JPH06500470A - メチロトローフ酵母細胞におけるインスリン様成長因子の産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、ｆＪ請求項に記載の酵母宿ｔ、ｍ胞を、ＩＧＦ−１が発現され且つ細胞外培 地中に１０ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度で分泌される条件下で培養すること を含む、ＩＧＦ−１を製造する方法。

４、ＤＮＡ構築物であって、 （ａ）インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）をコードするＤＮＡ。

（ｂ）ＩＧＦ−１をコードする該ＤＮＡに対して操作可能に結合したメチロトロ ーフ酵母のメタノール応答性遺伝子からのプロモーター領域：（ｃ）Ｓ、セレビ シェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ＞α交配因子（ｃｒＭＦ）ブレ１０配列をコードす るＤＮＡ。

（ｄ）ＴＧＦ−１をコードする該ＤＮＡに対して操作可能に結合したメチロトロ ーフ酵母宿主細胞の転写ターミネータ−機能を含み、 該ルグロ配列をコードするＤＮＡが、Ｉｙｓ−ａｒｇおよび１３’ｓ−ａｒｇ− （ｇｌｕ−ａｌａ）　Ｘがら成る群より選択される１が所またはそれ以上のプロ セッシング部位をコードするＤＮＡによって、ＩＧＦ−１をコードするＤＮＡに 対して操作可能に結合しており： Ｘは、ｇｌｕ−ａｌａ配列の反復数であり且つ不適当に開裂したｌＧ１−１を細 胞外培地中に生じる反復数未満である、発現カセットを含む上記のＤ　Ｎ　Ａ構 築物。

５、ｘが１．２または３である請求項４に記載のＤＮＡ構築物。

６、　少なくとも１種類の選択可能なりＡ識遺伝子および細菌性の複製起点を更 に含む請求項４に記載のＤＮＡ構築物。

７、　請求項６に記載のＤＮＡ構築物を含むプラスミド。

８、ｐｌＧＦ２０１．ｐｌＧＦ２０２、ｐＩＧＦ２０４、ｐＩＧＦ２０６および ｐＩＧＦ８１６から成る群より選択される請求項７に記載のプラスミド。

９、　ＩＧＦ−１ペプチドをコードする前記のＤＮＡか、図１に示した配列を有 する請求項４に記載のＤＮＡ構築物。

１０、プロモーターが誘導される前記のメチロトローフ酵母が、ピキア・バスト リス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）菌株である請求項４に記載のＤＮＡ構 築物。

１１、メチロトローフ酵母の前記のメタノール応答性遺伝子および転写ターミネ ータ−が双方ともＰ、パストリスＡＯＸＩ遺伝子から誘導される請求項１ｏに記 載のＤＮＡ構築物。

１２、構築物の３′末端および５′末端が、＃母宿主の標的遺伝子への該構築物 の組込みを指示された部位に作用するのに十分に該標的遺伝子と相同である請求 項１１に記載のＤＮＡ構築物。

１３、前記の発現力セントの多数のコピーを含む請求項１２に記載のＤＮＡ構築 物。

１４、構築物の３′末端およびう′末端が、酵母宿主の標的遺伝子への該構築物 の組込みを指示された部位に作用するのに十分に該標的遺伝子と相同である請求 項４に記載のＤＮＡ構築物。

Ｉう、前記の発現カセｖ（−の多数のコピーを含む請求項４に記載のＩ）ＮＡＷ ｓ築掬。

１６、前記の発現カセットの多数のコピーが頭−尾（ｈｅａｄ−ｔ、ｏ　−ｔａ ｌｅ）配向で配向されている請求項１′：）に記載のＤＮＡ構築物。

１７、前記の構築物か、ｐ［ＧＦ２０１、ρＩＧＦ２０２、ｐ　ＩＧＦ２０４、 ｐＩＧＦ２０６およびｐＩＧＦ８１６から成る群より選択されるプラスミドでＤ ＮＡに含まれている請求項４に記載のＤＮＡ構築物。

１８、請求項４に記載のＤＮＡ構築物を含むメチロトローフ酵母細胞。

１９、請求項９に記載のＤＮＡ構築物を含むメチロトローフ酵！細胞。

２０、前記の酵母かピキア・バストリス菌株である請求項１８に記載のメチロト ローフ酵母細胞。

２１、請求項１５に記載のＤＮＡ構築物を含むメチロトローフ酵母細胞。

２２　請求項１２に記載のＤＮＡ構築物を含むピキア・パストリス細胞。

２３　前記の細胞が、菌株Ｇ、−ＩＧＦ２０１Ｓ１．Ｇ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１、Ｇ ＋ＩＧＦ８１６Ｓ２、ＭｒＴＧＦ８１６Ｓ１およ乙（Ｃ±Ｉ　ＧＦ８１６　Ｓ　 １から成る群より選択される請求項２２に記載のＰ、パストリス細胞。

２４、請求項１３に記載のＤＮＡ４１１築鞠を含むＰ、パストリス細胞。

２５　前記の細胞か、菌株Ｇ＋ＩＧＦ２０６Ｓ２、Ｇ＋ＧＦ８１６Ｓ９、Ｇ＋Ｉ ＧＦ８１６Ｓ１１、Ｇ＋ＧＦ８１６Ｓ９およびＧ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１１．Ｇ十ｌ ＭＢ２０２Ｓ２、Ｇ−ＩＭＢ２０４Ｓ１４、ｃ＋ｌＭＢ２０６ｓ１、Ｇ＋ＩＭＢ 　２０６　Ｓ　２、Ｇ−ＩＭＢ２０６Ｓ３、Ｇ−１ＭＢ２０６Ｓ１、Ｇ＋ＩＧＦ ８１６Ｓ９、Ｇ＋ＩＧＦ８１６５１　Ｌ　Ｍ＋ＩＧＦ８１６Ｓ４およびＭＴＩ　 ＭＢ　２０６５１から成る群より選択される請求項２４に記載のＰ、パストリス 細胞。

２６、前記の細胞か、菌株ＧＴＩＧＦ２０６Ｓ２、Ｇ−ＩＭＢ２０６Ｓ３、Ｇ− １ＭＢ２０６Ｓ１．ＧｒＩＭＢ２０２Ｓ２およびＧ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４から成 る群より選択される請求項２４に記載のＰ、パストリス細胞４２７　請求項１８ に記載の酵母細胞を含む生育しうるメチロトローフ酵母細胞の培養。

２８、請求項２２に記載の＃ｔ４１１Ｉ胞を含む生ＷしうるＰ、バストリス＃胞 の培養。

２９、請求項２３に記載の酵！細胞の単一種類の菌株を含む生育しうるＰ、パス トリス細胞の培養。

３０、請求項２４に記載の酵母細胞を含む生育しうるＰ、パストリス細胞の培養 。

３１、請求項２５に記載の酵母細胞の単一種類の菌株を含む生育しうるＰ、パス トリス細胞の培養。

３２、請求項１８に記載の細胞を、該細胞が成熟ＩＧＦ−１ベグチドを発現し且 つ培地中に分泌する条件下で培養することを含む、インスリン様成長因子（ＩＧ Ｆ−１）を製造する方法。

３３、前記のメチロトローフ酵母がピキア・バストリス菌株である請求項３２に 記載の方法。

３４、前記の細胞を、炭素源としてメタノールを含む培地中で培養する請求項３ ２に記載の方法。

３５、前記の細胞かＭｕｔＴ表現型を有する請求項３２に記載の方法。

３６、前記の細胞がＭｕｔ−表現型を有する請求項３２に記載の方法。

３７、細胞がタンパク質分解によって損なわれいないし、そして培地のｐＨか約 ２〜約４である請求項３２に記載の方法。

３８、ｐＨが約３未満である請求項３７に記載の方法。

３９、前記の細胞がプロテアーゼ欠失であり且つ培地のｐＨが約２〜５である請 求項３２に記載の方法。

４０、請求項２１に記載の細胞を、該細胞が成！！！ＩＧＦ−１ペプチドを発現 し且つ培地中に介接する条件下で培養することを含む、インスリン様成長因子（ ■ＧＦ−１）を製造する方法。

４１、前記のメチロトローフ酵母がピキア・バストリス菌株である請求項４０に 記載の方法。

４２、前記の細胞を、炭素源としてメタノールを含む培地中で増殖させる請求項 ４０に記載の方法。

４３、前記の細胞がＭｕｔ、’表現型を有する請求項４０に記載の方法。

４４、前記の細胞がＭｕｔ−表現型を有する請求項４０に記載の方法。

４５、細胞がタンパク質分解によって損なわれていないし、そして培地のＰＨか 約２〜約４である請求項４０に記載の方法。

４６、ｐＨが約３未満である請求項４０に記載の方法。

４７、前記の細胞がプロテアーゼ欠失であり且つ培地のｐＨが約２〜うである請 求項４０に記載の方法。

４８、前記の菌株がプロテアーゼ欠失であり且つ該欠失が、前記のプロセンシン グ部位を認識する少なくとも１種類の１０テアーセに影響を及ぼさない請求項２ ０に記載の菌株。

４９、前記の欠失が、プロテイナーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＹおよびプロ テイナーゼＢから成る群より選択される１ｍ類またはそれ以上のプロテイナーゼ の不存在または濃度の減少を引き起こす請求項４８に記載の菌株。

５０、Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１、Ｍ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１．Ｍ士ＩＧＦ８１６Ｓ４ま たはＣ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１である請求項４９に記載の菌株。

明　細　書 メチロトローフ酵母細胞におけるインスリン様成長因子の産生関連出願 本出願は、１９９０年９月４日出願のブリアリ−（Ｂｒｉｅｒｌｅｙ）らによる 一部継続の米国特許出願第０７１５７８．７２８号明細書、「メチロトローフ酵 母細胞におけるインスリ７機成長因子の産生（ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ　０ＦＩＮ ＳＵＬＩＮ−ＬＩＫＥ　ＧＲＯＷＴＨＦＡＣＴＯＲ−Ｉ　ＩＮＭＥＴＨＹＬＯＴ ＲＯＰＨＩＣＹＥＡＳＴ　ＣＥＬＬＳ）Ｊである０本出願の内容は、更に、１９ ９１年４月１日出願のグリーソン（Ｇｌｅｅｓｏｎ）らによる米国特許出願第０ ７／６７８．９１６号明細書、「ピキア・バストリスのタンパク質分解活性に影 響を及ぼす遺伝子およびそれらの使用（ＧＥＮＥＳＷＨＩＣＨＩＮＦＬＵＥＮＣ Ｅ　ＰＩＣＨＩＡ　ＰＡＳＴＯＲＩＳＰＲＯＴＥＯＬＹＴＩＣＡＣＴＩＶＩＴＹ 、ＡＮＤ　ＵＳＥＳＴＨＥＲＥＦＯＲ）Ｊに関する。米国特許出願第０７１５７ ８．７２８号明細書および同第０７／６７８．９１６号明細書は、それらに対す る参考文献として完全に本明細書中に包含される。

発明の分野 ここにおいて、本発明は、ピキア・バストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ ＞（Ｐ、バストリス）などのメチロトローフ酵母宿主細胞を用いて、正しく折り たたまれた生物学的に活性のインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）を生産する方 法に関する。更に、本発明は、ＩＧＦ−１を産生ずるメチロトローフ酵母、ＩＧ Ｆ−１をコードするＤＮＡを含み且つメチロトローフ酵ｆ＆細胞を形質転換する のに用いられる発現ベクターを製造するためのＤＮＡ断片、発現ベクターおよび 形質転換した酵ｔｌ！ｌｌ胞を含む培養物に関する。

発明の背景 インスリン様成長因子−１は、インスリンの生物学的および化学的性質のいくつ かに関与するがインスリンとは抗原性によって興なる異種の系列のペプチドに属 する。現在利用可能な実験的根拠により、ＩＧＦ−１は成長ホルモンの作用を仲 介することによって成長を促進することが示唆される９例えば、骨格の成長、細 胞複製および他の成長関連過程などの過程はＩＧＦ−１濃度によって影響される 。ＩＧＦ−１の生理学的濃度は、甲状腺疾患、糖尿病および栄養失調などの症状 によって影響を受けることが分かった（プリース（Ｐｒｅｅｃｅ）（１９８３） Ｈｏｒｍ、Ｂｌｏｏｄ、４：１０８を参照されたい）、更に、ＩＧＦ−１は、例 えば、軟組織および間葉組織創傷の治癒を促進する場合（リンチ（Ｌｙｎｃｈ） ら（１９８９）Ｊ、Ｃ１ｔｎ、Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ、、工６：５４５：およ びリンチら（１９８７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、 ８４　ニア６９６を参照されたい）および血清不合組織培養培地中において哺乳 動物細胞の増殖を増大させる場合（バーレイ（Ｂｕｒｌｅｉｇｈ）ら（１９８６ ）Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌａｂ、、４：４８を参照されたい）に 、他の成長因子との相乗作用によって作用することか分かった。

ＩＧＦＩの多数の臨床および研究用途を考慮すると、ＩＧＦ−１の容易な供給は 、医学および生物工学の分野に対して大きな価値があるであろう、天然源からの 単離は技術的に難しく、高価でそして時間を浪費するので、最近の研究は、ＩＧ Ｆ−１の生産に有効な組換え体力法の開発に的がしぼられてきた。

異種のタンパク質の生産に用いられてきた宿主細胞の中で、大腸菌（Ｅｃｏｌｉ ）およびサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｖｉ ｓｉａｅ）（パン酵ｉ）がおそらく最も特徴付けられてｔ）る、インスリン様成 長因子−１（ＩＧＦ−１）は７０個のアミノ酸を有する分子量が７６４８ダルト ンのポリペプチドであり、３個の鎖内ジスルフィド橋を育する１本鎖タンパク質 である。これらのジスルフィド結合は、多数の水素結合および親水性相互作用と 一緒にこの分子の緻密な三次構造を保持している。しかしながら、大腸菌はタン パク質中にジスルフィド結合を生じる能力を有して覧）なし）ので、ＩＧＦ−１ などのジスルフィド結合を含むタンパク質は、大腸菌においてクローン化され且 つ発現される場合、不安定で且つ不活性複合体に凝集しがちであることカイ多い 、更に、大腸菌において生じたＩＧＦ−１は、酸化剤で抽出し且つ処理してジス ルフィド結合を生じさせなければならない、還元および再酸化の際に、細胞方墳 およびあまりに急速なジスルフィド結合の形成により不規則なジスルフィド結合 が結果として生じるので、ＩＧＦ−１は種々の方法で再度折りたたまれて１５種 類はどのモノマー性立体配置を形成する（メング（Ｍｅｎｇ）ら（１９８８）Ｊ 、Ｃｈｒｏｍ、、土工旦：１８３）、生物学的に活性のＩＧＦ−１を生産するた めに、得られた１５種類の種々の形態のＩＧＦ−１の混合物を分離しなければな らない、したがって、精製された生産物の収率は極めて低い（プロシアン（Ｇｒ ｏｓｓｇｉａｎ）（１９８５）Ｇｅｎｅ、１８：１９９）。

更に、大腸菌は原核生物であるので、真のＮ末端グリシンを含み且つ主要な翻訳 生成物に存在する開始メチオニンを含まないＩＧＦ−１分子を生産するには、Ｉ ＧＦ−１を大腸菌において融合タンパク質として発現させる必要があるｌ初に生 じた融合タンパク質からの成熟ＩＧＦ−１の開裂には、生産過程において更に別 の工程を必要とする。したがって、このペプチドを大腸菌宿主発現システムにお ける組換え手段によって生産する試みは、更に用いるために分離されなければな らない複雑な混合物の生産物形態を結果として生じる。（プロシアン（１９８５ ）Ｇｅｎｅ、１８：１９９を参照されたい）。

したがって、酵母細胞を含む真核宿主細胞は、多数の真核性タンパク質の発現用 に選択できる宿主細胞である。酵母宿主細胞は、異種タンパク質の生産において 、ブレプロ異種タンパク質を適切に処理し且つ異種蛋白を培地中に分泌するそれ らの能力を含む細菌にまさる明らかな利点を与える。細胞からのタンパク質の分 泌は、分泌された生成物がより高度の初期純度で得られ、そして更に、分泌され た生成物の精製が細胞破片の不存在によって一層容易になるという理由で、細胞 質中でのタンパク質の生産よりら優れていることが多い、更に、細胞の分泌軽路 および細胞外培地は、多数のタンパク質を適当に折りたたむのに必要なジスルフ ィド結合の形成を支持する酸化状態になりがちであるが（スミス（Ｓｍｉｔｈｌ ら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２１９）：４１１Ｉ胞質はジスルフ ィド結合を形成しない還元性環境である。したがって、正しい三次構造を維持す るのにジスルフィド結合に頼るスルフヒドリルに富むタンパク質の生産に対して は、このようなタンパク質を培地中に分泌することができる真核性宿主を発育さ せる抗しがたい必要性がある。したがって、適切に形成されたジスルフィド結合 を含むＩＧＦ−１などのスルフヒドリルに富むタンパク質の生産は、分泌経路を 経ることによって達成することができる。

ＩＧＦ−１は、自律複製する染色体外要素にＩＧＦＩをコードするＤＮＡを導入 することによってＳ、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主細胞を用いてク ローン化され且つ発現された。シェラ−フォース（Ｇｅｌｌｅｒｆｏｒｓ）らＮ １９８９）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６４＋１１４４４〜１１４４９）は、 Ｓ、セレビシェアクチンプロモーターの制御条件下におけるＳ、セレビシェでの ＩＧＦ−１の生産を記載している。ＩＧＦ−１生成物は、自律複製するプラスミ ド由来のＤＮＡによってコードされる。同様の研究において、ベイン（Ｂａｙｎ ｅｌら（（１９８８）Ｇｅｎｅ　６６：２３５〜２４４）は、Ｓ、セレビシェα 交配因子プロモーターの制御下のＳ、セレビシェにおけるＩＧＦ−１の生産を記 載している。しかしながら、後者は発酵ブイヨン１すｙトル当りのＩＧＦ−１が わずか約２ｍｇのＩＧＦ−１収率を報告している。

この低収率および自律性プラスミドに基づく酵母システムにおける異種タンパク 質の生産の拡大に関して一般的に遭遇される問題、例えば、プラスミド保持のた めの選択の失敗並びにプラスミド分布、コピー数および高細胞密度で操作された 発酵槽中の安定性に関する間趙を考慮して、生物学的に活性のＩＧＦ−１を多量 に製造するための一層有効な手段を開発する必要がある。

したがって、本発明の目的は、ＩＧＦ−１を安定して発現し且つ高濃度の生物学 的に活性のＩＧＦ−１を分泌する宿主細胞および発現ベクターを提供することで ある。

本発明のもう一つの目的は、高濃度の生物学的に活性のＩＧＦ−１を分泌するの みならす、このようなｒＧＦ−１を多量に製造するように容易に拡大することが できる、生物学的に活性のＩＧＦ−１の製造用発現システムを提供することであ る。

発明の概要 メチロトローフ酵母宿主細胞を用いる生物学的に活性のインスリン機成長因子− １（ＩＧＦ−１＞の製造用発現システムを用いる発現システムおよび方法を提供 する。その製造方法は、ＩＧＦ−１生産性を損なうことなく、しかも形質転換株 の増殖用に用いられた発酵粂件を大きく変化させることを必要とすることなく、 振どうフラスコ培養から大規模な発酵槽まで容易に拡大される。ＩＧＦ−１生成 物の単離および精製方法を更に提供する。

本明細書中において提供した発現システムおよび方法により、高水準の発現は宿 主細胞中へのマルチコピー１ラスミドの導入によってしか達成することができな いという、Ｓ、セレビシェでの異種タンパク質発現で遭遇した問題が避けられる 。

本明細書中に記載した発現システムは、ＩＧＦ−１の発現用に、例えば、Ｐ。

パストリスなどのメチロトローフ酵母宿主細胞を用いる。システムの重要な特徴 としては、ＩＧＦ−１をコードするＤＮＡ並びにＩＧＦ−１の分泌および１０セ ツシングを支配するシグナルをコードするＤＮＡの多重コピーを安定して組込み 且つ発現する能力並びに発現された前駆体ＩＧＦ−１から成熟ＩＧＦ−１を適当 に処理し且つ得られた成熟ＩＧＦ−１生成物を分泌する能力がある。

システムのもう一つの特徴は、ＩＧＦ−１をコードするＤ　Ｎ　Ａの発現を制御 するのに用いられてきたプロモーターの選択にある。プロモーターはメチロトロ ーフ酵母のメタノール応答性遺伝子、例えば、ＡＯＸｌから誘導され、厳格に調 節されており且つその制御下に置かれた遺伝子の高水準で調節された発現を提供 する（例えば、１９８６年６月４日に第０１８３０７１号として公開され米国に おいて米国特許第４．８５５．２３１号明細書として現在発行の欧州特許出願第 ８５１１３７３７．２号明細書を参照されたい）。

高濃度のＩＧＦ−１ペプチドの発現および分泌は、ＩＧＦ−１をコードするＤＮ Ａのコピーを６個程度またはそれ以上含んでよいが少なくとも１個のコピーを含 み、そこにおいてそのＤＮＡが、ＩＧＦ−１ペプチド生成物の１０セツシングお よび分泌を支配するのに有効であるシグナル配列をコードするＤＮＡと機能的に 結合しているＤＮＡＷＡ築鞠を用いてメチロトローフ酵母宿主を形質転換するこ とによって達成されてきた。そのＤＮＡ構築物は、更に、シグナル配列およびＩ ＧＦ−１ペプチドをコードするＤＮＡの発現を支配するプロモーター領域並びに メチロトローフ酵母における転写ターミネータ−機能を含む。

ここで提供されたＤＮＡ構築物は、更に、安定して組込みを行うのに、メチロト ローフ酵母宿主細胞ゲノム中の標的遺伝子と十分に相同であるヌクレオチド配列 を含む０組込みは標的遺伝子の部位での付加および置換によって生じる。或いは 、ＤＮＡ構築物は、宿主とプラスミド配列との相同部位での付加によって組込む 環状プラスミドの一部分であることかできる。

別の実施！ｒｓ様により、発現カセットの少なくとも１個のコピーを含むＤＮＡ 構築物を有する発現ベクターを提供する。前述。

らう一つの態様により、前記に記載したＤＮＡ断片の少なくとも１個のコピーを それらのゲノム中に含む新規のメチロトローフ酵母細胞を提供する。好ましい実 施ｇ様において、細胞は、ＩＧＦ−１の前駆体の適当な開裂に不可欠ではない１ 種類またはそれ以上のプロテアーゼを欠いている。

好ましい実施態様において、宿主細胞はＰ、パストリスであり、そのプロモータ ーはＡＯＸ１プロモーターであり、そしてシグナル配列は、式１ｙｓ−ａｒｇ− （ｇｌｕ−ａｌａ）　（式中、Ｘは０〜３であるのが好ましい）を有するプロセ ッシング配列を含むＳ、セレビシェα交配因子（αＭＦ）プレプロ配列である。

このＤＮＡ構築物の少なくとも１個のコピーが導入されたメチロトローフ酵母細 胞は、生物学的に活性のＩＧＦ−１ベグチドを効率よく生産し且つ培地中に分泌 する。好ましい実施態様において、ＩＧＦ−１は、メチロトローフ酵母であるＰ 。

パストリスにおいて極めて効率よく生産され且つそこから分泌された。

メチロトローフ宿主細胞によって生産されたポリペプチド生成物は、培地中に高 濃度で分泌され：そのＩＧＦ−１ベグチド分泌濃度は、Ｓ、セレビシェからのＩ ＧＦＩの分泌に関して報告されている濃度の数倍である（例えば、ベインら（１ ９８８）Ｇｅｎｅ、６６：２３５〜２４４を参照されたい）、ＩＧＦ−１ペアチ ドは、メチロトローフ酵母のメタノール応答性遺伝子のプロモーター領域の調節 下において、プレプロタンパク質からの成熟ＩＧＦ−１の適当なタンパク質分解 開裂に十分であるｌｙｓ−ａｒｇなどの少なくとも１か所の部位を含むＳ。

セレビシェα交配因子（αＭＦ）プレプロ配列などのシグナル配列をコードする ＤＮＡと機能的に結合したＩＧＦ−１ペプチドを機能的にコードするＤＮＡ配列 の１個またはそれ以上のコピーをゲノム中に含んでいるメチロトローフ＃母＃ｌ 胞によって生産される。更に、シグナル配列をコードするＤＮＡは、適当な１０ セツシングを支配するのにも役立つ１個またはそれ以上のｇｌｕ−ａｌａ配列を コードすることができる。ｇｌｕ−ａｌａ配列の数は０〜３個であるのが好まし いが、更に多くのコピーを含んでいてよい、コピー数は、選択された宿主のプレ プロタンパク質を適当に処理する能力によって制限される。

また更に別の実施態様により、Ｓ、セレビシェαＭＦプレ１０配列をコードする ＤＮＡと機能するように連結されたＩＧＦ−１ペプチドをｌｌ能的にコードする ＤＮＡ配列の少なくとも１個のコピーをゲノム中に含んでいるメチロトローフ酵 母形質転換細胞を増殖させることによってＩＧＦ−１ペプチドを生産する方法を 提供する。このブレ１０配列はグロセヅシング配列１ｙｓ−ａｒｇを含み、そし て更に、０〜３個のｇｌｕ−ａｌａｌミスペーサ−を含むことができる。シグナ ルをコードするＤＮＡおよびＩＧＦ−１ペプチドをコードするＤＮＡ双方の転写 は、メチロトローフ酵母のメタノール応答性遺伝子のプロモーター領域の調節下 にある。プロモーターを誘導する条件下において、ＤＮＡの転写は、前駆体ＩＧ Ｆ−１の発現およびグロセッシング並びにｒＧＦ−１ペプチドの培地中への分泌 の結果として誘導される。

ＩＧＦ−１ペプチドを生産することができる生存しうるメチロトローフ＃ｔ４１ １胞の培養もまた、本発明の範囲内である。好ましい実施態様において、ＩＧＦ −１を発現し且つ分泌する酵母宿主細胞は、宿主細胞１０テア一ゼ発現に直接的 にまたは間接的に影響を及ぼす１種類またはそれ以上の宿主細胞遺伝子の分断に よって修飾された。この分断の結果として、宿主細胞のある種のプロテアーゼ活 性、例えば、プロテアーゼＡおよびカルボキシペプチダーゼＹ活性の低下が起こ る。

Ｐ、パストリス発酵ブイヨンからＩＧＦ−１ペプチドを回収し且つ精製する好虚 しい方法は、米国特許出顯第０７／６４１，４３０号明細書に記載されている。

ＩＧＦ−１の好ましい形態は、承認された生物検定法（例えば、タカノ（Ｔａｋ ａｎｏ）ら（１９７６）Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏｃｒ、８２；４４９〜４５９；シェ ーニ−（Ｓｃｈｏｅｎｉｅ）ら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ　２９６：２５２〜２ ５３；コブランド（Ｃｏｐｅ　ｌ　ａｎｄｌら（１９８３）Ａｍ、Ｊ。

Ｐｒｉｍａｔｏｌｏ　旦：１６１〜１６９およびプール・オファース（Ｂｕｕｌ −Ｏｆｆｅｒｓｌら（１９８６）Ｐｅｄ、Ｒｅｓ、２０：８２５〜８２７を参照 されたい）で測定された場合に、天然のインスリン機成長因子−１と実質的に同 一の生物学的活性を示すポリペプチド生成物であり、配列表において配列番号１ である天然のＩＧＦ−１と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。１個若しくは それ以上のアミノ酸を欠いているかまたは追加のアミノ酸を含んでいるようにア ミノ酸配列に若干の変化を有する、或いは若干の１換アミノ酸を有するポリペプ チドは、これらのペプチドか既知の生物検定法によってＩＧＦ−１の機能活性を 示すという粂件付きで本発明の範囲内であることは理解される。このようなｒＧ Ｆ−１としては、正しく折りたたまれたＩＧＦ−１のみならず、ＩＧＦ−１受容 体に対して検出可能に結合する能力を示し且つＩＧＦ−１に関係した少なくとも １種類の生物活性を実証する誤って折りたたまれたおよびマルチマーの形態のＩ ＧＦ−１６挙げることができる。更に、生物学的に不活性の形態は、還元および 酸化によって活性形態に変換することができる。

図面の簡単な説明 図１は、合成インスリン様成長因子遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。

図２は、プラスミドρＩＧＦ２０１の制限地図である。

図３は、プラスミドρＩＧＦ２０２の制限地図である。

図４は、プラスミドｐｌＧＦ２０４の制限地図である。

図５は、グラスミドＰ　ＩＧＦ２０６の制限地図である。

図６は、プラスミドρＡＯ８１５の制限地図である。

発明の詳細な説明 定義： 特に定義しない限り、本明細書中で用いた技術的および科学的用語はいずれも本 発明の属する当該技術分野の技術者によって一般的に理解されるのと同一の意味 を有する０本明細書中で言及した印刷物はいずれも参考として包含される。本明 細書中で言及した米国特許明細書はいずれも参考として完全に包含される。

本明細書中で用いられるＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１ペプチドは、ＩＧＦ−１の 対立遺伝子変種を全て含むことを意味する。更に、天然に存在する生成物のアミ ノ酸配列の単純な修飾によって、例えば、特定部位の突然変異誘発または池の標 準法によって得られた誘導体は本発明の範囲内に包含される。天然に存在するＩ ＧＦ−１と同様の生物学的活性を示すＩＧＦ−１の形態もまた、本発明によって 包含される。ＩＧＦ−１とは、培地中に存在するＩＧＦ−１の形態を全て包含す ることを意味する。このようなＩＧＦ−１はいくつかの異なる三次元形態の混合 物であってよい、完全でモノマー性の正しく折りたたまれた材料である真のＩＧ Ｆ−１に加えて、他の形態はＩＧＦ−１を発現する宿主＋ｉｉＢ胞の細胞外培地 中に存在することができ、例えば、誤って折りたたまれたタンパク質、ダイマー およびトリマーなどのマルチマー形態である１本明細書中で用いられるＩＧＦ− １ペプチドとは、ＩＧＦ−１受容体に結合する能力を有し、そして標準的な活性 検定ランドら（１９８３）Ａｍ、Ｊ、Ｐｒｉｍａｔｏｌｏ　旦：１６１〜１６９ およびプール・オファースら（１９８６）Ｐｅｄ、Ｒｅｓ、２０：８２５〜８２ ７を参照されたい）において、細胞増殖若しくは細胞成長を促進する能力などの ＩＧＦ−１の生物学的活性に関係している少なくとも１種類の活性を示すペプチ ドをいずれも含むということを意味する。

本明細書中で用いられる生物学的活性を有するＩＧＦ−１ペプチドとは、標準検 定法によって検出されたようにＩＧＦ−１受容体に特異的に結合し、そして承認 された検定法において測定されたようにＩＧＦ−１に関係した生物学的活性を示 すペプチドである。このような検定法は当業者に知られている。

本明細書中で用いられる真のＩＧＦ−１とは、ジスルフィド結合を、それらが天 然に存在するＩＧＦ−１中に存在しているように含むＩＧＦ−１を意味する。

真のＩＧＦ−１は、Ｐ、バストリス発酵ブイヨンから効率よく回収し且つ精製す ることかできる。

本明細書中で用いられる成熟ＩＧＦ−１とは、シグナル配列およびプロセッシン グ配列か開裂された被処理ＩＧＦ−１を意味する。成熟ｒＧＦ−１としては、培 地中に分泌されている真のＩＧＦ−１および被処理ＩＧＦ−１の任意の他の形態 がある。ＩＧＦ−１とは、ｌＧ１−１受容体に結合し且つ当業者に知られている 任意の手段によって測定される細胞成長または増殖を促進するペプチドを包含す ることを意味する。

本明細書中で用いられるプレプロＩＧＦ−１とは、前記の宿主の細胞外空間中へ の成熟ＩＧＦ−１の分泌をもたらすリーダーまたはシグナル配列およびプレプロ ｌＧ１−１のグロ七ンシングを支配して成熟ＩＧＦｉを生産するＩＰ１１類また はそれ以上の１０センシング配列を含むポリペプチドを意味する６本明細書中で 用いられる分泌されたＩＧＦ−１とは、シグナルまたはリーダー配列を含んでい ない被処理ＩＧＦ−１を意味する。被処理ｒＧＦ−１または被処理タンパク質と は、リーダーシグナルが削除されたＩＧＦ−１またはタンパク質を意味する。

本明細書中で用いられるシグナルまたはリーダー配列という表現は交換可能に用 いられ、細胞膜を介する結合したポリペプチドの輸送をもたらすアミノ酸の配列 を意味する。シグナル配列とは、それが結合しているタンパク質のアミン末端に ある疎水性アミノ酸の配列を意味する。シグナル配列をコードするＤＮＡは１、 へＴＧ開始コドンから下流（転写方向の３′）および構造遺伝子をコードするＤ ＮＡから上！（５′）に位置する。更に、シグナル配列は、シグナル配列とタン パク質との間に挿入されたプロセッシング部位である、１種類またはそれ以上の 宿を細胞プロテアーゼによって認識されるアミノ酸の１種類またはそれ以上の配 列を含み、それによってシグナルの除去を行うことができる。シグナル配列、プ ロセッシング部位およびタンパク質をプレプロタンパク質と称する。

ここにおいて使用が考えられたシグナル配列およびプロセッシング部位は、Ｐ、 パストリスなどのメチロトローフ酵母宿主細胞のＩｔＭ胞膜を介するＩＧＦ−１ の輸送をもたらすものである。好ましい実施１［において、ｌｙｓ−ａｒｇおよ び（ｇｌｕ−ａｌａ）　（式中、Ｘは整数であり、好ましくは０〜３である）で あるシグナル配列およびプロセッシング部位はＳ、セレビシェαＭＦ遺伝子から 誘導される。当業者に知られているメチロトローフ宿主の細胞外空間中に成熟Ｉ ＧＦ−１を分泌するのに有効であるシグナル配列およびプロセッシング部位はい ずれも用いることができる。好ましい実施態様において、シグナル配列は、メチ ロトローフ宿主細胞の発酵ブイヨンの細胞密度が約３００ｇ／Ｌ　（ＭｅＯＨ） であり且つ少なくとも約Ｌｏｎｇ／ｍｌの真のＩＧＦ−１をブイヨン中に分泌す るように選択される。ＩＧＦ−１とコードするＤＮＡに対して結合した適当なシ グナル配列およびプロセッシング部位をコードするＤＮＡ構築物は、当業者に知 られている方法または本明細書中に記載された方法によって製造し且つメチロト ローフ宿主のゲノム中に導入し、そして培地中への成熟ＩＧＦ−１の分泌を支配 するそれらの能力について試験することができる。比較的高濃度の、好ましくは 、１０ｍｇ／ｍ＋を越える成熟ＩＧＦ−１を分泌させるシグナル配列はいずれも 、ここでの使用が考えられる。

本明細書中で用いられる異種ＤＮＡとしては、それか存在しているゲノムの一部 分として天然に存在していないまたはそれが天然に存在しているのとは興なるゲ ノム中の１か所または複数の位１で見出されるＤＮＡがある。異種ＤＮＡは、通 常、それが導入される細胞が内在しないものであり、別の細胞から得られたもの である。概して必然的ではないが、このようなりＮＡは、それが発現されている 細胞によって通常は生じないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。異種ＤＮＡ は他種ＤＮＡと称することもできる０発現させる細胞に対して当業者が異種また は他種として認識しまたは見なすであろうＤＮＡはいずれも、本明細書中では異 種ＤＮＡに包含される。異種ＤＮＡの例としては制限されないが、ＩＧＦ−Ｌ転 写および翻訳調節配列、選択可能なまたは由来のわかる標識タンパク質、例えば 、薬剤耐性を与えるタンパク質をコードするＤＮＡがある。

本明細書中で用いられる発現カセットとは、ＩＧＦ−１の発現および分泌双方に 対して配列機能を有するＤＮＡ構築物を意味する。したがって、発現カセットは 、ブロモ−ター領域をコードするＤＮＡ、転写終結領域をコードするＤ　Ｎ　Ａ 、発現されたペプチドの翻訳、分泌および適当なプロセッシングに十分な配列を 含む、更に、好ましい実施！９様において、発現カセットは、宿主細胞ゲノム中 の標的遺伝子座から誘導され、それによって宿主細胞中に導入する際に発現カセ ットが宿主細胞ゲノム中に安定して組込まれる５′および３′末端の配列かある 。

本明細書中で用いられるＤＮＡ構築物という用語は発現カセットを包含し、更に 、１種類以上の発現カセットを含むＤＮＡ断片を含む。

本明細書中で用いられる機能的結合または機能的に連結したという用語は、ＤＮ Ａ構築物の要素間の関係を意味し、ここにおいて要素は、ヌクレオチドのタンパ ク質−またはペプチドコード配列を含む構築物におけるＤＮＡの発現を直接的に または間接的に調節する構築物の一部分であるヌクレオチドのこのような調節配 列に配置されている。

本明細書中で用いられる７ＩＧＦ−１ペプチドを機能的にコードするＤＮＡ断片 」という用語は、ＩＧＦ−１または前記に定義の任意の他のｒＩＧＦ−１ペプチ ド」をコードするＤＮＡ断片を含む、ＩＧＦ−１をコードするＤＮＡは当該技術 分野において知られており、そして化学的合成法によってまたはＩＧＦ−１に対 応するメンセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への転 写によって得られ且つ後者を二本ｇｃＤＮＡに変換することことができる。ヒト ＩＧＦ−１に関する遺伝子の化学的合成法は、例えば、ニワ（Ｎｉｗａ）ら（１ ８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、上３：１９２３〜１９ ３８に開示されている。更に一必要なり　Ｎ　Ａ配列は、例えば、ＩＧＦ−１遺 伝子を保持している既知のベクターの制限酵素消化によって取り出すことかでき る。

このようなベクターの例およびそれらの製造手段は当業者に周知である０例えば 、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、上３：１９２３〜１９３８ を参照されたい０本発明によって用いられた現在のところ好ましいＩＧＦ−１遺 伝子のヌクレオチド配列を図１に図示し、更に実施例において説明する。

本明細書中で用いられる発現ベクターという用語は、選択された宿主細胞中のプ ロモーター配列などの発現をもたたらずことができる池の配列と機能的に連結さ れている、ＤＮＡを発現することができるベクターを含むことを意味する。一般 的には、組換えＤＮＡ技術において通常用いられる発現ベクターは、環状の二本 ＨＤＮＡループの染色体外要素である「１ラスミド」の形であることが多い。

本明細書中で用いられる「ベクター」および「プラスミド」という用語は交換可 能に用いられ、そして制限されないか、異種ＤＮＡを特定の宿主細胞において発 現させる発現ベクターまたは手段を全て含むことを意味する。

本明細書中で用いられる「培養」という用語は、細胞の増殖を導く培地中でのそ れらの増殖およびそれらの継代培養全部を意味する。「継代培養」という用語は 、問題の継代培養および培養源間で行われた継代培養回数にかかわりなく、別の 培養（培養源）の細胞から増殖した細胞の培養または培養源の任意の継代培養を 意味する。

明細書中に示したアミノ酸の各種配列で見られるアミノ酸は、当該技術分野にお いて日常的に用いられるそれらの通常の三文字および一文字略語を有する。

二９／敢　隻語 し−アラニン　Ａｌａ　Ａ し一アルギニン　Ａｒｇ　Ｒ し一アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ Ｌ−アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ Ｌ−システィン　Ｃｙｓ　Ｃ Ｌ−グルタミン　Ｇｌｎ　Ｑ Ｌ−グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ し一グリシン　ＧＩｙ　Ｇ Ｌ−ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ Ｌ−インロイシン　Ｉｌｅ　Ｔ Ｌ−ロイシン　Ｌｅｕ　Ｌ Ｌ−メチオニン　Ｍｅｔ、　Ｍ Ｌ−フェニルアラニジ　Ｐｈｅ　Ｆ Ｌ−１−リプトファン　Ｔ　ｒ　ｐ　Ｗ宿主細胞 本発明の実施において使用が考えられた酵母種はメチロトローフであり、すなわ ち、メタノールを炭素源として増殖することかできる種である。メタノールの利 用に不可欠の生化学的経路を有する種は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉ　ｄａ）、ハ ンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕ　Ｉａ）、ピキア属（Ｐｔｃｈｉａ）およびトルロ プシス属（Ｔｏｒｕ　ｔｏｐｓ　ｉｓ）の４種類の属に分けられる。これらの内 、ハンセヌラ・ポリモルフｙ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）お よびピキア・バストリス種の構成要素の分子生掬字についての実質的な量の知見 が存在する。

Ｐ、パストリスは現在のところ好ましい＃母種である。Ｐ、バストリスは、メタ ノールを堆−の炭素源およびエネルギー源として効率よく利用することができる 既知の工業用酵母菌株である。

ＤＮＡ構築物 メチロトローフ＃ｆ＆細胞を形質転換するのに用いられたＤＮＡ構築物または発 現カセットは、メチロトローフ酵母遺伝子からのメタノール応答性プロモーター 、ＩＧＦ−１−（ＩＧＦ−１遺伝子）をコードするＤＮＡ、遺伝子に関する読み 取り枠内のシグナル配列をコードするＤ　Ｎ　Ａおよびメチロトローフ酵母の転 写ターミネータ−機能を含む、シグナル配列は、酵母宿主細胞からの分泌および そこでのＩＧＦ−１の適当なプロセンシングを支配するように機能するような任 意の配列であることかできる。Ｓ、セレビシェαＭＦプレグロ配列は好ましいシ グナル配列である。αＭＦプレプロ配列としては、プロセッシング配列１ｙｓ− ａｒｇおよび（ｇｌｕ−ａｌａ）　スペーサー配列（式中、Ｘは０．１．２また は３である）をコードするＤＮＡ配列かある。

Ｓ、セレビシェアルファ交配因子は、「アルファ」交配型の細胞によって分泌さ れた１３残基ベグチドであり、対する１″ａ、交配型の細胞に対して、２穆頚の の細胞型間の有効な接合を促進し、それによって「ａ−アルファｊ二倍体細胞を 形成するように作用する（トーナー（Ｔｈｏｒｎｅｒ）ら（１９８１）ＴｈｅＭ ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｔｈｅ　ＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅ ｓ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−０ ＮＹ、１４３）、α因子は、８３残基リーダーおよび４つのα因子ペプチド領域 を含む１６５アミノ酸長さの前駆体として合成される。

各領域は、配列：Ｉｙｓ−ａｒｇ　ｇｌｕ−ａｌａ−ａｓｐ−ａｌａ−ｇｌｕ− ａｌａ；　！ｙｓ−ａｒｇ−（ｇｌｕ−ａｌａ＞３またはｌ　ｙｓ−ａｒｇ　− （ｇ　１ｕａｌａ）２の短いスペーサーベグチドを上流に有する。リーダーおよ びスペーサーは、タンパク質分解グロセッシングおよび分泌のためのアミノ酸配 列を含む（例えば、ブレイク（Ｂｒａｋｅｌら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａ ｄ。

Ｓｅｔ、ＵＳＡ、８１　：４６４２　（１９８４）を参照されない）。

メチロトローフ酵母には多数のメタノール応答性遺伝子が存在している。それぞ れの発現は、プロモーターとら称されるメタノール応答性調節領域によって制御 されている。このようなメタノール応答性プロモーターはいずれもＤＮＡ構築物 で用いるのに適当である。具体的な調節領域の例としては制限されないが、ピキ ア・パストリスＡＯＸ１からの第一アルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモータ ー、ピキア・バストリスＡＯＸ２からの第二アルコールオキシダーゼ遺伝子のプ ロモーター、ピキア・パストリスからのジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子 （ＤＡＳ）のプロモーター、ピキア・バストリスからのＰ４０遺伝子の１０モ− ター、ピキア・パストリスからのカタラーゼ遺伝子のプロモーターがある。適当 なプロモーター領域および他の調節領域の選択は、この開示の観点から当該技術 分野の技術水準の範囲内である。

ＩＧＦ−１遺伝子発現を誘導するのに用いられた現在のところ好ましい１０モー ター鎖域は、Ｐ、パストリスのメタノール調節アルコールオキシダーゼ遺伝子か ら誘導される。Ｐ、パストリスは、２種類の官能性アルコールオキシダーセ遺伝 子、すなわち、アルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸＩ）およびアルコールオキシ ダーゼＩ　Ｉ　（ＡＯＸ２）遺伝子を含むことが知られている。２種類のＡＯＸ 遺伝子のコーディング部分は、ＤＮＡおよび予測されたアミノ酸配列双方の段階 で密接に相同であり且つ共通の制限部位を共有している。２種類の遺伝子から発 現されたタンパク質は同機の酵素特性を有するが、ＡＯＸ１遺伝子のプロモータ ーはより有効であり且つ高水準の遺伝子発現を提供し、したがって、その使用は ＩＧＦ−１発現に好適である。そのプロモーターを含むＡＯＸ１遺伝子は単離さ れ且つ完全に特徴付けられた。プレス（Ｅｌｌｉｓ）ら（１９８５）Ｍｏｌ。

Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、５：１１１１および米国特許第４．８５５．２３１号明 細書を参照されたい。

メチロトローフ酵母細胞中に導入されているＤＮＡ構築物は、メチロトローフ酵 母遺伝子のメタノール応答性プロモーター並びにＩＧＦ−１−読み取り枠シグナ ルおよびプロセッシング配列をコードするＤＮＡおよび読み取り枠内シグナルお よびプロセッシング配列をコードするＤＮＡの他に、メチロトローフ酵母の転写 ターミネーター機能を含む、ここで用いたメチロトローフ酵母の転写ターミネー タ−機能は、（ａ）転写物におけるポリアデニル化シグナルおよびポリアデニル 化部位をコードするサブセグメントおよび／または（ｂ）発現カセットで用いら れるプロモーターからの転写のための転写終結シグナルを与えるサブセグメント を有する。完全な転写ターミネータ−は、プロモーター源である遺伝子と同一で あってよいしまたは興なっていてよいタンパク質コード遺伝子から得られる。

ＤＮＡ構築物は、更に、選択可能な標識遺伝子を含むことができる。この目的に 対しては、メチロトローフ酵母の選択可能な標識遺伝子機能をいずれも用いるこ とができ、制限されないか、メチロトローフ酵母に対してこのような酵ｔＡＩＩ Ｉ胞が大多数の非形質転換細胞の中から識別され且つ選択的に増殖することを許 す選択可能な表現型を与える任意の遺伝子がある。適当な選択可能なｍ識遺伝子 は、例えば、栄養要求性突然変異体Ｐ、バストリス宿主菌株および宿主の欠点を 相補する野生型生合成遺伝子であろう０例えば、Ｓ、セレビシェまたはＰ、バス トリスＨＩＳ４遺伝子を用いてＨｉｓ４　Ｐ、バストリス菌株を相補することが できるし、またはＳ、セレビシェＡＲＧ４遺伝子若しくはＰ、バストリスＡＲＧ ４遺伝子を用いてＡｒｇ４−突然変異体を相補することができる。

更に、ＤＮＡｍ築物は１細菌の機能である選択可能な標識遺伝子を付加的に含む ことかできる０例えば、細菌に対して、形質転換した細菌細胞が大多数の非形質 転換細胞の中から識別され且つ選択的に増殖することを許す表現型を与える任意 の遺伝子を用いることができる。この追加の選択可能な４１ｍは、このようなり ＮＡが大腸菌などの細菌宿主細胞中に導入され且つそこで増幅することを許す。

適当な選択可能な標識遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ　）、 テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃ’）等がある。

ＤＮＡ構築物は、細菌、特に大腸直での複製および選択を可能にする配列を含む ことができる。特に、ＤＮＡ構築物はグラミド中に挿入することができるしまた はそれを環状化して、細菌での複製および染色体外保持のための配列を含むプラ スミドを生成することができる。この方法において、多量のＤＮＡ断片を、細菌 における複製によって製造することができる。このような増幅が望まれる場合、 ＤＮＡ構築物は細菌性の複製起点を含んで、細菌の世代から世代へのＤＮＡ構築 物の維持を確実にすべきである。典型的な細菌性の複製起点としては、ｆｌ−ｏ ｒｉ、コリシン、ｃｏｌＥｌおよびその他の当業者に知られているものまたは当 業者によって識別されることができるものがある。

ＤＮＡ構築物は、シグナルおよび１０セツシングシグナル並びに他の転写調節シ グナルに対して機能的に結合したＩＧＦ−１をコードするＤＮＡの多重コピーを 含むことができ、すなわち、ＤＮＡ構築物は、発現カセットの多重コピーを含む ことができる。

ＤＮＡ構築物によるメチロトローフ酵母宿主細胞の形質転換メチロトローフ酵母 、例えば、Ｐ、パストリスなどを形質転換する方法並びにそれらのゲノム中に異 種タンパク質をコードする遺伝子を含むメチロトローフ酵ｍ細胞を培養するため の方法は、概して、当該技術分野において知られている。

発現カセットは、当業者に既知の任意の方法によってメチロトローフ酵母細胞中 に導入することができる。好ましい方法としては、フレラグ（Ｃｒｅｇｇｌら（ １９８５）Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、５：３３７６および米国特許第４゜ ８７９．２３１号明細書に記載されたスフェロプラスト技術、および全細胞塩化 リチウム酵母形質転換システム（イト−（Ｉｔｏ）ら（１９８４）Δ五二土立よ りｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、４８：　３４１）にＰ、パストリスなどのメチロトローフ 酵母に適応させるのに必要な修飾を伴うものがある（欧州特許出膨第３１２．９ ３・４号明細書：米国特許第４．９２９．５３５号明細書としても入手可能を＃ 照されたい）。

Ｐ、パストリス遺伝子のプロモーター領域の調節下において、ＩＧＦ１遺伝子を 含む１ｌｔａ状Ｄ　Ｎ　Ａ断片並びにプロセンシングおよび分泌に必要なαＭＦ プレプロ配列をコードするＤＮＡによって＃母宿主を形質転換する場合、発現カ セットは、何等かの当該技術分野において知られている遺伝子置換技術によって 、例えば、一段遺伝子置換（例えば、ロスティン（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ）（１９ ８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、１０１：２０２；フレラグら（１９８ ７）Ｂｉｏ／Ｔｅｅｈｎｏｌｏ　旦：　４７９　；および米国特許第４．８８２ ，２７９号明細書を参照されたい）によってまたは二段遺伝子置換法（例えば、 シエーラー（Ｓｃｈｅｒｅｒ）およびディビス（Ｄａｖｉｓ）（１９７９）Ｐｒ ｏｃ。

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、ヱ６：４９５１を参照されたい）に よって宿主ゲノム中に組み込まれる。線状ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ１！ｌｒ片か中 に組込まれるのに十分に標的遺伝子と相同であるＤ　Ｎ　Ａ配列の側面に位置す ることよって標的遺伝子に対して向けられている。一段遺伝子分断は、導入され るＤＮＡが、標的遺伝子の断片遺伝子座と０．２ｋｂ程度の小さい相同性を有す る場合に成功するのが一般的であるが：しかしながら、効率のためには相同の程 度を最大限にするのか好ましい。

好ましい実施態様において、これらの発現カセットの多重コピーは一つのＤＮＡ 断片上に、好ましくは、頭−尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｌｅｌ配向で含まれる。

ＤＮＡ断片が環状プラスミド中に含まれる場合、そのプラスミドは遺伝子分断よ りもむしろ付加によってゲノム中に組込まれることかできる。プラスミドの１個 またはそれ以上のコピーは、ゲノムの同一または異なる遺伝子座に組込まれるこ とができる。ゲノム中への組込みは、適当な制限エンドヌクレアーゼによるプラ スミドの線状化によって促進される。

１種類または複数の発現力セントを有するＤＮＡ断片は、互いに「機能的に連結 」しているといわれる、ＩＧＦ−１ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、１０モ ーター、Ｓ、セレビシェαＭＦプレグロ配列をコードするＤＮＡ配列および転写 ターミネータ−に関して機能的に位置し且つ配向している。したがって、ポリペ プチドコードセグメントはプロモーター領域の調節下において転写されて、翻訳 の際に望ましいポリペプチドを提供することができる転写物になる。αＭＦグレ グロ配列の存在ゆえに、発現されたＩＧＦ−１生成物は培地中に分泌される。

発現力セントの種々のセグメントの適当な読み取り枠位置決定および配向は、当 業者の知識の範囲内であり二更に詳細を実施例で与える。

陽性の形質転換細胞は、例えば、ＤＮＡ組込み部位を決定するサザンプロット分 析法（マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ ｌｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、＝ｒ−ルド・スプリン グ・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス、コールド・スプリング・ハーバ−。

ニューヨーク、米国）：例えば、メタノール応答性ＩＧＦ−１遺伝子発現を確証 するノザンブロント（マニアティスら（１９８２１ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏｎ ｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、＝７−ルド・スプリング・ハ ーバ−・ラボラトリ−・プレス、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨー ク、米国、Ｒ，Ｓ、シト７−（Ｚｉｔｏｍｅｒ）およびＢ、Ｄ、ホール（Ｈａｌ Ｉ）（１９７６）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５１：６３２０）；および増殖 培地中の分泌されたＩＧＦ−１ペプチドの存在を検出するための生成物分析法を 含む当業者に既知の任意の方法によって単離し、同定し且つ特徴付けることがで きる。

多数の発現カセットによって形質転換するための現在のところ好ましい宿主細胞 は、形質転換するＤＮＡ断片上に存在する標識遺伝子によって相補することがで きる少なくとも１種類の突然変異を有するＰ、パストリス細胞である。好ましく は、Ｈｉｓ４　（ＧＳ１１５）またはＡｒｇ４　（ＧＳ１９０）栄養要求突然変 異体Ｐ、バストリス菌株を用いる。ｌ＆も好ましい菌株は、選択されたリーダー 配列の適当なプロセンシングに必要とされない１種類またはそれ以上のプロテア ーゼの発現か更に欠けている。その欠失は、プロテアーゼをコードする遺伝子ま たはプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を直接的に若しくは間接的に変調す る遺伝子での点突然変異、挿入または欠失による１種類またはそれ以上のプロテ アーゼの活性の不存在または低下として明示することができる。

好ましい実施態様において、１１１類またはそれ以上の発現力セントを含むＤＮ Ａ断片を、宿主の欠点を相補する標識遺伝子を含み、場合により追加の配列、例 えば細菌の標識遺伝子、ベクター組込みを支配する酵母配列等を含むベクター中 に挿入する。ｐＢＲ３２２に基づくプラスミド、例えば、ｐＡＯ８１５はベクタ ーとして好ましい。ＩＧＦ−１発現／分泌カセｙトのｌｆｌ！］またはそれ以上 のコピーを親プラスミドｐＡ０８１５に挿入することにより、ρ１．ＧＦ２０１ 、ＰＩＧＦ２０２、ｐＩＧＦ２０４、ｐｌＧＦ２０６およびｐＩＧＦ８１６など のプラスミドが生じる。

ｐｅｐ４−またはρｅｐ４　ｐｒｂ　１＝菌株として知られ、以下および米国特 許出願第０７／６７８．９１６号明細書に記載されているＰ　バストリスのプロ テアーゼ欠失菌株は好ましい宿主細胞に含まれる。プロテアーゼ欠失Ｐ、バスト リス薗株は、細胞のプロテアーゼ活性に直接的にまたは間接的に影響を及ぼすタ ンパク質をコードするＰＥＰ４遺伝子またはＰＲＢ−１遺伝子などのＰ、パスト リス遺伝子の分断によって生じる。この分断は、ＩＧＦ−１の発現のための構築 物に対して無関係の追加のプラスミドをＰＥＰ４遺伝子またはＰＲＢ−１遺伝子 中に挿入することによって達成されるのが好ましい、この分断の結果、細胞中の ある種の１０テアーゼ活性、例えば、１０テイナーゼＡ、グロテイナーゼＢおよ びカルボキシベブチダーセＹ活性などが低下する。この宿主細胞菌株は、更に、 以下の実施例で論及されるように、発現カセット上に保持された標識遺伝子によ って相補することができる突然変異を有するのが好ましい。

好ましい宿主細胞は、Ｐ、パストリスのＭｕｔ−発現菌株を生じるために、宿主 細胞ゲノムにおいて標的とされる特定の部位に導入されている発現ベクターによ って形質転換することかできる。ｒＭｕＪとは、メタノール利用（ｍｅｔｈａｎ ｏｌ−ｕｔｉ　Ｉ　１ｚａｔｉｏｎ）表現型を意味する。ある穆の実施！ｇ様に おいて、選択された発現ベクターを適当な酵素で最初に消化して、ＡＯＸ１遺伝 子の５′および３′末端と相同の末端を有する線状ＤＮＡ断片を生じることによ ってＭｕｔ−菌株を製造する０次に、１８１類または複数の線状化ＤＮＡ構築物 発現力セントを、一段選伝子１換技術によってＡＯＸ１部位で宿主ゲノム中に組 込む、ＡＯＸｌの遺伝子置換の結果としてＭｕｔ−菌株が得られる。Ｍｕｔ−菌 株において、メタノールを利用する菌株の能力は低下する。メタノール上での菌 株の遅い増殖速度は、ＡＯＸ２遺伝子生成物の発現によって保持されている。特 定部位の組換えによって発現カセットがＡＯＸ１遺伝子座に組込まれた形質転換 細胞は、発現カセットに存在する相補性標識遺伝子の存在に関して最初にスクリ ーニングすることによって同定することができる。これは、相補性遺伝子生成物 を欠いている培地中で細胞を増殖させ且つ相補性遺伝子の発現によって増殖する ことができるこれらの細胞を同定することによって達成されるのが好ましい０次 に、選択された細胞のｒＭｕＪ表現型表現−て、メタノール存在下でそれらを増 殖させ且つそれらの増殖速度を暫視することによってスクリーンする。

Ｍｕｔ−表現型のメタノール上での成長は親菌株よりもはるかに遅い。

Ｍｕｔ”ＩＧＦ−１発現菌株を発育させるために、１種類またはそれ以上の発現 カセットを有する断片を、ＤＮＡ構築物を有する環状グラスミドまたは線状化１ ラスミドによる宿主の形質転換によって宿主ゲノム中に組込む０組込みは、断片 中に存在する１種類またはそれ以上の配列と相同である１個または複数個の遺伝 子座での付加による。

陽性の形質転換細胞は、ｍｌえば−ＤＮＡ組込みの部位を確認するサザン分析法 によって：例えば、メタノール応答性ＩＧＦ−１遺伝子発現を検出するノザン分 析法によって：および増殖培地中の分泌されたＩＧＦ−１ペプチドの存在と検出 する生成物分析法によって特徴付けることができる８ＤＮＡ構築物を保持してい る形質転換＃母宿主細胞の培養形質転換した宿主細胞を、ＩＧＦ−１、シグナル およびプロセッシングシグナルをコードするＤＮＡを発現させ、グレプロペプチ ドを処理し且つ分泌させる条件下において培養する。望ましい表現型および遺伝 子型を有する形質転＃ＩＡ菌株は一当業者に知られている任意の手段によって多 量に増殖することかできる。好ましい実施態様において、菌株を発酵槽中で培養 する。メチロトローフ酵母での組換えＤＮＡに基づいた生成物の大規模な生産に 対しては、通常、三段階の高細胞密度供給パンチ発酵システムが、用いられた好 ましい発酵プロトコルである。

最初に、すなわち増殖段階において、制限されないかグリセロールなどの過剰の 非誘導性炭素源を含む規定の最小培地中で発現宿主を培養する。このような炭素 源上で増殖させた場合、異種遺伝子発現は完全に抑制され、異種タンパク質発現 不存在での細胞壇の発生を可能にする。この増殖段階中に培地のｐＨを約５で保 持することは現存のところ好適である。第二段階は制限条件下の増殖期間と称さ れ、短期間の非誘導性炭素源制限増殖を意味する。この段階において細胞塊は増 加し続け、そしてメタノール応答性プロモーターは抑制解除される。約５のｐＨ はＰ　バストリスのｉ＆適増殖に好適であるか、完全にｐＨ５で培養されるタン パク質分解によって損なわれていないＩＧＦ−１発現菌株によって検出不能また は低濃度のＩＧＦ−１が分泌される。しかしながら、高濃度のＩＧＦ−１は、こ の制限増殖期間中の培地のＰＨを約４またはそれ未満に、好ましくは、約２〜３ ．５の範囲に調整する場合に生じる。このｐＨは生産期間中保持される。

プロテアーゼ欠失菌株からのＩＧＦ−１の発現は、タンパク質分解によって損な われていない菌株からの発現よりもＰＨに対する感受性が小さい、プロテアーゼ 欠失菌株は完全にｐＨ５で培養することができる。或いは、そして好ましくは、 プロテアーゼ欠失菌株を最初の２段階中にｐＨ３で培養した後、第三段階の際に ｐＨを約２．５〜約３．０に低下させる。

第三段階である生産段階において１本明細書中において・″メタノール過剰供給 バッチ様式、と称するメタノール単独かまたは本明細書中において１混合栄養供 給パンチ様式」と称する制限量の非誘導性炭素源を加えたメタノールを発酵槽に 加える。メタノールの添加は、メタノール応答性プロモーターと操作上結合して いるＩＧＦ−１などの遺伝子の発現を誘導する。

好ましい実施１ｇ様により、ＩＧＦ−１生産用に用いられた異檜タンパク質発現 システムは、厳重に調節されていて且つ遺伝子発現を前動にするＰ、パストリス のメタノール調節ＡＯＸ１遺伝子から誘導されたプロモーターを利用する。この 遺伝子は同様に転写ターミネータ−源であることができる。現在のところ好まし い発現力セントは、互いに操作上関連しているＰ、バストリスＡＯＸ１７０モー ター、プロセンシング配列１ｙｓ−ａｒｇ−（ｇｌｕ−ａｌａ）　（式中、Ｘは Ｏ〜３であることができる）をコードするＤ　Ｎ　Ａ配列を含むＳ、セレビシェ αＭＦプレグロ配列をコードするＤＮＡ、ＩＧＦ−１ポリペプチドをコードする ＤＮＡ配列およびＰ、バストリスＡＯＸＩ遺伝子由来の転写ターミネータ−を含 む。

好ましくは、２種類またはそれ以上のこのような発現カセｙｌ□は頭−尾配向で ＤＮＡ断片上に含まれていて、革−の連続ＤＮＡ断片上に多数の発現力セントを 生じる。

望ましい遺伝子型および表現型を有する選択されたメチロトローフ酵母形質転換 細胞を、ＩＧＦ−１が発現され且つ培地中に分泌される条件下において発酵槽中 で培養する。前記に記載された三段階生産工程を用いるのが現在のところ好まし い、培地中に分泌されたＩＧＦ−ＩＪ度は、ＩＧＦ−１標準との比較において抗 ＩＧＦ−１抗血清を用いる培地のウェスタンブロンド分析法によってニラジオイ ムノアッセイ（ＲＩＡ）によって：放射性受容体検定法によって：または培地を 適当に前処理した後の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定す ることができる。

前述のように、本明細書中で用いられるＩＧＦ−１とは、ＩＧＦ−１の対立遺伝 子変種全部を包含することを意味する。更に、前述のように、天然に存在する生 成物のアミノ酸配列の単純な修飾によって、例えば、特定部位の突然変異誘発ま たは池の標準的な方法によって得られた誘導体も本発明の範囲内に包含される。

天然に存在するＩＧＦ−１と同機の生物学的活性を示す宿主細胞のタンパク質分 解によって生じたＩＧＦ−１の形態も、本発明によって包含される。

下記の実施例は例示の目的にのみ包括され、本発明の範囲を制限するためのもの ではない。

実施例 Ｐ、バストリスを本明細書中においてメチロトローフ酵母宿主を用いるためのモ デルシステムとして記載する。４種類の属、すなわち、カンシタ属、ハンセヌラ 属、ピキア属およびトルロプシス属がらのメチロトローフ酵母宿主細胞を更に用 いることができる。曜−の炭素栄養としてのメタノール上で実証できるように増 殖する任意の種からの宿主細胞を用いることができる（例えば、グリーマン＜Ｇ ｌｅｅｓｏｎｌら〈１９８８）Ｙｅａｓｔ　４：１を参照されない）、Ｐ。

バストリスに関して本明細書中に記載したこのような種を用いることができる。

実施例Ｉ ＩＧＦ−ＩＱ現ベクターの製造において用いられるピキア・バストリス発現ベク ターの構築。

Ａ、プラスミドｐＡＯ２０３の構築。

グラスミドｐＡＯ２０３はαＭＦプレ１０領域をコードする５′ＥｃｏＲＩ−３ ′ＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩのＤＮＡ断片、１０テア一ゼプロセツシング部位のアミノ 酸である＋ｙｓ−ａｒｇおよび（ｇｌｕ−ａｌａ）　２並びにＡＯＸ１転写ター ミネータ−を含む。

ＡＯＸ１転写ターミネータ−はｐＰＧ２．０がら単離された。プラスミドρＰＧ ２．０は、ＡＯＸ１タ−ミ＊−９−’ｒ有するｐＧ４．０　（ＮＲＲＬＩう８６ ８）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片をｐＢＲ３２２に挿入することによ って製造された。ｐＰＧ２．０の２０μｇを５ｔｕＩで消化した後、５ａｌＩリ ンカ−（ＧＧＴＣＧＡＣＣ）０．２ｔｔｇを加えた。プラスミドを引き続きＨｉ ｎｄＩＩＩで消化し、そして３５０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−５ａｌＩ断片を１０ ％アクリルアミドゲルから単離し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよび５ａｌＩで消化 されたρｔＪｃｔ８（ベーリンガー・マンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎ ｎｈｅ　ｉｍ）＞にサブクローン化した。連結反応混合物でＪＭ１０３細胞を形 質転換し、そしてＡｍｐＲコロニーを選択した。ＨｌｎｄＩＩＩおよびＳａＩ■ 消化によって３５０ｂｐの断片を生じた正しい横築物を確認し、ｐＡＯ２０１と 称しな。

ｐＡ０２０１の５μｇをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ クレノウフラグメントを用いて平滑末端とし、そしてＢｇｌＩＩリンカ−（ＧＡ ＧＡＴＣＴＣ）０．１Ｍｇを加えた。過剰のＢｇｌｌＩリンカ−の消化後に、プ ラスミドを再度閉鎖し且つＭＣ１０６１＋Ｉ胞を形質転換した。ＡｍｐＲ細胞を 選択し、ＤＮＡを調製し、そしてＢｇｌＩＩ、Ｓａｌに重消化によって予想され る３５０ｂρの断片を生じ且っＨ＋ｎｄｌｌＴ消化によってＨｉｎｄＩＩＩ部位 の欠失を示した正しいプラスミドを確認した。このプラスミドをｐＡＯ２０２と 称した。

アルファ因子−〇ＲＦ融合物を、ＰＹＳＶ２０１からの３６０ｂｐのＢａｍＨｌ −Ｐｓｔ１部分消化物として単離した。１ラスミドｐＹＳＶ２０１は、欧州特許 出即第２０６，７８３号明細書に記載されているＧＲＦ−Ｅ−３のＥｃｏＲＩ− ＢａｍＨＩｌ！７ｉ片をＭ１３ｍｐ１８にュー・イングランド・バイオラプズ（ Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ））に挿入することによって製造され た。ｐＹｓＶ２０１プラスミド２０ｔｔｇをＢａｍＨＩで消化し且つＰｓｔｌで 部分的に消化した。下記のオリゴヌクレオチドをこの部分消化物に加えた。

ｓ　ＩｘｘｒｒｃｃｘＴｃｘｃｘＴＴＴｃｃＴＴｃｘｘｒｒｒｒｒｘｃｒｃｃｘ 　：ｌ　ｌ　（配列番号８）３’　ＧＣＴＡＣＴＣＴＡＡＡＧＧＡＡＧＴＴＡＡ ＡＡＡＴに　５’　（配列番号ｇ）オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖のみを キナーゼで標識して、オリゴヌクレオチドが５′末端で重合しないようにした。

３５０ｂｐの断片を、電気溶出に続いてアクリルアミドゲル電気泳動く１０％） によって単離した。この３８５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ＥｃｏＲ ＩおよびＢａｍＨＩで切断されたｐＡ０２０２にクローン化した。ＭＣ１０６１ １ＳＩｌｌ胞を形質転換し、そしてＡｍｐ　ＭＲ胞を選択した。得られたプラス ミドｐＡ０２０３は、ＥｃｏＲＩおよび８ｇ１ｌＴで切断して７００ｂρより大 きい断片を生じたことによって確認された４ Ｂ　プラスミドｐＡＯ８０７の！ｆ４築６！、ｆｌ−ｏｒｂ）ＮＡの製造。

バクテリオ７Ｆ−シｆｌ　ＤＮＡ（うＯμｇｌをＲｓａＩおよびＤｒａＩ５０単 位で消化して、ｆ１？！製起点（ｏｒｉ）を含む約４う８ｂｐのＤＮＡ１！？ｉ 片を放出させた。消化混合物を等量のフェノール、クロロホルム（Ｖ′〜′）で 抽出した？負、水性層を等量のクロロホルムで抽出し、そしてＩｉ＆後に、Ｎａ Ｃ１濃度を０．２ＭにｔＡＮし且つ２，５容量の無水アルコールを加えることに よって水性相中のＤへＡを沈殿させた。混合物を水ｈ（４’Ｃ）に１０分間放置 し、そしてＤＮＡ沈殿を、４°Ｃでのミクロフユーシ中においてｔｏ、ＯＯＯＸ ｇで３０分間遠心分離することによって集めた２ ＤＮＡペレットを７０％水・件エタノールで２回洗浄した６洗浄したベレットを 真空乾燥し且つＴＥ榎ｔｏ？ｔ（０，ＯＩＭ　（ｐＨ７，４）　トリス緩衝液中 １．０ｍＭ−ＥＤＴＡ）２５μｌ中に溶解させた。このＤＮＡを１．５９≦アガ ロースゲルＦで電気泳動させ、約４５８ｂｐのｆｌ−ｏｒｉｌ！！ｉ片を含むゲ ル部分を切取り、そしてそのゲル中の］）　Ｎ　Ａ　！−丁）Ｅ８］（ワットマ ン（Ｗｈａｔｍａｎ））ペーパー上に電気溶出し且つＩＭ−ＮａＣｌ中において ベーパーから溶離した。ＤＮＡ溶液を前記に詳述しｔ：ように沈殿させ、そして ＤＮＡ沈殿をＴＥ綬？ｊｊＩ液２５μｌ中に溶解させた（ｆｌ−ｏｒｉ断片）。

２、ｐＢＲ３２２のＤｒａ１部位へのｆｌ−ａｒｔのクローニング。

グラスミドｐＢＲ３２２（２μｇ）をＤｒａＩ２単位で部分的に消化した０反応 はフェノール７／クロロホルム抽出に続いて前記の工程１に記載のＤＮＡ沈殿に よって終結した。ＤＮＡＮレベレＩトをＴＥ［＊ｉ２０μｍ中に溶解させた。こ のＤＮＡ約１１００ｎを、連結反応用Ｗ１ｍｍ　２　Ｏｔｔ　Ｉ中においてＴ４ ＤＮＡ１．Ｊガーゼ１単位と一緒に１４°Ｃで一晩中インキユベートすることに よってｆｌ−ｏｒｔ断片（工程１）１００ｎｇと連結させた。連結反応を７０° Ｃまで１０分間加熱することによって終結させた後、大腸菌菌株ＪＭ１０３（ジ ャニシュ・ベロン（Ｊａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎｌら（１９８３１９ｅｎｅ　 ２２：ｌ０３）を形質転換するのに用いた。形質転換細胞ＡｍｐＲを集め且つヘ ルパーファージＲ４０８で重感染させた。１本鎖ファージを培地から単離し且つ 用いてＪＭ１０３に再感染させた。形質転換細胞ＡｍｐＲは、ρＢＲ３２２のＤ ｒａＩ部位（ヌクレオチド３２３２位および３２５１位）にクローン化されたｆ ｌ−ｏｒｉを含むｐＢＲｆｌ−ｏｒｉを含んでいた。

３、プラスミドｐＡＯ８０７の構築。

グラスミドｐＢＲｆ　１−ｏｒｉ　（１０μｇ）をＰｓｔＩおよびＮｄｅｌそれ ぞれ１０単位を用いて３７℃で４時間消化しな、消化したＤＮＡを、前記の工程 １に詳述したように、フェノール：クロロホルムで抽出し、沈殿させ、そしてＴ ＥＭｍ液２５μｌ中に溶解させた。この材料を１６２％アガロースゲル上で電気 泳動させ、そしてｆｌ−ｏｒｉを含むＮｄｅＩ　ＰｓｔＩ断片（約０．８ｋｂ） を前記の工程１に詳述したように単離し且つＴＥＩ！衝液２０μｌ中に溶解させ た。

このＤＮＡ約１１００ｎを、１９８９年５月１８日公開の国際特許出顧第ＷＯ３ ９１０４３２０号明細書および下記に記載されたように製造され、そしてＰｓｔ ＩおよびＮｄｅＩで消化され且つホスファターゼ処理されたｐＡＯ８０４の１１ ００ｎと混合した。この混合物を、連結反応用緩衝液２０μ！中においてＴ４Ｄ ＮＡリガーゼ１単位と一緒に１４℃で一晩中インキユベートすることによって連 結させた。連結反応を７０℃で１０分間加熱することによって終結させた。この ＤＮＡを用いて大腸菌菌株ＪＭ１０３を形質転換してＰＡＯ８０７を得た。

Ｃ，プラスミドｐＡＯ８０４の横築： １ラミドｐＡ０８０４は、１９８９年５月１８日公開の（！ｌＷＡ特許出膨第Ｗ Ｏ３９１０４３２０号明細書に記載された。このプラスミドの構築では下記の工 程を行った。

プラスミドｐＢＲ３２２を以下のように修飾してＥＣｏＲＩ部位を除去し且つＢ ｇ１１１部位をＰｖｕ　Ｉ　Ｉ部位に挿入した。グラスミドｐＢＲ３２２をＥｃ 。

ＲＩで消化し、突き出た末端を大腸菌Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩのクレノウフラ グメントにより平滑末端とし、そして得られたＤＮＡを、Ｔ４リカーセを用いて 再度環化した。再環化されたＤＮＡを用いて大腸菌ＭＣ１０６１をアンピシリン 耐性に形質転換し、そして形質転換細胞を、ＥｃｏＲＩ部位不合で大きさが約４ ．３７ｋｂｐのプラスミドを有することに関してスクリーンした。このような形 質転換細胞を一つ選択し且つ培養して、ＥｃｏＲ４部位か配列５　′−ＧＡＡＴ ＴＡＡＴＴＣ３’ ３′−ＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧ−５′ で１換したｐＢＲ３２２て゛ある、ｐＢＲ３２２ΔＲ１と称するプラスミドを生 じた。

プラスミドｐＢＲ３２２ΔＲ，ＩをＰｖｕＩＩで消化し、そして配列５’　−Ｃ ＡＧＡＴＣＴＧ−３’ ３’　−ＧＴＣＴＡＧＡＣ−５’ を有するリンカ−を、得られたプラント末端に対してＴ４リカーセを用いて連結 した。得られたＤＮＡを、Ｔ４り力−セを更に用いて再度環化した後、ＢｇｌＩ Ｉで消化し、そしてＴ４リカーゼを用いてもう一度再環化して、ＰＶＬＪＩＩで 開裂されたｐ　ＢＲ，３２２ΔＲＩに対する１個以上のリンカ−の連結に起因す る多数のＢｇｌｌＩ部位を除去した。Ｓ数のＢｇｌＩＩ部位を除去するように処 理されたＤＮＡを用いて大、ＭｉｌｉＭＣ１０６１をアンピシリン耐性に形質転 換した。形質転換細胞を、ＢｇｌｌＩ部位を含む約４．３８ｋｂｐのプラスミド に関してスクリーンした。このような形質転換Ｍ３胞を一つ選択し且つ培養して 、ｐＢＲ３２２ΔＲＩＢＧＬと称する更に先の作業用のグラスミドを生じた。プ ラスミドρＢＲ３２２ΔＲＩＢＧＬは、ρＢＲ３２２ΔＲＩＢＧＬか、ｐＢＲ３ ２２ΔＲＩのＰＶＩＪＩＩ部位の代わりに配列 ５’　ＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧ　３”　（配列番号１１）３′−ＧＴＣＧ ＴＣＴＡＧＡＣＧＡＣ−５′　（配列番号１２）を有することを除き、ｐＢＲ３ ２２ΔＲＩと同一である。

プラスミドｐ　Ｂａ３２２ΔＲＩ　ＢＧＬを５ａｌＩおよびＢｇｌＩＩで消化し 、大型の断片（約２．９７ｋｂρ）を単離した。ρ１えば、欧州特許出顆第０２ ２６７５２号明細書に記載されているプラスミドｐＢｓＡＧＩ５ＩをＢｇｌＩＩ およびＸｈｏＩで完全に消化し、そしてＡＯＸ１遺伝子転写ターミネータ−から 下流の（ＡＯＸＩプロモーターからの転写方向に対して）Ｐ、パストリスＡＯＸ １遺伝子座の領域からの約８５０ｂｐの断片を単離した。ｐＢｓＡＧＩ　５Ｉか らのＢｇｌｌＩ−ＸｈｏＩ断片およびＰＢＲ３２２ΔＲＩＢＧＬからの約２．９ ７ｋｂＰのＳａｌ　Ｉ−Ｂｇｌ　Ｔ　Ｉ断片を組合わせ且つＴ４リカーセを用い て連結反応を行った。連結反応混合物を用いて大腸菌ＭＣ１０６１をアンピシリ ン耐性に形質転換し、そして形質転換細胞を、ＢｇｌＩＩ部位を含む予想された 寸法（約３．８ｋｂｐ）のプラスミドに間してスクリーンした。このプラスミド をＰＡＯ８０１と称した。ｐＢＲ３２２ΔＲＩＢＧＬ断片からの５ａｉｌ部位の 突き出た末端を、８５０ｂｐのｐＢｓＡＧＩ５１上のＸｈｏ１部位の突き出た末 端に連結させ、そしてその工程において、ｐＡＯ８０１の５ａｉｌ部位およびＸ ｈｏ　Ｉ部位双方を除去した。

次に、プラスミドｐＢｓＡＧＩ５ＩをＣＩａＩで消化し、約２．０ｋｂＰの断片 を単離した。２．０ｋｂρの断片は、Ｐ、バストリスＡＯＸ１プロモーターおよ び転写開始部位を含む約１．０−ｋｂｐのセグメント、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗 原（ＨＢｓＡｇ）をコードする約７００ｂｐのセグメント並びにＰ、パストリス ＡＯＸ１遺伝子ポリアデニル化シグナルおよび部位コードセグメントおよび転写 ターミネータ−を含む約３００ｂｐのセグメントを有する。２．０ｋｂｐの断片 のＨＢｓＡｇコーディングセグメントは、ＥｃｏＲＩ部位によってＡＯＸＩプロ モーターを含む１．．０ｋｂｐのセグメントに隣接する末端でおよび３ｔｕＩ部 位によってＡＯＸ１転写ターミネータ−を含む３００ｂｐのセグメントに隣接す る末端で終結し、そして操作上、ＡＯＸＩプロモーターからの転写の際にＨＢｓ Ａｇを発現させるために、１．０ｋｂｐのプロモーター含有セグメントおよび３ ｏｏｂｐの転写ターミネータ−含有セグメントに関して配関し且つ位！しなＨＢ ｓＡｇをコードするそのサブセグメントを有する。ＨＢｓＡｇコーディングセグ メントに対してプロモーターセグメントを結合しているＥｃｏＲＩ部位は、Ａｏ Ｘ１プロモーターの転写開始シグナルコードトリプレＹトからすぐ上流に（ＡＯ ＸＩグロモプローからの転写方向に関して）存在する。

グラスミドｐＡＯ８０１をＣ１ａＩで切断し且つＴ４リガーゼおよびρＢＳＡＧ Ｉ５１からの約２．ｏｋｂｐのＣｌａＩ部位で終結した断片と一緒に混合した。

連結反応混合物を用いて大腸菌ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性に形質転換し、 そして形質転換細胞を、ＣＩａＩおよびＢｇｌｌｌでの消化によって約２．３２ ｋｂｐ　（複製起点およびｐＢＲ３２２からのアンピシリン耐性遺伝子を含む） 並びに約１．９ｋｂｐ、１．４８ｋｂｐおよび１ｏｏｂｐの断片を生じた予想さ れた寸法（約５．８ｋｂ）のプラスミドについてスクリーンしな、ＢｇｌＩＩお よびＥｃｏＲＩによる消化の際に、プラスミドは１．へ〇Ｘ１遺伝子からの３０ ０ｂｐのターミネータ−セグメントおよびＨＢｓＡｇコーディングセグメントを 含む約２．４８ｋｂｐの断片、ＡＯＸ１遺伝子座における。ＡＯＸ１遺伝子のＡ ＯＸＩタンパク質コードセグメントの上流からのセグメントを含む約９ｏｏｂｐ の断片：並びに複製起点およびｐ　Ｂａ３２２からのアンピシリン耐性遺伝子お よび、ＡＯＸ１遺伝子座（ｆｉ初に記述した９００ｂＰのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩ 　ＩセグメントよりもＡＯＸＩコードセグメントから更に上流）の約１００ｂＰ のＣＩ　ａ　Ｉ−ＢｇＩＩＩセグメントを含む約２．４２ｋｂＰの断片を生じた 。このようなプラスミドは望ましい配向で挿入されたｐＢｓＡＧＩ５ＴからのＣ １ａＩ断片を含んでいた。それか反対の望ましくない配向で挿入されたならば、 約３．３ｋｂｐ、２゜３８ｋｂｐおよびｃ＋ｏｏｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ　Ｉ 　Ｉ断片か存在したであろう。

ｐＡＯ８０２と称する望ましいプラスミドを保持している形質転換細胞の一つを 更に先の作業用に選択し且つ培養してそのプラスミドを生成した。

次に、グラスミドｐＡＯ８０２を処理して、ＥｃｏＲＩ部位および５ｔｕＩ部位 て・終結したＨＢｓＡｇコーディングセグメントを除去した。プラスミドをＳｔ ｕ　Ｉて゛消化し、そして配列 ５’　−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３′ ３’　−ＣＣＴＴＡＡＧＧ−ラ゛ を有するリンカ−を、Ｔ４リカーセを用いて平滑末端に連結させた０次に、混合 物をＥｃｏＲＩで処理し、そして再度Ｔ４リカーセを用いて連結反応を行った。

連結反応混合物３用いて大腸菌ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性に形質転換し、 形質転換細胞を、約Ｌ　７８ｋｂｐ、９００ｂｐおよび２．４２ｋｂｐのＥｃ。

Ｒ１−Ｂｇｌｌｌ断片並びに約１００ｂｐ、２．３２ｋｂρ、ｌ　４８ｋｂｐお よび１．２ｋｂＰのＢｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＣＩａＩ断片を含む予測された寸法（５， １ｋｂｐ）のプラスミドについてスクリーンした。望ましいプラスミドを含む形 質転換細胞を更に先の作業用に選択し且つ培養してｐＡＯ８０３を生成した。

プラスミドｐＡＯ８０４は、ｐＡ０８０３中のｐＢＲ３２２からのＢａｍＨＩ部 位に、Ｐ、パストリスＨＩＳ４遺伝子からの約２．７５ｋｂｐのＢｇｌＩＩ断片 を挿入することによってｐＡＯ８０３から製造された０例えば、フレラグら（１ ９８５）Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏ！、５．３３７６並びに欧州特許出願第１ ８０．８９９号明細書および同第１８８，６７７号明細書を参照されたい、プラ スミドｐＡＯ８０３をＢａｍＨＩで消化し且つＢｇｌＩＩ部位で終結したフラグ メントを含むＨＩＳ４遺伝子と組合わせ、そしてその混合物にＴ４リカーゼを用 いて連結反応を行った。連結反応混合物を用いて大腸菌ＭＣ１０６１をアンピシ リン耐性に形質転換し、そして形質転換細胞を、５ａｉｌによって切断される予 測された寸法（７，８５ｋｂｐ）の１ラスミドに関してスクリーンした。このよ うな形質転換細胞の一つを更に先の作業用に選択し、それが保持しているプラス ミドをｐＡＯ８０４と称しな。

プラスミドρＡＯ８０４は、一方が約１．５ｋｂｐでもう一方が約５．Ｏｋｂρ の５ａｉｌ−Ｃ１ａＩ断片および１．３ｋｂｐのＣ１ａＩ−Ｃ１ａＩ断片を有し 、プラスミド中のＨＩＳ遺伝子の転写の方向がアンピシリン耐性遺伝子の転写方 向と同一であり且つＡＯＸＩプロモーターからの転写方向と反対であることが示 される６ ｐＡＯ８０４でのＨＩＳ４遺伝子の配向は、プラスミドまたは、ＡＯＸＩグロモ プローおよびターミネータ−断片間のＥｃｏＲＩ部位に挿入された異種ＤＮＡ断 片を含む任意の誘導体の機能に対して重要ではない。したがって、ρＡ０８０４ 中のＨＩＳ４遺伝子の配向と反対の配向にあるＨＩＳ４遺伝子を有するプラスミ ドをρＡＯ８０４の代わりに用いることができる。

Ｄ、７ラスミドｐＡＯ８１５の構築 プラスミドρＡＯ８１５は、プラスミドｐＡＯ８０７を突然変異誘発してｐＡ０ ８０７中のＡＯＸ１転写ターミネータ−がら下流のＣＩａＩ部位をＢａｍＨＩ部 位に変更することによって構築された。ｐＡＯ８０７を突然変異誘発するのに用 いたオリゴヌクレオチドは下記の配列５’−Ｇ入ＣＧＴＴ　ＣＧＴ　ＴＴに　Ｔ ＧＣＧＧ入　ＴＣＣＡＡＴ　ＧＣＧ　にＴＡ　ＧＴＴ　ＴＡＴ７コ＋（配列番号 １０）を有した。

突然変異誘発プラスミドをρＡＯ８０７−Ｂａｍと称した。プラスミドｐＡ。

８０４（前記および国際特許出顧第ＷＯ３９１０４３２０号明細書に記載された ）を８ｇ＋１ｒで消化し、そして２４００ｂｐの断片２５ｎｇを、Ｂｇｌｌｒで 消化されたｐＡＯ８０７−Ｂａｍからの５４００ｂｐのＢｇｌｌｌ断片２５０ｎ ｇに連結させた。連結反応混合物でＭＣ１０６１細胞を形質転換し、そして正し い構築物をＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩでの消化によって確認して６１００および２１ ００ｂｐの寸法のバンドを同定しな、正しい構築物をＰＡＯ８１５と称した。

発現ベクターρＡ○８１５の制限地図を図７に示す。

実施例２ Ｐ　パストリスにおけるＩＧＦ−１の発現用のベクターの構築。

発現ベクター構築を、例えば、マニアティスらＮ１９８２）ＭｏｌＮ１９８２） 　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕａｌ、コールド・スプリン グ・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス、コールド・スプリング・ハーバ−、ニュ ーヨーク、米［１）およびディビスら（（１９８６）Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＢｉｏ±ｆｆ１＝エルセヴイア・サイエンス・パ ブリッシング・インコーホレーテッド（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐ ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｉｎｃ、）、ニューヨーク）によって記載されたように、 標準法を用いて行った。

Ａ、ａＭＦブレプｏ−１ｙｓ−ａｒｇ−ＩＣＦ−１をコードするＤＮＡ’！−含 む発現ベクターの構築。

ＩＧＦ−１遺伝子発現カセゾトである５’ＡＯＸ１−αＭＦブレプローＩｙｓ− ａｒｇ−ＩＧＦ−１−３’　ＡＯＸＩの１個のまたは多重コピーを含み、ａＭＦ アレ１０コード要素はαＭＦプレプロ〜Ｉｙｓ−ａｒｇを含むが、ｇｌｕ−ａｌ ａｌミスペーサ−コードヌクレオチドいている発現ベクターを製造した。

１、発現カセットの単コピーを含むｐＩＧＦ２０１の構築。

図１にＨｉｎｄＩ　Ｔ　Ｔ−ＢａｍＨＩ断片として示したヒトＩＧＦ−１をコー ドする合成遺伝子を、ベクターｐＵｃ１８中に組込み且つ用いて大腸菌菌株ＭＣ ｌ０６１を形質転換した。アンピシリン耐性形質転換細胞は、ＩＧＦ−１遺伝子 に対して予測された寸法である約２４０ｂρのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ 挿入断片の存在に関する制限酵素消化ＤＮＡ試験によって選択され且つスクリー ンされた。この寸法の挿入断片を有する形質転ｔｆｌ細胞の一つを用いてｐｒＧ Ｆｌｏｌと称するプラスミドＤＮＡを製造した。

ＩＣＦ−１遺伝子を有する、ＰＩＯＦＩＯＩから単離された２４０ｂＰ／）Ｈｉ ｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（２５０ｎｇ）を、５′末端のＥｃｏＲＩ部位 をコードするＤＮＡ、αＭＦグレア０領域、続いて、３が所のプロセッシング部 位のアミノ酸をコードするヌクレオチド、Ｉｙｓ−ａｒｇおよび（ｇｌｕ−ａｌ ａ）２を含み且つ３′末端のＨｉｎｄＩ１１部位を含んでいるプラスミドＩ）Ａ ○２０３のＨｉｎｄｒ　Ｔ　Ｉ−ＢａｍＨ１部位（１０ｎｇ）に挿入した。得ら れたプラスミドを用いて大腸菌ＭＣ１０６１細胞を形質転換した。アンピシリン 耐性コロニーを選択し且つＩＧＦ−１遺伝子の配列１６２〜１３２に相補的なオ リゴヌクレオチドである配列番号１を用いてスクリーンした。このスクリーンに おいて正であるコロニーを一つ選択し、そしてそのグラスミドをｐＩＧＦ１０２ と称した。

αＭＦグレ１０領域およびタンパク質分解プロセ・ｙシング部位を含むρＩＧ’ Ｆ１０２からのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（２５０ｎｇ）並びにＩＧＦ−１遺 伝子をＭｌ　３ｍｐ１９　（１０ｎｇ）にクローン化し且つ用いて大腸菌ＪＭ１ ０３細胞を形質転換した。得られた形質転換細胞を、制限酵素消化ＤＮＡの分析 によってスクリーンし、正しい寸法の挿入断片（４８０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｂａ ｍＨＩ断片）を含むクローン＜ｐＩＧＦ１０３）を一つ用いて、特定部位の突然 変異誘発のための１本Ｍ　Ｄ　Ｎ　Ａを製造した。１本、ｆｌＩＤＮＡの特定部 位の突然変異誘発を行って、（ｇ　ｌ　ＩＪ−ａ　ｌ　ａ）　２スペ一サ一部位 、ＨｉｎｄｌＩＩクローニング部位、合成遺伝子に結合したポリリンカーおよび ＩＧＦ−１の最初のメチオニンに対するコドンを除去した。突然変異誘発は、！ を準法および下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて達成された。

突然変３に誘発用オリゴヌクレオチド（配列番号２）：５’−ＧＴＡＴＣＴＴＴ ＧＧＡＴ入Ａ入ＡＧＡＧＧＡＣＣＧＧＡＧＡＣＧＣＴＣＴＧＣ−３’スクリーニ ング用オリゴヌクレオチド（配列番号３）：５’−人ＴＡＡＡＡＧＡＣ；ＧＡＣ ＣＧＧＡ−３’。

前述の配列の除去により、αＭＦプレプロ領域およびＩＧＦ−１遺伝子のコーデ ィング領域に直接融合したｌｙｓ−ａｒｇプロセッシング部位をコードするＤＮ Ａを含む融合遺伝子を生じた。

ｐＴＧＦ１０４と称する選択されたクローンを配列順序決定して変化を確認した 擾、第二の特定部位の突然変異誘発を行って、ＥｃｏＲＩ部位の直後にＴＧＦ− １遺伝子の転写終結コドンを挿入した。以下のような配列を有するオリゴヌクレ オチドをこの突然変異誘発において用いた。

突然変異誘発用オリゴヌクレオチド（配列番号４）：５’−ＡＧＴＣＡＧＣＴＴ ＧＡＴＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣに＾ＣＣＴＧＣＡＧＧＣ−３’スク リーニング用オリゴヌクレオチド（配列番号５）：５’−Ｔ大入ＧＡＡＴＴＣ入 入λＴにＡＧ？−４１。

突然変異誘発クローンをｐｌＧＦ１０５と称した。

第二の突然変異誘発をＤ　Ｎ　Ａの配列順序決定によって確証した後、αＭＦ− ＩＧＦＩ遣ｆ云子触合体を４５０ｂｐのＥｃｏＲＩ断片上に単離し、次に、この ＥｃｏＲＩｌ！ｌ’ｉ片２５０ｎｇを、予約２５０ｎスファターゼで処理された Ｐ，パストリス発現ベクターｐＡＯ８１５のＬｏｎｇ中に挿入した．得られた単 コピー発現ベクターであるｐＩＧＦ２０１は、ピキア・バストトリスＡＯＸ１プ ロモーターおよび調節領域、更にはＡＯＸ１転写終結およびポリアデニル化シグ ナルの転写制御下においてαＭＦーＩＧＦー１融合遺伝子の１個のコピーを含む ．更に、ベクターは、Ｈｉｓ−宿主の選択に用いられたピキア・パストリスＨＩ Ｓ４遺伝子および宿主ゲノムへのベクターの組込みを支配するのに用いることが できるおよび追加の３’ＡＯＸ１配列を含む．プラスミドｐｌＧＦ２０１を図２ に示す。

完全なαＭＦーＩＧＦー１融合遺伝子並びにそれぞれ約５０ヌクレオチドのＰＴ ＧＦ２０１のプロモーターおよび終結領域を配列順序決定して、クローニング工 程中にヌクレオチド配列が変更されなかったことを確認した。

２、発現カセットの多重コピーを含む発現ベクターＰＩＧＦ２０２、ＰＩＧＦ２ ０４およびｐＩＧＦ２０６の構築。

ＡＯＸＩプロモーターおよび調節領域含金む発現カセｙト、αＭＦーＩＧＦー１ １ａ合遺伝子並びにＡＯＸ１転写終結およびポリアデニル化シグナルを、ＰＩＧ Ｆ２０１から１７００ｂｐのＢｇ　Ｉ　Ｉ　Ｔ−ＢａｍＨ　Ｉ断片として単離し た．ＢｇＩＩＩ−ＢａｍＨＩ発現カセット＜２５０ｎｇ）を、ｐＴＧＦ２０１の 独特のＢａｍＨＩ部位（ＢａｍＨｒで消化した子ウシアルカリ性ホスファターゼ 処理済みＰＩＧＦ２０１の１０ｎｇ）に挿入し戻した０ＭＣ１０６１細胞を連結 反応によって形質転換しな．ＡｍｐＲコロニーを選択し、そしてグラスミドを制 限消化によって特徴付けた．得られたプラスミドである図３に示したｐｌＧＦ２ ０２の制限酵素消化分析により、二つの発現カセットは、逆方向反復単位よりも むしろ縦列反復単位として結合したことが確認され、すなわち、５ａ１１消化物 は約２１００、１７５０および６１００ｂｐバンドを生じ；Ｃ１ａｎ／ＢａｍＨ Ｉ消化物は約３８００および６４５０ｂｐバンドを生じた。

発現力セントの２個のコピーを含む、プラスミドｐｌＧＦ２０２からのＢｇｌＴ Ｔ−ＢａｍＨＴ断片を単離しく２５０ｎｇ）且つ子ウシアルカリ性ホスファター ゼ処理済みｐｌＧＦ２０２　（Ｌｏｎｇ）中の独特のＢａｍＨＩ部位に挿入し戻 して１発現カセットの４個のコピーを含む図４に示したベクターｐ　ＩＧＦ２０ ４を生じた０ＭＣ１０６１細胞を連結反応によって形質転換した，ＡｍｐＲコロ ニーを選択し、そしてグラスミドを制限消化によって特徴ｎ’４すた．正しいグ ラスミドは、ＣＩａＩおよびＥ３ａｍＨＩでの消化により、約６６００および６ ９００ｂＰバンドを実証した。

発現カセットの６個のコピーを含む発現ベクターＰＩＧＦ２０６を構築するため に、ｐｌＧＦ２０２からのＢｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＴ断片（２５０ｎｇ）を、 ρＩＧＦ２０４のＢａｒｎＨＩ部位（ｐ　ｒＧＦ２０４は子ウシアルカリ性ホス ファターゼで予め処理された：１０ｎｇ）にクローン化した０ＭＣ１０６１細胞 を連結反応によって形質転換した　Ａ　ｍ　ｐ　Ｒコロニーを選択し、そしてグ ラスミドを制限消化によって特徴付けた。ベクターＤＮＡの制限消化を実験して 、発現カセットの数および発現カセットが縦列反復単位として結合していたこと を確認した。

正しいプラスミドは、ＣＩａＴおよびＢａｍＨＩでの消化により、−６６００お よび１０３００ｂｐのバンド３生じた。グラスミドρＩＧＦ２０６を図５に示す 。

Ｂ、（２ＭＦプレグロー１ｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａｌａ　ＩＧＦ−１を含む発 現ベクターの構築。

ｌｙｓ−ａｒｇおよび１個のｇｌｕ−ａｌａプロセｙシング配列を含み、ＩＧＦ コーディング配列に融合したαＭＦプレプロ配列をコードするＤＮＡを含む■Ｇ Ｆ−１発現ベクターを、Ｍ１３ｍｐ１９中にαＭＦプレブ”　ｌｙ３−ａｒｇ− ＴＧＦ−１融合遺伝子を含むｐｌＧＦ１０５から製造した（実施例２．Ａ、１を 参照されたい）、ｐｌＧＦ１０５からの１本９　Ｄ　Ｎ　Ａの特定部位の突然変 異誘発を行って、ｇｌｕ−ａｌａｌミスペーサ−に対するコドンをαＭＦブレブ ローｌｙｓ−ａｒｇおよびＩＧＦ　ｌＤＮＡ配列間に挿入した。突然変異誘発は 標準法および下記の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて達成された。

突然変異誘発用オリゴヌクレオチド（配列番号６）：５’−ＴＣＴＴｒＧＧＡＴ ＡＡＡＧＡＧＡＧＧＣＴにＧＡＣＣＣ；ＣＡＧＡＣＣＣＴＣ−コ響スクリーニン グ用オリゴヌクレオチド（配列番号７）：５　’　−ＡＡＡＡＧＡＧＡＧにＣＴ ＧＧＡＣＣＧＣ−３’　。

選択されたクローン分配列順序決定して、ｇｌｕ−ａｌａ残基をコードするＤＮ Ａが正しく加えられたことを確認した。αＭＦプレプロー１　ｙｓ−ａｒｇ−ｇ 　ＩＩＪ　ａｌａ　ＩＧＦ　１遺伝子融合体を、４６５ｂｐのＥｃｏＲＩ断片上 の選択されたクローンから革離し、そしてＥｃｏＲＴで消化されたアルカリ性ホ スファターゼ処理済みベクターｐＡＯ８１５に連結した。得られた単コピー発現 ベクタｐ　Ｔ　Ｇ　Ｆ　８１６は、Ｐ、バストリスＡＯＸＩプロモーターおよび 調節領域、更にはＡＯＸ１転写終結およびポリアデニル化シグナルの転写制御下 においてαＭＦプレプＯ−１ｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａｏ−１ｙｓ−ａｒ遺伝子 融合体の１個のコピーを含む、更に、ベクターはＨｉｓ−宿主の選択のためのＰ 、バストリスＨＩＳ４遺伝子および追加のＡＯＸ１配列を含む、完全なαＭＦプ レプロー１ｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａｌａ−ＩＧＦ−１遺伝子融合体並びにそれ ぞれ約３０ヌクレオチドのｐＩＧＦ８１６のブロモ−ターおよび終結領域を配列 順序決定して、クローニング工程中に配列が変更されなかったことを確認した。

αＭＦプレプロー１ｙｓ−ａｒｇ　ｇｌｕ−ａｌａ−ＴＧＦ−１遺伝子カセ・ｙ トの２個またはそれ以上のコピーを含む発現ベクターは、αＭＦプレグロー１ｙ ｓ−ａｒｇ−ＩＧＦ−１遺伝子発現カセットの多重コピーを含むベクターの構築 に関して記載されたように製造することができる（実施例２．Ａ、２を参照され たい）。

実施例３ ＩＧＦ−１発現ベクターからの発現ベクターのピキア・バストリス菌株への導入 。

Ａ、Ｍｕｔ　菌株 発現ベクターＰＩＧＦ２０１、ＰＴＧＦ２０２、ＰＩＧＦ２０４、ｐＩＧＦ２０ ６およびρＩ　ＧＦ８１６を用いて、ピキア・バストリスのＩＧＦ−１発現性Ｍ ｕｔ＝菌株を発育させた。Ｍ＋】を表現型とは、菌株のメタノール利用能力を意 味する０Ｍｕｔ＋菌株は野生型菌株の場合と同様の速度でメタノールを消費する 。

ピキア・バストリスのＨＩＳ４突然変具体であるＧＳｌ　１５　（ＡＴＣＣ番号 ２０８６４）を、スフェロプラスト法によって（米国特許第４，８７９．２３１ 号明細書に記載されたように行った）かまたは全細胞塩化リチウム酵母形質転換 細胞システム（イト−（Ｉｔｏｌら（１９８４）Ａ　ｒｉｃ、Ｂｌｏｌ、ｃｈｅ ｍ。

４８：３４１）によって、Ｐ、バストリスなどのメチロトローフ酵母に適合させ るのに必要な修飾を伴って（欧州特許出即第３１２．９３４号明細書；米国特許 第４．９２９．５３５号明細書としても入手可能を参照されたい）達成された全 部の形質転換のための宿主として用いた。

Ｍ　ＩＪ　ｔ、菌株は、付加物相同組換え結果による宿主ゲノムのＡＯＸｌかま たはＨＩＳ４遺伝子座への完全な発現ベクターの組込みによって生じた。プラス ミドｐＩＧＦ２０１でＧ５１１５を非消化環状ベクターとして形質転換し且つプ ラスミドに含まれた配列と相同の５′か若しくは３′領域のＡＯＸ１遺伝子座に またはＨＩ３４遺伝子座に無作為に組込ませた。Ｈ１ｓ遺伝子座に対する特定部 位への付加に対しては、多重コピー発現ベクターｐ　ＩＧＦ２０２、ρＩＧＦ２ ０４およびｐＩＧＦ２０６並びに単コピーベクターρＩＧＦ８１６を、ＨＩ３４ 頭域内のベクターを切断することによってプラスミドを線状化する３　ｔ、　Ｉ Ｊ　Ｉ　″Ｃ’消化した。

ＡＯＸｌかまたはＨＩ３４遺伝子座での付加物組込みはＡＯＸＩ遺伝子を妨げな い。

無作為に（ρＩＧＦ２０１）かまたは特定部位（ｐ　ＩＧＦ２０２、ρＩＧＦ２ ０４、ｐｌＧＦ２０６およびｐｌＧＦ８１６）による発現プラスミドの付加物組 込みから得られたＭｕｔ　形質転換細胞を、ヒスチジン原栄養体性に関して最初 にスクリーンした。４種類のプラスミドそれぞれを用いるＧ５１１５の個別の形 質転換によって生じた原栄養体菌株を更に先の分析用に選択した。

ｐＩＧＦ２０１を用いるＧ５１１５の形質転換から得られた１０種類のＨ４５− 形質転換細胞を、サザンブロヅトハイプリダイセーションによって分析して、発 現グラスミドの組込み部位および組込まれたプラスミドのコピー数を確認した。

１０種類の形質転換細胞からの染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで個 別に消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離し、そしてニトロセルロース に移した。ＥｃｏＲＴ消化物を、ＡＯＸ１５’および３′領域かまたはピキア・ バストリスＨＩＳ４遺伝子を含むｐＢＲ３２２由来の１ラスミドを用いてグロー ブした。ＢｇｌＩＩ消化物をＩＧＦ−１遺伝子と相同のオリゴヌクレオチドを用 いてプローブした。

ｐｌＧＦ２０２を用いるＧ５１１５の形質転換によって生じた１６種類のＨｉｓ ＋形質転換紀胞、ｐｌＧＦ２０４を用いる形質転換によって生じた１６種頭およ びｐＩＧＦ２０６を用いる形質転換によって生じた２６種類をサザンブロソトハ イプリダイセーションによって更に分析して、多重コピー発現ベクターの組込み 部位および完全性を確認した。染色体ＤＮＡをＢｇｌＴＩで消化し且つＡＯＸｌ ５’および３′領域かまたはピキア・バストリスＨＩＳ４遺伝子を含むグラスミ ドを用いてプローブし、そして更に、Ｓｔｕ　Ｉで個別に消化し且つＩＧＦ−１ コーディング配列と相同のオリゴヌクレオチドを用いてプローブした。

サザンプロットハイプリダイセーションによる１０種類のｐＩＧＦ２０１形質転 ＃ｆＡ細胞からのＤＮＡの分析により、４種類の形質転換細胞はＡＯＸ１遺伝子 座に組込まれた発現ベクターの単コピーを含み且つ２ａｉ類の形質転換細胞はＨ ＩＳ４遺伝子座に組込まれたプラスミドの多重コピーを含むことが示された。４ ａ類の他の菌株は未知の遺伝子座に組込まれたプラスミドを含んでいた。ＨＩＳ ４に組込まれたグラスミドの正確なコピー数と決定することは不可能であった。

ＤＮＡのサザン分析法により、１０種類のρＩＧＦ２０２形質転換細胞、９種類 のｐＩＧＦ２０４形質転換細胞および２６種類のｐ　ＩＧＦ２０６形質転ｌｌ！ １ＩＳＩ胞の内の１３樫順は、ＨＩＳ４Ｔ組込まれたそれぞれの発現ベクターの 単コピーを含んでいることが示された。池の形質転換細胞は未知の遺伝子座に組 込まれたプラスミドを含んでいた。

ベクターｐｌＧＦ２０１、ｐＩＧＦ２０２、ｐＩＧＦ２０４またはｐＩＧＦ２０ ６を用いるＧ５１１５の形質転換によって生じた下記の代表的な菌株を更に先の 分析用に選択した。

菌株名称　組込まれた　組込み部位　組込まれた　発現カセットプラスミド　グ ラスミド数　コピー数 Ｇ＋ＩＧＦ２０１Ｓｌ　ｐ工ＧＦ２０１　ＡＱｌｕ　ｌ　ｌＧ十工ＧＦ２０６Ｓ ２　ｐ工ＧＦ２０６　圧「Ａ　１　６Ｇ＋ｌＭＢ２０２Ｓ２ｐ工ＧＦ２０２　１ １ｍ１　１　２Ｇ＋１ＭＢ２０４Ｓ１４　ｐ工にＦ２０４　比話４　１　４Ｇ＋ ｌＭＢ２０６Ｓ１　ｐＩＧＦ２０６　比■４　１　６＋ＩＧＦ８１６Ｓ１．Ｇ＋ ＩＧＦ８１６Ｓ２、Ｇ＋ＩＧＦ８１６Ｓ９およびＧ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１１を一１ リットルの発酵槽中で更に増殖させる際に更に分析した。

を分断する。したがって、Ｍｕｔ、−菌株はＭｕｔ”菌株よりもはるかに遅い速 度でメタノールを消費する。

Ｍｕｔ−菌株を生じさせるために、プラスミドｐＩＧＦ２０６をＢｇＩＩＩで消 化した。これにより、６種類のＩＧＦ−１発現カセット、選択のためのＨＩｓ４ 遺伝子およびＡＯＸＩの３′領域から成る断片が遊離する。この断片の両末端は 、ＡＯＸ１遺伝子座の５′および３′末端と相同である長い配列を有する。Ｂｇ ｌＩＩ末端付き断片を用いるＧ５１１５宿主の形質転換の際に、相同組換えによ るＡＯＸ１遺伝子座への組込みは、ＡＯＸＩ構造遺伝子のためのＢｇｌＩＩ末端 付き断片の１換を引き起こす、陽性の形質転換細胞は、それらのＨｉｓ−表現型 によっておよびメタノール上での増殖を遅らせるそれらのＭｕｔ−表現型によっ て選択された。１１！択は、最小グルコース（２％）マスターグレート上のＨｉ ｓ−形質転換細胞をプレートして革細胞由来のコロニーを得ることによって達成 される。３０℃で一晩中インキユベーションした後、マスターを最小グルコース グレートおよびメタノールかｇ気相で加えられた炭素源不合グレートに対してレ プリカ平板培養した。これは、メタノール約２００μｌを番付ベトリ皿の上部の 裏側に加えることによって達成される。プレートを３０℃で４〜６日間、２日毎 に羞気相で加えられる追加のメタノールと一緒にインキュベートした。可視の増 殖を示すコロニーをＭ　１．Ｊ　ｔ、とじて計数し、不可視または遅い増殖のも のをＭｕｔメタノール利用およびヒスチジン原栄養体性に関する最初のスクリー ニングに続いて、３種類のＭｕｔ−形質転換細胞からの染色体ＤＮＡを３種類の 異なるサザンプロットによって分析して、プラスミド組込みの部位および組込ま れたコピー数を確認しな。

Ｍｕｔ−形質転換細胞からの染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、そしてＡＯＸ ｌの５′および３′領域かまたはピキア・パストリスＨＩＳ４遺伝子を含むｐＢ Ｒ３２２基剤プラスミドを用いてプローブした。ＢｇｌＩＩで消化したＤＮＡに ついての追加のプロットを、ＩＧＦ−１遺伝子を含むグラスミドを用いてプロー ブした。プラスミドＰＩＧＦ２０６を用いて生じた３種類のＭｕｔ−形質転換細 胞のサザン分析により、３ａ！類全部が、ＡＯＸ１遺伝子座での置換によって組 込まれた６種類の発現カセットを含むＢｇ　Ｉ　Ｔ　ｌｌｔｆｉ片の基コピーを 含むことが示された。

菌株は下記のように特徴付けられた。

菌株名称　組込み部位　組込まれた　発現力セントースど　コー Ｇ−ＩＭＢ２０６ＳＩ　ＡＯＸｌ　１　６Ｇ−ＩＭＢ２０６Ｓ２　Ａｏｘｌｌ　 ６Ｇ−ＩＭ　へ　Ｘ Ｃ，ＩＧＦ−１の発現および分泌のためのプロテアーゼ欠失菌株の製造。

Ｐ、パストリスプロテアーゼによる分解に対して感受性の異種タンパク質の組換 え体発現に関するＰ、バストリス宿主のプロテアーゼ欠失菌株の使用は、米国特 許出Ｖ第０７／６７８．９１６号明細書に記載されている。プロテアーゼ欠失Ｐ 、パストリス菌株は、細胞のプロテアーゼ活性にｉｌｉ［接的または間接的に影 響を及ぼすタンパク質をコードするＰＥＰおよびＰＲＢ−１などのＰ、バストリ ス遺伝子を分断することによって生じた。これらの遺伝子の分断により、プロテ アーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＹおよびプロテアーゼＢ活性を含む細胞中の プロテアーゼ活性の少なくとも一部分の低下が生じる。Ｐ、バストリスの組換え 体Ｐｅｐ４　（ｐｅｐ４とも称する）およびＰｅｐ４　Ｐｒｂ−１（ｐｅｐ４ｐ ｒｂ−１とも称する）ＩＧＦ−１分泌性菌株を製造した。

Ｐ　バストリスの４種類のプロテアーゼ欠失ＩＧＦ−１発現性菌株である菌株Ｍ ”−ＩＭＢ２０６Ｓ１、Ｍ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１．Ｍ＋ＩＧＦ８１６Ｓ４およびＣ ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１を、２種類の異なる方法を用いて生じさせた。菌株Ｍ＋ｌＭ Ｂ２０６Ｓ１を、Ｐ　Ｅ　Ｐ　４遺伝子分断ベクターｐＤＲ４２１を用いるαＭ Ｆプレ１０−１　ｙｓ−ａｒｇ−ＩＧＦ−１遺伝子発現カセｙ　ｌ−の６個のコ ピーを含むＰ。

バストリス菌株（菌株Ｑ　ｔ　Ｉ　Ｍ　Ｂ　２０６　Ｓ　１　、実施例３．Ａを 参照されたい）の形質転換によって発育させた。ベクターＰＤＲ４２１（以下お よび米国特許出願第０７．、／６７８．９１６号明細書に詳細に記載された）は 、Ｐ　Ｅ、　Ｐ　４遺伝子座の宿主ゲノム中に組込支れてＰＥＰ４遺伝子の２個 の不完全で且つ非機能性コピーを生じるＰ、パストリスＰＥＰ遺伝子の内在部分 を含む。

菌株Ｍ−！−ＩＧＦ８１６Ｓ１、Ｍ→−ＩＧＦ８１６Ｓ４およびＣ＋ＩＧＦ８１ ６Ｓ１を、αＭＦプレプｏ−１ｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａｌａ−ＩＧＦ−１遺伝 子構築物を用いてプロテアーゼ欠失Ｐ　バストリス宿主菌株を形質転換すること によって生じさせた。菌株Ｍ〒ＩＧＦ８１６Ｓ１およびＭ＋ＩＧＦ８１６Ｓ４は 、Ｐｅｐ４宿主の形質転換によっておよびＣ＋ＩＧＦ８１６Ｓ］はｐｅｐ４、ｐ ｒｂ−１宿主の形質転換によって生じた。

１、Ｐ　パストリスＰＥＰ４遺伝子分断ベクターｐＤＲ４２１の構築。

プラスミドｐＤＲ，４２１を、不完全なＰＥＰ４遺伝子の内因性ＰＥＰ遺伝子座 への付加によって宿主ＰＥＰ４遺伝子が分断されているＰ、バストリスのＰＥＰ ４欠失（Ｐ　ｅ　ｐ　７４　）菌株の製造において用いるために構築した。１ラ スミドｐＲＤ４２１は、ＰＥＰ４遺伝子座で宿主ゲノム中に導入された場合にＰ ＥＰ４遺伝子の２種類の不完全で且つ非機能性コピーを生じるＰＥＰ４遺伝子の 内在部分を含む。

ｐＤＲ４２１を構築するために、Ｐ、バストリスのＵＲＡ３遺伝子をベクターｐ ＥＰ２０５にクローン化した。プラスミドρＥＰ２０５は、ＰＵＣ１９配列およ びｐＥＰ２０２由来の約４５０ｔ）ｐのＢａｍＨＩ断片によってコードされたＰ ＥＰ４遺伝子の一部分を含む、プラスミドｐＥＰ２０２は、ＥｃｏＲＩで消化さ れたＰ、パストリスゲノムＤＮＡの、相同のＳ、セレビシェＰＥＰ遺伝子をグロ ーブとして用いるサザンブロットハイプリダイセーションによってＰＥＰ遺伝子 を含むと同定されたＰ　パストリスゲノムの１０．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をｐ ＵＣ１９へ挿入することによって製造された。　１ｏ、　６ｋｂの断片を単離し 、その約２００ｎｇを、ＥｃｏＲＩで切断され且つ脱リン酸化された等量のＰＵ ＣＩ９と連結させた。連結反応混合物を用いて大腸菌菌株ＭＣ１０６１を形質転 換した。アンピシリン耐性コロニーは、特徴的な１０．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片 の存在により、コロニーＤＮＡの制限酵素消化の分析によって選択し且つスクリ ーンしな、大規模なグラスミド製造は、ｐＥＰ２０２と称する正しいプラスミド を有するコロニーから製造された。プラスミドｐＥＰ２０２は完全なＰ、バスト リスＰＥＰ４を含む。

ＵＲＡ３遺伝子を、２ｋｂの断片としての５ｐｅｌ／５ｐｈｌ消化ｐＰＵ２０５ から単離し且つＡｂａＩ／５ｐｈＩ消化ｐＥＰ２０５に連結させ、そして大腸菌 菌株ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性に形質転換するのに用いた。ＡｍｐＲコロ ニーを、ＢａｍＨＩ／５ｐｈｌ消化コロニーＤＮＡの、２．７ｋｂ、０．４ｋｂ およびｉ、９ｋｂの断片の存在に対する分析によってスクリーンした。正しいプ ラスミド構築物を含む選択された形質転換細胞を同定し、そのプラスミドをＰＤ Ｒ４２１と称した。

２、Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１の製造 ｐｅｐ４　１０Ｆ　１発現性菌株であるＭ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１は、ａＭＦプレプ ｏ−１ｙｓ　ａｒｇ−ＩＧＦ−１楕築物の６個のコピーを含むｐｅｐ４　Ｐ。

バストリス菌株を、Ｐ、パストリスＰＥＰ４遺伝子の内在部分を含み且つＰＥＰ 遺伝子座で宿主ゲノム中に組込まれることによって、遺伝子の２個の不完全で且 つ非機能性のコピーを生じることによる遺伝子の発現を分断するＰＥＰ４分断ベ クターｐＤＲ４２１を用いて形質転換することによって生じた。

ｐＤＲ４２１を取込んだ形質転換細胞の同定を容易にするために、栄貢要求性標 識選択システムを形質転換前の菌株Ｇ↑ｌＭＢ２０６ＳＬにおいて確立した。

これは、自然突然変異によってウラシルに対して栄養要求性（Ｕｒａ−）となっ たＧ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１のコロニーの単離によって達成された。ｐＤＲ４２１は 、ＰＥＰ４断片の他にＰ、パストリスＵＲＡ３１ｍ遺伝子を含むので、ＰＤＲ４ ２１を取込んだＧ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１のＵｒａ−誘導体のこれらの細胞をウラシ ル原栄養体性基準で選択することが可能であった。ＰＥＰ４　ＩＧＦ−１発現性 Ｐ。

パストリス菌株を生じさせる場合のＵｒａ　ＩＧＦ　１発現性Ｐ、バストリス閏 株の単離およびその使用をこの項に記載する。

ａ、Ｕｒａ　ＩＧＦ−１発現性菌株ＩＧＦ−Ｕの単離。

５−フルオロ−オロト酸（５−ＦＯＡ＋に対する耐性を、菌株Ｇ＋ｌＭＢ２０６ ５１のＵｒａ−誘導体を同定する手段として用いた。５−ＦＯＡは、ＬｉｒａＴ 薗株によ菌株代謝された場合に毒性化合物を生じるウラシル生合成経路中間体の 類似体である。したかって、Ｕｒａ＋菌株は５−ＦＯＡ含有含有上地上存するこ とができない、これに対して、ＬＪｒａ−菌株のウラシル生合成経路はある種の 段階で阻止され、そしてこのような菌株は５−ＦＯＡを代謝しないし且つその毒 性作用によって影響されない、したがって、５−ＦＯＡ含有含有上地上胞を平板 培養することは、自然突然変異によって生！二たＵｒａ−菌株を検出する方法と して用いることかできる。

ＩＧＦ−１生産性菌株Ｑ−ｉ−ＩＭＢ２０６Ｓ１のＵｒａ−誘導体は、ウラシル を補給した５−ＦＯＡ含有培地（酵母窒素塩基０．６７％、アガロース２％、グ ルコース２％、５−ＦＯＡ７５０ｍｇ／Ｌおよびウラシル４５ｍｇ／Ｌｌ中に細 胞約５Ｘ１０７個を直接平板培養することによって単離された。３０℃で１週間 のインキュベーション後、プレート上で増殖しているコロニーをｊｌＬ離した。

増殖するのにウラシルを必要としたこのコロニーはピキア・バストリスのｕｒａ ３菌株を相補することができなく、これをＩＧＦ−１と称した。

ｂ、ｐＤＲ４２１を用いるＩＧＦ−Ｕの形質転換プラスミドｐＤＲ４２１はピキ ア属ＵＲＡ、３遺伝子およびピキア属ＰＥＰ４遺伝子の小部分を含む、Ｂｇｌｌ ｌ消化プラスミドＰＤＲ４２１を用い、捩準的なスフェロプラスト形質転換法を 用いてＴＧＦ−Ｕを形質転換した。ＢｇｌＩＩを用いるｐＤＲ４２１の消化は、 ＰＥＰ遺伝遺伝子断片へクターを開裂することによってそれを線状化した。した がって、得られた線状ＤＮＡは、ＰＥＰ４遺伝子およびＵＲＡ３遺伝子からの、 ５′および３′末端を含む配列を有した。このＢｇｌＩＩ断片の両末端はＰＥＰ ４遺伝子の隣接する配列と相同であるので、ＩＧＦ−Ｕのゲノムでの断片の組込 みは、ＰＥＰ４遺伝子座の分断を引き起こした相同組換えによってＰＥＰ４部位 において行われた。Ｍ込まれたＤＮＡ断片のＵＲＡ３遺伝子は、形質転換された 菌株に対して標識を与えた形質転換細胞にＵｒａ’表現型全現型た。

引き続き、Ｕｒａ”形質転換細胞を、カルポキシペプチダーセＹ　（ＣＰＹ）活 性に関してコロニーオーバーレイ比色スクリーニング法（ジョーンズ（Ｊｏｎｅ ｓ）、Ｅ、（１９７７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８旦：２３〜３３）を用いて分析し た。この検定結果に基ついて低カルボキシペプチダーゼＹ　（ＣＰＹ）活性を有 することが分かったコロニーを単離し、継代培養した陵、オーバーレイ検定法を 用いて再度スクリーンした。これらの菌株の一つをＭ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１と称し た。

３、Ｍ＊ｌＭＢ２０６Ｓ１およびＭ＋ｌＭＢ２０６Ｓ４の製造ａＭＦプレプ０− ［ｙ５−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａｌａ−ＩＧＦ−１遺伝子発現カセットの１個または それ以上のコピーを有するプロテアーゼ欠失菌株は、ＭＧＰ２１と称するＰ、バ ストリスのＰｅｐ４　Ｈｉｓ４−菌株の、ｐＩＧＦ８１６を用いる形質転換によ って生じな。

ａ、ＭＧＰ２１の生産 プロテアーゼ欠失宿主菌株ＭＧＰ２１を、米国特許出膨第６７８，９１６号明細 書に記載されたように、ＰＥＰ遺伝子を欠陥ＰｅＰ４遺伝子に１換する遺伝子置 換法によって生じさせた。簡単には、５−ＦＯＡ上に平板培養されたＨｉ　ｓ４ −菌株（ＧＳｌ、１５）の細胞から選択されたＨｉｓ４　Ｕｒａ　Ｐ、パストリ ス菌株（ＧＳ４−２）を、ｐＤＲ６０２と称するＰＥＰ４分断ベクターの線状断 片を用いて形質転換しな（米国特許出願第０７／６７８，９１６号明細書を参照 されたい）、ｐＤＲ６０２の線状断片は、Ｐ、バストリスＰＥＰ４遺伝子の一部 分をコードするＤＮＡと一緒に各側面に位１したＰ、パストリスＵＲＡ３遺伝子 から成った。断片の両末端とＧ５４−２の内因性ＰＥＰ４遺伝子との相同性は、 ｐｅｐ４遺伝子を含む欠陥ＵＲＡ３か内因性ＰＥＰ４遺伝子に入れ替わる遺伝子 置換を引き起こすＰＥＰ遺伝子座での断片の組込みを刺激した。得られた＠ａＭ ＧＰ２１はＨｉｓ４　Ｕｒａ−Ｐｅｐ４−である。

ｂ、ＭＧＰ２１の形質転換 菌株ＭＧＰ２１を、塩化リチウム法によってＳｔｕ　Ｉ消化ｐｌＧＦ８１６を用 いて形質転換した。５ｔｕＩはＨＩ３４遺伝子のｐＩＧＦ８１６を開裂するので 、線状断片は菌株ＭＧＰ２１のｈ　ｉ　ｓ　４遺伝子座に組込まれた。得られた 形質転換細胞をヒスチジン原栄貢体性に関してスクリーンした。２１１ｔ類の菌 株をＭ　−ｒ　Ｉ　ＧＦ８１６Ｓ１およびＭ＋ＩＧＦ８１６Ｓ４と称した。

４、菌株Ｃ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１の製造 ａＭＦプレグｏ−１ｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａｌａ−ＩＧＦ−１発現カセットの １個のコピーを有するＰ　バストリスのｐｅｐ４　ｐｒｂ−Ｉ　ＩＧＦ−１発現 性菌株は、ＭＧ１８と称するｐｅｐ４　ｐｒｂ−Ｌ　Ｕｒａ３　ｈｉｓ４　Ｐ。

バストリス宿主菌株の、ｐｌＧＦ８１６を用いる形質転換によって生じた。

ａ、ＭＧ１８の生産 菌株ＭＧ１８を、ｐｅｐ４　Ｕｒａ３　ｈｉｓ４　Ｐ、パストリス菌株Ｇ５４− ２５２１−４−５のＰＲＢ−１遺伝子の分断によって生じさせた（中間体菌株Ｇ ５４−２５２１−４によるＵｒａ３　ｈｉｓ４菌株Ｇ５４−２からのＧ５４−２ ５２１−４−５の生産についての詳細な説明に関しては米国特許出即第０７／６ ７８．９１６号明細書を参照されたい）、これは、ＰＲＢ−１分断ベクターｐＤ Ｒ９１１を用いるＧＳ４　２５２１　４　５の形質転換によって達成された。

ベクターＰＤＲ９１１（米国特許出願第６７８．９１６号明細書に記載された） は、ＰバストリスのＰＲＢ−１旦株を形質転換するのに用いられた場合にＰＲＢ −１遺伝子座で宿主ゲノムに組込まれてＰＲＢ−１遺伝子の２個の不完全で且つ 非機能性コピーを生しるＰ　パストリスＰＲＢ−１遺伝子の内在部分を含む、更 に、ベクターｐＤＲ９１１は、Ｐ　バストリスのｕｒａ３宿主菌株、例えば、Ｇ ５４−２３２１−４−５において選択しうる標識として用いるための完全な機能 的Ｐ、バストリスＵＲＡ３遺伝子を含む。

プラスミドＰＤＲ９１１は、ＰＲＢ−１遺伝子の断片内でプラスミドを切断する ＢｇｌＩＩによる開裂によって線状化された。線状ＤＮＡを用いて、スフェロプ ラスト法によってＧ５４−２５２１−４　５を形質転換した。この線状ＤＮＡの 両末端はＰＲＢ−１遺伝子の隣接する配列と相同であるので、Ｇ５４−２５２１ −４−５のゲノムへのＤＮＡの組込みは、ＰＲＢ−１遺伝子座の分断を引き起こ す相同組換えによってＰＲＢ−１部分において行われた１組込まれたＤＮＡ断片 のＵＲＡ３遺伝子は、形質転換された菌株に対して標識を与えた形質転換細胞に Ｕｒａ−表現型を与えた。ウラシルを欠いている培地上で生存することができた 形質転換細胞からのゲノムＤＮＡをサザンブロントハイプリダイセーシゴンによ って分析した。Ｄ　Ｎ　ＡをＥｃｏＲＶで消化し、０．７う％アカロースゲル上 での電気泳動によって分離し、そしてニトロセルロースに移した。フィルターを ランダムアライムド（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｄ）ｐＤＲ９１１を用いてプロ ーブした。ＰＲＢ−１遺伝子が分断された菌株に関して予想されたバンドパター ンは、内因性非分断ＰＲＢ−１遺伝子を示す５ｋｂの断片の喪失およびうｋｂの 線状ベクターＤＮＡｐＤＴ９１１を加えた内因性の５ｋｂのＰＲＢ−１断片を示 す約１０ｋｂの断片の男現であった。４０種類の形質転換細胞の内の３種類から のＤＮＡかこのバンドパターンを示した。これらの菌株の一つがＭＧ１８であっ た。

ｂ、ｐＩＧＦ８１６を用いるＭＧ１８の形質転換Ｐ、バストリスのｐｅｐ４　ｐ ｒｂ−１旦株を発育させるために、菌株ＭＧＩ８を、塩化リチウム法によってＳ ｔｕ　Ｉ消化ｐＩＧＦ８１６を用いて形質転換しな。５ｔｕＩはＨＩＳ４遺伝子 のＰＩＧＦ８１６を開裂するので、線状断片は、菌株ＭＧ１８のｈｉｓ４遺伝子 座に組込まれた。′４られな形質転換細胞をヒスチジン原栄費体性に関してスク リーンＩＪ：、菌株の一つをＣ−ＩＧＦ８１６Ｓ１と称した。

実施例４ １リツトルおよび１０リツトルの発酵での菌株の増殖。

本明細書中に記載した発酵において用いた培地は下記の組成を有した。

Ａ、１０χ基礎塩類 化Ｔ嬰品　グラム、／リンドル リン酸、８５％　４２．０ｍｌ 硫酸カルシウム・２８２０　１．８ 硫酸カリウム　２８６ 硫酸マグネシウム・７Ｈ２０２３，４ 水酸化カリウム　６．５ Ｂ、ＰＴＭ１微量塩類 化学薬品　グラム／リットル 硫酸第二銅・５Ｈ２０６，０ ヨウ化ナトリウム　０．０８ 硫酸マンガン・Ｈ２Ｏ３，０ モリブデン酸ナトリウム・２Ｈ２００，２ホウ＃！ｊ　０１０２ 塩化コバルト　０．５ 塩化亜鉛　２０．０ 硫酸第一鉄・７Ｈ２０６５，０ ビオチン　０．２０ 硫酸　５．０ｍ１ Ａ、１リツトルの発酵 ＩＧＦ−１の発現および分泌を最大にするために、１リンドルの発酵でのＩＧＦ −１生産に対するグリセロール濃度およびＰＨの効果を研究した。

１、Ｍｕｔ”プロトコル：メタノール供給バッチ発酵。

Ｍｕｔ＋発酵プロトコルとしては三つの別個の段ｌ＠かあつ、すなわち、（１） 最初に、細胞をパンチ様式においてグリセロール上で培養し：　（２）グリセロ ールの消耗に続いて、限定されたグリセロール供給を開始してグリセロールが蓄 積しないようにし、ＡＯＸ１プロモーターを抑制解除し、そして細胞塊か増加し ：そして（３）メタノール供給バッチ様式でのＷ！穆タンパク質の生産用にメタ ノール供給を開始する。

使用前に発酵槽を、１０Ｘ基礎塩類培地（ｆｉ終基礎塩頚濃度５Ｘ、前記を参照 されたい）５００ｍｌおよびグリセロール３０〜５０ｇを含む培地的１すｙトル と一緒にオートクレーブ処理しな、滅菌後、ＰＴＭ１１！ｉ量塩類（前記を参照 されたい）４ｍｌを発酵槽に加え、そしてｐＨを１ＮＨ４０Ｈで５に調整した。

ｐＨを５で保持した実験において、ｐＨは０．１％ストラクトル（Ｓｔｒｕｋｔ ｏ　ｌ　）Ｊ６７３消泡剤を含む５０％Ｎ）（４０Ｈの添加によって調整された 。溶解酸素を、撹拌および通気を調節することによってまたは酸素を用いる空気 供給を補給することによって２０％を越える飽和に保持した。ｐＨを２．８〜３ ．５で保持しな低ＰＨ発酵において、ｐＨｆ制御器を、限定されたグリセロール 供給の開始時かまたはメタノール供給の開始時に望ましいＰＨに調整した後、細 胞性代謝によって望ましいＰＨまで低下させた。

接種材料を、緩衝されたＹＮＢグリセロールプレートから調製し且つ２％グリセ ロール含有リす酸緩衝ＹＮＢ（ＫＨＰＯ１１，５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４２，６６ ｇ／Ｌ、０．６７％酵母窒素塩基、ｐＨ６）中において３０℃で一晩中増殖させ た。０Ｄ６ｏｏか１〜６になるまで増殖したこれらの培養された細胞を発酵槽に 接種し、そしてバッチ増殖管理法を１８〜２４時間続けた。増加した溶解酸素に よって示されたグリセロール消耗の時点で、グリセロール供給（Ｐ　Ｔ　Ｍ　１ １２　ｍ　ｌ　／　ｌを加えた５０％グリセロール）を約５〜２０ｍ１／時の範 囲の速度で開始した。限定されたグリセロール上でのこの増殖時間は、約４０〜 ３００ｍ１の供給の全量が発酵槽に加えられるまで続けた。グリセロール供給の 添加後、メタノール供給（Ｐ　Ｔ　Ｍ　１１２　ｒｎ　Ｉ　／　Ｌを加えた１０ ０％メタノール）を開始した。メタノール添加の初期速度は約１〜２ｍｌ／時で あった。メタノール供給量を３〜８時間で５〜６ｍｌ／時まで増加させた。若干 の発酵槽においては、メタノール供給の３時間後に供給量を６ｍ１／時の速度ま で直線的に増加させた。メタノール誘導を開始して４０〜９５時間後に容器から 採取した。

２、Ｍｕｔ−プロトコルメタノール供給バッチ発酵（実験６５７）。

Ｍｕｔ−菌株のタメノール供給パンチ発酵の最初の二段階は、実施例４（Ａ）（ １）にＭｕｔ−菌株発酵に関して記載されたように行った。しかしながら、Ｍｕ ｔ＋およびＭｕｆ、−発酵プロトコルのメタノール誘導段階は、メタノール供給 が培ｗ物に加えられるという方法の点て異なった。Ｍｕｔ−菌株の標準的な発酵 において、メタノール供給量は、０３％を越えない（ガスクロマトグラフィーに よって決定される）培地中の過剰のメタノールを保持するように調製された。

メタノール供給を１　ｍ　Ｉ　／′時で開始し、そして２時間ｔ◆には、３０分 毎に１０°６増加量て゛、発酵時間中保持される３ｍｌ、時の速度まで増加させ た０次に、メタノール上での菌株の増殖の１０１時間後に容器から採取！７た。

８．１０リツトルの発酵 １、供給バッチ ａ、瞭卓メタノール供給量（実験８４３．９５９．９６０．９６２．９６８およ び９９９）。

水を加えることによって全量５．５リツトルにされたＩＯＸ基礎塩類３．５す・ １トルおよびグリセロール２２０ｇか入っている１５リツトルの発酵槽を滅菌し た６発酵槽を冷却した後、ＰＴＭ　１微量塩類２４ｍ１を加え、そしてｐＨを２ ８％水酸化アンモニウムの添加によって５．０に調整した８発酵のｐＨは同溶液 の添加によって調製され、そして発泡はストラフトルＪ　６７３の５％溶液の添 加によって制御された。温度を３０℃で保持し、そして溶解酸素を、撹拌、通気 および反応器圧力を調節することによってまたは酸素を用いる空気供給を補給す ることによって２０％を越える飽和に保持した。

接種材料を、２％グリセロールを含む緩衝されたＹＮＢ（ＫＨ２ＰＯ４１１−５ ｇ　／　Ｌ　、　Ｋ　２　ＨＰ　Ｏ４２−６６ｇ　／　Ｌ、酵母窒素塩基６．７ ｇ／Ｌ、ｐＨ６１中で一晩中増殖させた細胞から調製した。０Ｄ６ｏｏが２〜８ の濃度まで増殖した培養細胞う００〜７００ｍ１を発酵槽に接種し、そしてパン チ増殖管理法を、グリセロールが消耗されるまで１８〜２４時間続けた。溶解酸 素の増加によって示されたグリセロール消耗の時点で、グリセロール供給（ＰＴ Ｍ１１２ｍｌ／Ｌを加えた５０％ｗ／ｖグリセロール）を１００ｍ１／時で開始 した。４時間後にグリセロール供給？終結し、そしてメタノール供給（Ｐ　Ｔ　 Ｍ　１１２　ｍ　１／Ｌを加えた１００％メタノール）を２０　ｍ　ｌ　、′時 の速度で開始した。メタン−ルを供給して３〜４時間後に、メタノール供給量を ６０ｍ１／時まで増加させ、そしてこの速度で残りの発酵の間保持した。メタノ ール供給の開始の約７２時間後に容器から採取した。

ＰＨ５の発酵において、培養物のｐＨを発酵の間中５で保持した。低ＰＨ発酵（ すなわち、ｐＨ２，８〜３．０）において、ｐＨ制御器の設定値を目的ｐＨに調 整し、そして培養物のＰＨを、細胞性代謝の結果としての新規の設定値まで低下 させた。若干の発酵においては、ｐＨ制御器の設定値をグリセロール供給の開始 時に調整したか、他の発酵においては、ｐＨ設定値をメタノール供給の開始まで 低下させなかった。

ｂ、メタノール供給量の変更（実験７８９．８１０および９０６＞。

更に別の１０リツトルの発酵を、メタノール供給量が変更されたことを除き、本 質的には実施例４．Ｂ、１．ａ、に記載されたように行った。実験７８９におい ては、メタノール供給量を、発酵中にＡｆｔ胞密度か増加するのと同様に一定に 増加させた。メタノールを２０ｍ１／時で供給する最初の３時間後に、供給量を ３０ｍ１／時まで増加させた０次に、供給量を、細胞塊の増加に比例して一日に ２回増加させた。

実ｗＩ１８１０においては、メタノール供給量を、２０ｍ１／時での最初の４時 間後に６０ｍ１／時まで増加させた。メタノールを供給して２１時間後に、供給 量を１００ｍ１／時まで増加させ、そしてその速度で残りの発酵の間（５１時間 ）保持した。

実験９０６においては、４０ｍ１／時のメタノール供給量を最初の６０時間の供 給の間保持した後、残りの発酵の間に（全９０時間）６０ｍｌ／時まで増加させ た。

２、連続培養（実験９２９）。

実験９２９において、メタノールを供給して２０時間後に、発酵工程を供給バッ チから連続様式に切り換えた。これは、メタノール供給と一緒に３Ｘ基礎塩類供 給を開始し且つ全ブイヨン（４［［１胞を含む）の連続除去によって発酵槽中に おいて一定の容量を保持することによって達成された。メタノール供給を７０ｍ １／時の一定速度で保持し、そして基礎塩型供給量を全供給（すなわち、基礎塩 類を加えたメタノール）量の７０％に設定した。したがって、３０％メタノール を含む２３０ｍ１／時の全供給を、一定の全容量８リツトルで発酵槽中に供給し た。

連続培養を１３９時間実施した（メタノール上で全１５９時間）。

Ｃ結果 発酵槽培養物の試料（１，５ｍ！アリコート）を、発酵過程中の各種時間に発酵 槽から取出した。各試料のアリコートを６５００Ｘｇで５分間遠心分離してブイ ヨンおよび細胞を分離した。ＮＨ４０Ｈ２消泡剤、グリセロールおよびメタノー ル容器の量をこれらの時点で記録した。上澄み中のメタノールおよびエタノール 濃度を、ボラバク（ＰｏｒａｐａｋＱｌカラム（オールチク（Ａｌｌｔｅｃｈ） 、ディアフィールド、１１）を用いるガスクロマトグラフィーによって決定した 。

更に、培養物の湿量を、発酵層中の細胞増殖の指標として決定した。この目的の ために、発酵槽培養物の１ｍｌアリコートをミクロフユージで４分間遠心分離し 、上澄みを炉温し、そしてａ潤ベレットを秤量した。

細胞不合ブイヨンのＩＧＦ−１ａ度ｐＲＩＡ、定量的イムノプロットまたは逆相 ＨＰＬＣによって決定した（これらの各方法の説明に関しては実施例５を参照さ れたい）、Ｐ、パストリスのＩＧＦ−１発現性菌株の発酵の結果を表Ｉ〜表Ｖに 揚洪する。

表１ １リソ１−ル発酵からの細胞不合ブイヨンの定量的イムノプロット分析の結果ａ ｐＨは一メタノール上での増殖の２６時間擾に５〜３，５に低下した。

ｂｐＨは、グリセロール供給バッチ段階の開始時に５〜指示ＰＨに低下した。

表ＩＴ １リットル発酵からの細胞不合ブイヨンのインクスター（Ｉ　ｎ　ｃ　Ｓ　ｔ、 　ａ　ｒ　）抗血清基刑ＲＩＡｓの結果１リットル発酵からの細胞不合ブイヨン のニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ）ＲＴＡｓの結果表ＩＶ ｌリットル発酵からの細胞不合ブイヨンのＨＰＬＣ分析の結果８ａ細胞不合ブイ ヨンを、ＨＰＬＣによる分析の前に、陽イオン交換クロマトグラフィーに通過さ せた〈実施例４Ｃを参照されたい）。

６真のＩＧＦ−１の１度（すなわち、完全な、正しく折りたたまれたモノマー性 ＴＧＦ−１）。

６ごれらの菌株に含まれた発現カセットの数はＩＧＦ−１発現濃度に基づいて推 定される。

表Ｖ １０リットル発酵 ａｐＨは、グリセロール供給バッチ段階開始時に５〜２．８に低下した。

５連続培養。

ｃＭＡ胞不含ブイヨンのニコルスＲＩＡによって決定された（実施例５Ａを参照 されたい）。

６予め処理された細胞不合ブイヨンのＨＰＬＣ分析によって決定された真のＩａ Ｆ−ｔａ度（実施例５Ａを参照されたい）。

６ｐＨは、メタノール供給バッチ段階の開始時に５〜指示ＰＨに低下しな。

表■〜表Ｖに示されたように、ＩＧＦ−１ｆｉ度を測定するのに用いた４種類の 検定法により矛盾した結果が生じた。実施例５で検反されるように２種々の検定 法は、おそらく、Ｐ、パストリスブイヨン中に様々な濃度で存在するＩ　ＧＦ− １のいくつかの種間、すなわち、真のＩＧＦ−１と称する完全な、正しく折りた たまれたモノマー性ＩＧＦ−１：マルチマー性ＩＧＦ−１；切断されたＩＧＦ− １＋および誤って折りたたまれたＩＧＦ−１を含む種々の組合わせを検出し、そ れによってブイヨンのＩＧＦ−１４度に興なる値を与えていると考えられる。し がしながら１種々の発酵のＩＧＦ−１ａ度を同一の検定法によって測定する場合 にそれらを比較することは可能である。このような分析により下記の結論が得ら れる。

６コビ一薗株ＧＩＧＦ２０６Ｓ２　（実験５７６．５７８．５９６．５９８およ び６１３）および１コピ一薗株Ｇ＋ＩＧＦ２０１Ｓ１　（実験５７３および６゜ ５）の発酵の定量的イムノプロット分析の結果を表Ｉに示す、イムノプロットに よって定量された試料全部が、マルチマー性ＩＧＦ−１または切断されたＩＧＦ −１を互いに保持しているジスルフィド結合を分断するジチオトレイトール（Ｄ ＴＴ）によって最初に還元された。したがって、ＩＧＦ−１標準と一緒に同時移 動するタンパク質のみがこの検定で定量されたことがら（実施例５Ａを参照され ｔ：い）、この方法は、真のモノマーＩＧＦ−１を区別しなかったが、誤って折 りたたまれたモノマーＩＧＦ−１およびマルチマーＩＧＦ−１を検出しな０表■ に示された結果により、発現カセットコピー数はブイヨン中に含まれた免疫反応 性ＩＧＦ−１の濃度に影響を与え、ＩＧＦ−１濃度は、菌株に含まれた発現カセ ットのコピー数か増加するにつれて増加することが実証される（１コピ一薗株の 実験６０５（２１ｍｇ、／ｌ）および６コビ一菌株の実験６１３　（４８９ｍｇ 、／　Ｉ　）を比較されたい）、ｐＨ５で完全に行われた発酵（実験５７３およ び５７６）がらのブイヨンのＩＧＦ−１４度と、グリセロール供給の開始時（実 験５９８．６０５および６１３）かまｔ：はメタノール供給バッチ段階中（実験 ５７８）に更に低いｐＨ（５から３〜３５まで低下したｐＨ）で行われた発酵か らの濃度との比較により、免疫反応性ＩＧＦ−１の最大量は、一層低いＰＨで発 酵か行われた場合に得られたことが示される。更に、ＰＨを５〜≦３．５に低下 させた時点もＩＧＦ−１濃度に影響を与える。一層低いＩＧＦ−１ａ度は、発酵 のｐＨを発酵の後の方で、すなわち、メタノール供給バッチ段階中に低下させた 場合に得られた（実ｗＩ１５９８および５７８を比較されたい）、同一のプロト コル（グリセロール１５０ｇの添加、メタノール供給６０〜７０時間、そしてグ リセロール供給の開始時にｐＨを５〜３に低下させる）にしたがって行われた６ コビ一菌株のいくつかの発酵の結果は、全部の発酵が典型的に約３５０〜４８０ ｍｇ／′ｌを生じたことから、ＩＧＦ−１生産工程の再現性を実証した。

６コビ一菌株Ｇ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１　（実験６６１）−４コピ一菌株Ｇ±ｌＭＢ ２０４３１４　（実験６９１）、２コピ一薗株Ｇ＋ｌＭＢ２０２Ｓ２　（実験６ ８０）および１コピ一薗株Ｇ＋ＩＧＦ２０１Ｓ１　（実９６０５）の発酵による ブイヨンのインクスター（Ｉｎｃｓｔ、ａｒ）抗血清に基づ＜ＲＩＡの結果（表 ■■：この検定の説明に関しては実施例５Ａを参照されたい）は、Ｐ、パストリ スによるＩＧＦ−１発現に対する発現カセットコピー数の劇的な効果を例示して いる。４コピーおよび６コピ一菌株は、同機の濃度のＲＩＡ反応性ＩＧＦ−１（ それぞれ１４００ｍｇ／Ｉおよび１２８０ｍｇ／ｌ）並びに２コピーおよび１コ ピ一菌株（それぞれ７４０ｍｇ／Ｉおよび１６７ｍｇ／’　ｌ　）よりも２倍お よびほぼ１０倍大きいＩＧＦ−１を生産した。更に、Ｍｕｔ＋６コピー菌株Ｇ＋ ｌＭＢ２０６Ｓ１は、ＩＧＦ−１生産能力に関してＭｕｔ　６コピ一菌株（Ｇ− ＩＭＢ２０６Ｓ３）より優れていると考えられた（実１Ｍ６６１および６５７を 比較されたい）。

実験６６１および６９４（菌株Ｇ〒ｌＭＢ２０６Ｓ１）からのブイヨンのインク スター抗血清に基づ＜ＲＩＡは、ＰＨ５の発酵が低ＰＨ発酵よりも有意に低い濃 度のＩＧＦ−１を生じたという発見と一致した。

ニコルスＲＩＡは、ＩＧＦ−１発現濃度に関してインクスター抗血清基剤ＲＩＡ よりも低い値を一貫して生じたか、ニコルスＲＩＡによって測定される種々の発 酵からの相対ＩＧＦ−ＩＪ度は、インクスター抗血清に基づ＜ＲＩＡによって測 定されるものと一致しな０例えば、それぞれ、Ｇ＋ｌＭＢ２０２Ｓ２　（実験６ ８０）＝　Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４　（実験６９１）およびＧ＋ｌＭＢ２０６Ｓ １（実験６６１）である２コピー、４コピーおよび６コビ一菌株の発酵について 、ニコルスＲＩＡによって決定されるＩＧＦ−１濃度の比較は、更に、Ｉ　ＧＦ −１発現濃度に対する発現カセットコピー数の効果を実証した。更に、ニコルス ＲＩＡによって決定されたＩＧＦ−１生産物の濃度は、より低いｐＨで行われた 発酵においては有意に一層高いものであった。実験６９４　（ｐＨ５；　１５ｍ ｇ／ｌ　）と実験６６１　（ｐＨ３；　１４０ｍｇ／Ｉ）と実験７７６　＜ｐＨ ２，８；３５５ｍｇ／ｌ）とを比較されたい、最後に、グリセロールパンチおよ び供給バッチ段階中に加えられたグリセロールの量の変更は、４コピーおよび６ コピ一菌株の発酵からの最終ＩＧＦ−１１度にほとんど影響を与えなかったと考 えられる（双方が約３４５ｍ　ｇｙ’Ｉを生じた実＠７７２（加えられたグリセ ロール８５ｇ）および実験７７６（加えられたグリセロール４５ｇ）を比較され たい：更に、２５０〜３００ｍｇ、／ｌを生じた実験７５６．７５６．７５７． ７７３および７７５（加えられたグリセロールは４０〜１７５ｇに達した）を更 に比較されたい）。

発酵ブイヨンのＨＰＬＣ３＋析（実施例５Ｃを参照されたい）は、ブイヨン中に 存在するＩＧＦ−１の各Ｓ！類の区別および正確な測定を可能にした。表ＩＶに 、Ｐ、パストリスのＩＧＦ−１発現性菌株のｌすｌトル発酵によるブイヨンの逆 相）（ＰＬＣによって決定される真のＩＧＦ−１の１度を示す、これらめＨＰＬ Ｃ分析の結果は、種々の条件下で増殖した種々の菌株からのブイヨン中の相対Ｉ ＧＦ″′ｌａ度に関して、ブイヨンのＲＩＡおよびイイムノブロッ１〜分析の結 果と一致する１表ＩＶに示されたように、発現カセットコピー数は、ＩＧＦ−１ 発現１度に明らかに影響を与える（１コピ一菌株、Ｇ＋ＩＧＦ２０１Ｓ１　（１ ４ｍｇ／Ｉ、実験６０５）、２コピ一菌株　Ｇ＋ｌＭＢ２０２Ｓ２　（３９ｍｇ ／Ｌ実験６８０）、（４コピ一菌株、Ｇ±ｌＭＢ２０４Ｓ１４　（１０１ｍｇ／ ｌ、実験６９１）および６コビ一菌株、Ｇ＋ｌＭＢ２０６ＳＬ　（１２１ｍｇ／ ｌ、実験７７２）からのブイヨンのＩＧＦ−１ａ度を比較されたい）、更に、表 ＩＶの結果は、ＰパストリスにおけるＩＧＦＩの生産に対するＰＨの効果を実証 しておつ：ｐＨ５で行われた菌株Ｇ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１およびＧ＋ｌＭＢ２０４ Ｓ１の発酵（それぞれ実験６９４および９４３）は、真のＩＧＦ−１４または任 意の形態のＩＧＦ−１）を全く生じなかったか；これらの菌株の低ＰＨ発酵にお いて、ＩＧＦ−１ｆｊ−１２１ｍｇ、、’！および７４ｍｇ／Ｉ生じたくそれぞ れ実験７７２および７５７、ｐＨはグリセロール供給バッチ段階開始時に５〜２ ，８に低下した）０発酵槽に加えられたグリセロールの量が４０〜１７５ｇに変 化した菌株Ｇ−！−ＩＭＢ２０４Ｓ１４の数種類の低ＰＨ発酵によるブイヨンの ＨＰＬＣ分析の結果により、この範囲のグリセロール量はＩＧＦ−１め生産に対 して影響を与えないという発見が確証され：全部の発酵か７０〜１１０ｍｇ／Ｉ を生じた。

プロテアーゼ欠失（ｐｅｐ４）菌株Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１の１リットル発酵から のブイヨンをＨＰＬＣによって更に分析した６表ＩＶに示されたように、この菌 株のｐＨ５および低ＰＨ発酵（それぞれ実験９３５および９３４）は、同様の高 濃度（それぞれ１６７ｍｇ／ｌおよび１３９ｍｇ／′ｌ）の真のＩＧＦ−１を生 じな、更に、菌株Ｇ＋ｌＭＢ２０６ｓ１のこれらの発酵において生産された真の ＩＧＦ−１の１度は、４コピ一菌株ＰＥＰ４　Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４のＰＨ２ ，８の発＃（実験７５７　：　７４ｍｇ／ｌ　）において生じた濃度よりも約６ ０％高く且つ６コビ−ＰＥＰ４ｍ株Ｇ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１のｐＨ２，８の発＃（ 実験７７２　；　１２１ｍｇ／Ｉ　）において生じた濃度よりも約１５％高かっ た。

１個またはそれ以上のαＭＦブレプｏ−１ｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａｌａ−ＩＧ Ｆ−１発現カセットを有する菌株の１リットル発酵によるブイヨンのＨＰＬＣ分 析の結果を更に表ＩＶに示す、これらの菌株は２種類の異なる濃度のＩＧＦ−１ 発現を示した。菌株Ｇ＋ＩｃＦ８１６Ｓ１およびＧ＋ＩＧＦ８１６Ｓ２は、２種 類の同一の発酵（実験１０３９および１０４８）において同様の濃度の真のＩＧ Ｆ−１を生じた（約１６ｍｇ／Ｉ）、これに対して、菌株Ｇ＋ＩＧＦ８１６Ｓ９ およびＧＴ−ＩＧＦ８１６Ｓ１１は、実験１０４９および１０５０において３倍 以上の真のＩＧＦ−１を生じた（約４５ｍｇ／ｌ　）、したかって、菌株Ｇ−： ＩＧＦ８１６Ｓ９およびＧ−ｉ−ＩＧＦ８１６Ｓ１１は７２ＭＦプレプロー１ｙ ｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａｌａ−ＩＧＦ−１発現カセットの２〜３個のコピーをそ れらのゲノム中に偶然に取込んだと考えられるが：菌株Ｇ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１お よびＧ−ｉ−ＩＧＦ８１６Ｓ２は明らかに発現カセットの基コピーを含んでいる 。

１個またはそれ以上のａＭＦプレグロー１ｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａｌａ−ＩＧ Ｆ−１発現力セントを含む１０テア一ゼ欠失菌株Ｍ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１　（ρｅ ｐ４）、Ｍ＝ＩＧＦ８１６Ｓ４　（ｐｅｐ４）およびＣ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１　（ ｐｅｐ４　ρｒｂ−１）（実施例２Ｃを参照されたい）の発酵によるブイヨンを 更にＨＰＬＣによって分析した。菌株Ｍ＋ＩＧＦ８１６Ｓ４の低ｐＨ発酵（実験 １０５３．３３ｍｇ／ｌ）からのブイヨンの場合と比較される菌株Ｍ＋ＩＧＦ８ １６Ｓ１およびＣ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１の低ＰＨ発酵（実験１０４７および１０５ う、１６〜２０ｍｇ／ｌ　）からのブイヨンの真のＩＧＦ−１４度に基づいて、 菌株Ｍ↑ＩＧＦ８１６Ｓ１およびＣ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１は発現力セントの１個の コピーを含むが；Ｍ＋ＩＧＦ８１６Ｓ４は２ｆｌ＆ｌまたはそれ以上の発現カセ ットを含むと考えられる。これらの菌株のＰＨ５の発酵（実験１０６６および１ ０６７）が少なくともこれらの菌株の低ＰＨ発酵と同程度に５蓋の真のＩＧＦ− １を生じたことは注目すべきである。これに対して、αＭＦグレ１０−１　ｙｓ −ａｒｇ−ｇ　１ｕ−ａ　Ｉ　ａ　−ＩＧＦ−１発現力セントの多重コピーを含 むＰＥＰ４菌株のｐＨ５の発酵（実験１０６９）は真のＩＧＦ−１を生じなかっ た。

表Ｖに示されたように、Ｐ、パストリスによる高１度のＩＧＦ−１生産は、最大 １０リツトルまでの発酵水準に容易に拡大された。メタノール供給速度を変更し て行われた４コピ一菌株Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４の低ｐＨの１０リットル発酵（ 実験７８９．８１０．８４３および９０６）の比較により、同様の濃度の真のＩ ＧＦ−１生産が示された。真のＩＧＦ−１の有意の濃度（５４ｍｇ／ｌ）は、ｐ ｅｐ４菌株Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１のＰＨ５，０の１０リッル発酵（実験９５９） において生じた。この濃度は、ｐＨ５で開始された後に完全メタノール供給バン チ段階中にｐＨ２，８または３．０で行われたこの菌株の１０リンドル発酵（そ れぞれ実験９６０および９９９）において増加された。菌株Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ １４の同様の発酵（実験９６２）は、開始ｐＨ５をグリセロール供給パンチ段階 の開始によって２．８に低下させた発酵（実験７８９．８１０．８４３および９ ０６）において得られた４度に等しいＩＧＦ−１濃度を生じた。菌株Ｇ＋ｌＭＢ ２０４Ｓ１４の連続培養（実験９２９）は、培地２３０ｍ１／時の速度で真のＩ ＧＦ−１を５５〜７０ｍｇ／ｌ生産した。したがって、連続培養発酵の生産性は 供給バッチ発酵の場合よりも僅かに高かった。

実施例５ 培地中のＩＧＦ−Ｌａ度の測定 Ａ、ＲＩＡ検定法。

最終稀釈度１．３０００のウサギ抗ヒトＩＧＦ−１抗血／＊（インクスター抗ソ １２ラ マトメジンＣ抗体、カタログ＃　２２２７５　）、　Ｉ−ＩＧＦ−１（インクス ターカタログ；２２３０３）１０．０００〜１２．０００ｃｐｍおよび種々の稀 釈度の組換え体ヒトＩＧＦＩ標準（イムセラ（Ｉｍｃｅｒａ）から購入され且つ アミノ酸分析によって定量された）または未知のブイヨンｍＭを、１２Ｘ７５ｍ ｍのポリスチレン試験管中の最終容量０１５ｍ１中において４℃で一晩中インキ ユベートした。インキュベーションの最後に、パンソルビン（Ｐａｎｓｏｒｂｉ ｎ）（使用稀釈度１　：４０）１００μ＋を試験管に加え且つ室温で１５分間イ ンキュベートした。ＲＩＡ［衝Ｒ（５０ｒｎ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｐ　Ｏ４，０，１％ ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３および０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００ ，ｐＨ７，４）２ミリリツトルを各試験管に加えた後に、ベックマン（Ｂｅｃｋ ｍａｎ＞　Ｊ６Ｍ遠心分Ｍ機中４℃において３２００ｒｐｍで６８分開運心分離 した。遠心分離に続いて、上澄みを傾瀉し、そしてベレｙト化された材料に関す る放射能をガンマ計数器で決定した。

或いは、ある種の試料を市販のＲＩＡ　にニコルス・インステイトウ−１−・ダ イアグノスティック（Ｎｉｃｏｌｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ ｃ）：サン・ファン・カビストラノ、ＣＡ）を用いて検定しな、ニコルス検定法 は、ＩＧＦ−１に関して前記に記載したＲＩＡよりも低い濃度を一貫して測定し た（実験６６１．６８０．６９１および６９４による前記のデータを参照された い）、この明らかな不一致は、おそらく、前記に記載したＲＩＡで用いた抗体は モノマーおよびマルチマー双方のＩＧＦ−１を検出するが、ニコルス検定法で用 いた抗体はおそらくはモノマーＩＧＦ−１のみを検出すると考えられるために生 じると考えられる。

Ｂ、ウェスタンプロット Ｐ、バストリス発酵ブイヨンのイムノプロット分析を用いて、Ｐ、パストリスに おけるＩＧＦ−１の生産を定性的におよび定量的に評価した。

数種類の稀釈度の組換え体ヒトＩＧＦ−１標準（イムセラ）並びにピキア・パス トリスのＭｕｔ’およびＭｕｔ　ＩＧＦ−１発現性菌株の選択された発酵の終了 時に得られた細胞不合ブイヨンの試料を定量的ウェスタンプロットによって分析 して、ブイヨン中に含まれた免疫反応性ＩＧＦ−１の量を推定した。タンパク質 をトリシン（Ｔｒ　ｉ　ｃ　ｉ　ｎｅ　）　５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（シエガー（Ｓ ｃｈｅｇｇｅｒ）、Ｈ，および７オン・ヤゴウ（ｖｏｎ　Ｊａｇｏｗ）、Ｇ。

（１９８７）Ａｎ、ｉｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　１７：３０４〜３１０）によっ て最初に分離した潰、タウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）［＠ｌ’ｌｔ（２５ｍＭトリス −ＨＣｌ、ｐＨ８，３，１９０ｍＭグリジン、２０％メタノール）の溶液中にお いて２０Ｖ／”’Ｃｍで少なくとも９０分間のエレクトロプロットによって０． １μｍのニトロセルロースに移動させた。タンパク質をニトロセルロース上に移 動させ、そのフィルターをプロｌキング緩衝液（０２５％ゼラチン、リン酸緩衝 溶液、０．０５°≦１〜ウイーン（Ｔｗｅ　ｅ　ｎ　）　２０．０，０２％アジ 化ナトリウム）中において１時間インキュベートした。ウサギ抗ＩＧＦ−１抗血 清１０Ａを１０ｙ−１ｒング１衝液で１：２０００に稀釈し且つフィルターと一 緒に最低２時間インキュベートした。抗体１０Ａは、ヒトα−グロブリンに結合 したヒトＩＧＦ−１のカルボキシ末端の最後の１４個のアミノ酸に対応する合成 ペプチドに対抗して増加した。抗血清を使用前にヒトα−グロブリンに吸着させ た。フィルターをプロｌキング緩衝液で１時間洗浄し且つ１．２５　ｒ−プロテ ィンＡ（０，０２μＣｉ／ｍりと一緒に４５汁間インキュベートしな、ブロッキ ングＷ衝液で洗浄して１時間後に、フィルターを自然乾燥させ注つ増感スクリー ンを一７５°Ｃで用いてＸ線フィルムに感光させた。ブイヨンのＴＧＦ−１含量 を推定するために、ブイヨンを含むレーン中のＩＧＦＩに対応するバンド強度を 、種々の既知量のＩＧＦ−１標準に対応するバンド強度と比較した。オートラジ オグラフを鋳型として用い、ハンドに対応するゲルの一部分を切り取り、そして バンドの放射能をシンチレーション計数計で計数した。既知量のＩＧＦ−１を含 むバンドのｃｐｍをＩＧＦ−Ｌａ度に対してプロソトすることによって＠準曲線 を作成し、そしてブイヨンのＩＧＦ−１含量を標準曲線上の比較によって推定し た。

Ｃ１定量的逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）１、ＨＰＬＣシステム ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）（ベッドフォード、ＭＡ）６００溶媒送達システ ム、ウォーターズ４８１型ラムダ・マックス（Ｌａｍｂｄａ　Ｍａｘ）可変波長 検出器、ウィスグ（Ｗｉｓｐ）７１０Ｂオートインジエクターおよびシマズ・ク ロム・バク（Ｓｈｉｍａｄｚｕ　Ｃｒｏｍ−Ｐａｃ１Ｍ分器（コール・サイエン ティフィック（Ｃａｆｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃｉムーアパーク、ＣＡ）でＨＰ ＬＣシステムを構成した。カードカラムと備えたヴイダク（Ｖｙｄａｃ）Ｃ４カ ラム（０，４６Ｘ５ｃｍｌを用いてピキア・パストリスにより生産されたＩＧＦ −１標品の成分を分離した。以下の実施例６．Ｃ，２，に記載したように前処理 されたブイヨン試料を流量１ｍｌ／分でカラムに充填し且つトリフルオロ酢酸（ ＴＦＡ）／アセトニトリル〜ＴＦＡ勾配で溶離しな、溶離液を移動相Ａ（０，１ ％ＴＦＡ）を用いることによって調製して移動相Ｂ（アセトニトリル９５％、水 ５％、ＴＦＡｏ、１％）を稀釈した。１％／分勾配の２５％〜４２％移動相Ｂを 、流量１ｍ！／分で１７分間カラムに通過させて、カラムに充填された材料と溶 離した６次に、カラムを、１００％移動相Ｂを流、１２ｍ１／分で４分間に続い て２５％移動相Ｂを２ｍ１／分で４分間用いて再生した１次に、流量を１　ｍ　 ｌ　／分まで減少させ、そしてカラムを最初の開始条件（２う％移動相Ｂ）で、 別の分析される試料を再注入する前の２分間平衡させた。検出器を０，０５吸光 単位現寸で設定し、そして２１うｎｍの波長を最大感度に対して用いた。

２、粗製発酵ブイヨンの前処理。

Ｐ、パストリスにより生産されたＩＧＦ−１は、ＩＧＦ−１発現性Ｐ、バストリ ス菌株の発酵ブイヨン中に数種類の形態で存在している。ＩＧＦ−１発現性Ｐ。

パストリス菌株の発酵による粗製細胞不合ブイヨンのＨＰＬＣ分析は、様々なＩ ＧＦ−１種を適切に分離しない、これらのＩＧＦ−１種をＨＰＬＣによって区別 するために、真のＰ、パストリスタンパク質を、小規模の陽イオン交換クロマト グラフィ一工程によってブイヨンから除去しなければならない、数種類の陽イオ ン交換システムをこの目的のために試験しな、スルフィル１０リル陽イオン交換 カプセル（ＦＭＣ（パインプルツク、ＮＪ）およびクツ（Ｃｕｎｏ）（メリデン 、ＣＴ）並びに、組込まれた１０ｍ１の容器を備えた２ｍｌの使い捨てボリプロ ビレンカラム（０，８Ｘ４ｃｍ、バイオラド（ＢｉｏＲａｄ））中でのバルク陽 イオン交換体（例えば、Ｓ−セファロース・ファスト・フロー（Ｓｅｐｈａｒｏ ｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）＋ウプ サラ、スウーデン）、ＳＰ−スフｙｏテクス（Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ）（ＩＢＦ、 コｏンヒア、ＭＤ）またはトヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒ　Ｉ　）ＳＰ６５０Ｍ および５Ｐ５５０Ｃ（）−ソー／”ｔ−ス（Ｔｏｓｏ　Ｈａａｓ）、ウーバーン 、ＭＡ）の使用、これらのシステムノイすれもが満足な結果を生じた。ＩＧＦ− １ａ度の定量的ＨＰＬＣ分析用の粗製ブイヨンを前処理するのに日常的に用いら れた２種類のシステムは、カラム形式でのクツ陽イオン交換カプセルまたはＳＰ −スフェロデクス若しくはＳＰ５”５０Ｃ陽イオン交換体を用いた。粗製ブイヨ ンを陽イオン交換クロマトグラフィーによって清浄にし且つＨＰＬＣカラムに直 接注入した。得られたクロマトグラムはブイヨン中の種々のＩＧＦ−１欅を明確 に分離した。

ａ、陽イオン交換カプセルを用いる前処理。

クツ陽イオン交換カプセルは２５ｍｍディスクである。ｆｋ初に、それを０．２ Ｍ酢酸４ｍｌで＆浄した後、０．０２Ｍ＃酸４ｍｌで平衡させた。一定容量の粗 製ブイヨン（１〜１０ｍ１）を０．０２Ｍ酢酸で１：２に稀釈し且つディスクに 充填した。充填後、ディスクを０．０２Ｍ＃酸１．５ｍｌ’″Ｃ″＆浄し、そし てＩＧＦ−１を、ＬＭ　ＮａＣ１を加えたｐＨ５，５の０．０２Ｍ＃酸ナトリウ ム４ｍｌ　ａｄ！した。ｉＭＪの最初の１．５ｍｌは全ＩＧＦ−１の７５〜８０ ％を含んでおり、通常、集められた唯一の溶離量であった９次に、カプセルを１ ００％メタノール４ｍｌで洗浄することによって再生することができた。

ｂ、カラム形式のバルク陽イオン交換体を用いる前処理。

使い捨てカラムに対して、予め水和した陽イオン交換体０．２５ｍ１を加えた。

最初に、吸着剤を０　、２　Ｍ＃＠２　ｍ　ｌで洗浄した後、０．０２Ｍ酢酸２ ｍｌで平衡させた。一定容量のブイヨン（１ｍｌ）をカラムに充填した後、それ を０．０２Ｍ＃酸１ｍｌで洗浄した。ｌｌｊ液およびブイヨン全部を、カラム床 を分断させることかないように注意深くカラムに加えた０通常、カラムに液体を 加える際に吸着剤の若干の＠濁液が生じなが、それは試料の結合またはｆｊＭに 対して有害ではなかった。ブイヨン試料およびＨ８ｔｎを、カラムを介して重力 によって流動させた。ＩＧＦ−１を、１Ｍ−ＮａＣ１を含むｐＨ５，５の０．０ ５％Ｍ酢酸ナトリウム２ｍｌで７１離した。？ｇＭＨの最初のミリリットルは全 ＩＧＦ−１の８０〜９０％を含み、／ｓＭ綬衝１２ｍ１で溶離された０周期的に （約５〜１０個の試料毎に）、５０％メタノール洗浄による塩のｆｊＭ後にカラ ムを再生した。あまり頻繁ではないか、更に、カラムを０．５Ｍ　ＮａＯＨで再 生しな、これらのカラムは多数の連続使用の間それらの選択的結合性を保持する 。

３、ＩＧＦ−１Ｊ度の測定。

とキア属により生産されたＩＧＦ−１の濃度をＨＰＬＣによって測定するために 、既知量の標準ＩＧＦ−１（アムゲン（Ａｍｇｅｎ）　、サウザンド・オーク、 ＣＡ）および、米国特許出Ｖ第０７／６４１，４３０号明細書に記載されたよう に精製され且つアミノ酸組成分析によって定量された真のピキア属により生産さ れたＩＧＦ−１をＨＰＬＣカラムに注入し、そしてそのクロマトグラムでの対応 するピーク下の面積を測定した。ＨＰＬＣカラムに充填されたＩＧＦ　１のマイ クログラムに対して面積をプロｙ卜することによって標準曲線が作成された。Ｈ ＰＬＣクロマトグラムのピーク下の面積をＩ　ＧＦ−１ｉ！１度に変換する場合 に用いるための換算係数を標準曲線から計算した。この情報を用いて、試料のＨ ＰＬＣ分析によるクロマトグラムでの対応するピーク下の面積を測定することに よって前処理されたブイヨン試料中の真のＩＧＦ−１の濃度を決定することが可 能であった。この変換係数を更に用いて、他のＩＧＦ−１種の適切な濃度も同様 に推定した。しかしながら、これらの他の種それぞれの絶対濃度は、それらの特 定の換算係数の差に応じて変化することがある。

実施例６ 培地中に分泌されたＩＧＦ−１の濃度 とキア属により生産されたＩＧＦＩを、イムノプロット、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｈ ＰＬＣおよびタンパク質配列分析によって特徴付けた。これらの方法およびこれ らの分析結果をこの実施例に記載する。

Ａ、イムノプロット分析 ＩＧＦ−１発現性Ｐ、パストリスの発酵において生産されたＩＧＦ−１のいくつ かの特徴を、ブイヨンの還元（ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加えることによ る）および非還元（ＤＴＴを加えない）試料のイムノプロット分析（実施例５Ｂ に記載されたように実施された）から確認した。

第一に、ブイヨン試ｆ＋を電気泳動の前に還元しなかった場合、ＩＧＦ−１は、 ＴＧＦ−１のモノマー、ダイマーおよび種々のマルチマーであると考えられるい くつかの形態として移動しな６分泌されたｒＧＦ−１のモノマーからマルチマー までの形態の比率よｆ：はプロフィールがコピー数によって影響されるとは考え られなかった。第二に、還元試料のイムノプロットは非還元ブイヨン試料にお〜 ）て明らかであった高分子量免疫反応性種の大部分の不存在を示し且つＩＧＦ− １標準（モノマー）と−緒に同時移動するタンパク質、更には標準ＩＧＦ−１の 位置より１かに下の位置に移動する免疫反応性タンパク質の存在を示した。この 低分子量免疫反応性種のＮ末端タンパク質配列分析（実施例６．ｄ、）により、 それは成熟しトＩＧＦ−１の残基２うで開始しており、したがって、ＩＧＦ−１ のタンパク質分解断片であるということか実証された。この低分子量種は非還元 性条件下では見ちれないので、ＩＧＦ−１分子は、残基２４および２５の間での み切断することかできる、すなわち、アミノ酸１〜２４および２５〜７０を一緒 Ｇこ含むペプチド断片を保持しているＩＧＦ　１のＣｙｓ−６，・’Ｃｙｓ−４ ８およびＣｙｓ−１８７’Ｃｙｓ−６１でのジスルフィド結合に関して完全に断 片に分けることはできない、更に、減少したグリセロール発酵（実験７５う）は 全く完全なＩＧＦ−１分子（非分解）を生産したか、拡大されたグリセロール供 給発酵〈実験７５６　）は低濃度の分解生産物を実証した１分解は、４コピ一菌 株く実験７７５）に関するより６６コビ一菌株（実験７７６）に関して僅かに高 髪）と考えられた。

６コビ−Ｍｕｔ−菌株の発酵（実験６５７）において生産されたＩＧＦ−１を、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンプロ・１トによって更に分析した。６コビ− Ｍｕｔ−菌株の発酵による還元および非還元ブイヨンのＩＧＦ−４／＜ンドノ（ ターンは、Ｏコピーおよび４コピ−Ｍｕｔ−菌株の発酵による還元および非還元 ブイヨンのＩＧＦ−１パン・ドパターンと同様て゛ある。

Ｂ　定量的ＨＰＬＣ分析 粗製Ｐ、バストリス発酵ブイヨンをＨＰ　Ｌ　Ｃによって更に分析した（この分 析において用いたＨＰＬＣシステムの説明に関しては実施例う、Ｃ，１，を参照 されたい）、ＨＰＬＣカラムへの粗製ブイヨンの直接注入では、明瞭なピークを 有するクロマトグラムが得られなかった。粗製ブイヨンの成分をＨＰＬＣによっ て分析するために、実施例う、Ｃ８に記載の小規模の陽イオン交換クロマトグラ フィーを用いてブイヨンから内因性Ｐ、パストリス不純物を除去することが必要 であった。

Ｐ、パストリスのＩＧＦ−１発現性菌株の低ｐＨ発酵による細胞不合ブイヨンの 小規模の陽イオン交換クロマトグラフィー後に得られた溶離液は、実施例５Ｃで 記載されたＨＰＬＣプロトコルによって分離することができる切断された、誤っ て折りたたまれた、マルチマーのおよび真のＩＧＦ−１を含むＩＧＦ−１ポリマ ー全部を含む、陽イオン交換クロマトグラフィーを施されたブイヨンのＨＰＬＣ 分析によるクロマトグラムにおいて検出された種々のピークは、組換え体Ｐ。

バストリス発酵において生産されたＩＧＦ−１の種々の形態に対応する。これら のピークに対応するタンパク質の識別点は、ＨＰＬＣ，５ＤＳ−ＰＡＧＥ、イム ノプロット、ゲル濾過、陽イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィー において決定された（米国特許出Ｕ第６４１．４３０号明細書に記載されたよう に行った）。

ＩＧＦ−１発現性Ｐ、パストリス菌株の発酵によるブイヨンのＨＰＬＣ分析（実 施例５Ｃに記載されたように行った）からのクロマトグラムは、ＨＰＬＣカラム から約１０分でｍＭされたタンパク質に対応するピークを含み、それは正しく折 りたたまれた完全なＩＧＦ−１モノマーを示している。このタンパク質の識別点 は、標準の組換え体ＩＧＦ−１（アムゲン、サウザンド・オークス、ＣＡ）の場 合と同一であるＨＰＬＣでのそのａＭ時間基準で最初に確証された。更に、溶離 時間が約１０分のタンパク質を精製しく米国特許出願第６４１．４３０号明細書 を参照されたい）、そして更に別の分析を行った。精製されたタンパク質の還元 および非還元試料の５ＤＳ−Ｐ、ＡＧＥ分析は同一の結果を生じ、それが、■Ｇ Ｆ−１標準と一緒に同時移動する７、７ｋＤａの完全なタンパク質であるという ことを示した。精製されたタンパク質のイムノプロット分析は、それが、ＩＧＦ −１の最後の１４個のアミノ酸に対して生じた抗体と反応性であるということを 実証した。精製されたタンパク質のゲル濾過クロマトグラフィーは、それが、正 しい寸法のＩＧＦ−１モノマーに対して予想されたように溶離するということを 示した。最後に、アミノ酸分析により、精製されたタンパク質のアミノ酸比率は ＩＩＩ＊ＩＦ−１のそれに対応するということが確証された。タンパク質配列分 析により、精製されたタンパク質の完全なアミノ酸配列は真のＩＧＦ−１のそれ と同一であることが分かった。

ＨＰＬＣカラムから約８．６分て゛溶離するタンパク質を、誤って折りたたまれ たＩＧＦ−１として仮説的に同定した。このタンパク質をＨＰＬＣおよび疎水性 相互作用クロマトグラフィーによってＪＩＩＭＬ且つ５ＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノ プロットおよびタンパク質配列分析によって特徴付けた。このタンパク質の還元 および非還元試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、この形態か真のモノマー性ＩＧＦ −１と一緒に移動することおよびそれはＩＧＦ−１の切断された形態ではないこ とを実証した。ＩＧＦ−１のＣ末端に対して向けられた抗体を用いるこのタンパ ク質のイムノプロット分析により、それは免疫反応性であるということが分かっ た。

このタンパク質のアミン末端のタンパク質配列順序決定により、】種類のアミン 末端の配列なりを同定することかできたので、その分子は完全て゛あることが更 に確証された。これらの結果は、この形態がＩＧＦ−１の誤って折ったたまれた 種であることを示唆している。

ＨＰ　Ｌ　Ｃカラムから１０．５〜１１５分で溶離するタンパク質をＩ　ＧＦ− １の切断されたまたは分解された形態（すなわち、１個またはそれ以上のペプチ ド結合の開裂によって生じ且つジスルフィド結合によって互いに保持された２種 類またはそれ以上のペプチド断片を含むＩＧＦ−１分子）として同定した。清浄 されたブイヨンのＨＰＬＣ分析によって、切断れさたＩＧＦ−１に対応する少な くとも２個のピークか存在すると考えられる。主要ピークによって示されたタン パク質（１０７分で溶離）を、ＩＧＦ−１精製処理のＳ−セファロース陽イオン 交換Ｔ稈の際に単離した（米国特許出願第６４１，４３０号明細書を９照された い）、この単離された種の非還元試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、それがＩＧＦ −１標準と一緒に同時移動し且つ単一バンドとして現われるということを示した 。

しかしながら、このタンパク質の還元試料のゲルは、それぞれ約３〜４ｋＤａ（ 完全なＩＧＦ−１の寸法の約半分）の２種類のペプチドを示す二重線を示した。

この二重線のゲルにおける位１は、粗製ブイヨンの還元試料のゲルにおいて完全 なＩＧＦ−１を示すバンドより下に検出された２本のバンドの内の下方の位１に 対応した。これらの結果により、この分子は、開裂または切断され且つジスルフ ィド結合によって互いに保持されたモノマー性ＩＧＦ−１であるということが示 される。タンパク質のアミン末端のタンパク質配列分析により、その分子はＩＧ Ｆ−１の残基４０の前で切断されていることか確証された。この単離された切断 ＩＧＦ−１分子の還元および非還元試料のイムノプロット分析により、それは、 ＩＧＦ−１のＣ末端に対して向けられた抗体との反応性か完全なＩＧＦ−１より も小さいということが示された。

更に別の切断された２種を、精製処理の最初の陽イオン交換クロマトグラフィ一 工程から回収されたＩＧＦ−１のタンパク質配列分析において同定した（米国特 許出願筒６４１．４３０号明細書を参照されたい）、これらの種のいずれかまた は双方が、清浄された細胞不含ブイヨンのＨＰＬＣクロマトグラムにおける小さ いほうのピーク（１１分で溶離するタンパク質）に対応することかできた。これ らの切断された分子の一つのＣ末端断片のアミン末端は、ＩＧＦ−１の残基２５ で開始している。ブイヨン中で検出された他の切断された種のＣ末端のアミノ末 端はＩＧＦ−１の残基１４で開始している。

ＨＰＬＣカラムから１１．５〜１６分後に溶離する、細胞不合ブイヨンのＨＰＬ Ｃ分析において検出された最後の組のタンパク質は、ジスルフィド結合したマル チマー形態のＩＧＦ−１であると考えられる。ジスルフィド結合した［ＧＦ−１ マルチマーのＰ、パストリスブイヨン中の存在は、ブイヨンの５ＤＳ−ＰＡ’Ｇ Ｅ分析およびゲルのイムノプロットにおいて示された。推定上のマルチマーはＩ ＧＦ−１タイマーおよびトリマーとして非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動し 且つＩＧＦ−１のＣ末端に対して向けられた抗体と反応性であった。これらのマ ルチマーを還元した場合、それらは５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて標準モノマー ＩＧＦ−１と一緒に同時移動して、それによってジスルフィド結合したＩＧＦ− １モノマー？古むという二とか示される。ゲルて＃離されたダイマーのタンパク 質配列分析において生じたアミノ酸配列は、真のＩＧＦ−１のＮ末端と同一であ った。更に、マルチマー［ＧＦ−１（見かけ上のダイマーおよびトリマー穐）を ゲル濾過カラムて゛単ＭＬ且つＨＰＬＣによって分析した。単離されたマルチマ ーは、ＩＧＦｉのマルチマーであると考えられたブイヨン中のタンパク質の溶に 時間に対応する１２〜１４分て゛カラムからＭＷした。

実施例７ 精製された真のピキア・バストリス産生ＩＧＦ−１の特性表示。

ＭＬ＜折りたたまれた完全なモノマー性ｒＧＦ−１（真のＩ　ＧＦ−１）を、Ｉ ＧＦ−１発現性菌株Ｇ＋ＴＭＢ２０４Ｓ１４およびＭＴＩＮＢ２０６Ｓ１のブイ ヨンから、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ ーおよびゲル濾過クロマトグラフィー法の組合わせを用いてＩ製した。精製方法 は米国特許出願第０７．・６４１．４３０号明細書にＲ［に記載されている。精 製された材料をＨＰＬＣ、ゲル濾過クロマトグラフィー、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよ びイムノプロット分析並びにアミノ酸組成および配列分析によって特徴付けた。

、Ａ、ＨＰＬＣ分析 精製された調製試料のいくつかの異なる稀釈液に実施例うＣで記載したシステム および操作を用いてＨＰＬＣを行った。得られたタロマドグラムにおいて、溶離 時間かＩＧＦ−１ｔｊ卓のそれと同一であるタンパク質を示す単一の主要ピーク を検出した。

Ｂ　ゲル濾過クロマトグラフィー １、操作 比容量か２４ｍ１　（１０Ｘ３００ｍｍ）のスーパーチフス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ）７５ＨＲ１０・３０ゲル瀘過カラム（ファーマシア）を、寸法基準でＩＧＦ− １を特徴付けるゲル濾過クロマトグラフィー法において用いた。実施例うＣで記 載したＨＰＬＣシステムと、このカラムと一緒に用いるために変更した。検出器 を波長２８０ｎｍおよび感度０．０２ＡＵＦＳに設定した。０．０５Ｍ酢酸アン モニウム、ｐＨ６のＭ＠ｉを含むゲル濾過クロマトグラフィーカラムＭＷｔＨを 流量０．５ｍｌ／分でカラムを介して流動させた。

２、結果 精製されたＩＧＦ−１の２００μｇについてのゲル濾過クロマトグラフィー分析 によるクロマトグラムは、ＩＧＦ−１標準と一緒に同時ｆ！離したタンパク質を 示す単一ピークを生じた。

Ｃ，５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノプロット分析。

精製材料を、実施例５Ｂに記載の５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノプロット法によ って実験した。１μｇまたはそれ未満のタンパク質を含む材料の還元および非還 元試料の銀染色ゲルおよびイムノプロット双方において、単一バンドのみが検出 された。このタンパク質はＩＧＦ−１標準と一緒に同時移動した。

Ｄ、アミノ酸組成 精製ＩＧＦ−１を酸加水分解し、そしてそのアミノ酸をべ／クマン（パロ・アル ド、ＣＡ）６３００アミノ・アシド・アナライザー（Ａｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄＡｎ ａｌｙｚｅｒ）で特徴付けた。ＩＧＦ−１タンパク質を酸加水分解するために、 注意深く測定された容量の精製ＩＧＦ−１溶液を、６Ｘ５０ｍｍガラス試験管に 加え且つサヴアント（Ｓａｖａｎｔ）（ファーミンデール、ＮＹ）スピード・ヴ アク（Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃ）中で乾燥させた。これらの試験管を、６Ｎ−ＨＣＩ 約０．５ｍｌか入っている反応フラスコに入れた。ｌ１１２化反応は真空を適用 し且つフラスコを密封することによって最小限にされた。フラスコを１１０°Ｃ のオーブン中に一晩中入れ、そしてタンパク質をＨＣｘ蒸気によって加水分解し た。

加水分解に続いて、反応フラスコを室温まで冷却し、そして加水分解物を取出し た。試験管中で凝縮したかもしれないＨＣＩを全て、スピードヴアク中で試験管 を乾燥させることによって除去した。遊離アミノ酸は、分析器の５０μＩルーグ での充填用に、ベンクマン・アミノ・アシド・サンプル・ディル−ジョン・バッ ファー（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄｅ　ＳａｍｐｌｅＤｉｌｕｔｉ ｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ）Ｎａ−３の最小量１００μｌ中に溶解した。

ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）（キュバーチイノ、ＣＡ）３０００系クロマトグラフ イー・データ・システム（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ＤａｔａＳ　ｙ　ｓ 　ｔ、　ｅ　ｍ　）を用いて、アミノ酸襟章溶冴と再懸濁された加水分解試ｔ１ との完全なりロマトグラムを比較することによって４度を測定した。

表Ｖｌに、精製ＩＧＦ−ｉに対して推定されたアミノ酸比率およびヒトＩＧＦ〜 １に関して実際に公表されたアミノ酸比率を示す、推定された比率および公表さ れた比率はぴったりと一致し、推定された組成および公表された組成における１ かな尚早はこの分析の予想限界内である。

表ＩＩＩ 精製ｒＧＦ−１のアミノ酸組成分析データＥ、アミノ酸配列 ｌ　操作 菌株Ｍ＋ｌＭＢ２０６ＳＩのブイヨンから精製されたＩＧＦ−１のＮ末端のアミ ノ酸配列を決定するために、この材料の試料をアプライド・バイオシステムズ（ Ａｐｐｌｉｅｄ　ｎｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（フォスター・シティ−１ＣＡ）４７ ０／１２０カス・フェーズ・プロティン・シークエンサー（ＧａｓＰｈａｓｅ　 Ｐｒｏｔｅｔｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ）に直接充填した。配列順序決定は、バン カピラー（Ｈｕｎｋａｐｉ　ｌ　Ｉｅｒ）およびフッド（Ｈｃ＋ｏｄ）菌株Ｇ＋ ｌＭＢ２０４Ｓ１４のブイヨンから精製されたＩＧＦ−１の完全なアミノ酸配列 を決定するために、材料をＮ末端のアミノ酸からできるだけ多くの残つのタンパ ク質配列まで配列順序決定した。この分析により、精製タンパク質の最初の５９ 残基の配列が得られた。残基５９のアミノ酸はメチオニン残基であり、しかも臭 化シアンはメチオニン残基の後でタンパク質を切断するので、精製材料のタンパ ク質配列分析を完成するのに用いるための精製ＩＧＦ−１のＣ末端の１１個のア ミン＃（残基６０）７０）を含むペプチドを単離することは可能であった。精製 ＩＧＦ−１のＣ末端の１１個のアミノ酸は、実施例５Ｃに記載されたのと同一の ０４カラムを用いるＨＰＬＣによって、臭化シアン処理されたＩＧＦ−１から単 離されたペプチド断片として得られた。この断片をタンパク質配列決定装置に充 填して、Ｃ末端のアミノ酸（アミノ酸６０〜７０）の配列を生じた。

菌株Ｇ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１およびＧ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１１の発酵ブイヨンからの 真のＩＧＦ−１のＮ末端のアミノ酸配列も同様に決定しな、ブイヨンを実施例５ Ｃに記載されたように前処し、そしてＨＰＬＣ（同様に実施例５Ｃに記載の）を 行った。溶離時間が？ｊＡ準ＩＧＦ−１のそれと同一の、ＨＰＬＣカラムから５ 離された両分をＳＰ−スフェロデクスカラムに適用してＨＰＬ（Ｊ４ｊ（アセト ニトリルおよびＴＦＡ）を除去した０次に、ＩＧＦ−１を含む溶出液画分をタン パク質配列決定装置に直接充填した。

２、結果 菌株Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１のブイヨンから精製されたＩＧＦ−１の最初の３０個 のアミノ酸および菌株ＧｅｌＭＢ２０４Ｓ１４のブイヨンから精製されたＩＧＦ −１の完全なアミノ酸配列は、配列番号１であるヒトＩＧＦ−１の対応するアミ ノ酸と同一であった。

同様に、菌株Ｇ−ＩＧＦ８１６５１およびＧ−＋ＩＧＦ８１６Ｓ１１のブイヨン からのＩＧＦ−１の最初の１５個のアミノ酸は、ヒトＩＧＦ−１の対応するアミ ノ酸と同一て゛あった。二１ｔらの結果は、成熟ＩＧＦ−１が、Ｐ、パストリス におけるａＭＦプレプＯ−１ｙｓ−ａｏ−１ｙｓ−ａｒまたはαＭＦブレプＯ− １ｙｓ−ａｒｇ−０−１ｙｓ−ａｒ［ＧＦ−１前駆物質から正しく処理されてい ることを確証する。

このような修飾は当業者に明ちかて゛あつ、本発明は請求の範囲の範囲によって のみ制限されることを意味する。

配列表 配列番号　１ 配列の長さ　２４０ 配列の型　核酸 鎖の数　二本鎖 トポロジー　不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１４．．２３２ 配列 ＾ＡＧＣＴＴＡＣＣＴ　ＧＣＣＡＴＧ　ＧＧＡ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＣＴ ＣＴＧＣＧＧＧ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣＧＴＧ　４９１１ｅｔ　Ｇｌｙ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａ １ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＴｒＣＧＴＧ　ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＧＡＣＡ ＧＧ　ＧＧＣｍ　ＴＡＴ　ＴＴＣＡＡＣＡＡＧ　９７Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　 Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　 Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　ＬｙｓＣＣＣＡＣＡ　ＧＧＧ　ＴＡＴ　ＧＧＣＴＣＣ ＡＧＣＡＧｒＣＧＡ　ＣＧＧ　ＧＣＧ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＡＣＡ　ＧＧＣＡＴＣ １４５Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａ ｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ｌ１ｅＧＴＧ　ＧＡ ＴＧＡＧ　ＴＧＣＴＧＣＴＴＣＣＧＧ　ＡＧＣＴＧＴＧＡＴ　ＣＴＡ　ＡＧＧ　 ＡＧＧＣＴＣＧＡＧ　ＡＴＧ　１９３１１ａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｃｙ ｓ　Ｐｂｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｔ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅ■ ＴＡＴ　ＴＧＣＧＣＡ　ＣＣＣＣＴＣＡＡＧ　ＣＣＴ　ＧＣＣＡＡＧ　ＴＣＡ　 ＧＣＴ　ＴＧＡ　ＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧ　２３９Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒ ｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　審Ａ２４０ 配列番号：２ 配列の長さ二３６ 配列の型　核酸 鎖の数、−木調 トポロジー、不明 配列の種類ニゲノミツクＤＮＡ 配列 ＧＴＡＴＣＴｒＴＧＧ　ＡＴＡＡＡＡＧＡＧＧ　ＡＣＣＧＧＡＧＡＣＧ　ＣＴＣ ＴＧＣ３６配列番号・３ 配列の長さ＝１６ 配列の型、核酸 鎖の数−一本鎖 トポロジー・不明 配列の種類ニゲノミツクＤＮＡ 配列 ＡＴＡＡＡＡＧＡＧＧ　ＡＣＣＧＧＡ　１６配列番号：４ 配列の長さ＝４０ 配列の型：核酸 鎖の数・−木調 トポロジー　不明 配列の種類　ゲノミックＤＮＡ 配列 配列の長さ　１７ 配列の型、核酸 鎖の数・−木調 トポロジー二不明 配列の種類ニゲノミツクＤＮＡ 配列 ＴＡＡＧＡＡＴｒＣＡ　ＡＡＴＧＡＧＴ　１７配列番号＝６ 配列の長さ・３５ 配列の型・核酸 鎖の数ニ一本鎖 トポロジー、不明 配列の種類、ゲノミックＤＮＡ 配列 ＴＣｍＧＧＡＴＡ　ＡＡＧＡＧＡＧＧＣＴ　ＧＧＡＣＣＧＣＡＧＡ　ＣＧＣＴＣ ３５配列番号ニア 配列の長さ＝１８ 配列の型：核酸 鎖の数ニ一本鎖 トポロジー二不明 配列の種類ニゲノミツクＤＮＡ 配列 ＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧ　ＣＴＧＧＡＣＣＧ　１８配列番号−８ 配列の長さ、３３ 配列の型、核酸 トポロジー　不明 配列の種類、ケノミックＤＮＡ 配列 ＾ＡＴｒＣＧＡＴＧＡ　ＧＡｍＣＣＴｒＣＡＡＴｒＴｒＴＡＣＴ　ＧＣＡ　３３ 配列番号　９ 配列の長さ・２５ 配列の型　核酸 鎖の数・−木調 トポロジー　不明 配列の種類ニゲノミツクＤＮＡ 配列 ＧＴＡＡＡ＾ＡＴｒＧ　ＡＡＧＧＡＡＡＴＣＴ　ＣＡＴＣＧ　２５配列番号　１ ０ 配列の長さ　３６ 配列の型、核酸 鎖の数・−木調 トポロジー・不明 配列の種類　ゲノミックＤＮＡ 配列 ＧＡＣＧＴｒＣＧＴＴ　ＴＧＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＣＧＧＴＡ　ＧｍＡＴ 　３６配列番号　１１ 配列の長さ　１４ 配列の型　核酸 鎖の数　−木調 トポロジー　不明 配列の種類、ゲノミックＤＮＡ 配列 ＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴ　ＧＣＴＧ　１４配列番号−１２ 配列の長さ、１４ 配列の型、核酸 鎖の数　−木調 トポロジー８不明 配列の種類、ゲノミックＤＮＡ 配列 ＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴ　ＧＣＴＧ　１４成熟ＩＧＦ−１の最初のアミノ酸 ＡＴＴＣ ｃｏＲＩ ＡＡＧ 図１ 図３ 図も 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　５年　３月　４日４

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＮＡ構築物であって、 （ａ）インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）をコードするＤＮＡ；（ｂ）Ｉ ＧＦ−１をコードする該ＤＮＡに対して操作可能に結合したメチロトローフ酵母 のメタノール応答性遺伝子からのプロモーター領域；（ｃ）メチロトローフ酵母 宿主細胞からのＩＧＦ−１の細胞外分泌をもたらすアミノ酸のシグナル配列をコ ードするＤＮＡを含み、 該シグナル配列をコードするＤＮＡが、メチロトローフ酵母細胞プロテアーゼに よって認識され且つ開裂される１か所またはそれ以上のプロセツシング部位をコ ードするＤＮＡによって、ＩＧＦ−１をコードするＤＮＡに対して操作可能に結 合している上記のＤＮＡ構築物。
2. ２．メチロトローフ酵母宿主細胞であって、前記のＤＮＡ構築物が該宿主細胞の ゲノム中にある請求項１に記載のＤＮＡ構築物を含む上記のメチロトローフ酵母 宿主細胞。
3. ３．請求項２に記載の酵母宿主細胞を、ＩＧＦ−１が発現され且つ細胞外培地中 に１０ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度で分泌される条件下で培養することを含 む、ＩＧＦ−１を製造する方法。
4. ４．ＤＮＡ構築物であって、 （ａ）インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）をコードするＤＮＡ；（ｂ）Ｉ ＧＦ−１をコードする該ＤＮＡに対して操作可能に結合したメチロトローフ酵母 のメタノール応答性遺伝子からのプロモーター領域；（ｃ）Ｓ，セレビシエ（ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α交配因子（αＭＦ）プレプロ配列をコーＫするＤＮＡ； （ｄ）ＩＧＦ−１をコードする該ＤＮＡに対して操作可能に結合したメチロトロ ーフ酵母宿主細胞の転写ターミネーター機能を含み、 該ブレブロ配列をコードするＤＮＡが、１ｙｓ−ａｒｇおよびｌｙｓ−ａｒｇ− （ｇｌｕ−ａｌａ）ｘから成る群より選択される１か所またはそれ以上のプロセ ッシング部位をコードするＤＮＡによって、ＩＧＦ−１をコードするＤＮＡに対 して操作可能に結合しており； ｘは、ｇｌｕ−ａＩａ配列の反復数であり且つ不適当に開裂したＩＧＦ−１を細 胞外培地中に生じる反復数未満である、発現カセットを含む上記のＤＮＡ構築物 。
5. ５．ｘが１、２または３である請求項４に記載のＤＮＡ構築物。
6. ６．少なくとも１種類の選択可能な標識遺伝子および細菌性の複製起点を更に含 む請求項４に記載のＤＮＡ構築物。
7. ７．請求項６に記載のＤＮＡ構築物を含むプラスミド。
8. ８．ｐＩＧＦ２０１、ｐＩＧＦ２０２、ｐＩＧＦ２０４、ｐＩＧＦ２０６および ｐＩＧＦ８１６から成る群より選択される請求項７に記載のブラスミド。
9. ９．ＩＧＰ−１ペプチドをコードする前記のＤＮＡが、図１に示した配列を有す る請求項４に記載のＤＮＡ構築物。
10. １０．ブロモ−ターが誘導される前記のメチロトローフ酵母が、ビキア・バスト リス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）菌株である請求項４に記載のＤＮＡ構築 物。
11. １１．メチロトローフ酵母の前記のメタノール応答性遺伝子および転写ターミネ ーターが双方ともＰ．バストリスＡＯＸ１遺伝子から誘導される請求項１０に記 載のＤＮＡ構築物。
12. １２．構築物の３′末端および５′末端が、酵母宿主の標的遺伝子への該構築物 の組込みを指示された部位に作用するのに十分に該標的遺伝子と相同である請求 項１１に記載のＤＮＡ構築物。
13. １３．前記の発現カセットの多数のコピーを含む請求項１２に記載のＤＮＡ構築 物。
14. １４．構築物の３′末端および５′末端が、酵母宿主の標的遺伝子への該構築物 の組込みを指示された部位に作用するのに十分に該標的遺伝子と相同である請求 項４に記載のＤＮＡ構築物。
15. １５．前記の発現カセットの多数のコピーを含む請求項４に記載のＤＮＡ構築物 。
16. １６．前記の発現カセットの多数のコピーが頭−尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｌｅ ）配向で配向されている請求項１５に記載のＤＮＡ構築物。
17. １７．前記の構築物が、ｐＩＧＰ２０１、ｐＩＧＦ２０２、ｐＩＧＦ２０４、ｐ ＩＧＦ２０６およびｐＩＧＦ８１６から成る群より選択されるブラスミドでＤＮ Ａに含まれている請求項４に記載のＤＮＡ構築物。
18. １８．請求項４に記載のＤＮＡ構築物を含むメチロトローフ酵母細胞。
19. １９．請求項９に記載のＤＮＡ構築物を含むメチロトローフ酵母細胞。
20. ２０．前記の酵母がビキア・バストリス菌株である請求項１８に記載のメチロト ローフ酵母細胞。
21. ２１．請求項１５に記載のＤＮＡ構築物を含むメチロトローフ酵母細胞。
22. ２２．請求項１２に記載のＤＮＡ構築物を含むビキア・バストリス細胞。
23. ２３．前記の細胞が、菌株Ｇ＋ＩＧＦ２０１Ｓ１、Ｇ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１、Ｇ＋ ＩＧＦ８１６Ｓ２、Ｍ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１およびＣ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１から成る 群より選択される請求項２２に記載のＰ．バストリス細胞。
24. ２４．請求項１３に記載のＤＮＡ構築物を含むＰ・バストリス細胞。
25. ２５．前記の細胞が、菌株Ｇ＋ＩＧＦ２０６Ｓ２、Ｇ＋ＧＦ８１６Ｓ９、Ｇ＋Ｉ ＧＦ８１６Ｓ１１、Ｇ十ＧＦ８１６Ｓ９およびＧ十ＩＧＦ８１６Ｓ１１、Ｇ＋Ｉ ＭＢ２０２Ｓ２、Ｇ†ＩＭＢ２０４Ｓ１４、Ｇ＋ＩＭＢ２０６Ｓ１、Ｇ＋ＩＭＢ ２０６Ｓ２、Ｇ−｝ＭＢ２０６Ｓ３、Ｇ−ＩＭＢ２０６Ｓ１、Ｇ＋ＩＧＦ８１６ Ｓ９、Ｇ＋ＩＧＦ８１６Ｓｌ１、Ｍ＋ＩＧＦ８１６Ｓ４およびＭ＋ＩＭＢ２０６ Ｓ１から成る群より選択される請求項２４に記載のＰ．バストリス細胞。
26. ２６．前記の細胞が、菌株Ｇ＋ＩＧＦ２０６Ｓ２、Ｇ−ＩＭＢ２０６Ｓ３、Ｇ− ＩＭＢ２０６Ｓ１、Ｇ＋ＩＭＢ２０２Ｓ２およびＧ＋ＩＭＢ２０４Ｓ１４から成 る群より選択される請求項２４に記載のＰ．バストリス細胞。
27. ２７．請求項１８に記載の酵母細胞を含む生育しうるメチロトローフ酵母細胞の 培養。
28. ２８．請求項２２に記載の酵母細胞を含む生育しうるＰ．バストリス細胞の培養 。
29. ２９．請求項２３に記載の酵母細胞の単一種類の菌株を含む生育しうるＰ．バス トリス細胞の培養。
30. ３０．請求項２４に記載の酵母細胞を含む生育しうるＰ．バストリス細胞の培養 。
31. ３１．請求項２５に記載の酵母細胞の単一種類の菌株を含む生育しうるＰ．バス トリス細胞の培養。
32. ３２．請求項１８に記載の細胞を、該細胞が成熟１ＧＦ−１ペプチドを発現し且 つ培地中に分泌する条件下で培養することを含む、インスリン様成長因子（ＩＧ Ｆ−１）を製造する方法。
33. ３３．前記のメチロトローフ酵母がビキア・バストリス菌株である請求項３２に 記載の方法。
34. ３４．前記の細胞を、炭素源としてメタノールを含む培地中で培養する請求項３ ２に記載の方法。
35. ３５．前記の細胞がＭｕｔ＋表現型を有する請求項３２に記載の方法。
36. ３６．前記の細胞がＭｕｔ−表現型を有する請求項３２に記載の方法。
37. ３７．細胞がタンパク質分解によって損なわれいないし、そして培地のｐＨが約 ２〜約４である請求項３２に記載の方法。
38. ３８．ｐＨが約３未満である請求項３７に記載の方法。
39. ３９．前記の細胞がプロテアーゼ欠失であり且つ培地のｐＨが約２〜５である請 求項３２に記載の方法。
40. ４０．請求項２１に記載の細胞を、該細胞が成熟１ＧＦ−１ペプチドを発現し且 つ培地中に分泌する条件下で培養することを含む、インスリン様成長因子（ＩＧ Ｆ−１）を製造する方法。
41. ４１．前記のメチロトローフ酵母がビキア・バストリス菌株である請求項４０に 記載の方法。
42. ４２．前記の細胞を、炭素源としてメタノールを含む培地中で増殖させる請求項 ４０に記載の方法。
43. ４３．前記の細胞がＭｕｔ＋表現型を有する請求項４０に記載の方法。
44. ４４．前記の細胞がＭｕｔ−表現型を有する請求項４０に記載の方法。
45. ４５．細胞がタンパク質分解によって損なわれていないし、そして培地のｐＨが 約２〜約４である請求項４０に記載の方法。
46. ４６．ｐＨが約３未満である請求項４０に記載の方法。
47. ４７．前記の細胞がプロテアーゼ欠失であり且つ培地のｐＨが約２〜５である請 求項４０に記載の方法。
48. ４８．前記の菌株がプロテアーゼ欠失であり且つ該欠失が、前記のプロセッシン グ部位を認識する少なくとも１種類のプロテアーゼに影響を及ぼさない請求項２ ０に記載の菌株。
49. ４９．前記の欠失が、プロテイナーゼＡ、カルボキシベブチダーゼＹおよびプロ テイナーゼＢから成る群より選択される１種類またはそれ以上のプロテイナーゼ の不存在または濃度の減少を引き起こす請求項４８に記載の菌株。
50. ５０．Ｍ＋ＩＭＢ２０６Ｓ１、Ｍ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１、Ｍ＋ＩＧＦ８１６Ｓ４ま たはＣ＋ＩＧＰ８１６Ｓ１である請求項４９に記載の菌株。