CN101294153B - 一种黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程和酶学领域的一种黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶及其制备方法，其序列编码具有SEQ ID No.2的黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的氨基酸序列，该氨基酸序列具有SEQ ID No.1中第1-1581位所示的核苷酸序列。该氨基酸序列是具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽。通过试验，加入PEP后的啤酒蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后，8～14kDa的混浊性蛋白条带完全消失，说明富含脯氨酸残基的混浊活性蛋白被PEP完全水解，由此可以初步证明脯氨酸蛋白内肽酶能够特异性地切割蛋白质和肽链碳端的脯氨酸残基，能够消除啤酒中的冷混浊物质。

Description

一种黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程和酶学领域，更具体地，涉及一种黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶及其制备方法。

背景技术

脯氨酸蛋白内肽酶、脯氨酰内肽酶，(prolyl-specific endoprotease，proline-specific endoprotease，proline-specific endopeptidase简称PEP)在此发明中都指一种酶。脯氨酸蛋白内肽酶是一种能特异性地水解小分子量多肽中脯氨酸羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶(Wilk S.Life Science，1983，33(22)：2149)。

众所周知，在组成天然蛋白质或多肽的20种α-氨基酸中，脯氨酸(Pro)是唯一具有亚氨结构的氨基酸，其环状结构影响了与其他氨基酸形成肽键时的空间构象，同时使蛋白质中含Pro的肽键或其临近的其他肽键对广泛专一性的蛋白酶不敏感。自然界在进化过程中产生了一些专门针对多肽中Pro残基的蛋白酶，而且这种蛋白酶甚至对Pro在多肽中的位置和成键的构型都有很强的专一性，这类酶称为脯氨酸专一性肽酶，也就是脯氨酸蛋白内肽酶(PEP)。脯氨酸蛋白内肽酶可以作为一种分子生物学的工具酶，用于蛋白质序列测定、肽谱分析、特异位点的酶切、肽段的修饰和加工等。

饮料工业中广泛存在着混浊的问题，在啤酒、葡萄酒和果汁的生产过程中，用于生产的原料植物中都含有大量的蛋白质和多酚，由于它们的性质、比率等等，蛋白质和多酚会形成混浊。啤酒中能形成蛋白质-多酚复合物的蛋白质和多酚分别为混浊活性(haze-active)蛋白质和混浊活性多酚(分别简称为HA蛋白质和HA多酚)。对蛋白质来说，只有分子中富含脯氨酸的蛋白质才是HA蛋白质，而缺乏脯氨酸的蛋白质不具有混浊活性，而且蛋白质形成混浊的活性程度与其所含的脯氨酸的量呈正比。Bulter研究表明富含脯氨酸的蛋白与缺乏脯氨酸的蛋白有很大区别。HA蛋白质主要来自大麦醇溶蛋白，它富含脯氨酸，在HA蛋白质分子的氨基酸链中，脯氨酸是HA多酚的结合部位。脯氨酸蛋白内肽酶具有脯氨酸特异性是已知的，它能够特异性地切割蛋白质和肽链碳端的脯氨酸残基。研究证实脯氨酸蛋白内肽酶能够有效地水解HA(混浊活性)蛋白质。因此，脯氨酸蛋白内肽酶可以应用于啤酒、葡萄酒和果汁等饮料去除混浊。与其他吸附剂相比，使用脯氨酸蛋白内肽酶不会影响葡萄酒及果汁的香气口感和颜色，是一种比较好的去除混浊的物质。

PEP由Walter等人于1971年在人体子宫组织中发现，PEP广泛分布于哺乳动物的各种组织，同时也存在于少数几种真菌、细菌甚至古细菌中，但其含量很低，分离纯化困难，限制了对其生理功能和性质的研究。国外已经从脑膜炎脓毒黄杆菌(Chevallier S，Goeltz P，Thibault P et al.J Biochem，1992，267(12)：8192)、嗜水气单胞菌(Kanatani A，Yoshimoto T，Kitazona A et al.J Biochem 1993，113：790)、耐热古细菌(Robinson K A，Bartley Bartley D A，Robb F T et al.Gene，1995，152：123)、人淋巴细胞(Shirasawa Y，Osawa T，Hirashima A.J Biochem，1994，113：724)和猪脑cDNA库(Rennex D，HemmingsB A，Hofsteenge J et al.Biochemistry，1991，30：2195)中克隆了PEP基因，进行了基因工程研究。

黑曲霉是美国食品药品管理机构认定的生物安全菌，从黑曲霉中提取脯氨酸蛋白内肽酶应用于食品药品行业安全可靠，然而，迄今为止国内还没有有关黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶。

本发明的目的之二是提供一种编码黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的DNA序列。

本发明的目的之三是提供一种制备黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的方法。

本发明采取的技术方案是：

一种黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶，它是选自DNA序列编码具有SEQ IDNo.2的黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的氨基酸序列。

而且，所述的氨基酸序列具有SEQ ID No.1中第1-1581位所示的核苷酸序列。

而且，所述的氨基酸序列是具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽。

一段信号肽序列，所述的氨基酸序列具有SEQ ID No.1中第1-66位所示的核苷酸序列。

一种表达载体，它具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

一种宿主细胞，它被具有SEQ ID No.1中第66-1581位所示的核苷酸序列的表达载体所转化。

而且，它是毕赤酵母GS115/pPIC9-PEP。

一种黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的制备方法，该制备方法的步骤包括：

(1).黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因及其片段；

(2).编码黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的表达载体，所述的该核苷酸序列编码具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽；

(3).将上述的表达载体转入宿主细胞，形成脯氨酸蛋白内肽酶的重组细胞；

(4).在适合表达该脯氨酸蛋白内肽酶多肽的条件下，培养脯氨酸蛋白内肽酶的重组细胞；

(5).分离出具有黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶活性的多肽。

而且，所述的脯氨酸蛋白内肽酶来源于黑曲霉；所述的重组载体适合在酵母中表达。

本发明的优点和积极效果是：

1.本发明是综合从NCBI和EMBL上获得的黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的基因序列，设计简并引物，从黑曲霉中扩增出脯氨酸蛋白内肽酶基因，再根据简并引物重新设计上下游引物，扩增出PEP基因并测序，整个工艺简单可行。

2.本发明利用甲醇利用型酵母菌巴斯德毕赤酵母GS115，分泌型表达载体pPIC9，当外源基因PEP转化毕赤酵母时发生的是基因替换型整合，产生的表达菌的表型为Mut^s，转化子的甲醇利用率低，但它表达外源基因的效率高。

3.本发明将脯氨酸蛋白内肽酶与啤酒蛋白作用，能够特异性地切割蛋白质和肽链碳端的脯氨酸残基，可清楚看到啤酒冷混浊蛋白被分解，这对啤酒工业去除混浊有着一定的指导意义。

附图说明

图1为本发明脯氨酸蛋白内肽酶基因的PCR扩增电泳图；

图2为本发明重组质粒pPIC9-PEP的构建图；

图3本发明重组质粒pPIC9-PEP载体的酶切验证图；

图4本发明毕赤酵母GS115/pPIC9-PEP的表达图；

图5为本发明的PEP对啤酒蛋白作用图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

首先需要说明的是：

在本发明中，术语“黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶”指具有黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶活性的SEQ ID No.2序列的多肽。该术语还包括具有与黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶相同功能的、SEQ ID No.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的活性片段和活性衍生物。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种情况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、黑曲霉、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是毕赤酵母。

本发明是综合从NCBI和EMBL上获得的黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的基因序列，设计简并引物，从黑曲霉中扩增出脯氨酸蛋白内肽酶基因。再根据简并引物重新设计上下游引物，扩增出PEP基因并测序。

本发明的黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成法获得。

对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，以黑曲霉AS.3.360作为模板，扩增得到有关序列。

本发明所涉及的黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶，它是选自DNA序列编码具有SEQ ID No.2的黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的氨基酸序列，该氨基酸序列是具有SEQ ID No.1中第1-1581位所示的核苷酸序列。

此外，该氨基酸序列是具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽。

一段信号肽序列，氨基酸序列是具有SEQ ID No.1中第1-66位所示的核苷酸序列。

一种表达载体，它具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

一种宿主细胞，它被具有SEQ ID No.1中第66-1581位所示的核苷酸序列的表达载体所转化，该宿主细胞是毕赤酵母GS 115/pPIC9-PEP。

本发明所涉及的黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的制备方法的步骤是：

1.脯氨酸蛋白内肽酶基因的扩增

提取黑曲霉A.niger AS.3.360染色体RNA，设计如下引物(引物委托大连宝生物生物工程有限公司合成)：

上游引物P1：：5’-ATGCGTTCCTTCTCCGTTGTCG-3’

上游引物P2：5’-ATGCGTGCCTTCTCCGCTGT-3’

下游引物P3：5’-TCAGGCATAATACTCCTCCACCCAC-3’

以黑曲霉染色体总RNA为模板进行RT反应，按以下次序，将各成分在灭菌EP管中混合：模版RNA 1μl，oligo(dT)1μl，Rnase free H₂O 4μl，70℃保温10min，在冰上急冷2min以上；取引物变性溶液6μl，5×MMLV Buffer2μl，dNTP Mixture 0.5μl，Rnase Inhibitor 0.25μl，MMLV反转录酶0.4μl，Rnase free H₂O 0.85μl，42℃保温1h，70℃保温15min后冰上冷却。以RNA反转录产物cDNA为模板进行PCR反应，按以下次序，将各成分在灭菌EP管中混合，采用20μl反应体系：PCR Buffer 2μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.2μl，上游引物P1/P2(20μmol/L)1μl，下游引物P3(20μmol/L)1μl，反转录产物2μl，ddH₂O 12.2μl。扩增条件为：94℃5min，一个循环；94℃1min，60℃1min，72℃2min，30个循环；72℃，10min，一个循环。将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以P1和P3为引物扩增，检测到在1500bp和2000bp之间出现一条特异性条带，其大小与目的基因片段(1581bp)大小完全吻合，结果如图1所示。其中，1为1kb DNA ladder，2为以引物P1和P3扩增出的结果，3为P2和P3为引物扩增的结果。将目的基因与pUCm-T载体(购自上海生物工程公司)连接，得到pUCm-T-PEP，将此质粒穿刺LB培养基送TaKaRa公司测序。结果表明，扩增到的脯氨酸蛋白内肽酶基因的DNA序列如SEQ ID No.1，编码的核苷酸序列如SEQ ID No.2。

2.PEP基因的序列分析

从测序结果可知，PEP基因全长1581bp，其中1-1578位编码526个氨基酸残基，1578-1581为终止密码子(TGA)，GC比例为56.61％。1～66位碱基编码信号肽(22个氨基酸)，67～1578位编码成熟肽(504个氨基酸)。经EXPASY数据库分析推算，黑曲霉PEP成熟肽的等电点为4.43，相对分子质量为56486，结构中富含甘氨酸和丙氨酸，甲硫氨酸含量很少。

将本文获得的黑曲霉PEP的序列(PEPA)与NCBI报道的黑曲霉PEP基因序列(PEPN)进行比对，发现PEPA发生4个碱基的突变，其中第900位T突变为G，第942位C突变为T，第1578位T突变为C，此3个碱基的突变为同义突变，氨基酸并未发生改变。而第524位T突变为C，其所在的第175位氨基酸苏氨酸(Thr)突变为色氨酸(Trp)。虽然发生一个氨基酸的突变，但此突变并未发生在酶的活性中心Ser上。PEPA与PEPN氨基酸一级结构有20个左右氨基酸的不同，但是在组成催化三联体的Ser(S)₁₇₉、Asp(D)₄₅₈、His(H)₄₉₁附近具有高度保守的氨基酸序列，活性中心Ser附近也具有Gly-X-Ser-Y-X-Gly这一PEP家族的保守结构。因为氨基酸突变的位点都没有发生在活性中心附近，所以认为这些突变理论上并不影响酶的结构和生物学活性。可见，虽然PEP基因的获得是来自不同的黑曲霉种类，但是它们的保守性很高，理论上对酶活不会造成影响。

3.表达载体的制备

在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中接种携带质粒pPIC9的大肠杆菌DH5α菌株(本实验室保存)，于37℃振荡培养过夜。将1.5ml菌液转入微量离心管中，12000r/m，离心30s收集菌体，弃上清，空干残液。将沉淀重悬于100μl预冷的溶液I(50mmol/L蔗糖，25mmol/L Tris，10mmol/LEDTA，pH8.0)，混合均匀。加入200μl新配的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，盖紧管口，轻轻摇匀，放置冰上1～2min至液体清亮。加入150μl预冷的溶液III(3mol/L乙酸钾，pH4.8)，轻轻转动离心管，使溶液III在粘稠的细菌裂解液中混合均匀，冰浴3-5min。12000r/min，离心5min，将上清转移到另一EP管中，加等体积苯酚/氯仿溶液，振荡混匀，12000r/min离心5min，上清移入另一EP管中。加入2倍体积的无水乙醉，混匀，冰浴(或-20℃)放置30min。12000r/min，离心5min，弃上清。加入70％乙醇1ml洗涤2次，12000r/min离心5min，弃上清，静置干燥30min。加入20μl含RNase的TE溶液重溶沉淀。

在EP管中加入5μl按上述方法制备的质粒DNA，2μl10倍浓度酶切缓冲液，0.5μl EcoR I，0.5μl Not I，加入双蒸水至总体积为20μl，于37℃保温4h，然后于60℃保温20min，使限制酶失活。取5μl样品用琼脂糖凝胶电泳检测，超螺旋的pPIC9载体被切成线性DNA分子。

上述酶切片段采用DNA片段快速回收试剂盒(购自博大泰克生物基因技术有限公司)进行纯化。具体方法是：

把酶切产物与溶胶液以1∶7的比例混合，振荡混匀后装柱，9000r/m离心30s，去除液体，12000r/m离心30s，加入500μl漂洗液，12000r/m离心30s，重复漂洗一次，12000r/m离心2min，最后加入34μl洗脱液，12000r/m离心3～5min。

纯化好的DNA保存在4℃或-20℃的条件下。所获得的线性纯化pPIC9即可用作连接脯氨酸蛋白内肽酶基因的载体。

4.脯氨酸蛋白内肽酶表达载体的构建

成熟肽基因的获得：毕赤酵母对外源蛋白自身信号序列识别能力差，所以用酵母α因子信号肽取代脯氨酸蛋白内肽酶自身信号肽更有利于分泌。

以测序后的重组质粒pUCm-T-PEP为模板，上游引物P4、下游引物P5进行PCR扩增得到去自身信号肽的脯氨酸蛋白内肽酶基因。去除信号肽的脯氨酸蛋白内肽酶基因的序列如SEQ ID No.3

P4：5’-CCGGAATTCGCTCGCCCCCGTCTTGT-3’

P5：5’-CCGCGGCCGCTGCCTATCCCTACTTCACAT-3’

其中上游引物P4 5’端含EcoR I酶切位点，下游引物P5 5’端含Not I酶切位点。按照实验例1的PCR条件配置反应液。PCR扩增条件为：94℃5min，一个循环；94℃1min，58℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min，一个循环。

将扩增出的去除信号肽的PEP基因的PCR产物用DNA片段快速回收试剂盒进行割胶纯化。具体操作如下：用TAE缓冲液制作0.8％的琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯下切下含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，切碎胶块。称量胶块重量，计算胶块体积(按照1mg相当于1μl计算)。向胶块中加入7倍体积的溶胶液，均匀混合后室温溶胶或者60℃溶胶5min，其间偶尔摇动。装柱，9000r/m离心30s，去除液体，12000r/m离心30s，加入500μl漂洗液，12000r/m离心30s，重复漂洗一次，12000r/m离心2min，最后加入34μl洗脱液，12000r/m离心3～5min。

取26μl纯化的PCR产物，加入5μl10倍浓度的酶切缓冲液，2μl EcoR I，2μl Not I，5μl BSA，加入双蒸水至50μl总体积，于37℃保温4h，然后于65℃保温20min，使限制性内切酶失活。用实验例3所述的方法对酶切片段进行纯化。在1.5ml EP管中加入3μl纯化的DNA，1μl线性pPIC9质粒，1μl连接缓冲液，1μl T4 DNA连接酶，加双蒸水至总体积为10μl，16℃连接过夜。

将重组质粒按照下述方法线性化。取重组质粒10μl，加入2μl10倍浓度的酶切缓冲液，lμlBglII，加入双蒸水至20μl总体积，37℃保温4h，然后于65℃保温20min，使限制性内切酶失活。用实验例3所述的方法对酶切片段进行纯化。所得到的连接混合物用电转化法转化大肠杆菌DH5α。

按下述方法制备大肠杆菌DH5α的感受态细胞。接1环E.coli DH5α于装有5ml LB培养基的试管中，37℃、180r/min振荡培养12h。将培养物以1％接种量接种于另一装有50ml LB培养基的250ml三角瓶中，37℃、180r/min振荡培养2～3h，使细胞达到对数生长期(OD600＝0.6～0.8)。将三角瓶移到冰上放置20min，4℃、3000r/min离心15min收集菌体。将培养液倒净，用10％甘油100ml洗涤菌体两次。最后将细胞悬浮在50μl10％甘油中，每份40μl分装到预冷的EP管中，置-70℃保存。

使用时将感受态细胞置冰上融化，同时将电转杯也放在冰上冷却。在一个EP管中将10μl上述线性化质粒和40μl感受态细胞混合，混匀后加入电转杯中，轻击液体以确保细菌细胞与DNA悬液位于电转杯底部。打开电转化仪，调整到专门为大肠杆菌转化设置的一档。擦干电转化杯外面的冷凝水和雾气，放进电转化仪中，按上述设定的档，启动对细胞的电转化。转化结束后，尽可能快地取出电转杯，加入1mlSOC培养液。(SOC培养液配方：20g/L胰蛋白胨，0.5g/L NaCl，5g/L酵母粉，0.25mol/L氯化钾溶液10ml，2mol/L氯化镁溶液5ml，20ml/L 1mol/L葡萄糖溶液，pH7.0)。混匀后转入1.5mlEP管中，于37℃培养1h。取500μl涂布含氨苄青霉素(100μg/ml)的LA平板上，倒置培养过夜(16-20h)。从平板上挑取单菌落，接种于液体LB培养基中，于37℃振荡培养10-12h，然后小量提取质粒DNA，用限制酶EcoR I和Not I进行双酶切鉴定。选择能切下1.6kb片段和8.0 kb片段的克隆，将含有PEP基因的重组质粒命名为pPIC9-PEP。重组质粒的构建见图2。

也可以用氯化钙法转化大肠杆菌。大肠杆菌DH5α的培养同电转化法。培养好的菌液置0℃冰上冷却10min，取50ml培养液装入预冷的离心管中，4℃，4000r/m离心10min。倒出培养液，空干离心管。用30ml冰浴的MgCl₂-CaCl₂溶液(80mmol/LMgCl₂，20mmol/LCaCl₂)重悬细胞沉淀。4℃，4000r/m离心10min，倒出上清液，空干离心管。用1ml冰浴的0.1mol/LCaCl₂溶液悬浮。按每管40μl分装到1.5mlEP管中，-70℃保存。使用时将感受态细胞置冰上融化，加入5μl连接混合物，轻轻混匀，冰浴20min。于42℃热激90s，迅速转移至冰浴中，放置2～3min。加入SOC培养基1ml，37℃缓慢摇动45min。按每个平板150μl培养液涂布到含氨苄青霉素(100μg/ml)的LA平板上，37℃倒置培养过夜(16～20h)。从平板上挑取单菌落，接种于液体LB培养基中，37℃振荡培养10～12h，然后小量提取质粒DNA，并用限制酶EcoR I和Not I进行双酶切鉴定。选择能切下1.5kb左右片段和8.0kb片段的克隆，将含有PEP基因的重组质粒命名为pPIC9-PEP。

重组质粒pPIC9-PEP的酶切鉴定见图3，在图3中1为1kb DNA ladder；2为重组质粒PCR的结果；3为pPIC9 EcoR I+Not I酶切产物；4为pPIC9-PEP的EcoR I+Not I酶切产物；5为pPIC9-PEP EcoR I单酶切产物

委托TaKaRa公司对目的基因进行序列测定，所得结果与SEQ ID No.3的结果完全相同。

5.表达载体转化毕赤酵母

在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中接种携带质粒pPIC9-PEP的大肠杆菌DH5α菌株37℃振荡培养过夜。按实验例3的方法提取质粒。

按下述方法制备甲醇毕赤酵母GS115的感受态细胞。挑取酵母单菌落接种于10ml YEPD培养基中，30℃振荡培养12h。将培养物以1％接种量接种于50ml YEPD培养基中，30℃振荡培养至OD₆₀₀＝1.3～1.5。4℃，5000r/min离心5min，无菌条件下回收细胞，倒出上清液，加入50ml预冷的无菌水洗涤菌体沉淀。4℃，5000r/min离心5min，弃上清，用25ml预冷的无菌水洗涤菌体。4℃，5000r/min离心5min，弃上清，加入2ml预冷的1mol/L无菌山梨醇溶液，打散菌体使之重悬于溶液中。4℃，7000r/min离心5min，弃上清，加入0.4ml预冷1mol/L无菌山梨醇溶液，打散菌体，每份80μl分装到预冷的EP管中，-70℃保存。

使用时将感受态细胞置冰上融化，同时将电转杯也放在冰上冷却。在一个EP管中将20μl上述线性化质粒和80μl感受态细胞混合，混匀后加入2mm电转杯中，轻击液体以确保细胞与DNA悬液位于电转杯底部。打开电转化仪，擦干电转化杯外面的冷凝水和雾气，放进电转化仪中，在电压1500V，电容25μF，电阻200Ω条件下转化毕赤酵母。转化结束后，尽可能快地取出电转杯，室温下加入1ml预冷的1mol/L无菌山梨醇溶液，并将电转杯内物质移入EP管中。取250μl菌液涂布于MD平板上，(MD培养基配方：13.4g/L YNB，20g/L葡萄糖，4×10^-4g/L生物素，15g/L琼脂粉)30℃倒置培养3～5天，长出的白色菌落就是酵母转化子。

酵母转化子表型的鉴定：从平板上挑取同一菌落分别点接在MM和MD平板上，注意要先点接MM平板，在点接MD平板。(MM培养基配方：13.4g/L YNB，5ml/L甲醇，4×10^-4g/L生物素，15g/L琼脂粉)平板置于30℃倒置培养3～5天。在MD平板上生长状态良好而在MM平板上生长缓慢的为Mut^s型转化子，在MD和MM平板上生长均良好的为Mut⁺型转化子。实验证明，pPIC9-PEP转化子大部分都为Mut^s型转化子。

毕赤酵母转化子总DNA的提取与检测如下：接种转化子单菌落到装有10mlYEPD培养基的250ml三角瓶中，30℃培养至OD₆₀₀＝5-10。室温，5000r/m，离心5min，收集菌体。细胞悬浮在2ml的SCED缓冲液中(1mmol/L山梨醇，10mmol/L柠檬酸钠(pH7.5)，10mmol/L EDTA，10mmol/L DTT，pH7.5)。加入0.1～0.3mg的Zymolyase，37℃温育50min，使原生质体形成率小于80％。加入2ml1％的SDS，轻轻混匀，冰浴5min。加入1.5ml 5mmol/L醋酸钾(pH8.9)，混匀。4℃，5000r/m，离心5min，收集上清液。将上清液转入另一支离心管，加入等体积无水乙醇，室温放置15min。4℃，5000r/m，离心20min，收集沉淀。沉淀悬浮在0.7ml的TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH7.4)。加入等体积苯酚-氯仿溶液(1∶1，v/v)，4℃，10000r/m，离心5min。上清液转移到另一个离心管中，再加入等体积的氯仿-异戊醇溶液(24∶1，v/v)，4℃，10000r/m，离心5min。上清液转移到另一个离心管中，加入1/2体积的7.5mol/L的醋酸铵(pH7.5)，两倍体积无水乙醇，干冰中放置10min或-20℃放置60min，4℃，10000r/m，离心20min，用1ml70％乙醇洗涤沉淀两次。真空干燥沉淀，每个离心管中加入50μl TE缓冲液(pH7.4)溶解沉淀。

以空质粒pPIC9电转毕赤酵母GS115的转化子和连接质粒pPIC9-PEP电转GS115的酵母转化子总DNA为模板，用实验例3中设计的引物P4和P5进行PCR扩增。PCR条件为：94℃5min，一个循环；94℃1min，58℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min，一个循环。琼脂糖凝胶电泳检测证明，以空质粒转化子DNA为模板未扩增出条带，以pPIC9-PEP转化子DNA为模板扩增出与目的基因大小一致的特异性条带。证实，PEP基因已经插入毕赤酵母的染色体上。

6.毕赤酵母重组菌株中PEP基因表达的鉴定

重组酵母的诱导表达：挑取酵母转化子接种于10ml BMGY培养基中，(BMGY培养基配方：20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，100ml/L 1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，10ml/L甘油)30℃，200r/min振荡培养12h。将培养物以1％接种量接种于另一装有50ml BMGY培养基的250ml三角瓶中，30℃，200r/min振荡培养16h～20h。室温下3000r/min离心5min，收集菌体，置于装有25ml BMMY培养基(BMMY培养基配方：20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，100ml/L 1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，5ml/L甲醇)的250ml三角瓶中，30℃，200r/min继续振荡培养。每隔24h向培养基中添加甲醇至终浓度为0.5％。定时取样，离心收集上清液。

用上述方法培养pPIC9-PEP转化子和作为阴性对照的空质粒转化子，将培养好的细胞悬浮液分别转入离心管中，4℃，5000r/m，离心5min，除去细胞，取500μl发酵上清液加入50μl100％的TCA溶液，振摇均匀，室温放置10min，15000r/m离心10min，去上清，甩干后加入500μl冰冷丙酮，振荡混匀，放置10min后15000r/m离心10min，去上清，加入20μl上样缓冲液煮10min，取15μl用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，SDS-PAGE的分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。结果表明，在诱导表达的条件下携带有pPIC9-PEP的毕赤酵母样品中检测到了一条约60kD的蛋白带，比软件预测的PEP分子量大，原因是毕赤酵母可对目的蛋白进行蛋白质的翻译后修饰——糖基化。而阴性对照并未出现此带。这表明在诱导条件的条件下外源PEP基因得到了表达。

脯氨酸蛋白内肽酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测见图4，在图4中1为蛋白质Marker；2为阴性对照；3～6为PIC9-PEP转化子。由此可见，蛋白上清液中基本上没有其他蛋白，PEP蛋白的分子量大概为60kDa左右。

7.脯氨酸蛋白内肽酶酶活的测定

重组菌株诱导表达后，12000r/m离心10min去除菌体，测定上清液中的酶活。酶活单位定义：在相应条件下，每分钟释放1μmol p-NA所需要的酶量，即1个酶活力单位，以1U表示。测定方法如下：取1ml 0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)加入250μl底物溶液(底物溶液的配置：称取0.0085g特异性底物Z-Gly-Pro-pNA溶于含有40％1，4-二氧六环的0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)中)和100μl发酵液样品。37℃培养5min，测定其在410nm处的吸光度值。

酶活计算： $U/\mathrm{ml}=\frac{\mathrm{\ΔA}}{\min }\×\frac{V\×{10}^6}{\mathrm{\γ}\·v\·\mathrm{\β}}$

式中V-反应体系体积    γ-摩尔消光系数℃

    v-样品量          β-比色杯光程

   ΔA-吸光度变化     10⁶-将mol换算成μmol

经测定，酶活为407.2mU/ml。

8.产品性能测定

将脯氨酸蛋白内肽酶(DSM公司提供的酶纯品)与啤酒蛋白进行作用，具体方法如下：将啤酒后酵液500ml抽滤，加入1％的脯氨酸蛋白内肽酶，37℃保温1h，75％饱和度的硫酸铵盐析过夜，8000r/min离心20min，用5ml柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液溶解沉淀，4℃透析过夜。将经PEP处理的啤酒蛋白和未经PEP处理的啤酒蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶的浓度为12％，分离胶的浓度为5％。结果如图5。1为蛋白质Maker；2为经PEP处理的啤酒蛋白；3为未经PEP处理的啤酒蛋白；4为PEP蛋白。由图4可知，PEP分子量约为60kDa左右。啤酒蛋白由分子量为8～14kDa和35～45kDa的两种蛋白组成，其中分子量为35～45kDa的蛋白为泡沫蛋白，分子量8～14kDa的蛋白为混浊活性蛋白。在啤酒里，混浊活性蛋白主要起源于富含脯氨酸的α醇溶蛋白(大麦醇溶蛋白)。加入PEP后的啤酒蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后，8～14kDa的混浊性蛋白条带完全消失，说明富含脯氨酸残基的混浊活性蛋白被PEP完全水解，由此可以初步证明脯氨酸蛋白内肽酶能够特异性地切割蛋白质和肽链碳端的脯氨酸残基，能够消除啤酒中的冷混浊物质。

                            序列列表

SEQUENCE LISTING

(1)SEQ ID No.1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1581bp

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA

(iii)序列描述：SEQ ID No.1：

GCTCGCCCCCGTCTTGTGCCCAAGCCTATCTCTCGGCCAGCTTCGAGT

AAGTCGGCTGCGACTACGGGTGAGGCTTATTTTGAGCAGCTGCTGGACCATCACAA

CCCGGAGAAGGGAACGTTTTCCCAGCGGTACTGGTGGAGTACTGAATACTGGGGTG

GACCTGGGTCACCGGTGGTCCTCTTTAACCCTGGAGAGGTCTCTGCCGATGGCTATG

AGGGGTATCTCACCAACGATACTCTCACTGGTGTCTATGCGCAGGAGATCCAGGGTG

CCGTCATTCTCATTGAACACCGCTACTGGGGCGACTCTTCGCCTTATGAGGTGCTCA

ATGCCGAAACACTTCAGTATCTCACACTGGATCAGTCCATTCTGGACATGACCTACTT

CGCCGAGACGGTAAAGCTGCAGTTCGALAATAGCAGCCGCAGCAATGCGCAGAATG

CTCCCTGGGTCACGGTCGGTGGCTCATACAGCGGTGCCTTGACGGCTTGGACCGAG

TCTATCGCGCCTGGAACGTTCTGGGCTTACCATGCCACCAGTGCGCCTGTGGAGGCT

ATCTATGACTTTTGGCAATACTTCTACCCCATTCAGCAAGGTATGGCACAGAACTGCA

GCAAGGATGTGTCTCTGGTAGCCGAGTATGTCGACAAAATTGGGAAGAATGGAACT

GCCAAGGAACAGCAGGAGCTCAAAGAATTGTTTGGTCTGGGAGCTGTTGAGCATTA

CGATGACTTTGCCGCTGTCCTGCCCAACGGACCGTACCTCTGGCAAGACAACGACT

TTGTCACAGGATACTCTTCCTTCTTCCAGTTCTGTGATGCTGTCGAGGGGGTCGAAG

CCGGCGCGGCAGTGACCCCCGGCCCCGAGGGCGTTGGACTTGAAAAGGCCCTGGC

CAACTACGCAAACTGGTTCAATTCAACCATACTCCCTAACTACTGCGCAAGCTACGG

CTACTGGACCGACGAATGGAGCGTCGCCTGTTTCGACAGCTATAATGCCTCGAGCCC

CATCTTCACCGACACCTCCGTGGGTAACCCTGTCGACCGCCAATGGGAATGGTTCCT

CTGCAACGAGCCTTTCTTCTGGTGGCAGGACGGTGCCCCCGAGGGAACCTCCACTA

TTGTGCCCCGGCTCGTCAGCGCCTCCTACTGGCAACGCCAATGCCCGCTCTACTTCC

CCGAAGTTAACGGCTACACGTACGGCAGCGCGAAGGGTAAAAACTCCGCTACGGTG

AACAGCTGGACGGGTGGATGGGATATGACCCGCAACACGACGCGGTTGATCTGGAC

GAACGGGCAATATGACCCCTGGCGCGACTCCGGTGTGTCGAGCACTTTCCGGCCCG

GTGGTCCGCTGGTTAGCACGGCGAACGAACCCGTGCAGATTATTCCGGGCGGGTTC

CATTGCTCGGACTTGTATATGGAGGATTACTATGCGAATGAGGGTGTGAGGAAGGTG

GTTGATAATGAGGTGAAGCAGATTAAGGAGTGGGTGGAGGAGTATTATGCCTGA

(2)SEQ ID No 2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：526个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(iii)序列描述：SEQ ID No.2：

MRSFSVVAAASLALSWASLAQAARPRLVPKPISRPASSKSAATTGEAYFEQLLDHHNPE

KGTFSQRYWWSTEYWGGPGSPVVLFNPGEVSADGYEGYLTNDTLTGVYAQEIQGAVIL

IEHRYWGDSSPYEVLNAETLQYLTLDQSILDMTYFAETVKLQFDNSSRSNAQNAPWVT

VGGSYSGALTAWTESIAPGTFWAYHATSAPVEAIYDFWQYFYPIQQGMAQNCSKDVSL

VAEYVDKIGKNGTAKEQQELKELFGLGAVEHYDDFAAVLPNGPYLWQDNDFVTGYSSF

FQFCDAVEGVEAGAAVTPGPEGVGLEKALANYANWFNSTILPNYCASYGYWTDEWSV

ACFDSYNASSPIFTDTSVGNPVDRQWEWFLCNEPFFWWQDGAPEGTSTIVPRLVSASY

WQRQCPLYFPEVNGYTYGSAKGKNSATVNS WTGGWDMTRNTTRLIWTNGQYDPWR

DSGVSSTFRPGGPLVSTANEPVQIIPGGFHCSDLYMEDYYANEGVRKVVDNEVKQIKEW

VEEYYA

(3)SEQ ID No 3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：504个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(iii)序列描述：SEQ ID No.3：

ARPRLVPKPISRPASSKSAATTGEAYFEQLLDHHNPEKGTFSQRYWWSTEYWGGPGSPV

VLFNPGEVSADGYEGYLTNDTLTGVYAQEIQGAVILIEHRYWGDSSPYEVLNAETLQYL

TLDQSILDMTYFAETVKLQFDNSSRSNAQNAPWVTVGGSYSGALTAWTESIAPGTFWA

YHATSAPVEAIYDFWQYFYPIQQGMAQNCSKDVSLVAEYVDKIGKNGTAKEQQELKEL

FGLGAVEHYDDFAAVLPNGPYLWQDNDFVTGYSSFFQFCDAVEGVEAGAAVTPGPEGV

GLEKALANYANWFNSTILPNYCASYGYWTDEWSVACFDSYNASSPIFTDTSVGNPVDR

QWEWFLCNEPFFWWQDGAPEGTSTIVPRLVSASYWQRQCPLYFPEVNGYTYGSAKGK

NSATVNSWTGGWDMTRNTTRLIWTNGQYDPWRDSGVSSTFRPGGPLVSTANEPVQIIP

GGFHCSDLYMEDYYANEGVRKVVDNEVKQIKEWVEEYYA

Claims (1)

1.一种黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的制备方法，其特征在于，该制备方法的步骤包括：

(1).扩增黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因；

(2).编码黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的表达载体，所述的该核苷酸序列编码氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的多肽；

(3).将上述的表达载体转入毕赤酵母GS115，形成黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的重组细胞；

(4).在适合表达该黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶多肽的条件下，培养黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的重组细胞；

(5).分离出具有黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶活性的多肽。

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