CN102199587A

CN102199587A - 人纤溶酶原功能性突变体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102199587A
Application number: CN 201110071134
Authority: CN
Inventors: 陈武; 吴茂材; 吴敬源; 杨健忠; 陈振林; 黄智慧; 张鑫涌
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2011-03-24
Filing date: 2011-03-24
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2031-03-24
Also published as: CN102199587B

Abstract

本发明公开了人纤溶酶原功能性突变体，分别为hPLG-?K：人纤溶酶原蛋白的Pro⁵⁴⁴-Asn⁷⁹¹多肽；RGD-hPLG-?K：hPLG-?K中的Pro⁵⁵⁹突变为Asp⁵⁵⁹；和RHP-hPLG-?K：hPLG-?K多肽的Gly⁵⁶⁰突变为His⁵⁶⁰。本发明还公开了上述功能性突变体的制备方法，是以含人纤溶酶原全长cDNA序列的质粒为模板进行PCR后构建质粒，用巴斯德毕赤酵母进行表达，获得产物。本发明的功能性突变体兼具纤溶与抗血小板聚集或抗纤维蛋白单体聚合作用的双重功能。

Description

人纤溶酶原功能性突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术制药领域，具体涉及人纤溶酶原的功能性突变体及其制备方法和应用。

背景技术

栓塞是导致心脑血管疾病死亡的重要原因之一，溶栓治疗是一种有效的手段。目前临床使用的主要溶栓药物，如组织纤溶酶原激活剂 (Tissue-type plasminogen activator，t-PA) 、尿激酶 (Urokinase-type plasminogen activator，UK)、链激酶(Streptokinase，SK)等，尽管表现出一定的治疗效果，但由于需激活血液内的纤溶酶原（PLG）为纤溶酶（PLM）后方能发挥溶栓作用，因此对陈旧性血栓的效率较低，导致治疗时间窗短、出血并发症较高等缺点。且由于无抗栓功能，易出现溶栓后再栓的情况。PLM是血液内直接发挥纤溶及栓溶作用的蛋白酶。体内实验表明：与目前临床使用的溶栓剂相比，PLM具有可直接溶栓、出血并发症低等特点。PLM还可有效地治疗黄斑变性、木质结膜粘连等多种疾病，以及用于动静脉插管设备的清洗。此外，PLM还参与一系列与蛋白水解相关的生理、病理过程，如组织重构、排卵、炎症、肿瘤细胞侵袭和转移等。因此，PLM具备广阔的药用前景和研究价值。

然而一直以来，PLM的应用均采用混合人血浆提取，受到血浆来源的限制，难以大规模生产，且存在病毒污染的风险。基因工程的发展为大规模生产提供可能。人PLG是由791个氨基酸残基组成的糖蛋白，包含N端多肽（NTP）、五个同源的 Kringle 区（K1-K5）、丝氨酸蛋白酶区（SP）7个结构域。PLG 经纤溶酶原激活剂（PA）特异性水解激活环上的 Arg⁵⁶¹-Val⁵⁶²肽键后，转变为活性 PLM。然而，近年来通过大肠杆菌、哺乳动物细胞表达均未获得高水平的活性蛋白。一些学者通过构建包含SP 结构域和部分K区的小分子突变体，提高了表达水平，且保留了较好的纤溶活性，其中部分进入临床实验研究。

尽管溶栓治疗可以有效地使血管再通，但仍然不能阻止溶栓后再栓。目前尚无兼具溶栓与抗凝、防栓作用的 PLG突变体报道。Arg-Gly-Asp (RGD) 序列可与纤维蛋白原竞争结合与血小板聚集相关的膜受体 GPIIb/IIIa，阻断血栓形成的最后共同通路，其模拟物临床上常用于预防再栓塞。目前已构建了多种包含RGD的融合蛋白，且显示出较好的抗栓作用。

Arg-Pro-Gly（RPG）是纤维蛋白原 α 链 N 端附近的三个氨基酸残基，在凝血酶的作用下曝露出来成为末端三肽，参与纤维蛋白单体之间聚合，从而形成牢固的纤维蛋白栓子，而RPG三肽本身是一种纤维蛋白单体聚合抑制剂。近年来研究表明：一些合成的类似 RPG 多肽，如 GPRP、GPR-sarcosine 亦显示出抗纤维蛋白单体聚合活性，其中以GPRP活性最高。且修饰后的多肽可耐受蛋白酶水解，具有更好的稳定性。

尽管目前已构建出多种包含 SP 结构域的 PLM 突变体，且显示较好的溶栓活性，但尚无兼具溶栓与抗凝、防栓作用的 PLM 突变体报道。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中纤溶酶不能兼具溶栓、抗凝、防栓作用的缺点，提供兼具纤溶与抗血小板聚集或抗纤维蛋白单体聚合作用的双功能重组蛋白，即人纤溶酶原功能性突变体。

本发明的另一个目的是提供上述人纤溶酶原功能性突变体的制备方法。

本发明的又一目的是提供上述人纤溶酶原功能性突变体的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种人纤溶酶原功能性突变体，为人纤溶酶原蛋白的Pro⁵⁴⁴ - Asn⁷⁹¹多肽，去除了5个 Kringle 区，保留了酶催化活性区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，命名为hPLG-∆K；还包括在SEQ ID NO:1限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有如hPLG-∆K活性的蛋白。

上述人纤溶酶原功能性突变体hPLG-∆K的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种人纤溶酶原功能性突变体，是将hPLG-∆K的Pro⁵⁵⁹突变为Asp⁵⁵⁹，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，命名为RGD-hPLG-∆K；还包括在SEQ ID NO:3限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有如RGD-hPLG-∆K活性的蛋白。

上述人纤溶酶原功能性突变体RGD-hPLG-∆K的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

一种人纤溶酶原功能性突变体，是将hPLG-∆K的Gly⁵⁶⁰突变为His⁵⁶⁰，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，命名为RHP- hPLG-∆K；还包括在SEQ ID NO:5限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有如RHP- hPLG-∆K活性的蛋白。

上述人纤溶酶原功能性突变体RHP- hPLG-∆K的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

人纤溶酶原功能性突变体hPLG-∆K的制备方法，包括以下步骤：

以含人纤溶酶原全长cDNA序列的质粒为模板，设计上游引物SEQ ID NO:7和下游引物SEQ ID NO:8进行第一轮PCR；再以第一轮PCR产物为模板，设计上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:8进行第二轮PCR；第二轮PCR产物连接载体转化大肠杆菌，以巴斯德毕赤酵母进行表达，表达产物即为人纤溶酶原功能性突变体hPLG-∆K。

人纤溶酶原功能性突变体RGD-hPLG-∆K的制备方法，包括以下步骤：

以含人纤溶酶原全长cDNA序列的质粒为模板，以上游引物SEQ ID NO:7和下游引物SEQ ID NO:8进行第一轮PCR；以第一轮PCR产物为模板，以上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:8进行第二轮PCR；PCR产物连接载体转化大肠杆菌，构建质粒；以构建的质粒为模板，用上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:10进行第三轮PCR；再以线性化质粒为模板，以第三轮PCR产物为上游引物，与下游引物SEQ ID NO:8进行第四轮PCR；最后以第四轮PCR产物为模板，以上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:8进行第五轮PCR；第五轮PCR产物转化大肠杆菌，以巴斯德毕赤酵母GS115菌株进行表达，表达产物即为RGD-hPLG-∆K。

人纤溶酶原功能性突变体RHP- hPLG-∆K的制备方法，包括以下步骤：

以含人纤溶酶原全长cDNA序列的质粒为模板，以上游引物SEQ ID NO:7和下游引物SEQ ID NO:8进行第一轮PCR；以第一轮PCR产物为模板，上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:8进行第二轮PCR；PCR产物连接载体转化大肠杆菌，构建质粒；以构建的质粒为模板，用上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:11进行第三轮PCR；再以线性化质粒为模板，以第三轮PCR产物为上游引物，与下游引物SEQ ID NO:8进行第四轮PCR；最后以第四轮PCR产物为模板，以上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:8进行第五轮PCR；第五轮PCR产物转化大肠杆菌，所得产物以巴斯德毕赤酵母GS115菌株进行表达，表达产物即为RHP- hPLG-∆K。

以上所述人纤溶酶原功能性突变体在制备预防或治疗炎症、肿瘤、血栓、阿茨海默或黄斑水肿疾病的药物中的应用。

其中，人纤溶酶原hPLG的核苷酸序列Genebank编号：BC060513.1。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的突变体去除了人PLG的所有K区和部分SP区序列，其优势在于：（1）进一步缩减了分子量，有利于重组蛋白质的复性，从而增加了利用大肠杆菌获得高水平表达的可能性；（2）由于PLG的两个糖基化位点均位于K区，去除K区后避免了在酵母菌中表达时的过糖基化问题；（3）K区是PLG与促炎症细胞上受体相结合的主要结构域，去除后可避免重组蛋白激活中性粒细胞、巨噬细胞、血小板、血管内皮细胞，从而降低溶栓时可能存在的促炎症副作用。（4）K区也是PLG与血浆中的抑制物 α₂-抗纤溶酶结合位点，因此去除K区可延长药物在血浆中的半衰期。

本发明在获得重组人PLG突变体高水平表达的基础上，通过定点突变激活环上部分氨基酸序列，从而构建局部RGD、RPG及类似功能模序。激活环是由Cys⁵⁵⁸-Cys⁵⁶⁶二硫键形成的环袢结构，晶体衍射数据表明：该9肽的环袢结构曝露于分子表面，是 PLG 与 PA 相互作用的主要界面，且位于 PLM 蛋白水解结构域外。在 PA 特异性水解激活环上的 Arg⁵⁶¹-Val⁵⁶²肽键后，其下游游离出来的 V⁵⁶²V⁵⁶³G⁵⁶⁴G⁵⁶⁵通过二硫键旋转进入到 PLM的催化活性区，其中末端的 Val⁵⁴²与 Asp⁷⁴⁰形成氢键，引起结构改变，最终形成酶活性口袋。研究显示，激活环激活位点Arg⁵⁶¹上游的突变对 PLG 的激活影响较小，且不参与活性中心的形成，因此可能是进行功能突变的较好位点。本发明从多个突变体中筛选出具有溶栓与抗血小板聚集或抗纤维蛋白单体聚合作用的重组人PLG。

所构建的三个突变体 cDNA 序列经分泌型表达载体整合入巴斯德毕赤酵母染色体中，甲醇诱导后获得高水平表达，表达产物经Ni-NTA亲和层析后纯度达 90% 以上。将纯化后的蛋白 hPLG-∆K、RGD-hPLG-∆K 和 RHP- hPLG-∆K，经 UK 激活后，再经 Ni-NTA 亲和层析获得可稳定保存的 hPLM-∆K、RGD-hPLM-∆K 和 RHP- hPLM-∆K。体外活性测定显示：尽管突变体RGD-hPLG-∆K 和 RHP- hPLG-∆K被UK激活的速率低于PLG、hPLG-∆K，但24h时的激活比例无明显差别，且激活后产生的 RGD-hPLM-∆K 和 RHP-hPLM -∆K纤溶活性与PLM及hPLM-∆K相近。所构建的 RGD-hPLG-∆K 能显著地抑制 ADP诱导的血小板聚集，尽管激活后 RGD 的环袢结构被破坏，抑制活性有所下降，但与 hPLM-∆K 相比，其抑制活性仍然提高了约10倍，表明激活后 RGD 三肽依然位于分子表面，可与血小板充分作用；而构建的RHP- hPLG-∆K使纤维蛋白单体聚合时间延长约1倍。

总之，本研究成功构建了可替代人PLG而用于临床治疗的突变体hPLG-∆K，在此基础上构建了RGD-hPLG-∆K 和 RHP- hPLG-∆K，分别显示出抗血小板聚集和抗纤维蛋白单体聚合作用，并且详述了其制备过程和稳定保存方法。为进一步应用于炎症、肿瘤、血栓、阿茨海默、黄斑水肿等疾病的预防、治疗及相关病理研究提供了基础。

附图说明

图1：实施例1中hPLG-∆K的cDNA序列构建电泳图，M为DNA marker，1为第一轮PCR产物，2为第二轮PCR产物。

图2：实施例2中RGD-hPLG-∆K的cDNA序列构建电泳图，M为DNA maker，1为第一轮PCR产物，2为第二轮PCR产物，3为第三轮PCR产物。

图3：实施例3中RHP-hPLG-∆K的cDNA序列构建电泳图，M为DNA maker，1为第一轮PCR产物，2为第二轮PCR产物。

图4：hPLG-∆K核苷酸序列的测序图。

图5：RGD-hPLG-∆K核苷酸序列的测序图。

图6：RHP-hPLG-∆K核苷酸序列的测序图。

图7：构建的pGME载体质粒经Xba I和Xho I酶切鉴定电泳图，其中M为DNA marker，1为pGEM-T-hPLG-∆K，2为pGEM-T-RGD-hPLG-∆K，3为pGEM-T-RHP-hPLG-∆K，4为pPICZαA。

图8：实施例1中hPLG-∆K在巴斯德毕赤酵母中的表达检测电泳图，M为蛋白Marker，1～5分别为hPLG-∆K工程菌甲醇诱导0, 24, 48, 72, 96h。

图9：实施例2中RGD-hPLG-∆K在巴斯德毕赤酵母中的表达检测电泳图，M为蛋白Marker，1～5分别为RGD-hPLG-∆K工程菌甲醇诱导0, 24, 48, 72, 96h。

图10：实施例3中RHP-hPLG-∆K在巴斯德毕赤酵母中的表达检测电泳图，M为蛋白Marker，1～5分别为RHP-hPLG-∆K工程菌甲醇诱导0, 24, 48, 72, 96h。

图11：hPLG-∆K 、RGD-hPLG-∆K 和RHP-hPLG-∆K的纯化、鉴定图，其中A为Ni-NTA亲合层析图，组分Ⅳ含目的蛋白；B是还原性SDS-PAGE分析纯化过程电泳图，M为蛋白Marker，1为发酵液上清，2为组分Ⅰ（上升峰），3为组分Ⅰ（下降峰），4为组分Ⅱ，5为组分Ⅲ，6为组分Ⅳ；C是Weston bloting鉴定电泳图，1为hPLG-∆K，2为RGD-hPLG-∆K，3为RHP-hPLG-∆K。

图12：UK激活hPLG-∆K 、RGD-hPLG-∆K 和RHP-hPLG-∆K的动力学分析图。

图13：hPLG-∆K 、RGD-hPLG-∆K 和RHP-hPLG-∆K 的纤溶活性检测图，A是纤维蛋白板法测定纤溶活性图，1为0.02 mol/L PBS，2～6为5、2.5、1.25、0.62、0.32 U/mL牛血清PLG，7～10为0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL hPLG-∆K，11～13为0.1、0.2、0.4 mg/mL RGD-hPLG-∆K，14～17为0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL RHP-hPLG-∆K；B是纤溶活性对应于溶圈直径平方的标准曲线。

图14：RGD-hPLG-∆K抑制ADP诱导的血小板聚集活性 * P=0.0001, n=5。

具体实施方式

以下实施例中所用材料、试剂及仪器为：

大肠杆菌TOP10由本实验室保存，pDNR-LIB-hPLG质粒购自南京恩晶生物科技有限公司，pPICZαA质粒、巴斯德毕赤酵母GS115、Zeocin购自美国Invitrogen公司，牛血清PLG、PLM购自美国Sigma公司，pGM-T质粒购自上海Generay生物技术有限公司，Xba I、Xho I、Sac I、T4 DNA ligase 、Premix Taq、DNA Marker、蛋白Marker购自大连宝生物工程有限公司，引物合成由上海生工生物工程公司提供，测序由深圳华大测序公司完成，质粒抽提、DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司， Ni-NTA亲和介质为北京瑞达恒辉公司产品；LBY-NJ血液凝聚仪购自北京普利生公司，冷冻干燥仪ZMD-MS为Waters公司产品。

实施例 1 hPLG-∆K 的制备

1. hPLG-∆K基因的亚克隆：以含人PLG全长cDNA序列的pDNR-LIB-hPLG 质粒作为模板，以上游引物SEQ ID NO:7和下游引物SEQ ID NO:8进行第一轮PCR，其中上游引物SEQ ID NO:7中引入6个组氨酸残基的编码序列标签，下游引物SEQ ID NO:8中加上Xba I的酶切位点，反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，40℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃延伸7 min ，PCR产物1.0% 琼脂糖凝胶电泳、胶回收、浓度测定。再以该产物为模板，以上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:8进行第二轮PCR，其中引物SEQ ID NO:9中含Xho I 酶切位点和Kex 2酶识别位点的编码序列，PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，40℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃延伸7 min，PCR产物1.0% 琼脂糖凝胶电泳、胶回收、浓度测定。

2. pGME-T-hPLG-∆K质粒的构建：将上述浓度测定后的hPLG-∆K片段连接pGME-T载体，转化感受态大肠杆菌TOP10，Amp-LB培养板筛选白斑，菌落PCR和测序鉴定突变体pGME-T-hPLG-∆K质粒构建成功。

3. pPICZαA- hPLG-∆K质粒的构建：将鉴定正确的pGME-T-hPLG-∆K以Xho I、 Xba I酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳、胶回收、浓度测定后连接pPICZαA载体，再转化感受态大肠杆菌TOP10，涂布于含有25 µg/mL Zeocin的LB固体培养基上筛选转化子，菌落PCR鉴定重组子。

构建结果：以含全长人PLG基因cDNA序列的质粒pDNR-LIB-hPLG为模板，经第一轮、第二轮PCR在800 bp附近均显示单一条带，分别与理论计算的778 bp、792 bp相符（见图1）。经测序证实在指定位置进行了突变（见图4，下划线为定点突变的位置）。

4. 巴斯德毕赤酵母的转化与筛选：将构建的pPICZαA- hPLG-∆K质粒以Sac I线性化，酚氯仿抽提进行纯化浓缩，电击转化感受态巴斯德毕赤酵母GS115菌株后，涂布含100 µg/mL Zeocin YPDS培养板，待长出菌落后再用无菌芽签挑单菌落，接种至含200 µg/mL、800 µg/mL Zeocin的YPD培养板，筛选高拷贝重组子。同理进行pPICZαA-hPLG-∆K的转化与筛选。

5. hPLG-∆K基因的表达：从含800 µg/mL Zeocin的YPD酵母培养板上挑选2个单克隆菌落，接种到30 mL的BMGY液体培养基中，250 RPM，30℃培养16-18 h，直到OD600达到3.0左右。等体积预冷的灭菌水洗涤，1500 rpm，4℃离心5 min，弃上清，重复洗涤一次。菌体以15 mL的BMMY重悬，30℃摇床，250 rpm培养，每隔12 h取样300 µL，样品12 000 rpm离心5 min，上清-20℃保存，直至培养72 h，其间每隔24 h补加甲醇（终浓度1%）。样品以还原性12% SDS-PAGE检测目的蛋白表达；纤维蛋白板法鉴定发酵液活性。

表达结果：SDS-PAGE检测显示各重组菌经甲醇诱导表达24 h，在31 kDa处均出现单一条带，与理论计算的分子量接近，诱导72 h时即达到峰值（见图8）。

6. hPLG-∆K的纯化与鉴定：采用Ni-NTA亲和介质进行纯化，层析柱 (2.5 cm ×15 cm) 先以A液（0.05 mol/L KH₂PO₄－Na₂HPO₄缓冲液（pH 7.4），0.5 mol/L NaCl ）平衡 5 个柱床体积，流速为2 mL/min；发酵液12 000 rpm离心5 min后，上清取35 mL上样（流速1 mL/min)，再以 A 液冲洗至 A280 近基线（流速2 mL/min)。依次以含5、10、500 mmol/L 咪唑的A液进行阶段洗脱（流速2 mL/min)，收集各阶段洗脱峰，15% 还原性 SDS-PAGE 和纤维蛋白板法鉴定目的蛋白组份。合并活性组分，透析除盐（透析液：0.02 mol/L KH₂PO₄－Na₂HPO₄缓冲液（pH 7.4），0.15 mol/L NaCl ）和PEG 20 000 浓缩，冷冻抽干，-20℃保存备用。

取纯化、透析后的 hPLG-∆K，以摩尔比100：1加入UK，37℃分别反应20min、40min、60min、80min、6h、12h、18h、24 h，还原性SDS-PAGE分析最适激活时间。激活后反应液通过Ni-NTA亲和色谱去除UK，纯化方法同上，洗脱液以0.02 mol/L KH₂PO₄－Na₂HPO₄ 缓冲液（pH 3.0，0.15 mol/L NaCl ）透析、浓缩后冷冻干燥保存。

统计数据以（

± s）表示，采用SPSS 12.0软件进行处理，两均数间的比较采用t检验，P<0.05为有统计学意义。

纯化和UK激活结果：发酵液经Ni-NTA亲和层析纯化，可见位于97 kDa的杂带以及大部分的色素不能结合而流出，通过咪唑洗脱可得到纯度90%以上的hPLG-∆K。将hPLG-∆K经UK激活12h后，再通过Ni-NTA亲和层析去除UK，得到具有直接纤溶活性的hPLM-∆K。免疫印迹实验表明hPLG-∆K可与兔抗人PLG抗血清反应，证实为预期构建的蛋白（见图11）。

UK激活动力学：通过还原性SDS-PAGE分析可见未激活hPLG-∆K显示单一条带，而被UK激活为hPLm-∆K后，由于蛋白水解作用失去一段小肽，显示为分子量稍小的条带（见图12）。

实施例 2 RGD-hPLG-∆K 的制备

1. pGME-T- RGD-hPLG-∆K质粒的构建：通过三轮PCR反应，第一轮以实施例1中构建好的pGME-T -hPLG-∆K质粒为模板，用上游引物SEQ ID NO:9和下游突变引物SEQ ID NO:10进行PCR；第二轮以EcoRI线性化的pGME-T -hPLG-∆K质粒为模板，用第一轮PCR片段为上游引物，与下游引物SEQ ID NO:8进行PCR；第三轮用第二轮PCR产物为模板，以上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:8。PCR产物经1.0%琼脂糖电泳、胶回收、浓度测定后连接pGME-T载体，转化感受态大肠杆菌TOP10，Amp-LB培养板筛选白斑，菌落PCR和测序鉴定pGME-T- RGD-hPLG-∆K质粒构建成功。

2. pPICZαA-RGD-hPLG-∆K质粒的构建：将鉴定正确的pGME-T- RGD-hPLG-∆K以Xho I、 Xba I酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳、胶回收、浓度测定后连接pPICZαA载体，再转化感受态大肠杆菌TOP10，涂布于含有25 µg/mL Zeocin的LB固体培养基上筛选转化子，菌落PCR鉴定重组子。

构建结果：以实施例1的pGME-T -hPLG-∆K质粒为模板，通过三轮PCR构建了突变体RGD-hPLG-∆K的cDNA片段（见图2）；经测序证实在指定位置进行了突变（见图5，下划线为定点突变的位置）。

3. 巴斯德毕赤酵母的转化与筛选：将构建的pPICZαA- RGD- hPLG-∆K质粒以Sac I线性化，酚氯仿抽提进行纯化浓缩，电击转化感受态巴斯德毕赤酵母GS115菌株后，涂布含100 µg/mL Zeocin YPDS培养板，待长出菌落后再用无菌芽签挑单菌落，接种至含200 µg/mL、800 µg/mL Zeocin的YPD培养板，筛选高拷贝重组子。按实施例1方法进行pPICZαA- RGD- hPLG-∆K质粒的转化与筛选。

4. RGD- hPLG-∆K基因的表达：从含800 µg/mL Zeocin的YPD培养板上挑选2个单克隆菌落，接种到30 mL的BMGY液体培养基中，250 RPM，30℃培养16-18 h，直到OD600达到3.0左右。等体积预冷的灭菌水洗涤，1500 rpm，4℃离心5 min，弃上清，重复洗涤一次。菌体以15 mL的BMMY重悬，30℃摇床，250 rpm培养，每隔12 h取样300 µL，样品12 000 rpm离心5 min，上清-20℃保存，直至培养72 h，其间每隔24 h补加甲醇（终浓度1%）。样品以还原性12% SDS-PAGE检测目的蛋白表达；纤维蛋白板法鉴定发酵液活性。

表达结果：SDS-PAGE检测显示各重组菌经甲醇诱导表达24 h，在31 kDa处均出现单一条带，与理论计算的分子量接近，诱导72 h时即达到峰值（见图9）。

5. RGD- hPLG-∆K的纯化与鉴定：采用Ni-NTA亲和介质进行纯化，层析柱 (2.5 cm ×15 cm) 先以A液（0.05 mol/L KH₂PO₄－Na₂HPO₄缓冲液（pH 7.4），0.5 mol/L NaCl ）平衡 5 个柱床体积，流速为2 mL/min；发酵液12 000 rpm离心5 min后，上清取35 mL上样（流速1 mL/min)，再以 A 液冲洗至 A280 近基线（流速2 mL/min)。依次以含5、10、500 mmol/L 咪唑的A液进行阶段洗脱（流速2 mL/min)，收集各阶段洗脱峰，15% 还原性 SDS-PAGE 和纤维蛋白板法鉴定目的蛋白组份。合并活性组分，透析除盐（透析液：0.02 mol/L KH₂PO₄－Na₂HPO₄缓冲液（pH 7.4），0.15 mol/L NaCl ）和PEG 20 000 浓缩，冷冻抽干，-20℃保存备用。

取纯化、透析后的RGD- hPLG-∆K蛋白，以摩尔比100：1加入UK，37℃分别反应20min、40min、60min、80min、6h、12h、18h、24 h，还原性SDS-PAGE分析最适激活时间。激活后反应液通过Ni-NTA亲和色谱去除UK，纯化方法同5所述，洗脱液以0.02 mol/L KH₂PO₄－Na₂HPO₄ 缓冲液（pH 3.0，0.15 mol/L NaCl ）透析、浓缩后冷冻干燥保存。

统计数据以（

纯化和UK激活结果：发酵液经Ni-NTA亲和层析纯化，可见位于97 kDa的杂带以及大部分的色素不能结合而流出，通过咪唑洗脱可得到纯度90%以上的RGD- hPLG-∆K蛋白。将RGD- hPLG-∆K蛋白经UK激活12h后，再通过Ni-NTA亲和层析去除UK，得到具有直接纤溶活性的RGD- hPLm-∆K蛋白。免疫印迹实验表明RGD- hPLG-∆K蛋白可与兔抗人PLG抗血清反应，证实为预期构建的蛋白（见图11）。

UK激活动力学：通过还原性SDS-PAGE分析可见未激活RGD-hPLG-∆K蛋白显示单一条带，而被UK激活为RGD- hPLm-∆K蛋白后，由于蛋白水解作用失去一段小肽，显示为分子量稍小的条带，经光密度扫描分析显示：UK激活RGD-hPLG-∆ K显著的速率比hPLG-∆K要慢，两者在24 h时的激活百分比无显著差别（见图12）。

实施例 3 RHP-hPLG-∆K 的制备

1. pGME-T-RHP-hPLG-∆K质粒的构建：通过三轮PCR反应，第一轮以实施例1中构建好的pGME-T -hPLG-∆K质粒为模板，用上游引物SEQ ID NO:9和下游突变引物SEQ ID NO:11进行PCR；第二轮以EcoRI线性化的pGME-T -hPLG-∆K质粒为模板，用第一轮PCR片段为上游引物，与下游引物SEQ ID NO:8进行PCR；第三轮用第二轮PCR产物为模板，以上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:8。PCR产物经1.0%琼脂糖电泳、胶回收、浓度测定后连接pGME-T载体，转化感受态大肠杆菌TOP10，Amp-LB培养板筛选白斑，菌落PCR、Xho I和Xba I酶切测序鉴定pGME-T-RHP-hPLG-∆K质粒构建成功。

2. pPICZαA-RHP-hPLG-∆K质粒的构建：将鉴定正确的pGME-T- RHP -hPLG-∆K以Xho I、 Xba I酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳、胶回收、浓度测定后连接pPICZαA载体，再转化感受态大肠杆菌TOP10，涂布于含有25 µg/mL Zeocin的LB固体培养基上筛选转化子，菌落PCR鉴定重组子。

构建结果：以实施例1的pGME-T -hPLG-∆K质粒为模板，通过二轮PCR构建了突变体RHP -hPLG-∆K的cDNA片段（见图3）；经测序证实在指定位置进行了突变（见图6，下划线为定点突变的位置）。

3. 巴斯德毕赤酵母的转化与筛选：将构建的pPICZαA- RHP - hPLG-∆K质粒以Sac I线性化，酚氯仿抽提进行纯化浓缩，电击转化感受态巴斯德毕赤酵母GS115菌株后，涂布含100 µg/mL Zeocin YPDS培养板，待长出菌落后再用无菌芽签挑单菌落，接种至含200 µg/mL、800 µg/mL Zeocin的YPD培养板，筛选高拷贝重组子。按实施例1方法进行pPICZαA- RHP - hPLG-∆K的转化与筛选。

4. RHP - hPLG-∆K基因的表达：从含800 µg/mL Zeocin的YPD培养板上挑选2个单克隆菌落，接种到30 mL的BMGY液体培养基中，250 RPM，30℃培养16-18 h，直到OD600达到3.0左右。等体积预冷的灭菌水洗涤，1500 rpm，4℃离心5 min，弃上清，重复洗涤一次。菌体以15 mL的BMMY重悬，30℃摇床，250 rpm培养，每隔12 h取样300 µL，样品12 000 rpm离心5 min，上清-20℃保存，直至培养72 h，其间每隔24 h补加甲醇（终浓度1%）。样品以还原性12% SDS-PAGE检测目的蛋白表达；纤维蛋白板法鉴定发酵液活性。

表达结果：SDS-PAGE检测显示各重组菌经甲醇诱导表达24 h，在31 kDa处均出现单一条带，与理论计算的分子量接近，诱导72 h时即达到峰值（见图10）。

5. RHP - hPLG-∆K的纯化与鉴定：采用Ni-NTA亲和介质进行纯化，层析柱 (2.5 cm ×15 cm) 先以A液（0.05 mol/L KH₂PO₄－Na₂HPO₄缓冲液（pH 7.4），0.5 mol/L NaCl ）平衡 5 个柱床体积，流速为2 mL/min；发酵液12 000 rpm离心5 min后，上清取35 mL上样（流速1 mL/min)，再以 A 液冲洗至 A280 近基线（流速2 mL/min)。依次以含5、10、500 mmol/L 咪唑的A液进行阶段洗脱（流速2 mL/min)，收集各阶段洗脱峰，15% 还原性 SDS-PAGE 和纤维蛋白板法鉴定目的蛋白组份。合并活性组分，透析除盐（透析液：0.02 mol/L KH₂PO₄－Na₂HPO₄缓冲液（pH 7.4），0.15 mol/L NaCl ）和PEG 20 000 浓缩，冷冻抽干，-20℃保存备用。

取纯化、透析后的RHP - hPLG-∆K，以摩尔比100：1加入UK，37℃分别反应20min、40min、60min、80min、6h、12h、18h、24 h，还原性SDS-PAGE分析最适激活时间。激活后反应液通过Ni-NTA亲和色谱去除UK，纯化方法同5所述，洗脱液以0.02 mol/L KH₂PO₄－Na₂HPO₄ 缓冲液（pH 3.0，0.15 mol/L NaCl ）透析、浓缩后冷冻干燥保存。

统计数据以（

纯化和UK激活结果：发酵液经Ni-NTA亲和层析纯化，可见位于97 kDa的杂带以及大部分的色素不能结合而流出，通过咪唑洗脱可得到纯度90%以上的RHP - hPLG-∆K。将RHP - hPLG-∆K经UK激活12h后，再通过Ni-NTA亲和层析去除UK，得到具有直接纤溶活性的RGD- hPLm-∆K（未显示）。免疫印迹实验表明RHP - hPLG-∆K可与兔抗人PLG抗血清反应，证实为预期构建的蛋白（见图11）。

UK激活动力学：通过还原性SDS-PAGE分析可见被UK激活为RHP - hPLm-∆K后，由于蛋白水解作用失去一段小肽，显示为分子量稍小的条带，经光密度扫描分析显示：UK激活RGD-hPLG-∆ K显著的速率比hPLG-∆K要慢，而RHP-hPLM-∆K与hPLG-∆K无显著差别，且三者在24 h时的激活百分比无显著差别（见图12）。

实施例 4 hPLG-∆K 、 RGD-hPLG-∆K 、 RHP-hPLG-∆K 的活性测定

分别取hPLG-∆K、RGD-hPLG-∆K和RHP-hPLG-∆K冻干品，以0.5 mL双蒸水复溶，BCA法测定蛋白浓度后，再以0.02 mol/L PBS分别调整hPLG-∆K、RGD-hPLG-∆K至相同浓度：0.2 mg/mL，0.4 mg/mL。

1. hPLG-∆K、RGD-hPLG-∆K和RHP-hPLG-∆K的纤溶活性

1 %琼脂糖凝胶板中含有0.05 mol/L PBS（pH 7.4）、1.5% 纤维蛋白、800 U/mL UK、0.02% NaN₃。凝胶打孔后，各孔中加等体积的样品液或PLG 标准品，37℃ 湿盒保温过夜。游标卡尺测定各孔溶圈直径，以溶圈直径的平方与标准品活性作标准曲线，计算样品的比活性。

2. RGD-hPLG-∆K的抗血小板聚集活性

兔心脏取血18 mL加入2 mL 0.109 mol/L的枸椽酸钠溶液充分混匀，800 rpm离心10 min，取上清为富血小板血浆（PRP）；剩余血液再以2500 rpm离心20 min，取上清即为贫血小板血浆（PPP）。血细胞计数板计数，PPP调节PRP使血小板浓度为2.5-4.0×108/mL。将PRP、PPP转移至硅化的三角瓶中室温保存，1 h内用血小板聚集仪分别测定hPLG-∆K、RGD-hPLG-∆K及其激活产物的血小板聚集抑制率（Ri）。测定时，将200 µL PRP加入搅拌子后调零，加入5 µL ADP（终浓度10umol/L），反应5 min，记录最大聚集率（PAGm），以此为空白对照（PAGm.blank）；样品测定时，200 µL PRP分别加入5 µL 0.4 mg/mL PLG、PLM及hPLG-∆K、RGD-hPLG-∆K、hPLM-∆K、RGD-hPLM-∆K制备液，室温反应15min后检测样品PAGm （PAGm.sample）；hPLG-∆K的测定方法同上。血小板聚集抑制率的计算公式为：

3. RHP-hPLG-∆K的抗纤维蛋白单体聚合活性

兔血浆提取纤维蛋白单体混合物（参照Brosstad F, Godal HC, Kierulf P, Haemostasis, 1977;6:225-235）。测定时采用硅化的玻璃试管（Φ1 cm），200 µL 纤维蛋白单体混合物分别加入5 µL 0.4 mg/mL PLG、 hPLG-∆K、RHP-hPLG-∆K及PLM、 hPLM-∆K、RHP-hPLM-∆K制备液，37℃反应15min后，加入CaCl₂ (终浓度0.025 mol/L) 和2 U/mL 凝血酶，放置37℃水浴锅中，每隔7s取出试管水平向下缓慢倾斜30度，记录凝固时间。

4. 统计处理

统计数据以（

5. 活性测定结果

5.1 hPLG-∆K、RGD-hPLG-∆K和RHP-hPLG-∆K的纤溶活性

采用纤维蛋白板法测定，反应24 h后以牛血清PLG制作标准曲线，测定所纯化hPLG-∆K、RGD-hPLG-∆K和RHP-hPLG-∆K的比活性分别为 ( 17.6 ± 4.2 ) U/mg、( 16.3 ± 3.8 ) U/mg和( 15.7 ± 3.1 ) U/mg，经统计分析RGD-hPLG-∆K和RHP-hPLG-∆K的比活性与hPLG-∆K无显著区别 (P = 0.630, n =5) (P = 0.439, n =5)（见图13）。

5.2 RGD-hPLG-∆K的抗血小板聚集活性

对RGD-hPLG-∆K.、hPLG-∆K以及激活后的RGD-hPLM-∆K.和hPLM-∆K抗血小板聚集活性分析显示：RGD-hPLG-∆K、RGD-hPLM-∆K都可以明显抑制ADP诱导的血小板聚集，且RGD-hPLG-∆K的抑制率（36.1%±3.83%）高于RGD-hPLM-∆K（21.8%±1.57%），两者有显著差别 (P=0.0001, n=5)，两者都显著高于hPLG-∆K (2.2%±0.71%) (P=0.000, n=5)，PLG及PLM表现弱的抑制活性（见图14）。

5.3 RHP-hPLG-∆K的抗纤维蛋白单体聚合活性

RHP-hPLG-∆K能抑制凝血酶诱导的纤维蛋白单体聚合为纤维蛋白，从而延迟其凝固，其凝固时间与hPLG-∆K相比具有显著差别(P=0.001, n=5)；PLG和hPLG-∆K与PBS相比无显著抑制作用(P=0.0797, n=5) (P=0.794, n=5)；激活后的PLM、hPLM-∆K、RHP-hPLM-∆K由于降解纤维蛋白单体，均未发生凝固（见表1）。

表1 抗纤维蛋白单体聚合活性（

± s）

样品	凝固时间(s)
		PBS	53.0±10.7
PLG	66.4±12.8
		hPLG-∆K	51.6±10.4
RHP-hPLG-∆K	103.1±20.5
		PLM	未凝固
hPLM-∆K	未凝固
		RHP-hPLM-∆K	未凝固

SEQUENCE LISTING

<110> 广东药学院

<120> 人纤溶酶原功能性突变体及其制备方法和应用

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

His His His His His His Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val

1 5 10 15

Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His

20 25 30

Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met

35 40 45

His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala

50 55 60

Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile

65 70 75 80

Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile

85 90 95

Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu

100 105 110

Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Asp Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala

115 120 125

Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe

130 135 140

Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu

145 150 155 160

Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr

165 170 175

Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His

180 185 190

Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu

195 200 205

Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp

210 215 220

Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val

225 230 235 240

Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

245 250

<210> 2

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catcaccatc accatcaccc ttcatttgat tgtggtaagc ctcaagtgga gccgaagaaa 60

tgtcctggaa gggttgtagg ggggtgtgtg gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc 120

agtcttagaa caaggtttgg aatgcacttc tgtggaggca ccttgatatc cccagagtgg 180

gtgttgactg ctgcccactg cttggagaag tccccaaggc cttcatccta taaggtcatc 240

ctgggtgcac accaagaagt gaatctcgaa ccgcatgttc aggaaataga agtgtctagg 300

ctgttcttgg agcccacacg aaaagatatt gccttgctaa agctaagcag tcctgccgac 360

atcactgaca aagtaatccc agcttgtctg ccatccccaa attatgtggt cgctgaccgg 420

accgaatgtt tcatcactgg ctggggagaa acccaaggta cttttggagc tggccttctc 480

aaggaagccc agctccctgt gattgagaat aaagtgtgca atcgctatga gtttctgaat 540

ggaagagtcc aatccaccga actctgtgct gggcatttgg ccggaggcac tgacagttgc 600

cagggtgaca gtggaggtcc tctggtttgc ttcgagaagg acaaatacat tttacaagga 660

gtcacttctt ggggtcttgg ctgtgcacgc cccaataagc ctggtgtcta tgttcgtgtt 720

tcaaggtttg ttacttggat tgagggagtg atgagaaata at 762

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<212> PRT

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Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Asp Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala

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Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu

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Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu

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ctgggtgcac accaagaagt gaatctcgga ccgcatgttc aggaaataga agtgtctagg 300

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<212> PRT

<213> 人工序列

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His His His His His His Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val

1 5 10 15

Glu Pro Lys Lys Cys Pro His Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His

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Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met

35 40 45

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Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile

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Claims

1.一种人纤溶酶原功能性突变体，为人纤溶酶原蛋白的Pro⁵⁴⁴ - Asn⁷⁹¹多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述人纤溶酶原功能性突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种人纤溶酶原功能性突变体，是将权利要求1所述人纤溶酶原功能性突变体中的Pro⁵⁵⁹突变为Asp⁵⁵⁹，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.权利要求3所述人纤溶酶原功能性突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

5.一种人纤溶酶原功能性突变体，是将权利要求1所述人纤溶酶原功能性突变体中的Gly⁵⁶⁰突变为His⁵⁶⁰，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

6.权利要求5所述人纤溶酶原功能性突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

7.权利要求1所述人纤溶酶原功能性突变体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：以含人纤溶酶原全长cDNA序列的质粒为模板，设计上游引物SEQ ID NO:7和下游引物SEQ ID NO:8进行第一轮PCR；再以第一轮PCR产物为模板，设计上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:8进行第二轮PCR；第二轮PCR产物连接载体转化大肠杆菌，以巴斯德毕赤酵母进行表达，表达产物即为权利要求1所述人纤溶酶原功能性突变体。

8.权利要求3所述人纤溶酶原功能性突变体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：以含人纤溶酶原全长cDNA序列的质粒为模板，以上游引物SEQ ID NO:7和下游引物SEQ ID NO:8进行第一轮PCR；以第一轮PCR产物为模板，以上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:8进行第二轮PCR；PCR产物连接载体转化大肠杆菌，构建质粒；以构建的质粒为模板，用上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:10进行第三轮PCR；再以线性化的质粒为模板，以第三轮PCR产物为上游引物，与下游引物SEQ ID NO:8进行第四轮PCR；最后以第四轮PCR产物为模板，以上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:8进行第五轮PCR；第五轮PCR产物转化大肠杆菌，以巴斯德毕赤酵母GS115菌株进行表达，表达产物即为权利要求3所述人纤溶酶原功能性突变体。

9.权利要求5所述人纤溶酶原功能性突变体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：以含人纤溶酶原全长cDNA序列的质粒为模板，以上游引物SEQ ID NO:7和下游引物SEQ ID NO:8进行第一轮PCR；以第一轮PCR产物为模板，上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:8进行第二轮PCR；PCR产物连接载体转化大肠杆菌，构建质粒；以构建的质粒为模板，用上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:11进行第三轮PCR；再以线性化质粒为模板，以第三轮PCR产物为上游引物，与下游引物SEQ ID NO:8进行第四轮PCR；最后以第四轮PCR产物为模板，以上游引物SEQ ID NO:9和下游引物SEQ ID NO:8进行第五轮PCR；第五轮PCR产物转化大肠杆菌，所得产物以巴斯德毕赤酵母GS115菌株进行表达，表达产物即为权利要求5所述人纤溶酶原功能性突变体。

10.权利要求1、3或5所述人纤溶酶原功能性突变体在制备预防或治疗炎症、肿瘤、血栓、阿茨海默或黄斑水肿疾病的药物中的应用。