CN101144090A - 盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶及其基因和重组质粒，所述盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因来源于盐生杜氏藻，将所制备的盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因克隆至表达载体，即形成重组质粒，将重组质粒进行表达即形成盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶。试验表明，转入盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因的大肠杆菌SOD缺失突变株提高了抗逆能力，盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶具有清除超氧阴离子自由基的功能。

Description

盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于超氧化物歧化酶领域，特别涉及一种来源于盐生杜氏藻的锰超氧化物歧化酶及其基因，以及所述酶、基因、重组质粒的制备方法与应用。

背景技术

生物体中氧的毒性主要来自于其被部分还原所产生的氧自由基，又称为活性氧(reactive oxygen species)。当生物体处于病理状态下或逆境条件时，导致大量自由基的积累是引发氧化损伤、造成疾病的重要原因，这一观点早在1968年锰超氧歧化被发现时就得到了证实。

数年前，医学界提出SOD(超氧化物歧化酶的缩写)人类健康新学说时，引起普遍关注。研究表明，超氧化物歧化酶(SOD)能够清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基(O^2-)，是保护健康细胞不受氧自由基侵害的安全网，被称为生物体抗氧化系统的第一道防线，与生物的抗逆性和对逆境产生的活性氧的消除密切相关。

从超氧化物歧化酶问世至现在，虽然已有多种不同来源的超氧化物歧化酶问世，但对人类的健康和动、植物的保护而言，开发出更多的来源不同的超氧化物歧化酶有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于盐生杜氏藻(Dunaliella salina)的锰超氧化物歧化酶基因、重组质粒、锰超氧化物歧化酶，本发明的又一目的是提供所述锰超氧化物歧化酶基因、重组质粒、锰超氧化物歧化酶的制备方法，本发明的再一目的是证明锰超氧化物歧化酶的用途。

本发明的技术方案：

以盐生杜氏藻(Dunaliella salina)为原料制备锰超氧化物歧化酶基因，所述锰超氧化物歧化酶基因具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。盐生杜氏藻属绿藻门、绿藻纲、团藻目、多毛藻科、杜氏藻属，主要生长在高盐的水体中。细胞形态通常为卵圆形，当外界渗透压发生变化时，其形态可变为球形或纺锤形。它具有两条等长的鞭毛和一个杯状的叶绿体，在叶绿体的外缘可积累大量的β—胡萝卜素，使细胞呈橙红色。细胞无细胞壁，具有由糖蛋白形成的包被。锰超氧化物歧化酶基因的制备方法依次包括以下步骤：

(1)盐生杜氏藻总RNA的提取与mRNA的分离；

(2)盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因的全长克隆、测序，根据已知物种锰超氧化物歧化酶基因氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源基因克隆的原理，采用RACE方法进行cDNA全长克隆。

本发明所述盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶的重组质粒，含有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，其制备方法是将所制备的盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因克隆至中间载体pMD18-T，测序正确后，再克隆至表达载体pET32a，即形成重组质粒。

本发明所述盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶(其缩写为DsMnSOD)是将上述重组质粒进行表达而成，其制备包括以下步骤：

(1)将所构建的重组质粒转入大肠杆菌中进行原核表达；

(2)通过金属螯合层析纯化获得重组的盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶。

本发明所述盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶具有序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。

将上述制备方法制备的重组质粒转入大肠杆菌SOD缺失突变株K-12(sod^-)中，用于功能鉴定。鉴定结果显示，转入盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因提高了突变株的抗逆能力。抗逆能力的提高，意味着超氧阴离子自由基的减少，因此盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶具有清除超氧阴离子自由基的功能。

本发明为清除生物体中的超氧阴离子自由基提供了一种有效的新清除剂，具有明显的社会效益和经济效益。

附图说明

图1是含有盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因的重组质粒的一种结构示意图，表达载体为pET32a。

具体实施方式

实施例1盐生杜氏藻超氧化物歧化酶基因的制备

1、盐生杜氏藻的采集

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)购自中国科学院武汉水生生物所藻种库。

2、Poly A⁺RNA的分离(Poly A⁺RNA isolation)

用Trizol试剂(购自Gibco，NY，USA)提取盐生杜氏藻总RNA。采用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。使用Olidotex mRNA Kits(购自Qiagen)提供的试剂盒操作说明书提取盐生杜氏藻的mRNA。

3、盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因的全长克隆(Cloning ofFull-length cDNA)

根据已知物种(如衣藻，酵母，大肠杆菌等)锰超氧化物歧化酶基因氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源基因克隆的原理，采用RACE方法进行cDNA全长克隆，分为三个阶段进行：

(1)使用简并引物，以Poly A⁺RNA为模板，进行RT-PCR扩增

以寡核苷酸：5’CGITTIGGIAGIGGITGGGCITGG3’为正向引物；寡核苷酸：5’ITAIGCITGITCCCAIACITC 3’为反向引物，以Poly A⁺RNA为模板，进行RT-PCR扩增，扩增条件为94℃5min，随后94℃1min、55℃1min、72℃2min进行35个循环，最后以72℃延伸10min。电泳检测PCR扩增产物，获得目的片段，回收片段连接到pMD18-T载体(购自TaKaRa)上，以M13作为通用引物，在ABI377测序仪(购自Perkin-Elmer)上测序，测得一个约153bp序列。

将该序列及其编码蛋白质序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+Swissprot+Superdate+PIR数据库进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与多种生物线粒体上的锰超氧化物歧化酶基因有较高的同源性，证实了简并引物的正确。

(2)盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因的3’和5'RACE扩增

根据以上序列分析设计：

5’RACE引物：5′GTCCTGGTTGGCGGTGCTGGTGATG 3′

3’RACE引物：5′CACCGCCAACCAGGACAACC 3′

使用BD SMART RACE cDNA Amplification Kit(购自Clontech)，按照操作手册进行，得到DsMnSOD基因的5′端序列；使用3′Full RACE Core Set(购自TaKaRa)，按照操作手册进行，得到DsMnSOD基因的3′端序列。

(3)进一步验证盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因序列的正确性〔过程同(1)〕

在拼接得到全长(包括完整的开放读框〕的基础上，进一步在非翻译区设计引物：以寡核苷酸：5’GAACTCACAACACCCACCAAACG 3’为正向引物；寡核苷酸：5’ATCCAGAGCAAAACCAAAAGCAA3’为反向引物，以Poly A⁺RNA为模板，进行RT-PCR扩增，然后通过PCR扩增，并将扩增产物进行克隆、测序。结果验证了盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因的全长编码序列的正确性。所获得的盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因具有序列表中SEQID NO.1所述的核苷酸序列。

实施例2盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶重组质粒的构建

以pMD18-T为中间载体(购自TaKaRa)，以pET32a(购自Novagen)为表达载体，根据实施例1所制备的盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因的全长编码序列，设计扩增出完整编码读框的引物(正向引物：5′GAATTCATGGCGTTCGTGCTGCCCAAC 3′和反向引物：5′CTCGAGTCACAGCGCTGGCATGCCGCCA 3′)，并在正反引物上分别引入限制性酶切位点EcoRI和XhoI，以便构建。经PCR扩增后，将盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶cDNA克隆至中间载体pMD18-T，测序正确后再用EcoRI和XhoI消化pMD18-T，回收MnSOD基因。进一步将回收的MnSOD基因克隆到大肠杆菌表达载体pET32a的EcoRI和XhoI位点，即形成重组质粒。经PCR验证和酶切验证后确定表达载体盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶重组质粒(pET32a-DsMnSOD)的成功构建。

实施例3酶的种类鉴定

将实施例2构建的pET32a-DsMnSOD转入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导融合蛋白表达。SDS-PAGE显示，融合蛋白表观分子质量约22kD。PAGE结果显示，该酶活性不受到5mmol/L H₂O₂和5mmol/L KCN的抑制，确定为锰超氧化物歧化酶。

实施例4盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶的功能鉴定

将实施例2构建的重组质粒pET32a-DsMnSOD转入大肠杆菌SOD缺失突变株K-12(sod^-)(其构建见Construction of an Escherichia coli K-12 strain deleted for manganese andiron superoxide dismutase genes and its use in cloning the iron superoxide dismutase gene ofLegionella pneumophila，Mol Gen Genet，1992，P232：427～430)中，用SOD酶活试剂盒(购自南京建成)检测菌液粗酶活性。结果显示，对照组(K12(sod^-))没有SOD活性，转入pET32a-DsMnSOD重组质粒的菌株具有SOD活性。对菌株的耐盐、抗辐射、抗寒性能等进行鉴定，鉴定结果表明：转入盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因提高了突变株的抗逆能力，见下表：

实施例5盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶(DsMnSOD)在修复紫外损伤中的应用

1、盐生杜氏藻DsMnSOD脂质体制备

将卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、油酸、胆固醇、半琥珀酸酯以1∶2.5∶1.5∶1∶5的摩尔比或将磷脂(PC)100mg、胆固醇(CHOL)25mg、胆固醇琥珀酰酯(CHS)按磷脂的6％(质量比)溶于15ml氯仿或乙醚，除去氯仿或乙醚，形成均匀一致的干膜。加入DsMnSOD蛋白溶液(1mg/ml)1ml和9ml乙磺酸(MES)缓冲液(10mmol/L，pH5.0)，快速混合器旋涡振荡，超声10min。微孔滤膜过滤，4℃保存。被包封DsMnSOD酶的浓度用DsMnSOD免疫兔所得到的多克隆抗体进行ELISA检测。

2、盐生杜氏藻DsMnSOD脂质体修复紫外损伤验证

将待修复人XPA细胞重悬于RPMI medium1640(含4％小牛血清)，与盐生杜氏藻DsMnSOD脂质体(10-30mg/ml)置于37℃黑暗中共孵育60min，用0.9％生理盐水洗涤一次，重悬于PBS中。在培养皿(Petri dish)中以单层细胞进行光修复(5.0kJ/m²UVA)。以血球计数板计数计算细胞存活率。

实施例6重组盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶的分离、纯化和活性测定

1、粗酶液的制备

(1)摇菌

将构建好的重组质粒pET32a-DsMnSOD转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取能够在含10μmol/L paraquat的LB平板上生长的单菌落，接种于5ml LB中，37℃摇培过夜。按1/100(v∶v)接种到新的1L LB培养液中，28℃摇培至OD600约0.6时加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，继续28℃摇培4h，诱导蛋白表达。

(2)制备粗酶液

取诱导后的重组E.coli培养液1L，5000g离心10min，收集菌体，称菌沉淀重。将其重悬于一定体积的50mmol/L PBS(含0.5mol/L NaCl，pH7.4)中，使其终质量浓度为0.1g/L。加入终浓度为1mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)和终体积分数为0.1％的TritonX-100，在冷冻条件下，400-600W功率，3-5s超声波破碎10min，直到菌液澄清。4℃条件下，15000g离心10min。收集上清，即为粗酶液。

2、酶的纯化

金属螯合层析纯化

将收集到的粗酶液过Ni-NTA Sepharose柱(购自IBA)，操作按说明进行。

(1)SDS-PAGE检测纯化效果

纯化到的酶经过SDS-PAGE，无杂带出现，则说明纯化效果好。

(2)酶浓度测定

按Braford法测定蛋白质浓度。

(3)酶活测定

将纯化到的酶立即用SOD酶活试剂盒(购自南京建成)测定酶活，操作按照说明书进行。

3、酶的活性鉴定

(1)PAGE

纯化到的酶立即进行PAGE。

(2)活性染色

将活性电泳结束后的凝胶在20ml2.45mmol/L的NBT溶液中避光温育20min，然后在含28mmol/L TEMED和28mmol/L核黄素的36mmol/L磷酸缓冲液(pH7.8，内含0.1mmol/L EDTA)中避光浸泡15min，最后在28℃光反应室中(光强为4000 1x)处理25～30min。SOD的活性谱带出现在蓝色背景上无色透明区带。

(3)酶稳定性实验：

①温度：将纯酶在不同温度的水浴中保温15min，每隔30min取出，冷却至25℃，用SOD酶活试剂盒测定酶活力，并计算相对活力，以25℃酶活为基准。

②pH值：吸取0.1ml纯酶，加入3.9ml不同pH缓冲液(柠檬酸-硼酸-巴比妥-K₂HPO₄-NaOH，pH3.0-11.0)，25℃水浴维持3h，用SOD酶活试剂盒测定SOD活力并计算相对活力，以蒸馏水酶活力为基准。

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学

<120>盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶及其制备方法与应用

<140>

<141>

<160>2

<170>PatentIn vcrsion3.2

<210>1

<211>551

<212>DNA

<213>杜氏藻属(Dunaliella salina)

<400>1

cttacgtgaa caacgtcaat gcagccctgg aaaagttccc tgagatgaag tccctgggca 60

ttgtagacct caacaaggct gtgggaactg atgctattcc aaaggaaatt gctactacag 120

tgcgaaacaa tggtggcggc catttcaacc acagcttctt ctggaaggtc atgacaaagc 180

cctccaatag caacggcccc tctgcagagc tgaaggctgc catcgacaag gccttcggca 240

gcatggaggc catgaaggag aagttcaatg ctgctgccgc cggccgcttt ggcagcggtt 300

gggcatggct gggcgtgaag gctgatggct ccctgggcat caccagcacc gccaaccagg 360

acaaccctct gcagcaggtg gctgatgaga agatgatccc catcctaggc ctggatgttt 420

gggagcacgc ctactacctc aagtaccaga accgccgtcc agagtacatt gctgcattct 480

ggaacattgt gaactgggag caagtgaacg acaacttcaa ggccgctagc ggtggcggca 540

tgccagcgct g                                                      551

<210>2

<211>217

<212>PRT

<213>杜氏藻属(Dunaliella salina)

<400>2

Met Ala Phe Val Leu Pro Asn Leu Pro Tyr Ala Pro Asp Ala Leu

1               5                   10                  15

Glu Pro Tyr Val Asp Thr Thr Thr Met Thr Lle His His Gly Lys

                20                   25                 30

His His Ala Thr Tyr Val Asn Asn Val Asn Ala Ala Leu Glu Lys

                35                  40                  45

Phe Pro Glu Met Lys Ser Leu Gly Lle Val Asp Leu Asn Lys Ala

                50                  55                  60

Val Gly Thr Asp Ala Lle Pro Lys Glu Lle Ala Thr Thr Val Arg

                65                  70                  75

Asn Asn GLy Gly Gly His Phe Asn His Ser Phe Phe Trp Lys Val

                80                  85                  90

Met Thr Lys Pro Ser Asn Ser Asn Gly Pro Ser Ala Glu Leu Lys

                95                  100                 105

Ala Ala Lle Asp Lys Ala Phe Gly Ser Met Glu Ala Met Lys Glu

                110                 115                 120

Lys Phe Asn Ala Ala Ala Ala Gly Arg Phe Gly Ser Gly Trp Ala

                125                 130                 135

Trp Leu Gly Val Lys Ala Asp Gly Ser Leu Gly Lle Thr Ser Thr

                140                 145                 150

Ala Asn Gln Asp Asn Pro Leu Gln Gln Val Ala Asp Glu Lys Met

                155                 160                 165

Lle Pro Lle Leu Gly Leu Asp Val Trp GLu His Ala Tyr Tyr Leu

                170                 175                 180

Lys Tyr Gln Asn Arg Arg Pro Glu Tyr Lle Ala Ala Phe Trp Asn

                185                 190                  195

Lle Val Asn Trp Glu Gln Val Asn Asp Asn Phe Lys Ala Ala Ser

                200                 205                  210

Gly Gly Gly Met Pro Ala Leu

                215

Claims (7)

1.一种盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。

2.一种盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因的重组质粒，其特征在于含有权利要求1所述的核苷酸序列。

3.一种盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶，其特征在于它由权利要求2所述的重组质粒表达而成，具有序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。

4.一种权利要求1所述的盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因的制备方法，其特征在于以盐生杜氏藻为原料，依次包括以下步骤：

(1)盐生杜氏藻总RNA的提取与mRNA的分离；

(2)盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因的全长克隆、测序，根据已知物种锰超氧化物歧化酶基因氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源基因克隆的原理，采用RACE方法进行cDNA全长克隆。

5.一种权利要求2所述盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因的重组质粒的的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤：

(1)按照权利要求4所述方法制备盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因；

(2)将步骤(1)所制备的盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶基因克隆至中间载体，测序正确后，再克隆至表达载体，即形成重组质粒。

6.一种权利要求3所述重组盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶的制备方法，依次包括以下步骤：

(1)将权利要求2中的重组质粒转入大肠杆菌中进行原核表达；

(2)通过金属螯合层析纯化获得重组的盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶。

7.权利要求3所述盐生杜氏藻锰超氧化物歧化酶作为生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基的清除剂的应用。

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