CN104726461B - 甲鱼胶原蛋白基因功能片段及其重组蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从甲鱼中克隆得到的如序列表SEQ ID NO.1所示的胶原蛋白基因功能片段，该克隆基因功能片段的表达得到如序列表SEQ ID NO.2所示的重组蛋白，该重组蛋白为重组甲鱼胶原蛋白功能肽段。该重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的全长为252个氨基酸，含有27个胶原蛋白特有的Gly‑X‑Y重复域，分子量大小为38kDa。其制备方法为：表达重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的大肠杆菌基因工程菌的构建；大肠杆菌基因工程菌的培养；重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的诱导和表达；重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的纯化复性。采用本发明方法制备的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段，经试验，具有较强的抗氧化活性，具有开发为抗氧化剂的应用价值。

Description

甲鱼胶原蛋白基因功能片段及其重组蛋白和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及甲鱼胶原蛋白基因功能片段及其重组蛋白和应用。

背景技术

胶原蛋白是一种细胞外的结构蛋白，主要存在于人和动物的肌腱、韧带、软骨、皮肤及结缔组织中。胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸，其水解得到的多肽产物不仅有许多重要的生理活性功能而且具有良好的消化吸收特性。这使得胶原蛋白在近年来成为研究热点，同时也在医药、食品、美容以及生物材料等方面得到了广泛的应用。

传统的制备胶原蛋白的主要方法为从牛、猪等动物的皮肤、胎盘等组织提取，具有诸多不利因素。例如：利用酸碱水解法从动物结缔组织中提取的胶原蛋白掺杂了较多的杂质，在提取过程中部分蛋白较易丧失活性；异体来源的胶原蛋白存在着传染病危险(疯牛病等)、异种或异体的排斥反应、刚性很强易引发分子链断裂、提取物不溶于水导致细胞毒性等问题。利用基因工程法生产胶原蛋白不仅可以克服传统方法中存在的病毒隐患等问题，同时也使胶原蛋白的免疫排异性和亲水性等性能得到极大的改善。大肠杆菌(E.coli)是最常用的外源基因表达系统之一，因生长周期短、培养成本低廉、代谢调控较为成熟，在重组蛋白质生产过程中占主导地位。利用大肠杆菌合成的胶原分子具有显著的柔韧性，可以更广泛的将稀有氨基酸残基合成到重组蛋白中。

甲鱼(Trionyx sinensis Wiegmann)是重要的淡水爬行动物，在亚洲的很多国家和地区都有养殖，如中国、日本、韩国、越南和台湾。自古以来，甲鱼就以其美味和营养而深受中国人民的喜爱。鳖甲周围的结缔软组织通常被称为“裙边”，裙边胶原蛋白含量相当丰富，可作为高品质、优良胶原蛋白的来源。迄今为止，尚无甲鱼胶原蛋白基因及其重组蛋白的报道。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种甲鱼胶原蛋白基因功能片段，该甲鱼胶原蛋白基因功能片段编码的重组蛋白具有强抗氧化性；

本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种甲鱼胶原蛋白基因功能片段编码的强抗氧化性的重组蛋白，该重组蛋白即为重组甲鱼胶原蛋白功能肽段；

本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种上述重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的制备方法；

本发明所要解决的还有一个技术问题在于为上述重组甲鱼胶原蛋白功能肽段提供一种应用。

解决上述技术问题采用的技术方案是：

一种甲鱼胶原蛋白基因功能片段，该甲鱼胶原蛋白基因功能片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

甲鱼胶原蛋白基因功能片段编码的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段，该重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，其含有252个氨基酸，含有27个胶原蛋白特有的Gly-X-Y重复域。

重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的制备方法，步骤如下：

1、甲鱼胶原蛋白基因功能片段的克隆

用Trizol LS(购自于Invitrogen公司)从新鲜的甲鱼组织中提取总RNA，提取步骤根据Invitrogen公司提供的说明书进行；以总RNA为模板，反转录得甲鱼cDNA；设计甲鱼胶原蛋白基因功能片段引物，甲鱼胶原蛋白基因功能片段引物序列为：

F 5’-CATATGATCAACGCAGAGTGGCCATTATG-3’(划线处为NdeI酶切位点)

R 5’-CTCGAGAGCATACTTGTGTTGCACGCGA-3’(划线处为XhoI酶切位点)

以上述甲鱼cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，回收特异性DNA扩增条带，将回收产物连接载体pMD19-T(购自于大连宝生物工程有限公司)，转化E.coli DH5α感受态细胞(购自于大连宝生物工程有限公司)，涂布平板，经蓝白斑筛选，挑选阳性克隆接种于5mL LB液体培养基(1升培养基含有胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，pH7.5)中，37℃，200rpm振荡过夜培养，提取重组质粒。对该重组质粒进行测序，得甲鱼胶原蛋白基因功能片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2、大肠杆菌重组表达载体的构建

将上述重组质粒用限制性内切酶Nde I和Xho I(购自于大连宝生生物工程有限公司)双酶切后，回收甲鱼胶原蛋白功能片段连接表达载体pET-28a，连接后转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基(1升培养基含有胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，pH7.5)，挑选阳性克隆接种于5mLLB培养基中37℃，200rpm培养过夜，提取质粒备用。

3、基因重组甲鱼胶原蛋白功能肽段大肠杆菌Rosetta基因工程菌的构建

将上述提取得到的质粒转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，涂布含有34μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，待其长出阳性克隆即为基因重组甲鱼胶原蛋白功能片段大肠杆菌Rosetta基因工程菌。

4、制备基因重组甲鱼胶原蛋白功能肽段

挑取上述阳性克隆接种于5mL LB培养基中37℃，200rpm培养过夜。取过夜培养的菌液按菌液：LB培养基为1∶100的比例接种于新鲜的LB培养基中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀的值为0.6-0.8，加入终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。继续培养4h后，4℃，5000rpm离心10min收集菌体，菌体用与原始菌液体积相同的PBS(1L溶液中含有NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄0.2g，pH7.4)重悬后4℃，5000rpm离心10min收集沉淀以洗涤菌体，重复上述洗涤步骤一次。将最后得到的菌体按每克湿菌体加入5mL PBS重悬，超声波破碎细胞，破碎条件为：300W，破2s，停8s，120个循环。

将上述破碎后的菌液4℃，12,000g离心20min收集包涵体，包涵体用40mL PBS重悬后4℃，12,000g离心20min以洗涤沉淀，重复上述洗涤步骤两次，最后得到的包涵体用5-10mL的尿素缓冲液(该缓冲液含有20mM Tris-HCl、8M尿素、500mM NaCl，5mM咪唑，pH调至8.0再加入1mMβ-巯基乙醇)溶解，溶解后的包涵体蛋白用His GraviTrap螯合柱(购自于GE公司)层析纯化、洗脱，得到重组蛋白，即本发明的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段。将纯化得到的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段透析复性，冷冻干燥至粉末状即得重组甲鱼胶原蛋白功能肽段。该重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的分子量为38kDa，含有27个胶原蛋白特有的Gly-X-Y重复域，与GenBank中的蛋白序列比对显示本发明的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段与细粒棘球绦虫XI型胶原蛋白α2链具有最高的同源性(47％)。

重组甲鱼胶原蛋白功能肽段抗氧化活性的检测。其检测方法如下：

采用芬顿反应体系。具体操作为：取一空白组试管依次加入0.025mol/L的磷酸缓冲液(100mL溶液中含有Na₂HPO₄·12H₂O0.716g、KH₂PO₄0.068g，pH7.4)1mL，40μg/mL的番红花红1mL，蒸馏水0.5mL，3wt％过氧化氢1mL(新鲜配制)，0.945mmol/LEDTA-Fe²⁺1ml(1.89mmol/L的EDTA与1.89mmol/L的FeSO₄等体积混合，新鲜配制)；另取一对照组试管依次加入0.025mol/L的磷酸缓冲液1mL，40μg/mL的番红花红1mL，蒸馏水1.5mL，3wt％过氧化氢1mL。试验组按顺序依次加入0.025mol/L的磷酸缓冲液1mL，40μg/mL的番红花红1mL，重组甲鱼胶原蛋白功能肽段0.5mL，3wt％过氧化氢1mL，0.945mmol/LEDTA-Fe²⁺1ml。将上述试管混合均匀后置于37℃水浴中反应30min，测A_520nm值，按下式计算重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的羟自由基清除率：

清除率％＝(A_样品-A_空白)/(A_对照-A_空白)×100％

式中，A_样品、A_空白、A_对照分别为重组甲鱼胶原蛋白功能肽段、空白组和对照组的吸光值。

取羟自由基特异性清除剂D-甘露醇代替重组甲鱼胶原蛋白功能肽段做相同试验。

经检测，重组甲鱼胶原蛋白功能肽段具有优异的抗氧化活性。当浓度为1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL和3mg/mL时，重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的羟自由基清除率分别为27.4％、43.2％、63.2％、83.2％和98.9％，高于同等测定条件下的D-甘露醇的羟自由基清除率，高于刺参体壁胶原蛋白[毕琳.刺参(Stichopus japonicus)体壁胶原蛋白的理化性质和生物活性研究[D].青岛：中国海洋大学，2006.]、尼罗罗非鱼鱼皮胶原蛋白[ZengMY，Guo Y，Liu ZY，Dong SY，Zhao YH，Cui WX.Preparation of radical scavengingpiptides from Oreochromis niloticus skin gelatin and its antioxidativeactivity.Journal of Fisheries of China2008；32：117-23.]等胶原蛋白的羟自由基清除率。

与现有发明相比，本发明的优点在于：首次从甲鱼中克隆得到如序列表SEQ IDNO.1所示的胶原蛋白基因功能片段，该克隆基因功能片段的表达得到如序列表SEQ IDNO.2所示的重组蛋白，该重组蛋白即为重组甲鱼胶原蛋白功能肽段，具有良好的抗氧化活性，具有开发为抗氧化剂的价值。该重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的制备过程中，通过总RNA提取、反转录得mRNA、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤，能得到产量和纯度较高的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段，具有成本低、周期短、操作方便的特点。

附图说明

图1为实施例1甲鱼胶原蛋白基因功能片段的PCR产物电泳图。图中泳道1为Fermentas1kb DNA分子量标准，泳道2为PCR获得的甲鱼胶原蛋白基因功能片段的DNA。

图2为实施例1重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的SDS-PAGE分析。图中泳道1为Takara宽蛋白分子量标准，泳道2为转入了空质粒pET-28a的Rosetta的诱导表达产物分析，泳道3为转入了重组质粒的Rosetta的诱导表达产物分析。

图3为实施例2不同浓度的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段和D-甘露醇对羟自由基清除率的对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

本发明从甲鱼中克隆得到甲鱼胶原蛋白基因功能片段，其具有序列表SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，该基因的表达得到如序列表SEQ ID NO.2所示的重组蛋白，该重组蛋白即为重组甲鱼胶原蛋白功能肽段，其含有27个胶原蛋白特有的Gly-X-Y重复域，分子量为38kDa。

上述重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的制备方法，具体步骤如下：

1、甲鱼胶原蛋白功能片段cDNA的克隆

1.1甲鱼总RNA的提取

采用RNA提取试剂盒Trizol LS(购自于英骏公司)按照说明书提取甲鱼总RNA，提取得到的RNA保存于-80℃。

1.2反转录获得甲鱼的cDNA

使用M-MLV反转录酶(Takara公司生产)，按照使用说明书操作，具体步骤如下：

在不含RNA酶的PCR管中，加入12μL上述提取得到的RNA、50μmol Radom Primer pd(N)6：5′d(NNNNNN)3′(50μM)1μL，混匀后瞬时离心，65℃反应5min，迅速冰浴3min。再依次加入：5×first strand buffer 4μL、0.1mol/LDTT 1μL、2.5mmol/LdNTP混合物4μL、40U/μLRNA酶抑制剂0.5μL、200U/μL反转录酶0.5μL，30℃反应10min，42℃反应60min，70℃，10min终止反应，冰上冷却即得甲鱼的cDNA。

1.3引物设计

设计甲鱼胶原蛋白基因功能片段PCR扩增引物，在F引物中引入限制性内切酶NdeI酶切位点，R引物中引入限制性内切酶Xho I酶切位点。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。上述引物序列如下所示：

F 5’-CATATGATCAACGCAGAGTGGCCATTATG-3’(划线处为NdeI酶切位点)

R 5’-CTCGAGAGCATACTTGTGTTGCACGCGA-3’(划线处为XhoI酶切位点)

预计使用上述引物扩增得到的PCR产物长度为756bp。

1.4甲鱼胶原蛋白基因功能片段的克隆

以上述反转录得到的甲鱼cDNA为模板，1.3中所述引物进行PCR扩增。反应体系如下：

反应的条件及程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，40℃复性40s，72℃延伸1min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min即得PCR产物。取5μL上述PCR产物作1wt％琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。由图可见，在756bp处有一条特异性的DNA条带，与预期的大小一致。

1.5重组质粒的构建和鉴定

取5μL上述PCR产物作1wt％琼脂糖凝胶电泳，用DNA纯化试剂盒Biospin GelExtraction Kit(BioFlux Japan)回收目的片段。回收后的目的片段连接载体pMD19-T后，转化DH5α感受态细胞，涂布平板，经蓝白斑筛选，挑选阳性克隆接种子5mL LB培养基中于37℃，200rpm过夜培养。用质粒微量提取试剂盒抽提质粒DNA，得重组克隆载体。上述的连接条件为：16℃连接30min，或室温连接过夜；上述的转化步骤如下所示：

(1)取冻存于-80℃的DH5α感受态细胞于冰上化冻，化冻完毕后轻轻旋转混匀；

(2)取上述重组克隆载体1μL于100μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；

(3)将上述连接产物和DH5α感受态细胞混合物置于42℃水浴中热激90s；

(4)迅速转移至冰浴中，使细胞冷却1-2min；

(5)向其中加入900μL SOC培养基，37℃，200rpm孵育1h；

(6)取100μL上述菌液涂布异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷(X-Gal)、氨苄青霉素(Amp)平板培养基(该平板培养基中含有0.1mM的IPTG、40μg/mL X-Gal和50μg/mL Amp)，于37℃培养箱中倒置培养12-18h。

待其长出阳性克隆后，委托测序公司进行基因测序，测序结果与GenBank中的蛋白序列作同源性比较，最高的同源性为47％(细粒棘球绦虫XI型胶原蛋白α2链)，显示克隆得到了一个新的胶原蛋白基因。

2、大肠杆菌重组表达载体的构建

2.1重组克隆质粒的双酶切

将上述经过检测的重组克隆载体用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，酶切条件为：37℃，水浴2h。酶切体系如下：

酶切产物经1wt％琼脂糖凝胶电泳检测后，用胶回收试剂盒Biospin GelExtraction Kit回收目的片段。

2.2表达载体的双酶切

将表达载体pET-28a用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切。酶切条件为37℃，水浴2h。酶切体系如下：

酶切产物经1wt％琼脂糖凝胶电泳检测后，用胶回收试剂盒Biospin GelExtraction Kit回收载体大片段。

2.3表达载体的构建与检测

将2.1中酶切后回收的目的片段和2.2中回收的载体大片段进行连接构建重组表达载体，连接条件为16℃连接3h，或4℃连接过夜。连接体系如下：

连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化完成后取100-200μL菌液涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，将平板放置37℃培养箱倒置培养14-18h。挑取单菌落于5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中37℃，200rpm培养过夜，提取质粒。

3、基因重组甲鱼胶原蛋白功能肽段大肠杆菌基因工程菌的构建

将上述提取的质粒转化入大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，涂布含有34μg/mL的氯霉素和50μg/mL的卡那霉素的LB平板，将此LB平板置于37℃培养箱中倒置培养12-18h长出单菌落即为大肠杆菌基因工程菌。

4、基因重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的制备

4.1基因重组甲鱼胶原蛋白功能肽段大肠杆菌基因工程菌的诱导表达

以下步骤中用到的LB培养基均含有34μg/mL的氯霉素和50μg/mL的卡那霉素。

(1)挑取上述单菌落至5mL LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养；

(2)吸取上述过夜培养的菌液1mL加入到100mL LB培养基中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀的值为0.6-0.8；

(3)向上述100mL菌液中加入IPTG至终浓度为1mmol/L进行诱导表达；

(4)诱导后继续培养4h，取1mL菌液，12,000g离心1min收集菌体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。

4.2基因重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的SDS-PAGE分析

(1)玻璃板清洗、晾干后安装；

(2)灌注12％分离胶：在一个干净的小烧杯中依次加入蒸馏水1.65mL，30wt％丙烯酰胺2mL，1.5M Tris-HCl(pH8.8)1.25mL，10wt％十二烷基硫酸钠(SDS)50μL，10wt％过硫酸铵(APS)50μL，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)2μL，混匀后立即灌注于玻璃板的间隙中，留出灌注浓缩胶所需的空间(梳子的齿长再加1cm)，小心地在分离胶溶液上覆盖一层蒸馏水；

(3)分离胶聚合完全后(30-60min)，倒出覆盖的蒸馏水，并用滤纸将残留的水分吸干；

(4)灌注5％的浓缩胶：另取一个干净的小烧杯，在其中依次加入蒸馏水1.4mL，30wt％丙烯酰胺0.33mL，1M Tris-HCl(pH6.8)0.25mL，10wt％SDS 20μL，10wt％APS 20μL，TEMED2μL，轻旋混匀后立即灌入已聚合的分离胶上，轻轻插入梳子，避免产生气泡；

(5)样品的处理：取4.1中的菌体加入50μL 1×蛋白上样缓冲液漩涡混匀后煮沸5min，冷却后12,000g离心1min，取上清作为样品；

(6)待浓缩胶完全聚合后(约30min)，把凝胶固定于电泳装置上，槽内外各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，轻轻拔出梳子，按预定顺序加样，每孔的上样量为10μL；

(7)将电泳装置与电源相连，凝胶上所加电压为80V。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到120V，继续电泳直到样品到达分离胶底部，然后关闭电源；

(8)取出凝胶，用考马斯亮蓝染色液进行染色，染色条件为：微波炉加热60s后室温染色30min。染色完毕后用脱色液进行脱色，脱色条件为：微波炉加热60s后室温摇动脱色，更换几次脱色液直至条带清晰；

(9)取出凝胶，用蒸馏水冲洗几次，然后使用凝胶成像仪进行图像分析和拍照，结果如图2所示。由图可知，重组甲鱼胶原蛋白功能肽段在大肠杆菌Rosetta中得到了高效表达。

4.3重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的纯化

取4.1中诱导表达4h后的菌液，4℃，5000rpm离心10min收集菌体，菌体用与原始菌液体积相同的PBS重悬，然后4℃，5000rpm离心10min收集菌体，重复上述重悬和离心步骤一次以除净培养基的成分。重组甲鱼胶原蛋白功能肽段主要是以包涵体的形式表达的。将上述菌体按每克湿菌体加入5mL PBS重悬细胞，超声波破碎，破碎条件为：300W，破2s，停8s，重复120个循环。将上述破碎后的菌液4℃，12,000g离心20min收集沉淀，沉淀用40mLPBS重悬后4℃，12,000g离心20min以洗涤沉淀，重复上述洗涤步骤两次以除净杂蛋白，最后得到的沉淀用5-10mL的尿素缓冲液溶解，4℃，12,000g离心15min收集可溶性组分，将该可溶性组分用镍柱亲和纯化试剂盒进行纯化，纯化过程依据试剂盒说明书进行。纯化后的蛋白采用依次降低尿素浓度的方法进行透析复性，透析缓冲液成分如下：PBS，0.2％L-精氨酸，尿素(7M，6M，5M，4M，3M，2M，1M和OM)。透析缓冲液依次降低尿素的浓度，每次于4℃透析40min。最后在PBS中透析两次，每次40min。透析完全后即为可溶性的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段。将可溶性的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段冷冻干燥至粉末状，储存于-80℃冰箱备用。

实施例2

测定实施例1所述的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的抗氧化能力，具体步骤如下：

参考胡文婷等报道的方法(胡文婷，孙谧，王跃军.栉孔扇贝(Chlamys farreri)中抗氧化肽的分离纯化及性质研究[J].海洋与湖沼，2006，37(1)：14-19.)。采用芬顿反应体系。原理为：亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基，该反应产生的羟自由基可使番红花红褪色。而抗氧化剂可清除羟自由基，抑制番红花红褪色。具体操作为：取4支试管，编号为1、2、3、4。其中1号试管按顺序依次加入0.025mol/L的磷酸缓冲液1mL，40μg/mL的番红花红1mL，1mg/mL的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段0.5mL，3wt％过氧化氢1mL，0.945mmol/LEDTA-Fe²⁺1ml；2号试管按顺序依次加入0.025mol/L的磷酸缓冲液1mL，40μg/mL的番红花红1mL，1.5mg/mL的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段0.5mL，3wt％过氧化氢1mL，0.945mmol/LEDTA-Fe²⁺1ml；3号试管按顺序依次加入0.025mol/L的磷酸缓冲液1mL，40μg/mL的番红花红1mL，2.5mg/mL的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段0.5mL，3wt％过氧化氢1mL，0.945mmol/LEDTA-Fe²⁺1ml；4号试管按顺序依次加入0.025mol/L的磷酸缓冲液1mL，40μg/mL的番红花红1mL，3mg/mL的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段0.5mL，3wt％过氧化氢1mL，0.945mmol/L EDTA-Fe²⁺1ml。另取一空白组试管按顺序依次加入0.025mol/L的磷酸缓冲液1mL，40μg/mL的番红花红1mL，蒸馏水0.5mL，3wt％过氧化氢1mL，0.945mmol/L EDTA-Fe²⁺1ml；取一对照组试管按顺序依次加入0.025mol/L的磷酸缓冲液1mL，40μg/mL的番红花红1mL，蒸馏水1.5mL，3wt％过氧化氢1mL。每组做三个平行。将上述试管混合均匀后置于37℃水浴中反应30min，测A_520nm值，按下式计算羟自由基清除率：

清除率％＝(A_样品-A_空白)/(A_对照-A_空白)×100％

式中，A_样品、A_空白、A_对照分别为重组甲鱼胶原蛋白功能肽段、空白组和对照组的吸光值。

取羟自由基特异性清除剂D-甘露醇代替重组甲鱼胶原蛋白功能肽段做相同试验。检测结果如图3所示。由图可知，重组甲鱼胶原蛋白功能肽段和D-甘露醇对羟自由基的清除率均与其浓度相关，当重组甲鱼胶原蛋白功能肽段和D-甘露醇的浓度为1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL和3mg/mL时，重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的羟自由基清除率分别为27.4％、43.2％、63.2％、83.2％和98.9％；D-甘露醇的羟自由基清除率分别为1.08％、4.3％、5.38％、11.83％和13.98％。由以上数据可知，重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的羟自由基清除率大大高于D-甘露醇的羟自由基清除率。

Claims (4)

1.甲鱼胶原蛋白基因功能片段，其特征在于：该甲鱼胶原蛋白基因功能片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的甲鱼胶原蛋白基因功能片段编码的功能蛋白，其特征在于：该蛋白即为重组甲鱼胶原蛋白功能肽段，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

3.一种权利要求2所述的甲鱼胶原蛋白基因功能片段编码的功能蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)总RNA的提取：用Trizol LS从新鲜的甲鱼裙边组织中提取总RNA，提取得到的总RNA保存于-80℃；

2)反转录获得甲鱼的cDNA：使用M-MLV反转录酶，按照使用说明书操作得到甲鱼cDNA；

3)甲鱼胶原蛋白基因功能片段的克隆：以上述反转录得到的甲鱼cDNA为模板，设计引物F 5’-CATATGATCAACGCAGAGTGGCCATTATG-3’和R5’-CTCGAGAGCATACTTGTGTTGCACGCGA-3’，其中划线处分别为NdeI酶切位点和XhoI酶切位点，用该对引物进行PCR扩增，PCR产物用胶回收试剂盒进行回收和纯化，将纯化的PCR产物与载体pMD19-T连接，连接后转化E.coliDH5α感受态细胞，阳性转化子经PCR筛选后测序得到含有甲鱼胶原蛋白功能片段的阳性克隆质粒；

扩增反应体系及条件：含Mg²⁺的10×buffer 2.5μL，50ng/μL的cDNA 1.0μL，2.5mmol/L的dNTPs 2.0μL，10μmol/μL的F引物0.5μL，10μmol/μL的R引物0.5μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.2μL，PCR专用水18.3μL；条件：94℃预变性4min，94℃变性45s，40℃复性40s，72℃延伸1min，共进行35个循环，最后72℃延伸10min；

4)重组表达质粒的构建：将上述阳性克隆质粒用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切后进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，得甲鱼胶原蛋白基因功能片段，该甲鱼胶原蛋白基因功能片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，将该基因功能片段连接经限制性内切酶NdeI和XhoI同样双酶切的表达载体pET-28a，得重组表达质粒；

5)重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的表达：将上述重组表达质粒转化入表达宿主E.coliRosetta，涂布平板，挑取阳性克隆接种于5mL LB培养基中37℃，200rpm过夜培养；将上述过夜培养的菌液按1∶100的比例接种到新鲜的LB培养基中培养至OD₆₀₀的值为0.6-0.8，加入IPTG诱导表达，使其终浓度达到1mmol/L，继续37℃，200rpm培养4h后，4℃，5000rpm，离心10min，收集菌体；

6)重组甲鱼胶原蛋白功能肽段的纯化复性：取上述离心收集的菌体用与原始菌液体积相同的PBS重悬，4℃，5000rpm离心10min收集菌体，重复上述重悬和离心步骤一次，按每克湿菌体加入5mL PBS重悬细胞，超声波破碎，破碎条件为：300W，破2s，停8s，重复120个循环，将上述破碎后的菌液4℃，12,000g离心20min收集沉淀，沉淀用40mL PBS重悬后4℃，12,000g离心20min，重复上述重悬离心步骤两次，最后得到的沉淀用5-10mL尿素缓冲液溶解，4℃，12,000g离心15min收集可溶性组分，将该可溶性组分用镍柱亲和纯化试剂盒进行纯化，纯化过程依据试剂盒说明书进行；纯化后的蛋白采用依次降低尿素浓度的方法进行透析复性，透析缓冲液成分如下：PBS，0.2％L-精氨酸和7M、6M、5M、4M、3M、2M、1M、0M的尿素；透析缓冲液依次降低尿素的浓度，每次于4℃透析40min，最后在PBS中透析两次，每次40min，透析完全后即为可溶性的重组甲鱼胶原蛋白功能肽段。

4.一种权利要求2所述的甲鱼胶原蛋白基因功能片段编码的功能蛋白其用于制备抗氧化剂的应用。