CN102702339A - 斜带石斑鱼补体c3基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了斜带石斑鱼补体C3基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用。石斑鱼rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，或者是SEQIDNO:4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。本发明首次获得了石斑鱼的补体C3基因序列以及C3序列上的功能片段rC3B核苷酸序列，不仅丰富了石斑鱼的基因库，而且可应用于制备重组蛋白、鱼类免疫制剂或饲料添加剂，为石斑鱼的生理免疫研究提供了新的理论与实践基础。

Description

斜带石斑鱼补体C3基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种rC3B 蛋白及编码该蛋白的基因、含有该基因的载体及其应用；还涉及一种补体C3蛋白及编码该蛋白的基因、含有该基因的载体及其应用。

背景技术

补体第三组分(C3)是补体系统的核心 ，它是 1912年 Ritg用蛇毒处理血清时发现的。在补体各成分中， 补体C3 的血清含量最高。补体C3蛋白具有特殊的结构，是一种β2糖蛋白，由α、β两条肽链组成，两肽链间以二硫键相连，分子量为195KDa，其中α链为115KDa，由998个氨基酸残基组成，N末端和C末端均为丝氨酸；β链为75KDa，由669个氨基酸组成，N末端为丝氨酸，C末端为丙氨酸。两链间氢键、疏水键及二硫键相互连接，其中二硫键散在于α链的92-93位氨基酸及β链的11-656位氨基酸之间。C3的激活与灭活酶的作用部位主要在α链，β链则与稳定必要的分子构象有关。在α链的半胱氨酸和谷氨酸残基之间有一个分子内硫酯键，此键不稳定，尤其是对蛋白质和碳水化合物中的亲核基团敏感，如羟基（－OH）和氨基（－NH₂）。C3当被C3转化酶裂解为C3a和C3b时，C3b分子内硫酯键变得更加不稳定，可被附近的羟基或氨基激活，断裂为酰基和巯基。酰基具有较强的亲电性，可与相应膜表面的亲核基团形成酯键或酰氨键，由此C3b结合于相应的膜表面，此结合部位为C3b的不稳定结合部位，借此部位，C3b除可结合于细胞膜表面外，还可结合于相应的免疫复合物、脂多糖、酵母多糖及多糖等。在功能上 ，C3 亦居于中心地位 ，它既是3条激活途径的交汇 ，又是C3b依赖性阳性反馈环路的基础;同时 C3 裂解片段及其结合蛋白复杂而多样 。C3分子上存在着众多与其他分子的结合位点，C3通过其上的系列受体位点与补 体其它成分、病原体、血细胞等发生广泛的作用，从而在机体的免疫防御和免疫病理中发挥重要作用。rC3B是C3上与单核细胞、巨噬细胞表面补体受体的结合位点，也就是补体 Ⅲ型受体( CR3，CD1lb／CD18 )结合位 。C3裂解片段通过该结合位点与大量存在于单核细胞、中性粒细胞等上的 C R 3结合，从而促进机体对血液中病原体的吞噬和清除，提高鱼类抗病性，增强鱼类自身的免疫力。

石斑鱼类隶属鲈形目(Perciformes)，鮨科(Serranidae)，石斑鱼亚科(Epinephelinae)，石斑鱼属(Epinephelus)，为暖水性礁栖鱼类，广泛分布于印度洋和太平洋的热带、亚热带海域。石斑鱼是驰名世界的名贵海产鱼类之一，其肉质鲜美，营养丰富，为餐桌中的上等佳肴，被港澳地区推为我国的四大名鱼之一，深受各地消费者的喜爱，经济价值巨大。但是，当前气候灾害和环境污染导致的高致病率和高死亡率，一直是石斑鱼人工养殖过程中难以解决的问题。市场上还没有一种能够有效增强石斑鱼免疫力的饲料添加剂。

酵母是最简单的真核生物，以其作为宿主表达外源蛋白有很大的优势：生长繁殖快，易培养，操作简单；能对表达的外源蛋白进行翻译后加工修饰，如糖基化、乙酰化等；安全性高，无致病性。巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，能将甲醇作为代谢的唯一碳源和能源。毕赤酵母表达系统有很多优点在科研及生产中广泛应用：使用强的可诱导启动子-AOX1基因启动子；外源基因以单拷贝或多拷贝定点整合入基因组中，遗传稳定性好；重组蛋白以高水平分泌到几乎无蛋白的培养基中，利用表达蛋白的纯化；容易进行高密度发酵，适合于产业化生产。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种石斑鱼rC3B蛋白。

本发明的另一目的在于提供编码上述石斑鱼rC3B蛋白的基因。

本发明的另一目的在于提供一种石斑鱼rC3B蛋白的前体蛋白，即石斑鱼补体C3蛋白。

本发明的另一目的在于提供编码上述石斑鱼补体C3蛋白的基因。

本发明的另一目的在于提供含有石斑鱼补体C3蛋白基因及功能片段rC3B的克隆载体。

本发明的另一目的在于提供含有石斑鱼补体C3蛋白基因及功能片段rC3B的表达载体。

本发明的另一目的在于提供一种石斑鱼补体C3功能片段rC3B重组蛋白及其制备方法。

本发明的另一目的在于提供石斑鱼rC3B蛋白和/或C3蛋白在制备提高鱼类免疫力制剂中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

石斑鱼rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或者是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。

编码上述石斑鱼rC3B蛋白的基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

石斑鱼补体C3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。

编码上述石斑鱼补体C3蛋白的基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

生产石斑鱼rC3B蛋白或石斑鱼补体C3蛋白的方法，包括将上述表达载体导入宿主细胞中，表达得到rC3B蛋白或C3蛋白。

本发明的有益效果如下：

1．本发明首次获得了石斑鱼的补体C3基因序列以及C3序列上的功能片段rC3B核苷酸序列，不仅丰富了石斑鱼的基因库，而且可应用于制备重组蛋白、鱼类免疫制剂或饲料添加剂，为石斑鱼的生理免疫研究提供了新的理论与实践基础；

2. 将石斑鱼rC3B核苷酸序列在毕赤酵母重组株表达，可以大量生产石斑鱼rC3B重组蛋白，大大降低了生产成本，具有很高的经济价值；

3. 本发明所提供的石斑鱼rC3B重组蛋白，经实验证明具有提高石斑鱼免疫力等功能，可以应用于制备鱼类尤其是石斑鱼免疫制剂或饲料添加剂，具有广阔的应用前景。

附图说明   

图1是斜带石斑鱼补体C3基因5’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析图；

图2是斜带石斑鱼补体C3基因3’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析图；

图3是C3基因ORF的PCR扩增产物的电泳鉴定图。

图4是斜带石斑鱼补体C3功能片段rC3B的PCR扩增产物的凝胶电泳分析图；

图 5是克隆载体pMD18-T-rC3B双酶切（EcoRI 、XbaI）验证图；

图6是表达载体pPICZaA-rC3B双酶切（EcoRI、XbaI）验证图；

图7是重组株pPICZaA-rC3B-X-33表达产物rC3B重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析图；

图8是重组株pPICZaA-rC3B-X-33表达产物rC3B重组蛋白的western-blot 鉴定图；

图9是pPICZaA-rC3B毕赤酵母表达载体构建示意图；

图10是石斑鱼rC3B的氨基酸序列和人类rC3B氨基酸序列的对比图；

图11是rC3B抗原表位预测分析；

图12是重组株pPICZaA-rC3B-X-33高密度发酵产物rC3B重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析图（M：蛋白分子量标准；1：pPICZaA- rC3B -X-33发酵产物； NC：阴性对照pPICZαA-33发酵产物）；

图13是在低温应激中的，A，B，C三组鱼血细胞数目随应激时间的变化情况（*表示与对照组相比有显著性差异，P＜0.0＝5）；

图14是在低温应激中A、B、C三组鱼血细胞呼吸爆发水平随应激时间的变化情况（*表示与对照组相比有显著性差异，P＜0.05）；

图15是在低温应激中A、B、C三组鱼血细胞凋亡情况随应激时间的变化情况（*表示与对照组相比有显著性差异，P＜0.05）。

具体实施方式

通过抑制性消减杂交技术获得斜带石斑鱼补体C3基因中间片段

通过抑制性消减杂交技术（SSH）构建了石斑鱼低温文库，测序得到一些功能基因, 其中包含与石斑鱼补体C3高度同源的片段。该补体C3基因中间片段长度为396bp（SEQ ID NO.5）。

斜带石斑鱼补体C3基因5’端片段的合成

操作按照BD SMART RACE cDNA Ampli?cation Kit (BD Bioscience Clontech， CA， USA) Protocol来进行。根据试剂盒的要求，依据已测序的补体C3中间片段的序列设计了两条下游引物C351和C352以进行嵌套PCR。第一条下游引物C351为【5’- CTTTCGGCCTTGGCGGGTTTG】（SEQ ID NO.6），第二条下游引物C352为【5’- ACGGAAACAACACGTCCTCTACG】（SEQ ID NO.7）。

第一次PCR以M-MLV reverse transcriptase kit (Promega， Madison， WI， USA)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA为模板，经降落PCR方法扩增原补体C3中间片段的序列第298位至5’端的核苷酸序列，反应条件为：94℃预变性5分钟；（1）94℃变性30秒，72℃退火30秒，共5循环，72℃延伸2分钟；（2）94℃变性30秒，70℃退火30秒，共5循环，72℃延伸2分钟；最后94℃变性30秒68℃退火30秒，共30循环，72℃延伸2分钟。第二次PCR以第一次PCR产物为模板，经PCR方法扩增原补体C3中间片段的序列第150位至5’端的核苷酸序列，反应条件为：94℃预变性5分钟；（1）94℃变性30秒，72℃退火30秒，共5循环，72℃延伸2分钟；（2）94℃变性30秒，70℃退火30秒，共5循环，72℃延伸2分钟；最后94℃变性30秒68℃退火30秒，共30循环，72℃延伸2分钟。第一次PCR在琼脂糖凝胶上未能检测出条带，第二次PCR扩增产物的电泳鉴定图见图1，其中：M为分子量标准；NC为阴性对照；1为 PCR扩增产物。

将1804bp的扩增产物连接到pMD18-T载体上得到重组质粒pMD18-T-C3-5’-1804。将重组质粒pMD18-T-C3-5’-1804用pMD18-T的一对通用引物进行序列测定，其序列如SEQ ID NO.14所示。测序结果与Genebank的序列进行比较，结果表明克隆的1804bp产物是斜带石斑鱼补体C3基因5’端基因。

斜带石斑鱼补体C3基因3’端片段的合成

操作按BD SMART RACE cDNA Ampli?cation Kit (BD Bioscience Clontech， CA， USA) Protocol来进行。根据试剂盒的要求，依据已测序的补体C3中间片段的序列设计了两条上游引物C331和C332以进行嵌套PCR。第一条上游引物C331为【5’-GTGGAAATCAGCGTACGGCAGA】（SEQ ID NO.8），第二条上游引物C332为【5’-ACCCGCTCAAGCGTCCGAAAG】（SEQ ID NO.9）。

第一次PCR以M-MLV reverse transcriptase kit (Promega， Madison， WI， USA)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA为模板，引物为C331，经PCR方法扩增补体C3中间片段的序列第120位至3’poly A端的核苷酸序列，反应条件为：94℃预变性5分钟；（1）94℃变性30秒，72℃退火30秒，共5循环，72℃延伸2分钟；（2）94℃变性30秒，70℃退火30秒，共5循环，72℃延伸2分钟；最后94℃变性30秒68℃退火30秒，共30循环，72℃延伸2分钟。第二次PCR以第一次PCR产物为模板，经PCR方法扩增，反应条件为：94℃预变性5分钟；（1）94℃变性30秒，72℃退火30秒，共5循环，72℃延伸2分钟；（2）94℃变性30秒，70℃退火30秒，共5循环，72℃延伸2分钟；最后94℃变性30秒68℃退火30秒，共30循环，72℃延伸2分钟。第一次PCR在琼脂糖凝胶上未能检测出条带，第二次PCR扩增产物的电泳鉴定图见图2，其中：M为分子量标准；NC为阴性对照；1为PCR扩增产物。

将3332bp的扩增产物连接到pMD18-T载体上得到重组质粒pMD18-T-C3-3’-3210。将重组质粒pMD18-T-C3-3’-3332用pMD18-T的一对通用引物进行序列测定，其序列如SEQ ID NO.15所示。测序结果与Genebank的序列进行比较，结果表明克隆的3332bp产物是斜带石斑鱼补体C3 的3’端基因。

斜带石斑鱼补体C3基因全长序列的拼接

将已经测序的补体C3中间片段、5’RACE片段和3’RACE片段进行拼接，得到斜带石斑鱼补体C3基因的ORF全长，即补石斑鱼补体C3 cDNA全序列（SEQ ID NO.1）的第1—4974bp，总长为4974bp，并推测出其氨基酸序列（SEQ ID NO.2）。

根据拼接得到的C3基因ORF全长设计引物C3qF【5’-CTTCAGGGTTTAGGACGATGTG】（SEQ ID NO.10），C3qA【5’-CCAGTGGGTCTTCTGGTGAGTG】（SEQ ID NO.11）。扩增的长度为5120bp。以M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA为模板，经PCR方法扩增石斑鱼的补体C3功能片段rC3B序列，PCR反应条件为：94℃预变性3分钟；下边为40个循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸5分钟；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图3，其中：M为分子量标准；NC为阴性对照；1为PCR扩增产物。PCR产物送去华大基因公司测序，测序结果和拼接结果一致。

生物信息学方法分析斜带石斑鱼活性区段C3 补体受体Ⅲ结合区rC3B序列

经文献调研，得到了人类补体C3功能片段的序列。使用clustalx和GeneDoc两个序列分析软件，将石斑鱼补体C3基因氨基酸序列和人类补体C3氨基酸序列进行序列比对，发现人类的补体C3功能片段rC3B序列和石斑鱼的补体C3功能片段rC3B同源性较高（图10）。另外。通过DNAstar软件分析了石斑鱼的补体C3基因的抗原表位（图11）。进一步的确定了包含最多结合位点的活性区段石斑鱼C3补体受体Ⅲ结合区rC3B(C3蛋的1331—1430 AA)。最后，使用RNAstructure 4.6软件分析了该功能片段的RNA二级机构，发现没有复杂的二级结构。

斜带石斑鱼功能片段rC3B序列基因的合成

根据分析好的斜带石斑鱼功能片段rC3B的cDNA序列（SEQ ID NO.3），设计合成两段引物，上游引物是在该片段第1位碱基起的19个碱基前加上ECORI的限制酶切位点以及保护碱基【5’- CCGGAATTCATGGAAGCAACGGTGAAAA】（SEQ ID NO.12），共28bp；下游引物是在该片段第284位碱基起的前17个碱基加上XbaI的限制酶切位点、保护碱基、6×his终止密码子5’-TGCAGATCTTTAATGATTGAGATAGATGATGTCTTTCTGACAGGACTG-3’（SEQ ID NO.13），共48bp。以M-MLV reverse transcriptase kit (Promega， Madison， WI， USA)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA为模板，经PCR方法扩增石斑鱼的补体C3功能片段rC3B序列，PCR反应条件为：94℃预变性3分钟；下边为40个循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30分钟；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图4，其中：M: marker，NC为阴性对照，1： PCR扩增产物。从图4可见PCR扩增了一段长约350bp的序列。

含斜带石斑鱼功能片段rC3B序列的克隆载体

将实施例6所获得目的基因片段分离纯化，然后与pMD18-T（TAKARA）载体按照该试剂盒提供的体系4℃连接过夜（约16h），将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经Amp+抗性和蓝白斑筛选出阳性克隆，通过质粒提取试剂盒提取质粒，质粒经过双酶切验证以及测序验证，证明斜带石斑鱼功能片段rC3B序列克隆到载体中，命名为pMD18-T-rC3B，克隆载体转化大肠杆菌DH5α所得到的重组菌株命名为pMD18-T-rC3B-DH5α。使用EcoRI 、XbaI对克隆载体pMD18-T-rC3B进行双酶切，酶切图谱见图5，其中M: marker，NC为pMD18-T-rC3B，1：pMD18-T-rC3B的EcoRI 、XbaI 双酶切产物。

含斜带石斑鱼功能片段rC3B序列的表达载体pPICZaA- rC3B的构建

克隆载体pMD18-T-rC3B用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切后，酶切产物用E.Z.N.A.^? Gel Extraction Kit回收，进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化约350bp的斜带石斑鱼功能片段rC3B序列；

载体质粒pPICZaA经限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切后分离纯化3.6kb的大片段，与约350bp的斜带石斑鱼功能片段rC3B的基因片段按1:3混合，用T4连接酶16℃连接16小时后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌DH5a中，用低盐LB平板筛选具Zeocin抗性的转化子，以标准方法提取质粒，筛选大小约4.0 kb的重组质粒，用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切重组质粒，得到约350bp和3.6kb的两个片段，大小分别与斜带石斑鱼功能片段rC3B的基因片段和表达载体pPICZaA大小相同，证明斜带石斑鱼功能片段rC3B的基因片段已克隆入毕赤酵母表达载体pPICZaA中，重组质粒命名为pPICZaA-rC3B。质粒构建流程图见图9。使用EcoRI 、XbaI对表达载体pPICZaA-rC3B进行双酶切，酶切分析图见图6，其中M: marker，NC为pPICZαA双酶切产物，1：pPICZaA-rC3B双酶切产物。

能高效表达斜带石斑鱼功能片段rC3B蛋白的毕赤酵母重组株pPICZaA- rC3B -X-33构建

按照Invitrogen公司的The Easyselect^TM  Pichia Expression Kit说明书制备毕赤酵母X-33感受态细胞，重组质粒pPICZaA- rC3B用 SacI 线形化后凝胶回收，用标准方法电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞，在含Zeocin 400μg/ml的YPDS平板上28℃进行培养。约3d后长出单克隆，挑取单克隆经诱导培养与鉴定筛选出能高效表达斜带石斑鱼功能片段rC3B重组蛋白的毕赤酵母重组株pPICZaA- rC3B -X-33。

利用毕赤酵母基因工程菌pPICZaA- rC3B -X-33生产重组斜带石斑鱼功能片段rC3B蛋白

 分别挑取各种工程菌的单克隆，接种于BMGY中，28℃，200rpm培养OD600至2-6，换培养基BMMY稀释OD600至1.0，每24h向培养基中补加0.5%甲醇，培养48h-72h后2000rpm，4℃收集上清。取1ml上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法浓缩后，加5×电泳上样缓冲液，煮沸10分钟后按标准方法跑Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳，同时取阴性对照按同样方法处理后电泳。阴性对照为空载质粒pPICZaA转化X-33后长出的单克隆培养后的上清蛋白。结果见图7，其中：M：蛋白分子量标准；1、2、3、4、5、6、7、8：重组株pPICZaA- rC3B -X-33表达产物； NC为阴性对照，显示pPICZaA- rC3B -X-33在12Kd和17Kd之间出现一条新的蛋白条带，而阴性对照不出现此带。从图中看出，第四个菌株的表达量最高。

石斑鱼rC3B蛋白抗原活性鉴定实验

将重组斜带石斑鱼功能片段rC3B蛋白采用免疫印迹（Western blot）方法进行免疫活性鉴定。一抗为鼠源his单克隆抗体（Novagen），二抗为羊抗鼠IgG-HRP（鼎国公司）。结果见图8，其中：M：蛋白分子量标准；1、2、3、4、5、6、7、8：重组株pPICZaA- rC3B -X-33表达产物Western blot鉴定图谱； NC为阴性对照，显示鼠源his单克隆抗体能识别我们用毕赤酵母表达的重组斜带石斑鱼功能片段rC3B蛋白，证明得到的蛋白是重组斜带石斑鱼功能片段rC3B蛋白。

动物实验

一、毕赤酵母基因工程菌pPICZaA- rC3B -X-33的高密度发酵

发酵过程参照 invitrogen 公司的Pichia Fermentation Process Guidelines，具体步骤如下：

1. 分别挑取筛选好的单克隆菌株pPICZαA-rC3B-X-33与pPICZαA-33，pPICZαA-33菌株作为空载对照。加入200ml MGY液体培养基到1L的锥形瓶中，30℃，200rpm振荡培养至OD600=2-6（约16-24hours）。

2.  组装好发酵罐，加入3L含有4% 甘油的发酵基础培养基（配方见Pichia Fermentation Process Guidelines），然后121℃，15min 灭菌，待冷却后，用流加瓶加入氨水，调pH到5。

3. 在火焰圈保护下，将步骤1中摇好的菌种接种于自动控制发酵罐中。调节通气量，灌压，转速来维持溶氧高于20%。设定发酵温度为29℃，自动流加氨水控制pH 5±0.05。

4. 当发酵罐中的甘油耗尽后（约接种后20个小时），用流加瓶流加每升含12mlPTM1（配方见Pichia Fermentation Process Guideline），设置流加速度为54.45ml/h，直到细胞湿重为200 g/liter结束（流加大约4个小时）。

5. 甘油消耗尽后，开始添加每升含12mlPTM1的甲醇，设定流加速度为10.8 ml/h，两个小时，设定流加速度为21.9 ml/h，两个小时后，设定流加速度为32.7 ml/h，保持这个速度直到发酵结束。这个阶段需要60个小时，总共添加约1.2L的甲醇。此时的细胞湿重约为290 g/liter。

6. 分别取pPICZαA-rC3B-X-33与pPICZαA-33发酵的菌液各1ml，上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法浓缩后，加5×电泳上样缓冲液，煮沸10分钟后按标准方法跑Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳，pPICZαA-33发酵的菌液做为阴性对照组，结果见图12。显示pPICZaA- rC3B -X-33在12Kd和17Kd之间出现一条新的蛋白条带，而阴性对照不出现此带。结果说明，pPICZaA- rC3B -X-33菌种发酵产生了高浓度的重组蛋白。

7. 把发酵液用喷雾干燥器处理，得到粉末，pPICZaA- rC3B -X-33菌种的发酵液粉末做为饲料添加剂，pPICZαA-33菌种的发酵液粉末做为对照，用于下面的饲养实验。

二、饲养实验

1 实验条件

选取同一批次、体质健康、规格相近的斜带石斑鱼放养在养殖桶中。水温25～30℃，水体盐度28～32‰，pH值8.1～8.3，溶解氧值大于5.0 mg/L，并且水体持续循环。

2 饲料配置

饲料共分为3种，A为商品料，B为商品料＋1wt% pPICZαA-33菌种的发酵液粉末， C为商品料＋1wt%pPICZaA- rC3B -X-33菌种的发酵液粉末。

分别将各组粉料搅拌均匀，每天投喂前准确称量，用水稀释后制备成湿颗粒饲料投喂。

3实验鱼饲养

本试验设3个实验组，每组30条鱼。分别投喂A、B、C组饲料。试验鱼平均体重0.95±0.01g，长度为3±0.5cm。养殖水不断充气，水温29± 2℃，水体pH值8.1-8.3，盐度28～32‰。上午和下午按照鱼体重的8%左右各投喂一次，雨天少量投喂。每天及时清理残饵，观察记录，饲养时间7周。实验前禁食一天。

4 应激实验

4.1 实验设计

取用饲喂的斜带石斑鱼做温度应激实验，应激温度为14± 0.5℃。实验准备1.0 m×0.5 m× 0.5 m的储物箱3个，在每个储物箱先装满40L的海水，并将装有海水的储物箱置于气候箱中并放入水温计来测定水温，待水温稳定在14±0.5℃，然后每个储物箱分别放A，B，C三组鱼各30条鱼，将做低温应激实验的储物箱置于气候箱中并放入水温计来测定水温。应激12小时，分别在0小时、3小时、6小时、12小时取样，每组取6尾。

4.2 血细胞计数及渗透压的测定

用1 mL一次性无菌注射器臀鳍下方尾静脉或尾动脉抽血，取完血后，拔下针头，将血液注入玻璃采血管中，4℃下静置，取血清。血细胞计数板的计数血细胞方法按照WHO手册进行计数，分别计数血细胞3次，取3次结果的平均值为计数结果。

4.2.1血细胞计数的测定原理

血细胞的计数一般使用血球计数板。每块计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池，计数池高0.1mm。计数池分为9个大方格，每个大格面积为1.0mm.容积为0.1mm³（μl），其中，中央大方格分成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域。四角的4个大方格是白细胞计数区域。在计数血细胞时，要计算位于中央的大方格中，其正中及四角5个中方格的总细胞数目，再根据公式细胞数/ml=五个中方格内的细胞个数/5×25×10000×稀释倍数。

4.2.2血细胞计数的测定方法

视待测血细胞的浓度，加抗凝剂适当稀释（一般稀释100倍），然后取洁净的血球计数板一块，并在计数区内盖上一块盖玻片。将血细胞轻轻吹打混匀，用移液枪吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生。静置片刻后，把血球计数板放在显微镜的载物台上然后观察并计数中央的大方格中，其正中及四角5个中方格的总细胞数目。在计数时，要遵循原则：数上线不数下线，数左线不数右线。测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净。每个血样分别计数血细胞3次，取3次结果的平均值为计数结果。

结果显示：应激过程中，在14±0.5℃应激0小时，三种饲料喂养的鱼血细胞数目并没有明显差异，C组略高。应激3小时后，A，B，C三组的血细胞数目均有下降，但是C组的血细胞数目高于A、B组，并且差异显著。应激6小时后，A，B，C三组的血细胞数目进一步下降，但是C组的血细胞数目下降较A、B组少，数目明显高于A、B组，并且差异显著。应激12小时后，A，B，C三组的血细胞数目均有上升， C组的血细胞数目略高于A，B组，没有明显差异（见图13）。

4.3 呼吸爆发的测定

4.3.1细胞呼吸爆发的测定原理

活性氧（Reactive oxygen species, ROS）包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。2，7-二氯氢化荧光素二脂（2,7-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA）是迄今为止最常用、最灵敏的细胞内活性氧检探针。本身没有荧光的DCFH-DA可穿过细胞膜进入细胞，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化生成荧光物质DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。在激发波长502nm，发射波长530nm附近，使用流式细胞仪的FL1通道检测DCF荧光，从而测定细胞内活性氧水平。

4.3.2血细胞呼吸爆发的测定方法

取200μl的血细胞悬液，加入200μl PBS缓冲液（MAS抗凝剂进行稀释），混匀，调整细胞的浓度为1×10⁶个/ml左右，使用荧光染料2,7-二氯氢化荧光素二脂（DCFH-DA）（终浓度10 μM）25℃下避光染色30min。然后使用200目的筛网过滤将细胞悬液转移到上样管中，使用流式细胞仪进行检测，并用Cellquest 软件分析DCF平均荧光强度的变化。

结果显示：A，B，C三组鱼受到低温14±0.5℃应激后，应激0小时，三种饲料喂养的鱼血细胞的活性氧（呼吸爆发）并没有明显差异。随着应激时间的延长，血细胞的活性氧（呼吸爆发）水平不断升高，A，B组血细胞的活性氧含量上升明显比C组多，在6小时达到最大值，并且A，B组的活性氧含量明显高于C组。应激12小时后，A，B，C三组的血细胞的活性氧（呼吸爆发）均有下降，但是C组的血细胞的活性氧（呼吸爆发）明显低于A，B组（见图14）。

细胞凋亡测定

4.4.1血细胞凋亡的测定原理

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。血淋巴细胞凋亡的测定原理：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由膜脂内侧翻向外侧。Annexin V是一种依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。用标记了FITC的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生，正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。碘化丙啶( propidine iodide,PI) 是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够细胞膜与细胞核结合呈现红色。将Annexin V与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。在双参数流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为( FIT C－ / PI－) ；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为( FIT C＋ / PI＋) ；而右下象限为凋亡细胞, 显现( FIT C＋/ PI－) 。

4.4.2血淋巴细胞凋亡的测定方法 

使用Annexin V/PI apoptosis kit，购自联科生物。具体步骤：

收集血细胞，用MAS抗凝剂进行稀释，调整血细胞浓度大约为1-5×10⁶ cells/ml，取200μl稀释的血细胞，在细胞悬浮液中加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI后轻轻混匀，在黑暗环境下静置5分钟，然后使用200目的筛网过滤将细胞悬液转移到上样管中，使用流式细胞仪进行检测。

结果表明：A，B，C三组鱼受到低温14±0.5℃应激后，应激0小时，三种饲料喂养的鱼血细胞的细胞凋亡数目并没有明显差异。随着应激时间的延长，血细胞的细胞凋亡数目不断增加，A、B组血细胞的细胞凋亡数目增加比C组多，在6小时达到最大值，并且A、B组的细胞凋亡数目明显高于C组。应激12小时后，A、B、C三组的血细胞的细胞凋亡数目均有下降，但是C组的血细胞的细胞凋亡数目明显少于A、B组，并且差异显著（见图15）。

以上实验表明：实验组C组，食用了含有重组蛋白 rC3B 的饲料后，在低温应激过程中，其抗应激能力明显优于对照组A、B。 由此可见，重组蛋白rC3B可用于制备鱼类免疫制剂或饲料添加剂，提高鱼类尤其是石斑鱼的免疫力。

<110>  华南师范大学

<120>  斜带石斑鱼补体C3基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用

<130> 

<150>  CN201110134612.6

<151>  2011-05-24

<160>  13   

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  5130

<212>  DNA

<213>  石斑鱼(Epinephelussp)

<400>  1

atgagaagga ctctgctgtg gctgacggcc tctctggcct ttgtctctct aacttctctg       60

gctgatggag ctccattgca ggtgatgact gcccccaact taatgcgggt aggaacagca      120

gaaaacatct ttgtggagtg tcaagactgc actggaggag acatcagggt cgaaatcatc      180

gtgcagaacc atccaactaa aaccacaagg ctagcatcta cagctgtgac acttaatggt      240

gcaaatgact tccaggcgct cggacgaata acgatccctg ttggagactt cagtaaagat      300

cccaacatga aacagtatgt gtacctgcaa gctcagttcc ctgaccgact gctggagaaa      360

gtcgtcttgg tgtccttcca gtccggctac atcttcatcc agaccgataa gaccctctac      420

acccccgaca gcaaagttta ttacaggatg tttgcagtga cgcccagcat ggagcctgta      480

gagagggatg acacaaccca aactgatgct tctattgcca ttgagattga gacccccgaa      540

ggcatcattt taccactcga tccagtctct ctgatatcag ggatgcactc tggggattac      600

caactttctg aaattgtcag tcctggactg tggaaggtgg tggcaaagtt ccacagcaac      660

ccacagcaga gctattttgc agagtttgag gtcagagaat acgtgctgcc cagttttgag      720

gtcaaactga cacctgacag ccccttcttc tacgtggaca gtcaggagct ccgcgtcaac      780

atcaaagcga catacctatt tggtgaagag gtggaaggga cggcttacgt ggtgtttgga      840

gttatgcaag atggtcaaaa gaaaagcttc ccatcttctc ttcagagagt gccggttggc      900

agaggtagtg gagcggtcac actgaagaga gagcacatca cacagacctt cccaaacatc      960

ctcgagctgg tcgggaaatc catatttgta gctgtcagtg tgctgacgga gagcggtagt     1020

gaaatggtgg aggcagagtt gagaagtatc cagatcgtca catcaccgta caccattcac     1080

ttcacgaaaa cacccaaata cttcaaacca ggaatgtcct tcgatgttgc ggttgaagtt     1140

gtgaatcctg atgagactcc agcacaaggt gttgcagtgg tggtcgatcc aggcaacgtg     1200

cagggcttca ccgcagccaa tggcatggca aggctcacca tcaatacagt cgcagggaat     1260

gcaagactga caatcaacgc aaggaccaat gatcctcgta tttcagctga aagacaagca     1320

agagccagca tgacagctgt cccatatgcc accaaaagca acaactacat ccacataggt     1380

gtggatacag cagagctgca attaggagac aatctgaaaa tcaacctgaa cctcaacaga     1440

caggaaaatc tcaacagtga caccacatac ctgatcctga gcagaggcca gctggtgaaa     1500

aaaggccgtt acaagacaag aggtcaagta ctgatttccc tgatcgttcc catcaccaaa     1560

gaaatgctgc catcgttccg tatcgttgcc tactaccata caagtggcaa tgaagtggta     1620

tcagactcag tttgggtgga tgtgacagac tcctgcatgg gctcgctgaa actggaatca     1680

ttgagagccg ctccatccta tgagcctcgc aggatgtttg gcctgaaggt cactggagac     1740

ccagggtcca cagtgggact ggtggcagtc gacaaaggag tcttcgtcct aaacaaacag     1800

catcgtctca cccagaaaaa ggtgtgggat attgtagaga agtatgacac aggctgcaca     1860

ccaggtggag ggaaggacgg tatgggtgtg tttttcgatg ctgggctgtt gtttgagtcc     1920

agtacggctt ctgggactgc ctacagacaa gaaatgaaat gtgcggcccc cagcaggaag     1980

aaacgaacca ctataatgga cgtctcaacc agcttagtga gtaagtataa agagaaactg     2040

gaacgtgact gttgtttgga tggcatgcag aaatctttgc tctcatacac gtgtgagaga     2100

cgctcagagt acatcaacga tggtgcagcc tgtgtcgcag ccttcctgca ctgctgtaag     2160

gagatggaaa gccagcgagc tgagatgaag gaggatagcc tgcgactggc tcgaagtgag     2220

gaggaggaca acagttacat ggacagcaat gaaattggtt cacgcaccaa gttccctgaa     2280

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accacatcat ttacgaaaaa cgttcctttg caagactcaa tcacaacctg gcagttcact     2400

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cgcaaggaat tcttcatcgg tctcaggctg ccgtactctg ctgtccgtgg agagcagctc     2520

gaagtgaagg caatcctcca caactacagc ccagatccta tcactgtgcg tgtggatctg     2580

attgagaagg agcacgtgtg cagttcagct tctaaacgtg gaaagtatcg tcaggaagtc     2640

aacattgggc ccctgactac acgatctgta cccttcatca ttattcccat gaaagatgga     2700

cactaccccg ttgaggtcaa agcagccgtt aaagattcgt cgctcaatga cggaatcatg     2760

aagatgctac gggtggtgcc tgaaggcgta ctgattaaac atcctcagat tgtaactcta     2820

gatcccatta ataaaggagt tggtggtaaa caagaagaaa ctctcaacag tggaattcct     2880

aagaaagatt tggctccaaa cacacctacc agcacacaga tttctgtgac aggacgagaa     2940

caagtggctg cactggtgga gaacgccatt agtgggaaat ctatgggtag tctgatctat     3000

cagccctcag gctgtggaga gcagaacatg atccacatga ccctgccggt cattgcaacc     3060

acatatttgg acaaaaccaa ccagtgggaa gctgtgggct ttcagaaacg tgctgaagcc     3120

ctccaacaca ttcagaccgg ctaccggaac gagctggcct tccgtaaaaa tgatgggtct     3180

tttgctgttt gggccaatcg ccaaagtagc acctggctga cagcatatgt tgccaaggtg     3240

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tttctgattc ttaacgccca gcaacctgac ggcttgttta gagaagttgg aaaggtttct     3360

cacggagaga tgattggaga tgtgcgcggt gcagattcag atgcctccat gacagccttc     3420

tgcctcattg ccatgcagga gtcacgcaca ctatgtgcag ccactgttaa tagtcttcca     3480

ggcagtattg acaaagcagt ggcctacctg gagaagcgtt tgcccagcct caccaaccca     3540

tatgccgtta ccatgtcgtc atatgccctg gccaatgaaa acaaactgga ccgcgaaatc     3600

ctcaacaagt ttgcttccgc agaattatcc cactggccga cacctaaggg acgcatttac     3660

acactggagg ccacagctta tgctcttctc gctctcgtca aggccaaggc atttgaagac     3720

gccagaccta ttgtgagatg gttcaacaaa cagcagaagg tgggcggagg ctacggatca     3780

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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                      5130

 

 

<210>  2

<211>  1657

<212>  PRT

<213>  石斑鱼(Epinephelussp)

<400>  2

Met Arg Arg Thr Leu Leu Trp Leu Thr Ala Ser Leu Ala Phe Val Ser

1               5                   10                  15     

Leu Thr Ser Leu Ala Asp Gly Ala Pro Leu Gln Val Met Thr Ala Pro

            20                  25                  30         

Asn Leu Met Arg Val Gly Thr Ala Glu Asn Ile Phe Val Glu Cys Gln

        35                  40                  45             

Asp Cys Thr Gly Gly Asp Ile Arg Val Glu Ile Ile Val Gln Asn His

    50                  55                  60                 

Pro Thr Lys Thr Thr Arg Leu Ala Ser Thr Ala Val Thr Leu Asn Gly

65                  70                  75                  80 

Ala Asn Asp Phe Gln Ala Leu Gly Arg Ile Thr Ile Pro Val Gly Asp

                85                  90                  95     

Phe Ser Lys Asp Pro Asn Met Lys Gln Tyr Val Tyr Leu Gln Ala Gln

            100                 105                 110        

Phe Pro Asp Arg Leu Leu Glu Lys Val Val Leu Val Ser Phe Gln Ser

        115                 120                 125            

Gly Tyr Ile Phe Ile Gln Thr Asp Lys Thr Leu Tyr Thr Pro Asp Ser

    130                 135                 140                

Lys Val Tyr Tyr Arg Met Phe Ala Val Thr Pro Ser Met Glu Pro Val

145                 150                 155                 160

Glu Arg Asp Asp Thr Thr Gln Thr Asp Ala Ser Ile Ala Ile Glu Ile

                165                 170                 175    

Glu Thr Pro Glu Gly Ile Ile Leu Pro Leu Asp Pro Val Ser Leu Ile

            180                 185                 190        

Ser Gly Met His Ser Gly Asp Tyr Gln Leu Ser Glu Ile Val Ser Pro

        195                 200                 205            

Gly Leu Trp Lys Val Val Ala Lys Phe His Ser Asn Pro Gln Gln Ser

    210                 215                 220                

Tyr Phe Ala Glu Phe Glu Val Arg Glu Tyr Val Leu Pro Ser Phe Glu

225                 230                 235                 240

Val Lys Leu Thr Pro Asp Ser Pro Phe Phe Tyr Val Asp Ser Gln Glu

                245                 250                 255    

Leu Arg Val Asn Ile Lys Ala Thr Tyr Leu Phe Gly Glu Glu Val Glu

            260                 265                 270        

Gly Thr Ala Tyr Val Val Phe Gly Val Met Gln Asp Gly Gln Lys Lys

        275                 280                 285            

Ser Phe Pro Ser Ser Leu Gln Arg Val Pro Val Gly Arg Gly Ser Gly

    290                 295                 300                

Ala Val Thr Leu Lys Arg Glu His Ile Thr Gln Thr Phe Pro Asn Ile

305                 310                 315                 320

Leu Glu Leu Val Gly Lys Ser Ile Phe Val Ala Val Ser Val Leu Thr

                325                 330                 335    

Glu Ser Gly Ser Glu Met Val Glu Ala Glu Leu Arg Ser Ile Gln Ile

            340                 345                 350        

Val Thr Ser Pro Tyr Thr Ile His Phe Thr Lys Thr Pro Lys Tyr Phe

        355                 360                 365            

Lys Pro Gly Met Ser Phe Asp Val Ala Val Glu Val Val Asn Pro Asp

    370                 375                 380                

Glu Thr Pro Ala Gln Gly Val Ala Val Val Val Asp Pro Gly Asn Val

385                 390                 395                 400

Gln Gly Phe Thr Ala Ala Asn Gly Met Ala Arg Leu Thr Ile Asn Thr

                405                 410                 415    

Val Ala Gly Asn Ala Arg Leu Thr Ile Asn Ala Arg Thr Asn Asp Pro

            420                 425                 430        

Arg Ile Ser Ala Glu Arg Gln Ala Arg Ala Ser Met Thr Ala Val Pro

        435                 440                 445             

Tyr Ala Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ile His Ile Gly Val Asp Thr Ala

    450                 455                 460                

Glu Leu Gln Leu Gly Asp Asn Leu Lys Ile Asn Leu Asn Leu Asn Arg

465                 470                 475                 480

Gln Glu Asn Leu Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Leu Ile Leu Ser Arg Gly

                485                 490                 495    

Gln Leu Val Lys Lys Gly Arg Tyr Lys Thr Arg Gly Gln Val Leu Ile

            500                 505                 510        

Ser Leu Ile Val Pro Ile Thr Lys Glu Met Leu Pro Ser Phe Arg Ile

        515                 520                 525            

Val Ala Tyr Tyr His Thr Ser Gly Asn Glu Val Val Ser Asp Ser Val

    530                 535                 540                 

Trp Val Asp Val Thr Asp Ser Cys Met Gly Ser Leu Lys Leu Glu Ser

545                 550                 555                 560

Leu Arg Ala Ala Pro Ser Tyr Glu Pro Arg Arg Met Phe Gly Leu Lys

                565                 570                 575    

Val Thr Gly Asp Pro Gly Ser Thr Val Gly Leu Val Ala Val Asp Lys

            580                 585                 590        

Gly Val Phe Val Leu Asn Lys Gln His Arg Leu Thr Gln Lys Lys Val

        595                 600                 605            

Trp Asp Ile Val Glu Lys Tyr Asp Thr Gly Cys Thr Pro Gly Gly Gly

    610                 615                 620                

Lys Asp Gly Met Gly Val Phe Phe Asp Ala Gly Leu Leu Phe Glu Ser

625                 630                 635                 640

Ser Thr Ala Ser Gly Thr Ala Tyr Arg Gln Glu Met Lys Cys Ala Ala

                645                 650                 655    

Pro Ser Arg Lys Lys Arg Thr Thr Ile Met Asp Val Ser Thr Ser Leu

            660                 665                 670        

Val Ser Lys Tyr Lys Glu Lys Leu Glu Arg Asp Cys Cys Leu Asp Gly

        675                 680                 685            

Met Gln Lys Ser Leu Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Arg Arg Ser Glu Tyr

    690                 695                 700                

Ile Asn Asp Gly Ala Ala Cys Val Ala Ala Phe Leu His Cys Cys Lys

705                 710                 715                 720

Glu Met Glu Ser Gln Arg Ala Glu Met Lys Glu Asp Ser Leu Arg Leu

                725                 730                 735    

Ala Arg Ser Glu Glu Glu Asp Asn Ser Tyr Met Asp Ser Asn Glu Ile

            740                 745                 750        

Gly Ser Arg Thr Lys Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Ser Asp Ile Lys

        755                 760                 765            

Leu Pro Thr Cys Pro Arg Gln Ser Pro Asn Cys Asp Thr Thr Ser Phe

    770                 775                 780                

Thr Lys Asn Val Pro Leu Gln Asp Ser Ile Thr Thr Trp Gln Phe Thr

785                 790                 795                 800

Gly Ile Ser Leu Ser Pro Thr Asn Gly Ile Cys Val Gly Gln Pro Leu

                805                 810                 815    

Glu Val Ile Val Arg Lys Glu Phe Phe Ile Gly Leu Arg Leu Pro Tyr

            820                 825                 830        

Ser Ala Val Arg Gly Glu Gln Leu Glu Val Lys Ala Ile Leu His Asn

        835                 840                 845            

Tyr Ser Pro Asp Pro Ile Thr Val Arg Val Asp Leu Ile Glu Lys Glu

    850                 855                 860                

His Val Cys Ser Ser Ala Ser Lys Arg Gly Lys Tyr Arg Gln Glu Val

865                 870                 875                 880

Asn Ile Gly Pro Leu Thr Thr Arg Ser Val Pro Phe Ile Ile Ile Pro

                885                 890                 895    

Met Lys Asp Gly His Tyr Pro Val Glu Val Lys Ala Ala Val Lys Asp

            900                 905                 910         

Ser Ser Leu Asn Asp Gly Ile Met Lys Met Leu Arg Val Val Pro Glu

        915                 920                 925            

Gly Val Leu Ile Lys His Pro Gln Ile Val Thr Leu Asp Pro Ile Asn

    930                 935                 940                 

Lys Gly Val Gly Gly Lys Gln Glu Glu Thr Leu Asn Ser Gly Ile Pro

945                 950                 955                 960

Lys Lys Asp Leu Ala Pro Asn Thr Pro Thr Ser Thr Gln Ile Ser Val

                965                 970                 975    

Thr Gly Arg Glu Gln Val Ala Ala Leu Val Glu Asn Ala Ile Ser Gly

            980                 985                 990        

Lys Ser Met Gly Ser Leu Ile Tyr  Gln Pro Ser Gly Cys  Gly Glu Gln

        995                 1000                 1005            

Asn Met  Ile His Met Thr Leu  Pro Val Ile Ala Thr  Thr Tyr Leu

    1010                 1015                 1020            

Asp Lys  Thr Asn Gln Trp Glu  Ala Val Gly Phe Gln  Lys Arg Ala

    1025                 1030                 1035            

Glu Ala  Leu Gln His Ile Gln  Thr Gly Tyr Arg Asn  Glu Leu Ala

    1040                 1045                 1050            

Phe Arg  Lys Asn Asp Gly Ser  Phe Ala Val Trp Ala  Asn Arg Gln

    1055                 1060                 1065            

Ser Ser  Thr Trp Leu Thr Ala  Tyr Val Ala Lys Val  Phe Ala Met

    1070                 1075                 1080            

Ala Asn  Ser Leu Val Ala Val  Gln Lys Glu His Ile  Cys Glu Ala

    1085                 1090                 1095            

Ile Lys  Phe Leu Ile Leu Asn  Ala Gln Gln Pro Asp  Gly Leu Phe

    1100                 1105                 1110            

Arg Glu  Val Gly Lys Val Ser  His Gly Glu Met Ile  Gly Asp Val

    1115                 1120                 1125            

Arg Gly  Ala Asp Ser Asp Ala  Ser Met Thr Ala Phe  Cys Leu Ile

    1130                 1135                 1140            

Ala Met  Gln Glu Ser Arg Thr  Leu Cys Ala Ala Thr  Val Asn Ser

    1145                 1150                 1155            

Leu Pro  Gly Ser Ile Asp Lys  Ala Val Ala Tyr Leu  Glu Lys Arg

    1160                 1165                 1170            

Leu Pro  Ser Leu Thr Asn Pro  Tyr Ala Val Thr Met  Ser Ser Tyr

    1175                 1180                 1185            

Ala Leu  Ala Asn Glu Asn Lys  Leu Asp Arg Glu Ile  Leu Asn Lys

    1190                 1195                 1200            

Phe Ala  Ser Ala Glu Leu Ser  His Trp Pro Thr Pro  Lys Gly Arg

    1205                 1210                 1215            

Ile Tyr  Thr Leu Glu Ala Thr  Ala Tyr Ala Leu Leu  Ala Leu Val

    1220                 1225                 1230            

Lys Ala  Lys Ala Phe Glu Asp  Ala Arg Pro Ile Val  Arg Trp Phe

    1235                 1240                 1245            

Asn Lys  Gln Gln Lys Val Gly  Gly Gly Tyr Gly Ser  Thr Gln Ala

    1250                 1255                 1260            

Thr Ile  Met Val Tyr Gln Ala  Val Ala Glu Tyr Trp  Ala Ser Ala

    1265                 1270                 1275            

Lys Glu  Pro Glu Tyr Asp Leu  Asn Val Asp Ile Leu  Leu Pro Gly

    1280                 1285                 1290            

Arg Ala  Lys Pro Glu Lys Phe  Asn Phe Asn Arg Leu  Asn Gln Tyr

    1295                 1300                 1305            

Ala Thr  Arg Thr Ser Lys Leu  Asn Asp Ile Asn Gln  Asp Val Lys

    1310                 1315                 1320            

Val Thr  Ala Thr Gly Ser Gly  Glu Ala Thr Val Lys  Met Val Ser

    1325                 1330                 1335            

Leu Tyr  Tyr Ala Leu Pro Lys  Glu Lys Glu Ser Asp  Cys Glu Lys

    1340                 1345                 1350            

Phe Asn  Val Ser Val Gln Leu  Ile Pro Glu Lys Ile  Glu Glu Glu

    1355                 1360                 1365            

Glu Lys  Val Tyr Lys Leu Arg  Ile Glu Val Leu Tyr  Lys Asp Arg

    1370                 1375                 1380            

Glu Ser  Asp Ala Ser Met Ser  Ile Leu Asp Ile Gly  Leu Leu Thr

    1385                 1390                 1395            

Gly Phe  Thr Pro Asn Thr Asn  Asp Leu Asp Leu Ser  Ser Lys Gly

    1400                 1405                 1410            

Arg Ala  Arg Thr Ile Ala Lys  Tyr Glu Met Asn Thr  Val Leu Ser

    1415                 1420                 1425            

Glu Arg  Gly Ser Leu Ile Ile  Tyr Leu Asp Lys Val  Ser His Thr

    1430                 1435                 1440            

Arg Pro  Glu Glu Ile Ser Phe  Arg Ile Ser Gln Lys  Leu Lys Val

    1445                 1450                 1455            

Gly Val  Leu Gln Pro Ala Ala  Val Ser Val Tyr Glu  Tyr Tyr Asp

    1460                 1465                 1470            

Gln Ser  His Cys Val Lys Phe  Tyr His Pro Glu Arg  Lys Ala Gly

    1475                 1480                 1485            

Gln Leu  Leu Arg Leu Cys Arg  Asn Asp Glu Cys Thr  Cys Ala Glu

    1490                 1495                 1500            

Glu Asn  Cys Ser Met Gln Lys  Lys Glu Glu Ile Thr  Asn Asp Gln

    1505                 1510                 1515            

Arg Thr  Ala Lys Ala Cys Glu  Ser Thr Pro Thr Ser  Lys Ile Asp

    1520                 1525                 1530            

Phe Val  Tyr Lys Val Arg Val  Glu Gly Phe Thr Asp  Gly Leu Ser

    1535                 1540                 1545            

Thr Asp  Ile Tyr Thr Val Met  Val Leu Glu Val Ile  Lys Glu Gly

    1550                 1555                 1560            

Ser Tyr  Asp Val Gly Pro Val  Asn Lys Met Arg Thr  Phe Leu Ser

    1565                 1570                 1575            

Tyr Pro  His Cys Arg Asp Ser  Leu Asp Leu Ala Thr  Gly Lys Thr

    1580                 1585                 1590            

Tyr Leu  Ile Met Gly Thr Ser  Ser Asp Ile His Arg  Asp Glu Gln

    1595                 1600                 1605            

Glu Gln  Thr Tyr Gln Tyr Val  Leu Gly Glu Arg Thr  Trp Ile Glu

    1610                 1615                 1620            

Tyr Trp  Pro Thr Glu Ala Glu  Cys Gln Ser Asp Glu  His Arg Pro

    1625                 1630                 1635            

Thr Cys  Leu Gly Met Glu Glu  Leu Val Gln Gln Tyr  Gln Leu Phe

    1640                 1645                 1650            

Gly Cys  Gln Gln

    1655        

 

 

<210>  3

<211>  300

<212>  DNA

<213>  石斑鱼(Epinephelussp)

<400>  3

gaagcaacgg tgaaaatggt gtcgctgtat tacgctctgc ctaaagaaaa ggagagtgac       60

tgtgagaagt ttaacgtgtc agtgcagctt atcccagaga aaattgaaga ggaggagaag      120

gtatacaagc tgagaataga agttttgtat aaggacagag agagtgatgc atccatgtca      180

atcttggata ttgggttgct taccggcttc actcccaaca caaatggcct ggacttgttg      240

tctaaaggac gtgcccgcac cattgcaaaa tatgagatga acacagtcct gtcagaaaga      300

 

 

<210>  4

<211>  100

<212>  PRT

<213>  石斑鱼(Epinephelussp)

<400>  4

Glu Ala Thr Val Lys Met Val Ser Leu Tyr Tyr Ala Leu Pro Lys Glu

1               5                   10                  15     

Lys Glu Ser Asp Cys Glu Lys Phe Asn Val Ser Val Gln Leu Ile Pro

            20                  25                  30          

Glu Lys Ile Glu Glu Glu Glu Lys Val Tyr Lys Leu Arg Ile Glu Val

        35                  40                  45             

Leu Tyr Lys Asp Arg Glu Ser Asp Ala Ser Met Ser Ile Leu Asp Ile

    50                  55                  60                  

Gly Leu Leu Thr Gly Phe Thr Pro Asn Thr Asn Asp Leu Asp Leu Ser

65                  70                  75                  80 

Ser Lys Gly Arg Ala Arg Thr Ile Ala Lys Tyr Glu Met Asn Thr Val

                85                  90                  95     

Leu Ser Glu Arg

            100

 

 

<210>  5

<211>  396

<212>  DNA

<213>  石斑鱼(Epinephelussp)

<400>  5

gtactgattt ccctgatcgt tcccatcacc aaagaaatgc tgccatcgtt ccgtatcgtt       60

gcctactacc atacaagtgg caatgaagtg gtatcagact cagtttgggt ggatgtgaca      120

gactcctgca tgggctcgct gaaactggaa tcattgagag ccgctccatc ctatgagcct      180

cgcaggatgt ttggcctgaa ggtcactgga gacccagggt ccacagtggg actggtggca      240

gtcgacaaag gagtcttcgt cctaaacaaa cagcatcgtc tcacccagaa aaaggtgtgg      300

gatattgtag agaagtatga cacaggctgc acaccaggtg gagggaagga cggtatgggt      360

gtgtttttcg atgctgggct gttgtttgag tccagt                                396

 

 

<210>  6

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  6

ctttcggcct tggcgggttt g                                                 21

 

 

<210>  7

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  7

acggaaacaa cacgtcctct acg                                               23

 

 

<210>  8

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  8

gtggaaatca gcgtacggca ga                                                22

 

 

<210>  9

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  9

acccgctcaa gcgtccgaaa g                                                 21

 

 

<210>  10

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  10

cttcagggtt taggacgatg tg                                                22

 

 

<210>  11

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  11

ccagtgggtc ttctggtgag tg                                                22

 

 

<210>  12

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  12

ccggaattca tggaagcaac ggtgaaaa                                          28

 

 

<210>  13

<211>  48

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  13

tgcagatctt taatgattga gatagatgat gtctttctga caggactg                    48

Claims (10)

1.石斑鱼rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或者是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。

2.编码权利要求1所述石斑鱼rC3B蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.石斑鱼补体C3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。

5.编码权利要求4所述石斑鱼补体C3蛋白的基因。

6.根据权利要求5所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

7.一种克隆载体，含有权利要求2、3、5或6所述的基因。

8.一种表达载体，含有权利要求2、3、5或6所述的基因。

9.生产石斑鱼rC3B蛋白或石斑鱼补体C3蛋白的方法，包括将权利要求8所述表达载体导入宿主细胞中，表达得到rC3B蛋白或C3蛋白。

10.权利要求1或4所述的蛋白在制备提高鱼类免疫力制剂中的应用。

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