信号肽或具有信号肽酶切割位点的信号肽，以及所需蛋白质)，可以操作甲基营养酵母菌株如巴斯德毕赤酵母菌株，从而将所需产物分泌到生长培养基中，从所述生长培养基中可以纯化分泌的蛋白质。

可以有利地产生编码具有实质上不同的密码子选择的前-蛋白质的核苷酸序列。根据宿主使用特定密码子的频率，选择密码子来增加前-蛋白质表达在特定酵母表达宿主发生的速率。实质上改变编码前-蛋白质的核苷酸序列而不改变所编码的氨基酸序列的其它原因包括产生比从天然存在的序列中产生的转录物具有更多所需性质如更大半衰期的RNA转录物。

实施例3说明了提供编码胰蛋白酶变体的表达载体的克隆步骤。使用包含编码能够表达(例如，其有效连接到启动子或启动子元件并连接到终止子或终止子元件，以及连接到充分翻译所需的序列)的前-蛋白质的核苷酸序列的载体，将宿主生物用该载体转化并且选择转化体。

一方面，表达产量取决于所需产物的适当靶向，例如通过信号肽(如来自酿酒酵母的α-因子信号肽或天然猪胰腺胰蛋白酶原的猪信号肽)靶向到分泌途径。实施例4提供了转化的微生物宿主并且实施例5表明如何实现胰蛋白酶变体的表达。因此，初级翻译产物包括将多肽导向到分泌途径的信号肽。实施例6说明了在转化的甲基营养酵母上清液中胰蛋白酶活性的测量。

另一方面，表达产量可以通过增加编码所需产物的基因的剂量来增加。因此，在宿主生物中扩增表达构建体的拷贝数，所述表达构建体是表达载体或表达盒。一种实现此的方式是通过编码所需产物的表达载体的多重转化。另一种方式是使用第一和第二表达载体将编码所需产物的基因引入到宿主生物中，其中第二表达载体是基于与在第一表达载体中使用的选择标记不同的选择标记。甚至当宿主生物已经携带了第一表达载体的多拷贝时，也可以引入编码相同所需产物的第二表达载体(US 5,324,639；Thill，G.P.，等人，Positive and Negative Effects of Multi-Copy Integrated Expression inPichia pastoris，International Symposium on the Genentics ofMicroorganisms 2(1990)，第477-490页；Vedvick，T.，等人，J.Ind.Microbiol.7(1991)197-201；Werten，M.W.，等人，Yeast 15(1999)1087-1096)。实施例7描述了如何可以增加胰蛋白酶变体的表达产量以提供用于工业规模生产的酵母克隆。

对于分泌到生长培养基中的重组蛋白质产量，重复分析转化体。选择分泌了最高量酶促活性重组蛋白质的转化体。

猪胰蛋白酶变体向生长培养基中的分泌指导成熟重组蛋白质到胞质外空间，所述重组蛋白质从所述胞质外空间扩散到生长培养基中。生长在液体培养基中的转化的甲基营养酵母将重组猪胰腺胰蛋白酶变体分泌到液体生长培养基(即液体培养基)中。这使得可以使用例如过滤技术非常有效地分离酵母生物量和重组蛋白质。因此，从此来源中纯化的重组猪胰蛋白酶变体与其它酶活性(例如核糖核酸酶或其它(非胰蛋白酶的)蛋白酶活性)非常有效地分离。

因此，本发明第一个优选的实施方案是一种变体，其通过猪胰腺胰蛋白酶同种型I的氨基酸取代得到，其中在第172位中氨基酸丝氨酸被氨基酸残基丙氨酸取代，以形成具有胰蛋白酶活性的猪胰腺胰蛋白酶变体，所述位置是根据SEQ ID NO：1的猪胰腺胰蛋白酶同种型I的N端开始编号的。

优选地，猪胰腺胰蛋白酶变体对在氨基酸精氨酸羧基基团处的水解切割，而不是对于氨基酸赖氨酸羧基基团的水解切割具有增加的切割位点选择性。

更优选地，当胰岛素前体多肽或其类似物用作底物时，分离的变体表现出增加的选择性。

而在本发明的另一优选的实施方案中，与野生型猪胰腺胰蛋白酶相比，猪胰腺胰蛋白酶变体的特异性蛋白水解活性是100％。因此，当在等同条件下产生和纯化时，与野生型形式的未改变的猪胰腺胰蛋白酶相比，重组猪胰腺胰蛋白酶变体的特异性胰蛋白酶活性是100％。

本发明另一优选的实施方案是产生猪胰腺胰蛋白酶变体的方法，其包括步骤(a)提供包含编码猪胰腺胰蛋白酶变体的核苷酸序列的载体，(b)用该载体转化微生物宿主菌株，(c)在包含营养物的生长培养基中培养转化的微生物宿主菌株，从而微生物宿主菌株表达重组猪胰腺胰蛋白酶变体，以及(d)从微生物宿主菌株和/或生长培养基中纯化重组猪胰腺胰蛋白酶变体。

异源蛋白质的翻译效率可以通过根据宿主生物中优选的密码子来改编编码异源蛋白质的核苷酸序列密码子来增强。因此，在本发明优选的实施方案中，编码重组猪胰腺胰蛋白酶变体的核苷酸序列是SEQ ID NO：4。

在本发明甚至更优选的实施方案中，(a)载体包含编码前-蛋白质的核苷酸序列，所述前-蛋白质由在SEQ ID NO：6中给出的重组猪胰腺胰蛋白酶原和信号肽组成，(b)微生物宿主菌株是甲基营养酵母菌株，(c)生长培养基包含作为碳源的甲醇，(d)甲基营养酵母菌株表达并且分泌重组猪胰腺胰蛋白酶变体，以及(e)从生长培养基中纯化猪胰腺胰蛋白酶变体。

除具体提及的外，酵母来源的和非酵母来源的真核生物信号肽可以用于相同的目的。尽管信号肽可以是信号肽酶不可切割的，但是可以向位于信号肽的氨基酸序列和变体重组猪胰腺胰蛋白酶多肽的氨基酸序列之间的前-蛋白质氨基酸序列中插入信号肽酶切割肽。因此，在另一本发明非常优选的实施方案中，信号肽包含信号肽酶切割位点，其与重组猪胰腺胰蛋白酶原的第一个(N-端)氨基酸相邻。

在本发明另一优选的实施方案中，编码前-蛋白质的核苷酸序列与启动子或启动子元件有效连接。优选该载体是能够作为附加体在甲基营养酵母菌株中复制的质粒。更优选地，能够在甲基营养酵母菌株中复制的人造染色体包含载体。但是，最优选甲基营养酵母菌株的染色体包含作为整合物的载体。

因此，在使用甲基营养酵母菌株的优选的方法中，并且特别是在巴斯德毕赤酵母菌株中，载体编码进入分泌途径的猪胰腺胰蛋白酶原前-蛋白质变体的氨基酸序列。

在本发明更优选的实施方案中，甲基营养酵母菌株是汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属或球拟酵母属物种。非常优选甲基营养酵母菌株选自巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母、博伊丁假丝酵母和光滑球拟酵母。甚至更优选地，甲基营养酵母菌株是美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)保藏号为76273的巴斯德毕赤酵母菌株或其衍生物。

本发明另一优选的实施方案是具有含有载体的染色体的巴斯德毕赤酵母菌株，所述载体包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码由重组猪胰腺胰蛋白酶变体和信号肽组成的前-蛋白质，与SEQ ID NO：7的巴斯德毕赤酵母AOX1启动子或其启动子元件有效连接。

本领域的技术人员已知这样的事实，即从生长培养基如液体生长培养基中得到的分泌的异源蛋白质(例如猪胰腺胰蛋白酶变体)的产量可以在编码前-蛋白质的核苷酸序列拷贝数增加时增加，异源蛋白质从所述核苷酸序列表达并且被分泌。因此，从生长培养基中得到的分泌的异源蛋白质的产量可以在当甲基营养酵母菌株基因组中载体拷贝数增加时增加。例如，可以通过使得甲基营养酵母菌株进行载体的重复转化和重复选择循环来增加载体的拷贝数，所述重复选择循环使用增加浓度的选择剂，包含在载体中的选择标记赋予针对所述选择剂的抗性(US 5,324,639；Thill，G.P.，等人，Positive and Negative Effects of Multi-Copy Integrated Expression inPichia pastoris，International Symposium on the Genentics ofMicroorganisms 2(1990)，第477-490页；Vedvick，T.，等人，J.Ind.Microbiol.7(1991)197-201)。

选择标记的实例是Sh ble基因，其为Zeocin^TM抗性基因(Drocourt，D.，等人，Nucleic Acids Res.18(1990)4009；Carmels，T.，等人，Curr.Genet.20(1991)309-314)。Sh ble基因编码的蛋白质化学计量地结合Zeocin^TM，并且具有强亲和性。Zeocin^TM的结合抑制了其毒性活性，从而选择包含Sh ble基因的转化体。本领域的技术人员已知在培养基中增加作为选择剂的Zeocin^TM的浓度选择了表达Sh ble基因的载体拷贝数的增加。因此有利地使用用Sh ble基因作为选择标记的载体，通过重复转化，来生成包含载体的多个拷贝的甲基营养酵母菌株的多转化体。更有利地，重复转化，并且重复选择更有抗性的转化体，直到对于转化的甲基营养酵母菌株，再也不能得到Zeocin^TM抗性水性的进一步增加，或者在选择培养基中再也不可能增加Zeocin^TM浓度。

本领域的技术人员熟悉通过层析纯化重组表达和分泌的猪胰腺胰蛋白酶(Funakoshi，A.，等人，J.Biochem.(Tokyo)88(1980)1113-1138；Paudel，H.K.，和Liao，T.H.，J.Biol Chem.261(1986)16006-16011；Nefsky，B.，和Bretscher，A.，Eur.J.Biochem.179(1989)215-219)。优选地，使用离子交换层析纯化生长培养基中的猪胰腺胰蛋白酶原变体。产生纯化产物的下游加工步骤描述在实施例8中。类似地产生野生型猪胰腺胰蛋白酶同种型I，只是用野生型编码序列构建表达载体。

本发明另一优选的实施方案是通过上述方法之一的猪胰腺胰蛋白酶同种型I的变体。本发明的另一实施方案是猪胰腺胰蛋白酶变体用于前-胰岛素原加工的用途。使用猪胰蛋白酶Ser172Ala变体用于酶促切割不同前-胰岛素原的益处描述在实施例10-12中。提供下列实施例、参考文献、序列表和图用来帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附的权利要求中给出。要理解可以在说明的方法中进行改变而不背离本发明的精神。

附图描述

图1：人胰岛素、甘精胰岛素和谷赖胰岛素的前-胰岛素原的主要胰蛋白酶切割位点图。实心三角形指出产生产物的切割位点，空心三角形指出产生副产物的切割位点。未显示前-前胰岛素的二硫键。

图2：用重组、野生型人胰蛋白酶的前-甘精胰岛素原切割(实施例1)。

图3：用重组、丝氨酸190丙氨酸人胰蛋白酶变体的前-甘精胰岛素原切割(实施例1)。

图4：质粒pTry-Ser172Ala的图谱，所述质粒是可商购的质粒pPICZαA(Invitrogen)的衍生物，其赋予了对Zeocin^TM的抗性。指示了TrySer172Ala的插入片段是编码重组猪分泌的胰蛋白酶原变体的合成DNA序列，所述变体携带Ser172Ala氨基酸取代，并且与编码来自酿酒酵母的α-因子信号肽的核苷酸序列融合。“AOX1-Prom”是指巴斯德毕赤酵母AOX1启动子，“Term”是指巴斯德毕赤酵母AOX1终止子。

图5：显示了用天然、重组猪胰蛋白酶的前-胰岛素原(人胰岛素)切割(实施例10，表1)。

图6：显示了用S172A变体猪胰蛋白酶的前-胰岛素原(人胰岛素)切割。

通常，在下列实施例中，应用在英俊公司(Invitrogen)操作手册“PichiaExpression Kit”版本M 01110225-0043，“pPICZ A，B和C”版本D11080125-0148，“pPICZαA，B和C”版本E 01030225-0150和“pPIC9K”版本E 03040225-0106中建议和描述的方法。还参考了其中提到的其它载体、酵母菌株和培养基。使用如在Sambrook，Fritsch &Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版，CSHL Press，2001中描述的分子生物学的基本方法。

HPLC方法：

固定相：Nucleosil 120-5C18，Macherey &Nagel，250×4mm；流动相A：45mM磷酸钠缓冲液(pH 2，5)，315mM NaCl，25％(v/v)乙腈；流动相B：45mM磷酸钠缓冲液(pH 2，5)，55mM NaCl，65％(v/v)乙腈；梯度：线性，在30分钟内从6％B相到10％B相。

下列实施例意图说明本发明，而非限制。

实施例1：使用重组人野生型胰蛋白酶和丝氨酸190丙氨酸人胰蛋白酶变体切割前-甘精胰岛素原

这些实验在8℃和pH值8.3(缓冲溶液)下进行，并且最大为50mL规模。

将PPI溶液装入适当的恒温反应容器中并且通过添加酶制品开始反应。在一定时间间隔后取样品；通过1N或2N HCl溶液酸化样品溶液立即终止酶促反应。通过HPLC测定各产物的浓度。

实施例2：编码猪胰腺胰蛋白酶原的合成核苷酸序列的诱变

通常，应用如在Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第3版，CSHL Press，2001中描述的分子生物学标准方法。下文描述的方法是已知为“位点定向诱变”的非常常规方法的具体应用。

使用聚合酶链式反应，以位点定向模式生成突变。为了突变所需的密码子(即碱基三联体)，设计并且合成一对互补单链DNA寡核苷酸，所述DNA寡核苷酸代表编码猪胰腺胰蛋白酶原的合成核苷酸序列的变体部分。除了待突变的三联体序列外，单链DNA寡核苷酸与在SEQ ID NO：2中给出的序列相同或互补。通常，DNA寡核苷酸具有约20至45个核苷酸的长度；待突变的三联体序列或其互补序列位于包含其的DNA寡核苷酸的中间部分，并且在两侧侧接约10至12个核苷酸。设计DNA寡核苷酸从而使得该DNA寡核苷酸与“野生型”重组猪胰腺胰蛋白酶原DNA(根据SEQID NO：2)杂交，产生这样的杂交分子，其具有中心错配，但是在错配的两侧(包括每个DNA寡核苷酸的5’和3’端)具有完整碱基配对。

另外，提供了两个单链DNA寡核苷酸引物，其中第一个(称作“5’胰蛋白酶”)(SEQ ID NO：8)包含SEQ ID NO：2的5’端9个核苷酸，并且第二个(称作“3胰蛋白酶”)(SEQ ID NO：9)包含与SEQ ID NO：2的3’-端12个核苷酸互补的序列。将两个引物设计成为包含限制性内切酶切割位点。因此，第一和第二引物延伸，并且包括与SEQ ID NO：2的合成核苷酸序列侧接的相邻序列。“5’胰蛋白酶”包含EcoRI和3’Xba I位点。

通过一些基于PCR的步骤合成编码变体的核苷酸序列，所述变体是通过野生型成熟猪胰腺胰蛋白酶蛋白质的氨基酸取代得到的。

使用双链DNA作为模板进行第一次和第二次PCR，所述双链DNA包含根据SEQ ID NO：2的核苷酸序列，其作为载体中的插入片段存在。侧接插入片段的载体序列是PCR过程中退火时使得引物“5’胰蛋白酶”和“3’胰蛋白酶”完全匹配的序列。使用一对引物进行第一次PCR，所述引物由“5’胰蛋白酶”引物和包含突变的(即变体三联体)序列的第一单链DNA寡核苷酸组成，因此两个引物与相对的模板DNA链退火。因此使用“3’胰蛋白酶”引物和与第一个单链DNA寡核苷酸互补的第二单链DNA寡核苷酸进行第二次PCR。因此第一和第二次PCR生成两种直接产物：编码重组猪胰腺胰蛋白酶变体的核苷酸序列的5’和3’部分，其中5’部分在其3’端携带突变的序列，反之亦然，3’部分在其5’端携带突变的序列。

通过琼脂糖凝胶电泳分析得到的两种中间扩增产物，剪切所需片段并且使用“QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)”Qiagen，货号28704)从琼脂糖块中分离DNA。

随后进行第三次PCR，从而融合所述两部分。为此，将两部分在单个PCR中联合，并且进行5个PCR循环，不再添加任何额外的上游和下游引物。在这些循环中，形成一些全长产物，其中对于5’部分和3’部分的重叠序列计算使用的退火温度。随后，添加引物“5’胰蛋白酶”和“3’胰蛋白酶”，并且再进行25个PCR循环，其中在此使用的退火温度对应于具有较低解链温度的所添加的引物。

随后使用“PCR克隆试剂盒-平端”(罗切诊断学有限公司，曼海姆(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)；货号1 939 645)插入突变的全长DNA片段。通过限制酶分析和测序验证DNA片段。然后通过用XhoI和NotI的切割来剪切下验证的DNA片段并且将其插入到巴斯德毕赤酵母表达载体中，所述载体用相同的限制酶切割(见实施例3和实施例5)。

Ser172Ala：在SEQ ID NO：2的第528-531位上发现的碱基三联体“TCT”由“GCT取代”。为此，在第一次PCR中，将DNA寡核苷酸“5’-Try-Ser172Ala”(SEQ ID NO：10)与“3’-胰蛋白酶”组合用作引物，在第二次PCR中，将“3’-Try-Ser172Ala”(SEQ ID NO：11)与“5’-胰蛋白酶”组合用作引物。然后将分离的中间片段用于第三次PCR，从而生成全长产物。

实施例3：在pPICZαA-衍生的表达载体中克隆编码变体重组猪胰腺胰蛋白酶原的人造DNA

用EcoRI和XbaII(罗切诊断学有限公司)切割从PCR片段生成的编码变体重组猪胰腺胰蛋白酶原的DNA片段(见实施例2)。根据制造商的说明，使用“QIAauick凝胶提取试剂盒”分离片段。

将片段连接到pPICZαA载体中，从而将编码变体重组猪胰腺胰蛋白酶原的核苷酸序列融合到编码来自酿酒酵母的α-因子信号肽的核苷酸序列上。在连接反应之前，类似地用EcoRI和XbaI切割载体，并且分离。

随后的克隆步骤将编码变体重组猪胰腺胰蛋白酶原的核苷酸序列直接并且符合读框地插入到编码酿酒酵母α-因子信号肽的核苷酸序列之后。

如在SEQ ID NO：6中给出的编码重组前-蛋白原的核苷酸序列受到巴斯德毕赤酵母AOX-1启动子(SEQ ID NO：7)的控制，所述启动子例如在巴斯德毕赤酵母中可由甲醇诱导。

通过在总体积10μl中连接20ng的线性化载体片段(1μl体积)、100ng切割的PCR片段(3μl)，并且在16℃，T4DNA连接酶(罗切诊断学有限公司)存在时，根据制造商的说明进行构建。随后将5μl连接制备物用于转化感受态大肠杆菌XL1Blue细胞(斯莱特基因公司(Stratagene))，总体积205μl。在冰上温育30分钟后，将细胞在42℃热激90秒。随后，将细胞转移到1ml LB培养基中并且在37℃温育1小时，以允许表达选择性标记。然后将等分试样接种在包含100μg/ml Zeocin的LB平板上，并且在37℃温育15小时。挑取抗性克隆，将质粒分离(Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版，CSHL Press，2001)并且用限制性分析以及序列分析测试。选择验证为没有错误和克隆人为产物的构建体克隆。具有变体重组猪胰腺胰蛋白酶和酿酒酵母的α-因子信号肽的表达载体被称为pTry-Ser172Ala。

实施例4：用pPICZαA-衍生的pTry-Ser172Ala表达载体转化巴斯德毕赤酵母

使用的宿主菌株是毕赤酵母X-33、GS115、KM71H和SMD1168(英俊公司(Invitrogen))。优选的菌株是X-33和KM71H。转化的目的在于将表达构建体稳定整合到宿主生物的基因组中。最初，用巴斯德毕赤酵母菌落接种5ml YPD培养基(YPD＝酵母蛋白胨葡萄糖；英俊公司(Invitrogen))，并且在摇床上在30℃预培养过夜。为了制备转化感受态细胞，将100μl预培养物作为接种物添加到200ml新鲜YPD培养基中，并且生长直到OD_600nm达到1.3至1.5之间。将细胞在1500×g下离心5分钟并且重悬在200ml冰预冷的(0℃)无菌水中。将细胞在1500×g下再次离心5分钟并且重悬在100ml冰预冷的无菌水中。将细胞在1500×g下再一次离心5分钟并且重悬在10ml冰预冷的的1M山梨糖醇(ICN)中。以这种方式制备的细胞保存在冰上并且立即用于转化。

使用SacI限制性内切核酸酶(罗切诊断学有限公司)线性化待被用于转化的pPICZαA-衍生的pTrySer172Ala表达载体，将其沉淀并且重悬在水中。转化通过使用“Gene Pulser II^TN”(生物雷德公司(BioRad))的电穿孔来进行。关于转化准备，将80μl在1M山梨糖醇溶液中的巴斯德毕赤酵母与1μg线性化的表达载体DNA温和混合，并且转移到冰预冷的小杯中，然后将该小杯在冰上保持5分钟。随后，将小杯转移到基因脉冲发生器(GenePulser)中。电穿孔参数是1kV、1kΩ和25μG。电穿孔后，将1ml的1M山梨糖醇溶液添加到细胞悬液，随后将细胞悬液接种到YPDS平板(YPDS＝酵母蛋白胨葡萄糖山梨糖醇，英俊公司(Invitrogen))，所述平板包含100μg/mlZeocin^TM(Invitrogen)，其中100-150μl的细胞悬液被涂在单个平板上。将YPDS平板在30℃温育2-4天。将酵母克隆转移到分格的极限葡萄糖平板上。挑取这些平板的菌落并且分别重悬在无菌水中。将细胞用17.5个单位的溶细胞酶(罗切诊断学有限公司)在30℃消化1小时，然后在-80℃冷冻10分钟。通过PCR，验证各自pPICZαA-衍生的pTrySer172Ala表达载体的表达盒的存在。术语“表达盒”是指编码变体重组猪胰腺胰蛋白酶前-蛋白质的核苷酸序列，其与AOX1启动子和AOX1终止子有效连接，其中表达盒来自用于转化的各自pPICZαA-载体。对于包含表达盒的载体，术语“载体”和“表达盒”是同义的。

将阳性克隆用于变体重组猪胰腺胰蛋白酶表达的进一步表征，所述阳性克隆即验证为对于稳定整合到基因组中的完整表达盒的存在是阳性的克隆。

另外，使用原始pPICZαA载体，与受体巴斯德毕赤酵母KM71H菌株一起进行对照转化。以类似的方式获得并且验证阳性克隆。

实施例5：变体重组猪胰腺胰蛋白酶原的表达和分泌

将一组用pPICZαA-pTrySer172Ala表达载体转化的阳性克隆(20-30个)作为摇动培养物培养过夜，每个在3ml BMGY培养基中(BMGY＝缓冲的甘油复合培养基；英俊公司)。然后，在将它们在摇瓶中传代之前测定培养物的OD₆₀₀值，所述每个摇瓶包含pH3的10ml BMMY培养基(英俊公司)。将预培养物用作接种物，使得每个OD_600nm为1。将培养物在30℃摇床上保持30分钟。平行地，在相同条件下培养阳性对照克隆。

BMMY(BMMY＝缓冲的甲醇复合培养基)培养基包含甲醇(Mallinckrodt Baker B.V.)，甲醇是AOX-1启动子的诱导物，所述启动子控制编码变体重组猪胰腺胰蛋白酶原的核苷酸序列的转录。

在72小时的整个时间内，以24小时间隔从摇瓶中取出500μl样品。当移出样品等分试样时，也将培养物加入0.5％的甲醇。测试上清液生长培养基样品的胰蛋白酶酶促活性。

实施例6：变体猪胰腺胰蛋白酶表达的分析

首先测定在实施例5所述得到的样品等分试样的OD_600nm。随后通过离心沉淀细胞并且保存上清液。测量未稀释的上清液以及1∶10稀释的上清液中的胰蛋白酶活性。

尽管用pPICZαA载体转化的对照克隆在培养基中不产生任何可测量的胰蛋白酶活性，但是用pPICZαA-pTrySer172Ala表达载体转化的毕赤酵母属菌株表现出胰蛋白酶活性，这是因为分泌到生长培养基(即培养基)中的重组猪胰腺胰蛋白酶的各个变体。因此可以得出结论，在此情形中，包含酿酒酵母的α-因子信号肽的重组前-蛋白质的表达使得具有蛋白水解活性的活性酶能够被分泌。

实施例7：通过多重转化和增加的Zeocin^TM浓度增加表达产量

对用pPICZαA-和pPICZA-衍生的pDNM表达载体转化、发现在上清培养基中产生最高的胰蛋白酶活性的酵母克隆使用与前面相同的表达载体进行重复的电穿孔。电穿孔的条件描述在实施例4中，只是YPDS平板含有增加浓度(在1000和2000μg/ml之间)的Zeocin^TM。增加抗生素的浓度从而选择转化体，所述转化体已经向其基因组中整合了各自表达载体的多个拷贝。将对抗生素具有增加的抗性的酵母克隆转移到分格的极限葡萄糖平板上。如已经在实施例5中描述的，从单个酵母克隆产生预培养物，并且如实施例6所述通过测定分泌到生长培养基中的胰蛋白酶酶促活性测量表达。发现单个克隆产生增加量的胰蛋白酶活性。一般地说，与仅进行了单次转化的各自的前体菌株相比，用各自pPICZαA-pTry-Ser172Ala表达载体重复转化的毕赤酵母属菌株上清液中测量的胰蛋白酶活性高2至3倍。

实施例8：从液体培养上清液中纯化猪胰腺胰蛋白酶原的变体并活化以形成胰蛋白酶变体

用包含5-30mM氯化钙，pH3.5的乙酸铵缓冲液(5-20mM)，以约1∶2至1∶4的比例稀释整个发酵液。通过膨胀床层析(McCornick(1993)；EP 0699 687)使用阳离子交换剂(例如SP，XL)纯化胰蛋白酶原变体。不用酵母细胞的预先分离，而进行层析。使用填充床柱(bed column)(例如

XL，ff)进行进一步纯化。通过在20mM CaCl₂的存在时，将pH重新缓冲到7-8来开始自身催化的活化。通过将pH改回2-4的范围来终止活化。将纯化的胰蛋白酶储存在pH1.5-3，从而避免自身蛋白水解。

实施例9：用于测定纯化的变体重组猪胰腺胰蛋白酶的特异胰蛋白酶活性的测定法

使用Chromozym TRY(罗切诊断学有限公司)在100mM Tris pH 8.0，20mM CaCl₂，在25℃下测定胰蛋白酶的活性。在405nm进行光度测量。为了区别精氨酸与赖氨酸的底物特异性，使用Chromozym TH(包含精氨酸/罗切诊断学有限公司)和Chromozym PL(包含赖氨酸/罗切诊断学有限公司)。

实施例10：前-人胰岛素原的切割

所有实验在8℃和pH值8.3(缓冲液或通过NaOH剂量控制)下进行，并且在20mL至3.5L规模下进行。在一些实验中，也使用天然、重组的猪胰蛋白酶切割前-胰岛素原，从而直接比较两种酶。

将PPI溶液装入适当的热稳定反应容器中，并且通过添加酶制剂开始反应。在一定的时间间隔后取样品；通过1N或2N HCl溶液酸化样品溶液立即终止酶促反应。通过HPLC测定各自产物的浓度。

表1描述了一个实验的例示性结果。

规模	胰蛋白酶	∑前-Arg-Ins[面积％]	∑Arg-Ins[面积％]	-Thr[面积％]	∑A0化合物[面积％]	产量(外部标准)[％]
规模	胰蛋白酶	∑前-Arg-Ins[面积％]	∑Arg-Ins[面积％]	-Thr[面积％]	∑A0化合物[面积％]	产量(外部标准)[％]	3.5L	天然S172A	1.40.9	68.882.5	7.23.3	10.74.1	84.296.5

表1：使用天然重组猪胰蛋白酶和S172A胰蛋白酶变体(使用等量U/gPPI)的前-前-胰岛素(人胰岛素)切割反应的结果。

如从表1中可见，使用S172A胰蛋白酶变体减少了不需要的副产物去-Thr和A0-化合物的形成，并且因此增加有价值的Arg-胰岛素(Arg-Ins)的量和各自的切割产量。

图5显示了用天然重组的猪胰蛋白酶转化前-胰岛素原，图6显示了用S172A变体转化前-胰岛素原(PPI)。

实施例11：前-甘精胰岛素原的切割

使用实施例10的实验条件。也使用天然、重组猪胰蛋白酶切割前-胰岛素原，从而直接比较两种酶。

HPLC方法：如所述。

表2描述了所进行实验的例示性结果。给出的值标记了最大产物形成点。

规模	胰蛋白酶	前-甘精胰岛素[面积％]	甘精胰岛素[面积％]	去-Thr[面积％]	∑A0化合物[面积％]	产量(外部标准)[％]
规模	胰蛋白酶	前-甘精胰岛素[面积％]	甘精胰岛素[面积％]	去-Thr[面积％]	∑A0化合物[面积％]	产量(外部标准)[％]	1L	天然S172A	0.50.4	51.155.5	5.62.6	10.95.1	58.162.9

表2：使用天然、重组胰蛋白酶和S172A变体(使用200U/g PPI)的前-前-胰岛素(甘精胰岛素)切割反应的结果。

如从表2中可见的，使用S172A胰蛋白酶变体减少了不需要的副产物去-Thr和A0-化合物的形成并且因此增加了甘精胰岛素的量。

实施例12：前-谷赖胰岛素原的切割

使用实施例10的实验条件。也使用天然、重组猪胰蛋白酶切割前-胰岛素原，从而直接比较两种酶。表3描述了所进行实验的例示性结果。给出的值标记了最大产物形成点。

规模	胰蛋白酶	胰蛋白酶量[U/g PPI]	Arg-谷赖胰岛素[面积％]	A0-Arg-谷赖胰岛素[面积％]	产量(外部标准)[％]
规模	胰蛋白酶	胰蛋白酶量[U/g PPI]	Arg-谷赖胰岛素[面积％]	A0-Arg-谷赖胰岛素[面积％]	产量(外部标准)[％]	1L	天然S172A	250250	35.839.2	4.71.2	91.6100.0

表3：使用天然、重组胰蛋白酶和S172A胰蛋白酶变体的前-前-胰岛素(谷赖胰岛素)切割反应的结果。

如从表3可见的，使用S172A胰蛋白酶变体减少了不需要的A0-化合物的形成并且因此增加了甘精胰岛素的量。

序列表

<110>塞诺菲-安万特德国有限公司

弗·哈夫曼-拉罗切有限公司

<120>通过胰蛋白酶变体切割胰岛素前体

<130>DE 2005/039G

<140>0577086.6

<141>2005-09-14

<160>11

<170>PatentIn版本2.1

<210>1

<211>223

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>成熟序列描述：没有信号肽和前肽的野生型猪胰腺胰蛋白酶的序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>1

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser

20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val

35 40 45

Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe

50 55 60

Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr

65 70 75 80

Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu

85 90 95

Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala

100 105 110

Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser

130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met

145 150 155 160

Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp

165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser

180 185 190

Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys

195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn

210 215 220

<210>2

<211>687

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：编码没有信号肽和编码肠激酶切割位点的前肽部分的猪胰腺胰蛋白酶原的序列

<400>2

gatgatgatg ataaaattgt tggtggttat acttgtgctg ctaattctat tccatatcaa 60

gtttctttaa attctggttc tcatttttgt ggtggttctt tgattaattc tcaatgggtt 120

gtttctgctg ctcattgtta caaatcaaga atccaagtta gattgggtga acataatatt 180

gatgttttgg aaggtaatga acaatttatt aatgctgcta aaattattac tcatccaaat 240

tttaatggta atactttgga taatgatatt atgttgatta aattgtcttc tccagctact 300

ttaaattcaa gagttgctac tgtttctttg ccaagatctt gtgctgctgc tggtactgaa 360

tgtttgattt ctggttgggg taatactaaa tcttctggtt cttcttatcc atctttgttg 420

caatgtttga aagctccagt tttgtctgat tcttcttgta aatcttctta cccaggtcaa 480

attactggta atatgatttg tgttggtttt ttggaaggtg gtaaagattc ttgtcaaggt 540

gattctggtg gtccagttgt ttgtaatggt caattgcaag gtattgtttc ttggggttat 600

ggttgtgctc aaaaaaataa accaggtgtt tacactaaag tttgtaatta tgttaattgg 660

attcaacaaa ctattgctgc taattag 687

<210>3

<211>223

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：变体猪胰腺胰蛋白酶的氨基酸序列

<220>

<221>肽

<222>(1)..(223)

<400>3

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val

l 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser

20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val

35 40 45

Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe

50 55 60

Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr

65 70 75 80

Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu

85 90 95

Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala

100 105 110

Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser

130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met

145 150 155 160

Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp

165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser

180 185 190

Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys

195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn

210 215 220

<210>4

<211>687

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：编码没有信号肽和编码肠激酶切割位点的前肽部分的猪胰腺胰蛋白酶原变体的序列

<400>4

gatgatgatg ataaaattgt tggtggttat acttgtgctg ctaattctat tccatatcaa 60

gtttctttaa attctggttc tcatttttgt ggtggttctt tgattaattc tcaatgggtt 120

gtttctgctg ctcattgtta caaatcaaga atccaagtta gattgggtga acataatatt 180

gatgttttgg aaggtaatga acaatttatt aatgctgcta aaattattac tcatccaaat 240

tttaatggta atactttgga taatgatatt atgttgatta aattgtcttc tccagctact 300

ttaaattcaa gagttgctac tgtttctttg ccaagatctt gtgctgctgc tggtactgaa 360

tgtttgattt ctggttgggg taatactaaa tcttctggtt cttcttatcc atctttgttg 420

caatgtttga aagctccagt tttgtctgat tcttcttgta aatcttctta cccaggtcaa 480

attactggta atatgatttg tgttggtttt ttggaaggtg gtaaagatgc ttgtcaaggt 540

gattctggtg gtccagttgt ttgtaatggt caattgcaag gtattgtttc ttggggttat 600

ggttgtgctc aaaaaaataa accaggtgtt tacactaaag tttgtaatta tgttaattgg 660

attcaacaaa ctattgctgc taattag 687

<210>5

<211>247

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>成熟猪前-胰蛋白酶原的氨基酸序列

<220>

<221>肽

<222>(1)..(16)

<223>信号肽的氨基酸序列

<220>

<221>肽

<222>(17)..(247)

<223>猪胰蛋白酶原的氨基酸序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<300>

<400>5

Ile Pro Asn Thr Phe Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ala Ala Val Ala

1 5 10 15

Phe Pro Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala

20 25 30

Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe

35 40 45

Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His

50 55 60

Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp

65 70 75 80

Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr

85 90 95

His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile

100 105 110

Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser

115 120 125

Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly

130 135 140

Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln

145 150 155 160

Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr

165 170 175

Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly

180 185 190

Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn

195 200 205

Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys

210 215 220

Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile

225 230 235 240

Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn

245

<210>6

<211>960

<212>DNA

<213>巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)

<220>

<223>猪胰腺前-胰蛋白酶原变体的核苷酸序列

<220>

<221>不确定

<222>(1)..(267)

<223>编码信号肽的核苷酸序列

<220>

<221>不确定

<222>(268)..(960)

<223>编码变体猪胰腺胰蛋白酶原

<400>6

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgaa ttcgatgatg atgataaaat tgttggtggt 300

tatacttgtg ctgctaattc tattccatat caagtttctt taaattctgg ttctcatttt 360

tgtggtggtt ctttgattaa ttctcaatgg gttgtttctg ctgctcattg ttacaaatca 420

agaatccaag ttagattggg tgaacataat attgatgttt tggaaggtaa tgaacaattt 480

attaatgctg ctaaaattat tactcatcca aattttaatg gtaatacttt ggataatgat 540

attatgttga ttaaattgtc ttctccagct actttaaatt caagagttgc tactgtttct 600

ttgccaagat cttgtgctgc tgctggtact gaatgtttga tttctggttg gggtaatact 660

aaatcttctg gttcttctta tccatctttg ttgcaatgtt tgaaagctcc agttttgtct 720

gattcttctt gtaaatcttc ttacccaggt caaattactg gtaatatgat ttgtgttggt 780

tttttggaag gtggtaaaga tgcttgtcaa ggtgattctg gtggtccagt tgtttgtaat 840

ggtcaattgc aaggtattgt ttcttggggt tatggttgtg ctcaaaaaaa taaaccaggt 900

gtttacacta aagtttgtaa ttatgttaat tggattcaac aaactattgc tgctaattaa 960

<210>7

<211>938

<212>DNA

<213>巴斯德毕赤酵母

<220>

<223>巴斯德毕赤酵母AOX1启动子的核苷酸序列

<400>7

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaa 938

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物5’-胰蛋白酶

<400>8

gctgaagctg aattcgatga tgatg 25

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

3’胰蛋白酶

<400>9

gtttttgttc tagactaatt agcagc 26

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

5’Try-Ser172Ala

<400>10

ggtggtaaag atgcttgtca aggtg 25

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

3’Try-Ser172Ala

<400>11

caccttgaca ggcatcttta ccacc 25

Claims

1. Ser172Ala猪胰蛋白酶变体在制备胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物的方法中的用途。

2. 制备胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物的方法，其中：

(b)将得到的切割产物分离并且

(bb)将是胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物前体的那些切割产物进一步处理，并且分离并得到从此进一步处理得到的胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物。

3. 根据权利要求2的方法，其中所述胰岛素是人胰岛素。

4. 根据权利要求2的方法，其中所述胰岛素类似物选自包含Lys^B28Pro^B29人胰岛素、B28Asp人胰岛素、其中第B28位的脯氨酸已经被Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代并且第B29位的Lys可以被Pro取代的人胰岛素；AlaB26人胰岛素；去(B28-B30)人胰岛素；去(B27)人胰岛素和去(B30)人胰岛素的组。

5. 根据权利要求2的方法，其中所述胰岛素类似物是谷赖胰岛素。

6. 根据权利要求2的方法，其中所述胰岛素类似物是甘精胰岛素。

7. 根据权利要求2的方法，其中所述胰岛素衍生物选自包含B29-N-肉豆蔻酰-去(B30)人胰岛素、B29-N-棕榈酰-去(B30)人胰岛素、B29-N-肉豆蔻酰人胰岛素、B29-N-棕榈酰人胰岛素、B28-N-肉豆蔻酰Lys^B28Pro^B29人胰岛素、B28-N-棕榈酰-Lys^B28Pro^B29人胰岛素、B30-N-肉豆蔻酰-Thr^B29Lys^B30人胰岛素、B30-N-棕榈酰-Thr^B29Lys^B30人胰岛素、B29-N-(N-棕榈酰-Y-谷氨酰)-去(B30)人胰岛素、B29-N-(N-石胆酰-Y-谷氨酰)-去(B30)人胰岛素、B29-N-(ω-羧基十七酰)-去(B30)人胰岛素和B29-N-(ω-羧基十七酰)人胰岛素的组。

8. 根据权利要求2至5和7的任一项的方法，其中作为胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物前体的那些切割产物的进一步处理包括用羧肽酶B切割所述产物。

9. 根据权利要求2至8任一项的方法，其中用Ser172Ala猪胰蛋白酶切割在7.5至9.5范围的pH值、1℃至30℃的温度下进行；并且通过酸化样品终止酶促反应。

10. 根据权利要求9的方法，其中切割在8.3的pH值、8至12℃之间的温度下进行，并且通过加入1N或2N HCl溶液进行酸化。

11. 由序列SEQ ID.NO：3表征的Ser172Ala猪胰蛋白酶。

12. 编码Ser172Ala猪胰蛋白酶的DNA。

13. 根据权利要求12的DNA，其通过序列SEQ ID.NO：4表征。

14. 编码Ser172Ala猪胰蛋白酶原的DNA。

15. 根据权利要求14的DNA，其通过序列SEQ ID.NO：6表征。

16. 包含根据权利要求12、13、14或15任一项的DNA的载体。

17. 产生Ser172Ala猪胰蛋白酶的方法，其包括步骤：

(a)提供根据权利要求16的载体，

(b)用所述载体转化微生物宿主菌株，

(c)在包含营养物的生长培养基中培养转化的微生物宿主菌株，从而微生物宿主菌株表达Ser172Ala猪胰蛋白酶或Ser172Ala猪胰蛋白酶原，

(d)如果(c)的表达产物是Ser172Ala猪胰蛋白酶原，那么将其转化为成熟Ser172Ala猪胰蛋白酶，并且

(e)从微生物宿主菌株和/或生长培养基纯化Ser172Ala猪胰蛋白酶。

18. 根据权利要求17的方法，其中所述微生物宿主菌株是选自包含汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属和球拟酵母属物种的组的甲基营养酵母菌株。

19. 根据权利要求18的方法，其中所述微生物宿主菌株选自包含巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母、博伊丁假丝酵母和光滑球拟酵母的组。